KR20170003630A - 수크로스 상의 정밀 화학물질의 개선된 생산을 위한 유전자 변형된 미생물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 야생형과 비교하여 - ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성, - ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 또는 - ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 및 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성을 갖는 변형된 미생물에 관한 것이며, 여기서 변형된 미생물이 유래된 야생형은 파스테우렐라세아에 과에 속한다. 본 발명은 또한 숙신산을 생산하는 방법 및 변형된 미생물의 용도에 관한 것이다.

Description

수크로스 상의 정밀 화학물질의 개선된 생산을 위한 유전자 변형된 미생물 {GENETICALLY MODIFIED MICROORGANISM FOR IMPROVED PRODUCTION OF FINE CHEMICALS ON SUCROSE}
본 발명은 변형된 미생물, 유기 화합물을 생산하는 방법 및 변형된 미생물의 용도에 관한 것이다.
유기 화합물, 예컨대 6개 이하의 탄소를 갖는 소형 디카르복실산은 다수의 용도를 가지면서 상업적으로 중요한 화학물질이다. 예를 들어, 소형 이산은 1,4-이산, 예컨대 숙신산, 말산 및 타르타르산, 및 5-탄소 분자 이타콘산을 포함한다. 다른 이산은 2 탄소 옥살산, 3 탄소 말론산, 5 탄소 글루타르산 및 6 탄소 아디프산을 포함하고, 또한 이러한 이산의 다수의 유도체가 존재한다.
기로서 소형 이산은 일부 화학적 유사성을 갖고, 중합체 생산에 있어서 그들의 용도는 특수한 특성을 수지에 제공할 수 있다. 이러한 다용도성은 그들을 하류의 화학 인프라 시장에 용이하게 적합하도록 한다. 예를 들어, 1,4-이산 분자는 그들이 다양한 산업적 화학물질 (테트라히드로푸란, 부티로락톤, 1,4-부탄디올, 2-피롤리돈) 및 숙시네이트 유도체 숙신디아미드, 숙시노니트릴, 디아미노부탄 및 숙시네이트의 에스테르로 전환된다는 점에서 대규모 화학적 말레산 무수물의 다수의 용도를 충족시킨다. 타르타르산은 식품, 가죽, 금속 및 인쇄 산업에서 다수의 용도를 갖는다. 이타콘산은 3-메틸피롤리돈, 메틸-BDO, 메틸-THF 및 다른 것의 생산을 위한 출발 물질을 형성한다.
특히, 숙신산 또는 숙시네이트 - 이들 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨 - 는 식품, 화학 및 제약 산업에서 산업적으로 중요한 다수의 화학물질의 전구체로서 사용되어 왔기 때문에 상당한 관심을 이끌었다. 실제로, 미국 에너지부로부터의 보고는 숙신산이 바이오매스로부터 제조된 12종의 상위 화학적 빌딩 블록 중 1종이라고 보고한다. 따라서, 박테리아에서 이산을 만드는 능력은 유의한 상업적 중요성을 가질 것이다.
WO-A-2009/024294는 원래 반추위로부터 단리된 파스테우렐라세아에(Pasteurellaceae) 과의 구성원이며 글리세롤을 탄소 공급원으로서 사용할 수 있는 숙신산 생산 박테리아 균주, 및 상기 능력을 보유하는 그로부터 유래된 변이체 및 돌연변이체 균주, 특히 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 독일 D-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7베)에 기탁 번호 DSM 18541 (ID 06-614)로 기탁된 DD1로 지정된 숙신산을 생산하는 능력을 갖는 박테리아 균주를 개시한다. DD1-균주는 문헌 [Kuhnert et al., 2010]에 의해 분류된 바와 같이 바스피아 숙시니시프로두센스(Basfia succiniciproducens) 종 및 파스테우렐라세아에 과에 속한다. ldhA-유전자 및/또는 pflD- 또는 pflA-유전자가 파괴된 이들 균주의 돌연변이는 WO-A-2010/092155에 개시되며, 이들 돌연변이체 균주는 WO-A-2009/024294에 개시된 DD1-야생형과 비교하여 혐기성 조건 하에, 탄소 공급원, 예컨대 글리세롤 또는 글리세롤 및 탄수화물, 예컨대 말토스의 혼합물로부터의 숙신산의 유의하게 증가된 생산을 특징으로 한다.
그러나, 생물-기반 숙시네이트는 석유화학-기반 대안에 대해 비용 경쟁적이 되는 과제를 여전히 직면한다. 숙신산의 생물-기반 산업적 생산을 개발하기 위해, 세포를 저렴한 배지에서 성장시키는 것은 중요할 것이고, 작업 균주는 최적으로는 가장 저렴한 이용가능한 원료가 사용될 수 있도록 우수한 수율로 숙신산을 생산하기 위해 광범위한 저비용 당 공급원료를 대사할 수 있어야 한다.
수크로스 (통상적으로 당으로 공지됨)는 글루코스 및 프룩토스로 이루어진 디사카라이드이고, 이는 자연에 매우 풍부하고 광합성 능력을 갖는 모든 식물로부터 생산되는 탄소 공급원이다. 특히, 사탕수수 및 사탕무는 다량의 수크로스를 함유하고, 전세계 수크로스의 60% 초과는 현재 사탕수수로부터 생산되고 있다. 특히, 수크로스는 사탕수수의 기계적 가압에 의해 수득된 추출물을 증발/농축시키는 단순한 공정을 통해 산업적으로 생산될 수 있기 때문에, 이는 매우 저비용으로 생산된다. 미생물 발효를 통해 화학적 화합물을 생산하기 위한 원료로서의 수크로스는 따라서 비싸지 않고, 이는 또한 문헌 [Kilimann et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1764, 2006)]에 제시된 바와 같이 세포 막을 다량의 목적하는 대사물을 함유하는 외부 환경으로부터 보호하고, 그에 따라 고농도의 목적하는 대사물을 생산하는 기능을 한다.
수크로스가 낮은 가격 및 미생물을 외부 환경으로부터 보호하는 기능을 포함하는 상기 기재된 장점을 갖는 탁월한 원료일지라도, 이 탄소 공급원의 단점은 다수의 미생물이 수크로스를 세포로 수송하고, 수송된 수크로스를 분해하고, 분해된 생성물을 당분해로 연결하는 완전한 메카니즘을 가지고 있지 않고, 그에 따라 수크로스를 탄소 공급원으로서 사용할 수 없다는 사실에서 나타날 수 있다. 심지어 수크로스를 사용할 수 있는 메카니즘을 갖는 미생물의 경우에도, 탄소 공급원으로서의 수크로스의 섭취 및 분해 속도가 매우 낮기 때문에, 그들은 목적하는 대사물을 효율적으로 생산할 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 극복하는 것이다.
특히, 유기 화합물, 예컨대 숙신산의 발효적 생산에 사용될 수 있고, 성장률 또는 수율을 희생시키지 않으면서 수크로스를 우세한 탄소 공급원으로서 효율적으로 사용할 수 있는 미생물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 바람직하게는 상기 미생물은 수많은 저렴한 탄소 공급원을 사용하고, 탁월한 수율의 유기 화합물, 예컨대 숙신산을 생성할 수 있을 것이다. 숙신산의 발효적 생산에 사용되는 선행 기술의 재조합 미생물과 비교하여, 본 발명의 미생물은 우세한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서의 세포의 성장 동안 증가된 숙신산 수율 및 증가된 탄소 수율을 특징으로 하여야 한다.
상기 언급된 목적을 달성하는 것에 대한 기여는 그의 야생형과 비교하여
- ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성,
- ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 또는
- ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 및 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성
을 갖는 변형된 미생물에 의해 제공되며, 여기서 변형된 미생물이 유래된 야생형은 파스테우렐라세아에 과에 속한다.
상기 언급된 목적을 달성하는 것에 대한 기여는 특히
- ptsA-유전자 또는 그의 일부,
- ptsH-유전자 또는 그의 일부, 또는
- ptsA-유전자 또는 그의 일부 및 ptsH-유전자 또는 그의 일부
가 결실되거나, 또는 이들 유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부가 결실되거나, 또는 적어도 1개의 돌연변이가 이들 유전자 내로 도입된 변형된 미생물에 의해 제공되며, 여기서 변형된 미생물이 유래된 야생형은 파스테우렐라세아에 과에 속한다.
놀랍게도, 파스테우렐라세아에 과에 속하는 미생물에서의 예를 들어 ptsA-유전자 또는 그의 일부 및/또는 ptsH-유전자 또는 그의 일부의 결실에 의한 ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소 (이 효소는 포스포엔올피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템의 에너지 커플링 효소 I임)의 활성의 감소 및/또는 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소 (이 효소는 포스포엔올피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템의 히스티딘-함유 단백질 HPr임)의 활성의 감소는 이러한 효소 또는 이들 효소들의 활성이 감소되지 않은 상응하는 미생물과 비교하여, 특히 이들 변형된 미생물이 동화가능한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 성장되는 경우에, 유기 화합물, 예컨대 숙신산의 증가된 수율을 특징으로 하는 변형된 미생물을 발생시킨다는 것이 발견된 바 있다. 이는 파스테우렐라세아에 과에 속하는 미생물, 예컨대 바스피아 속의 미생물, 특히 바스피아 숙시니시프로두센스 종의 미생물에서, 포스포엔올피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템 (즉, PTS-시스템)이 세포 내로의 프룩토스의 섭취를 담당한다는 점에서 사실상 놀라운 것이다. 바스피아-균주가 수크로스 상에서 배양되는 경우에, 디사카라이드는 글루코스-6-포스페이트 및 프룩토스를 수득하기 위해 세포 내에서 가수분해된다. 그러나 프룩토스는 가수분해 후에 분비되고, 프룩토스 PTS-시스템을 사용하는 세포에 의해 다시 흡수된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 따라서 PTS-시스템의 불활성화를 발생시키는 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자의 불활성화는, 세포가 우세한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 배양되는 경우에 적어도 디사카라이드 (즉, 프룩토스)의 일부가 세포 내로 유입될 수 없기 때문에 숙신산의 감소된 형성으로 이어질 것이라고 가정할 것이다.
표현 "그의 야생형과 비교하여 x-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성을 갖는 변형된 미생물" (여기서 x-유전자는 ptsA-유전자 또는 ptsH-유전자이고, 임의로 하기 기재되는 바와 같은 ldhA-유전자, pflA-유전자, pflD-유전자, wcaJ-유전자 및/또는 pykA-유전자임)과 관련하여, 용어 "야생형"은 x-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성이 감소되지 않은 미생물, 즉 그의 게놈이 x-유전자의 유전자 변형의 도입 이전과 같은 상태로 존재하는 미생물을 지칭한다. 바람직하게는, 표현 "야생형"은 그의 게놈, 특히 그의 x-유전자가 진화의 결과로서 자연적으로 생성되는 것과 같은 상태로 존재하는 미생물 (예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 진균 세포 등)을 지칭한다. 용어는 전체 미생물 및 개별 유전자 둘 다에 대해 사용된다. 따라서, 용어 "야생형"은 바람직하게는 특히 그의 유전자 서열이 재조합 방법의 수단에 의해 인간에 의해 적어도 부분적으로 변형된 미생물, 또는 그러한 유전자를 포괄하지 않는다. 용어 "변형된 미생물"은 따라서 그것이 유래된 자연-발생 야생형 미생물과 비교하여 변경된, 변형된 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형 (예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미치는 경우)을 나타내도록 유전자 변경된, 변형된 또는 조작된 (예를 들어, 유전자 조작된) 미생물을 포함한다. 본 발명에 따른 변형된 미생물의 특정한 바람직한 실시양태에 따르면, 변형된 미생물은 재조합 미생물이며, 이는 미생물이 재조합 DNA를 사용하여 수득되었음을 의미한다. 본원에 사용된 표현 "재조합 DNA"는 실험실 방법 (분자 클로닝)을 사용하여 다중 공급원으로부터의 유전 물질을 함께 가져와, 생물학적 유기체에서 달리 찾아볼 수 없는 서열을 생성함으로써 생성된 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 재조합 DNA의 예는 이종 DNA-서열이 삽입된 플라스미드이다.
본 발명에 따른 미생물이 유래된 야생형은 파스테우렐라세아에 과에 속한다. 파스테우렐라세아에는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)와 같은 박테리아에서부터 동물 및 인간 점막의 공생생물에 이르는 구성원을 갖는 그람-음성 프로테오박테리아의 거대 과를 포함한다. 대부분의 구성원은 조류 및 포유동물의 점막 표면 상에서, 특히 상기도에서 공생생물로서 산다. 파스테우렐라세아에는 전형적으로 막대형이고, 통성 혐기성균의 주목할 만한 군이다. 이들은 옥시다제의 존재에 의해 관련 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)와 구별될 수 있고, 편모의 부재에 의해 대부분의 다른 유사한 박테리아와 구별될 수 있다. 파스테우렐라세아에 과의 박테리아는 대사 특성 및 그의 16S RNA 및 23S RNA의 서열에 기초하여 다수의 속으로 분류되었다. 대부분의 파스테우렐라세아에는 피루베이트-포르메이트-리아제 유전자를 함유하고, 탄소 공급원을 유기 산으로 혐기적으로 발효시킬 수 있다.
본 발명에 따른 변형된 미생물의 특정한 바람직한 실시양태에 따르면, 변형된 미생물이 유래된 야생형은 바스피아(Basfia) 속에 속하고, 변형된 미생물이 유래된 야생형이 바스피아 숙시니시프로두센스 종에 속하는 것이 특히 바람직하다.
가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 변형된 미생물이 유래된 야생형은 부다페스트 조약 하에 독일 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하, 독일 D-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7베)에 기탁 번호 DSM 18541로 2006년 8월 11일에 기탁된 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1이다. 이 균주는 원래 독일 기원의 소의 반추위로부터 단리되었다. 파스테우렐라(Pasteurella) 박테리아는 동물 및, 바람직하게는 포유동물의 위장관으로부터 단리될 수 있다. 박테리아 균주 DD1은 특히 소의 반추위로부터 단리될 수 있고, 탄소 공급원으로서 글리세롤 (조 글리세롤 포함)을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 변형된 미생물을 제조하는데 사용될 수 있는 바스피아 속의 추가의 균주는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하로부터 DSM 번호 22022 하에 상업적으로 입수가능한 바스피아-균주 또는 스웨덴 괴테보르크 유니버시티 컬처 콜렉션 (Culture Collection of the University of Goeteborg) (CCUG, SE-413 46 괴테보르크 굴드헤드스카탄 10 고텐부르크 유니버시티 임상 박테리아학부)에 기탁 번호 CCUG 57335, CCUG 57762, CCUG 57763, CCUG 57764, CCUG 57765 또는 CCUG 57766으로 2009년 2월 27일에 기탁된 바스피아-균주이다. 상기 균주는 원래 독일 또는 스위스 기원의 소의 반추위로부터 단리되었다.
이와 관련하여 본 발명에 따른 변형된 미생물이 유래된 야생형이 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 또는 서열식별번호: 1과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.9%의 서열 상동성을 나타내는 서열의 16S rDNA를 갖는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 변형된 미생물이 유래된 야생형이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 2와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.9%의 서열 상동성을 나타내는 서열의 23S rDNA를 갖는 것이 또한 바람직하다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에 사용되는 다양한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 언급되는 백분율 값에서의 동일성은 바람직하게는, 예를 들어 디폴트 파라미터, 즉 갭 개방 (갭을 개방하기 위한 페널티): 10.0, 갭 연장 (갭을 연장하기 위한 페널티): 0.5, 및 데이터 파일 (패키지에 포함된 스코어링 매트릭스 파일): EDNAFUL을 갖는 생물정보학 소프트웨어 패키지 EMBOSS (버전 5.0.0, http://emboss.source-forge.net/what/)로부터의 프로그램 니들 (needle)의 보조 하에 (다소 유사한 서열에 대해) 계산된 동일성과 같은, 정렬된 서열의 완전한 길이에 걸친 잔기의 동일성으로서 계산된다.
