KR101892722B1 - 허혈성 질환 치료제 - Google Patents

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Abstract

혐기성 균주를 형질 전환시키고 표적 단백질의 고효율 및 안정한 분비 발현을 가능하게 하는 형질 전환 플라스미드; 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 상기 혐기 세균으로부터 형성된 유전자 전달 담체; 상기 유전자 전달 담체를 포함하는 약학 조성물; 및 이를 이용한 허혈성 질환의 진단 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 새로운 분비 신호; 상기 분비성 신호를 포함하는 형질 전환 플라스미드; 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 혐기 세균으로부터 형성된 유전자 전달 담체; 상기 유전자 전달 담체를 포함하는 약학 조성물; 및 이를 이용한 허혈성 질환의 진단 또는 치료 방법을 제공한다.

Description

허혈성 질환 치료제{THERAPEUTIC AGENT FOR ISCHEMIC DISEASE}
본 발명은 새로운 분비 신호(secretory signal), 상기 분비 신호를 포함하는 형질전환용 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환된 혐기성 세균으로부터의 유전자 수송 담체(gene transport carrier), 상기 유전자 수송 담체를 포함하는 약학 조성물, 및 이를 이용한 허혈성 질환의 진단 또는 치료 방법에 관한 것이다.
최근 악성 종양의 치료 방법에 있어서, 형질전환 혐기성 균을 유전자 수송 담체로 사용하는 방법이 주목받고 있는데, 예를 들어, 형질전환된 클로스트리디움(clostridium)을 이용하여 항종양 물질의 프로드러그(prodrug)를 항종양 물질로 변환하는 효소 니트로리덕타아제(nitroreductase)의 발현 유전자를 종양 부위에 수송하는 방법이 제안되었다(특허문헌 1 ~ 3 참조).
그런데 종래 이러한 목적으로 사용되는 미생물은 모두 병원성 균을 낮은 독성으로 변이된 것이며, 역변이화하여 원래의 병원성 균으로 돌아가 유해성을 발휘할 가능성이 부인할 수 없으며, 또한, 운동성, 침윤성 때문에 질환 조직뿐만 아니라 정상 조직에도 작용을 발현하는 전신성 부작용 증상을 일으킬 우려가 있는 등 안전성에 문제 가능성이 우려된다.
그래서 인간의 장내에 존재하여 플로라(flora)를 형성하는 비병원성 장내 세균으로, 매우 안전한 편성 혐기성 세균(obligate anaerobic bacterium)인 것으로 알려진 비피더스균이 주목받아, 항암 물질 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)의 프로드러그의 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine)을 5-FU로 변환하는 효소의 시토신 데아미나제(cytosine deaminase)을 발현하도록 형질전환된 비피더스균과 항암성을 갖는 단백질인 TNFα를 발현하도록 형질전환된 비피더스균이 개발되었다(특허문헌 4 ~ 6 참조).
이 형질전환 비피더스균은 이를 혐기성 질환의 고형 종양 동물 모델에 정맥 투여한 경우, 저산소 상태의 혐기성 질환 조직 특이적으로 생착(colonize), 증식하여 혐기성 환경이 아닌 정상 조직에서는 신속하게 소실하는 특징을 가지고 있다(비특허문헌 1, 2 참조).
한편 허혈성 질환의 치료, 특히 중증 허혈의 치료에서 혈관 신생과 측부 혈행을 발달시킴으로써 혈류를 회복하고자 하는 혈관 신생 요법이 시도되고 있다. 혈관 신생 요법은 크게 나누면 세포 이식, 단백질 투여 및 유전자 치료의 3가지 치료법이 있지만, 낮은 침투성의 관점에서 최근 특히 유전자 치료가 주목받고 있다. 유전자 치료에 의한 혈관 신생에 있어서, 예를 들어 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor: HGF)와 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 등을 암호화하는 유전자를 환부 부근에 근육 주사 또는 동맥 내 주입에 의해 도입하여, 환부 근처의 혈관 신생을 촉진하여 혈류를 회복시킨다(예를 들면, 비특허문헌 3, 4 참조).
이러한 혈관 신생 요법은 세동맥 수준(arteriolar level)의 장애로 인해 혈행 재건이 불가능하거나 효과가 불충분한 환자와 침습성 문제로 인해 외과적 치료를 할 수 없는 환자 등에 대한 대안의 하나로 주목받고 있으며, 특히 유전자 치료에 의한 혈관 신생 요법에 관해서는 최근 많은 임상 시험이 진행되고 있다.
그러나 기존의 유전자 치료를 이용한 혈관 신생 치료는 병변 부위 특이성이 없기 때문에 전신 투여가 불가능하다는 점, 허혈 부위보다 비 허혈 부위의 혈관 신생이 촉진되어 버리는 스틸 현상이 우려되는 점, 유전자 도입 효율과 도입 유전자의 발현 기간의 제어가 곤란하다는 점, 혈관 신생에 의해 증상이 악화될 수 있는 합병증을 가지고 있는 경우에는 적용에 큰 위험을 수반하는 등, 적용에는 아직 많은 문제를 해결할 필요가 있다.
그래서 본 발명자들은 혐기성 질환 조직 특이적으로 생착, 증식하는 혐기성 균에 착안하여 형질전환 비피더스균을 이용하는 것으로, 허혈 부위에만 특이적으로 집착하고 해당 허혈 부위에서 원하는 단백질을 생산하고, 치료와 함께 병변 부위에서 소실되어 단백질을 생산하지 않게 되는 유전자 수송 담체의 제작에 성공했다(특허문헌 7).
특허문헌 1: 미국 특허 제 6416754 호 명세서 특허문헌 2: 미국 특허 제 6652849 호 명세서 특허문헌 3: 미국 특허 출원 공개 2003/0103952 호 명세서 특허문헌 4: 일본 특허 공개 2002-97144 호 공보 특허문헌 5: 국제 공개 제 2007/136107 호 특허문헌 6: 국제 공개 제 2011/093465 호 특허문헌 7: 국제 공개 제 2013/008881 호
비특허문헌 1: Yazawa et al., Cancer Gene Therapy, 7(2): 269-274, 2000. 비특허문헌 2: Yazawa et al., Breast Cancer Research and Treatment, 66: 165-170, 2001. 비특허문헌 3: Gupta et al., Circ. Res., 105: 724-736, 2009. 비특허문헌 4: Morishita et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 31: 713-720, 2011.
본 발명의 과제는 목적 단백질을 고효율로 안정적인 분비 발현을 가능하게 하는, 혐기성 균을 형질전환하기 위한 형질전환용 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환된 혐기성 세균으로부터의 유전자 수송 담체, 상기 유전자 수송 담체를 포함하는 약학 조성물, 및 이를 이용한 허혈성 질환의 진단 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 특허문헌 7에서 인간 FGF2를 암호화하는 유전자를 조합한 형질전환용 플라스미드 pFGF12a를 제작하고, 이를 이용하여 형질전환된 편광성 혐기성 균(obligate anaerobic bacterium), 예를 들면, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 105A/pFGF12a, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) JCM1192/pFGF12a이 전신 투여에 의해 허혈성 질환 부위에만 특이적으로 집적 및 생육하고, 해당 허혈성 질환 부위에서 인간 FGF2 단백질을 발현 및 분비 가능했다고 보고했다(특허문헌 7).
그러나 추가 연구를 계속하다가 상기 특허문헌 7에서 주로 사용되는 형질전환 플라스미드 pFGF12a로 형질전환된 비피도박테리움 속 세균은 발현 단백질의 분비량이 충분하지 않고, 또한 분비량도 경시적으로 감소되어 가는 안정성이 결여된 새로운 문제에 직면했다.
그래서 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 계속 한 결과, 비피도박테리움 롱검 유래의 신규한 분비 신호 펩타이드 SP56 및 SP67을 찾아 이러한 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함한 플라스미드를 제작한 결과, 놀랍게도 상기 플라스미드로 형질전환한 혐기성 균은 기존 세포주보다 단백질 분비 및 발현이 현격히 높아져, 장기 배양하여도 안정적으로 발현 단백질을 분비하고, 반복 계대 배양을 하고도 높은 플라스미드 보유균 비율을 나타내는 플라스미드임을 발견하여, 더욱 연구를 계속한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음에 관한 것이다.
(1) 혐기성 균의 형질전환용 플라스미드(transformation plasmid)로, 프로모터 유닛(promoter unit), 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하는 분비 신호 유닛(secretory signal unit), 및 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 목적 유전자 유닛(target gene unit)을 포함하는, 형질전환용 플라스미드.
(2) 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질이 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor; FGF), 내피세포 증식 인자(endothelial cell growth factor; ECGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 간 세포 증식 인자(hepatocyte growth factor ; HGF), 혈관 증식 인자(vascular growth factor; AGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor; PDGF), 형질전환 성장 인자 β(transforming growth factor β; TGFβ), 안지오포이에틴(angiopoietin) 또는 에프린(ephrin)과 같은 혈관 신생 촉진 활성(angiogenesis promoting activity)을 갖는 단백질; 프로스타글란딘(prostaglandin)과 같은 혈관 확장(vasodilation)에 관여하는 인자; 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor; G-CSF) 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor; GM-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자; 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF); 뇌 유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF); 뉴로트로핀(neurotrophin) 3과 같은 뉴로트로핀; 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor; IGF); 및 혈소판 유래 혈관 내피세포 증식 인자(platelet-derived vascular endothelial cell growth factor; PD-ECGF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나인, 형질전환용 플라스미드.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질이 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2)인, 형질전환용 플라스미드.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 분비 신호 유닛이 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA의 3’말단에 이어서 스페이서 펩타이드(spacer peptide)를 암호화하는 DNA를 더 포함하는, 형질전환용 플라스미드.
(5) (4)에 있어서, 스페이서 펩타이드가 1 내지 25 아미노산 길이를 가지고, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산의 서열 N 말단 아미노산에서 시작하는 서열로 표시되는, 형질전환용 플라스미드.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 분비 신호 유닛이 서열번호 9 또는 서열번호 10로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 인, 형질전환용 플라스미드.
(7) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 형질전환용 플라스미드가 비셔틀 플라스미드(non-shuttle plasmid)인, 형질전환용 플라스미드.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 프로모터 유닛에 포함되는 프로모터가 서열번호 13으로 기재되는 염기서열 또는 그 염기서열의 1 또는 그 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 서열인, 형질전환용 플라스미드.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 형질전환용 플라스미드가 pFGF110(서열번호 14) 또는 pFGF111(서열번호 15)의 염기서열로 표시되는, 형질전환용 플라스미드.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성 균을 포함하는 유전자 수송 담체(gene transport carrier).
(11) (10)에 있어서, 혐기성 균이 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균인, 유전자 수송 담체.
(12) (11)에 있어서, 비피도박테리움 속 균이 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)인, 유전자 수송 담체.
(13) (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송 담체를 포함하는 약학 조성물.
