CN106536717A - 用于依赖蔗糖改善精细化学品产生的基因修饰微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种修饰的微生物，与其野生型相比，所述修饰的微生物具有‑减少的由ptsA‑基因编码的酶的活性，‑减少的由ptsH‑基因编码的酶的活性，或‑减少的由ptsA‑基因编码的酶的活性和减少的由ptsH‑基因编码的酶的活性，其中已经从中衍生修饰微生物的野生型属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)。本发明还涉及一种用于产生琥珀酸的方法并涉及修饰的微生物的用途。

Description

用于依赖蔗糖改善精细化学品产生的基因修饰微生物
本发明涉及修饰的微生物、涉及一种用于产生有机化合物的方法并涉及修饰的微生物的用途。
具有6个或更少碳的有机化合物如小型二羧酸是有商业意义的用途多样的化学品。例如，小型二酸类包括1,4-二酸类，如琥珀酸、苹果酸和酒石酸，和5-碳分子衣康酸。其他二酸类包括二碳草酸、三碳丙二酸、五碳戊二酸和六碳己二酸并且也存在这类二酸的许多衍生物。
作为一类，这些小型二酸具有某种化学相似性和它们在聚合物生产中的用途可以为树脂提供专化特性。这种多用性使其轻易契合下游化工基础设施市场。例如，1,4-二酸类分子满足大规模化学品马来酐的许多用途，在于它们转化成多种工业化学品(四氢呋喃，丁内酯，1,4-丁二醇，2-吡咯烷酮)和琥珀酸盐衍生物琥珀酰胺、琥珀腈、二氨基丁烷和琥珀酸酯。酒石酸在食品、皮革、金属和印刷行业具有众多用途。衣康酸形成生产3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO、甲基-THF和其他的原料。
尤其，琥珀酸或琥珀酸酯-这些术语在本文中互换使用-已经吸引巨大兴趣，因为已经在食品、化工和制药业中使用它作为许多工业上重要的化学品的前体。实际上，一份来自美国能源部的报告报道，琥珀酸是从生物质生产的前12大化学结构单元之一。因此，在细菌中制得二酸类的能力将具有明显的商业重要性。
WO-A-2009/024294公开了产生琥珀酸的细菌菌株，其属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)成员，最初从瘤胃分离并能够利用甘油作为碳源，和从中衍生的保留所述能力的变体和突变株，尤其，如保藏于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),亥姆霍兹7B,D-38124布伦瑞克，德国)的命名为DD1的细菌菌株，所述细菌菌株具有保藏编号DSM 18541(ID06-614)并且具有产生琥珀酸的能力。DD1-菌株属于物种Basfia succiniciproducens及巴斯德菌科，如依据Kuhnert等人,2010分类。WO-A-2010/092155中公开了对这些菌株的突变，其中已经破坏ldhA-基因和/或pflD-或pflA-基因，这些突变株的特征为：与WO-A-2009/024294中公开的DD1-野生型相比，在无氧条件下显著增加从碳源如甘油或甘油和糖(如麦芽糖)的混合物产生琥珀酸。
然而，基于生物的琥珀酸仍然面临以下挑战：在成本上针对基于石油化学的替代品变得有竞争力。为了发展基于生物的工业生产琥珀酸，在低成本培养基中培养细胞将是重要的，并且工作菌株应当最佳地能够代谢类型广泛的低成本糖原料以按照良好产率产生琥珀酸，从而可以使用最便宜的可用原料。
蔗糖(俗称为糖)是由葡萄糖和果糖组成的二糖，并且它是自然界中非常丰富并从具有光合作用能力的全部植物产生的碳源。尤其，甘蔗和糖用甜菜含有大量蔗糖，并且世界上超过60％的蔗糖目前产自甘蔗。特别地，蔗糖以十分低的成本生产，因为它可以通过蒸发/浓缩通过机械压榨甘蔗获得的提取物的简单工艺而工业产生。蔗糖作为通过微生物发酵用于产生化学化合物的原料因此是价廉的，并且它还发挥以下作用：保护细胞膜免受含有大量所需代谢物的外部环境影响，因此产生高浓度的所需代谢物，如Kilimann等人,(Biochimica et Biophysica Acta,1764,2006)所示。
即使蔗糖是具有上述优点(包括低价格和保护微生物免受外部环境影响的功能)的优异原料，这种碳源的缺点可以见于以下事实：众多微生物没有运输蔗糖至细胞中、降解运输的蔗糖并将降解产物与糖酵解联系的完整机制，并且因此不能利用蔗糖作为碳源。甚至在微生物具有能够利用蔗糖的机制情况下，它们也不能高效产生所需的代谢物，因为摄入和降解作为碳源的蔗糖的速率十分低下。
因此，本发明的一个目的是克服现有技术的缺点。
特别地，本发明的目的是提供可以用于发酵产生有机化合物如琥珀酸并且可以在不牺牲生长速率或产率的情况下高效利用蔗糖作为主要碳源的微生物。优选地，所述微生物将能够利用众多低成本碳源并产生优异产量的有机化合物如琥珀酸。与用于发酵产生琥珀酸的现有技术的重组微生物相比，本发明的微生物特征在于：细胞在生长期间依赖蔗糖作为主要碳源而琥珀酸产率增加和碳产率增加。
实现上述目标的贡献由一种修饰的微生物提供，所述修饰的微生物与其野生型相比具有
-减少的由ptsA-基因编码的酶的活性，
-减少的由ptsH-基因编码的酶的活性，或
-减少的由ptsA-基因编码的酶的活性和减少的由ptsH-基因编码的酶的活性，
其中已经从中衍生修饰微生物的野生型属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)。
实现上述目标的贡献特别由一种修饰的微生物提供，所述修饰的微生物已经使
-ptsA-基因或其部分，
-ptsH-基因或其部分，或
-ptsA-基因或其部分和ptsH-基因或其部分
缺失或其中这些基因或至少其部份的调节元件已经缺失或其中已经向这些基因引入至少一个突变，其中已经从中衍生修饰微生物的野生型属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)。
令人惊讶地，已经发现在属于巴斯德菌科的微生物中，例如通过缺失ptsA-基因或其部分和/或ptsH-基因或其部分而减少由ptsA-基因编码的酶的活性(这种酶是磷酸烯醇式丙酮酸-依赖性磷酸转移酶系统的能量偶联酶I)和/或减少由ptsH-基因编码的酶的活性(这种酶是磷酸烯醇式丙酮酸-依赖性磷酸转移酶系统的含有组氨酸的蛋白质HPr)，产生修饰的微生物，与其中这种酶或这些酶的活性尚未减少的相应微生物相比，所述修饰的微生物以增加的有机化合物(如琥珀酸)产量为特征，尤其如果这些修饰的微生物依赖蔗糖作为可同化碳源培育时如此。这的确令人惊讶，因为在属于巴斯德菌科的微生物中，如Basfia属的那些微生物，尤其物种Basfia succiniciproducens的那些微生物，磷酸烯醇式丙酮酸-依赖性磷酸转移酶系统(即，PTS-系统)负责摄取果糖至细胞中。当Basfia-菌株依赖蔗糖培养时，这种二糖在细胞内部水解以获得葡萄糖-6-磷酸和果糖。然而，果糖在水解后分泌并且由细胞使用果糖PTS-系统再次摄取。本领域技术人员将因此假定，当细胞依赖蔗糖作为主要碳源培养时，ptsA-基因和/或ptsH-基因的失活(其导致PTS-系统失活)将导致琥珀酸的形成减少，因为至少一部分的二糖(即果糖)不能输入细胞中。
在表述“与其野生型相比具有由x-基因编码的酶的减少活性的修饰微生物”(其中x-基因是ptsA-基因或ptsH-基因和任选地，如稍后所述是ldhA-基因、pflA-基因、pflD-基因、wcaJ-基因和/或pykA-基因)的上下文中，术语“野生型”指其中由x-基因编码的酶的活性尚未减少的微生物，即，指其基因组按照如引入x-基因的基因修饰之前的状态存在的微生物。优选地，表述“野生型”指其基因组、特别其x-基因按照因进化而天然生成的状态存在的微生物(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)。该术语用于完整的微生物并用于各个基因。因此，术语“野生型”优选地尤其不涵盖其基因序列已经至少部分地由人类借助重组方法修饰过的那些微生物或那些基因。术语“修饰的微生物”因此包括这样的微生物，所述微生物已经被遗传改变、修饰或工程化(例如，基因工程化)，从而如与衍生它的天然存在的野生型微生物相比，显示出改变、修饰或不同的基因型和/或表型(例如，当基因修饰影响微生物的编码性核酸序列时)。根据本发明的修饰微生物的具体的优选实施方案，修饰的微生物是重组微生物，其意指已经使用重组DNA获得该微生物。如本文所用的表述“重组DNA”指因利用实验室方法(分子克隆)以令来自多个来源的遗传物质在一起，产生否则在生物学生物中将不存的序列而产生的DNA序列。这种重组DNA的例子是已经向其中插入异源性DNA序列的质粒。
从中衍生本发明微生物的野生型属于巴斯德菌科。巴斯德菌科包含一个庞大科-革兰氏阴性变形菌门(Proteobacteria)，其成员范围从细菌如流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)至动物及人粘膜的共生物。大部分成员作为共生物生活在鸟和哺乳动物的粘膜表面上，特别地生活在上呼吸道中。巴斯德菌科细菌一般为杆状，并且是令人瞩目的一组兼性需氧厌氧菌。它们可以与相关的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌区别在于存在氧化酶，并且与大部分的其他相似细菌区别在于无鞭毛。巴斯德菌科中的细菌已经基于代谢特性和16S RNA和23S RNA序列划分成多个属。许多巴斯德菌科细菌含有丙酮酸-甲酸-裂合酶基因并且能够将碳源厌氧发酵成有机酸。
根据本发明修饰微生物的具体的优选实施方案，已经从中衍生该修饰微生物的野生型属于Basfia属并且特别优选已经从中衍生该修饰微生物的野生型属于Basfiasucciniciproducens物种。
最优选地，已经从中衍生本发明修饰微生物的野生型是根据布达佩斯条约已经在2006年8月11日保藏于德国DSMZ(德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH),Inhoffenstr.7B,D-38124布伦瑞克，德国)的Basfia succiniciproducens菌株DD1，其具有保藏编号DSM 18541。该菌株最初从德国起源的牛的瘤胃分离。巴氏杆菌属(Pasteurella)细菌可以从动物和优选地哺乳动物的胃肠道分离。细菌菌株DD1尤其可以从牛瘤胃分离并且能够利用甘油(包括粗制甘油)作为碳源。可以用于制备本发明修饰微生物的Basfia属其他菌株是从德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)按照DSM编号22022可商业获得的Basfia-菌株或者是已经在2009年2月27日保藏于瑞典哥德堡大学培养物保藏中心(CCUG，哥德堡大学，临床细菌学系，Guldhedsgatan 10、SE-413 46哥德堡)的具有保藏编号CCUG 57335、CCUG 57762、CCUG 57763、CCUG 57764、CCUG 57765or CCUG 57766的Basfia-菌株。该菌株最初从德国或瑞士起源的牛的瘤胃分离。
在这种情况下，特别优选已经从中衍生本发明修饰微生物的野生型具有SEQ IDNO:1的16S rDNA或显示与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列。还优选已经从中衍生本发明修饰微生物的野生型具有SEQ IDNO:2的23S rDNA或显示与SEQ ID NO:2具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列。
与待用于本发明修饰微生物的各种多肽或多核苷酸结合所提到的以百分数值计的同一性优选地计算为所比对序列的整个长度范围内的残基同一性，例如，采用以下默认参数，借助来自生物信息学软件包EMBOSS(第5.0.0版，http://emboss.source-forge.net/what/)的程序needle计算的同一性(对于相当相似的序列)：空位开口(空位开口罚分)：10.0；空位延伸(空位延伸罚分)：0.5和数据文件(软件包中包含的评分矩阵)：EDNAFUL。
应当指出，本发明的修饰微生物不能仅衍生自上文提到的野生型微生物，特别衍生自Basfia succiniciproducens菌株DD1，还衍生自这些菌株的变体。在这种情况下，表述“菌株的变体”包括具有与野生型菌株相同或基本上相同的特征的每个菌株。在这种情况下，特别优选该变体的16S rDNA与已经从其中衍生变体的野生型具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少99％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少99.8％和最优选地至少99.9％的同一性。还特别优选该变体的23SrDNA与已经从其中衍生变体的野生型具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少99％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少99.8％和最优选地至少99.9％的同一性。在这种定义的含义下，可以例如通过用化学诱变剂、X射线或紫外线处理野生型菌株获得菌株的变体。
本发明的修饰的微生物特征在于与其野生型相比，它具有减少的由ptsA-基因编码的酶的活性、减少的由ptsH-基因编码的酶的活性、或减少的由ptsH-基因编码的酶的活性和减少的由ptsH-基因编码的酶的活性。
酶活性减少(Δ活性)定义如下：
其中，当测定Δ活性时，野生型中的活性和修饰的微生物中的活性在完全相同的条件下测定。用于检测和测定由ptsA-基因和ptsH-基因编码的酶的活性的方法可以例如在Reizer等人,“Evidence for the presence of heat-stable protein(HPr)and ATP-dependent HPr kinase in heterofermentative lactobacilli lackingphosphoenolpyruvate:glycose phosphotransferase activity”；Proc.Nadl.Acad.Sci.USA；第85卷,第2041-2045页(1988)中找到。
本文公开的减少的酶活性、尤其减少的由ptsA-基因和/或ptsH-基因、ldhA-基因、pflA-基因、pflD-基因和/或wcaJ-基因编码的酶的活性可以是与微生物的野生型中所述酶的活性相比，酶活性减少至少50％、或酶活性减少至少90％或更优选地酶活性减少至少95％、或更优选地酶活性减少至少98％、或甚至更优选地酶活性减少至少99％或甚至更优选地酶活性减少至少99.9％。在pykA-基因的情况下，减少的活性优选地是与微生物的野生型中所述酶的活性相比，酶活性减少0.1至99％、或酶活性减少至少15％、或至少25％、或至少35％、或至少45％、或至少55％、或至少65％、或至少75％或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％。优选地，由pykA-基因编码的酶的活性减少处于15％至99％的范围内、更优选地50％至95％的范围内和甚至更优选地处于90％至99％的范围内。术语“减少的由x-基因编码的酶的活性”还可以涵盖没有这种具体酶的可检出活性的修饰微生物。
术语“减少的酶活性”例如包括该酶由所述基因操作(例如，基因工程)微生物按照比所述微生物野生型表达的水平更低的水平表达。减少酶表达的遗传操作可以包括，但不限于缺失编码该酶的基因或其部分、改变或修饰与表达编码该酶的基因结合的调节序列或位点(例如，通过移除强启动子或阻遏型启动子)、修饰参与编码酶的基因的转录和/或基因产物翻译的蛋白质(例如，调节蛋白、阻抑蛋白、增强蛋白、转录激活蛋白等)或本领域常规的减少特定基因表达的任何其他常规手段(包括但不限于，使用敲除或阻断靶蛋白表达的反义核酸分子或其他方法)。另外，可以将去稳定化元件引入mRNA中或引入导致RNA的核糖体结合位点(RBS)劣化的基因修饰。还可能以某种方式改变基因的密码子选择，从而降低翻译效率和速度。