본 발명에 따른 변형된 미생물이 상기 언급된 야생형-미생물, 특히 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1로부터 뿐만 아니라, 이들 균주의 변이체로부터 유래될 수 있다는 것을 유의해야 한다. 이와 관련하여 표현 "균주의 변이체"는 야생형-균주와 동일한 또는 본질적으로 동일한 특징을 갖는 모든 균주를 포함한다. 이와 관련하여 변이체의 16 S rDNA가 변이체가 유래된 야생형과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 적어도 99.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99.6%, 보다 바람직하게는 적어도 99.7%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8% 및 가장 바람직하게는 적어도 99.9%의 동일성을 갖는 것이 특히 바람직하다. 변이체의 23 S rDNA가 변이체가 유래된 야생형과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 적어도 99.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99.6%, 보다 바람직하게는 적어도 99.7%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8% 및 가장 바람직하게는 적어도 99.9%의 동일성을 갖는 것이 또한 특히 바람직하다. 본 정의의 의미에서 균주의 변이체는, 예를 들어 야생형-균주를 돌연변이유발성 화학적 작용제, X선, 또는 UV 광으로 처리함으로써 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 변형된 미생물은, 그의 야생형과 비교하여 ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성, ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 또는 ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 및 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
효소 활성의 감소 (Δ활성)는 하기와 같이 규정되며:
Figure pct00001
여기서, Δ활성을 결정하는 경우, 야생형에서의 활성 및 변형된 미생물에서의 활성은 정확히 동일한 조건 하에 결정된다. ptsA-유전자 및 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 검출 및 결정 방법은, 예를 들어 문헌 [Reizer et al.: "Evidence for the presence of heat-stable protein (HPr) and ATP-dependent HPr kinase in heterofermentative lactobacilli lacking phosphoenolpyruvate:glycose phosphotransferase activity"; Proc. Nadl. Acad. Sci. USA; Vol. 85, pages 2041-2045 (1988)]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 개시된 효소의 감소된 활성, 특히 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자, ldhA-유전자, pflA-유전자, pflD-유전자 및/또는 wcaJ-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성은 미생물의 야생형에서의 상기 효소의 활성과 비교하여 적어도 50%의 효소적 활성의 감소, 또는 적어도 90%의 효소적 활성의 감소, 또는 보다 바람직하게는 적어도 95%의 효소적 활성의 감소, 또는 보다 바람직하게는 적어도 98%의 효소적 활성의 감소, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 효소적 활성의 감소 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99.9%의 효소적 활성의 감소일 수 있다. pykA-유전자의 경우에, 감소된 활성은 바람직하게는 야생형 미생물에서의 상기 효소의 활성과 비교하여 0.1 내지 99%의 효소적 활성의 감소, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 75% 또는 적어도 85%, 또는 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 또는 적어도 88%, 또는 적어도 89%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 효소적 활성의 감소이다. 바람직하게는, pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소는 15 내지 99% 범위 내, 보다 바람직하게는 50 내지 95% 범위 내 및 보다 더 바람직하게는 90 내지 99% 범위 내이다. 용어 "x-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성"은 또한 이러한 특정한 효소의 검출가능한 활성을 전혀 갖지 않는 변형된 미생물을 포괄한다.
용어 "효소의 감소된 활성"은, 예를 들어 상기 미생물의 야생형에 의해 발현되는 것보다 낮은 수준에서의 상기 유전자 조작된 (예를 들어, 유전자 조작된) 미생물에 의한 효소의 발현을 포함한다. 효소의 발현을 감소시키기 위한 유전자 조작은 효소를 코딩하는 유전자 또는 그의 일부의 결실, (예를 들어, 강력한 프로모터 또는 억제성 프로모터의 제거에 의한) 효소를 코딩하는 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형, 효소를 코딩하는 유전자의 전사 및/또는 유전자 산물의 번역에 수반되는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 억제자, 인핸서, 전사 활성화제 등)의 변형, 또는 관련 기술분야에서 상용되는 특정한 유전자의 발현을 감소시키는 임의의 다른 통상적인 수단 (안티센스 핵산 분자, 또는 표적 단백질의 발현을 녹-아웃 또는 차단하는 다른 방법의 사용을 포함하나, 이에 제한되지는 않음)을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 또한, 탈안정화 요소를 mRNA 내로 도입하거나 RNA의 리보솜 결합 부위 (RBS)의 열화로 이어지는 유전자 변형을 도입할 수 있다. 유전자의 코돈 용법을 번역 효율 및 속도가 감소되는 방식으로 변화시키는 것이 또한 가능하다.
효소의 감소된 활성은 또한 효소의 감소된 활성으로 이어지는 하나 이상의 유전자 돌연변이를 도입함으로써 수득될 수 있다. 또한, 효소의 활성의 감소는 또한 그의 활성이 감소되어야 할 효소를 활성화시키기 위해 필요한 활성화 효소의 불활성화 (또는 감소된 발현)를 포함할 수 있다. 후자의 접근법에 의해 그의 활성이 감소되어야 할 효소는 바람직하게는 불활성화된 상태로 유지된다.
ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성을 갖는 미생물은 자연적으로, 즉 자연 돌연변이로 인해 발생할 수 있다. 미생물은 다양한 기술, 예컨대 화학적 처리 또는 방사선에 의해 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성이 결여되거나 또는 유의하게 감소되도록 변형될 수 있다. 이를 위해, 미생물은 예를 들어 돌연변이유발성 화학적 작용제, X선 또는 UV 광에 의해 처리될 것이다. 후속 단계에서, ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성을 갖는 미생물이 선택될 것이다. 변형된 미생물은 또한 미생물의 게놈에서 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자를 돌연변이시키거나, 파괴하거나, 절제하는 것 또는 유전자를 야생형-유전자에 의해 코딩된 효소와 비교하여 감소된 활성을 갖는 효소를 코딩하는 상응하는 유전자로 치환하는 것을 목적으로 하는 상동 재조합 기술에 의해 수득가능하다.
본 발명에 따른 변형된 미생물의 바람직한 실시양태에 따르면, ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소는 ptsA-유전자 및 ptsH-유전자 각각의 변형에 의해 달성되며, 여기서 이러한 유전자 변형은 바람직하게는 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자 또는 이들 유전자의 적어도 일부의 결실, ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자의 조절 요소 또는 이들 조절 요소의 일부, 예컨대 프로모터 서열의 결실에 의해, 또는 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입에 의해 실현된다.
하기에는, 재조합에 적합한 기술, 특히 돌연변이를 도입하거나 또는 서열을 결실시키는데 적합한 기술이 기재되어 있다.
이 기술은 또한 본원에서 때때로 "캠벨(Campbell) 재조합"으로 지칭된다 (Leenhouts et al., Appl Env Microbiol. (1989), Vol. 55, pages 394-400). 본원에 사용된 "캠벨 인(Campbell in)"은 전체 원형 이중 가닥 DNA 분자 (예를 들어, 플라스미드)가 단일 상동 재조합 사건 (크로스 인 사건)에 의해 염색체 내로 통합되고, 상기 원형 DNA 분자의 선형화 버전을 상기 원형 DNA 분자의 제1 DNA 서열에 상동성인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입시키는 원래 숙주 세포의 형질전환체를 지칭한다. "캠벨드 인(Campbelled in)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 통합된 선형화 DNA 서열을 지칭한다. "캠벨 인"은 제1 상동 DNA 서열의 복제물을 함유하며, 이들 각각의 카피는 상동 재조합 교차 점의 카피를 포함하고 이를 둘러싼다.
본원에 사용된 "캠벨 아웃(Campbell out)"은, 제2 상동 재조합 사건 (크로스 아웃 사건)이 "캠벨드 인" DNA의 삽입된 선형화 DNA 상에 함유된 제2 DNA 서열과 상기 선형화 삽입물의 제2 DNA 서열에 상동성인 염색체 기원의 제2 DNA 서열 사이에서 발생한 "캠벨 인" 형질전환체로부터의 세포를 지칭하며, 제2 재조합 사건은 통합된 DNA 서열의 부분의 결실 (폐기)을 일으킬 뿐만 아니라, 또한 중요하게는 염색체에 남아있는 통합된 캠벨드 인 DNA의 부분 (이는 단일 염기만큼 작을 수 있음)을 생성시켜, 원래 숙주 세포와 비교하여 "캠벨 아웃" 세포가 염색체에서 하나 이상의 의도적인 변화 (예를 들어, 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 이종 유전자 또는 DNA 서열의 삽입, 상동 유전자 또는 변형된 상동 유전자의 추가의 카피 또는 카피들의 삽입, 또는 상기에 열거된 이들 상기 언급된 예 중 1개 초과를 포함하는 DNA 서열의 삽입)를 함유하도록 한다. "캠벨 아웃" 세포는 바람직하게는, "캠벨드 인" DNA 서열의 부분 (폐기시키는 것이 요구되는 부분)에 함유된 유전자, 예를 들어 약 5% 내지 10% 수크로스의 존재 하에 성장시킨 세포에서 발현되는 경우에 치명적인 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) sacB-유전자에 대한 역-선택에 의해 수득된다. 역-선택을 사용하거나 사용하지 않고서도, 목적하는 "캠벨 아웃" 세포는 임의의 스크리닝 표현형, 예컨대 비제한적으로 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 내성의 존재 또는 부재, 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 주어진 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 콜로니 핵산 혼성화, 항체 스크리닝 등을 사용하여, 목적하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 수득되거나 식별될 수 있다. 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"은 또한, 다양한 시제의 동사로서 상기 기재된 방법 또는 공정을 지칭하는데 사용될 수 있다.
"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"으로 이어지는 상동 재조합 사건은 상동 DNA 서열 내의 소정의 범위의 DNA 염기에 걸쳐 발생할 수 있고, 상동 서열은 이 범위의 적어도 일부에 대해 서로 동일할 것이기 때문에, 교차 사건이 발생하는 곳을 정확하게 명시하는 것은 통상적으로 가능하지 않는 것이 이해된다. 다시 말해서, 어떠한 서열이 삽입된 DNA로부터 기원하는지, 및 어떠한 서열이 염색체 DNA로부터 기원하는지를 정확하게 명시하는 것은 가능하지 않다. 더욱이, 제1 상동 DNA 서열 및 제2 상동 DNA 서열은 통상적으로 부분 비-상동성 영역에 의해 분리되고, "캠벨 아웃" 세포의 염색체에 침착된 채로 있는 것이 이러한 비-상동성 영역이다.
바람직하게는, 제1 및 제2 상동 DNA 서열은 적어도 약 200개 염기 쌍 길이이고, 수천개 이하의 염기 쌍 길이일 수 있다. 그러나, 절차는 보다 짧거나 보다 긴 서열을 사용하여 수행되도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 상동 서열에 대한 길이는 약 500 내지 2000개 염기의 범위일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 수득하는 것은 제1 및 제2 상동 서열을 거의 동일한 길이가 되도록, 바람직하게는 200개 미만의 염기 쌍 차이를 갖도록, 가장 바람직하게는 2개의 서열 중 보다 짧은 것이 보다 긴 것의 염기 쌍 길이의 적어도 70%가 되도록 배열함으로써 용이하게 된다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에서 그의 활성이 감소되는 ptsA-유전자는 바람직하게는
a1) 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
b1) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
c1) a1) 또는 b1)의 핵산과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 (동일성은 a1) 또는 b1)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
d1) a1) 또는 b1)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 a1) 또는 b1)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
e1) 엄격한 조건 하에 a1) 또는 b1)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
f1) a1) 또는 b1)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 a1) 또는 b1)의 핵산과는 상이한 핵산
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에서 그의 활성이 감소되는 ptsH-유전자는 바람직하게는
a2) 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
b2) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
c2) a2) 또는 b2)의 핵산과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 (동일성은 a2) 또는 b2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
d2) a2) 또는 b2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 a2) 또는 b2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
e2) 엄격한 조건 하에 a2) 또는 b2)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
f2) a2) 또는 b2)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 a2) 또는 b2)의 핵산과는 상이한 핵산
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "혼성화"는 "핵산 분자의 가닥이 염기 쌍형성을 통해 상보적 가닥과 연결되는 임의의 공정"을 포함한다 (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). 혼성화 및 혼성화의 강도 (즉, 핵산 분자 사이의 회합의 강도)는 핵산 분자 사이의 상보성 정도, 수반된 조건의 엄격도, 형성된 하이브리드의 Tm, 및 핵산 분자 내의 G:C 비와 같은 인자에 의해 영향을 받는다.
본원에 사용된 용어 "Tm"은 "용융 온도"에 관하여 사용된다. 용융 온도는 이중-가닥 핵산 분자의 집단이 단일 가닥으로 절반 해리되는 온도이다. 핵산 분자의 Tm을 계산하기 위한 방정식은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 표준 참고문헌에 나타난 바와 같이, Tm 값의 간단한 추정은, 핵산 분자가 수용액 중에 1 M NaCl로 있는 경우에, 식: Tm = 81.5 + 0.41(% G+C)로 계산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)] 참조). 다른 참고문헌은 보다 복잡한 계산을 포함하며, 이는 Tm을 계산하기 위해 구조적 특징뿐만 아니라 서열 특징을 고려한다. 엄격한 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다.
특히, 용어 "엄격도 조건"은 단편이거나 또는 상보적 핵산 분자 (DNA, RNA, ssDNA 또는 ssRNA)와 동일한 100개 이상의 인접 뉴클레오티드, 150개 이상의 인접 뉴클레오티드, 200개 이상의 인접 뉴클레오티드 또는 250개 이상의 인접 뉴클레오티드가 50℃ 또는 65℃, 바람직하게는 65℃에서의 2 x SSC, 0.1% SDS 중 세척을 수반하는 50℃에서의 7% 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA 중 혼성화와 동등한 조건 하에서 특정 핵산 분자 (DNA; RNA, ssDNA 또는 ssRNA)와 혼성화하는 조건을 지칭한다. 바람직하게는, 혼성화 조건은 50℃ 또는 65℃, 바람직하게는 65℃에서의 1 x SSC, 0.1% SDS 중 세척을 수반하는 50℃에서의 7% 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA 중 혼성화와 동등하며, 보다 바람직하게는 혼성화 조건은 50℃ 또는 65℃, 바람직하게는 65℃에서의 0.1 x SSC, 0.1% SDS 중 세척을 수반하는 50℃에서의 7% 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA 중 혼성화와 동등하다. 바람직하게는, 상보적 뉴클레오티드는 단편 또는 전체 wcaJ 핵산과 혼성화한다. 대안적으로, 바람직한 혼성화 조건은 65℃에서의 1 x SSC 중 또는 42℃에서의 1 x SSC 및 50% 포름아미드 중 혼성화 후 65℃에서의 0.3 x SSC 중 세척, 또는 50℃에서의 4 x SSC 중 또는 40℃에서의 6 x SSC 및 50% 포름아미드 중 혼성화 후 50℃에서의 2 x SSC 중 세척을 포괄한다. 추가의 바람직한 혼성화 조건은 0.1% SDS, 0.1 SSD 및 65℃이다.
상기 언급된 "캠벨 재조합"에 의해 결실될 수 있거나 적어도 1개의 돌연변이가 상기 언급된 "캠벨 재조합"에 의해 도입되는 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자 또는 이들 유전자의 일부는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 핵산을 포함한다.
서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1의 ptsA-유전자 및 ptsH-유전자에 상응한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물의 바람직한 실시양태에 따르면, 이 미생물은 ptsA-유전자 및/또는 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성을 특징으로 할 뿐만 아니라 야생형과 비교하여 하기 특성 중 적어도 1개를 특징으로 한다:
i) 감소된 피루베이트 포르메이트 리아제 활성;
ii) 감소된 락테이트 데히드로게나제 활성;
iii) wcaJ-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성;
iv) pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성.
이와 관련하여 특히 바람직한 변형된 미생물은 하기 특성 또는 특성의 조합을 갖는 것이고: i), ii), iii), iv), i)ii), i)iii), i)iv), ii)iii), ii)iv), iii)iv), i)ii)iii), i)ii)iv), i)iii)iv), ii)iii)iv) 및 i)ii)iii)iv), 여기서 특성 i), ii), iii) 및 iv)를 특징으로 하는 변형된 미생물이 가장 바람직하다.
락테이트 데히드로게나제가 결핍된 및/또는 피루베이트 포르메이트 리아제 활성이 결핍된 변형된 미생물은 WO-A-2010/092155, US 2010/0159543 및 WO-A-2005/052135에 개시되어 있으며, 미생물에서의, 바람직하게는 파스테우렐라 속의 박테리아 세포에서의, 특히 바람직하게는 바스피아 숙시니시프로두센스 균주 DD1에서의 락테이트 데히드로게나제 및/또는 피루베이트 포르메이트 리아제의 활성을 감소시키는 상이한 접근법에 관한 그의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다. 피루베이트 포르메이트 리아제 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Asanuma N. and Hino T. in "Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis", Appl. Environ. Microbiol. (2000), Vol. 66, pages 3773-3777]에 의해 개시되고, 락테이트 데히드로게나제 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Bergmeyer, H.U., Bergmeyer J. and Grassl, M. (1983-1986) in "Methods of Enzymatic Analysis", 3rd Edition, Volume III, pages 126-133, Verlag Chemie, Weinheim]에 의해 개시된다.
