CN109370971A - 一株发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用，所述菌株分类命名为Escherichia coli △iclR，其保藏号为CCTCC NO：M 2018521。其构建过程主要包括敲除重组菌保藏号为CGMCC NO：2301中aceBAC操纵子的阻遏基因iclR，从而打开乙醛酸途径分流通量，充分利用发酵过程中积累的乙酸，以其为原料通过发酵获得富马酸，提高碳源的利用效率，从而进一步提高L‑天冬氨酸的产率。本发明还公布了该基因工程菌发酵制备L‑天冬氨酸的培养基和培养条件，实现了完全采用葡萄糖为原料发酵制备L‑天冬氨酸的路线，提高L‑天冬氨酸产率，绿色、环保，具有经济性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一株发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与运用。
背景技术
L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。
目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，而目前富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，L-天冬氨酸的制备仍然依赖化石资源。葡萄糖、木糖等单糖来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够通过发酵制备L-天冬氨酸的生产菌株具有重要的意义。国内全生物合成上述产品尚处于实验室研究阶段，其产业化实施经济性偏低，造成这一现状的主要问题包括：1）原料成本高；2）原料转化率低。
先期已获得了一株厌氧条件下能够利用葡萄糖发酵制备L-天冬氨酸的菌株，但产物浓度不高。因此通过基因工程改造菌株，使其能够充分利用碳源，减少流失，同时改进发酵培养过程，实现进一步提高糖类利用效率，加大目标产物的转化率具有显著意义。本发明基于此，公开了相关的技术。
发明内容
本发明要求解决的技术问题是，提供一株发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其分类命名为Escherichia coli △iclR，其保藏号为CCTCC NO：M 2018521。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法，敲除出发菌株乙醛酸途径aceBAC操纵子的阻遏基因iclR，得到所述基因工程菌，所述出发菌株的保藏号为CGMCC NO：2301，所述iclR基因序列如SEQ ID NO:1所示，基因的敲除采用通用的CRISPR/Cas9技术。具体构建及选育方法如下：
（1）以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为引物，质粒pTarget F为模板，PCR扩增得到线性片段1；
（2）将线性片段1用SpeI酶切后进行连接，并将连接后产物转化到感受态中，涂布大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（3）将阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTargetT1质粒；
（4）以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段2；以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段3；
（5）以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为引物，片段2和片段3的混合物为模板，重叠PCR扩增得到线性片段4；
（6）将pTarget T1质粒用EcoRI线性化后去磷酸化作为载体，与片段4进行吉布森一步克隆，用大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（7）将步骤（6）中的阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTarget T2质粒；
（8）将pCas质粒导入待基因编辑的大肠杆菌重组菌保藏号为CGMCC NO：2301，用卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（9）将步骤（8）中的阳性重组子用阿拉伯糖诱导，制备为感受态；
（10）将pTarget T2质粒导入步骤（9）的感受态中，用添加大观霉素和卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（11）将步骤（10）中的阳性重组子用PCR的方法进行鉴定，筛选出目的基因工程菌株。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用。
上述利用发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌株发酵产L-天冬氨酸的具体发酵培养过程如下：
(S1)将基因工程改造的大肠杆菌菌株转接到LB培养基中，有氧培养10～12h，得到一级种子液；
(S2)将一级种子液转接到发酵罐LB培养基中培养，得到二级种子液 ；
(S3)待二级种子液OD600至8.5时，再接种到发酵培养基，再接种到发酵培养基，所述发酵培养基的配方如下：
M9培养基：(NH4)2SO4 6g/L，Na2HPO4·12H2O 15.2g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl1g/L，MgSO4 2mM，CaCl2 0.1mM，100g/L葡萄糖。
步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35～37℃，步骤(S3)中采用有氧发酵模式，溶解氧为5～40％且发酵过程中温度为28~30℃，培养过程pH用氨水调节为7.0。
本发明的有益效果在于：本发明创新性地通过基因敲除的方式改良了原有发酵制备L-天冬氨酸的菌种，彻底摆脱了依赖于石油基富马酸的问题，针对之前有氧和厌氧发酵制备L-天冬氨酸存在的问题，重新设计路线，最终提高了L-天冬氨酸的收率和浓度，具有显著的经济性和社会效益，工艺路线绿色、环保。