也可以通过引入导致酶活性减少的一个或多个基因突变，获得减少的酶活性。另外，减少酶活性还可以包括失活下述活化的酶(或减少其表达)，所述活化酶是激活待减少其活性的酶必需的。通过后一种方案，优选地保持待减少其活性的酶处于失活状态。
由ptsA-基因和/或ptsH-基因编码的酶活性减少的微生物可以天然地存在，即因自发性突变产生。可以通过多种技术(如化学处理或辐射)修饰某微生物以缺少或具有显著减少的由ptsA-基因和/或ptsH-基因基因编码的酶的活性。为此目的，微生物将例如受化学诱变剂、X射线或紫外线处理。在后续步骤中，将选出这些微生物，所述微生物具有减少的由ptsA-基因和/或由ptsH-基因编码的酶的活性。修饰的微生物还通过同源重组技术可获得，所述同源重组技术旨在突变、破坏或切除该微生物基因组中的ptsA-基因和/或ptsH-基因或旨在将该基因置换为编码下述酶的相应基因，其中所述酶与野生型基因编码的酶相比，具有减少的活性。
根据本发明修饰微生物的一个优选实施方案，分别通过修饰ptsA-基因和ptsH-基因实现减少的由ptsA-基因和/或由ptsH-基因编码的酶的活性，其中优选地通过缺失ptsA-基因和/或ptsH-基因或这些基因的至少部份、缺失ptsA-基因和/或ptsH-基因的调节元件或这些调节元件的部份如启动子序列、或通过向ptsA-基因和/或向ptsH-基因引入至少一个突变，实现这种基因修饰。
在下文中，描述一项用于重组、尤其用于引入突变或用于缺失序列的合适技术。
这项技术在本文中有时也称作“坎贝尔重组”(Leenhouts等人,Appl EnvMicrobiol.(1989),第55卷,第394-400页)。如本文所用，“坎贝尔进入”指原始宿主细胞的转化体，在所述转化体中，完整环状双链DNA分子(例如质粒)已经通过单个同源重组事件(交叉进入事件)整合入染色体，并且所述转化体有效地导致线性化形式的所述环状DNA分子插入染色体的第一DNA序列，所述第一DNA序列与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源。“坎贝尔化进入”指已经整合至“坎贝尔进入”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“坎贝尔进入”含有第一同源性DNA序列的重复，所述第一同源性DNA序列的每个副本包括同源重组交换点副本并且包围该副本。
如本文中所用，“坎贝尔离开”指从“坎贝尔进入”转化体遗传的细胞，在所述细胞中，其中第二同源重组事件(交叉离开事件)已经在“坎贝尔进入”DNA的插入的线性化DNA上所含有的第二DNA序列和与所述线性化插入物的第二DNA序列同源的染色体源第二DNA序列之间发生，第二重组事件导致整合的DNA序列的一部分缺失(丢弃)，但是，重要的，还导致整合型坎贝尔化DNA的一部分(这可以小至单个碱基)留在染色体中，从而与原始宿主细胞相比，“坎贝尔离开”细胞在染色体中含有一个或多个刻意变化(例如，单碱基置换、多碱基置换、插入异源基因或DNA序列，插入同源基因或修饰的同源基因的一个额外拷贝或多个拷贝，或插入包含上文所列的前述这些例子中超过一个例子的DNA序列)。优选地通过对基因反向选择获得“坎贝尔离开”细胞，所述基因包含于“坎贝尔进入”DNA序列的下述部分(需要抛弃的部分)中，(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)sacB-基因)，其在约5％至10％蔗糖存在下培育的细胞中表达时有致死性。借助或不借助反向选择，可以通过使用任何可筛选表型如，但不限于菌落形态、菌落颜色、抗生素耐药性的存在或不存在、借助聚合酶链反应判断给定DNA序列的存在或不存在、某种营养缺陷型的存在或不存在、某种酶的存在或不存在、菌落核酸杂交、抗体筛选法等筛选所需细胞，获得或鉴定所需的“坎贝尔离开”细胞。术语“坎贝尔进入”和“坎贝尔离开”也可以用作各种时态的动词以指称上文所述的方法或过程。
可以理解，导致“坎贝尔进入”或“坎贝尔离开”的同源重组事件可以在同源性DNA序列内部的某个DNA范围内发生，并且由于同源序列将相对于这个范围的至少部分是彼此相同的，所以通常不可能确切指定交换事件在何处发生。换句话说，不可能确切指出哪个序列最初来自插入的DNA并且哪个序列最初来自染色体DNA。另外，第一同源性DNA序列和第二同源性DNA序列通常由一个部分非同源区域隔开，并且正是这个非同源区域仍安置在“坎贝尔离开”细胞的染色体中。
优选地，第一和第二同源性DNA序列长至少约200碱基对，并且可以长达几千碱基对。然而，可以用更短或更长的序列实施该过程。例如，第一和第二同源序列的长度可以是约500个至2000个碱基，并且通过设置第一和第二同源序列具有大致相同的长度、优选地具有少于200碱基对的差异并且最优选地二者中较短者在碱基对长度上是较长者的至少70％，促进从“坎贝尔进入”获得“坎贝尔离开”。
本发明的修饰微生物中其活性减少的ptsA-基因优选地包含选自以下的核酸：
a1)具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核酸；
b1)编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列的核酸；
c1)与a1)或b1)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性的核酸，同一性是在a1)或b1)的核酸总长度范围内的同一性；
d1)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性，同一性是在a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
e1)能够在严格条件下与根据a1)或b1)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
f1)编码与a1)或b1)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文a1)或b1)的核酸不同的核酸。
本发明的修饰微生物中其活性减少的ptsH-基因优选地包含选自以下的核酸：
a2)具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸；
b2)编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的核酸；
c2)与a2)或b2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性的核酸，同一性是在a2)或b2)的核酸总长度范围内的同一性；
d2)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性，同一性是在a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
e2)能够在严格条件下与根据a2)或b2)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
f2)编码与a2)或b2)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文a2)或b2)的核酸不同的核酸。
如本文中所用，术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基配对作用与互补链结合的任意过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,NewYork)。杂交和杂交的强度(即，核酸分子之间结合的强度)受此类因素影响，如核酸分子之间的互补性程度、所涉及条件的严格性、所形成杂合体的Tm和核酸分子内部的G:C比。
如本文中所用，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离成单链的温度。用于计算核酸分子的Tm的等式是本领域熟知的。如标准参考文献所示，当核酸分子处于1M NaCl的水溶液中时，可以通过等式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算来进行Tm值的简单估计(见例如，Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,inNucleic Acid Hybridization(1985))。其他参考文献包括更复杂计算法，这些算法考虑了结构特征及序列特征以计算Tm。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。
特别地，术语“严格性条件”指这些条件，其中作为互补核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或与之相同的100个或更多个连续核苷酸、150个或更多个连续核苷酸、200个或更多个连续核苷酸或250个或更多个连续核苷酸在等同于在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交同时在50℃或65℃、优选地在65℃于2×SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下与特定核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)杂交。优选地，该杂交条件等同于在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，同时在50℃或65℃、优选地65℃于1×SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选地，该杂交条件等同于在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，同时在50℃或65℃、优选地在65℃于0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。优选地，互补核苷酸与wcaJ核酸的片段或完整wcaJ核酸杂交。备选地，优选的杂交条件涵盖在65℃在1×SSC中或在42℃在1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃在0.3×SSC中洗涤或在50℃在4×SSC中或在40℃在6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃在2×SSC中洗涤。其他优选的杂交条件是0.1％SDS、0.1SSD和65℃。
可以通过上文提到的“坎贝尔重组”缺失或其中通过上文提到的“坎贝尔重组”引入至少一个突变的ptsA-基因和/或ptsH-基因或这些基因的部分优选地包含如上文定义的核酸。
具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸对应于Basfiasucciniciproducens-菌株DD1的ptsA-基因和ptsH-基因。
根据本发明修饰微生物的又一个优选的实施方案，这种微生物不仅特征在于减少的由ptsA-基因和/或ptsH-基因编码的酶的活性，而且与野生型相比，还特征在于至少一种以下特性：
i)减少的丙酮酸甲酸裂合酶活性；
ii)减少的乳酸脱氢酶活性；
iii)减少的由wcaJ-基因编码的酶的活性，
iv)减少的由pykA-基因编码的酶的活性，
在这种情况下，特别优选修饰的微生物是具有以下特性或特性组合的那些：i)、ii)、iii)、iv)、i)ii)、i)iii)、i)iv)、ii)iii)、ii)iv)、iii)iv)、i)ii)iii)、i)ii)iv)、i)iii)iv)、ii)iii)iv)和i)ii)iii)iv)，其中最优选以特性i)、ii)、iii)和iv)为特征的修饰微生物。
存在乳酸脱氢酶缺陷或存在丙酮酸甲酸裂合酶活性缺陷的修饰微生物在WO-A-2010/092155、US 2010/0159543和WO-A-2005/052135中公开，其中就减少微生物中、优选地巴氏杆菌属细菌细胞中、特别优选地Basfia succiniciproducens菌株DD1中乳酸脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性的不同方法而言，通过引用方式并入本文所述文献的公开内容。用于确定丙酮酸甲酸裂合酶活性的方法例如由Asanuma N.和Hino T.在“Effects ofpH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase inStreptococcus bovis”,Appl.Environ.Microbiol.(2000),第66卷,第3773-3777页中公开，并且用于确定乳酸脱氢酶活性的方法例如由H.U.,Bergmeyer J.和Grassl,M.(1983-1986)在“Methods of Enzymatic Analysis”,第3版,第III卷,第126-133页,VerlagChemie,Weinheim中公开。
在这种情况下，优选通过失活ldhA-基因(其编码乳酸脱氢酶；LdhA；EC 1.1.1.27或EC 1.1.1.28)实现乳酸脱氢酶活性的减少并且通过失活pflA-基因(其编码丙酮酸甲酸裂合酶的激活蛋白；PflA；EC 1.97.1.4)或pflD-基因(其编码丙酮酸甲酸裂合酶；PflD；EC2.3.1.54)实现丙酮酸甲酸裂合酶活性的减少，其中优选地通过以下方式实现这些基因(即ldhA、pflA和pflD)的失活：缺失这些基因或其部分、缺失这些基因的调节元件或至少其部份或向这些基因引入至少一个突变，尤其优选地借助如上文所述的“坎贝尔重组”进行。
优选地通过修饰wcaJ-基因，实现减少的由wcaJ-基因编码的酶的活性，其中优选地通过缺失wcaJ-基因或至少其部份、缺失wcaJ-基因的调节元件或至少其部份如启动子序列、或通过向wcaJ-基因引入至少一个突变，实现这种基因修饰。在向wcaJ-基因引入至少一个突变的情况下，特别优选至少一个突变导致由wcaJ-基因编码的截短型酶表达。进一步优选在截短型酶中，由wcaJ-基因编码的野生型酶的至少100个氨基酸、优选地至少125个氨基酸、更优选地至少150个氨基酸和最优选地至少160个氨基酸从C末端缺失。wcaJ-基因编码的这种截短型酶可以例如通过以下方式获得：在wcaJ-基因内部的适宜位置插入或缺失导致移码突变的核苷酸，其中借助这种移码突变引入终止密码子。例如，在编码赖氨酸的密码子中位置81处的胸腺嘧啶和位置82处的腺嘌呤之间插入核苷酸导致移码突变，借助所述移码突变，引入如SEQ ID NO:13中所示的终止密码子。可以引入wcaJ-基因的这类突变，例如，通过位点定向诱变或随机诱变引入，随后将修饰的基因通过重组引入微生物的基因组中。可以通过借助PCR突变wcaJ-基因序列SEQ ID NO:13，产生wcaJ-基因的变体。“快速改变位点定向诱变试剂盒”(Stratagene)可以用来实施定向诱变。可以借助“GeneMorph II随机诱变试剂盒”(Stratagene)在SEQ ID NO:13的整个编码序列范围内或另外仅在其部份范围内进行随机诱变。
优选地通过向pykA-基因引入、优选地向野生型-pykA-基因引入至少一个突变，实现减少由pykA-基因编码的酶的活性。在这种情况下，特别优选至少一个突变导致修饰pykA-基因的核酸序列，从而由修饰的基因编码的酶的氨基酸序列与野生型pykA-基因编码的酶的氨基酸序列差异至少一个氨基酸。可以向pykA-基因引入突变，例如，通过位点定向诱变或随机诱变引入，随后将修饰的基因通过重组引入微生物的基因组中。可以通过借助PCR突变基因序列SEQ ID NO:15，产生pykA-基因的变体。“快速改变位点定向诱变试剂盒”(Stratagene)可以用来实施定向诱变。可以借助“GeneMorph II随机诱变试剂盒”(Stratagene)在SEQ ID NO:15的整个编码序列范围内或另外仅在其部份范围内进行随机诱变。通过所用模板DNA的量，将诱变率设定至所需的突变量。通过各个突变的定向组合或通过依次执行几次诱变循环，生成多突变。