이와 관련하여 락테이트 데히드로게나제의 활성의 감소는 ldhA-유전자 (락테이트 데히드로게나제; LdhA; EC 1.1.1.27 또는 EC 1.1.1.28을 코딩함)의 불활성화에 의해 달성되고, 피루베이트 포르메이트 리아제의 감소는 pflA-유전자 (피루베이트 포르메이트 리아제의 활성화제; PflA; EC 1.97.1.4를 코딩함) 또는 pflD-유전자 (피루베이트 포르메이트 리아제; PflD; EC 2.3.1.54를 코딩함)의 불활성화에 의해 달성되는 것이 바람직하며, 여기서 이들 유전자 (즉, ldhA, pflA 및 pflD)의 불활성화는 바람직하게는 이들 유전자 또는 그의 일부의 결실, 이들 유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 이들 유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입, 특히 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 "캠벨 재조합"의 수단에 의해 달성된다.
wcaJ-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소는 바람직하게는 wcaJ-유전자의 변형에 의해 달성되며, 여기서 이 유전자 변형은 바람직하게는 wcaJ-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, wcaJ-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부, 예컨대 프로모터 서열의 결실, 또는 wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입에 의해 실현된다. wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입과 관련하여 적어도 1개의 돌연변이가 wcaJ-유전자에 의해 코딩된 말단절단된 효소의 발현으로 이어지는 것이 특히 바람직하다. 말단절단된 효소에서 wcaJ-유전자에 의해 코딩된 야생형 효소의 적어도 100개 아미노산, 바람직하게는 적어도 125개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 150개 아미노산 및 가장 바람직하게는 적어도 160개 아미노산이 C-말단 단부로부터 결실되는 것이 또한 바람직하다. wcaJ-유전자에 의해 코딩된 이러한 말단절단된 효소는, 예를 들어 프레임 시프트 돌연변이로 이어지는 wcaJ-유전자 내의 적절한 위치에서 뉴클레오티드를 삽입하거나 결실시킴으로써 수득될 수 있고, 여기서 이 프레임 시프트 돌연변이의 수단에 의해 정지 코돈이 도입된다. 예를 들어, 위치 81의 티민과 위치 82의 아데닌 사이에 리신을 코딩하는 코돈의 뉴클레오티드를 삽입하는 것은 프레임 시프트 돌연변이로 이어지고, 그에 의해 정지 코돈이 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같이 도입된다. wcaJ-유전자의 이러한 돌연변이는, 예를 들어 부위-지정 또는 무작위 돌연변이유발에 이어서, 재조합에 의한 미생물의 게놈 내로의 변형된 유전자의 도입에 의해 도입될 수 있다. wcaJ-유전자의 변이체는 PCR의 수단에 의해 wcaJ-유전자 서열 서열식별번호: 13을 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. "퀵체인지(Quickchange) 부위-지정 돌연변이유발 키트" (스트라타진(Stratagene))는 지정된 돌연변이유발을 수행하는데 사용될 수 있다. 서열식별번호: 13의 전체 코딩 서열, 또는 단지 그의 일부에 걸친 무작위 돌연변이유발은 "진모르프(GeneMorph) II 무작위 돌연변이유발 키트" (스트라타진)의 도움 하에 수행될 수 있다.
pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소는 바람직하게는 pykA-유전자, 바람직하게는 야생형-pykA-유전자 내로 적어도 1개의 돌연변이를 도입하는 것에 의해 달성된다. 이와 관련하여 적어도 1개의 돌연변이는 pykA-유전자의 핵산 서열의 변형으로 이어져, 변형된 유전자에 의해 코딩된 효소의 아미노산 서열이 적어도 1개의 아미노산에서 야생형 pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 아미노산 서열과 상이하게 되는 것이 특히 바람직하다. pykA-유전자 내로의 돌연변이는, 예를 들어 부위-지정 또는 무작위 돌연변이유발에 이어서, 재조합에 의한 미생물의 게놈 내로의 변형된 유전자의 도입에 의해 도입될 수 있다. pykA-유전자의 변이체는 PCR에 의해 유전자 서열 서열식별번호: 15를 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. "퀵체인지 부위-지정 돌연변이유발 키트" (스트라타진)는 지정된 돌연변이유발을 수행하는데 사용될 수 있다. 서열식별번호: 15의 전체 코딩 서열, 또는 단지 그의 일부에 걸친 무작위 돌연변이유발은 "진모르프 II 무작위 돌연변이유발 키트" (스트라타진)의 도움 하에 수행될 수 있다. 돌연변이유발률은 사용된 주형 DNA의 양을 통해 돌연변이의 목적하는 양으로 설정된다. 다중 돌연변이는 개개의 돌연변이의 표적화 조합에 의해 또는 수회의 돌연변이유발 주기의 순차적 수행에 의해 생성된다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에서 그의 활성이 감소될 수 있는 ldhA-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:
α1) 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
α2) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
α3) α1) 또는 α2)의 핵산과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 (동일성은 α1) 또는 α2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
α4) α1) 또는 α2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 α1) 또는 α2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
α5) 엄격한 조건 하에 α1) 또는 α2)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
α6) α1) 또는 α2)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 α1) 또는 α2)의 핵산과는 상이한 핵산.
서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1의 ldh-유전자에 상응한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에서 그의 활성이 감소될 수 있는 pflA-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:
β1) 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
β2) 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
β3) β1) 또는 β2)의 핵산과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 (동일성은 β1) 또는 β2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
β4) β1) 또는 β2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 β1) 또는 β2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
β5) 엄격한 조건 하에 β1) 또는 β2)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
β6) β1) 또는 β2)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 β1) 또는 β2)의 핵산과는 상이한 핵산.
서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1의 pflA-유전자에 상응한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에서 그의 활성이 감소될 수 있는 pflD-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:
γ1) 서열식별번호: 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
γ2) 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
γ3) γ1) 또는 γ2)의 핵산과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 (동일성은 γ1) 또는 γ2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
γ4) γ1) 또는 γ2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 γ1) 또는 γ2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
γ5) 엄격한 조건 하에 γ1) 또는 γ2)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
γ6) γ1) 또는 γ2)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 γ1) 또는 γ2)의 핵산과는 상이한 핵산.
서열식별번호: 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1의 pflD-유전자에 상응한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에서 그의 활성이 감소될 수 있는 wcaJ-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:
δ1) 서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
δ2) 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
δ3) δ1) 또는 δ2)의 핵산과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 (동일성은 δ1) 또는 δ2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
δ4) δ1) 또는 δ2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 δ1) 또는 δ2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
δ5) 엄격한 조건 하에 δ1) 또는 δ2)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
δ6) δ1) 또는 δ2)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 δ1) 또는 δ2)의 핵산과는 상이한 핵산.
서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1의 wcaJ-유전자에 상응한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물에서 그의 활성이 감소될 수 있는 pykA-유전자는 바람직하게는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함한다:
ε1) 서열식별번호: 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
ε2) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
ε3) ε1) 또는 ε2)의 핵산과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 핵산 (동일성은 ε1) 또는 ε2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
ε4) ε1) 또는 ε2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 ε1) 또는 ε2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
ε5) 엄격한 조건 하에 ε1) 또는 ε2)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
ε6) ε1) 또는 ε2)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 ε1) 또는 ε2)의 핵산과는 상이한 핵산.
서열식별번호: 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 바스피아 숙시니시프로두센스-균주 DD1의 pykA-유전자에 상응한다.
이와 관련하여 본 발명에 따른 변형된 미생물은 하기 유전자 변형 A) 내지 E) 중 적어도 1개를 포함하는 것이 바람직하다:
A) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 ldhA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
B) pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflD-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 pflD-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
또는
pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 pflA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
C) wcaJ-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, wcaJ-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
D) pykA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pykA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소로 이어지는 pykA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
E) ptsA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ptsA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 ptsA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
및/또는
ptsH-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ptsH-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 ptsH-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입.
이와 관련하여 특히 바람직한 변형된 미생물은 하기 특성 또는 특성의 조합을 갖는 것이고: A), B), C), D), E), A)B), A)C), A)D) A)E), B)C), B)D), B)E), C)D), C)E), D)E), A)B)C), A)B)D), A)B)E), A)C)D), A)C)E), A)D)E), B)C)D), B)C)E), B)D)E), C)D)E), A)B)C)D), A)B)C)E), A)B)D)E), A)C)D)E, B)C)D)E) 및 A)B)C)D)E), 여기서 특성 A), B), C), D) 및 E)를 특징으로 하는 변형된 미생물이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 변형된 미생물의 제1의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 미생물은 하기 유전자 변형 A) 내지 E)를 포함한다:
A) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
B) pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
C) wcaJ-유전자에 의해 코딩된 말단절단된 효소의 발현으로 이어지는 wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
D) pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소로 이어지는 pykA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입; 및
E) ptsA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실.
본 발명에 따른 변형된 미생물의 제2의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 미생물은 하기 유전자 변형 A) 내지 E)를 포함한다:
A) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
B) pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
C) wcaJ-유전자에 의해 코딩된 말단절단된 효소의 발현으로 이어지는 wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
D) pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소로 이어지는 pykA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입; 및
E) ptsH-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실.
본 발명에 따른 변형된 미생물의 특히 바람직한 실시양태는 다음과 같다:
- 파스테우렐라세아에 과, 특히 바람직하게는 바스피아 속 및 보다 바람직하게는 바스피아 숙시니시프로두센스 종의 변형된 박테리아 세포,
-- 바람직하게는 ptsA-유전자의 결실에 의해, 특히 서열식별번호: 3에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 4에 따른 아미노산 서열을 갖는 효소를 코딩하는 ptsA-유전자의 변형에 의해 ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성이 감소된 것;
-- 바람직하게는 ldhA-유전자 및 pflA-유전자의 변형에 의해, 특히 서열식별번호: 7에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 LdhA를 코딩하는 ldhA-유전자의 변형에 의해, 및 서열식별번호: 9에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 10에 따른 아미노산 서열을 갖는 PflA를 코딩하는 pflA-유전자의 변형에 의해, 또는 ldhA-유전자 및 pflD-유전자의 변형에 의해, 특히 서열식별번호: 7에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 LdhA를 코딩하는 ldhA-유전자의 변형에 의해, 및 서열식별번호: 11에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 PflD를 코딩하는 pflD-유전자의 변형에 의해 락테이트 데히드로게나제 및 피루베이트 포르메이트 리아제의 활성이 감소된 것;
-- wcaJ-유전자 또는 그의 적어도 일부가 결실되거나, 또는 적어도 1개의 돌연변이가 wcaJ-유전자, 특히 서열식별번호: 13에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 14에 따른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 wcaJ-유전자에 도입된 것, 여기서 적어도 1개의 돌연변이의 도입은 바람직하게는 wcaJ-유전자에 의해 코딩된 야생형 효소의 적어도 100개 아미노산, 바람직하게는 적어도 125개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 150개 아미노산 및 가장 바람직하게는 적어도 160개 아미노산이 C-말단 단부로부터 결실된 효소의 발현으로 이어짐;
및
-- 적어도 1개의 돌연변이가 pykA-유전자, 특히 서열식별번호: 15에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 16에 따른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 pykA-유전자에 도입된 것, 바람직하게는 적어도 1개의 돌연변이는 pykA-유전자에 의해 코딩된 효소에서 적어도 1개의 아미노산의 치환을 발생시키고, 가장 바람직한 돌연변이는 pykA-유전자에 의해 코딩된 효소에서 적어도 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환, 또는 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환 또는 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환, 또는 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환 및 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환, 또는 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환 및 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환, 또는 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환 및 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환, 또는 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환, 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환 및 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환을 발생시킴,
- 파스테우렐라세아에 과, 특히 바람직하게는 바스피아 속 및 보다 바람직하게는 바스피아 숙시니시프로두센스 종의 변형된 박테리아 세포,
-- 바람직하게는 ptsH-유전자의 결실에 의해, 특히 서열식별번호: 5에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 효소를 코딩하는 ptsH-유전자의 변형에 의해 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성이 감소된 것;
-- 바람직하게는 ldhA-유전자 및 pflA-유전자의 변형에 의해, 특히 서열식별번호: 7에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 LdhA를 코딩하는 ldhA-유전자의 변형에 의해, 및 서열식별번호: 9에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 10에 따른 아미노산 서열을 갖는 PflA를 코딩하는 pflA-유전자의 변형에 의해, 또는 ldhA-유전자 및 pflD-유전자의 변형에 의해, 특히 서열식별번호: 7에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 LdhA를 코딩하는 ldhA-유전자의 변형에 의해, 및 서열식별번호: 11에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 PflD를 코딩하는 pflD-유전자의 변형에 의해 락테이트 데히드로게나제 및 피루베이트 포르메이트 리아제의 활성이 감소된 것;
-- wcaJ-유전자 또는 그의 적어도 일부가 결실되거나, 또는 적어도 1개의 돌연변이가 wcaJ-유전자, 특히 서열식별번호: 13에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 14에 따른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 wcaJ-유전자에 도입된 것, 여기서 적어도 1개의 돌연변이의 도입은 바람직하게는 wcaJ-유전자에 의해 코딩된 야생형 효소의 적어도 100개 아미노산, 바람직하게는 적어도 125개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 150개 아미노산 및 가장 바람직하게는 적어도 160개 아미노산이 C-말단 단부로부터 결실된 효소의 발현으로 이어짐;
및
-- 적어도 1개의 돌연변이가 pykA-유전자, 특히 서열식별번호: 15에 따른 핵산 서열을 갖고 서열식별번호: 16에 따른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 pykA-유전자에 도입된 것, 바람직하게는 적어도 1개의 돌연변이는 pykA-유전자에 의해 코딩된 효소에서 적어도 1개의 아미노산의 치환을 발생시키고, 가장 바람직한 돌연변이는 pykA-유전자에 의해 코딩된 효소에서 적어도 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환, 또는 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환 또는 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환, 또는 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환 및 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환, 또는 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환 및 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환, 또는 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환 및 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환, 또는 위치 167에서의 글리신의 시스테인에 의한 치환, 위치 417에서의 시스테인의 티로신에 의한 치환 및 위치 171에서의 알라닌의 글리신에 의한 치환을 발생시킴.
처음에 언급된 문제를 해결하는 것에 대한 기여는 또한 다음을 포함하는 유기 화합물의 생산 방법에 의해 제공된다:
I) 본 발명에 따른 변형된 미생물을 적어도 1종의 동화가능한 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양하여, 변형된 미생물이 유기 화합물을 생산하도록 하고, 그에 따라 유기 화합물을 포함하는 발효 브로쓰를 수득하는 단계;
II) 공정 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 유기 화합물을 회수하는 단계.
공정 단계 I)에서 본 발명에 따른 변형된 미생물은 적어도 1종의 동화가능한 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양되어, 변형된 미생물이 유기 화합물을 생산하도록 하고, 그에 따라 유기 화합물을 포함하는 발효 브로쓰가 수득된다. 본 발명에 따른 공정에 의해 생산될 수 있는 바람직한 유기 화합물은 카르복실산, 예컨대 포름산, 락트산, 프로피온산, 2-히드록시프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 3-히드록시부티르산, 아크릴산, 피루브산 또는 이들 카르복실산의 염, 디카르복실산, 예컨대 말론산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 글루타르산, 이타콘산, 아디프산 또는 그의 염, 트리카르복실산, 예컨대 시트르산 또는 그의 염, 알콜, 예컨대 메탄올 또는 에탄올, 아미노산, 예컨대 L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-아르기닌, L-이소류신, L-글리신, L-글루타민, L-글루탐산, L-시스테인, L-세린, L-티로신, L-트립토판, L-트레오닌, L-발린, L-히스티딘, L-프롤린, L-메티오닌, L-리신, L-류신 등을 포함한다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에 따르면 유기 화합물은 숙신산이다. 본 발명의 문맥에 사용된 용어 "숙신산"은 그의 가장 넓은 의미로 이해되어야 하고, 또한 예를 들어, Na+ 및 K+-염과 같은 알칼리 금속 염, 또는 Mg2 + 및 Ca2 +-염과 같은 알칼리 토금속 염, 또는 암모늄 염 또는 숙신산의 무수물로서 그의 염 (즉, 숙시네이트)을 포괄한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물은 바람직하게는 약 10 내지 60℃ 또는 20 내지 50℃ 또는 30 내지 45℃의 범위의 온도에서 5.0 내지 9.0 또는 5.5 내지 8.0 또는 6.0 내지 7.0의 pH에서 배양 배지 중에서 인큐베이션된다.
바람직하게는, 유기 화합물, 특히 숙신산은 혐기성 조건 하에 생산된다. 혐기성 조건은 통상적인 기술의 수단에 의해, 예를 들어 반응 배지의 구성성분을 탈기시키고 이산화탄소 또는 질소 또는 그의 혼합물을 예를 들어, 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유량으로 도입하는 것에 의해 혐기성 조건을 유지하는 것에 의해 확립될 수 있다. 호기성 조건은 통상적인 기술의 수단에 의해, 예를 들어 공기 또는 산소를 예를 들어, 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유량으로 도입하는 것에 의해 확립될 수 있다. 적절한 경우에, 0.1 내지 1.5 bar의 다소 과도한 압력이 공정에 적용될 수 있다.