(14) (13)에 있어서, 약학 조성물은 허혈성 질환 부위에서 상기 유전자 수송 담체의 생착(colonization) 및 증식 촉진제를 추가적으로 포함하는, 의약 조성물.
(15) (14)에 있어서, 생착 및 증식 촉진제가 말토오스(maltose), 락툴로오스(lactulose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 갈락토스(galactose), 글루코오스(glucose), 락토오스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 멜레지토스(melezitose), 라피노스(raffinose)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 의약 조성물.
(16) (10) 내지 (12) 중 어느 하나의 유전자 수송 담체를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환을 진단하거나 치료하는 방법.
(17) (16)에 있어서, 투여가 전신투여(systemic administration)인, 방법.
본 발명의 형질전환용 플라스미드는 신규한 분비 신호를 갖는 허혈성 질환을 진단 및/또는 치료를 위한 형질전환 혐기성 균의 제작에 유용한 신규 플라스미드이며, 본 발명의 형질전환용 플라스미드에 의해 형질전환된 혐기성 균은, 목적 단백질을 대량으로 그리고 안정적으로 분비할 수 있다.
그리고 본 발명의 유전자 수송 담체는 본 발명의 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성 균으로 구성되기 때문에, 비록 전신 투여된 경우에도 혐기성 환경에서 허혈성 질환 부위에 특이적으로 생착 및 증식하여 해당 질환 부위에서 허혈성 질환의 치료 활성을 갖는 단백질을 충분히 생산 및 분비할 수 있다. 따라서 유전자 수송 담체로써 나아가 허혈성 질환 치료제로서 매우 유용하다. 또한 허혈성 질환 부위 특이적으로 생착하기 위해 정맥 주사 등의 전신 투여에도 허혈성 질환 부위에 특이적으로 집적하여 효과를 발휘하는 것이다. 따라서 대량 투여나 복수의 투여가 필요 없고, 투여 대상의 부담을 경감할 수 있다. 또한 허혈이 지속되는 동안 허혈성 질환 부위의 혐기성 환경이 유지되기 때문에 장기적으로 생착하지만, 일단 허혈이 치유되면 더이상 혐기성 환경이 아니게 되므로 생육이 불가능하게 되어 신속하게 사라진다.
또한 본 발명의 유전자 수송 담체는 유전자 수송 담체 자체가 치료에 유용한 단백질을 발현할 수 있기 때문에 종래와 같이 허혈성 부위 또는 그 근방의 세포에 유전자 도입 효율을 생각할 필요가 없고, 항상 높은 단백질 발현 효율을 발휘할 수 있다. 또한 허혈성 부위에 특이적으로 전달되는 담체이기 때문에 합병증의 위험성도 적다. 따라서 기존보다 더 낮은 침습성으로 부작용도 적고, 안전성이 높은 혈관 신생 치료를 실시하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 유전자 수송 담체에 마커를 동시에 발현시킴으로써, 허혈성 부위의 진단과 치료의 모니터로써 이용하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 유전자 수송 담체는 여러 유전자를 동시에 전달할 수 있으며, 여러 효과적인 성장 인자를 포함하여 투여함으로써 보다 효율적이고 비침습적인 치료가 가능해질 것으로 간주된다.
[도 1] 도 1은 인간 FGF2 분비 셔틀 플라스미드의 제작에 관한 모식도를 나타낸다. pCDshuttle 플라스미드에서 CD를 hFGF2 (His 태그)로 대체하여 pFGF-Hu을 제작하고, 프로모터 및 hFGF2 유전자 사이에 SP26L20를 삽입하고 pHuSP26L20-FGF2를 제작하고 거기에서 His-tag를 제거하고 pHuSP26L20-FGF2-dHis를 제작하였다.
[도 2] 도 2는 인간 FGF2 (태그 포함) 분비 셔틀 플라스미드의 제작에 관한 모식도를 나타낸다.직쇄화(straight chain) pHu-FGF2 조각에 SP56L20 또는 SP67L20를 삽입하고 각각 pHuSP56L20-FGF2 또는 pHuSP67L20-FGF2를 제작하였다.
[도 3] 도 3은 인간 FGF2 (태그 없음) 분비 셔틀 플라스미드의 제작에 관한 모식도를 나타낸다. 직쇄화 pHuSP26L20-FGF2-dHis 조각에 SP56L20 또는 SP67L20를 삽입하고 각각 pHuSP56L20-FGF2-dHis 또는 pHuSP67L20-FGF2-dHis를 제작하였다.
[도 4] 도 4는 인간 FGF2 (태그 없음) 분비 비-셔틀(non-shuttle) 플라스미드의 제작에 관한 모식도를 나타낸다. pHuSP56L20-FGF2-dHis 및 pHuSP67L20-FGF2-dHis에서 pUCori을 각각 제거하고 pFGF110 및 pFGF111를 제작하였다.
[도 5] 도 5는 FGF110 주 및 FGF111 주의 배양 상청의 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸다. M: 분자량 마커, FGF110: FGF110 주의 배양 상청 농축물, FGF111: FGF111 주의 배양 상청 농축물, 12a: FGF12a 식의 배양 상청 농축물, R: 재조합 인간 FGF2. FGF110 주, FGF111 주, FGF12a 주에 대해 양성 대조군인 재조합(분자량 약 17kDa)과 같은 위치에 밴드가 확인되었다.
[도 6] 도 6은 SP56 주 및 SP67 주로부터 분비된 인간 FGF2 단백질의 NIH/3T3 세포 증식 촉진 활성을 나타낸다. 세로축: 450-630 nm에서의 흡광도, 가로축: 인간 FGF2 농도(ng/mL)를 나타낸다. SP56, SP67 주로부터 분비한 인간 FGF2는 rhFGF2과 마찬가지로, 농도 의존적으로 세포 증식 촉진 활성을 가지고 있었다.
[도 7] 도 7은 장기 배양시의 인간 FGF2 분비량 추이를 나타낸다. 세로축: FGF2 분비량(ng/mL), 가로축: 배양 시간. 2day, 4day, 7day 중 어느 시점에서도 FGF2 분비량은 높은 순서로 FGF110 주, FGF111 주, FGF12a 주였다. FGF12a 주의 FGF2 분비량은 배양 4일째 이후에 크게 하락했지만 FGF110 주 및 FGF111 주에서는 끝까지 안정된 발현 및 분비가 관찰되었다.
[도 8] 도 8은 FGF110의 혈류 개선 효과를 나타낸다. 세로축: 허혈성 측/비 허혈성 측 혈류량 비율, 가로축: 2차 수술 후 일 수. FGF110 투여군에서는 day14 이후 PBS, BEshuttle 군에 비해 유의한 혈류 개선 효과를 보였다. 이 효과는 day36까지 지속되었다.
본 발명은 비피도박테리움 균 유래의 신규한 분비 신호 펩타이드 및 상기 펩타이드를 암호화하는 분비 신호, 상기 분비 신호를 포함하는 형질전환용 플라스미드 등에 관한 것이다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
<형질전환용 플라스미드>
본 발명의 형질전환용 플라스미드는 신규한 분비 신호 유닛의 작용에 의해 더 많은 발현 단백질을 보다 안정적으로 분비가 가능하며, 따라서 상기 형질전환 플라스미드를 이용하여 어떤 목적 단백질을 발현할 때 고효율로 분비할 수 있다는, 뛰어난 실용성 높은 형질전환된 혐기성 균을 제작할 수 있다는 점에 특징을 갖는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 혐기성 균을 형질전환 하기 위한 형질전환용 플라스미드이며, 상기 형질전환용 플라스미드는 프로모터 유닛, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하는 분비 신호 유닛 및 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질(목적 단백질)을 암호화하는 DNA를 포함하는 목적 유전자 유닛을 포함하는, 상기 형질전환용 플라스미드에 관한 것이다.
본 명세서에서 “혐기성 균(anaerobic bacterium)”은 혐기성 성질을 갖는 세균을 의미하고, "혐기성 성질"은 산소가 적은 또는 없는 조건에서 생육 가능한 성질을 의미한다. 일반적으로 혐기성 세균은 산소의 존재 하에서도 생육 가능한 통성 혐기성 균(facultative anaerobic bacteria)과 산소의 존재 하에서 생육할 수 없는 편광성 혐기성 균(obligate anaerobic bacteria)으로 분류할 수 있지만, 본 발명의 일 구체 예에서, 예를 들어 비피도박테리움 균 등의 편광성 혐기성 균이 바람직하다. 본 발명의 혐기성 균이 갖는 혐기성 성질은 세균이 선천적으로 갖는 성질이어도 좋고, 돌연변이 또는 형질전환 등의 돌연변이 화에 의해 얻어진 것이라도 좋다. 따라서 본 발명의 일 구체 예에서, 혐기성 균은 편광성 혐기성 균이 되도록 변이된 것이다. 예를 들어, 락토바실러스 등의 통성 혐기성 균에도 편광성 혐기성으로 변이된 것이면 좋다.
바람직한 구체 예에서, 본 발명의 형질전환용 플라스미드는 비피도박테리움 속 세균을 형질전환 하기 위한 것이며, 더욱 바람직한 구체 예에서, 비피도박테리움 롱검을 형질전환 하기 위한 것이다.
본 명세서에서 “발현 카세트(expression cassette)”는 플라스미드에 포함된 특정 단백질 또는 펩티드 단편을 발현시키기 위한 유전자 세트를 의미하고, 상기 세트는 프로모터 유닛 및 목적 유전자 유닛을 포함하며, 임의로 다른 유용한 유닛을 포함할 수 있다. 다른 유용한 유닛으로는, 예를 들면 분비 신호 등의 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자, 목적 유전자가 암호화하는 단백질의 분자 샤페론(molecular chaperone)을 암호화하는 유전자 등을 들 수 있다.
본원 명세서에서 “목적 유전자 단위(target gene unit)”는 원하는 단백질 (발현 단백질)를 암호화하는 유전자를 포함하는, 발현 단백질에 대한 유전자의 집합(set)을 말한다. 목적 유전자 유닛은 목적 단백질을 암호화하는 유전자 이외에 다른 DNA를 포함할 수 있다. 목적 유전자 유닛에 포함될 수 있는 다른 DNA로는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 His-Tag 등의 발현 단백질을 표지하는 펩타이드를 암호화하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명의 플라스미드는 본 발명의 형질전환용 플라스미드에 의해 암호화되는 단백질이 혐기성 균체 내에서 생산되어 균체 외로 방출되어 치료 효과를 얻을 수 있도록 분비 신호 유닛을 포함한다.