本发明的修饰微生物中其活性可以减少的ldhA-基因优选地包含选自以下的核酸：
α1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的核酸；
α2)编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的核酸；
α3)与α1)或α2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性的核酸，同一性是在α1)或α2)的核酸总长度范围内的同一性；
α4)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与α1)或α2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性，同一性是在α1)或α2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
α5)能够在严格条件下与根据α1)或α2)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
α6)编码与α1)或α2)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文α1)或α2)的核酸不同的核酸。
具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的核酸对应于Basfia succiniciproducens-菌株DD1的ldh-基因。
本发明的修饰微生物中其活性可以减少的pflA-基因优选地包含选自以下的核酸：
β1)具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的核酸；
β2)编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列的核酸；
β3)与β1)或β2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性的核酸，同一性是在β1)或β2)的核酸总长度范围内的同一性；
β4)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与β1)或β2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性，同一性是在β1)或β2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
β5)能够在严格条件下与根据β1)或β2)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
β6)编码与β1)或β2)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文β1)或β2)的核酸不同的核酸。
具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的核酸对应于Basfia succiniciproducens-菌株DD1的pflA-基因。
本发明的修饰微生物中其活性可以减少的pflD-基因优选地包含选自以下的核酸：
γ1)具有SEQ ID NO:11的核苷酸序列的核酸；
γ2)编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列的核酸；
γ3)与γ1)或γ2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％与的同一性的核酸，同一性是在γ1)或γ2)的核酸总长度范围内的同一性；
γ4)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与γ1)或γ2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性，同一性是在γ1)或γ2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
γ5)能够在严格条件下与根据γ1)或γ2)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
γ6)编码与γ1)或γ2)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文γ1)或γ2)的核酸不同的核酸。
具有SEQ ID NO:11的核苷酸序列的核酸对应于Basfia succiniciproducens-菌株DD1的pflD-基因。
本发明的修饰微生物中其活性可以减少的wcaJ-基因优选地包含选自以下的核酸：
δ1)具有SEQ ID NO:13的核苷酸序列的核酸；
δ2)编码SEQ ID NO:14的氨基酸序列的核酸；
δ3)与δ1)或δ2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性的核酸，同一性是在δ1)或δ2)的核酸总长度范围内的同一性；
δ4)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与δ1)或δ2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性，同一性是在δ1)或δ2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
δ5)能够在严格条件下与根据δ1)或δ2)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
δ6)编码与δ1)或δ2)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文δ1)或δ2)的核酸不同的核酸。
具有SEQ ID NO:13的核苷酸序列的核酸对应于Basfia succiniciproducens-菌株DD1的wcaJ-基因。
本发明的修饰微生物中其活性可以减少的pykA-基因优选地包含选自以下的核酸：
ε1)具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的核酸；
ε2)编码SEQ ID NO:16的氨基酸序列的核酸；
ε3)与ε1)或ε2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性的核酸，同一性是在ε1)或ε2)的核酸总长度范围内的同一性；
ε4)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与ε1)或ε2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最优选地100％的同一性，同一性是在ε1)或ε2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
ε5)能够在严格条件下与根据ε1)或ε2)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
ε6)编码与ε1)或ε2)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文ε1)或ε2)的核酸不同的核酸。
具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的核酸对应于Basfia succiniciproducens-菌株DD1的pykA-基因。
在这种情况下，优选本发明的修饰微生物包含以下基因修饰A)至E)中的至少一种：
A)ldhA-基因或至少其部份的缺失、ldhA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向ldhA-基因引入至少一个突变；
B)pflD-基因或至少其部份的缺失、pflD-基因调节元件或至少其部份的缺失或向pflD-基因引入至少一个突变；
或
pflA-基因或至少其部份的缺失、pflA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向pflA-基因引入至少一个突变；
C)wcaJ-基因或至少其部份的缺失、wcaJ-基因调节元件或至少其部份的缺失或向wcaJ-基因引入至少一个突变；
D)pykA-基因或至少其部份的缺失、pykA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向pykA-基因引入至少一个突变，所述突变导致减少pykA-基因编码的酶的活性；
E)ptsA-基因或至少其部份的缺失、ptsA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向ptsA-基因引入至少一个突变；
和/或
ptsH-基因或至少其部份的缺失、ptsH-基因调节元件或至少其部份的缺失或向ptsH-基因引入至少一个突变。
在这种情况下，特别优选修饰的微生物是具有以下特性或特性组合的那些：A)、B)、C)、D)、E)、A)B)、A)C)、A)D)A)E)、B)C)、B)D)、B)E)、C)D)、C)E)、D)E)、A)B)C)、A)B)D)、A)B)E)、A)C)D)、A)C)E)、A)D)E)、B)C)D)、B)C)E)、B)D)E)、C)D)E)、A)B)C)D)、A)B)C)E)、A)B)D)E)、A)C)D)E、B)C)D)E)和A)B)C)D)E)，其中最优选以特性A)、B)、C)、D)和E)为特征的修饰微生物。
根据本发明的修饰微生物的第一特别优选实施方案，微生物包含以下基因修饰A)至E)：
A)ldhA-基因或至少其部份的缺失；
B)pflA-基因或至少其部份的缺失或pflD-基因或至少其部份的缺失；
C)向wcaJ-基因引入至少一个突变，所述突变导致由wcaJ-基因编码的截短型酶表达；
D)向pykA-基因引入至少一个突变，所述突变导致减少pykA-基因编码的酶的活性；和
E)ptsA-基因或至少其部份的缺失。
根据本发明的修饰微生物的第二特别优选实施方案，微生物包含以下基因修饰A)至E)：
A)ldhA-基因或至少其部份的缺失；
B)pflA-基因或至少其部份的缺失或pflD-基因或至少其部份的缺失；
C)向wcaJ-基因引入至少一个突变，所述突变导致由wcaJ-基因编码的截短型酶表达；
D)向pykA-基因引入至少一个突变，所述突变导致减少的pykA-基因编码的酶的活性；和
E)ptsH-基因或至少其部份的缺失。
本发明的修饰微生物的具体的优选实施方案是：
-巴斯德菌科、尤其优选地Basfia属和甚至更优选地物种Basfiasucciniciproducens的修饰的细胞细菌，
--其中已经减少、优选地通过缺失ptsA-基因、尤其通过修饰具有根据SEQ ID NO:3的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列的酶的ptsA-基因减少由ptsA-基因编码的酶的活性；
--其中减少乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，优选地通过修饰ldhA-基因和pflA-基因、尤其通过修饰下述ldhA-基因和通过修饰下述pflA-基因减少乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，所述ldhA-基因具有根据SEQ ID NO:7的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LdhA，所述pflA-基因具有根据SEQ ID NO:9的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列的PflA，或通过修饰ldhA-基因或pflD-基因、尤其通过修饰下述ldhA-基因和通过修饰下述pflD-基因减少乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，所述ldhA-基因具有根据SEQ ID NO:7的核酸序列并且编码具有根据SEQ IDNO:8的氨基酸序列的LdhA，所述pflD-基因具有根据SEQ ID NO:11的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列的PflD；
--其中wcaJ-基因或至少其部份已经缺失或其中已经在wcaJ-基因中、尤其在下述wcaJ-基因中引入至少一个突变，所述wcaJ-基因具有根据SEQ ID NO:13的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列的蛋白质，其中引入至少一个突变优选地导致酶的表达，在所述酶中，从C末端缺失由wcaJ-基因编码的野生型酶的至少100个氨基酸、优选地至少125个氨基酸、更优选地至少150个氨基酸和最优选地至少160个氨基酸。
和
--其中已经在pykA-基因中、尤其在下述pykA-基因中引入至少一个突变，所述pykA-基因具有根据SEQ ID NO:15的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列的蛋白质，优选地引入导致置换由pykA-基因所编码酶的至少一个氨基酸的至少一个突变，最优选地引入这样的突变，所述突变至少在pykA-基因编码的酶中导致在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换或在位置417处半胱氨酸由酪氨酸置换或在位置171处丙氨酸由甘氨酸置换、或在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换和在417位置处半胱氨酸由酪氨酸置换、或在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换和在位置171处丙氨酸由甘氨酸置换、或在位置417处半胱氨酸由酪氨酸置换和在位置171处丙氨酸由甘氨酸置换、或在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换、在位置417处半胱氨酸由酪氨酸置换和在171位置处丙氨酸由甘氨酸置换。
-巴斯德菌科、尤其优选地Basfia属和甚至更优选地物种Basfiasucciniciproducens的修饰的细胞细菌，
--其中已经减少、优选地通过缺失ptsH-基因、尤其通过修饰下述ptsH-基因减少由ptsH-基因编码的酶的活性，所述ptsH-基因具有根据SEQ ID NO:5的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列的酶；
--其中减少乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，优选地通过修饰ldhA-基因和pflA-基因、尤其通过修饰下述ldhA-基因和通过修饰下述pflA-基因减少乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，所述ldhA-基因具有根据SEQ ID NO:7的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LdhA，所述pflA-基因具有根据SEQ ID NO:9的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列的PflA，或通过修饰ldhA-基因或pflD-基因、尤其通过修饰下述ldhA-基因和通过修饰下述pflD-基因减少乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，所述ldhA-基因具有根据SEQ ID NO:7的核酸序列并且编码具有根据SEQ IDNO:8的氨基酸序列的LdhA，所述pflD-基因具有根据SEQ ID NO:11的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:12的氨基酸序列的PflD；