동화가능한 탄소 공급원은 바람직하게는 수크로스, 말토스, 말토트리오스, 말토테르라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, D-프룩토스, D-글루코스, D-크실로스, L- 아라비노스, D-갈락토스, D-만노스, 글리세롤 및 그의 혼합물 또는 상기 화합물 중 적어도 1종을 함유하는 조성물로부터 선택되거나, 또는 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및/또는 리그노셀룰로스의 분해 생성물로부터 선택된다. 바람직한 동화가능한 탄소 공급원은 수크로스이다. 추가의 바람직한 혼합물은 수크로스 및 적어도 1종의 추가의 동화가능한 탄소 공급원의 혼합물, 예컨대 수크로스 및 말토스, 수크로스 및 D-프룩토스, 수크로스 및 D-글루코스, 수크로스 및 D-크실로스, 수크로스 및 L-아라비노스, 수크로스 및 D-갈락토스, 수크로스 및 D-만노스의 혼합물이다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에 따르면 이산화탄소를 제외한 동화가능한 탄소 공급원의 전체 중량에 기초하여 적어도 50 중량%, 바람직하게는 적어도 75 중량%, 보다 바람직하게는 적어도 90 중량%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95 중량% 및 가장 바람직하게는 적어도 99 중량%의 동화가능한 탄소 공급원은 수크로스이다.
동화가능한 탄소 공급원의 초기 농도는, 바람직하게는 수크로스의 초기 농도는, 바람직하게는 5 내지 100 g/l, 바람직하게는 5 내지 75 g/l 및 보다 바람직하게는 5 내지 50 g/l의 범위의 값으로 조정되고 배양 동안 상기 범위로 유지될 수 있다. 반응 배지의 pH는 적합한 염기, 예를 들어 기체상 암모니아, NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, Mg(HCO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N 및/또는 그의 혼합물의 첨가에 의해 제어될 수 있다. 이들 알칼리 중화 작용제는 특히 발효 공정의 과정 중에 형성되는 유기 화합물이 카르복실산 또는 디카르복실산인 경우에 요구된다. 유기 화합물로서 숙신산의 경우에, Mg(OH)2가 특히 바람직한 염기이다.
본 발명에 따른 발효 단계 I)은, 예를 들어 교반된 발효기, 버블 칼럼 및 루프 반응기에서 수행될 수 있다. 교반기 유형 및 기하학적 설계를 포함하는 가능한 방법 유형의 포괄적 개관은 문헌 [Chmiel: "Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik", Volume 1]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에 따른 공정에서, 이용가능한 전형적인 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 예를 들어, 문헌 [Chmiel, Hammes and Bailey: "Biochemical Engineering"]에서 설명된 하기 변형, 예컨대 바이오매스의 재활용을 포함하는 및 포함하지 않는, 회분식, 유가식, 반복 유가식 또는 연속식 발효이다. 생산 균주에 따라, 공기, 산소, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 적절한 기체 혼합물을 사용한 살포가 우수한 수율 (YP/S)을 달성하기 위해 실시될 수 있다.
유기 산, 특히 숙신산을 공정 단계 I)에서 생산하기 위한 특히 바람직한 조건은 다음과 같다:
동화가능한 탄소 공급원: 수크로스
온도: 30 내지 45℃
pH: 5.5 내지 7.0
공급 기체: CO2
공정 단계 I)에서 동화가능한 탄소 공급원, 바람직하게는 수크로스가 적어도 0.5 g/g 내지 약 1.18 g/g의 탄소 수율 YP/S; 예를 들어, 적어도 0.6 g/g, 적어도 0.7 g/g, 적어도 0.75 g/g, 적어도 0.8 g/g, 적어도 0.85 g/g, 적어도 0.9 g/g, 적어도 0.95 g/g, 적어도 1.0 g/g, 적어도 1.05 g/g, 또는 적어도 1.1 g/g (유기 화합물/탄소, 바람직하게는 숙신산/탄소)의 탄소 수율 YP/S로 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산으로 전환되는 것이 또한 바람직하다.
공정 단계 I)에서 동화가능한 탄소 공급원, 바람직하게는 수크로스가 적어도 0.6 g g DCW-1h-1 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산, 또는 적어도 0.65 g g DCW-1h-1, 적어도 0.7 g g DCW-1h-1, 적어도 0.75 g g DCW-1h-1 또는 적어도 0.77 g g DCW-1h-1 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산의 비생산성 수율로 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산으로 전환되는 것이 또한 바람직하다.
공정 단계 I)에서 동화가능한 탄소 공급원, 바람직하게는 수크로스가 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산에 대해 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산의 적어도 2.2 g/(Lxh) 또는 적어도 2.5 g/(Lxh), 적어도 2.75 g/(Lxh), 적어도 3 g/(Lxh), 적어도 3.25 g/(Lxh), 적어도 3.5 g/(Lxh), 적어도 3.7 g/(Lxh), 적어도 4.0 g/(Lxh), 적어도 4.5 g/(Lxh) 또는 적어도 5.0 g/(Lxh)의 공간 시간 수율로 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산으로 전환되는 것이 또한 바람직하다. 본 발명에 따른 공정의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 공정 단계 I)에서 변형된 미생물은 적어도 20 g/L, 보다 바람직하게는 적어도 25 g/l 및 보다 더 바람직하게는 적어도 30 g/l의 동화가능한 탄소 공급원, 바람직하게는 수크로스를 적어도 20 g/l, 보다 바람직하게는 적어도 25 g/l 및 보다 더 바람직하게는 적어도 30 g/l의 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산으로 전환시킨다.
본원에 기재된 상이한 수율 파라미터 ("탄소 수율" 또는 "YP/S"; " 비생산성 수율"; 또는 "공간-시간-수율 (STY)")는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Song and Lee, 2006]에 의해 기재된 바와 같이 결정된다. "탄소 수율" 및 "YP/S" (각각은 생산된 유기 화합물의 질량/소모된 동화가능한 탄소 공급원의 질량으로 표현됨)는 본원에서 동의어로서 사용된다. 비생산성 수율은 h 당 생산되는 숙신산과 같은 생성물의 양 및 건조 바이오매스 g 당 발효 브로쓰 L을 기재한다. "DCW"로서 언급되는 건조 세포 중량의 양은 생화학적 반응에서의 생물학적 활성 미생물의 양을 기재한다. 값은 h 당 DCW g 당 생성물 g으로서 주어진다 (즉, g g DCW-1h- 1). 공간-시간-수율 (STY)은 배양의 전체 시간에 걸쳐 고려되는, 배양물의 부피에 대한 발효 공정에서 형성된 유기 화합물의 총량의 비로서 규정된다. 공간-시간 수율은 또한 "부피 생산성"으로서 공지된다.
공정 단계 II)에서 유기 화합물은 공정 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 회수된다.
통상적으로, 회수 공정은 재조합 미생물을 "바이오매스"로도 불리는 발효 브로쓰로부터 분리하는 단계를 포함한다. 바이오매스를 제거하는 공정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 여과, 침강, 부유 또는 그의 조합을 포함한다. 따라서, 바이오매스는, 예를 들어 원심분리, 분리기, 디켄터, 필터로 또는 부유 장치에서 제거될 수 있다. 가치있는 생성물의 최대 회수를 위해, 바이오매스의 세척은 종종, 예를 들어 투석여과의 형태로 권장될 수 있다. 방법의 선택은 발효 브로쓰 중 바이오매스 함량 및 바이오매스의 특성, 및 또한 바이오매스와 유기 화합물 (즉, 가치있는 생성물)의 상호작용에 좌우된다. 한 실시양태에서, 발효 브로쓰는 멸균되거나 저온살균될 수 있다. 추가 실시양태에서, 발효 브로쓰는 농축된다. 요구사항에 따라, 이 농축은 회분식 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 압력 및 온도 범위는 첫째로 어떠한 생성물 손상도 발생시키지 않고, 둘째로 장치 및 에너지의 최소 사용이 요구되도록 선택되어야 한다. 다단계 증발을 위한 압력 및 온도 수준의 숙련된 선택은 특히 에너지 절약을 가능하게 한다.
회수 공정은 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산이 추가로 정제되는 추가의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 유기 화합물이 하기에 기재된 바와 같은 화학 반응에 의해 2차 유기 생성물로 전환되는 경우, 반응의 종류 및 반응 조건에 따라 유기 화합물의 추가 정제가 반드시 요구되는 것은 아니다. 공정 단계 II)에서 수득된 유기 화합물의 정제, 바람직하게는 숙신산의 정제를 위해, 예를 들어, 결정화, 여과, 전기투석 및 크로마토그래피와 같은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유기 화합물로서 숙신산의 경우, 숙신산은 침전물의 중화 및 여과를 위해 칼슘 히드록시드, -옥시드, -카르보네이트 또는 히드로겐 카르보네이트를 사용하여 이를 칼슘 숙시네이트 생성물로서 침전시킴으로써 단리될 수 있다. 숙신산은 황산을 사용한 산성화에 이어서 침전하는 황산칼슘 (석고)을 제거하기 위한 여과에 의해 침전된 칼슘 숙시네이트로부터 회수된다. 생성된 용액은 원치 않는 잔류 이온을 제거하기 위해 이온 교환 크로마토그래피의 수단에 의해 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 수산화마그네슘, 탄산마그네슘 또는 그의 혼합물이 발효 브로쓰를 중화시키는데 사용되는 경우, 공정 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰는 배지에 함유된 마그네슘 숙시네이트를 산 형태 (즉, 숙신산)로 변형시키기 위해 산성화되고, 이는 후속적으로 산성화된 배지를 냉각시킴으로써 결정화될 수 있다. 추가의 적합한 정제 공정의 예는 EP-A-1 005 562, WO-A-2008/010373, WO-A-2011/082378, WO-A-2011/043443, WO-A-2005/030973, WO-A-2011/123268 및 WO-A-2011/064151 및 EP-A-2 360 137에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에 따르면 공정은 공정 단계:
III) 공정 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰에 함유된 유기 화합물 또는 공정 단계 II)에서 수득된 회수된 유기 화합물을, 적어도 하나의 화학 반응에 의해 유기 화합물과는 상이한 2차 유기 생성물로 전환시키는 단계
를 추가로 포함한다.
유기 화합물로서 숙신산의 경우에 바람직한 2차 유기 생성물은 숙신산 에스테르 및 그의 중합체, 테트라히드로푸란 (THF), 1,4-부탄디올 (BDO), 감마-부티로락톤 (GBL) 및 피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
THF, BDO 및/또는 GBL의 생산을 위한 바람직한 실시양태에 따르면 이 공정은 다음을 포함한다:
b1) 공정 단계 I) 또는 II)에서 수득된 숙신산의 THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL로의 직접 촉매 수소화 또는
b2) 공정 단계 I) 또는 II)에서 수득된 숙신산 및/또는 숙신산 염의 그의 상응하는 디-저급 알킬 에스테르로의 화학적 에스테르화 및 상기 에스테르의 THF 및/또는 BDO 및/또는 GBL로의 후속 촉매 수소화.
피롤리돈의 생산을 위한 바람직한 실시양태에 따르면 이 공정은 다음을 포함한다:
b) 그 자체로 공지된 방식으로의 공정 단계 I) 또는 II)에서 수득된 숙신산 암모늄 염의 피롤리돈으로의 화학적 전환.
이들 화합물을 제조하는 것의 세부사항을 위한 참조는 US-A-2010/0159543 및 WO-A-2010/092155에 대해 이루어진다.
처음에 언급된 문제를 해결하는 것에 대한 기여는 또한 유기 화합물의 발효적 생산을 위한 본 발명에 따른 변형된 미생물의 사용에 의해 제공된다. 바람직한 유기 화합물은 이미 본 발명에 따른 공정과 관련하여 언급된 화합물이며, 숙신산이 가장 바람직한 유기 화합물이다. 게다가, 유기 화합물, 바람직하게는 숙신산의 발효적 생산을 위한 바람직한 조건은 이미 본 발명에 따른 공정의 공정 단계 I)과 관련하여 기재된 조건이다. 유기 화합물의 발효적 생산을 위해, 특히 숙신산의 발효적 생산을 위해 사용되는 바람직한 동화가능한 탄소 공급원은 수크로스이다.
본 발명은 이제 도면 및 비-제한적 실시예의 도움에 의해 보다 상세하게 설명된다.
도 1은 플라스미드 pSacB (서열식별번호: 17)의 개략적 지도를 보여준다.
도 2는 플라스미드 pSacB ΔldhA (서열식별번호: 18)의 개략적 지도를 보여준다.
도 3은 플라스미드 pSacB ΔpflA (서열식별번호: 19)의 개략적 지도를 보여준다.
도 4는 플라스미드 pSacB pykA1 (서열식별번호: 20)의 개략적 지도를 보여준다.
도 5는 플라스미드 pSacB wcaJ* (서열식별번호: 21)의 개략적 지도를 보여준다.
도 6은 플라스미드 pSacB ΔptsA (서열식별번호: 22)의 개략적 지도를 보여준다.
도 7은 플라스미드 pSacB ΔptsH (서열식별번호: 23)의 개략적 지도를 보여준다.
실시예
실시예 1: 바스피아 숙시니시프로두센스의 형질전환을 위한 일반적 방법
Figure pct00002
표 1: 실시예에서 언급된 DD1-야생형 및 돌연변이체의 명명법
바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 (야생형)을 하기 프로토콜을 사용하여 전기천공에 의해 DNA로 형질전환시켰다:
예비-배양물을 제조하기 위해 DD1을 동결된 스톡으로부터 100 ml 진탕 플라스크 내의 40 ml BHI (뇌 심장 주입물; 벡톤, 디킨슨 앤드 캄파니 (Becton, Dickinson and Company))에 접종하였다. 인큐베이션을 37℃; 200 rpm에서 밤새 수행하였다. 주-배양물을 제조하기 위해 100 ml BHI를 250 ml 진탕 플라스크에 넣고, 예비-배양물로 0.2의 최종 OD (600 nm)로 접종하였다. 인큐베이션을 37℃, 200 rpm에서 수행하였다. 세포를 대략 0.5, 0.6 및 0.7의 OD에서 수거하고, 펠릿을 10% 차가운 글리세롤로 4℃에서 1회 세척하고, 2 ml 10% 글리세롤 (4℃) 중에 재현탁시켰다.
100 μl의 적격 세포를 2-8 μg 플라스미드-DNA와 혼합하고, 0.2 cm의 폭을 갖는 전기천공 큐벳에서 2분 동안 얼음 상에 두었다. 하기 조건 하의 전기천공: 400 Ω; 25 μF; 2.5 kV (진 펄서(Gene Pulser), 바이오-라드(Bio-Rad)). 1 ml의 냉각된 BHI를 전기천공 직후에 첨가하고, 인큐베이션을 37℃에서 대략 2시간 동안 수행하였다.
세포를 5 mg/L 클로람페니콜을 포함하는 BHI 상에 플레이팅하고, 형질전환체의 콜로니가 보일 때까지 37℃에서 2-5일 동안 인큐베이션하였다. 클론을 단리하고, 순수한 클론을 수득할 때까지 5 mg/l 클로람페니콜을 포함하는 BHI 상에 재스트리킹하였다.