본원 명세서에서 “분비 신호 유닛(secretory signal unit)”란 분비 신호 서열을 포함하는 발현 단백질을 균체 외에 분비하기 위한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 집합을 말한다. 본 명세서에서 단순히 “분비 신호”라고 하거나 “분비 신호 서열”이라고 하는 경우는 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 유전자 또는 DNA 서열을 의미한다. 분비 신호 유닛은 분비 신호 서열 외, 예를 들어 목적 유전자와 분비 신호 서열 사이에 삽입되는 스페이서 펩타이드를 암호화하는 DNA 등, 다른 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 분비 신호 유닛에 포함된 분비 신호 서열은 SP56(서열번호 1) 또는 SP67(서열번호 2)로 기재되는 신규한 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 서열이다. 또한 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 분비 신호 펩타이드 서열에 대응하는 분비 신호 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 것 외에 그 축중배열(degenerate sequence)을 포함한다. 이하, 본 명세서에서 아미노산 서열을 “암호화하는 DNA” 또는 아미노산 서열에 “상응하는 염기서열”등의 경우, 별도의 설명이 없는 한 예로 표시된 특정 서열 외, 그 축중서열을 포함하는 것을 의도한다.
SP56(서열번호 1) 또는 SP67(서열번호 2)로 기재되는 신규한 분비 신호 펩타이드는 비피도박테리움 롱검의 게놈 데이터베이스에 등록된 전체 아미노산 서열에서 분비 신호 펩타이드 예측 프로그램을 이용하여 추출된 후보 중에서 또한 선발된 분비 신호 펩타이드이며, 본 발명자들에 의해 처음 유용한 분비 신호 펩타이드인 것이 확인된 것이다.
본 발명의 분비 신호 펩타이드 SP56 및 SP67은 특히 뛰어난 분비 활성을 가지며, 또한 비 병원성 편광성 혐기성 세균인 비피더스균으로 기능하기 위해 SP56 및 SP67을 암호화하는 DNA는 혐기성 질환 특히 허혈성 질환의 진단 또는 치료용 혐기성 균의 형질전환용 플라스미드에 사용하는데 특히 적합하다. 따라서 SP56 및 SP67을 암호화하는 DNA를 포함하는 임의의 형질전환용 플라스미드 또한 본 발명에 포함된다.
한 구체 예에서, 본 발명의 목적 유전자 유닛은, 발현 단백질로서 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한다.
본 명세서에서 “허혈(ischemia)”은 혈관의 협착이나 폐색에 의해 조직에 공급되는 동맥량이 감소함에 따른 조직의 산소 및 영양 결핍 상태를 의미하고 지속적인 허혈 조직의 위축이나 변성, 괴사 등을 일으킨다.
본 발명의 형질전환용 플라스미드는 주로 혈관 신생 치료, 장기 보호 등 허혈로 인한 바람직하지 않은 상태를 개선하는 조치법에 적합하게 사용되는 것이다. 따라서 본 명세서에서 “허혈성 질환(ischemic disease)”은 자각 증상의 유무에 관계 없이 동맥의 협착이나 폐색에 의해 조직의 허혈이 지속되고 있는 상태, 또는 이러한 허혈에 의해 발생되는 바람직하지 않은 상태를 말한다. 허혈성 질환으로는 이에 한정하는 것은 아니지만 예를 들면, 협심증(angina pectoris), 심근 경색(myocardial infarction) 등의 허혈성 심장 질환(ischemic heart disease), 뇌졸중(cerebral infarction) 등의 뇌 허혈성 질환(cerebral ischemic disease), 모야모야 병(moyamoya disease) 등의 만성 뇌 허혈 질환(chronic cerebral ischemic disease), 척수 허혈 질환(spinal ischemic disease), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 장간막 동맥 폐색(mesenteric arterial occlusion) 등의 허혈성 장 질환(ischemic bowel disease), 말초 혈관 질환(arteriosclerosis obliterans)이나 버거 질환(Buerger’s disease) 등의 하지 허혈 질환(lower limb ischemic disease), 당뇨병 망막증(diabetic retinopathy) 등의 망막 허혈 질환(retinal ischemic disease) 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 “허혈성 부위”는 허혈에 의해 동맥혈량, 영양 및 산소가 감소하고 있는 상태의 부위를 의미하며, “허혈성 질환 부위”또는 “허혈성 질환 조직”과 호환으로 사용된다.
허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질로는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 혈관 신생 촉진 활성을 갖는 단백질, 혈관 확장에 관여하는 단백질 등을 들 수 있다. 혈관 신생 촉진 활성을 갖는 단백질로는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 섬유아세포 성장 인자(FGF), 내피세포 증식 인자(ECGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 간세포 증식 인자(HGF), 혈관 증식 인자(AGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 β(TGFβ), 안지오포이에틴(angiopoietin) 또는 에프린(ephrin) 등을 들 수 있고, 혈관 확장에 관여하는 인자로는 프로스타글란딘 류 등을 들 수 있다. 다른 치료에 유용한 단백질로는 콜로니 자극 인자(예: 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 등), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀(예를 들어, 뉴로트로핀 3 등), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 혈소판 유래 혈관 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF) 등을 들 수 있다. 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질로, 특히 바람직하게는 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)이다.
본 발명에서 “프로모터 유닛(promoter unit)”은 프로모터 및 어떤 다른 전사 제어에 관련된 영역을 포함하는 유닛이며, 다른 전사 제어에 관계하는 영역으로는, 예를 들어 오퍼레이터(operator), 터미네이터(terminator) 등을 들 수 있다.
본 발명의 프로모터 유닛에 포함된 프로모터는 혐기성 균으로 기능하는 것이면 무엇이든지 좋고, 예를 들면, 비피더스균 유래의 분비 신호의 상류에 위치한 프로모터 또는 비피더스균으로 기능하는 히스톤과 같은 DNA 결합 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터(Hu promoter) 등을 포함한다. 한 구체 예에서, 본 발명의 프로모터 유닛에 포함된 프로모터, 예를 들어 Hu 프로모터(서열번호 13) 및 P37 프로모터(서열번호 16) 이어도 좋고, 바람직하게는 Hu 프로모터다. 본 발명의 프로모터 유닛에 포함된 프로모터는 프로모터의 기능을 잃지 않는 범위에서 그 염기서열의 1 또는 그 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 것(기능적 등가물)으로 표시될 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 프로모터 유닛은 터미네이터를 포함한다. 포함될 수 있는 터미네이터로는 비피더스균에서 기능하는 것이면 무엇이든지 좋지만, 비피더스균에서 기능하는 히스톤과 같은 DNA 결합 단백질을 암호화하는 유전자의 터미네이터(Hu 터미네이터)가 바람직하고, 특히 서열번호 38의 염기서열 또는 이의 1 또는 그 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 서열에서 나타나는 DNA가 가장 바람직하다.
본 발명의 일 구체 예에서, 분비 신호 유닛은 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA의 3’말단에 이어서, 스페이서 펩타이드를 암호화하는 DNA를 더 포함한다.
본 명세서에서 “스페이서 펩타이드(spacer peptide)”는 분비 신호 펩타이드와 목적 단백질의 N 말단 사이에 삽입되는 펩티드이다. 따라서 스페이서 펩타이드를 암호화하는 DNA는 발현 카세트 중 분비 신호의 하류 측, 그리고 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 상류 측에 존재하는 DNA가 된다.
스페이서 펩타이드가 존재하는 것으로부터, 목적 단백질의 분비 효율이 높아진다. 따라서 바람직한 구체 예에서, 스페이서 펩티드는 1 ~ 25 아미노산 길이이고,보다 바람직하게는 1 ~ 20 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 5 ~ 20 아미노산 길이이다. 스페이서 펩타이드의 배열은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 SP56의 경우는 서열번호 5로 표시되는 펩타이드 또는 이의 N 말단을 포함하는 부분 펩티드이며, SP67의 경우는 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드 또는 이의 N 말단을 포함하는 부분 펩티드이다.
서열번호 5 및 6은 각각 비피도박테리움 롱검에서 SP56 및 SP67에 의해 분비되는 단백질의 N 말단 ~ 25 번째 아미노산까지 배열로 구성된 펩타이드이다. 위의 바람직한 구체 예에서, 본 발명의 스페이서 펩티드는 예를 들어 SP56의 경우, 서열번호 5로 표시되는 펩타이드의 첫 번째 아미노산만으로 구성되는 1 아미노산 길이의 부분 서열, 서열번호 5의 1 번째 아미노산에서부터 15 번째 아미노산까지의 15 아미노산 길이의 부분 서열, 서열번호 5의 1 번째 아미노산에서부터 20 번째 아미노산까지의 20 아미노산 길이의 부분 배열 또는 서열번호 5의 25 아미노산 길이의 전체 서열로 기재되는 펩타이드 등으로 있어서 좋고, SP67의 경우 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드의 첫 번째 아미노산만으로 구성되는 1 아미노산 길이의 부분 서열, 서열번호 6의 1 번째 아미노산에서부터 15 번째 아미노산까지의 15 아미노산 길이의 부분 서열, 서열번호 6의 1 번째 아미노산에서부터 20 번째 아미노산까지의 20 아미노산 길이의 부분 서열 또는 서열번호 6의 25 아미노산 길이의 전체 서열로 표시되는 펩타이드 등으로 있어도 좋다.
또한, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열에 대응하는 염기서열은 바람직하게는 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 것이다.
본 발명의 더 바람직한 구체 예에서, 분비 신호 유닛은 SP56과 20 아미노산 분자의 스페이서 펩타이드로 이루어진, 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열, 또는 SP67와 20 아미노산 분자의 스페이서 펩타이드로 이루어진 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA이다. 또한, 서열번호 9 및 서열번호 10로 기재되는 아미노산 서열에 대응하는 염기서열은 바람직하게는 각각 서열번호 11 및 서열번호 12로 기재되는 것이다.
본 발명의 일 구체 예에서, 형질전환용 플라스미드로는 프로모터 유닛, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 분비 신호 펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함 분비 신호 유닛 및 허혈성 질환의 진단 또는 치료 유용한 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 목적 유전자 유닛을 포함하고, 혐기성 균을 형질전환하기 위해 기능하고 상기 균의 혐기적 성질을 잃지 않는 것이면 어떠한 플라스미드도 이용될 수 있다. 그러나 형질전환된 혐기성 세균에서 유전자 수송 담체를 제약하는 경우에는 형질전환용 플라스미드가, 예를 들면 대장균 등 체 내의 다른 박테리아에 수평 전달되고, 수평 전달된 다른 박테리아에서 플라스미드가 복제되어 그 결과 의도하지 않은 부위에서 플라스미드가 암호화하는 단백질이 발현될 위험을 부인할 수 없다. 따라서 바람직한 구체 예에서, 형질전환용 플라스미드는 비-셔틀 플라스미드이다.
본 명세서에서, “셔틀 플라스미드(shuttle plasmid)”는 2 종 이상의 다른 숙주에서 복제 가능한 플라스미드를 의미하고, “셔틀 벡터 플라스미드”와 호환으로 사용된다. 따라서 “비 셔틀 플라스미드”는 1 종의 숙주에서만 복제 가능한 플라스미드를 의미한다. 즉 상기의 예에서 형질전환용 플라스미드는 형질전환 대상의 혐기성 균으로 기능하는 복제 개시점 만을 양성하고 그 외의 균에서 기능하는 복제 개시점을 양성하지 않는 것이며, 대장균 등 형질전환 혐기성 균 이외의 균은 복제되지 않는 플라스미드이다.
