CN102618478B - 一株产d-乳酸动态调控重组菌及用其制备d-乳酸的方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一株产D-乳酸动态调控重组菌及用其制备D-乳酸的方法，属于微生物基因工程技术领域。本重组菌命名为大肠杆菌（Escherichiacoli）B0013-070B，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2012071。该菌株其基因组中乳酸脱氢酶基因启动子ldhAp被替换为培养环境/营养因素控制型启动子。利用该重组菌，在25~50℃条件下分阶段发酵28~40h，产D-乳酸水平达12.5%；光学纯度达99.9%，化学纯度达98.4%。本发明对D-乳酸高产菌B0013-070染色体上的D-乳酸脱氢酶编码基因的表达进行动态调控，使得D-乳酸的生产过程仅需改变发酵温度即可控制，达到以葡萄糖为原料高效合成D-乳酸的目的。本发明经简单修改后，可用于其它工业上重要的微生物代谢产物的生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物法高效制备D-乳酸的发酵工艺及其发酵生产菌种，尤其是一种能够在工业化生产规模下，仅通过发酵工艺条件如温度因素的简单调控，实现D-乳酸高效合成和低成本发酵生产的工艺，属于微生物基因工程、生物化工和微生物发酵工程技术领域。
背景技术
乳酸（α-羟基丙酸，分子式为C2H5OCOOH）是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人、动物、植物和微生物中。乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，乳酸及其衍生物被广泛应用于酿造、食品、农业、医药、化工、纺织、皮革、烟草、印染等行业中。乳酸是自然界最小的手性分子，其羧基α位碳原子为不对称碳原子，具有L（＋）和D（－）两种光学构型。异构体之一的D-乳酸是一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料。随着人们环保意识的提高，生物可降解聚乳酸材料的市场需求量剧增，也推动了对其单体D-乳酸的需求，同时促进了对以高产量、高转化率和高生产强度生产D-乳酸合成方法的需求。
实现D-乳酸的快速高效合成需要两个条件：一是菌体生长阶段，消除各种不利因素对菌体活性的影响，获得高活性的细胞工厂；二是D-乳酸合成阶段，菌体不生长或缓慢生长，副产物不合成，细胞工厂处于高强度合成D-乳酸状态。
已有的研究多是为了实现上述目标。但是采用的方式或者是添加乙酸等物质（Zhu Y. et al., Applied Environmental Microbiology, 2007, 73: 456~464），或者是通入氮气等维持厌氧条件的气体（Zhu Y. et al., Applied Environmental Microbiology, 2007, 73: 456~464）。而从工业化规模生产角度来讲，前者在乙酸等物质的流加控制上实现难度大，后者则需要维持发酵体系的密闭性，从而增加了设备成本和维护成本。
本发明涉及的菌种可以通过环境条件的调整或改变，如：温度的降低及提高；或营养物质添加或浓度变更，如：乳糖或其结构类似物向培养基的添加；或特殊营养物质的浓度变更，如：氧气（空气）的增减；或上述方法的组合，简易实现微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成途径的启动/关闭，来实现培养环境条件更适合细胞生长或更适合微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成，且该过程对环境因素无特殊要求。可以在工业规模生产中，仅通过简单的培养环境条件或因子，如温度的变化，方便地实现菌体的快速生长和微生物初级代谢产物，如D-乳酸的不合成；而在微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成过程中，其它种类的有机分子副产物不合成。在这一过程中，微生物初级代谢产物，如D-乳酸的合成速度还得到了大幅度加强。更为有益的是，该工艺发酵生产D-乳酸的过程在乳酸合成阶段对发酵体系的密闭性及无菌程度均无较高要求，甚至可以在开放环境中实现发酵生产。本发明涉及的发酵工艺和菌种，在微生物初级代谢产物如D-乳酸的工业化规模生产中意义显著，推广前景广阔。