本发明所述的生物材料，其分类命名为Escherichia coli △iclR，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M 2018521，保藏日期为：2018年08月03日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本实施例说明利用重叠PCR技术构建包含基因打靶序列和同源重组片段的目标质粒pTarget T2的方法。
1、以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为引物，质粒pTarget F为模板，PCR扩增得到线性片段1；
2、将线性片段1用SpeI酶切后进行连接，并将连接后产物转化到感受态中，涂布大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
3、将阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTarget T1质粒；
4、以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段2；以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段3；
5、以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为引物，片段2和片段3的混合物为模板，重叠PCR扩增得到线性片段4；
6、将pTarget T1质粒用EcoRI线性化后去磷酸化作为载体，与片段4进行吉布森一步克隆，用大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
7、将步骤6中的阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTarget T2质粒。
实施例2
本实施例说明利用阿拉伯糖诱导制备含cas9蛋白感受态的方法，具体步骤包括：
1、将pCas质粒导入待基因编辑的大肠杆菌重组菌保藏号为CGMCC NO：2301，用卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
2、将上述步骤中的阳性重组子用30mM的阿拉伯糖诱导，于30℃环境中摇菌培养3-4小时，OD值约0.4~0.6，制备为感受态。
实施例3
本实施例说明利用CRISPR/Cas9技术敲除亲本大肠杆菌aceBAC操纵子的阻遏基因iclR的过程。
1、将pTarget T2质粒导入含cas9蛋白感受态中，用添加大观霉素和卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
2、将上述中的阳性重组子用PCR的方法进行鉴定，筛选出目的基因工程菌株。
3、将步骤2中筛选出的阳性重组子转入添加了IPTG诱导的含卡那霉素的LB培养基中培养后，分别转点至含卡那霉素的LB培养基平板和同时含卡那霉素和大观霉素的LB培养基平板，筛选出已降解了pTarget T2质粒的重组菌株。
实施例4
本实施例说明采用有氧发酵提高L-天冬氨酸产量。具体步骤如下：
1、采用LB培养基按1～2％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2％(v/v)接种量接种至种子发酵罐(培养基也为LB)，培养4～6h后待菌体OD600至2 .5～4之间，按5～10％接种发酵培养基(M9培养基)；
2、种子培养过程温度控制在35～37℃，培养中不需调节pH。发酵过程采用有氧发酵模式，溶解氧为5～40％，发酵过程温度控制在28～30℃，培养过程pH用氨水控制在7 .0。发酵48小时候结果见表1。
表1 两种菌株发酵产L-天冬氨酸情况
| 菌株 | 发酵时间（h） | 葡萄糖消耗量（g/L） | L-天冬氨酸（g/L） |
| 出发菌株 | 48 | 41.5 | 21.7 |
| 重组菌株 | 48 | 42.1 | 25.0 |
从上表可见，发酵条件相同的情况下，重组菌株比出发菌株的L-天冬氨酸产量提高了15.2%。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
<130> xb18111309
<141> 2018-11-13
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtcgcac ccattcccgc gaaacgcggc agaaaacccg ccgttgccac cgcaccagcg 60
actggacagg ttcagtcttt aacgcgtggc ctgaaattac tggagtggat tgccgaatcc 120
aatggcagtg tggcactcac ggaactggcg caacaagccg ggttacccaa ttccacgacc 180
caccgcctgc taaccacgat gcaacagcag ggtttcgtgc gtcaggttgg cgaactggga 240
cattgggcaa tcggcgcaca tgcctttatg gtcggcagca gctttctcca gagccgtaat 300
ttgttagcga ttgttcaccc tatcctgcgc aatctaatgg aagagtctgg cgaaacggtc 360
aatatggcgg tgcttgatca aagcgatcac gaagcgatta ttatcgacca ggtacagtgt 420
acgcatctga tgcgaatgtc cgcgcctatc ggcggtaaat tgccgatgca cgcttccggt 480
gcgggtaaag cctttttagc ccaactgagc gaagaacagg tgacgaagct gctgcaccgc 540
aaagggttac atgcctatac ccacgcaacg ctggtgtctc ctgtgcattt aaaagaagat 600