본 발명의 형질전환용 플라스미드는 다른 유용한 유전자를 더 포함할 수 있다. 다른 유용한 유전자는 예를 들어, 스펙티노마이신 내성 유전자(spectinomycin resistant gene; SPCM) 등의 선택 마커 유전자, 비피더스균 플라스미드 복제 시작점(pTB6) 등의 복제 개시점, GFP 등의 표식 단백질을 암호화하는 유전자 등을 들 수 있다.
바람직한 구체 예에서, 본 발명의 형질전환용 플라스미드는 pFGF110(서열번호 14) 또는 pFGF111(서열번호 15)이다.
본 발명의 형질전환용 플라스미드는 예를 들어, 다음과 같이하여 제조할 수 있다.
예를 들어, 일반적인 방법에 따라 형질전환 균과 형질전환 균 이외의 균, 예를 들어 비피더스균과 대장균에서 각각 기능하는 복제 개시점을 갖는 셔틀 플라스미드에 적어도 1종의 프로모터 유닛, 분비 신호 유닛, 원하는 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질을 암호화하는 DNA(목적 유전자 단위)를 삽입하는 것으로, 셔틀 플라스미드를 제조할 수 있다.
그리고 선택적으로 이 셔틀 플라스미드에서 형질전환 균 이외의 균의 복제 시작점을 제거함으로써 비-셔틀 플라스미드를 제조할 수 있다.
또한, 상기 각 공정의 작업은 유전 공학 분야의 공지된 방법에 준하여 실시할 수 있다.
<유전자 수송 담체 >
한 측면에서, 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성 세균으로 형성된 유전자 수송 담체에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 수송 담체는 본 발명의 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 상기 혐기성 균으로 형성된 유전자 수송 담체이며, 혐기성 환경 하에 있는 조직 내에서 생육할 수 있고, 목적 활성을 갖는 단백질을 발현 및 분비할 수 있는 것이다.
본 발명의 유전자 수송 담체는 허혈성 질환 부위 특이적으로 생착하기 위해, 목적 단백질은 필연적으로 허혈성 질환 부위에 특이적으로 발현 및 분비되게 된다. 따라서 허혈성 질환의 진단 또는 치료에 이용하는 단백질을 발현할 수 있는 본 발명의 유전자 수송 담체는 효과적으로 허혈성 질환을 진단 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 유전자 수송 담체는 허혈성 질환 부위 특이적으로 생착하기 위해, 상기 유전자 수송 담체의 존재를 감지하여 허혈성 질환 부위를 진단할 수 있게 된다. 유전자 수송 담체의 검출은, 예를 들면 유전자 수송 담체를 표지하여 간편하게 할 수 있다. 질환의 진단에 이용한다는 관점에서 검출은 침습성이 적은 것이 바람직하고, 표지에 의한 생체에의 악영향이 적은 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체 예에서, 유전자 수송 담체는 진단에 유용한 단백질로 형광 단백질을 발현한다. 형광 단백질로는 각종 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 등을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 수송 담체는 체내에 투여하는 것을 전제로 하는 것이기 때문에, 사용되는 혐기성 균은 독성을 갖지 않거나 독성이 낮은 것일 필요가 있다. 예를 들어, 클로스트리듐(Clostridium) 또는 살모넬라(Salmonella) 균 등 병원성 균이어도 비 병원성화 된 것이면 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체 예에서, 본 발명의 혐기성 균은 병원성 균을 저독성으로 변이시켜 얻을 수 있다. 그러나 저독성으로 변이된 박테리아는 반대로 돌연변이 되어 원래의 병원성 균으로 돌아가 유해성을 발휘할 가능성이 있기 때문에 선천적으로 비병원성 세균인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체 예에서, 혐기성 균은 비병원성 장내 세균을 이용한다.
본 발명에 사용할 수 있는 비병원성 장내 세균으로는 바람직하게는 비피도박테리움 균(비피더스균)을 들 수 있다. 비피도박테리움 속 세균으로는, 예를 들어 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 안그라텀(Bifidobacterium angulatum), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 아스테로이데스(Bifidobacterium asteroides), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 보움(Bifidobacterium boum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 카테누라텀(Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 코에리눔(Bifidobacterium choerinum), 비피도박테리움 코리네포르메(Bifidobacterium coryneforme), 비피도박테리움 쿠니쿠리(Bifidobacterium cuniculi), 비피도박테리움 덴티코렌스(Bifidobacterium denticolens), 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium), 비피도박테리움 갈리쿰(Bifidobacterium gallicum), 비피도박테리움 갈리나룸(Bifidobacterium gallinarum), 비피도박테리움 글로보섬(Bifidobacterium globosum), 비피도박테리움 인디쿰(Bifidobacterium indicum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 이노피나텀(Bifidobacterium inopinatum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 락텐티스(Bifidobacterium lactentis), 비피도박테리움 리베로룸(Bifidobacterium liberorum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 매그넘(Bifidobacterium magnum), 비피도박테리움 메리시쿰(Bifidobacterium merycicum), 비피도박테리움 미니멈(Bifidobacterium minimum) 비피도박테리움 몬골리언스(Bifidobacterium mongoliens), 비피도박테리움 파르블로룸(Bifidobacterium parvulorum), 비피도박테리움 슈도카테눌라텀(Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 사이쿠라에로필럼(Bifidobacterium psychraerophilum), 비피도박테리움 플로럼(Bifidobacterium pullorum), 비피도박테리움 루미나레(Bifidobacterium ruminale), 비피도박테리움 루미난티움(Bifidobacterium ruminantium), 비피도박테리움 사에쿠라레(Bifidobacterium saeculare), 비피도박테리움 스카루도뷔(Bifidobacterium scardovi), 비피도박테리움 서브틸(Bifidobacterium subtile), 비피도박테리움 스위스(Bifidobacterium suis), 비피도박테리움 델마시드필램(Bifidobacterium thermacidophillum), 비피도박테리움 서모필램(Bifidobacterium thermophilum) 등이 있으며, 비피도박테리움 롱검 가장 바람직하다.
이 균은 모두 시판되고 있거나 기탁 기관에서 쉽게 구할 수 있다. 예를 들어, 비피도박테리움 롱검 ATCC-15707, 비피도박테리움 비피덤 ATCC-11863, 비피도박테리움 인판티스 ATCC-15697 등은 ATCC (The American Type Culture Collection)에서 쉽게 구할 수 있다.
또한 각각의 균의 주에 대해서도 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 비피도박테리움 롱검의 주에 대해서, 비피도박테리움 롱검 105-A 주, 비피도박테리움 롱검 aE-194b 주, 비피도박테리움 롱검 bs-601 주, 비피도박테리움 롱검 M101-2 주를 들 수 있으며, 그 중에서도 비피도박테리움 롱검 105-A 주가 바람직하다.
비피도박테리움 브레베의 주에 대해서는, 예를 들어, 비피도박테리움 브레베 표준 주 (JCM1192), 비피도박테리움 브레베 aS-1 주, 비피도박테리움 브레베 I-53-8W 주를 들 수 있으며, 그 중에서도 비피도박테리움 브레베 표준 주, 비피도박테리움 브레베 aS-주가 바람직하다.
비피도박테리움 인판티스의 주에 대해서는, 예를 들어, 비피도박테리움 인판티스 표준 주 (JCM1222), 비피도박테리움 인판티스 I-10-5 주를 들 수 있으며, 그 중에서도, 비피도박테리움 인판티스 표준 주, 비피도박테리움 인판티스 I-10-5 주가 바람직하다.
또한 비피도박테리움 락텐티스의 주에 대해서는, 예를 들어, 비피도박테리움 락텐티스표준 주 (JCM1220)를 들 수 있다.
본 발명의 유전자 수송 담체는 형질전환하는 임의의 혐기성 균을 상기 본 발명의 형질전환용 플라스미드를 사용하여 유전자 공학 분야의 공지된 방법에 따라 형질전환함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 유전자 수송 담체의 제조는 시판 실험서, 예를 들어, 유전자 설명서 (Kodansha), Y. Takagi 편 유전자 조작 실험 방법(Kodansha), 분자 클로닝(Molecular Cloning) 콜드 스프링 하버 연구소 (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982), 분자 클로닝 제 2 판 (Molecular C1oning, 2nd ed.) 콜드 스프링 하버 연구소 (Cold Spring Harbor Laboratory) (1989), 효소학의 방법(Methods in Enzymology), 194 (1991) 등에 기재된 방법에 따라 할 수 있다.
<의약 조성물>
한 측면에서, 본 발명은 상기 본 발명의 유전자 수송 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 유전자 수송 담체를 함유하고 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 유전자 수송 담체는 적어도 1종 포함되어 있으면 좋고, 2종 이상 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 유전자 수송 담체 이외의 허혈성 질환 치료 효과를 나타내는 화합물을 함유하는 약학 조성물 및 허혈성 질환 치료제와 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 본 발명의 유전자 수송 담체 외에 어떤 성분을 함유할 수 있다. 그런 어떤 성분으로는 예를 들어, 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 유전자 수송 담체의 생착 증식 촉진제 등을 들 수 있다. 생착 증식 촉진제로는 이에 한정하는 것은 아니지만 예를 들어, 말토오스, 락툴로오스, 아라비노스, 자일로스, 갈락토스, 포도당, 유당, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스 등의 본 발명의 유전자 수송 담체에 이용되고 있는 형질전환 균이 동화(assimilated) 될 수 있는 당 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 본 발명의 유전자 수송 담체를 함유하는 액체 또는 고체 제제를 들 수 있다. 액제는 본 발명의 유전자 수송 담체의 혐기성 균의 배양액을 정제하고 이에 필요한 적절한 생리 식염 주사액 또는 보충액 또는 의약 첨가물을 가하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전하여 제조할 수 있다. 또한 고형 제제는 액제에 적당한 보호제를 첨가하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전한 후 동결 건조 또는 L 건조(L-drying) 또는 액제에 적당한 보호제를 첨가하여 동결 건조 또는 L 건조한 후 이를 앰플 또는 바이알 병 등에 충전함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여 모두 가능하지만, 비경구 투여가 바람직하며, 예를 들어 정맥 주사, 피하 주사, 국소 주입, 뇌 실내 투여 등을 할 수 있으며, 정맥 주사, 즉 전신 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물의 유전자 수송 담체의 투여량은 질환 부위에서 생육할 수 있고, 또한 유효한 치료양의 활성 단백질을 발현하는데 충분한 양이라면 특별히 제한되지 않지만, 경제적인 관점 및 부작용을 최대한 방지하는 관점에서 필요한 치료 효과를 얻을 수 있는 범위에서 최대한 적은 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물에 있어서 유전자 수송 담체의 투여량은 질환의 정도, 환자의 체중, 연령, 성별에 따라 적절하게 선택하고 개선의 정도에 따라 적절히 증감할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 이용시에는 사용하는 혐기성 균의 균 자체가 나타내는 질환 치료 활성, 사용하는 혐기성 균이 생산하는 질병 치료 활성을 갖는 단백질 등의 종류 및 사용하는 혐기성 균의 해당 활성 단백질의 생산량 등에 따라 적절히 설정한다.