실시예 2:
a) 결실 구축물의 생성
결실 플라스미드를 벡터 pSacB (서열식별번호: 17)에 기초하여 구축하였다. 도 1은 플라스미드 pSacB의 개략적 지도를 보여준다. 결실되어야 할 염색체 단편의 5'- 및 3'- 플랭킹 영역 (각각 대략 1500 bp)을 바스피아 숙시니시프로두센스의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 표준 기술을 사용하여 상기 벡터에 도입하였다. 통상적으로, ORF의 적어도 80%를 결실을 위해 표적화하였다. 이러한 방식으로, 락테이트 데히드로게나제 ldhA, pSacB_델타_ldhA (서열식별번호: 18), 피루베이트 포르메이트 리아제 활성화 효소 pflA, pSacB_델타_pflA (서열식별번호: 19), ptsA-유전자, pSacB_델타_ptsA (서열식별번호: 22), 및 ptsH-유전자, pSacB_델타_ptsH (서열식별번호: 23)에 대한 결실 플라스미드를 구축하였다. 도 2, 3, 6 및 7은 각각 플라스미드 pSacB_델타_ldhA, pSacB_델타_pflA, pSacB _델타_ptsA 및 pSacB _델타_ptsH의 개략적 지도를 보여준다.
pSacB의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 17)에서 sacB-유전자는 염기 2380-3801로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 3802-4264로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 526-984로부터 함유된다. 이. 콜라이(E. coli)에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 1477-2337로부터 함유된다 (도 1 참조).
pSacB_델타_ldhA의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 18)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 ldhA 유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1519-2850으로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 ldhA-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 62-1518로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5169-6590으로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 6591-7053으로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3315-3773으로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4266-5126으로부터 함유된다 (도 2 참조).
pSacB_델타_pflA의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 19)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 pflA-유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1506-3005로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 pflA-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 6-1505로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5278-6699로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 6700-7162로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3424-3882로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4375-5235로부터 함유된다 (도 3 참조).
pSacB_델타_ptsA의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 22)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 ptsA-유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1506-3005로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 ptsA-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 6-1505로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5278-6699로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 6700-7162로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3424-3882로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4375-5235로부터 함유된다 (도 6 참조).
pSacB_델타_ptsH의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 23)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 ptsH-유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1541-3055로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 ptsH-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 6-1540으로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5328-6749로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 6750-7212로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3474-3932로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4425-5285로부터 함유된다 (도 7 참조).
b) pykA-유전자 내 및 wcaJ-유전자 내로의 점 돌연변이의 도입에 사용되는 구축물의 생성
pSacB_pykA1의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 20)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 pykA-유전자의 일부는 염기 6-1185로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 3458-4879로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 4880-5342로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 1604-2062로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 2555-3415로부터 함유된다 (도 4 참조). 플라스미드 pSacB_pykA1은 pykA-유전자에 G에서 T로의 돌연변이를 도입하고, 이는 최종적으로 PykA-단백질의 위치 167에서 G (글리신)의 C (시스테인)로의 교환을 발생시킨다 (서열식별번호: 16).
pSacB_wcaJ*의 플라스미드 서열 (서열식별번호: 21)에서 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 wcaJ-유전자의 5' 플랭킹 영역은 염기 1838-3379로부터 함유되고, 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈과 상동성인 wcaJ-유전자의 3' 플랭킹 영역은 염기 6-1236으로부터 함유된다. sacB-유전자는 염기 5652-7073으로부터 함유된다. sacB-프로모터는 염기 7074-7536으로부터 함유된다. 클로람페니콜 유전자는 염기 3798-4256으로부터 함유된다. 이. 콜라이에 대한 복제 기점 (ori EC)은 염기 4749-5609로부터 함유된다. wcaJ-유전자는 염기 1237-1837로부터 함유되고, 위치 81의 티민과 위치 82의 아데닌 사이에 리신을 코딩하는 코돈의 뉴클레오티드의 삽입을 갖는다 (플라스미드 pSacB_wcaJ*의 위치 1756에 상응함, 도 5 참조). 이러한 삽입은 프레임 시프트 돌연변이로 이어지고, 여기서 이러한 프레임 시프트 돌연변이의 수단에 의해 정지 코돈이 도입되며, 이는 말단절단된 효소의 발현으로 이어진다.
실시예 3: 개선된 숙시네이트 생산 균주의 생성
a) 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1을 상기 기재된 바와 같이 pSacB_델타_ldhA로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈 내로의 형질전환 및 통합은 바스피아 숙시니시프로두센스의 게놈 내로의 플라스미드의 통합 사건에 대한 밴드를 생성한 PCR에 의해 확인하였다.
이어서, "캠벨 인" 균주를 역 선택 배지로서 수크로스를 함유하는 한천 플레이트를 사용하여 "캠벨드 아웃"하여, sacB 유전자의 (기능의) 손실에 대해 선택하였다. 따라서, "캠벨 인" 균주를 37℃, 220 rpm에서 밤새 25-35 ml의 비-선택 배지 (항생제를 함유하지 않는 BHI) 중에서 인큐베이션하였다. 이어서, 밤샘 배양물을 새로 제조된 BHI 함유 수크로스 플레이트 (10%, 항생제 무함유) 상에 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다 ("제1 수크로스 전달"). 제1 전달로부터 수득된 단일 콜로니를 다시 새로 제조된 BHI 함유 수크로스 플레이트 (10%) 상에 스트리킹하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다 ("제2 수크로스 전달"). 이 절차를 수크로스 중 5회 전달 ("제3, 제4, 제5 수크로스 전달")의 최소 완료까지 반복하였다. 용어 "제1 내지 제5 수크로스 전달"은 sacB 유전자 및 주변 플라스미드 서열의 손실을 갖는 균주를 선택하기 위한 목적을 위해 수크로스 및 성장 배지 함유 한천 플레이트 상으로의 sacB 레반-수크라제 유전자를 함유하는 벡터의 염색체 통합 후의 균주의 전달을 지칭한다. 제5 전달 플레이트로부터의 단일 콜로니를 25-35 ml의 비-선택 배지 (항생제 무함유 BHI)에 접종하고, 37℃, 220 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤샘 배양물을 연속 희석시키고 BHI 플레이트 상에 플레이팅하여 단리된 단일 콜로니를 수득하였다.
ldhA-유전자의 돌연변이/결실을 함유하는 "캠벨드 아웃" 균주를 클로람페니콜 감수성에 의해 확인하였다. 이들 균주 중에서 돌연변이/결실 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 ldhA-결실 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA가 생성되었다.
b) 바스피아 숙시니시프로두센스 ΔldhA를 상기 기재된 바와 같이 pSacB_델타_pflA로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 형질전환 및 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 이전에 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"하였다. 이들 균주 중에서 결실 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 ldhA pflA 이중 결실 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflA가 생성되었다.
c) 바스피아 숙시니시프로두센스 ΔldhA ΔpflA를 상기 기재된 바와 같이 pSacB_pykA1로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 이어서 "캠벨 인" 균주를 이전에 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"하였다. 이들 균주 중에서 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 ldhA 및 pflA가 결실된 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1이 생성되었고, 이는 위치 167의 아미노산에서 글리신이 시스테인에 의해 치환된 피루베이트 키나제를 발현하였다.
d) 바스피아 숙시니시프로두센스 ΔldhA ΔpflA pykA1을 상기 기재된 바와 같이 pSacB_wcaJ*로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 이어서 "캠벨 인" 균주를 이전에 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"하였다. 이들 균주 중에서 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 ldhA 및 pflA가 결실된 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ*이 생성되었고, 이는 위치 167의 아미노산에서 글리신이 시스테인에 의해 치환된 피루베이트 키나제를 발현하였고, wcaJ-유전자에 의해 코딩된 말단절단된 효소를 발현하였다.
e) 바스피아 숙시니시프로두센스 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ*를 상기 기재된 바와 같이 pSacB_델타_ptsA로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 형질전환 및 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 이전에 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"하였다. 이들 균주 중에서 결실 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ* ΔptsA가 생성되었다.
f) 바스피아 숙시니시프로두센스 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ*를 상기 기재된 바와 같이 pSacB_델타_hPr로 형질전환시키고 "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 형질전환 및 통합을 PCR에 의해 확인하였다. 이어서, "캠벨 인" 균주를 이전에 기재된 바와 같이 "캠벨드 아웃"하였다. 이들 균주 중에서 결실 돌연변이체를 PCR 분석에 의해 식별하고 확인하였다. 이로부터 돌연변이체 바스피아 숙시니시프로두센스 DD1 ΔldhA ΔpflA pykA1 wcaJ* ΔptsH가 생성되었다.
실시예 4: 글루코스 및 수크로스 상에서의 다양한 DD1-균주의 배양
생산성을 하기에 기재된 배지 및 인큐베이션 조건을 사용하여 분석하였다.
1. 배지 제조
배양 배지 CGM의 조성 및 제조는 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
Figure pct00003
표 2: 글루코스 상에서의 배양을 위한 배지 조성 (배지 CGM)
배양 배지 LSM_3의 조성 및 제조는 하기 표 3, 4 및 5에 기재된 바와 같다.
Figure pct00004
표 3: 미량 원소 용액의 조성
Figure pct00005
표 4: 비타민 용액의 조성
Figure pct00006
표 5: 수크로스 상에서의 배양을 위한 LSM_3 배지의 조성
2. 배양 및 분석
성장을 위해 새롭게 성장한 BHI-한천 플레이트로부터의 사전-배양 박테리아 (혐기성 조건 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션함)를 사용하여 CO2-분위기 하에 표 2에 기재된 CGM 액체 배지 50 ml를 함유하는, 기밀 부틸 고무 마개를 갖는 100 ml-혈청 병에 OD600 = 0.75로 접종하였다. 병을 37℃ 및 170 rpm에서 인큐베이션하였다 (진탕 직경: 2.5 cm). 성장을 위해 CGM 배지 중 박테리아 배양물의 주 배양물 2.5 ml를 (10시간의 인큐베이션 후에) 사용하여 CO2-분위기 하에 표 5에 기재된 LSM_3 액체 배지 50 ml를 함유하는, 기밀 부틸 고무 마개를 갖는 100 ml-혈청 병에 접종하였다. 숙신산의 생산을 HPLC를 통해 정량화하였다 (HPLC 방법은 표 7 및 8에 기재되어 있음). 세포 성장을 분광광도계 (울트라스펙3000(Ultrospec3000), 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 스웨덴 웁살라)를 사용하여 600 nm에서 흡광도 (OD600)를 측정함으로써 측정하였다.
3. 결과
상이한 DD1-균주를 사용한 배양 실험의 결과를 표 6에 나타낸다.
Figure pct00007
표 6: 수크로스 (배지 LSM_3) 상에서의 DD1ΔldhAΔpflApykA1wcaJ*-균주, DD1ΔldhAΔpflApykA1wcaJ*ΔptsA-균주 및 DD1ΔldhAΔpflApykA1wcaJ*ΔptsH-균주의 배양
a SA 수율 (소모된 기질당 숙신산의 양)
Figure pct00008
표 7: 숙신산의 분석을 위한 HPLC 방법 (ZX-THF50)
Figure pct00009
표 8: 수크로스의 분석을 위한 HPLC 방법 (고속-CH)
서열
서열식별번호: 1 (균주 DD1의 16 S rDNA의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00010
서열식별번호: 2 (균주 DD1의 23 S rDNA의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00011
Figure pct00012
서열식별번호: 3 (균주 DD1로부터의 ptsA-유전자의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00013
서열식별번호: 4 (상기 ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 아미노산 서열)
Figure pct00014
서열식별번호: 5 (균주 DD1로부터의 ptsH-유전자의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00015
서열식별번호: 6 (상기 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 아미노산 서열)
Figure pct00016
서열식별번호: 7 (균주 DD1로부터의 ldhA-유전자의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00017
서열식별번호: 8 (균주 DD1로부터의 LdhA의 아미노산 서열)
Figure pct00018
서열식별번호: 9 (균주 DD1로부터의 pflA-유전자의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00019
서열식별번호: 10 (균주 DD1로부터의 PflA의 아미노산 서열)
Figure pct00020
서열식별번호: 11 (균주 DD1로부터의 pflD-유전자의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00021
서열식별번호: 12 (균주 DD1로부터의 PflD의 아미노산)
Figure pct00022
서열식별번호: 13 (균주 DD1로부터의 wcaJ-유전자의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00023
서열식별번호: 14 (상기 wcaJ-유전자에 의해 코딩된 효소의 아미노산 서열)
Figure pct00024
서열식별번호: 15 (균주 DD1로부터의 pykA-유전자의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00025
서열식별번호: 16 (균주 DD1로부터의 PykA의 아미노산 서열)
Figure pct00026
서열식별번호: 17 (플라스미드 pSacB의 완전한 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00027
Figure pct00028
서열식별번호: 18 (플라스미드 pSacB_델타_ldhA의 완전한 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
서열식별번호: 19 (플라스미드 pSacB_델타_pflA의 완전한 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
서열식별번호: 20 (플라스미드 pSacB_pykA1의 완전한 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00035
Figure pct00036
서열식별번호: 21 (플라스미드 pSacB_wcaJ*의 완전한 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
서열식별번호: 22 (플라스미드 pSacB_델타_ptsA의 완전한 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00040
Figure pct00041
서열식별번호: 23 (플라스미드 pSacB_델타_ptsH의 완전한 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
[수탁번호]
기탁기관명 : DSMZ
수탁번호 : DSM 18541
수탁일자 : 20060811
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Genetically modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose <130> 0000078475WO01 <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1517 <212> DNA <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1517) <223> 16 S rDNA of strain DD1 <400> 1 tttgatcctg gctcagattg aacgctggcg gcaggcttaa cacatgcaag tcgaacggta 60 gcgggaggaa agcttgcttt ctttgccgac gagtggcgga cgggtgagta atgcttgggg 120 atctggctta tggaggggga taacgacggg aaactgtcgc taataccgcg taatatcttc 180 ggattaaagg gtgggacttt cgggccaccc gccataagat gagcccaagt gggattaggt 240 agttggtggg gtaaaggcct accaagccga cgatctctag ctggtctgag aggatgacca 300 gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360 cacaatgggg ggaaccctga tgcagccatg ccgcgtgaat gaagaaggcc ttcgggttgt 420 aaagttcttt cggtgacgag gaaggtgttt gttttaatag gacaagcaat tgacgttaat 480 cacagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcgagc 540 gttaatcgga ataactgggc gtaaagggca tgcaggcgga cttttaagtg agatgtgaaa 600 gccccgggct taacctggga attgcatttc agactgggag tctagagtac tttagggagg 660 ggtagaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaatac cgaaggcgaa 720 ggcagcccct tgggaagata ctgacgctca tatgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccacg cggtaaacgc tgtcgatttg gggattgggc tttaggcctg 840 gtgctcgtag ctaacgtgat aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact 900 caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg 960 cgaagaacct tacctactct tgacatccag agaatcctgt agagatacgg gagtgccttc 1020 gggagctctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt 1080 aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag catgtaaaga tgggaactca 1140 aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc 1200 ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggtgcataca gagggcggcg ataccgcgag 1260 gtagagcgaa tctcagaaag tgcatcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1320 gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcaaatca gaatgttgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380 tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgtacc agaagtagat agcttaacct 1440 tcgggggggg cgtttaccac ggtatgattc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtaac 1500 cgtaggggaa cctgcgg 1517 <210> 2 <211> 3008 <212> DNA <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3008) <223> 23 S rDNA of strain DD1 <400> 2 agtaataacg aacgacacag gtataagaat acttgaggtt gtatggttaa gtgactaagc 60 gtacaaggtg gatgccttgg caatcagagg cgaagaagga cgtgctaatc tgcgaaaagc 120 ttgggtgagt tgataagaag cgtctaaccc aagatatccg aatggggcaa cccagtagat 180 gaagaatcta ctatcaataa ccgaatccat aggttattga ggcaaaccgg gagaactgaa 240 acatctaagt accccgagga aaagaaatca accgagatta cgtcagtagc ggcgagcgaa 300 agcgtaagag ccggcaagtg atagcatgag gattagagga atcggctggg aagccgggcg 360 gcacagggtg atagccccgt acttgaaaat cattgtgtgg tactgagctt gcgagaagta 420 gggcgggaca cgagaaatcc tgtttgaaga aggggggacc atcctccaag gctaaatact 480 cctgattgac cgatagtgaa ccagtactgt gaaggaaagg cgaaaagaac cccggtgagg 540 ggagtgaaat agaacctgaa accttgtacg tacaagcagt gggagcccgc gagggtgact 600 gcgtaccttt