--其中wcaJ-基因或至少其部份已经缺失或其中已经在wcaJ-基因中、尤其在下述wcaJ-基因中引入至少一个突变，所述wcaJ-基因具有根据SEQ ID NO:13的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列的蛋白质，其中引入至少一个突变优选地导致酶的表达，在所述酶中，从C末端缺失由wcaJ-基因编码的野生型酶的至少100个氨基酸、优选地至少125个氨基酸、更优选地至少150个氨基酸和最优选地至少160个氨基酸。
和
--其中已经在pykA-基因中、尤其在下述pykA-基因中引入至少一个突变，所述pykA-基因具有根据SEQ ID NO:15的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列的蛋白质，优选地引入导致置换由pykA-基因所编码酶的至少一个氨基酸的至少一个突变，最优选地引入这样的突变，所述突变至少在pykA-基因编码的酶中导致在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换或在位置417处半胱氨酸由酪氨酸置换或在位置171处丙氨酸由甘氨酸置换、或在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换和在417位置处半胱氨酸由酪氨酸置换、或在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换和在位置171处丙氨酸由甘氨酸置换、或在位置417处半胱氨酸由酪氨酸置换和在位置171处丙氨酸由甘氨酸置换、或在位置167处甘氨酸由半胱氨酸置换、在位置417处半胱氨酸由酪氨酸置换和在171位置处丙氨酸由甘氨酸置换。
进一步通过产生有机化合物的方法提供解决一开始所提到问题的促进手段，所述方法包括：
I)在包含至少一种可同化碳源以允许修饰的微生物产生有机化合物的培养基中培育本发明的修饰微生物，因而获得包含有机化合物的发酵液；
II)从过程步骤I)中获得的发酵液回收有机化合物。
在过程步骤I)中，将本发明的修饰微生物在包含至少一种可同化碳源以允许修饰的微生物产生有机化合物的培养基中培育，因而获得包含有机化合物的发酵液。可以通过本发明方法产生的优选有机化合物包括羧酸如甲酸、乳酸、丙酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或这些羧酸的盐、二羧酸如丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或盐其，三羧酸如柠檬酸或其盐，醇如甲醇或乙醇、氨基酸如L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-异亮氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酰胺，L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸等。
根据本发明方法的一个优选实施方案，有机化合物是琥珀酸。如本发明上下文中所用，术语“琥珀酸”应当以其最广意义理解并且还涵盖其盐(即，琥珀酸盐)，例如碱金属盐，如Na+盐和K+盐，或碱土金属盐，如Mg2+盐和Ca2+盐，或琥珀酸的铵盐或酐。
优选地在培养基中在约10℃至60℃或20℃至50℃或30℃至45℃范围内的温度在5.0至9.0或5.5至8.0或6.0至7.0的pH孵育本发明的修饰微生物。
优选地，在无氧条件下产生有机化合物，尤其琥珀酸。可以借助常规技术建立厌氧条件，例如通过使反应介质组分脱气并且通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm流速引入二氧化碳或氮气或其混合物和任选地氢，维持厌氧条件。可以借助常规技术建立需氧条件，例如通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm流速引入空气或氧气。根据需要，可以在过程中应用0.1至1.5巴的略微较高压力。
可同化碳源优选地选自蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甘油及其混合物或含有至少一种所述化合物的组合物，或选自淀粉、纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的分解产物。优选的可同化碳源是蔗糖。其他优选的混合物是蔗糖和至少一种其他可同化碳源的混合物，如蔗糖和麦芽糖、蔗糖和D-果糖、蔗糖和D-葡萄糖、蔗糖和D-木糖、蔗糖和L-阿拉伯糖、蔗糖和D-半乳糖、蔗糖和D-甘露糖的混合物。
根据本发明方法的一个优选实施方案，基于可同化碳源(二氧化碳例外)的总重量，至少50wt.％、优选地至少75wt.％、更优选地至少90wt.％、甚至更优选地至少95wt.％和最优选地至少99wt.％的可同化碳源是蔗糖。
将可同化碳源的初始浓度调节至、优选地将蔗糖的初始浓度调节至5至100g/l、优选地5至75g/l和更优选地5至50g/l范围内的值，并且可以在培养期间维持所述初始浓度处于所述范围内。反应介质的pH可以通过添加合适的碱控制，所述碱例如是氨气、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果发酵过程期间形成的有机化合物是羧酸或二羧酸，则尤其需要这些碱性中和剂。在作为有机化合物的琥珀酸情况下，Mg(OH)2是特定优选的碱。
本发明的发酵步骤I)可以例如在搅拌式发酵罐、鼓泡塔和环流反应器中进行。可以在Chmiel:“Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,第1卷"中找到可能方法类型的综合概览，包括搅拌器类型和几何设计。在本发明的方法中，可用的常见变例是本领域技术人员(例如在Chmiel,Hammes and Bailey:“BiochemicalEngineering”中)已知或解释的以下变体，如分批发酵、补料分批、重复补料分批或另外伴随或不伴随生物质再循环的连续发酵。取决于生产菌株，可以用空气、氧、二氧化碳、氢气、氮气或适宜气体混合物实现通气，以实现良好产量(YP/S)。
在过程步骤I)中产生有机酸、尤其琥珀酸的特别优选条件是：
在过程步骤I)中进一步优选，可同化碳源(优选地蔗糖)，转化成有机化合物，优选地转化成琥珀酸，其中碳产率YP/S是至少0.5g/g直至约1.18g/g；例如碳产量YP/S为至少0.6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g或至少1.1g/g(有机化合物/碳，优选地琥珀酸/碳)。
在过程步骤I)中还优选，可同化碳源(优选地蔗糖)，转化成有机化合物，优选地转化成琥珀酸，其中比生产率产量是至少0.6g g DCW-1h-1有机化合物，优选地琥珀酸，或是至少0.65g g DCW-1h-1、至少0.7g g DCW-1h-1、至少0.75g g DCW-1h-1或至少0.77g g DCW-1h-1有机化合物，优选地琥珀酸。
在过程步骤I)中还优选，可同化碳源(优选地蔗糖)，转化成有机化合物，优选地转化成琥珀酸，有机化合物、优选地琥珀酸的空间时间产率是至少2.2g/(L×h)或至少2.5g/(L×h)、至少2.75g/(L×h)、至少3g/(L×h)、至少3.25g/(L×h)、至少3.5g/(L×h)、至少3.7g/(L×h)、至少4.0g/(L×h)、至少4.5g/(L×h)或至少5.0g/(L×h)有机化合物，优选地琥珀酸。根据另本发明方法的一个优选实施方案，在工艺步骤I)中修饰的微生物将至少20g/L，更优选地至少25g/l和甚至更优选地至少30g/l的可同化碳源、优选地蔗糖转化成至少20g/l、更优选地至少25g/l和甚至更优选地至少30g/l有机化合物、优选地琥珀酸。
如本文所述的不同产量参数(“碳产率”或“YP/S”；“比生产率产量”；或“空间-时间-产率(STY)”)是本领域熟知的并且例如由Song和Lee,2006所述那样测定。“碳产率”和“YP/S”(各自以产生的有机化合物的质量/消耗的可同化碳源的质量表述)在本文中作为同义词使用。比生产率产量描述每小时和每升酵液每g干生物质产生的产物(如琥珀酸)的量。称作“DCW”的干细胞重量的量描述了生物化学反应中有生物学活性的微生物的量。该值作为g产物/g DCW·小时(即g g DCW-1h-1)给出。空间-时间-产率(STY)定义为在整个培养时间范围内考虑时在发酵过程中形成的有机化合物的总量对培养物体积的比率。空间-时间-产率也称作“体积生产率”。
在过程步骤II)中，从过程步骤I)中获得的发酵液回收有机化合物。
通常，回收方法包括步骤：将重组微生物从发酵液分离作为所谓“生物质”。用于取出生物质的方法是本领域技术人员已知的，并且包括过滤、沉积和浮选或其组合。因此，生物质可以用例如离心机、分离器、滗析器、滤器或在浮选装置中取出。为了最大限度回收有价值的产物，经常建议洗涤生物量，例如以渗滤形式洗涤。方法的选择取决于发酵液中的生物质含量和生物质的特性，并且还取决于生物质与有机化合物(即有价值产物)的相互作用。在一个实施方案中，可以将发酵液消毒或巴氏消毒。在又一个实施方案中，浓缩发酵液。取决于要求，这浓缩可以分批或连续地进行。应当如此选择压力和温度范围，从而首先不出现产物受损，并且其次必须最大限度减少装置和能量的使用。熟练选择用于多步蒸发的压力和温度水平尤其能够节省能量。
回收过程还可以包括其中进一步纯化有机化合物、优选地琥珀酸的额外纯化步骤。然而，如果有机化合物通过如下文描述的化学反应转化成次生有机产物，则取决于反应类别和反应条件，不必然要求进一步纯化有机化合物。为了纯化过程步骤II)中获得的化合物，优选地纯化琥珀酸，可以例如使用本领域技术人员已知的方法，如结晶、过滤、电渗析和色谱。在琥珀酸作为有机化合物的情况下，例如，可以通过以下方式分离琥珀酸：通过使用氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙或碳酸氢钙中和将琥珀酸作为琥珀酸钙产物沉淀并过滤沉淀物。通过用硫酸酸化作用，随后过滤以移除沉淀的硫酸钙(石膏)，从沉淀的琥珀酸钙回收琥珀酸。所产生的溶液可以通过离子交换色谱手段进一步纯化以除去不想要的残余离子。备选地，如果氢氧化镁，碳酸镁或其混合物已经用来中和发酵液，则可以酸化过程步骤I)中获得的发酵液以转化培养基中所含的琥珀酸镁成为酸形式(即琥珀酸)，后者随后可以通过冷却酸化的培养基而结晶。其他合适的纯化过程的例子在EP-A-1005562，WO-A-2008/010373，WO-A-2011/082378，WO-A-2011/043443，WO-A-2005/030973，WO-A-2011/123268和WO-A-2011/064151和EP-A-2360137中公开。
根据本发明方法的一个优选实施方案，该过程还包含过程步骤：
III)通过至少一个化学反应，将过程步骤I)中获得的发酵液内所含的有机化合物转化成与该有机化合物不同的次生有机产物或将过程步骤II)中获得的已回收有机化合物转化成与该有机化合物不同的次生有机产物。
在琥珀酸作为有机化合物的情况下，优选的次级有机产物选自琥珀酸酯及其聚合物、四氢呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮。
根据一个用于产生THF、BDO和/或GBL的优选实施方案，这种方法包括：
b1)将过程步骤I)或II)中获得的琥珀酸直接催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL或
b2)将过程步骤I)或II)中获得的琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其相应双低级烷基酯并将所述酯后续催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL。
根据一个用于产生吡咯烷酮的优选实施方案，这种方法包括：
b)将过程步骤I)或II)中获得的琥珀酸铵盐按本身已知的方式化学转化成吡咯烷酮。
关于制备这些化合物的详情，参考US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155。
进一步通过本发明的修饰微生物用于发酵产生有机化合物的用途提供了解决一开始所提到问题的促进手段。优选的有机化合物是已经与本发明方法相联系时提到的那些化合物，琥珀酸是最优选的有机化合物。另外，发酵产生有机化合物、优选地琥珀酸的优选条件是已经与本发明方法的过程步骤I)相联系时描述的那些条件。用于发酵生产有机化合物、尤其用于发酵生产琥珀酸的优选可同化碳源是蔗糖。
现在借助附图和非限制性例子更详细地解释本发明。
图1显示质粒pSacB(SEQ ID NO:17)的示意性图谱。
图2显示质粒pSacBΔldhA(SEQ ID NO:18)的示意性图谱。
图3显示质粒pSacBΔpflA(SEQ ID NO:19)的示意性图谱。
图4显示质粒pSacB pykA1(SEQ ID NO:20)的示意性图谱。
图5显示质粒pSacB wcaJ*(SEQ ID NO:21)的示意性图谱。
图6显示质粒pSacBΔptsA(SEQ ID NO:22)的示意性图谱。
图7显示质粒pSacBΔptsH(SEQ ID NO:23)的示意性图谱。
实施例
实施例1：用于转化Basfia succiniciproducens的一般方法
菌株
野生型DD1(保藏物DSM 18541)
DD1 ΔldhA
DD1 ΔldhA ΔpflA
DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1
DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ*
DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ*ΔptsA
DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ*ΔptsH
表1：实施例中提到的DD1-野生型和突变体的命名
使用以下方案，通过电穿孔法，用DNA转化Basfia succiniciproducensDD1(野生型)：
为了制备预培养物，将DD1从冷冻贮存物接种至100ml摇瓶中的40ml BHI(心脑浸液；Becton,Dickinson and Company)。孵育在37℃；200转/分钟过夜进行。为了制备主培养物，将100ml BHI置于250ml摇瓶中并用预培养物接种至最终OD(600nm)0.2。孵育在37℃，200转/分钟进行。在大约0.5、0.6和0.7的OD时收获细胞，将沉淀物用10％冷甘油在4℃洗涤1次并重悬于2ml 10％甘油(4℃)中。
将100μl感受态细胞与2-8μg质粒DNA混合并且在冰上在宽度0.2cm的电穿孔杯中保持2分钟。电穿孔按以下条件进行：400Ω；25μF；2.5kV(Gene Pulser,Bio-Rad)。在电穿孔后立即添加1ml冰冷的BHI，并且孵育在37℃进行大约2小时。
将细胞铺种在含5mg/L氯霉素的BHI上并且在37℃孵育2-5天直至转化体的菌落可见。将克隆分离并再划线到含5mg/L氯霉素的BHI上直至获得克隆纯化。
实施例2：
a)缺失构建体的产生