구체적으로는, 예를 들어 정맥 내 투여의 경우에는 특히 세균 덩어리 의한 색전 등의 위험을 감소하는 것이 요구되기 때문에 가능한 낮은 농도의 주사용 제제를 여러 번에 나누어 분주하거나 또는 적절한 수액으로 희석하여 지속 주입하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 성인의 경우, 본 발명의 혐기성 균의 균체를 체중 1 kg 당 106 ~ 1012 cfu을 1일 1 ~ 여러 차례에 걸쳐 1 ~ 여러 일 연속 또는 적절하게 간격을 두고 투여한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 비피더스균의 균체를 104 ~ 1010 cfu/mL 함유하는 제제를, 성인 1인당 1 ~ 1000 mL를 직접 또는 적절한 수액으로 희석하여 1일 1 ~ 수회로 나누어 1 ~ 수일 연속하여 투여한다.
또한 질병 조직에 직접 투여하는 국소 투여의 경우는 가능한 질환 조직 전체에 균이 생착 증식하는 것이 요구되기 때문에 고농도의 주사제를 질병 조직의 복수 개소에 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 성인의 경우, 본 발명의 비피더스균의 균체를 체중 1 kg 당 106 ~ 1012 cfu을 1일 1 ~ 여러 번 필요에 따라 1 ~ 수일 연속 또는 적절하게 간격을 두고 투여한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 비피더스균의 균체를 104 ~ 1010 cfu/mL 함유하는 제제를, 성인 1인당 1 ~ 1000 mL를 직접 1일 수회 필요에 따라 1 ~ 수일 연속하여 투여한다.
치료 기간 동안 질병 조직 중 균이 소실되고 있는 것으로 확인된 경우는 일단 치료를 중단하고 상기와 동일한 방법으로 균을 투여한다.
또한, 본 발명에 있어서 “X와 Y를 조합(combination)한다”는 X와 Y를 다른 형태로 한 것이든, X와 Y를 동일한 형태(예를 들어 X와 Y를 함유하는 형태)로 한 것이든, 어느 경우도 포함한다. 또한 X와 Y를 다른 형태로 제공된 경우 X, Y가 모두 다른 성분을 더 함유하고 있는 경우도 포함된다.
본 발명의 유전자 수송 담체는 허혈성 질환 부위 특이적으로 생착 및 증식하는 것이며, 혐기성 환경에 없는 정상 조직에서 증식할 수 없다. 따라서 허혈성 질환 부위를 겨냥한 국소 투여가 아니어도 질병 부위 특이적으로 유전자가 전달된다. 따라서 투여의 편리성, 낮은 침투성 등의 관점에서 바람직하게는 본 발명의 약학 조성물은 전신 투여된다.
<진단방법 또는 치료방법>
한 측면에서, 본 발명은 상기 서술된 하나의 유전자 수송 담체를 투여하는 것을 포함하는 허혈성 질환을 진단하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 수송 담체를 사용함으로써 고효율로 안전한 진단 또는 치료가 가능해진다.
본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 유전자 수송 담체를 허혈성 질환 대상에 투여한다. 투여 방법은 경구 투여, 비경구 투여 모두 가능하지만, 비경구 투여가 바람직하며, 예를 들어 정맥 주사, 피하 주사, 국소 주입, 뇌 실내 투여 등을 할 수 있으며, 정맥 주사, 즉 전신 투여가 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명의 방법의 바람직한 구체 예에서, 본 발명의 유전자 수송 담체를 전신 투여한다. 본 발명의 유전자 수송 담체는 유전자를 허혈성 질환 부위 특이적으로 송달할 수 있기 때문에, 카테터나 근육 주사 등을 이용하여 환부에 직접 투여하지 않고, 정맥 주사 등으로 전신 투여한 경우에도 허혈성 질환 부위 특이적으로 생착 및 증식하여 효과를 발휘할 수 있다. 따라서 기존의 치료법과 비교하여도 매우 침습성이 낮은 치료가 가능해진다.
실시예
이하, 참고예 및 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이러한 예시에 한정되는 것은 아니다.
분비 신호 펩타이드의 동정
다음 순서로 분비 신호 펩타이드 SP56 및 SP67을 확인했다.
NCBI의 게놈 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)에 등록되어 있는 비피도박테리움 롱검 NCC2705 주 유래 단백질의 전체 아미노산 서열을 분비 신호의 유무를 예측하는 신호 배열 예측 프로그램 SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)으로 분석했다. 이 분석을 통해 단백질의 N 말단에 분비 신호 펩타이드 서열을 갖는 것으로 예측된 단백질의 일부 아미노산 배열에 대해 막관통 영역(TM)을 추정하는 프로그램 TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)에서 토폴로지 분석을 실시했다. 이 토폴로지 분석 결과로부터 단백질의 N 말단에 TM이 존재하는 것으로 추정된 단백질을 선정했다. 이러한 단백질을 TM이 있는 것으로 예상되는 비피도박테리움 롱검 NCC2705 주 유래의 분비 신호 펩티드로 선정했다. 선정된 분비 신호 펩타이드의 아미노산 서열에 대응하는 비피도박테리움 롱검 105A 주의 아미노산 서열에서 각 단백질의 아미노산 서열 N 말단에서 SignalP 분석에 의해 프로테아제 절단 추정 부위로 추정된 아미노산 서열까지 각 분비 신호 단백질 서열(SP56 및 SP67)로 하였다. 또한 스페이서 단백질 서열은 각 신호 배열의 C 말단으로부터 이어지는 20 아미노산 잔기로 하였고, 이들을 분비 신호 유닛으로 했다. 이용한 분비 신호 유닛의 배열을 아래에 나타내었다.
SP56과 스페이서 펩타이드(서열번호 9), SP67과 스페이서 펩타이드(서열번호 10).
각종 hFGF2 분비 플라스미드의 제작
플라스미드 제작에 사용한 PCR 용 프라이머를 표 1에 나타낸다.
Figure 112017080826118-pct00001
1. 플라스미드 pFGF - Hu의 제작
(1) 인간 FGF2-HisTag 인서트(insert) 단편(인서트 단편 1)의 조제
C 말단에 히스티딘 태그를 융합한 인간 FGF2를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 “hFGF2 in pUC57”를 GenScript 사에서 입수했다. hFGF2의 DNA 서열은 hFGF2(GenBank Accession No. # NM_002006의 AUG 부터 번역 시작의 약 18kDa의 단백질)의 아미노산 서열에 따라 코돈을 비피더스균에 최적화한 인공 DNA 서열(서열번호 31)이다. 이 플라스미드 hFGF2 in pUC57 1 ng을 주형으로 FGF4 프라이머(포워드) 및 FGF3 프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 실시했다. 프라이머 서열은 인서트 단편과 벡터 단편의 말단 15bp가 중복되도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0.2 μM 반응 용량을 50 μL로 PrimeSTAR HS (Premix) 키트(다카라 바이오 주식회사)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭 프로그램으로는 98℃에서 10초(변성 반응), 55℃에서 5초(어닐링 반응), 72℃에서 30초(신장 반응)을 1 사이클로서 30 사이클 실시한 후, 72℃에서 30초 추가 신장 반응을 실시하여 약 0.5 kbp의 hFGF2-HisTag 인서트 단편(인서트 단편 1)을 제조하였다.
(2) 벡터 단편 1의 조제
플라스미드 pCDshuttle(국제 공개 번호 제 2009/128272 호)(서열번호 32) 1 ng를 주형으로 FGF1 프라이머(포워드) 및 FGF2 프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 상기와 동일하게 수행 하였다. 그러나 PCR의 신장 반응은 72℃에서 4 분 수행하였다. 벡터 단편 1의 길이는 약 3.9 kbp이다.
(3) 주입 반응
상기에서 제조된 인서트 단편 1과 벡터 단편 1을 In-Fusion (R) HD Cloning 키트(다카라 바이오 주식회사 제품)를 사용하여 연결했다. 즉, 마이크로 튜브에 상기 벡터 단편 50 ng과 인서트 단편 13 ng를 첨가하여 키트에 5 × In-Fusion HD Enzyme premix 2 μL, Cloning Enhancer 1 μL를 추가로 첨가하여 0.1 × TE 버퍼(1 mM Tris- HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)에서 반응액 용량을 10 μL 조정했다. 이것을 37℃에서 15분간 보온한 후 또한 50℃에서 15분간 보온했다. 기타 절차는 키트 제품 설명서에 따라 주입 반응액 1을 제조하였다.
(4) 대장균의 형질전환 및 플라스미드 pFGF-Hu의 DNA 서열 확인
상기 주입 반응액 1을 이용하여 대장균 TOP10 컴피턴트 세포(competent cells)(인비트로젠)의 형질전환을 제품 설명서에 따라 수행하였다. 형질전환 후 균 현탁액은 75 μg/mL 스페치노마이신 함유 LB 한천 배지에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 위 한천 배지에 형성된 대장균 콜로니를 75 μg/mL 스페치노마이신 함유 LB 액체 배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 이로부터 QIAprep Spin Miniprep 키트(퀴아젠 사제)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드에 대한 상기 인간 FGF2 발현 카세트 포함하는 영역(5'-Hu 프로모터-인간 FGF2 단백질-His 태그-Hu 터미네이터-3')의 서열을 결정하기 위해 Big Dye(등록 상표) Terminator v3.1 Cycle Sequencing 키트(어플라이드 바이오 시스템즈 사제)를 이용하여 시퀀스 반응을 수행하였다. 추출한 플라스미드를 pFGF-Hu라고 명명했다.
2. 플라스미드 pHuSP56L20 - FGF2 및 pHuSP67L20 - FGF2의 제작
(1) SP56L20 및 SP67L20 인서트 단편(인서트 단편 2 및 3)의 조제
비피도박테리움 롱검 105-A 주의 게놈 DNA를 주형으로 표 1에 기재된 SP56-ins_F1 프라이머(포워드) 및 SP56-ins_R1_FGF 프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 실시했다. 프라이머 서열은 삽입 단편과 벡터 단편의 말단 15 bp가 중복하도록 설계했다. 각 프라이머 농도를 0.2M 반응 용량을 20L로 PrimeSTAR HS (Premix) 키트(다카라 바이오 주식회사)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭 프로그램으로는 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 72℃에서 20초를 1 사이클로 30 사이클 실시한 후, 72℃에서 30초 신장 반응을 실시하여 약 0.2 kbp의 SP56L20 인서트 단편 증폭 산물(인서트 단편 2)를 제조하였다.
SP67L20 인서트 단편(인서트 단편 3)는 PCR 증폭 프라이머로 SP67-ins_F1 프라이머(포워드) 및 SP67-ins_R1_FGF 프라이머를 이용한 이외는 상기와 동일하게 제조하였다.