tgtataatgg gtcagcgact tatattatgt agcgaggtta accgaatagg 660 ggagccgaag ggaaaccgag tcttaactgg gcgtcgagtt gcatgatata gacccgaaac 720 ccggtgatct agccatgggc aggttgaagg ttgggtaaca ctaactggag gaccgaaccg 780 actaatgttg aaaaattagc ggatgacctg tggctggggg tgaaaggcca atcaaaccgg 840 gagatagctg gttctccccg aaatctattt aggtagagcc ttatgtgaat accttcgggg 900 gtagagcact gtttcggcta gggggccatc ccggcttacc aacccgatgc aaactgcgaa 960 taccgaagag taatgcatag gagacacacg gcgggtgcta acgttcgtcg tggagaggga 1020 aacaacccag accgccagct aaggtcccaa agtttatatt aagtgggaaa cgaagtggga 1080 aggcttagac agctaggatg ttggcttaga agcagccatc atttaaagaa agcgtaatag 1140 ctcactagtc gagtcggcct gcgcggaaga tgtaacgggg ctcaaatata gcaccgaagc 1200 tgcggcatca ggcgtaagcc tgttgggtag gggagcgtcg tgtaagcgga agaaggtggt 1260 tcgagagggc tgctggacgt atcacgagtg cgaatgctga cataagtaac gataaaacgg 1320 gtgaaaaacc cgttcgccgg aagaccaagg gttcctgtcc aacgttaatc ggggcagggt 1380 gagtcggccc ctaaggcgag gctgaagagc gtagtcgatg ggaaacgggt taatattccc 1440 gtacttgtta taattgcgat gtggggacgg agtaggttag gttatcgacc tgttggaaaa 1500 ggtcgtttaa gttggtaggt ggagcgttta ggcaaatccg gacgcttatc aacaccgaga 1560 gatgatgacg aggcgctaag gtgccgaagt aaccgatacc acacttccag gaaaagccac 1620 taagcgtcag attataataa accgtactat aaaccgacac aggtggtcag gtagagaata 1680 ctcaggcgct tgagagaact cgggtgaagg aactaggcaa aatagcaccg taacttcggg 1740 agaaggtgcg ccggcgtaga ttgtagaggt atacccttga aggttgaacc ggtcgaagtg 1800 acccgctggc tgcaactgtt tattaaaaac acagcactct gcaaacacga aagtggacgt 1860 atagggtgtg atgcctgccc ggtgctggaa ggttaattga tggcgttatc gcaagagaag 1920 cgcctgatcg aagccccagt aaacggcggc cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaaa 1980 ttccttgtcg ggtaagttcc gacctgcacg aatggcataa tgatggccag gctgtctcca 2040 cccgagactc agtgaaattg aaatcgccgt gaagatgcgg tgtacccgcg gctagacgga 2100 aagaccccgt gaacctttac tatagcttga cactgaacct tgaattttga tgtgtaggat 2160 aggtgggagg ctttgaagcg gtaacgccag ttatcgtgga gccatccttg aaataccacc 2220 ctttaacgtt tgatgttcta acgaagtgcc cggaacgggt actcggacag tgtctggtgg 2280 gtagtttgac tggggcggtc tcctcccaaa gagtaacgga ggagcacgaa ggtttgctaa 2340 tgacggtcgg acatcgtcag gttagtgcaa tggtataagc aagcttaact gcgagacgga 2400 caagtcgagc aggtgcgaaa gcaggtcata gtgatccggt ggttctgaat ggaagggcca 2460 tcgctcaacg gataaaaggt actccgggga taacaggctg ataccgccca agagttcata 2520 tcgacggcgg tgtttggcac ctcgatgtcg gctcatcaca tcctggggct gaagtaggtc 2580 ccaagggtat ggctgttcgc catttaaagt ggtacgcgag ctgggtttaa aacgtcgtga 2640 gacagtttgg tccctatctg ccgtgggcgt tggagaattg agaggggctg ctcctagtac 2700 gagaggaccg gagtggacgc atcactggtg ttccggttgt gtcgccagac gcattgccgg 2760 gtagctacat gcggaagaga taagtgctga aagcatctaa gcacgaaact tgcctcgaga 2820 tgagttctcc cagtatttaa tactgtaagg gttgttggag acgacgacgt agataggccg 2880 ggtgtgtaag cgttgcgaga cgttgagcta accggtacta attgcccgag aggcttagcc 2940 atacaacgct caagtgtttt tggtagtgaa agttattacg gaataagtaa gtagtcaggg 3000 aatcggct 3008 <210> 3 <211> 1728 <212> DNA <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1728) <223> nucleotide sequence of ptsA-gene from strain DD1 <400> 3 atgatttcag gaatcccggc ctcaccaggt atcgtttttg gtaaagcgtt agttctgaaa 60 gaggaaaaaa ttgtacttga tatgcaaaaa attgctgaag atcaagttga aactgaagta 120 gctcgttttt atgaaggccg tacggcggca gtggaacaat taagcgccat tagagatcgt 180 gcagagaaaa ctctcggtga agaaaaagcg gctatcttcg aaggtcattt aatgattctt 240 gaagatgaag agttggaaga agaaatcatt gattatttgc gttcaaacaa agtaaatgcg 300 ggcgttgcgg caagtaaaat cattgatcaa caagttgcta tgcttgcgga tattgatgat 360 gagtacttaa aagaacgtgc cggcgatatt cgcgatatcg gtaaccgttt aattaaaaat 420 atcttaggca tgaaaattgt ggatttgggc gaaatcaatg aagagtcaat cttggttgct 480 tatgacttaa cgccatcaga aaccgcacaa ttgaatttag acaaagtatt aggttttatt 540 actgatatcg gtggtcgtac ttcacatacc tctattatgg cccgttcgct ggaattaccg 600 gcaattgtag gtacaaataa tgcaaccgca atgattaaca gcggtgatta tttagtactt 660 gatgcaatca ataacgctgt ttatgtgaat ccggctcaag acgtgattga cggcttaaaa 720 gcccaacaag caaaattagc ggaagaaaaa gcggaattag ctaaattaaa agatttaccg 780 gcagtaacat tggacggtca ccgtgttgaa gtggtggcga atatcggtac gattcgtgac 840 tgtgagggtg cggatcgtaa cggtgcggaa ggtgtcggtt tataccgtac cgagttcctg 900 ttcatggatc gtgaccaact gccttcagaa gaagaacaat ttatcgctta taaagaagtg 960 gtagaagcga tgaacggtcg ccaggtggta ttacgtacca tggatattgg tggagataaa 1020 gaattacctt atatgaatct gccaaaagaa atgaatccgt tcttaggctg gcgtgcggtt 1080 cgtatcgcat tggatcgtcg cgaaatctta aatgctcaat tgcgtgcggt attacgtgct 1140 tccgcattcg gtaaattagc ggtaatgttc ccgatgatta tttccgttga agaaattcgc 1200 gaattgaaat ccgttatcga aactttaaaa caagaattac gcaccgaagg taaagccttt 1260 gatgaaaata ttcaaatcgg tgtaatgtgt gaaacgccgt cagctgcagt aaatgcaaaa 1320 ttcttagcaa aagaagtgga cttcttcagt atcggtacta atgatttaac tcaatatact 1380 ttagcggttg accgtggtaa tgaaatgatt tcacatttat ataatccaat gtcaccttca 1440 gtattaagtt taattaaaca ggttattgac gcctctcata ccgaaggcaa atggactggt 1500 atgtgcggtg agttagccgg tgatgaaaaa gccactattt tattattagg tatgggatta 1560 gacgaattca gcatgagcgc tatttccgtt cctcgtatta aaaaattggt tcgtagtgtt 1620 aattttgccg aagcaaaagc attagcggat aaagccctgc aattaccgac tgctgccgaa 1680 attgaaaaat tagttgctga ttttttagct gaaaaaacat taaattag 1728 <210> 4 <211> 575 <212> PRT <213> Basfia succinicproducens <220> <221> SITE <222> (1)..(575) <223> amino acid sequence of the enzyme encoded by the above ptsA-gene <400> 4 Met Ile Ser Gly Ile Pro Ala Ser Pro Gly Ile Val Phe Gly Lys Ala 1 5 10 15 Leu Val Leu Lys Glu Glu Lys Ile Val Leu Asp Met Gln Lys Ile Ala 20 25 30 Glu Asp Gln Val Glu Thr Glu Val Ala Arg Phe Tyr Glu Gly Arg Thr 35 40 45 Ala Ala Val Glu Gln Leu Ser Ala Ile Arg Asp Arg Ala Glu Lys Thr 50 55 60 Leu Gly Glu Glu Lys Ala Ala Ile Phe Glu Gly His Leu Met Ile Leu 65 70 75 80 Glu Asp Glu Glu Leu Glu Glu Glu Ile Ile Asp Tyr Leu Arg Ser Asn 85 90 95 Lys Val Asn Ala Gly Val Ala Ala Ser Lys Ile Ile Asp Gln Gln Val 100 105 110 Ala Met Leu Ala Asp Ile Asp Asp Glu Tyr Leu Lys Glu Arg Ala Gly 115 120 125 Asp Ile Arg Asp Ile Gly Asn Arg Leu Ile Lys Asn Ile Leu Gly Met 130 135 140 Lys Ile Val Asp Leu Gly Glu Ile Asn Glu Glu Ser Ile Leu Val Ala 145 150 155 160 Tyr Asp Leu Thr Pro Ser Glu Thr Ala Gln Leu Asn Leu Asp Lys Val 165 170 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gacagccggg cggcaatcga agcgttaaaa 780 cggcagaaaa tcggcgctct cggtatggat gtttatgaaa atgaacggga tttgtttttc 840 gaggataaat ctaacgatgt tattacggat gatgtattcc gtcgcctttc ttcctgtcat 900 aatgtgcttt ttaccggtca tcaggcgttt ttaacggaag aagcgctgaa taatatcgcc 960 gatgtgactt tatcgaatat tcaggcggtt tccaaaaatg caacgtgcga aaatagcgtt 1020 gaaggctaa 1029 <210> 8 <211> 342 <212> PRT <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> SITE <222> (1)..(342) <223> amino acid sequence of LdhA from strain DD1 <400> 8 Met Thr Lys Ser Val Cys Leu Asn Lys Glu Leu Thr Met Lys Val Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ser Thr Lys Asn Tyr Asp Arg Lys His Leu Asp Leu Ala Asn 20 25 30 Lys Lys Phe Asn Phe Glu Leu His Phe Phe Asp Phe Leu Leu Asp Glu 35 40 45 Gln Thr Ala Lys Met Ala Glu Gly Ala Asp Ala Val Cys Ile Phe Val 50 55 60 Asn Asp Asp Ala Ser Arg Pro Val Leu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly 65 70 75 80 Val Lys Ile Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn Asn Val Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Lys Val Val Arg Val Pro Ala Tyr 100 105 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ccataaatgg gaagtactcg gcgataaata cgagcttgaa 660 gatgtaaaac cgccgacaaa agaattaatg gagcatgtta aggggttgct tgcaggctac 720 gggcttaatg tgacatatta g 741 <210> 10 <211> 246 <212> PRT <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> SITE <222> (1)..(246) <223> amino acid sequence of PflA from strain DD1 <400> 10 Met Ser Val Leu Gly Arg Ile His Ser Phe Glu Thr Cys Gly Thr Val 1 5 10 15 Asp Gly Pro Gly Ile Arg Phe Ile Leu Phe Leu Gln Gly Cys Leu Met 20 25 30 Arg Cys Lys Tyr Cys His Asn Arg Asp Thr Trp Asp Leu His Gly Gly 35 40 45 Lys Glu Ile Ser Val Glu Glu Leu Met Lys Glu Val Val Thr Tyr Arg 50 55 60 His Phe Met Asn Ala Ser Gly Gly Gly Val Thr Ala Ser Gly Gly Glu 65 70 75 80 Ala Ile Leu Gln Ala Glu Phe Val Arg Asp Trp Phe Arg Ala Cys His 85 90 95 Lys Glu Gly Ile Asn Thr Cys Leu Asp Thr Asn Gly Phe Val Arg His 100 105 110 His Asp His Ile Ile Asp Glu Leu Ile Asp Asp Thr Asp Leu Val Leu 115 120 125 Leu Asp Leu Lys Glu Met Asn Glu Arg Val His Glu Ser Leu Ile Gly 130 135 140 Val Pro Asn Lys Arg Val Leu 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ctgtgcgaaa gtatctattg atacttcctc cgtacaatac 1200 gaaaatgatg acttaatgcg tcctgacttc aacaacgatg actatgcaat cgcatgctgc 1260 gtatcaccga tggtcgtagg taaacaaatg caattcttcg gtgcgcgcgc aaacttagct 1320 aaaactatgt tatacgcaat taacggcggt atcgatgaga aaaatggtat gcaagtcggt 1380 cctaaaactg cgccgattac agacgaagta ttgaatttcg ataccgtaat cgaacgtatg 1440 gacagtttca tggactggtt ggcgactcaa tatgtaaccg cattgaacat catccacttc 1500 atgcacgata aatatgcata tgaagcggca ttgatggcgt tccacgatcg cgacgtattc 1560 cgtacaatgg cttgcggtat cgcgggtctt tccgtggctg cggactcatt atccgcaatc 1620 aaatatgcga aagttaaacc gattcgcggc gacatcaaag ataaagacgg taatgtcgtg 1680 gcctcgaatg ttgctatcga cttcgaaatt gaaggcgaat atccgcaatt cggtaacaat 1740 gatccgcgtg ttgatgattt agcggtagac ttagttgaac gtttcatgaa aaaagttcaa 1800 aaacacaaaa cttaccgcaa cgcaactccg acacaatcta tcctgactat cacttctaac 1860 gtggtatacg gtaagaaaac cggtaatact ccggacggtc gtcgagcagg cgcgccattc 1920 ggaccgggtg caaacccaat gcacggtcgt gaccaaaaag gtgcggttgc ttcacttact 1980 tctgtggcta aacttccgtt cgcttacgcg aaagacggta tttcatatac cttctctatc 2040 gtaccgaacg cattaggtaa agatgacgaa gcgcaaaaac gcaaccttgc cggtttaatg 2100 gacggttatt tccatcatga agcgacagtg gaaggcggtc aacacttgaa tgttaacgtt 2160 cttaaccgtg aaatgttgtt agacgcgatg gaaaatccgg aaaaataccc gcaattaacc 2220 attcgtgttt caggttacgc ggttcgtttc aactcattaa ctaaagagca acaacaagac 2280 gtcatcactc gtacgtttac acaatcaatg taa 2313 <210> 12 <211> 770 <212> PRT <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> SITE <222> (1)..(770) <223> amino acid of PflD from strain DD1 <400> 12 Met Ala Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Lys Ala Trp Glu Gly Phe Val 1 5 10 15 Pro Gly Glu Trp Gln Asn Gly Val Asn Leu Arg Asp Phe Ile Gln Lys 20 25 30 Asn Tyr Thr Pro Tyr Glu Gly Asp Glu Ser Phe Leu Ala Asp Ala Thr 35 40 45 Pro Ala Thr Ser Glu Leu Trp Asn Ser Val Met Glu Gly Ile Lys Ile 50 55 60 Glu Asn Lys Thr His Ala Pro Leu Asp Phe Asp Glu His Thr Pro Ser 65 70 75 80 Thr Ile Thr Ser His Lys Pro Gly Tyr Ile Asn Lys Asp Leu Glu Lys 85 90 95 Ile Val Gly Leu Gln Thr Asp Ala Pro Leu Lys Arg Ala Ile Met Pro 100 105 110 Tyr Gly Gly Ile Lys Met Ile Lys Gly Ser Cys Glu Val Tyr Gly Arg 115 120 125 Lys Leu Asp Pro Gln Val Glu Phe Ile Phe Thr Glu Tyr Arg Lys Thr 130 135 140 His Asn Gln Gly Val Phe Asp Val Tyr Thr Pro Asp Ile Leu Arg Cys 145 150 155 160 Arg Lys Ser Gly Val Leu Thr Gly Leu Pro Asp Ala Tyr Gly Arg Gly 165 170 175 Arg Ile Ile Gly Asp Tyr Arg Arg Leu Ala Val Tyr Gly Ile Asp Tyr 180 185 190 Leu Met Lys Asp Lys Lys Ala Gln Phe Asp Ser Leu Gln Pro Arg Leu 195 200 205 Glu Ala Gly Glu Asp Ile Gln Ala Thr Ile Gln Leu Arg Glu Glu Ile 210 215 220 Ala Glu Gln His Arg Ala Leu Gly Lys Ile Lys Glu Met Ala Ala Ser 225 230 235 240 Tyr Gly Tyr Asp Ile Ser Gly Pro Ala Thr Asn Ala Gln Glu Ala Ile 245 250 255 Gln Trp Thr Tyr Phe Ala Tyr Leu Ala Ala Val Lys Ser Gln Asn Gly 260 265 270 Ala Ala Met Ser Phe Gly Arg Thr Ser Thr Phe Leu Asp Ile Tyr Ile 275 280 285 Glu Arg Asp Leu Lys Arg Gly Leu Ile Thr Glu Gln Gln Ala Gln Glu 290 295 300 Leu Met Asp His Leu Val Met Lys Leu Arg 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Met Ala Cys Gly Ile Ala 515 520 525 Gly Leu Ser Val Ala Ala Asp Ser Leu Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Lys 530 535 540 Val Lys Pro Ile Arg Gly Asp Ile Lys Asp Lys Asp Gly Asn Val Val 545 550 555 560 Ala Ser Asn Val Ala Ile Asp Phe Glu Ile Glu Gly Glu Tyr Pro Gln 565 570 575 Phe Gly Asn Asn Asp Pro Arg Val Asp Asp Leu Ala Val Asp Leu Val 580 585 590 Glu Arg Phe Met Lys Lys Val Gln Lys His Lys Thr Tyr Arg Asn Ala 595 600 605 Thr Pro Thr Gln Ser Ile Leu Thr Ile Thr Ser Asn Val Val Tyr Gly 610 615 620 Lys Lys Thr Gly Asn Thr Pro Asp Gly Arg Arg Ala Gly Ala Pro Phe 625 630 635 640 Gly Pro Gly Ala Asn Pro Met His Gly Arg Asp Gln Lys Gly Ala Val 645 650 655 Ala Ser Leu Thr Ser Val Ala Lys Leu Pro Phe Ala Tyr Ala Lys Asp 660 665 670 Gly Ile Ser Tyr Thr Phe Ser Ile Val Pro Asn Ala Leu Gly Lys Asp 675 680 685 Asp Glu Ala Gln Lys Arg Asn Leu Ala Gly Leu Met Asp Gly Tyr Phe 690 695 700 His His Glu Ala Thr Val Glu Gly Gly Gln His Leu Asn Val Asn Val 705 710 715 720 Leu Asn Arg Glu Met Leu Leu Asp Ala Met 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gatattaatg cggcagatga tgccaccatg cctaaatttg aagggaataa aaaatcatga 600 <210> 14 <211> 199 <212> PRT <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> SITE <222> (1)..(199) <223> amino acid sequence of the enzyme encoded by the above wcaJ-gene <400> 14 Met Ile Lys Arg Leu Phe Asp Ile Val Val Ala Leu Ile Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Phe Ser Pro Leu Tyr Leu Phe Val Ala Tyr Lys Val Lys Gln Asn 20 25 30 Leu Gly Ser Pro Val Leu Phe Lys Gln Thr Arg Pro Gly Leu His Gly 35 40 45 Lys Pro Phe Glu Met Ile Lys Phe Arg Thr Met Lys Asp Gly Ala Asp 50 55 60 Glu Asn Gly Asn Ile Leu Pro Asp Ala Glu Arg Leu Thr Pro Phe Gly 65 70 75 80 Lys Met Leu Arg Ala Thr Ser Leu Asp Glu Leu Pro Glu Leu Trp Asn 85 90 95 Val Leu Lys Gly Asp Met Ser Leu Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Met 100 105 110 Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr Asn Glu Arg Gln Ala Lys Arg His Glu Val 115 120 125 Lys Pro Gly Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Gly Arg Asn Ala Ile 130 135 140 Ser Trp Glu Gln Lys Phe Glu Leu Asp Ala Trp Tyr Val Glu His Gln 145 150 155 160 Ser 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tatcggtgtg gattaccttg ccgtatcttt cccgcgttca 600 agcgcggatt taaactacgc ccgtcaatta gcaaaagatg cgggcttgga tgcgaaaatc 660 gttgcgaaag tagaacgtgc cgaaacagtt gaaacggacg aagcaatgga cgatatcatc 720 aatgcggcgg acgtaatcat ggttgcgcgc ggtgacttag gtgttgaaat cggtgatccg 780 gaattagtcg gtgttcagaa aaaattaatc cgtcgttcac gtcagttaaa tcgtgttgtt 840 attaccgcaa ctcaaatgat ggaatcaatg attagtaatc ctatgccgac tcgtgcggaa 900 gtaatggacg tagctaacgc agtattggac ggtaccgatg cggtaatgct ttctgctgaa 960 accgcggctg gtcaatatcc ggcggaaact gttgcggcga tggcgaaagt tgcgttaggt 1020 gcggagaaaa tgccaagcat taatgtgtct aaacaccgta tgaacgttca attcgagtct 1080 attgaagaat ctgttgcgat gtctgcaatg tatgcggcaa accacatgag aggcgtagcg 1140 gcgattatca cattaacaag tagcggtcgt actgctcgtt taatgtctcg cattagttcc 1200 ggtttaccaa tctttgcatt gtcacgtaac gaatctacat taaacttatg cgcattatat 1260 cgtggtgtga caccggttca ttttgataaa gacagccgta cctcagaagg tgcgacagcg 1320 gcggttcaat tattaaaaga cgaaggtttc ttagtgtctg gcgatttagt gttattaact 1380 cagggcgacg caagcagttc tagcggtact aacctttgcc gtacattgat tgttgaataa 1440 <210> 16 <211> 479 <212> PRT <213> Basfia succiniciproducens <220> <221> SITE <222> (1)..