ctcgcccaaa cgcgcaaacg gggttattca tttgacgatg aggaacatgc actggggcta 660
cgttgccttg cagcgtgtat tttcgatgag caccgtgaac cgtttgccgc aatttctatt 720
tccggaccga tttcacgtat taccgatgac cgcgtgaccg agtttggcgc gatggtgatt 780
aaagcggcga aggaagtgac gctggcgtac ggtggaatgc gctga 825
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgactagt attataccta ggactgag 28
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagactagt gtgcgtcagg ttggcgaact gttttagagc tagaaatagc aag 53
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcggtgctt tttttgaatt ctcgttcagt cgataactct gg 42
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attgcctctg cccgccagaa aaaggacagt ctcttttttc tgtatcgt 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgatacaga aaaaagagac tgtccttttt ctggcgggca gaggcaat 48
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggtcgact ctagagaatt cgatgtcttg aattttaact atcag 45
Claims (8)
1.一株发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其分类命名为Escherichia coli △iclR，其保藏号为CCTCC NO：M 2018521。
2.根据权利要求1 所述的发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，敲除出发菌株aceBAC操纵子的阻遏基因iclR，得到所述基因工程菌，所述出发菌株的保藏号为CGMCCNO：2301，所述iclR基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1 所述发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列为引物，质粒pTarget F为模板，PCR扩增得到线性片段1；
（2）将线性片段1用SpeI酶切后进行连接，并将连接后产物转化到感受态中，涂布大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（3）将阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTargetT1质粒；
（4）以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段2；以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到线性片段3；
（5）以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列为引物，片段2和片段3的混合物为模板，重叠PCR扩增得到线性片段4；
（6）将pTarget T1质粒用EcoRI线性化后去磷酸化作为载体，与片段4进行吉布森一步克隆，用大观霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（7）将步骤（6）中的阳性重组子接种于添加大观霉素的LB液培扩繁后进行质粒抽提，获得pTarget T2质粒；
（8）将pCas质粒导入保藏号为CGMCC NO：2301的出发菌株中，用卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（9）将步骤（8）中的阳性重组子用阿拉伯糖诱导，制备为感受态；
（10）将pTarget T2质粒导入步骤（9）的感受态中，用添加大观霉素和卡那霉素的LB平板筛选出阳性重组子；
（11）将步骤（10）中的阳性重组子用PCR的方法进行鉴定，筛选出目的基因工程菌株。
4.权利要求1所述发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的种子液培养过程如下：
(S1)将所述基因工程菌转接到LB培养基中，有氧培养10～12h，得到一级种子液；
(S2)将一级种子液转接到发酵罐LB培养基中培养，得到二级种子液 ；
(S3)待二级种子液OD600至8.5时，再接种到发酵培养基，所述发酵培养基的配方如下：
M9培养基：(NH4)2SO4 6g/L，Na2HPO4·12H2O 15.2g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl1g/L，MgSO4 2mM，CaCl2 0.1mM，100g/L葡萄糖。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35～37℃。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(S3)中，溶解氧控制在5～40％。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(S3)发酵过程中温度为28~30℃，培养过程pH用氨水调节为7.0。
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-
2018
- 2018-11-13 CN CN201811346790.3A patent/CN109370971A/zh active Pending
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