(2) 인간 FGF2 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터 단편 2 조제
플라스미드 pFGF-Hu를 주형으로 표 1에 기재된 FGF35 프라이머(포워드) 및 HuProm_R 프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 상기 인서트 조각의 조제와 같은 방법으로 PCR 증폭을 실시했다. 그러나 PCR 반응 용량을 50 μL했다. 증폭 프로그램으로는 98℃에서 10초, 65℃에서 5초, 72℃에서 4분 30초를 1 사이클로 30 사이클 실시한 후, 72℃에서 30초 신장 반응하고, 약 4.3 kbp의 벡터 단편 증폭 산물을 제조하였다. 이 PCR 산물을 0.8% 아가로오스겔(에틸디움브로마이드 포함)에서 전기 영동하여 UV로 조사하면서 약 4.3 kbp의 DNA 밴드를 포함한 젤을 꺼냈다. 이 젤에서 QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아젠 사제)를 이용하여 DNA를 추출하여 벡터 단편 2(직쇄화 pHu-FGF2 단편 서열번호 33)로 하였다.
(3) 주입 반응
상기에서 제조된 인서트 단편 2 또는 인서트 단편 3과 벡터 단편 2를 각각 In-Fusion (R) HD Cloning 키트(다카라 바이오 주식회사 제품)를 사용하여 연결했다. 즉, 마이크로 튜브에 상기 벡터 단편 증폭 산물 68 ng과 인서트 단편 증폭 산물 6.15 ng(인서트 단편 2의 경우) 또는 6.55 ng(인서트 단편 3의 경우)을 첨가하여, 키트에 5 × In- Fusion HD Enzyme premix 2 μL, Cloning Enhancer 1 μL를 추가로 첨가하여 0.1 × TE 버퍼 (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)에서 반응 액 용량을 10 μL 조정했다. 이것을 37℃에서 15분간 보온한 후 또한 50℃에서 15분간 보온했다. 기타 절차는 키트 제품 설명서에 따라 주입 반응액 2를 제조하였다.
(4) 대장균의 형질전환 1 및 플라스미드 pHuSP56L20-FGF2 및 pHuSP67L20-FGF2의 DNA 서열 확인
상기 주입 반응액 2를 이용하여 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포(다카라 바이오 주식회사 제품)의 형질전환을 제품 설명서에 따라 수행하였다. 형질전환 후 균 현탁액은 75 μg/mL 스페치노마이신 함유 LB 한천 배지에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 위 한천 배지에 형성된 대장균 콜로니를 75 μg/mL 스페치노마이신 함유 LB 액체 배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 이로부터 QIAprep Spin Miniprep 키트(퀴 아젠 사제)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드의 상기 인간 FGF2 분비 발현 카세트 포함하는 영역(5'-Hu 프로모터-SP56L20-인간 FGF2 단백질-His 태그-Hu 터미네이터-3') 또는 (5'-Hu 프로모터-SP67L20-인간 FGF2 단백질-His 태그-Hu 터미네이터-3 ')의 서열을 상기 1. (4)와 동일하게 확인하였다. 추출한 플라스미드를 각각 pHuSP56L20-FGF2 및 pHuSP67L20-FGF2라고 명명했다. 각 플라스미드의 인간 FGF2 분비 발현 카세트를 포함하는 영역의 서열을 각각 서열번호 34 및 35에 나타내었다.
3. 플라스미드 pHuSP26L20 - FGF2 - dHis 제작
(1) SP26L20 인서트 단편(인서트 단편 4)의 조제
비피도박테리움 롱검 105A의 게놈 DNA 80 ng을 주형으로 Hu_SP26_F 프라이머(포워드) 및 FGF_SP26L20_R 프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 상기 2. (1)과 동일하게 수행했다. 그러나 PCR의 신장 반응은 72℃에서 14초, PCR 용액 량은 20 μL로 하였다. 삽입 단편의 길이는 약 0.1 kbp이다.
(2) 주입 반응
상기에서 제조된 인서트 단편 4와 벡터 단편 2를 이용하여 상기 2. (3)과 같이 In-Fusion 반응하고, 주입 반응액 3을 제조하였다. 그러나 In-fusion 반응에 이용한 벡터 양을 50 ng 인서트 양을 4.2 ng로 했다.
(3) 대장균의 형질전환 2 및 플라스미드 pHuSP26L20-FGF2의 DNA 서열 확인
상기 주입 반응액 3을 이용하여 상기 1. (4)와 같은 방법으로 대장균 TOP10 컴피턴트 세포의 형질전환, 재조합 대장균에서 DNA 추출, 인간 FGF2 발현 카세트 포함하는 영역(5'-Hu 프로모터-SP26L20-인간 FGF2 단백질-His 태그-Hu 터미네이터-3 ')의 서열 결정을 하였다. 추출한 플라스미드를 pHuSP26L20-FGF2라고 명명했다.
(4) 인간 FGF2 인서트 단편(인서트 단편 5)의 조제
플라스미드 pHuSP26L20-FGF2 1 ng를 주형으로 FGF35 프라이머(포워드)와 FGF-His_R 프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 상기 2. (1)과 동일하게 수행했다. 그러나 PCR 어닐링 온도는 60℃, 신장 반응은 72℃에서 35초로했다. 삽입 단편의 길이는 약 0.5 kbp이다.
(5) 벡터 단편 3의 조제
플라스미드 pHuSP26L20-FGF2 1ng를 주형으로 FGF-His_F 프라이머(포워드) 및 FGF_SP26L20_R 프라이머(리버스)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 상기 2. (2)와 동일하게 수행하였다. 그러나 PCR 어닐링 온도는 60℃, 신장 반응은 72℃에서 4분 10초로 했다. 벡터 단편의 길이는 약 4 kbp이다.
(6) 주입 반응
상기에서 제조된 인서트 단편 5와 벡터 단편 3을 이용하여 상기 2. (3)과 같이 In-Fusion 반응하고, 주입 반응액 4를 제조하였다. 그러나 In-fusion 반응에 이용한 벡터 양을 20 ng 인서트 양을 4 ng으로 했다.
(7) 대장균의 형질전환 3 및 플라스미드 pHuSP26L20-FGF2-dHis 서열 확인
상기 주입 반응액 4를 이용하여 상기 2. (4)와 같은 방법으로 대장균의 형질전환, 재조합 대장균에서 DNA 추출하였다. 추출한 DNA를 이용하여 인간 FGF2 발현 카세트 포함하는 영역(5'-Hu 프로모터 -SP26L20-인간 FGF2 단백질-Hu 터미네이터 -3')의 서열 결정을 했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP26L20-FGF2-dHis라고 명명했다.
4. 플라스미드 pHuSP56L20 - FGF2 - dHis 및 pHuSP67L20 - FGF2 - dHis 제작
(1) 인간 FGF2 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터 단편 4 조제
플라스미드 pHuSP26L20-FGF2-dHis를 주형으로 한 것 외에는 상기 2. (2)와 같은 방법으로 PCR을 수행하여 벡터 단편 4 (직쇄화 pHuSP26L20-FGF2-dHis 단편 서열번호 36)를 제조하였다.
(2) 주입 반응
상기에서 제조된 인서트 단편 2 또는 3 (SP56 또는 SP67) 및 벡터 단편 4를, 상기 2. (3)과 동일한 방법으로 실시하여 주입 반응액 5를 제조하였다. 그러나 벡터 량은 75 ng로 하였다.
(3) 대장균의 형질전환 4 및 플라스미드 pHuSP56L20-FGF2-dHis 및 pHuSP67L20-FGF2-dHis의 DNA 서열 확인
상기 2. (4)와 동일한 방법으로 상기 주입 반응액 5를 이용하여 상기 대장균 HST16CR 컴피턴트 세포의 형질전환, 재조합 대장균에서 플라스미드 추출하였다. 추출한 플라스미드의 전장 서열의 결정을 동일한 순서로 실시했다. 추출한 플라스미드를 pHuSP56L20-FGF2-dHis 및 pHuSP67L20-FGF2-dHis라고 명명했다.
5. 플라스미드 pFGF110 및 pFGF111 제작
(1) 플라스미드 pHuSP56L20-FGF2-dHis 및 pHuSP67L20-FGF2-dHis에서 pUCori 제거
상기 플라스미드 pHuSP56L20-FGF2-dHis 또는 pHuSP67L20-FGF2-dHis 3 μg을 제한 효소 BamHI (Thermo Scientific 사) 및 Bgl II (Thermo Scientific 사)으로 반응시킨 뒤, 약 0.7 kbp의 pUC ori를 포함 DNA 단편과 그 이외의 부분(약 3.8 kbp)의 2 개의 조각으로 절단했다. 이 반응액을 0.8% 아가로오스겔(에틸디움브로마이드 포함)에서 전기 영동하여 UV로 조사하면서 약 3.8 kbp의 DNA 밴드를 포함한 젤을 추출하였다. 이 젤로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아젠 사제)를 이용하여 DNA를 추출하고 이들을 각각 직쇄화 비셔틀 플라스미드 pFGF110 및 pFGF111로 하였다.
(2) 비셔틀 플라스미드 pFGF110 및 pFGF111 제작
상기 직쇄화 비셔틀 플라스미드의 자기 결합(Self ligation)을 Rapid DNA Ligation Kit (Thermo Scientific 사)를 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 즉, 상기 직쇄화 비셔틀 플라스미드 400 ng에 상기 키트 첨부의 5 × Rapid Ligation Buffer 80μL, T4 DNA Ligase 8μL을 더해 0.1 × TE에서 400 μL로 하였다. 이를 80 μL 씩 5 개의 마이크로 튜브에 분주하고 22℃에서 5 분간 반응시키고, 셀프 결합 반응을 수행하였다. 이 반응액을 하나로 묶어 Proteinase K 처리, 그 다음 페놀/클로로포름에 의한 단백질 제거, 클로로포름 추출 및 알코올 침전을 통상의 방법으로 실시했다. 알코올 침전된 DNA를 0.1 × TE에 용해하고 비셔틀 플라스미드 pFGF110(서열번호 14) 및 pFGF111(서열번호 15)로 하였다.
재조합 비피더스균의 제작
(1) FGF110 주 및 FGF111 주의 제작
상기에서 제작한 비셔틀 플라스미드 pFGF110 및 pFGF111의 DNA 용액을 이용하여 비피도박테리움 롱검 105-A 주의 형질전환을 electroporation의 시스템(Genepulser II, Bio-Rad)에 의해 수행했다. 전기 충격(2kV, 25μF, 200Ω) 후 큐벳(2 mm 간격)에 800μL의 IMR 액체 배지와 50 μL의 비타민 C 첨가 용액 (100 mL 당 아스코르빈산 35 g, L-cysteine hydrochloride monohydrate 2 g 및 탄산나트륨 11 g을 함유하는 용액)의 혼합액을 즉시 첨가하고 이것을 멸균한 2 mL 마이크로 튜브에 회수했다. 이 2 mL 튜브의 뚜껑을 풀고 산소 및 탄산 가스 발생제(AnaeroPack (registered trademark) Kenki, Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.)와 함께 밀폐 용기에 넣고 37℃로 설정한 인큐베이터에서 3시간 보온하였다.
