JP2017514511A - ショ糖におけるファインケミカルの改善された生産のための遺伝的改変微生物 - Google Patents
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Abstract
Description
−ptsA遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、
−ptsH遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、又は
−ptsA遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性及びptsH遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性
を有する改変微生物であって、改変微生物が由来する野生型が、パスツレラ科の科に属する、改変微生物によって提供される。
ptsA遺伝子又はその一部、
ptsH遺伝子又はその一部、又は
ptsA遺伝子又はその一部及びptsH遺伝子又はその一部
が欠失した、又はそれらの遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部が欠失した、又はそれらの遺伝子に少なくとも一つの経煮が導入された改変微生物であって、改変微生物が由来する野生型が、パスツレラ科の科に属する、改変微生物によって提供される。
a1)配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸;
b1)配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸;
c1)a1)又はb1)の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がa1)又はb1)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
d1)a1)又はb1)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がa1)又はb1)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
e1)a1)又はb1)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
f1)a1)又はb1)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記a1)又はb1)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む。
a2)配列番号5のヌクレオチド配列を有する核酸;
b2)配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸;
c2)a2)又はb2)の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がa2)又はb2)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
d2)a2)又はb2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がa2)又はb2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
e2)a2)又はb2)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
f2)a2)又はb2)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記a2)又はb2)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む。
i)低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性、
ii)低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性、
iii)wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、
iv)pykA遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、
の少なくとも一つによっても特徴づけられる。
α1)配列番号7のヌクレオチド配列を有する核酸;
α2)配列番号8のアミノ酸配列をコードする核酸;
α3)α1)又はα2)の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がα1)又はα2)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
α4)α1)又はα2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がα1)又はα2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
α5)α1)又はα2)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
α6)α1)又はα2)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記α1)又はα2)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む。
β1)配列番号9のヌクレオチド配列を有する核酸;
β2)配列番号10のアミノ酸配列をコードする核酸;
β3)β1)又はβ2)の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がβ1)又はβ2)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
β4)β1)又はβ2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がβ1)又はβ2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
β5)β1)又はβ2)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
β6)β1)又はβ2)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記β1)又はβ2)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む。
γ1)配列番号11のヌクレオチド配列を有する核酸;
γ2)配列番号12のアミノ酸配列をコードする核酸;
γ3)γ1)又はγ2)の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がγ1)又はγ2)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
γ4)γ1)又はγ2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がγ1)又はγ2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
γ5)γ1)又はγ2)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
γ6)γ1)又はγ2)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記γ1)又はγ2)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む。
δ1)配列番号13のヌクレオチド配列を有する核酸;
δ2)配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸;
δ3)δ1)又はδ2)の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がδ1)又はδ2)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
δ4)δ1)又はδ2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がδ1)又はδ2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
δ5)δ1)又はδ2)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
δ6)δ1)又はδ2)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記δ1)又はδ2)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む。