(479) <223> amino acid sequence of PykA from strain DD1 <400> 16 Met Ser Arg Arg Leu Arg Arg Thr Lys Ile Val Cys Thr Met Gly Pro 1 5 10 15 Ala Thr Asp Lys Gly Asn Asn Leu Glu Lys Ile Ile Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Asn Val Val Arg Met Asn Phe Ser His Gly Thr Pro Glu Asp His Ile 35 40 45 Gly Arg Ala Glu Lys Val Arg Glu Ile Ala His Lys Leu Gly Lys His 50 55 60 Val Ala Ile Leu Gly Asp Leu Gln Gly Pro Lys Ile Arg Val Ser Thr 65 70 75 80 Phe Lys Glu Gly Lys Ile Phe Leu Asn Ile Gly Asp Lys Phe Ile Leu 85 90 95 Asp Ala Glu Met Pro Lys Gly Glu Gly Asn Gln Glu Ala Val Gly Leu 100 105 110 Asp Tyr Lys Thr Leu Pro Gln Asp Val Val Pro Gly Asp Ile Leu Leu 115 120 125 Leu Asp Asp Gly Arg Val Gln Leu Lys Val Leu Ala Thr Glu Gly Ala 130 135 140 Lys Val Phe Thr Glu Val Thr Val Gly Gly Pro Leu Ser Asn Asn Lys 145 150 155 160 Gly Ile Asn Lys Leu Gly Gly Gly Leu Ser Ala Asp Ala Leu 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tgtttgcgga 360 tgattggccg gaataaataa agccgggctt aatacagatt aagcccgtat agggtattat 420 tactgaatac caaacagctt acggaggacg gaatgttacc cattgagaca accagactgc 480 cttctgatta ttaatatttt tcactattaa tcagaaggaa taaccatgaa ttttacccgg 540 attgacctga atacctggaa tcgcagggaa cactttgccc tttatcgtca gcagattaaa 600 tgcggattca gcctgaccac caaactcgat attaccgctt tgcgtaccgc actggcggag 660 acaggttata agttttatcc gctgatgatt tacctgatct cccgggctgt taatcagttt 720 ccggagttcc ggatggcact gaaagacaat gaacttattt actgggacca gtcagacccg 780 gtctttactg tctttcataa agaaaccgaa acattctctg cactgtcctg ccgttatttt 840 ccggatctca gtgagtttat ggcaggttat aatgcggtaa cggcagaata tcagcatgat 900 accagattgt ttccgcaggg aaatttaccg gagaatcacc tgaatatatc atcattaccg 960 tgggtgagtt ttgacgggat ttaacctgaa catcaccgga aatgatgatt attttgcccc 1020 ggtttttacg atggcaaagt ttcagcagga aggtgaccgc gtattattac ctgtttctgt 1080 acaggttcat catgcagtct gtgatggctt tcatgcagca cggtttatta atacacttca 1140 gctgatgtgt gataacatac tgaaataaat taattaattc tgtatttaag ccaccgtatc 1200 cggcaggaat ggtggctttt tttttatatt ttaaccgtaa tctgtaattt cgtttcagac 1260 tggttcagga tgagctcgct tggactcctg ttgatagatc cagtaatgac ctcagaactc 1320 catctggatt tgttcagaac gctcggttgc cgccgggcgt tttttattgg tgagaatcca 1380 agcactagcg gcgcgccggc cggcccggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 1440 ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 1500 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 1560 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 1620 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 1680 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 1740 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 1800 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 1860 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 1920 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 1980 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 2040 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 2100 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 2160 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 2220 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 2280 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 2340 ggccggccgc ggccgccatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg 2400 tccttgttca aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag 2460 gaagctcggc gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct 2520 tgtaatcacg acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt 2580 tacatcgtta ggatcaagat ccatttttaa cacaaggcca gttttgttca gcggcttgta 2640 tgggccagtt aaagaattag aaacataacc aagcatgtaa atatcgttag acgtaatgcc 2700 gtcaatcgtc atttttgatc cgcgggagtc agtgaacagg taccatttgc cgttcatttt 2760 aaagacgttc gcgcgttcaa tttcatctgt tactgtgtta gatgcaatca gcggtttcat 2820 cacttttttc agtgtgtaat catcgtttag ctcaatcata ccgagagcgc cgtttgctaa 2880 ctcagccgtg cgttttttat cgctttgcag aagtttttga ctttcttgac ggaagaatga 2940 tgtgcttttg ccatagtatg ctttgttaaa taaagattct tcgccttggt agccatcttc 3000 agttccagtg tttgcttcaa atactaagta tttgtggcct ttatcttcta cgtagtgagg 3060 atctctcagc gtatggttgt cgcctgagct gtagttgcct tcatcgatga actgctgtac 3120 attttgatac gtttttccgt caccgtcaaa gattgattta taatcctcta caccgttgat 3180 gttcaaagag ctgtctgatg ctgatacgtt aacttgtgca gttgtcagtg tttgtttgcc 3240 gtaatgttta ccggagaaat cagtgtagaa taaacggatt tttccgtcag atgtaaatgt 3300 ggctgaacct gaccattctt gtgtttggtc ttttaggata gaatcatttg catcgaattt 3360 gtcgctgtct ttaaagacgc ggccagcgtt tttccagctg tcaatagaag tttcgccgac 3420 tttttgatag aacatgtaaa tcgatgtgtc atccgcattt ttaggatctc cggctaatgc 3480 aaagacgatg tggtagccgt gatagtttgc gacagtgccg tcagcgtttt gtaatggcca 3540 gctgtcccaa acgtccaggc cttttgcaga agagatattt ttaattgtgg acgaatcaaa 3600 ttcagaaact tgatattttt catttttttg ctgttcaggg atttgcagca tatcatggcg 3660 tgtaatatgg gaaatgccgt atgtttcctt atatggcttt tggttcgttt ctttcgcaaa 3720 cgcttgagtt gcgcctcctg ccagcagtgc ggtagtaaag gttaatactg ttgcttgttt 3780 tgcaaacttt ttgatgttca tcgttcatgt ctcctttttt atgtactgtg ttagcggtct 3840 gcttcttcca gccctcctgt ttgaagatgg caagttagtt acgcacaata aaaaaagacc 3900 taaaatatgt aaggggtgac gccaaagtat acactttgcc ctttacacat tttaggtctt 3960 gcctgcttta tcagtaacaa acccgcgcga tttacttttc gacctcattc tattagactc 4020 tcgtttggat tgcaactggt ctattttcct cttttgtttg atagaaaatc ataaaaggat 4080 ttgcagacta cgggcctaaa gaactaaaaa atctatctgt ttcttttcat tctctgtatt 4140 ttttatagtt tctgttgcat gggcataaag ttgccttttt aatcacaatt cagaaaatat 4200 cataatatct catttcacta aataatagtg aacggcaggt atatgtgatg ggttaaaaag 4260 gatcggcggc cgctcgattt aaatc 4285 <210> 18 <211> 7074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complete nucleotide sequence of plasmid pSacB_delta_ldhA <400> 18 tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60 tgggtcagcc tgaacgaacc gcacttgtat gtaggtagtt ttgaccgccc gaatattcgt 120 tataccttgg tggaaaaatt caaaccgatg gagcaattat acaattttgt 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atctcctgaa 1200 tcgacaattt tccgtattct acatgaaaaa catgaatttg tatctaattt aatgtttttt 1260 cagctaaaaa atcagcaact aatttttcaa tttcggcagc agtcggtaat tgcagggctt 1320 tatccgctaa tgcttttgct tcggcaaaat taacactacg aaccaatttt ttaatacgag 1380 gaacggaaat agcgctcatg ctgaattcgt ctaatcccat acctaataat aaaatagtgg 1440 ctttttcatc accggctaac tcaccgcaca taccagtcca tttgccttcg gtatgagagg 1500 cgtcacgccg tacggccttc ataaaaacga gctacttcag tttcaacttg atcttcagca 1560 attttttgca tatcaagtac aattttttcc tctttcagaa ctaacgcttt accaaaaacg 1620 atacctggtg aggccgggat tcctgaaatc atgtgtaacc ttccgataat aatttaatta 1680 aaaaaatcta actatgataa acgacatagc cataaaactc ttttattaac agtgataaat 1740 caataagaaa gttttatggc cagacaaatt attctaatgt aggaattaat gcaactaaat 1800 ggtcaacagc attttgctca tcttcgcctt cagctgaaat tgtaattaca gttccttgag 1860 ttaagcctaa agtttgtaat ttgaataaac ttttcgcact tgcactttta ccggcagaag 1920 tcactgttac atcagatgca aacgcttttg cttcttttac aaattgtgca gccggacgag 1980 tgtgtaagcc gttaggagct gtaatttcaa catcttttga atacataatt ttacctctaa 2040 tagtaatgtt ttttgtttta atgtggagca aacaggtaaa cggttaactt ttgacctgcc 2100 tactaaaatt taattattca taaaccacag cggacactct aaaccatttt gtctgatagt 2160 tcaaaataaa tcttatttag tatcaagatt attcctaatt aattcaagtt aaatcctata 2220 aaaacttgag ctagttcatc tttttgtcaa ccgatagatt aatttttaat aaaaatgtaa 2280 caaattagta ataaaaaata accgaattac cttatatcct gctccataaa atggcgttgc 2340 gatttatttt cttcccggct tgaaatcaag cgatggtaat tatcaaatct gacggggtgg 2400 attttcccga gctccacagc ttcccgtaag gcgcagcccg gatcatcaat atgtttgcag 2460 tctctgaatt tgcaggtccc taagaaatat tggaattccc gataaccgtt ggtgatttgt 2520 gcaggttcca aatgccataa accgaactct cgaatgcccg gcgaatcaat cagatttccg 2580 ccctgaggta aatgatataa acgggaagac gtggtggtat gctgtcccaa tcccgaagtt 2640 tcgctgattt caccggtttg cgcattaact tccggtaaaa tatagttgat taaactggac 2700 ttccctaccc cggattgccc gacgaaaatc gacgtaccat ccgctaaaag tgcggtcagt 2760 ttttccatat tttttccact aatcgccgaa atcattaatg tttcatagcc gatttttcgg 2820 tagatttcca gttgttcttc cgcttcccgc cactgttcgt ccgttaataa atcaacctta 2880 ttcaacaaga taacggcagg aatattagcg ttttcacaaa taaccaaata acgatcaata 2940 atattcaggg ataacgccgg tagcaccgac gaaacaataa taatgcgatc gatattcgat 3000 gccattctag actccatagg ccgctttcct ggctttgctt ccagatgtat gctctcctcc 3060 ggagagtacc gtgactttat tttcggcaca aatacagggg tcgatggata aatacggcga 3120 tagtttcctg acggatgatc cgtatgtacc ggcggaagac aagctgcaaa cctgtcagat 3180 ggagattgat ttaatggcgg atgtgctgag agcaccgccc cgtgaatccg cagaactgat 3240 ccgctatgtg tttgcggatg attggccgga ataaataaag ccgggcttaa tacagattaa 3300 gcccgtatag ggtattatta ctgaatacca aacagcttac ggaggacgga atgttaccca 3360 ttgagacaac cagactgcct tctgattatt aatatttttc actattaatc agaaggaata 3420 accatgaatt ttacccggat tgacctgaat acctggaatc gcagggaaca ctttgccctt 3480 tatcgtcagc agattaaatg cggattcagc ctgaccacca aactcgatat taccgctttg 3540 cgtaccgcac tggcggagac aggttataag ttttatccgc tgatgattta cctgatctcc 3600 cgggctgtta atcagtttcc ggagttccgg atggcactga aagacaatga acttatttac 3660 tgggaccagt cagacccggt ctttactgtc tttcataaag aaaccgaaac attctctgca 3720 ctgtcctgcc gttattttcc ggatctcagt gagtttatgg caggttataa tgcggtaacg 3780 gcagaatatc agcatgatac cagattgttt ccgcagggaa atttaccgga gaatcacctg 3840 aatatatcat cattaccgtg ggtgagtttt gacgggattt aacctgaaca tcaccggaaa 3900 tgatgattat tttgccccgg tttttacgat ggcaaagttt cagcaggaag gtgaccgcgt 3960 attattacct gtttctgtac aggttcatca tgcagtctgt gatggctttc atgcagcacg 4020 gtttattaat acacttcagc tgatgtgtga taacatactg aaataaatta attaattctg 4080 tatttaagcc accgtatccg gcaggaatgg tggctttttt tttatatttt aaccgtaatc 4140 tgtaatttcg tttcagactg gttcaggatg agctcgcttg gactcctgtt gatagatcca 4200 gtaatgacct cagaactcca tctggatttg ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt 4260 tttattggtg agaatccaag cactagcggc gcgccggccg gcccggtgtg aaataccgca 4320 cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 4380 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 4440 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 4500 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 4560 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 4620 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 4680 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 4740 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 4800 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 4860 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 4920 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 4980 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 5040 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 5100 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 5160 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 5220 cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg cattttcttt tgcgttttta 5280 tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct ttgacaacag atgttttctt 5340 gcctttgatg ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat tgtttgtctg cgtagaatcc 5400 tctgtttgtc atatagcttg taatcacgac attgtttcct ttcgcttgag gtacagcgaa 5460 gtgtgagtaa gtaaaggtta catcgttagg atcaagatcc atttttaaca caaggccagt 5520 tttgttcagc ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa acataaccaa gcatgtaaat 5580 atcgttagac gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg cgggagtcag tgaacaggta 5640 ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt tcatctgtta ctgtgttaga 5700 tgcaatcagc ggtttcatca cttttttcag tgtgtaatca tcgtttagct caatcatacc 5760 gagagcgccg tttgctaact cagccgtgcg ttttttatcg ctttgcagaa gtttttgact 5820 ttcttgacgg aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct ttgttaaata aagattcttc 5880 gccttggtag ccatcttcag ttccagtgtt tgcttcaaat actaagtatt tgtggccttt 5940 atcttctacg tagtgaggat ctctcagcgt atggttgtcg cctgagctgt agttgccttc 6000 atcgatgaac tgctgtacat tttgatacgt ttttccgtca ccgtcaaaga ttgatttata 6060 atcctctaca ccgttgatgt tcaaagagct gtctgatgct gatacgttaa cttgtgcagt 6120 tgtcagtgtt tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca gtgtagaata aacggatttt 6180 tccgtcagat gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt gtttggtctt ttaggataga 6240 atcatttgca tcgaatttgt cgctgtcttt aaagacgcgg ccagcgtttt tccagctgtc 6300 aatagaagtt tcgccgactt tttgatagaa catgtaaatc gatgtgtcat ccgcattttt 6360 aggatctccg gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga tagtttgcga cagtgccgtc 6420 agcgttttgt aatggccagc tgtcccaaac gtccaggcct tttgcagaag agatattttt 6480 aattgtggac gaatcaaatt cagaaacttg atatttttca tttttttgct gttcagggat 6540 ttgcagcata tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat gtttccttat atggcttttg 6600 gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc agcagtgcgg tagtaaaggt 6660 taatactgtt gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc gttcatgtct ccttttttat 6720 gtactgtgtt agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt gaagatggca agttagttac 6780 gcacaataaa aaaagaccta aaatatgtaa ggggtgacgc caaagtatac actttgccct 6840 ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac ccgcgcgatt tacttttcga 6900 cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct attttcctct tttgtttgat 6960 agaaaatcat aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga actaaaaaat ctatctgttt 7020 cttttcattc tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg gcataaagtt gcctttttaa 7080 tcacaattca gaaaatatca taatatctca tttcactaaa taatagtgaa cggcaggtat 7140 atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa atc 7183 <210> 23 <211> 7233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complete nucleotide sequence of plasmid pSacB_delta_ptsH <400> 23 tcgagccgat actgaagaag tccacttctt