作为聚乳酸合成材料的单体，D-乳酸的光学纯度和化学纯度直接影响聚合材料的物理性能（Jem K.J. et al., Microbiology Monographs, 2010, 14: 323~346）。因此，获得高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸显得尤为重要。
野生大肠杆菌即可发酵产生较高光学纯度的D-乳酸（常在99%以上），且其生长速度快、营养需求简单，但其化学纯度不高（常在80%以下）。因此，重组大肠杆菌是生物合成乳酸的主要菌种。与乳酸细菌相比，重组大肠杆菌进行D-乳酸发酵生产的优越之处在于其对乳酸的转化率常常可超过90%；更重要的是，作为基因操作的工具菌，大肠杆菌遗传背景清楚、易于进行基因操作。通关定向遗传改良，可以使大肠杆菌在合成乳酸时的光学纯度和化学纯度皆能达到理想的程度。
前期研究已有许多通过删除乳酸竞争途径来增加乳酸合成的报道（Zhou L. et al., Current Microbiology, 2011, 62: 981~989；Zhu Y. et al., Applied Environmental Microbiology, 2007, 73: 456~464; Zhou S. et al., Applied Environmental Microbiology, 2003, 69: 399~407; Zhu J. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 64: 367~375; Zhu J. et al., Metabolic Engineering, 2005, 7: 104~115）。进一步在重组大肠杆菌中增加乳酸合成关键途径----乳酸脱氢酶基因（ldhA）的拷贝数或将其启动子替换为强启动子有可能会增加乳酸合成的速率。然而，Bunch等（Bunch P.K. et al., Microbiology, 1997, 143: 187~195）研究表明，在大肠杆菌中高表达D-乳酸脱氢酶基因，过量的乳酸脱氢酶将丙酮酸池转化为乳酸，使得三碳中间代谢产物缺乏，菌体生长受到抑制。此外，在菌体生长阶段产生乳酸会消耗大量的碳源，使得好氧阶段不能得到高菌体浓度，从而第二阶段的乳酸体积生产强度下降。如，我们前期报道的菌种B0013-070（Zhou L. et al., Current Microbiology, 2011, 62: 981~989）在菌体生长阶段合成7 g/L乳酸，与细胞合成竞争底物，由于在大规模发酵过程中供氧能力会显著下降，好氧阶段乳酸的积累会进一步增加，从而影响菌体量的积累，使得在乳酸积累阶段乳酸体积生产强度降低。
本发明建立了操作简易且能高效率制备高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸的发酵工艺。为了实现发酵操作过程的简洁性，本发明通过基因重组技术构建了一株利于发酵过程动态调控的生产菌种。
本发明技术经过简单修改后，同样可以用于其它工业上重要的微生物代谢产物，但不限于，如L-乳酸、乙酸、丙酮酸、丁二酸、苹果酸等多种有机酸；脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸；硫胺素、维生素B12等多种微生物；或，乙醇、丙醇等短链醇的菌种构建与发酵生产新工艺技术的建立与应用。
发明内容
本发明的目的是建立一种操作简洁的高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸高效制备工艺，并获得一株与该工艺相对应的可以实现代谢过程动态调控的发酵生产菌种。
本发明的技术方案：一株产D-乳酸动态调控重组菌，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）B0013-070B，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012071。
所述产D-乳酸动态调控重组菌，其基因组中乳酸脱氢酶基因启动子ldhAp被替换为培养环境/营养因素控制型启动子。