ε1)配列番号15のヌクレオチド配列を有する核酸;
ε2)配列番号16のアミノ酸配列をコードする核酸;
ε3)ε1)又はε2)の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がε1)又はε2)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
ε4)ε1)又はε2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がε1)又はε2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
ε5)ε1)又はε2)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
ε6)ε1)又はε2)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記ε1)又はε2)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む。
A)ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
B)pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;又は
pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
C)wcaJ遺伝子又は少なくともその一部の欠失、wcaJ遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はwcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
D)pykA遺伝子によってコードされる酵素の活性を少なくとも低減する(least to a reduction)、pykA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pykA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpykA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
E)ptsA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ptsA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はptsA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び/又は
ptsH遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ptsH遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はptsH遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
の少なくとも一つを含むことが好ましい。
A)ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
B)pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
C)トランケートされたwcaJ遺伝子によってコードされる酵素の発現をもたらす、wcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
D)pykA遺伝子によってコードされる酵素の活性を少なくとも低減する(least to a reduction)、pykA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;及び
E)ptsA遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
を含む。
A)ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
B)pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
C)トランケートされたwcaJ遺伝子によってコードされる酵素の発現をもたらす、wcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
D)pykA遺伝子によってコードされる酵素の活性を少なくとも低減する(least to a reduction)、pykA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;及び
E)ptsH遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
を含む。
−パスツレラ科の、特に好ましくはバスフィア属の、及びさらにより好ましくはバスフィア・スクシニシプロデュセンスの改変細菌細胞、
−−ここで、好ましくはptsA遺伝子の欠失によって、特に配列番号3に記載の核酸配列を有し、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する酵素をコードするptsA遺伝子の改変によって、ptsA遺伝子によってコードされる酵素の活性が低減されている;
−−ここで、好ましくはldhA遺伝子及びpflA遺伝子の改変によって、特に配列番号7に記載の核酸配列を有し、配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するLdhAをコードするldhA遺伝子の改変によって、及び配列番号9に記載の核酸配列を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列を有するPflAをコードするpflA遺伝子の改変によって、又はldhA遺伝子及びpflD遺伝子の改変によって、特に配列番号7に記載の核酸配列を有し、配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するLdhAをコードするldhA遺伝子の改変によって、及び配列番号11に記載の核酸配列を有し、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するPflDをコードするpflD遺伝子の改変によって、乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸ギ酸リアーゼの活性が低減されている;
−−ここで、wcaJ遺伝子又は少なくともその一部が欠失している、又は少なくとも一つの変異がwcaJ遺伝子、特に配列番号13に記載の核酸配列を有し、配列番号14に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするwcaJ遺伝子に導入されており、該少なくとも一つの変異が、好ましくはwcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸、好ましくは少なくとも125アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、及びもっと好ましくは少なくとも160アミノ酸が、C末端から欠失している酵素の発現をもたらす;
及び
−−ここで、少なくとも一つの変異がpykA遺伝子、特に配列番号15に記載の核酸配列を有し、配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするpykA遺伝子に導入されており、好ましくは少なくとも一つの変異がpykA遺伝子によってコードされる酵素の少なくとも一つのアミノ酸の置換をもたらし、最も好ましくは変異が、pykA遺伝子によってコードされる酵素における、167位におけるグリシンのシステインによる置換、又は417位におけるシステインのチロシンによる置換又は171位におけるアラニンのグリシンによる置換、又は167位におけるグリシンのシステインによる置換及び417位におけるシステインのチロシンによる置換、又は167位におけるグリシンのシステインによる置換及び171位におけるアラニンのグリシンによる置換、又は417位におけるシステインのチロシンによる置換及び171位におけるアラニンのグリシンによる置換、又は167位におけるグリシンのシステインによる置換、417位におけるシステインのチロシンによる置換及び171位におけるアラニンのグリシンによる置換を少なくとももたらす。
−パスツレラ科の、特に好ましくはバスフィア属の、及びさらにより好ましくはバスフィア・スクシニシプロデュセンスの改変細菌細胞、
−−ここで、好ましくはptsH遺伝子の欠失によって、特に配列番号5に記載の核酸配列を有し、配列番号6に記載のアミノ酸配列を有する酵素をコードするptsH遺伝子の改変によって、ptsH遺伝子によってコードされる酵素の活性が低減されている;