보온 후의 각 균 현탁액을 75 μg/mL 스페치노마이신 함유 IMR 한천 배지에 도포하였다. 이 플레이트를 상기 산소 및 탄산 가스 발생제와 함께 밀폐 용기에 넣고 37℃로 설정 한 인큐베이터에서 2일간 배양했다.
상기 스페치노마이신 함유 IMR 한천 배지에 형성된 콜로니 중 플라스미드 pFGF110에서의 형질전환체를 비피도박테리움 롱검 105-A/pFGF110 주(이하 FGF110 주), 플라스미드 pFGF111의 형질전환체를 비피도박테리움 롱검 105-A/pFGF111 주 (이하 FGF111 주)로 하였다.
(2) SP56 주 및 SP67 주의 제작
셔틀 플라스미드 pHuSP56L20-FGF2 및 pHuSP67L20-FGF2를 이용하여 상기 (1)과 동일한 방법으로 비피도박테리움 롱검 105-A 주의 형질전환을 실시하여 각각 비피도박테리움 롱검 105-A/pHuSP56L20-FGF2 주 (이하 SP56 주) 및 비피도박테리움 롱검 105-A/pHuSP67L20-FGF2 주 (이하 SP67 주)를 얻었다.
(3) 대조군 주의 제작
벡터 골격인 WO2011/093467에 기재된 pBEshuttle(서열번호 37)를 이용하여 상기(FGF110 주 및 FGF111 주 제작)와 동일한 방법으로 비피도박테리움 롱검 105-A 주의 형질전환을 하고 비피도박테리움 롱검 105-A/pBEshuttle 주(이하 BEshuttle 주)를 얻었다.
발현 단백질의 분석
(1) 재조합 비피도박테리움 속 세균의 배양
상기 FGF110 주, FGF111 주 및 특허문헌 7 (WO2013/008881)에 기재된 비피도박테리움 롱검 105A/pFGF12a 주(이하 FGF12a 주)를, 스페치노마이신(최종 농도 75 μg/mL)과 비타민 C 첨가액 100 μL를 첨가한 MRS(Beckton Dickinson) 액체 배지 10 mL에 접종하고, 37℃에서 24시간 혐기 배양하여 활성화 배양액으로 하였다. 다음은 DMEM (Cat No.11885-084: Life Technologies Corporation) : MRS를 9 : 1의 비율로 혼합한 배지 20 mL에 비타민 C 첨가액 100 μL, 스페치노마이신을 75 μg/mL가 되도록 첨가하여, 상기 활성화 배양액 100 μL를 접종했다. 이것을 37℃에서 15시간 혐기 배양하였다.
(2) 시료 준비
상기 재조합 비피더스균 배양액의 상층액을 통상적인 방법에 따라 트리클로로 아세트산(TCA)침전하여, 1 × SDS 샘플 버퍼로 다시 용해시켰다. 이것을 95℃에서 3분간 가열 처리, 웨스턴 분석에 사용하였다.
(3) 웨스턴 블랏
상기 각 배양 상청 농축물(배양 상청 0.2 mL 상당) 및 양성 대조인 재조합 인간 FGF2(Peprotech 사 분자량 17.2 kDa)를 Mini-protean (registered trademark) TGXTM 젤 (4 ~ 20%) (Bio-rad 사제)에서 전기 영동하여, 젤을 PVDF 막 (멤브레인)(iBlot Transfer Stacks, Life Technologies Corporation)에 iBlot 전송 장치 (Life Technologies Corporation)를 이용하여 전사했다. 블랏팅 종료 후 PVDF 멤브레인을 블로킹(2 % ECL Prime Blocking agent (GE Healthcare Japan) in TTBS) 했다. 일차 항체로, Anti FGF-2 human rabbit poly (H-131, Santa Cruz Biotechnology Inc.)을 넣고 4℃에서 밤새 진탕했다. 일차 항체 반응 후 멤브레인을 TTBS로 약 5분 세척을 6회 반복하여, 이차 항체 Goat anti-rabbit IgG HRP(Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 첨가하여 실온에서 1시간 진탕했다. 항체 반응 종료 후 멤브레인을 Western Lightning Ultra(Perkin Elmer)를 이용하여 발광시켰다. 이것을 이미징 장치 (Fluor-S MAX, Bio-Rad)로 분석했다.
(4) 결과
결과를 도 5에 나타낸다. FGF110 주 및 FGF111 주에 대해 예상되는 분자량 약 20 kDa의 밴드가 확인되었다.
비피더스균로부터 His-tag 정제한 FGF2의 생리 활성 측정
(1) SP56 주 및 SP67 주 배양 상청에서 인간 FGF2 정제
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 SP56 주 및 SP67 주의 배양을 하였다. 이 배양액을 원심 분리하여 상층액을 회수하여 황산 암모늄 침전을 통상의 방법으로 실시했다. 또한, 히스티딘 태그를 갖는 단백질용 정제 키트(TALON(등록 상법) Metal Affinity Resin 다카라 사제)를 이용하여 선호도 정제(affinity purification) 하였다. 이것을 여과 카세트(Amicon Ultra-4, 10K, Millipore)를 사용하여 버퍼를 PBS로 대체하고 정제 인간 FGF2 용액을 얻었다. 이 정제 용액의 인간 FGF2 양을 Quantikine ELISA FGF2 basic Immunoassay (R & D Systems; DFB50)를 이용하여 측정하였다.
(2) SP56 주 및 SP67 주 분비물 중 FGF2 단백질의 증식 촉진 활성
FGF2의 생리 활성은 SP56 주 및 SP67 주의 배양 상청으로부터 상기와 같이 정제된 인간 FGF2를 NIH/3T3 세포(마우스 섬유아 용 세포주)에 첨가하여 세포 증식 촉진 활성으로 평가했다. 즉, NIH/3T3 세포를 DMEM 배지(10% (v/v) FBS)에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양 후 DMEM 배지( % (v/v) FBS)에서 96 홀 플레이트에 1 × 103 개씩 파종하여 37℃에서 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 다음으로, 상기 SP56 주 및 SP67 주 유래 인간 FGF2 정제물 또는 재조합 hFGF2 (R & D systems)을 FGF2 농도가 0.25 ng/mL ~ 10 ng/mL이 되도록 DMEM 배지(5% (v/v) FBS)와 혼합한 배지로 교체했다. 대조군으로 FGF2 용액 대신에 PBS(-)를 혼합한 배지로 교환도 동일하게 수행하였다. 이 플레이트를 37℃에서 5% CO2 조건에서 4일간 배양하였다.
상기 플레이트에 Cell Counting kit-8 (주식회사 동인 화학 연구소) 100μL 씩 첨가한 후 두 시간 동안 37℃에서 5% CO2 조건에서 보온 파장 450 nm 및 630 nm (참조 파장)에서 흡광도를 측정하여 상기 NIH/3T3 세포에 대한 세포 증식 촉진 활성을 측정했다.
(3) 결과
결과를 도 6에 나타낸다.
SP56, SP67 주로부터 분비된 인간 FGF2은 농도 의존적으로 세포 증식 촉진 활성을 가지고 있었다.
FGF2 분비량의 안정성 비교
(1) 방법
WO2013/008881에 기재된 비피도박테리움 롱검 105A/pFGF12a 주 및 상기 FGF110 주, FGF111 주의 글리세린 스톡을 MRS (75 μg/mL 스페치노마이신, 1% 비타민 C 첨가액) 배지 10 mL에 1%로 접종하여, 37℃에서 24시간 혐기 배양하여 활성화 배양액으로 하였다. 이어서 활성화 배양액을 같은 배지에 1% 접종하고, 마찬가지로 24시간 배양하여 계대 배양하였다. 이후 24 시간마다 계대를 반복했다.
인간 FGF2 분비량 측정 전날에는 상기 계대 배양액을 인간 FGF2 측정용 배지 인 DMEM : MRS (9 : 1) (75 μg/mL 스페치노마이신, 1 % 비타민 C 첨가액 함유) 배지로 0.5% 접종하고 37℃에서 13시간 배양 하였다. 인간 FGF2 분비량 측정은 글리세린 스톡에서 배양 후 2일째, 4일째, 7일째에 수행하였다.
인간 FGF2 측정용 배지로 배양액을 원심 분리하여 배양 상청을 얻었다. 이 배양 상청 중 FGF2 단백질양을 Quantikine ELISA FGF2 basic Immunoassay (R & D Systems; DFB50)를 이용하여 측정하였다.
(2) 결과
결과를 도 7에 나타낸다.
FGF2 분비량이 높은 순서로는 FGF110 주, FGF111 주, FGF12a 주였다.
FGF12a 주는 배양 4 일째 이후에 FGF2 분비량이 크게 떨어졌다.
FGF110 주 투여한 만성 허혈성 모델 마우스의 손상된 사지 혈류량의 추이
본 발명의 유전자 수송 담체의 허혈성 질환 부위의 치료 효과를 검증하기 위해,하지 허혈의 마우스 모델을 제작하고, 인간 FGF2 분비 비피더스균을 투여하여 검토 하였다.
(1) 마우스 다리 허혈 모델(necrotic model)의 제작
실험 동물은 19주령 암컷 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)을 사용했다. 마취는 Somnopentyl (Kyoritsu Seiyaku)을 2.5 mg/mL에 희석한 것을 체중 20 g 당 0.4 mL 복강에 주사하였다. 마취와 동시에 heparin sodium (Nipro)(생리 식염수로 50 u/mL에 희석)을 0.2 mL 복강에 주사하였다. 복부에서 종아리 제모를 실시한 후 대퇴 동맥을 9-0 폴리프로필렌 원사로 연결하고 대퇴 동맥 중추를 절제했다. 상처 내부를 생리 식염수로 세척 후 6-0 나일론 실로 봉합했다. 수술후 재가열(Postoperative rewarming)을 시행하고, 헤파린 0.2 mL를 피하 주사 하였다. 수술 후 1, 2 일째에도 헤파린 0.4 mL를 피하 주사하였다.
처음 수술 후 6 일째에 처음과 마찬가지로 마취를 하고 헤파린 투여 후 대퇴 동맥 말초를 결찰하고 절제했다. 처음과 같이 수술 후 2일째까지 헤파린 투여를 실시했다. 또한 재조합 비피더스균 투여 후로부터 매일 10% 말토오스 1 mL를 복강 내 투여했다.
(2) 레이저 도플러(laser Doppler) 혈류 측정기에 의한 혈류 측정
마우스를 마취 후 레이저 도플러 혈류 측정기(Moor Instruments 사제)를 이용하여 혈류 측정을 실시했다. 족근 하퇴 관절 이하에서 손끝까지의 혈류를 양쪽에 대해 혈류를 정량하고 허혈/비허혈의 비율로 나타냈다. 혈류 측정은 두 번째 수술을 day0으로 하고, day2, 7, 14, 21, 36 에 수행하였다.