用所述产D-乳酸动态调控重组菌制备D-乳酸的方法，利用该重组菌，在25~50℃条件下分阶段发酵28~40 h，产D-乳酸水平以g/mL计达到12.5%~13.9%或以上；其先在发酵初期的6~15 h内，控制培养环境/营养因素，进行菌体的快速生长但不形成D-乳酸，然后在余下的发酵阶段，控制培养环境/营养因素，进行D-乳酸的快速合成；
所述控制培养环境/营养因素：控制培养温度：发酵初期的温度为25~36℃下利用葡萄糖进行菌体的快速生长；然后在余下的发酵阶段在37~50℃下利用葡萄糖快速合成D-乳酸且几乎不形成其它有机酸。
构建一种D-乳酸发酵和菌体生长能够进行动态调控的菌种并优化其发酵培养条件，在相应培养方法下，该菌种在25~50℃条件下分阶段发酵28~40h，产光学及化学纯度D-乳酸水平达到12.5%~13.9%(w/v)或以上。
进一步地，上述的D-乳酸高效制备工艺及其发酵生产菌种，其D-乳酸发酵生产菌种，先在25~36℃下利用葡萄糖快速生长，形成菌体但不形成D-乳酸，然后在37~50℃下菌体停止生产，让细胞利用葡萄糖快速合成D-乳酸且不形成其它有机酸。
更进一步地，所述D-乳酸高产重组菌，其基因组中D-乳酸脱氢酶编码基因ldhA的启动子被替换为培养条件可以控制其启动转录功能的启动子。
更进一步地，这类启动子可以是pH、温度、溶氧等控制型启动子，也可以是多种营养因素如乳糖、木糖、阿拉伯糖等控制型启动子。
更进一步地，本发明使用了温度调控型启动子p R-p L来控制和调节D-乳酸合成关键基因ldhA的转录启动。
更进一步地，本发明菌种在较低的温度下，如25~36℃，D-乳酸合成关键基因ldhA的转录被强烈抑制；而在较高温度下，如37~50℃，D-乳酸合成关键基因ldhA的转录被强烈启动。
更进一步地，上述的D-乳酸高效制备工艺及其发酵生产菌种，其中，在发酵初期的6~15 h内，培养温度控制在25~36℃，进行菌体的快速生长；在余下的发酵阶段，培养温度控制在37~50℃，进行D-乳酸的快速合成。
更进一步地，上述的D-乳酸高效制备工艺及其发酵生产菌种，其中，所述D-乳酸发酵生产重组菌，不限于肠杆菌，还包括具有类似D-乳酸合成能力的其他菌种，如凝结芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，酵母菌，乳杆菌，乳球菌，米根霉等等。
更进一步地，上述的动态调控D-乳酸合成过程，并不仅限于D-乳酸的合成。对于类似的有机酸，氨基酸，蛋白，糖、醇等多种重要的发酵产品具有同样的适用型，如L-乳酸，苹果酸，丁二酸，丙酮酸，各种酶等产物的合成。
本发明的突出的实质性特点和显著进步主要体现在：
1、本发明提供的重组菌具有明显的高产高光学纯度及高化学纯度的D-乳酸能力，菌种在25~50℃的条件下发酵28~40 h，产D-乳酸水平达到12.5%~13.9%(w/v)或以上；
2、本发明的D-乳酸高产菌，在乳酸发酵中，基本没有杂酸等副产物的合成，保障了D-乳酸的聚合级品质；
3、本发明的D-乳酸重组菌的发酵工艺技术：D-乳酸高产菌生长温度在25~36℃下利用葡萄糖快速生长，形成菌体；在37~50℃下利用葡萄糖快速合成D-乳酸，并几乎不形成其它有机酸。即：运用本发明的重组菌及其发酵工艺，D-乳酸的生产过程仅需改变发酵温度控制参数，即可实现以葡萄糖为原料高效合成D-乳酸。
生物材料样品保藏：一株产D-乳酸动态调控重组菌，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）B0013-070B，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2012071，保藏日期2012年3月9日。
附图说明
图1 重组质粒T-ldhAp::Kan-cI ts 857-p R -p L物理图谱。
图2 菌种B0013-070B的PCR鉴定电泳图谱；1. B0013-070 PCR产物；2. B0013-007B (B0013-070, ldhAp::kan-cI ts857-p R -p L) PCR产物；M. lambda DNA/Pst I marker。
图3 菌种B0013-070B ldhA基因上游区域示意图。
图4 重组菌种乳酸脱氢酶比活力的比较。
图5 菌种B0013-070B在7 L发酵罐中乳酸产量变化曲线；虚线表示将发酵液从好氧培养转化为限氧培养的时间。