基于载体pSacB(SEQ ID NO:17)构建缺失质粒。图1显示质粒pSacB的示意性图谱。从Basfia succiniciproducens的染色体DNA通过PCR扩增应当缺失的染色体片段5’-和3’-侧翼区(各自大约1500bp)，并且使用标准技术，将它们引入所述载体中。正常情况下，将至少80％的ORF靶向用于缺失。以如此方式，构建了乳酸脱氢酶ldhA的缺失质粒pSacB_delta_ldhA(SEQ ID NO:18)、丙酮酸甲酸裂合酶活化酶pflA的缺失质粒pSacB_delta_pflA(SEQID NO:19)、ptsA-基因的缺失质粒pSacB_delta_ptsA(SEQ ID NO:22)和ptsH-基因的缺失质粒pSacB_delta_ptsH(SEQ ID NO:23)。图2、图3、图6和图7分别显示质粒pSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA、pSacB_delta_ptsA和pSacB_delta_ptsH的示意性图谱。
在pSacB的质粒序列(SEQ ID NO:17)中，sacB-基因含于碱基2380-3801之间。sacB-启动子含于碱基3802-4264之间。氯霉素基因含于碱基526-984之间。大肠杆菌复制起点(ori EC)含于碱基1477-2337之间(参见图1)。
在pSacB_delta_ldhA的质粒序列(SEQ ID NO:18)中，与Basfiasucciniciproducens的基因组同源的ldhA基因5’侧翼区含于碱基1519-2850之间，而与Basfia succiniciproducens的基因组同源的ldhA基因3’侧翼区含于碱基62-1518之间。sacB-基因含于碱基5169-6590之间。sacB-启动子含于碱基6591-7053之间。氯霉素基因含于碱基3315-3773之间。大肠杆菌复制起点(ori EC)含于碱基4266-5126之间(参见图2)。
在pSacB_delta_pflA的质粒序列(SEQ ID NO:19)中，与Basfiasucciniciproducens的基因组同源的pflA基因5’侧翼区含于碱基1506-3005之间，而与Basfia succiniciproducens的基因组同源的pflA基因3’侧翼区含于碱基6-1505之间。sacB-基因含于碱基5278-6699之间。sacB-启动子含于碱基6700-7162之间。氯霉素基因含于碱基3424-3882之间。大肠杆菌复制起点(ori EC)含于碱基4375-5235之间(参见图3)。
在pSacB_delta_ptsA的质粒序列(SEQ ID NO:22)中，与Basfiasucciniciproducens的基因组同源的ptsA基因5’侧翼区含于碱基1506-3005之间，而与Basfia succiniciproducens的基因组同源的ptsA基因3’侧翼区含于碱基6-1505之间。sacB-基因含于碱基5278-6699之间。sacB-启动子含于碱基6700-7162之间。氯霉素基因含于碱基3424-3882之间。大肠杆菌复制起点(ori EC)含于碱基4375-5235之间(参见图6)。
在pSacB_delta_ptsH的质粒序列(SEQ ID NO:23)中，与Basfiasucciniciproducens的基因组同源的ptsH基因5’侧翼区含于碱基1541-3055之间，而与Basfia succiniciproducens的基因组同源的ptsH基因3’侧翼区含于碱基6-1540之间。sacB-基因含于碱基5328-6749之间。sacB-启动子含于碱基6750-7212之间。氯霉素基因含于碱基3474-3932之间。大肠杆菌复制起点(ori EC)含于碱基4425-5285之间(参见图7)。
b)生成用于将点突变引入pykA-基因，和引入wcaJ-基因的构建体
在pSacB_pykA1的质粒序列(SEQ ID NO:20)中，与Basfia succiniciproducens的基因组同源的pykA基因部分含于碱基6-1185之间。sacB-基因含于碱基3458-4879之间。sacB-启动子含于碱基4880-5342之间。氯霉素基因含于碱基1604-2062之间。大肠杆菌复制起点(ori EC)含于碱基2555-3415之间(参见图4)。质粒pSacB_pykA1在pykA-基因中引入G至T突变，所述突变最终导致PykA-蛋白(SEQ ID NO:16)中位置167处G(甘氨酸)交换成C(半胱氨酸)。
在pSacB_wcaJ*的质粒序列(SEQ ID NO:21)中，与Basfia succiniciproducens的基因组同源的wcaJ基因5’侧翼区含于碱基1838-3379之间，而与Basfiasucciniciproducens的基因组同源的wcaJ基因3’侧翼区含于碱基6-1236之间。sacB-基因含于碱基5652-7073之间。sacB-启动子含于碱基7074-7536之间。氯霉素基因含于碱基3798-4256之间。大肠杆菌复制起点(ori EC)含于碱基4749-5609之间。wcaJ-基因含有于碱基1237-1837之间，带有在编码赖氨酸的密码子位置81处的胸腺嘧啶和位置82处的腺嘌呤之间的核苷酸插入(其对应于质粒pSacB_wcaJ*的位置1756，参见图5)。这个插入导致移码突变，其中借助这种移码突变引入终止密码子，导致截短型酶表达。
实施例3：产生改进的琥珀酸产生菌株
a)将Basfia succiniciproducens DD1用pSacB_delta_ldhA和“坎贝尔进入”如上文所述转化以产生“坎贝尔进入”菌株。通过PCR证实转化和整合入Basfiasucciniciproducens基因组中，所述PCR产生进入Basfia succiniciproducens基因组的质粒的整合事件的条带。
随后使用含有蔗糖的琼脂平板作为反向选择培养基，对“坎贝尔进入”菌株进行“坎贝尔离开”过程，从而选出sacB基因(功能)丧失。因此，将“坎贝尔进入”菌株在25-35ml非选择性培养基(不含抗生素的BHI)中在37℃，220转/分钟孵育过夜。随后将过夜培养物在新鲜制备的含有蔗糖的BHI平板上(10％，无抗生素)划线并且在37℃孵育过夜(“第一次蔗糖转移”)。从第一次转移获得的单菌落在新鲜制备的含有蔗糖的BHI平板上(10％)划线并且在37℃孵育过夜(“第二次蔗糖转移”)。重复这各程序直至在蔗糖中最少完成5次转移(“第三、第四、第五次糖转移”)。术语“第一至第五次蔗糖转移”指菌株在含有sacB果聚糖-蔗糖酶基因的载体发生染色体整合后转移到含有蔗糖和生长培养基的琼脂平板上，目的在于选出sacB基因和包围性质粒序列丢失的菌株。将来自第五次转移平板的单菌落接种到25-35ml非选择性培养基(不含抗生素的BHI)上并且在37℃，220转/分钟孵育过夜。将过夜培养物连续稀释并铺种在BHI平板上以获得孤立的单菌落。
通过氯霉素敏感性证实含有ldhA-基因突变/缺失的“坎贝尔离开”菌株。通过PCR分析鉴定并且证实这些菌株当中的突变/缺失突变体。这种产生ldhA-缺失突变体Basfiasucciniciproducens DD1ΔldhA。
b)将Basfia succiniciproducensΔldhA用如上文所述的pSacB_delta_pflA和“坎贝尔进入”转化以产生“坎贝尔进入”菌株。通过PCR证实转化和整合。随后如先前所描述将“坎贝尔进入”菌株进行“坎贝尔离开”。通过PCR分析鉴定并且证实这些菌株当中的缺失突变体。这导致ldhA pflA双缺失突变体Basfia succiniciproducens DD1ΔldhAΔpflA。
c)将Basfia succiniciproducensΔldhAΔpflA用如上文所述的pSacB_pykA1和“坎贝尔进入”转化以产生“坎贝尔进入”菌株。随后如先前所描述将“坎贝尔进入”菌株进行“坎贝尔离开”。通过PCR分析鉴定并且证实这些菌株当中的突变体。这导致其中ldhA和pflA缺失并且表达丙酮酸激酶的突变体Basfia succiniciproducens DD1ΔldhAΔpflApykA1，在所述丙酮酸激酶中位置167处的氨基酸甘氨酸由半胱氨酸置换。
d)将Basfia succiniciproducensΔldhAΔpflA pykA1用如上文所述的pSacB_wcaJ*和“坎贝尔进入”转化以产生“坎贝尔进入”菌株。随后如先前所描述将“坎贝尔进入”菌株进行“坎贝尔离开”。通过PCR分析鉴定并且证实这些菌株当中的突变体。这导致其中ldhA和pflA缺失的突变体Basfia succiniciproducens DD1ΔldhAΔpflA pykA1wcaJ*，所述突变体表达其中位置167处的氨基酸甘氨酸由半胱氨酸置换的丙酮酸激酶并且表达wcaJ-基因编码的截短型酶。
e)将Basfia succiniciproducensΔldhAΔpflA pykA1wcaJ*用如上文所述的pSacB_delta_ptsA和“坎贝尔进入”转化以产生“坎贝尔进入”菌株。通过PCR证实转化和整合。随后如先前所描述将“坎贝尔进入”菌株进行“坎贝尔离开”。通过PCR分析鉴定并且证实这些菌株当中的缺失突变体。这导致突变体Basfia succiniciproducens DD1ΔldhAΔpflA pykA1wcaJ*ΔptsA。
f)将Basfia succiniciproducensΔldhAΔpflA pykA1wcaJ*用如上文所述的pSacB_delta_hPr和“坎贝尔进入”转化以产生“坎贝尔进入”菌株。通过PCR证实转化和整合。随后如先前所描述将“坎贝尔进入”菌株进行“坎贝尔离开”。通过PCR分析鉴定并且证实这些菌株当中的缺失突变体。这导致突变体Basfia succiniciproducens DD1ΔldhAΔpflA pykA1wcaJ*ΔptsH。
实施例4：依赖葡萄糖和蔗糖培养各种DD1菌株
利用下文描述的培养基和孵育条件，分析生产率。
1.培养基制备
培养基CGM的组成和制备如下表2中所述。
化合物 浓度[g/L]
酵母提取物(Bio Springer) 12.5
琥珀酸 2.5
(NH4)2SO4 0.5
KH2PO4 1.0
MgCO3 50.0
Na2CO3 2.0
葡萄糖 50
表2：依赖葡萄糖培养的培养基组成(培养基CGM)
培养基LSM_3的组成和制备如下表3、表4和表5中所述。
表3：微量元素溶液的组成
表4：维生素溶液的组成
表5：依赖蔗糖培养的LSM_3培养基的组成
2.培养和分析
为了培育预培养物，来自新鲜培育的BHI-琼脂平板(在37℃在无氧条件下孵育过夜)的细菌用来接种100ml含有表2中所述的50ml CGM液体培养基连同CO2-气氛的带气密性丁基橡胶瓶塞的血清瓶至OD600＝0.75。将各瓶在37℃和170转/分钟(振摇直径：2.5cm)孵育。为了培育主培养物，2.5ml在CGM培养基中的细菌培养物(在10小时孵育后)用来接种100ml含有表5中所述的50ml LSM_3液体培养基连同CO2-气氛的带气密性丁基橡胶瓶塞的血清瓶。通过HPLC对琥珀酸的产生定量(HPLC方法在表7和表8中描述)。通过使用分光光度计(Ultrospec3000,Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典)测量600nm处吸光度(OD600)，测量细胞生长。
3.结果
表6中显示采用不同DD1-菌株的培养实验的结果。
表6：依赖蔗糖培养DD1ΔldhAΔpflApykA1wcaJ*-菌株、DD1ΔldhAΔpflApykA1wcaJ*ΔptsA-菌株和DD1ΔldhAΔpflApykA1wcaJ*ΔptsH-菌株(培养基LSM_3)。
aSA产率(琥珀酸/消耗底物的比率)
表7：分析琥珀酸的HPLC方法(ZX-THF50)
表8：分析蔗糖的HPLC方法(Fast-CH)
序列表
SEQ ID NO：1(菌株DD1的16S rDNA的核苷酸序列)
tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgggaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcgg
SEQ ID NO：2(菌株DD1的23S rDNA的核苷酸序列)
agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcagaggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaacccagtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaatcggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcgggacacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaaggaaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaatagaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtgactgcgtaccttttgtataatgggtcagcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaactgggcgtcgagttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactggaggaccgaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggctgggggtgaaaggccaatcaaaccgggagatagctggttctccccgaaatctatttaggtagagccttatgtgaataccttcgggggtagagcactgtttcggctagggggccatcccggcttaccaacccgatgcaaactgcgaataccgaagagtaatgcataggagacacacggcgggtgctaacgttcgtcgtggagagggaaacaacccagaccgccagctaaggtcccaaagtttatattaagtgggaaacgaagtgggaaggcttagacagctaggatgttggcttagaagcagccatcatttaaagaaagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatgtaacggggctcaaatatagcaccgaagctgcggcatcaggcgtaagcctgttgggtaggggagcgtcgtgtaagcggaagaaggtggttcgagagggctgctggacgtatcacgagtgcgaatgctgacataagtaacgataaaacgggtgaaaaacccgttcgccggaagaccaagggttcctgtccaacgttaatcggggcagggtgagtcggcccctaaggcgaggctgaagagcgtagtcgatgggaaacgggttaatattcccgtacttgttataattgcgatgtggggacggagtaggttaggttatcgacctgttggaaaaggtcgtttaagttggtaggtggagcgtttaggcaaatccggacgcttatcaacaccgagagatgatgacgaggcgctaaggtgccgaagtaaccgataccacacttccaggaaaagccactaagcgtcagattataataaaccgtactataaaccgacacaggtggtcaggtagagaatactcaggcgcttgagagaactcgggtgaaggaactaggcaaaatagcaccgtaacttcgggagaaggtgcgccggcgtagattgtagaggtatacccttgaaggttgaaccggtcgaagtgacccgctggctgcaactgtttattaaaaacacagcactctgcaaacacgaaagtggacgtatagggtgtgatgcctgcccggtgctggaaggttaattgatggcgttatcgcaagagaagcgcctgatcgaagccccagtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcataatgatggccaggctgtctccacccgagactcagtgaaattgaaatcgccgtgaagatgcggtgtacccgcggctagacggaaagaccccgtgaacctttactatagcttgacactgaaccttgaattttgatgtgtaggataggtgggaggctttgaagcggtaacgccagttatcgtggagccatccttgaaataccaccctttaacgtttgatgttctaacgaagtgcccggaacgggtactcggacagtgtctggtgggtagtttgactggggcggtctcctcccaaagagtaacggaggagcacgaaggtttgctaatgacggtcggacatcgtcaggttagtgcaatggtataagcaagcttaactgcgagacggacaagtcgagcaggtgcgaaagcaggtcatagtgatccggtggttctgaatggaagggccatcgctcaacggataaaaggtactccggggataacaggctgataccgcccaagagttcatatcgacggcggtgtttggcacctcgatgtcggctcatcacatcctggggctgaagtaggtcccaagggtatggctgttcgccatttaaagtggtacgcgagctgggtttaaaacgtcgtgagacagtttggtccctatctgccgtgggcgttggagaattgagaggggctgctcctagtacgagaggaccggagtggacgcatcactggtgttccggttgtgtcgccagacgcattgccgggtagctacatgcggaagagataagtgctgaaagcatctaagcacgaaacttgcctcgagatgagttctcccagtatttaatactgtaagggttgttggagacgacgacgtagataggccgggtgtgtaagcgttgcgagacgttgagctaaccggtactaattgcccgagaggcttagccatacaacgctcaagtgtttttggtagtgaaagttattacggaataagtaagtagtcagggaatcggct
SEQ ID NO：3(来自菌株DD1的ptsA基因的核苷酸序列)
atgatttcaggaatcccggcctcaccaggtatcgtttttggtaaagcgttagttctgaaagaggaaaaaattgtacttgatatgcaaaaaattgctgaagatcaagttgaaactgaagtagctcgtttttatgaaggccgtacggcggcagtggaacaattaagcgccattagagatcgtgcagagaaaactctcggtgaagaaaaagcggctatcttcgaaggtcatttaatgattcttgaagatgaagagttggaagaagaaatcattgattatttgcgttcaaacaaagtaaatgcgggcgttgcggcaagtaaaatcattgatcaacaagttgctatgcttgcggatattgatgatgagtacttaaaagaacgtgccggcgatattcgcgatatcggtaaccgtttaattaaaaatatcttaggcatgaaaattgtggatttgggcgaaatcaatgaagagtcaatcttggttgcttatgacttaacgccatcagaaaccgcacaattgaatttagacaaagtattaggttttattactgatatcggtggtcgtacttcacatacctctattatggcccgttcgctggaattaccggcaattgtaggtacaaataatgcaaccgcaatgattaacagcggtgattatttagtacttgatgcaatcaataacgctgtttatgtgaatccggctcaagacgtgattgacggcttaaaagcccaacaagcaaaattagcggaagaaaaagcggaattagctaaattaaaagatttaccggcagtaacattggacggtcaccgtgttgaagtggtggcgaatatcggtacgattcgtgactgtgagggtgcggatcgtaacggtgcggaaggtgtcggtttataccgtaccgagttcctgttcatggatcgtgaccaactgccttcagaagaagaacaatttatcgcttataaagaagtggtagaagcgatgaacggtcgccaggtggtattacgtaccatggatattggtggagataaagaattaccttatatgaatctgccaaaagaaatgaatccgttcttaggctggcgtgcggttcgtatcgcattggatcgtcgcgaaatcttaaatgctcaattgcgtgcggtattacgtgcttccgcattcggtaaattagcggtaatgttcccgatgattatttccgttgaagaaattcgcgaattgaaatccgttatcgaaactttaaaacaagaattacgcaccgaaggtaaagcctttgatgaaaatattcaaatcggtgtaatgtgtgaaacgccgtcagctgcagtaaatgcaaaattcttagcaaaagaagtggacttcttcagtatcggtactaatgatttaactcaatatactttagcggttgaccgtggtaatgaaatgatttcacatttatataatccaatgtcaccttcagtattaagtttaattaaacaggttattgacgcctctcataccgaaggcaaatggactggtatgtgcggtgagttagccggtgatgaaaaagccactattttattattaggtatgggattagacgaattcagcatgagcgctatttccgttcctcgtattaaaaaattggttcgtagtgttaattttgccgaagcaaaagcattagcggataaagccctgcaattaccgactgctgccgaaattgaaaaattagttgctgattttttagctgaaaaaacattaaattag
SEQ ID NO：4(由以上ptsA基因编码的酶的氨基酸序列)
MISGIPASPGIVFGKALVLKEEKIVLDMQKIAEDQVETEVARFYEGRTAAVEQLSAIRDRAEKTLGEEKAAIFEGHLMILEDEELEEEIIDYLRSNKVNAGVAASKIIDQQVAMLADIDDEYLKERAGDIRDIGNRLIKNILGMKIVDLGEINEESILVAYDLTPSETAQLNLDKVLGFITDIGGRTSHTSIMARSLELPAIVGTNNATAMINSGDYLVLDAINNAVYVNPAQDVIDGLKAQQAKLAEEKAELAKLKDLPAVTLDGHRVEVVANIGTIRDCEGADRNGAEGVGLYRTEFLFMDRDQLPSEEEQFIAYKEVVEAMNGRQVVLRTMDIGGDKELPYMNLPKEMNPFLGWRAVRIALDRREILNAQLRAVLRASAFGKLAVMFPMIISVEEIRELKSVIETLKQELRTEGKAFDENIQIGVMCETPSAAVNAKFLAKEVDFFSIGTNDLTQYTLAVDRGNEMISHLYNPMSPSVLSLIKQVIDASHTEGKWTGMCGELAGDEKATILLLGMGLDEFSMSAISVPRIKKLVRSVNFAEAKALADKALQLPTAAEIEKLVADFLAEKTLN
SEQ ID NO：5(来自菌株DD1的ptsH基因的核苷酸序列)
atgtattcaaaagatgttgaaattacagctcctaacggcttacacactcgtccggctgcacaatttgtaaaagaagcaaaagcgtttgcatctgatgtaacagtgacttctgccggtaaaagtgcaagtgcgaaaagtttattcaaattacaaactttaggcttaactcaaggaactgtaattacaatttcagctgaaggcgaagatgagcaaaatgctgttgaccatttagttgcattaattcctacattagaataa
SEQ ID NO：6(由以上ptsH基因编码的酶的氨基酸序列)
MYSKDVEITAPNGLHTRPAAQFVKEAKAFASDVTVTSAGKSASAKSLFKLQTLGLTQGTVITISAEGEDEQNAVDHLVALIPTLE
SEQ ID NO：7(来自菌株DD1的1dhA基因的核苷酸序列)
ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagtactaaaaattatgatcgcaaacatctggatttggcgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttacttgatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgtattttcgtcaatgatgatgcgagccgcccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaataatgtggatttggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagcatgcgatcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccataaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttctctggaaggattggtcggttttaatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggcggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgttctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgttgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgttatcactttgcattgcccggctacggcggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaataccagccgcggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctctcggtatggatgtttatgaaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgcctttcttcctgtcataatgtgctttttaccggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtgactttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaacgtgcgaaaatagcgttgaaggctaa
SEQ ID NO：8(来自菌株DD1的LdhA的氨基酸序列)
MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFELHFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFVNDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNNVDLEAAKELGLKVVRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLNRRIHKAYQRTRDANFSLEGLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAEALGAKYVGLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAIEALKRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQAFLTEEALNNIADVTLSNIQAVSKNATCENSVEG
SEQ ID NO：9(来自菌株DD1的pflA基因的核苷酸序列)
atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaatgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtgacctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactggttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgatgacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcgaattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgcacatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaagtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctacgggcttaatgtgacatattag
SEQ ID NO：10(来自菌株DD1的PflA的氨基酸序列)
MSVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNRDTWDLHGGKEISVEELMKEVVTYRHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDWFRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLVLLDLKEMNERVHESLIGVPNKRVLEFAKYLADRNQRTWIRHVVVPGYTDSDEDLHMLGNFIKDMKNIEKVELLPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY
SEQ ID NO：11(来自菌株DD1的pflD基因的核苷酸序列)
atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggtgaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgactttatccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcattcttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtgatggaaggcatcaaaatcgaaaacaaaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttctcacaagcctggttatatcaataaagatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatcaaaatgatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgtaaaacccataaccaaggcgtattcgacgtttatacgccggatattttacgctgccgtaaatcaggcgtgttaaccggtttaccggatgcttacggtcgtggtcgtattatcggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctgatgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaagcgggcgaagacattcaggcaactatccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatggcggcatcttacggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacatattttgcttatctggcagcggttaaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgacttaaaacgcggtttaatcactgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggttcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattattctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccggtatgggcttagacggtcgtccgttggtaactaaaaacagcttccgcgtattacatactttatacactatgggtacttctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgtgcgaaagtatctattgatacttcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatcgcatgctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaactatgttatacgcaattaacggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgattacagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcgaacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgtaaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatgaagcggcattgatggcgttccacgatcgcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatccgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgcggcgacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctcgaatgttgctatcgacttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagacttagttgaacgtttcatgaaaaaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctgactatcacttctaacgtggtatacggtaagaaaaccggtaatactccggacggtcgtcgagcaggcgcgccattcggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggtgcggttgcttcacttacttctgtggctaaacttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattaggtaaagatgacgaagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaatggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtcaacacttgaatgttaacgttcttaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaattaaccattcgtgtttcaggttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactcgtacgtttacacaatcaatgtaa
SEQ ID NO：12(来自菌株DD1的PflD的氨基酸序列)
MAELTEAQKKAWEGFVPGEWQNGVNLRDFIQKNYTPYEGDESFLADATPATSELWNSVMEGIKIENKTHAPLDFDEHTPSTITSHKPGYINKDLEKIVGLQTDAPLKRAIMPYGGIKMIKGSCEVYGRKLDPQVEFIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRLAVYGIDYLMKDKKAQFDSLQPRLEAGEDIQATIQLREEIAEQHRALGKIKEMAASYGYDISGPATNAQEAIQWTYFAYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDIYIERDLKRGLITEQQAQELMDHLVMKLRMVRFLRTPEYDQLFSGDPMWATETIAGMGLDGRPLVTKNSFRVLHTLYTMGTSPEPNLTILWSEQLPEAFKRFCAKVSIDTSSVQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMVVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGIDEKNGMQVGPKTAPITDEVLNFDTVIERMDSFMDWLATQYVTALNIIHFMHDKYAYEAALMAFHDRDVFRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRGDIKDKDGNVVASNVAIDFEIEGEYPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKVQKHKTYRNATPTQSILTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEAQKRNLAGLMDGYFHHEATVEGGQHLNVNVLNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM
SEQ ID NO：13(来自菌株DD1的wcaJ基因的核苷酸序列)
atgataaaacgccttttcgatattgttgtcgcattgatagcattgattttgttttcgcccttatatttgtttgtggcttataaggtaaaacaaaatttgggatcaccggtgttatttaaacaaacccgccccggattgcatggtaaaccctttgagatgattaagttcagaacaatgaaagacggcgcagatgaaaacggtaatattttgccggatgcggagcgcttaacacctttcggcaaaatgttgcgcgctaccagtctggacgagttgccggaactttggaatgtattaaaaggtgatatgagtctggtggggccgcgtcctctactgatggaatatttgccgctgtataacgaaagacaggctaagcgccatgaagtgaaacccggaattaccggttatgcacaggtaaacggtcgcaatgccatcagttgggagcagaaatttgaattggatgcctggtatgttgaacatcaatccttgtggctggatttgaaaattatcgcaaagaccatccaaaaagtgatcgcaaaagacgatattaatgcggcagatgatgccaccatgcctaaatttgaagggaataaaaaatcatga
SEQ ID NO：14(由以上wcaJ基因编码的酶的氨基酸序列)
MIKRLFDIVVALIALILFSPLYLFVAYKVKQNLGSPVLFKQTRPGLHGKPFEMIKFRTMKDGADENGNILPDAERLTPFGKMLRATSLDELPELWNVLKGDMSLVGPRPLLMEYLPLYNERQAKRHEVKPGITGYAQVNGRNAISWEQKFELDAWYVEHQSLWLDLKIIAKTIQKVIAKDDINAADDATMPKFEGNKKS
SEQ ID NO：15(来自菌株DD1的pykA基因的核苷酸序列)
atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctcataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaatatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgcaagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccgaagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcggcggtttatctgccgatgcattaaccgaaaaagataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcagaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgactcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacgttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaacaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatgcgcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaagacgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgttgaataa
SEQ ID NO：16(来自菌株DD1的PykA的氨基酸序列)
MSRRLRRTKIVCTMGPATDKGNNLEKIIAAGANVVRMNFSHGTPEDHIGRAEKVREIAHKLGKHVAILGDLQGPKIRVSTFKEGKIFLNIGDKFILDAEMPKGEGNQEAVGLDYKTLPQDVVPGDILLLDDGRVQLKVLATEGAKVFTEVTVGGPLSNNKGINKLGGGLSADALTEKDKADIITAARIGVDYLAVSFPRSSADLNYARQLAKDAGLDAKIVAKVERAETVETDEAMDDIINAADVIMVARGDLGVEIGDPELVGVQKKLIRRSRQLNRVVITATQMMESMISNPMPTRAEVMDVANAVLDGTDAVMLSAETAAGQYPAETVAAMAKVALGAEKMPSINVSKHRMNVQFESIEESVAMSAMYAANHMRGVAAIITLTSSGRTARLMSRISSGLPIFALSRNESTLNLCALYRGVTPVHFDKDSRTSEGATAAVQLLKDEGFLVSGDLVLLTQGDASSSSGTNLCRTLIVE
SEQ ID NO：17(质粒pSacB的完整核苷酸序列)
tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatatcgtcgacatcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatcctctagactccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccgcgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtagccgtgatagtttgcgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgcagaagagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcatttttttgctgttcagggatttgcagcatatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgcggtagtaaaggttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttccagccctcctgtttgaagatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgccaaagtatacactttgccctttacacattttaggtcttgcctgctttatcagtaacaaacccgcgcgatttacttttcgacctcattctattagactctcgtttggattgcaactggtctattttcctcttttgtttgatagaaaatcataaaaggatttgcagactacgggcctaaagaactaaaaaatctatctgtttcttttcattctctgtattttttatagtttctgttgcatgggcataaagttgcctttttaatcacaattcagaaaatatcataatatctcatttcactaaataatagtgaacggcaggtatatgtgatgggttaaaaaggatcggcggccgctcgatttaaatc
SEQ ID NO：18(质粒pSacB_delta_ldhA的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：19(质粒pSacB_delta-pflA的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：20(质粒pSacB-pykA1的完整核苷酸序列)
tcgagcagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctcataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaatatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgcaagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccgaagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcggcggtttatctgccgatgcattaaccgaaaaagataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcagaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgactcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacgttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaacaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctagactccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccgcgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtagccgtgatagtttgcgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgcagaagagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcatttttttgctgttcagggatttgcagcatatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgcggtagtaaaggttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttccagccctcctgtttgaagatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgc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SEQ ID NO：21(质粒pSacB_wcaJ*的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：23(质粒pSacB_de lta-ptsH的完整核苷酸序列)
tcgagccgatactgaagaagtccacttcttttgctaagaattttgcatttactgcagctgacggcgtttcacacattacaccgatttgaatattttcatcaaaggctttaccttcggtgcgtaattcttgttttaaagtttcgataacggatttcaattcgcgaatttcttcaacggaaataatcatcgggaacattaccgctaatttaccgaatgcggaagcacgtaataccgcacgcaattgagcatttaagatttcgcgacgatccaatgcgatacgaaccgcacgccagcctaagaacggattcatttcttttggcagattcatataaggtaattctttatctccaccaatatccatggtacgtaataccacctggcgaccgttcatcgcttctaccacttctttataagcgataaattgttcttcttctgaaggcagttggtcacgatccatgaacaggaactcggtacggtataaaccgacaccttccgcaccgttacgatccgcaccctcacagtcacgaatcgtaccgatattcgccaccacttcaacacggtgaccgtccaatgttactgccggtaaatcttttaatttagctaattccgctttttcttccgctaattttgcttgttgggcttttaagccgtcaatcacgtcttgagccggattcacataaacagcgttattgattgcatcaagtactaaataatcaccgctgttaatcattgcggttgcattatttgtacctacaattgccggtaattccagcgaacgggccataatagaggtatgtgaagtacgaccaccgatatcagtaataaaacctaatactttgtctaaattcaattgtgcggtttctgatggcgttaagtcataagcaaccaagattgactcttcattgatttcgcccaaatccacaattttcatgcctaagatatttttaattaaacggttaccgatatcgcgaatatcgccggcacgttcttttaagtactcatcatcaatatccgcaagcatagcaacttgttgatcaatgattttacttgccgcaacgcccgcatttactttgtttgaacgcaaataatcaatgatttcttcttccaactcttcatcttcaagaatcattaaatgaccttcgaagatagccgctttttcttcaccgagagttttctctgcacgatctctaatggcgcttaattgttccactgccgccgtacggccttcataaaaacgagctacttcagtttcaacttgatcttcagcaattttttgcatatcaagtacaattttttcctctttcagaactaacgctttaccaaaaacgatacctggtgaggccgggattcctgaaatcatgtgtaaccttccgataataatttaattaaaaaaatctaactatgataaacgacatagccataaaactcttttattaacagtgataaatcaataagaaagttttatggccagacaaattattctaatgtaggaattaatgcaactaaatggtcaacagcattttgctcatcttcgccttcaacctctaatagtaatgttttttgttttaatgtggagcaaacaggtaaacggttaacttttgacctgcctactaaaatttaattattcataaaccacagcggacactctaaaccattttgtctgatagttcaaaataaatcttatttagtatcaagattattcctaattaattcaagttaaatcctataaaaacttgagctagttcatctttttgtcaaccgatagattaatttttaataaaaatgtaacaaattagtaataaaaaataaccgaattaccttatatcctgctccataaaatggcgttgcgatttattttcttcccggcttgaaatcaagcgatggtaattatcaaatctgacggggtggattttcccgagctccacagcttcccgtaaggcgcagcccggatcatcaatatgtttgcagtctctgaatttgcaggtccctaagaaatattggaattcccgataaccgttggtgatttgtgcaggttccaaatgccataaaccgaactctcgaatgcccggcgaatcaatcagatttccgccctgaggtaaatgatataaacgggaagacgtggtggtatgctgtcccaatcccgaagtttcgctgatttcaccggtttgcgcattaacttccggtaaaatatagttgattaaactggacttccctaccccggattgcccgacgaaaatcgacgtaccatccgctaaaagtgcggtcagtttttccatattttttccactaatcgccgaaatcattaatgtttcatagccgatttttcggtagatttccagttgttcttccgcttcccgccactgttcgtccgttaataaatcaaccttattcaacaagataacggcaggaatattagcgttttcacaaataaccaaataacgatcaataatattcagggataacgccggtagcaccgacgaaacaataataatgcgatcgatattcgatgccatgactttcagtccgtcataataatccgggcgggcaatttcattttcacgcggtttaatcgcctcaatgaccccgctaataccctgtagtttttcatgccctcggcgccacactacgtgatctcccaccaccacattggctaatgtgcgacgtaaattacaacggaaaatctcgccttgactattctccacatccgcatgcatagaataacgagtgacgacaacgccgtcttgcgtatcgccaagcatttcttcctgccaatcaatctctttttttactcttcggtgatgacgatccaatgcttttacattatttgaatgaattcgacgtttttgattttgagttaatttacgcttagtcaaacagaagtccttaaagtgcggtagattttcgtataatattacgggtcaacaaatcagttaacgtataaatgcttataggatactccaaattatgcaattagataaccaaaatctaatctggatcgacttagaaatgaccgggttagaccctgaaaacgagcgcattattgaaatcgccaccatctagactccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtg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PCT/RO/134表

Claims (15)

1.修饰的微生物，与其野生型相比，具有
-减少的由ptsA-基因编码的酶的活性，
-减少的由ptsH-基因编码的酶的活性，或
-减少的由ptsH-基因编码的酶的活性和减少的由ptsH-基因编码的酶的活性，
其中已经从中衍生修饰微生物的野生型属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)。
2.根据权利要求1所述的修饰微生物，其中已经从中衍生出修饰微生物的野生型属于Basfia属。
3.根据权利要求1或2所述的修饰的微生物，其中ptsA-基因包含选自以下的核酸：
a1)具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核酸；
b1)编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列的核酸；
c1)与a1)或b1)的核酸具有至少70％的同一性的核酸，同一性是在a1)或b1)的核酸总长度范围内的同一性；
d1)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性，同一性是在a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
e1)能够在严格条件下与根据a1)或b1)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
f1)编码与a1)或b1)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文a1)或b1)的核酸不同的核酸。
4.根据权利要求1或2所述的修饰的微生物，其中ptsH-基因包含选自以下的核酸：
a2)具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸；
b2)编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的核酸；
c2)与a2)或b2)的核酸具有至少70％的同一性的核酸，同一性是在a2)或b2)的核酸总长度范围内的同一性；
d2)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性，同一性是在a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度范围内的同一性；
e2)能够在严格条件下与根据a2)或b2)的任一核酸的互补序列杂交的核酸；和
f2)编码与a2)或b2)的任一核酸编码的蛋白质相同的蛋白质，但因遗传密码简并性而与上文a2)或b2)的核酸不同的核酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的修饰微生物，其中与其野生型相比，微生物还具有至少一种以下特性：
i)减少的丙酮酸甲酸裂合酶活性；
ii)减少的乳酸脱氢酶活性；
iii)减少的由wcaJ-基因编码的酶的活性，
iv)减少的由pykA-基因编码的酶的活性，
6.根据权利要求5所述的修饰的微生物，其中微生物包含以下基因修饰A)至E)中的至少一种：
A)ldhA-基因或至少其部份的缺失、ldhA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向ldhA-基因引入至少一个突变；
B)pflD-基因或至少其部份的缺失、pflD-基因调节元件或至少其部份的缺失或向pflD-基因引入至少一个突变；
或
pflA-基因或至少其部份的缺失、pflA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向pflA-基因引入至少一个突变；
C)wcaJ-基因或至少其部份的缺失、wcaJ-基因调节元件或至少其部份的缺失或向wcaJ-基因引入至少一个突变；
D)pykA-基因或至少其部份的缺失、pykA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向pykA-基因引入至少一个突变，所述突变导致减少pykA-基因编码的酶的活性；
E)ptsA-基因或至少其部份的缺失、ptsA-基因调节元件或至少其部份的缺失或向ptsA-基因引入至少一个突变；
和/或
ptsH-基因或至少其部份的缺失、ptsH-基因调节元件或至少其部份的缺失或向ptsH-基因引入至少一个突变。
7.根据权利要求6所述的修饰的微生物，其中微生物包含：
A)ldhA-基因或至少其部份的缺失；
B)pflA-基因或至少其部份的缺失或pflD-基因或至少其部份的缺失；
C)向wcaJ-基因引入至少一个突变，所述突变导致由wcaJ-基因编码的截短型酶表达；
D)向pykA-基因引入至少一个突变；和
E)ptsA-基因或至少其部份的缺失。
8.根据权利要求6所述的修饰的微生物，其中微生物包含：
A)ldhA-基因或至少其部份的缺失；
B)pflA-基因或至少其部份的缺失或pflD-基因或至少其部份的缺失；
C)向wcaJ-基因引入至少一个突变，所述突变导致由wcaJ-基因编码的截短型酶表达；
D)向pykA-基因引入至少一个突变；和
E)ptsH-基因或至少其部份的缺失。
9.产生有机化合物的方法，包括
I)在包含至少一种可同化碳源以允许根据权利要求1至8中任一项所述的修饰的微生物产生有机化合物的培养基中培育修饰的微生物，因而获得包含有机化合物的发酵液；
II)从过程步骤I)中获得的发酵液回收有机化合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中有机化合物是琥珀酸。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中基于除去二氧化碳的可同化碳源的总重量，至少50wt.-％的可同化碳源是蔗糖。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中方法还包括过程步骤：
III)通过至少一个化学反应，将过程步骤I)中获得的发酵液内所含的有机化合物转化成与该有机化合物不同的次生有机产物或将过程步骤II)中获得的已回收有机化合物转化成与该有机化合物不同的次生有机产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中有机化合物是琥珀酸并且其中次生有机产物选自琥珀酸酯或其聚合物、四氢呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的修饰微生物的用途，用于发酵产生有机化合物。
15.根据权利要求14所述的用途，其中有机化合物是琥珀酸并且其中使用蔗糖作为可同化碳源。
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