ttgctaagaa ttttgcattt actgcagctg 60 acggcgtttc acacattaca ccgatttgaa tattttcatc aaaggcttta ccttcggtgc 120 gtaattcttg ttttaaagtt tcgataacgg atttcaattc gcgaatttct tcaacggaaa 180 taatcatcgg gaacattacc gctaatttac cgaatgcgga agcacgtaat accgcacgca 240 attgagcatt taagatttcg cgacgatcca atgcgatacg aaccgcacgc cagcctaaga 300 acggattcat ttcttttggc agattcatat aaggtaattc tttatctcca ccaatatcca 360 tggtacgtaa taccacctgg cgaccgttca tcgcttctac cacttcttta taagcgataa 420 attgttcttc ttctgaaggc agttggtcac gatccatgaa caggaactcg gtacggtata 480 aaccgacacc ttccgcaccg ttacgatccg caccctcaca gtcacgaatc gtaccgatat 540 tcgccaccac ttcaacacgg tgaccgtcca atgttactgc cggtaaatct tttaatttag 600 ctaattccgc tttttcttcc gctaattttg cttgttgggc ttttaagccg tcaatcacgt 660 cttgagccgg attcacataa acagcgttat tgattgcatc aagtactaaa taatcaccgc 720 tgttaatcat tgcggttgca ttatttgtac ctacaattgc cggtaattcc agcgaacggg 780 ccataataga ggtatgtgaa gtacgaccac cgatatcagt aataaaacct aatactttgt 840 ctaaattcaa ttgtgcggtt tctgatggcg ttaagtcata agcaaccaag attgactctt 900 cattgatttc gcccaaatcc acaattttca tgcctaagat atttttaatt aaacggttac 960 cgatatcgcg aatatcgccg gcacgttctt ttaagtactc atcatcaata tccgcaagca 1020 tagcaacttg ttgatcaatg attttacttg ccgcaacgcc cgcatttact ttgtttgaac 1080 gcaaataatc aatgatttct tcttccaact cttcatcttc aagaatcatt aaatgacctt 1140 cgaagatagc cgctttttct tcaccgagag ttttctctgc acgatctcta atggcgctta 1200 attgttccac tgccgccgta cggccttcat aaaaacgagc tacttcagtt tcaacttgat 1260 cttcagcaat tttttgcata tcaagtacaa ttttttcctc tttcagaact aacgctttac 1320 caaaaacgat acctggtgag gccgggattc ctgaaatcat gtgtaacctt ccgataataa 1380 tttaattaaa aaaatctaac tatgataaac gacatagcca taaaactctt ttattaacag 1440 tgataaatca ataagaaagt tttatggcca gacaaattat tctaatgtag gaattaatgc 1500 aactaaatgg tcaacagcat tttgctcatc ttcgccttca acctctaata gtaatgtttt 1560 ttgttttaat gtggagcaaa caggtaaacg gttaactttt gacctgccta ctaaaattta 1620 attattcata aaccacagcg gacactctaa accattttgt ctgatagttc aaaataaatc 1680 ttatttagta tcaagattat tcctaattaa ttcaagttaa atcctataaa aacttgagct 1740 agttcatctt tttgtcaacc gatagattaa tttttaataa aaatgtaaca aattagtaat 1800 aaaaaataac cgaattacct tatatcctgc tccataaaat ggcgttgcga tttattttct 1860 tcccggcttg aaatcaagcg atggtaatta tcaaatctga cggggtggat tttcccgagc 1920 tccacagctt cccgtaaggc gcagcccgga tcatcaatat gtttgcagtc tctgaatttg 1980 caggtcccta agaaatattg gaattcccga taaccgttgg tgatttgtgc aggttccaaa 2040 tgccataaac cgaactctcg aatgcccggc gaatcaatca gatttccgcc ctgaggtaaa 2100 tgatataaac gggaagacgt ggtggtatgc tgtcccaatc ccgaagtttc gctgatttca 2160 ccggtttgcg cattaacttc cggtaaaata tagttgatta aactggactt ccctaccccg 2220 gattgcccga cgaaaatcga cgtaccatcc gctaaaagtg cggtcagttt ttccatattt 2280 tttccactaa tcgccgaaat cattaatgtt tcatagccga tttttcggta gatttccagt 2340 tgttcttccg cttcccgcca ctgttcgtcc gttaataaat caaccttatt caacaagata 2400 acggcaggaa tattagcgtt ttcacaaata accaaataac gatcaataat attcagggat 2460 aacgccggta gcaccgacga aacaataata atgcgatcga tattcgatgc catgactttc 2520 agtccgtcat aataatccgg gcgggcaatt tcattttcac gcggtttaat cgcctcaatg 2580 accccgctaa taccctgtag tttttcatgc cctcggcgcc acactacgtg atctcccacc 2640 accacattgg ctaatgtgcg acgtaaatta caacggaaaa tctcgccttg actattctcc 2700 acatccgcat gcatagaata acgagtgacg acaacgccgt cttgcgtatc gccaagcatt 2760 tcttcctgcc aatcaatctc tttttttact cttcggtgat gacgatccaa tgcttttaca 2820 ttatttgaat gaattcgacg tttttgattt tgagttaatt tacgcttagt caaacagaag 2880 tccttaaagt gcggtagatt ttcgtataat attacgggtc aacaaatcag ttaacgtata 2940 aatgcttata ggatactcca aattatgcaa ttagataacc aaaatctaat ctggatcgac 3000 ttagaaatga ccgggttaga ccctgaaaac gagcgcatta ttgaaatcgc caccatctag 3060 actccatagg ccgctttcct ggctttgctt ccagatgtat gctctcctcc ggagagtacc 3120 gtgactttat tttcggcaca aatacagggg tcgatggata aatacggcga tagtttcctg 3180 acggatgatc cgtatgtacc ggcggaagac aagctgcaaa cctgtcagat ggagattgat 3240 ttaatggcgg atgtgctgag agcaccgccc cgtgaatccg cagaactgat ccgctatgtg 3300 tttgcggatg attggccgga ataaataaag ccgggcttaa tacagattaa gcccgtatag 3360 ggtattatta ctgaatacca aacagcttac ggaggacgga atgttaccca ttgagacaac 3420 cagactgcct tctgattatt aatatttttc actattaatc agaaggaata accatgaatt 3480 ttacccggat tgacctgaat acctggaatc gcagggaaca ctttgccctt tatcgtcagc 3540 agattaaatg cggattcagc ctgaccacca aactcgatat taccgctttg cgtaccgcac 3600 tggcggagac aggttataag ttttatccgc tgatgattta cctgatctcc cgggctgtta 3660 atcagtttcc ggagttccgg atggcactga aagacaatga acttatttac tgggaccagt 3720 cagacccggt ctttactgtc tttcataaag aaaccgaaac attctctgca ctgtcctgcc 3780 gttattttcc ggatctcagt gagtttatgg caggttataa tgcggtaacg gcagaatatc 3840 agcatgatac cagattgttt ccgcagggaa atttaccgga gaatcacctg aatatatcat 3900 cattaccgtg ggtgagtttt gacgggattt aacctgaaca tcaccggaaa tgatgattat 3960 tttgccccgg tttttacgat ggcaaagttt cagcaggaag gtgaccgcgt attattacct 4020 gtttctgtac aggttcatca tgcagtctgt gatggctttc atgcagcacg gtttattaat 4080 acacttcagc tgatgtgtga taacatactg aaataaatta attaattctg tatttaagcc 4140 accgtatccg gcaggaatgg tggctttttt tttatatttt aaccgtaatc tgtaatttcg 4200 tttcagactg gttcaggatg agctcgcttg gactcctgtt gatagatcca gtaatgacct 4260 cagaactcca tctggatttg ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt tttattggtg 4320 agaatccaag cactagcggc gcgccggccg gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta 4380 aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 4440 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 4500 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 4560 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 4620 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 4680 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 4740 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 4800 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 4860 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 4920 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 4980 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 5040 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 5100 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 5160 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 5220 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 5280 cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg cattttcttt tgcgttttta tttgttaact 5340 gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct ttgacaacag atgttttctt gcctttgatg 5400 ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat tgtttgtctg cgtagaatcc tctgtttgtc 5460 atatagcttg taatcacgac attgtttcct ttcgcttgag gtacagcgaa gtgtgagtaa 5520 gtaaaggtta catcgttagg atcaagatcc atttttaaca caaggccagt tttgttcagc 5580 ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac 5640 gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg 5700 ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt tcatctgtta ctgtgttaga tgcaatcagc 5760 ggtttcatca cttttttcag tgtgtaatca tcgtttagct caatcatacc gagagcgccg 5820 tttgctaact cagccgtgcg ttttttatcg ctttgcagaa gtttttgact ttcttgacgg 5880 aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct ttgttaaata aagattcttc gccttggtag 5940 ccatcttcag ttccagtgtt tgcttcaaat actaagtatt tgtggccttt atcttctacg 6000 tagtgaggat ctctcagcgt atggttgtcg cctgagctgt agttgccttc atcgatgaac 6060 tgctgtacat tttgatacgt ttttccgtca ccgtcaaaga ttgatttata atcctctaca 6120 ccgttgatgt tcaaagagct gtctgatgct gatacgttaa cttgtgcagt tgtcagtgtt 6180 tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat 6240 gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt gtttggtctt ttaggataga atcatttgca 6300 tcgaatttgt cgctgtcttt aaagacgcgg ccagcgtttt tccagctgtc aatagaagtt 6360 tcgccgactt tttgatagaa catgtaaatc gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg 6420 gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga tagtttgcga cagtgccgtc agcgttttgt 6480 aatggccagc tgtcccaaac gtccaggcct tttgcagaag agatattttt aattgtggac 6540 gaatcaaatt cagaaacttg atatttttca tttttttgct gttcagggat ttgcagcata 6600 tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat gtttccttat atggcttttg gttcgtttct 6660 ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc agcagtgcgg tagtaaaggt taatactgtt 6720 gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt 6780 agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt gaagatggca agttagttac gcacaataaa 6840 aaaagaccta aaatatgtaa ggggtgacgc caaagtatac actttgccct ttacacattt 6900 taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta 6960 ttagactctc gtttggattg caactggtct attttcctct tttgtttgat agaaaatcat 7020 aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga actaaaaaat ctatctgttt cttttcattc 7080 tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg gcataaagtt gcctttttaa tcacaattca 7140 gaaaatatca taatatctca tttcactaaa taatagtgaa cggcaggtat atgtgatggg 7200 ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa atc 7233

Claims (15)

  1. 야생형과 비교하여
    - ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성,
    - ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 또는
    - ptsA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성 및 ptsH-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성
    을 갖는 변형된 미생물이며, 여기서 변형된 미생물이 유래된 야생형은 파스테우렐라세아에(Pasteurellaceae) 과에 속하는 것인 변형된 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 미생물이 유래된 야생형이 바스피아(Basfia) 속에 속하는 것인 변형된 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ptsA-유전자가
    a1) 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
    b1) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
    c1) a1) 또는 b1)의 핵산과 적어도 70% 동일한 핵산 (동일성은 a1) 또는 b1)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
    d1) a1) 또는 b1)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 a1) 또는 b1)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
    e1) 엄격한 조건 하에 a1) 또는 b1)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
    f1) a1) 또는 b1)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 a1) 또는 b1)의 핵산과는 상이한 핵산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 것인 변형된 미생물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, ptsH-유전자가
    a2) 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산;
    b2) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산;
    c2) a2) 또는 b2)의 핵산과 적어도 70% 동일한 핵산 (동일성은 a2) 또는 b2)의 핵산의 전체 길이에 걸친 동일성임);
    d2) a2) 또는 b2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 (동일성은 a2) 또는 b2)의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸친 동일성임);
    e2) 엄격한 조건 하에 a2) 또는 b2)에 따른 핵산 중 어느 것의 상보적 서열과 혼성화할 수 있는 핵산; 및
    f2) a2) 또는 b2)의 핵산 중 어느 것과 동일한 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축중성으로 인해 상기 a2) 또는 b2)의 핵산과는 상이한 핵산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 것인 변형된 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형과 비교하여 하기 특성:
    i) 감소된 피루베이트 포르메이트 리아제 활성;
    ii) 감소된 락테이트 데히드로게나제 활성;
    iii) wcaJ-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성;
    iv) pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 감소된 활성
    중 적어도 1개를 추가로 갖는 변형된 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 하기 유전자 변형 A) 내지 E):
    A) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ldhA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 ldhA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    B) pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflD-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 pflD-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    또는
    pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pflA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 pflA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    C) wcaJ-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, wcaJ-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    D) pykA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, pykA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 pykA-유전자에 의해 코딩된 효소의 활성의 감소로 이어지는 pykA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    E) ptsA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ptsA-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 ptsA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    및/또는
    ptsH-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실, ptsH-유전자의 조절 요소 또는 그의 적어도 일부의 결실, 또는 ptsH-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입
    중 적어도 1개를 포함하는 변형된 미생물.
  7. 제6항에 있어서,
    A) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
    B) pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
    C) wcaJ-유전자에 의해 코딩된 말단절단된 효소의 발현으로 이어지는 wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    D) pykA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입; 및
    E) ptsA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실
    을 포함하는 변형된 미생물.
  8. 제6항에 있어서,
    A) ldhA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
    B) pflA-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실 또는 pflD-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실;
    C) wcaJ-유전자에 의해 코딩된 말단절단된 효소의 발현으로 이어지는 wcaJ-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입;
    D) pykA-유전자 내로의 적어도 1개의 돌연변이의 도입; 및
    E) ptsH-유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실
    을 포함하는 변형된 미생물.
  9. I) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 변형된 미생물을 적어도 1종의 동화가능한 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 배양하여, 변형된 미생물이 유기 화합물을 생산하도록 하고, 그에 따라 유기 화합물을 포함하는 발효 브로쓰를 수득하는 단계;
    II) 공정 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 유기 화합물을 회수하는 단계
    를 포함하는, 유기 화합물을 생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 유기 화합물이 숙신산인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 이산화탄소를 제외한 동화가능한 탄소 공급원의 전체 중량에 기초하여 적어도 50 중량%의 동화가능한 탄소 공급원이 수크로스인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 공정이 공정 단계:
    III) 공정 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰에 함유된 유기 화합물 또는 공정 단계 II)에서 수득된 회수된 유기 화합물을, 적어도 하나의 화학 반응에 의해 유기 화합물과는 상이한 2차 유기 생성물로 전환시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 유기 화합물이 숙신산이고, 2차 유기 생성물이 숙신산 에스테르 또는 그의 중합체, 테트라히드로푸란 (THF), 1,4-부탄디올 (BDO), 감마-부티로락톤 (GBL) 및 피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 유기 화합물의 발효적 생산을 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 변형된 미생물의 용도.
  15. 제14항에 있어서, 유기 화합물이 숙신산이고, 수크로스가 동화가능한 탄소 공급원으로서 사용되는 것인 용도.
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