图6 菌种B0013-070B在7 L发酵罐中副产物含量变化曲线，○: 乙酸; ▲: 琥珀酸; □: 丙酮酸. 虚线表示将发酵液从好氧培养转化为限氧培养的时间。
图7 五批次中试发酵过程中各产物的含量示例。
具体实施方式
本发明提供一种D-乳酸高效制备工艺及其发酵生产菌种，D-乳酸高产菌在25~36℃下利用葡萄糖快速生长形成菌体，然后在37~50℃下利用葡萄糖快速合成D-乳酸，并几乎不形成其它有机酸。其工艺特征是：25~50℃的条件下，发酵28~40h，产D-乳酸水平达到12.5%~13.9%(w/v)或以上。上述D-乳酸高效制备工艺及其发酵生产菌种，其基因组中D-乳酸脱氢酶编码基因ldhA的启动子被替换为温度调控型启动子p R-p L。
本发明涉及的具体方法有：
染色体基因整合技术：运用PCR（多聚酶链反应）从大肠杆菌基因组中扩增获得染色体目标整合位点的上游及下游各50-200bp基因序列。将目的整合表达基因与抗性基因进行连接，所获得的片段克隆入上述目标整合位点的上游和下游基因序列之间，形成目的基因整合序列，如ldhAp::kan-cI ts857-p R -p L。将此基因整合序列转化入大肠杆菌。在选择性培养基上选择培养出转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR对转化子的目的基因突变进行验证。
利用上述重组方法，按照以下步骤完成对动态调控D-乳酸重组菌的构建。
①研究菌种：大肠杆菌B0013-070（Zhou L. et al., Curr Microbiol, 2011, 62: 981~989）。
②利用基因整合技术，将步骤①所获得的出发菌种中的乳酸脱氢酶基因的启动子ldhAp替换为p R -p L启动子（Love C.A. et al., Gene, 1996, 176: 49~53），并获得重组菌种B0013-070B（B0013-070 ldhAp::kan-cI ts857-p R -p L）。
③将步骤②所获得的重组菌种在30°C和45°C、200 r/min进行摇瓶培养，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析乳酸脱氢酶比活性，鉴定p R -p L启动子功能。
④将步骤②所获得的重组菌种分别在25~36°C、200 r/min进行摇瓶培养，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、乳酸、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定菌体生长培养温度。
⑤将步骤②所获得的重组菌种在25~36°C、200 r/min好氧生长3~10 h，再进行37~45°C、200 r/min培养0~5 h，最后进行37~50°C静置培养发酵乳酸。
⑥同时菌种B0013-070和B0013-070B在25~36°C、200 r/min好氧生长3~10 h，再在37~45°C静置培养发酵乳酸，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定乳酸合成诱导时机。
⑦将步骤②所获得的重组菌种在7 L~30,000L发酵罐中进行乳酸发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。
下面以具体实例对本发明技术方案作进一步详细说明。
实施例1：温度调控型启动子对大肠杆菌染色体乳酸脱氢酶启动子的替换
用引物Ec-lA3-5和YldhA3 PCR扩增B0013-070染色体上的ldhA基因片段ldhA’，克隆入pMD18-T simple载体，获得重组质粒T-ldhA’。用引物PPL1和PPL2对质粒pPL451（Gene, 1996, 176: 49~53）进行反向PCR扩增，并与卡那霉素抗性基因片段（质粒pSKsymKm （Applied Microbiology and Biotechnology, 1999, 52: 820~828）用限制性内切酶，如SmaI进行酶切，胶回收966 bp片段）进行连接，获得重组质粒pPL-Kan。用引物PPL3和PPL4对质粒pPL-Kan进行PCR扩增，产物用限制性内切酶，如EcoRI和StuI进行双酶切，并与以T-ldhA’为模板用引物Ec-RlA1和Ec-RlA2进行反向PCR扩增并用限制性内切酶，如EcoRI进行酶切的产物连接，从而获得重组质粒T-ldhAp::kan-cI ts 857-p R -p L，其物理图谱如图1所示。