−−ここで、好ましくはldhA遺伝子及びpflA遺伝子の改変によって、特に配列番号7に記載の核酸配列を有し、配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するLdhAをコードするldhA遺伝子の改変によって、及び配列番号9に記載の核酸配列を有し、配列番号10に記載のアミノ酸配列を有するPflAをコードするpflA遺伝子の改変によって、又はldhA遺伝子及びpflD遺伝子の改変によって、特に配列番号7に記載の核酸配列を有し、配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するLdhAをコードするldhA遺伝子の改変によって、及び配列番号11に記載の核酸配列を有し、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するPflDをコードするpflD遺伝子の改変によって、乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸ギ酸リアーゼの活性が低減されている;
−−ここで、wcaJ遺伝子、又は少なくともその一部が欠失している、又は少なくとも一つの変異がwcaJ遺伝子、特に配列番号13に記載の核酸配列を有し、配列番号14に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするwcaJ遺伝子に導入されており、該少なくとも一つの変異が、好ましくはwcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸、好ましくは少なくとも125アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、及びもっと好ましくは少なくとも160アミノ酸が、C末端から欠失している酵素の発現をもたらす;
及び
−−ここで、少なくとも一つの変異がpykA遺伝子、特に配列番号15に記載の核酸配列を有し、配列番号16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするpykA遺伝子に導入されており、好ましくは少なくとも一つの変異がpykA遺伝子によってコードされる酵素の少なくとも一つのアミノ酸の置換をもたらし、最も好ましくは変異が、pykA遺伝子によってコードされる酵素における、167位におけるグリシンのシステインによる置換、又は417位におけるシステインのチロシンによる置換又は171位におけるアラニンのグリシンによる置換、又は167位におけるグリシンのシステインによる置換及び417位におけるシステインのチロシンによる置換、又は167位におけるグリシンのシステインによる置換及び171位におけるアラニンのグリシンによる置換、又は417位におけるシステインのチロシンによる置換及び171位におけるアラニンのグリシンによる置換、又は167位におけるグリシンのシステインによる置換、417位におけるシステインのチロシンによる置換及び171位におけるアラニンのグリシンによる置換を少なくとももたらす。
I)本発明に従う改変微生物を、改変微生物が有機化合物を生産することを可能にする少なくとも一つの同化可能な炭素源を含む培養培地で培養し、それによって有機化合物を含む発酵ブロスを得るステップ;
II)プロセスステップI)で得られる発酵ブロスから有機化合物を回収するステップ
を含む、有機化合物の生産方法によって提供される。
同化可能な炭素源:ショ糖
温度:30〜45℃
pH:5.5〜7.0
供給ガス:CO2
である。
III)少なくとも一つの化学反応による、前記有機化合物と異なる二次有機産物への、プロセスステップI)で得られる発酵ブロスに含まれる有機化合物の変換、又はプロセスステップII)で得られる回収される有機化合物の変換
を含む。
b1)プロセスステップI)又はII)で得られるコハク酸の、THF及び/又はBDO及び/又はGBLへの直接的触媒水素化、又は
b2)プロセスステップI)又はII)で得られるコハク酸及び/又はコハク酸塩の、対応するジ低級アルキルエステルへの化学的エステル化、及びそれに続く前記エステルのTHF及び/又はBDO及び/又はGBLへの触媒水素化、
のいずれかを含む。
b)プロセスステップI)又はII)で得られるコハク酸アンモニウム塩の、それ自体は公知である方法におけるピロリドンへの化学的変換
を含む。
前培養を調製するために、DD1を凍結ストックから100ml振盪フラスコ中の40ml BHI(ブレインハートインフュージョン、Becton, Dickinson and Company)に接種した。インキュベーションを、37℃;200rpmで一晩行った。本培養を調製するために、100mlのBHIを250ml振盪フラスコに入れ、0.2の最終OD(600nm)で前培養を接種した。インキュベーションを、37℃、200rpmで行った。約0.5、0.6、及び0.7のODで細胞を回収し、ペレットを一度4℃で10%の冷グリセロールで洗浄し、2mlの10%グリセロール(4℃)に再懸濁した。
a)欠失構築物の作製
欠失プラスミドは、pSacBベクター(配列番号17)に基づいて構築した。図1は、pSacBプラスミドの模式的なマップを示す。欠失されるべき染色体フラグメントの5'及び3'フランキング領域(それぞれ約1500bp)は、バスフィア・スクシニシプロデュセンスの染色体DNAからPCRによって増幅し、標準的な方法を用いて前記ベクターに導入した。通常、少なくともORFの80%が欠失のために標的化された。かかる方法では、乳酸デヒドロゲナーゼldhAのための欠失プラスミド、pSacB_delta_ldhA(配列番号18)、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflAのための欠失プラスミド、pSacB_delta_pflA(配列番号19)、ptsA遺伝子、psacB_delta_ptsA(配列番号22)、及びptsH遺伝子、psacB_delta_ptsH(配列番号23)。図2、3、6及び7は、それぞれpSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA、psacB_delta_ptsA及びpsacB_delta_ptsHプラスミドの模式的マップを示す。
b)pykA遺伝子、及びwcaJ遺伝子への点突然変異の導入のために用いた構築物の作製
pSacB_pykA1(配列番号20)のプラスミド配列では、バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるpykA遺伝子の一部は塩基6〜1185に含まれる。sacB遺伝子は塩基3458〜4879に含まれる。sacBプロモーターは塩基4880〜5342に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基1604〜2062に含まれる。大腸菌の複製開始点(ori EC)は塩基2555〜3415に含まれる(図4を参照されたい)。プラスミドpSacB_pykA1は、最終的にPykAタンパク質(配列番号16)の167位のG(グリシン)のC(システイン)への置換をもたらす、pykA遺伝子中のGのTへの変異を導入する。
a)バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1を、pSacB_delta_ldhAにより上記の通り形質転換し、「キャンベルイン」して「キャンベルイン」株を得た。バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムへの形質転換及び組込みは、バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムへのプラスミドの組込み事象のPCRで得られるバンドによって確認した。
生産性を、下記の培地及びインキュベーション条件を用いて分析した。
培養培地CGMの組成及び調製は、以下の表2に記載される通りである。
前培養増殖のために、BHI寒天プレートで新たに増殖させた細菌(嫌気条件下で37℃で一晩インキュベートした)を用い、CO2雰囲気下で、表2に記載された50mlのCGM液体培地を含み、気密ブチルゴム栓を有する100ml血清ボトルにOD600=0.75で接種した。ボトルを、37℃及び170rpmでインキュベートした(振盪直径:2.5cm)。主培養増殖のために、(10hのインキュベーション後の)CGM培地中の2.5mlの細菌培養物を用い、CO2雰囲気下で、50mLの表5に記載されたLSM_3液体培地を含み、気密ブチルゴム栓を有する100ml血清ボトルに接種した。コハク酸の生産を、HPLCを介して(HPLC法は、表7及び8に記載されている)定量した。細胞の増殖を、分光光度計(Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Sweden)を用いて600nmの吸光度(OD600)を測定することによって測定した。
様々なDD1株の培養実験の結果を表6に示す。
Claims (15)
- 野生型に比べて、
−ptsA遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、
−ptsH遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、又は