将重组质粒T-ldhAp::kan-cI ts 857-p R -p L用限制性内切酶，如SalI进行酶切，并胶回收线性化质粒，用引物Ec-lA3-5和YldhA3进行PCR扩增，获得ldhAp::kan-cI ts 857-p R -p L基因片段。将该片段电转化菌种B0013-070，卡那霉素抗性平板上筛选转化子，提取其染色体用PCR进行验证。该突变菌种命名为B0013-070B（B0013-070 ldhAp::kan-cI ts 857-p R -p L），其PCR验证电泳图谱如图2所示。菌种B0013-070B ldhA基因上游区域结构如图3所示，可见残留的ldhAp启动子不能对其下游基因的表达产生作用。
实施例2：菌种B0013-070B中p R -p L启动子活性的确定
菌种B0013-070和B0013-070B分别在25~36°C和37~50°C进行培养2~10 h，其培养基为（g/L）：酵母膏15，蛋白胨0.5，无水MgSO4 0.25，葡萄糖5。并测定它们的乳酸脱氢酶（LDH）比酶活，典型的结果如图4所示。菌种B0013-070B在30°C仅产生极低量的LDH活性。在42°C培养，菌种B0013-070B的LDH活性是出发菌种B0013-070的2.2倍，足够进行乳酸合成。将菌种B0013-070在30°C培养的LDH比酶活值标定为100%，与此相比，该菌种在42°C生长时LDH酶活有所降低。说明通过温度的变化来控制菌种B0013-070B的p R-p L启动子有效地控制了ldhA基因的表达。
实施例3：7 L发酵罐中发酵葡萄糖生产乳酸
菌种B0013-070B在7 L发酵罐中进行乳酸发酵来检验温度调控的LDH表达在可控生产条件下的效果。菌种B0013-070B在25~36°C进行好氧培养至OD600值约为15~40，将发酵罐温度设定为37~50°C继续好氧培养0~120 min，再将通气量设为0~0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段发酵温度为37~50°C。其发酵培养基为（g/L）：酵母膏0~25，蛋白胨0~2.5，MgSO4 0~0. 5，CaCO3 0~175，pH 6.0~7.5。发酵过程中乳酸、副产物和菌体浓度如图5所示。
菌种B0013-070B好氧菌体转化率比菌种B0013-070的发酵罐发酵结果高9%，表明在好氧阶段成功将乳酸合成转换为菌体量的积累。最终发酵液中，乳酸产量高达122.8~126.7 g/L。仅产生不到1 g/L的乙酸、琥珀酸和丙酮酸副产物。菌种B0013-070B限氧阶段体积生产强度提高了40%~61%，限氧发酵阶段比产酸速率提高了40%~56%，整个发酵过程中乳酸体积生产强度提高了18%~32%。
实施例4：菌种30吨发酵罐中5批次发酵葡萄糖生产乳酸
将案例3中的发酵工艺放大至30吨规模。分批完成5次发酵试验。以满足葡萄糖和Ca(OH)2的连续补加为参考指标对发酵罐和流加罐进行选择，并按照工厂里的常规操作完成运行前发酵罐的准备工作。主发酵罐一个，葡萄糖补料罐一个，Ca(OH)2补料罐一个和种子罐一个。配置70%葡萄糖，加热溶解后，灭菌备用。配置25%Ca(OH)2溶液，灭菌后，搅拌备用。配置培养基，并灭菌，然后进行接种，开始发酵，25~36℃，通风180~340L/h搅拌0~600 r/min。每隔2个小时测定葡萄糖含量，至葡萄糖含量为1%~5%视作糖耗尽，停止通风，搅拌速度降至0~180 r/min，进入厌氧发酵，发酵温度提高为37~50℃。厌氧发酵38h后，停止补糖，待葡萄糖消耗至0.6 g/L以下后结束发酵。单批发酵结束，放罐后重新投料进行下批次的实消和接种发酵。陆续完成5批发酵试验。
综上所述，本发明通过基因工程技术对D-乳酸高产重组菌染色体上的乳酸脱氢酶编码基因的表达进行简易条件下的动态调控，从而实现了重组菌从葡萄糖高效单一生产D-乳酸的简洁发酵工艺。本发明技术经过简单修改后，同样可以用于其它工业上重要的微生物代谢产物，但不限于，如L-乳酸、乙酸、丙酮酸、丁二酸、苹果酸等多种有机酸；脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸；硫胺素、维生素B12等多种微生物；或，乙醇、丙醇等短链醇的菌种构建、发酵生产和新工艺技术的建立与应用。