−ptsA遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性及びptsH遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性
を有する改変微生物であって、改変微生物が由来する野生型が、パスツレラ科の科に属する、上記改変微生物。 - 改変微生物が由来する野生型が、バスフィア属に属する、請求項1に記載の改変微生物。
- ptsA遺伝子が、以下:
a1)配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸;
b1)配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸;
c1)a1)又はb1)の核酸と少なくとも70%同一である核酸であって、同一性がa1)又はb1)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
d1)a1)又はb1)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がa1)又はb1)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
e1)a1)又はb1)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
f1)a1)又はb1)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記a1)又はb1)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む、請求項1又は2に記載の改変微生物。 - ptsH遺伝子が、以下:
a2)配列番号5のヌクレオチド配列を有する核酸;
b2)配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸;
c2)a2)又はb2)の核酸と少なくとも70%同一である核酸であって、同一性がa2)又はb2)の核酸の全長にわたる同一性である核酸;
d2)a2)又はb2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がa2)又はb2)の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸;
e2)a2)又はb2)に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸;及び
f2)a2)又はb2)のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記a2)又はb2)の核酸とは異なる核酸;
からなる群より選択される核酸を含む、請求項1又は2に記載の改変微生物。 - 前記微生物が野生型と比べて、以下の特徴:
i)低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性、
ii)低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性、
iii)wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、
iv)pykA遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性、
の少なくとも一つをさらに有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の改変微生物。 - 前記微生物が、以下のA)〜E)の遺伝的改変:
A)ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
B)pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;又は
pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
C)wcaJ遺伝子又は少なくともその一部の欠失、wcaJ遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はwcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
D)pykA遺伝子によってコードされる酵素の活性を少なくとも低減する、pykA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pykA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpykA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
E)ptsA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ptsA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はptsA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び/又は
ptsH遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ptsH遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はptsH遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
の少なくとも一つを含む、請求項5に記載の改変微生物。 - 前記微生物が、以下:
A)ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
B)pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
C)トランケートされたwcaJ遺伝子によってコードされる酵素の発現をもたらす、wcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
D)pykA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;及び
E)ptsA遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
を含む、請求項6に記載の改変微生物。 - 前記微生物が、以下:
A)ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
B)pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
C)トランケートされたwcaJ遺伝子によってコードされる酵素の発現をもたらす、wcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;
D)pykA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入;及び
E)ptsH遺伝子又は少なくともその一部の欠失;
を含む、請求項6に記載の改変微生物。 - I)請求項1〜8のいずれか一項に記載の改変微生物を、改変微生物が有機化合物を生産することを可能にする少なくとも一つの同化可能な炭素源を含む培養培地で培養し、それによって有機化合物を含む発酵ブロスを得るステップ;
II)プロセスステップI)で得られる発酵ブロスから有機化合物を回収するステップ
を含む、有機化合物の生産方法。 - 有機化合物が、コハク酸である、請求項9に記載の方法。
- 二酸化炭素を除く同化可能な炭素源の総重量に基づいて、同化可能な炭素源の少なくとも50重量%がショ糖である、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記方法がプロセスステップ:
III)少なくとも一つの化学反応による、前記有機化合物と異なる二次有機産物への、プロセスステップI)で得られる発酵ブロスに含まれる有機化合物の変換、又はプロセスステップII)で得られる回収される有機化合物の変換
をさらに含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。 - 有機化合物がコハク酸であり、二次有機産物が、コハク酸エステル又はそのポリマー、テトラヒドロフラン(THF)、1,4-ブタンジオール(BDO)、γ-ブチロラクトン(GBL)及びピロリドンからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 有機化合物の発酵生産のための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の改変微生物の使用。
- 有機化合物がコハク酸であり、ショ糖が同化可能な炭素源として用いられる、請求項14に記載の使用。
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