表1：五批次30吨发酵试验结果
<160> 8
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Ec-lA3-5
<400> 1
TTA GTCGAC C AGCCCGAGCG TCATCAG；
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 22
<212> DNA
<213> YldhA3
<400> 2
GTTATTGAAA CCGGCACAGC GC
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 21
<212> DNA
<213> PPL1
<400> 3
AGCTTGGCTG CAGGTGATGA T
<210> SEQ ID NO: 4
<211> 21
<212> DNA
<213> PPL2
<400> 4
ATCGCCGGCA ATTCGTAATC A
<210> SEQ ID NO: 5
<211> 30
<212> DNA
<213> PPL3
<400> 5
CTT AGGCCT C CATGATTACG AATTGCCGGC;
<210> SEQ ID NO: 6
<211> 37
<212> DNA
<213> PPL4
<400> 6
TCC GAATTC A GTTAACCTCC TTAGGATCCC AATGCTT;
<210> SEQ ID NO: 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Ec-RlA1
<400> 7
TCC GAATTC A TGAAACTCGC CGTTTATAGC AC;
<210> SEQ ID NO: 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Ec-RlA2
<400> 8
CTTTCTCCAG TGATGTTGAA TC；
Claims (3)
1.一株产D-乳酸动态调控重组菌，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）B0013-070B，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012071。
2.根据权利要求1所述产D-乳酸动态调控重组菌，其特征在于：所述产D-乳酸动态调控重组菌，其基因组中乳酸脱氢酶基因启动子ldhAp被替换为培养环境/营养因素控制型启动子。
3.用权利要求1所述产D-乳酸动态调控重组菌制备D-乳酸的方法，其特征在于：利用该重组菌，在25~50℃条件下分阶段发酵28~40 h，产D-乳酸水平以g/mL计达到12.5%~13.9%；其先在发酵初期的6~15 h内，控制培养环境/营养因素，进行菌体的快速生长但不形成D-乳酸，然后在余下的发酵阶段，控制培养环境/营养因素，进行D-乳酸的快速合成； 所述控制培养环境/营养因素为控制培养温度：发酵初期的温度为25~36℃下利用葡萄糖进行菌体的快速生长；然后在余下的发酵阶段在37~50℃下利用葡萄糖快速合成D-乳酸且几乎不形成其它有机酸。
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| CN1560254A (zh) * | 2004-03-03 | 2005-01-05 | 南开大学 | L-乳酸脱氢酶基因、包括该基因的重组载体及其宿主细胞 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘鹏等.基因工程菌生产D-乳酸研究进展.《现代化工》.2010,第30卷(第10期),13-19. |
| 基因工程菌生产D-乳酸研究进展;刘鹏等;《现代化工》;20101031;第30卷(第10期);13-19 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102618478A (zh) | 2012-08-01 |
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