(3) 재조합 비피더스균의 투여
인간 FGF2 분비 비피더스균인 FGF110 주의 동결 제제에 PBS를 첨가하여 균 농도를 조제하여 사용하였다. 하지 허혈 모델 2번째 수술을 day0으로 하고, day3, 4, 11, 18, 25, 32에 꼬리 정맥으로부터 0.6 × 109 cfu을 하루에 두 번 투여했다. 대조군으로 BEshuttle 주의 동결 제제를 동량 투여한 군 및 PBS를 동일 수분량(0.2 mL) 투여한 군을 설정했다.
(4) 결과
FGF110 투여군에서는 day14 이후 PBS, BEshuttle 군에 비해 유의한 혈류 개선 효과를 보였다. 이 효과는 day36까지 지속되었다(표 2, 도 8).
Figure 112017080826118-pct00002
비 선택 배지에서 계대 배양 후 플라스미드 유지 안정성
(1) 방법
상기에서 제작한 FGF110 주 및 FGF111 주 외에 대조군 주인 BEshuttle 주의 글리세린 스탁을 MRS(75 μg/mL 스페치노마이신, 1% 비타민 C 첨가액) 배지 5 mL에 1% 접종하고 37℃에서 24시간 혐기 배양하여 활성화 배양액으로 하였다. 이 활성화 배양액을 같은 배지에 1% 접종하고, 마찬가지로 24시간 배양하여 전 배양액으로 하였다. 이후 스페치노마이신을 포함하지 않는 비 선택 배지인 MRS(1% 비타민 C 첨가액 함유) 배지 5 mL에 접종하고 24시간마다 같은 배지에 계대하고 비 선택 배지에서 계대 배양을 반복했다. 7회 계대한 배양액을 혐기성 희석액으로 적절히 희석하여 이를 BL 한천 배지에 도포하고, 37℃에서 2일간 혐기배양하였다.
BL 한천 배지에 형성된 콜로니를 무작위로 100개 선택하고 이러한 콜로니를 BL-bS 및 BL 한천 배지에 천공시키고 37℃에서 1일간 혐기 배양하였다. 각 배지에 천체흔(puncture mark)에 대해 비피더스균의 생육을 확인하고 (BL-bS 한천 배지에서의 생육 개소)/(BL 한천 배지에서의 생육 개소) × 100을 산출하고, 플라스미드 보유 균율로 하였다.
(2) 결과
결과를 표 3에 나타내었다. 플라스미드 유지 안정성을 측정한 결과, FGF110 주, FGF111 주는 어떠한 것도 매우 높은 플라스미드 보유 균율을 보였다.
Figure 112017080826118-pct00003
본 발명의 형질전환용 플라스미드에 의해, 목적 단백질을 높고 안정적인 분비 발현을 가능하게 하는, 혐기성 균을 형질전환하기 위한 형질전환용 플라스미드를 제공할 수 있게 된다. 따라서 기존의 방법과 비교하여 혈관 신생 요법을 최소 침습으로서 고효율로 간편하게 할 수 있게 된다. 또한, 이러한 플라스미드로 형질전환된 혐기성 균 자체가 유전자 수송 담체가 되기 때문에, 목적 부위에 유전자 도입 효율 등이 문제가 되지 않고, 종래와 비교하여 매우 효율적인 치료가 가능해진다. 따라서 고령자 등 본래 혈관 신생 요법이 효과적임에도 침습성이 높고 전신 부작용이 걸림돌이 되어 치료되지 못한 대상 등에 대해서도 유효하게 치료가 가능해진다.
<110> Shinshu University Anaeropharma Science, Inc. <120> Therapeutic drug for ischemic disease <130> 2017FPI-06-006_JP <150> JP 2015-007760 <151> 2015-01-19 <150> PCT/JP 2016/051293 <151> 2016-01-18 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretion signal peptide (SP56) <400> 1 Met Lys Lys Lys Lys Thr Ile Ser Ala Ala Leu Ala Thr Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Thr Cys Met Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ala Phe Ala 20 25 <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretion signal peptide (SP67) <400> 2 Met Lys Ile Asn Asn Lys Gly Lys Gly Ala Leu Ile Ala Ala Ile Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Cys Gly Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser 20 25 30 Ala <210> 3 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dna for secretion signal peptide (SP56) <400> 3 atgaaaaaga agaagactat atcggctgcg ctggcaacag cgttagcctt aacctgcatg 60 ggcagcgggg gaggtactgc gttcgca 87 <210> 4 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dna for secretion signal peptide (SP67) <400> 4 atgaagataa acaataaggg caagggcgct cttatcgcgg caattaccgc cgcggcaacg 60 ctattgtcat gcgggctggc cgctgcaagt gccagtgcg 99 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer peptide <400> 5 Val Pro Leu Ser Asp Ala Asp Leu Gln Thr Leu Ala Ser Gln Ile Gln 1 5 10 15 Gln Ile Asn Asp Thr Ser Asp Ser Ala 20 25 <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer peptide <400> 6 Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly Gln Val Pro Thr Tyr Thr 1 5 10 15 Lys Phe Gln Pro Thr Ala Asp Pro Gly 20 25 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dna for spacer peptide <400> 7 gtgcccctgt ctgatgctga cttgcagact ttggcaagtc agattcagca aatcaacgat 60 acttctgatt ctgca 75 <210> 8 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dna for spacer peptide <400> 8 gcaggtgtgg attacctgcc taccatcggc caagtgccga catacaccaa gttccagccc 60 acagccgatc cgggc 75 <210> 9 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretion signal peptide (SP56) with spacer <400> 9 Met Lys Lys Lys Lys Thr Ile Ser Ala Ala Leu Ala Thr Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Thr Cys Met Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ala Phe Ala Val Pro Leu 20 25 30 Ser Asp Ala Asp Leu Gln Thr Leu Ala Ser Gln Ile Gln Gln Ile Asn 35 40 45 Asp <210> 10 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretion signal peptide (SP67) with spacer <400> 10 Met Lys Ile Asn Asn Lys Gly Lys Gly Ala Leu Ile Ala Ala Ile Thr 1 5 10 15 Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ser Cys Gly Leu Ala Ala Ala Ser Ala Ser 20 25 30 Ala Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Thr Ile Gly Gln Val Pro Thr Tyr 35 40 45 Thr Lys Phe Gln Pro 50 <210> 11 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dna for secretion signal peptide (SP56) with spacer <400> 11 atgaaaaaga agaagactat atcggctgcg ctggcaacag cgttagcctt aacctgcatg 60 ggcagcgggg gaggtactgc gttcgcagtg cccctgtctg atgctgactt gcagactttg 120 gcaagtcaga ttcagcaaat caacgat 147 <210> 12 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dna for secretion signal peptide (SP67) with spacer <400> 12 atgaagataa acaataaggg caagggcgct cttatcgcgg caattaccgc cgcggcaacg 60 ctattgtcat gcgggctggc cgctgcaagt gccagtgcgg caggtgtgga ttacctgcct 120 accatcggcc aagtgccgac atacaccaag ttccagccc 159 <210> 13 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu promoter <400> 13 gtcttcctgc tggcctatgc attgggttcc gcagtgccca ctccaggcgg tctgggcggt 60 gtggaagcgg cgctgacatt cgcgttcgtg gcggtcggag tgccgcaggg cgtggcgctt 120 tccgccactt tgctgcaccg cgtggtgttc tactggctgc gcattccgct gggcgcggcg 180 gccatgaagt ggcttgacaa gcataatctt gtctgattcg tctattttca tacccccttc 240 ggggaaatag atgtgaaaac ccttataaaa cgcgggtttt cgcagaaaca tgcgctagta 300 tcattgatga caacatggac taagcaaaag tgcttgtccc ctgacccaag aaggatgctt 360 t 361 <210> 14 <211> 3780 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of pFGF110 <400> 14 agatccgtct tcctgctggc ctatgcattg ggttccgcag tgcccactcc aggcggtctg 60 ggcggtgtgg aagcggcgct gacattcgcg 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ccctgtgccg ggttctccgc 2640 ctgtgcgcgt tgttcggcca tgcgcagtgc gagggccttc acctgttcgg ggcttgtcga 2700 ctcgattttc gttcgtgaat acatgttata ataactataa ctaataacgt aacgtgactg 2760 gcaagagata tttttaaaac aatgaatagg tttacactta ctttagtttt atggaaatga 2820 aagatcatat catatataat ctagaataaa attaactaaa ataattatta tctagataaa 2880 aaatttagaa gccaatgaaa tctataaata aactaaatta agtttattta attaacaact 2940 atggatataa aataggtact aatcaaaata gtgaggagga tatatttgaa tacatacgaa 3000 caaattaata aagtgaaaaa aatacttcgg aaacatttaa aaaataacct tattggtact 3060 tacatgtttg gatcaggagt tgagagtgga ctaaaaccaa atagtgatct tgacttttta 3120 gtcgtcgtat ctgaaccatt gacagatcaa agtaaagaaa tacttataca aaaaattaga 3180 cctatttcaa aaaaaatagg agataaaagc aacttacgat atattgaatt aacaattatt 3240 attcagcaag aaatggtacc gtggaatcat cctcccaaac aagaatttat ttatggagaa 3300 tggttacaag agctttatga acaaggatac attcctcaga aggaattaaa ttcagattta 3360 accataatgc tttaccaagc aaaacgaaaa aataaaagaa tatacggaaa ttatgactta 3420 gaggaattac tacctgatat tccattttct gatgtgagaa gagccattat ggattcgtca 3480 gaggaattaa tagataatta tcaggatgat gaaaccaact ctatattaac tttatgccgt 3540 atgattttaa ctatggacac gggtaaaatc ataccaaaag atattgcggg aaatgcagtg 3600 gctgaatctt ctccattaga acatagggag agaattttgt tagcagttcg tagttatctt 3660 ggagagaata ttgaatggac taatgaaaat gtaaatttaa ctataaacta tttaaataac 3720 agattaaaaa aattataaaa aaattgaaaa aatggtggaa acactttttt caattttttt 3780 3780 <210> 15 <211> 3792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of pFGF111 <400> 15 agatccgtct tcctgctggc ctatgcattg ggttccgcag tgcccactcc aggcggtctg 60 ggcggtgtgg aagcggcgct gacattcgcg ttcgtggcgg tcggagtgcc gcagggcgtg 120 gcgctttccg ccactttgct gcaccgcgtg gtgttctact ggctgcgcat tccgctgggc 180 gcggcggcca tgaagtggct tgacaagcat aatcttgtct gattcgtcta ttttcatacc 240 cccttcgggg aaatagatgt gaaaaccctt ataaaacgcg ggttttcgca gaaacatgcg 300 ctagtatcat tgatgacaac atggactaag caaaagtgct tgtcccctga cccaagaagg 360 atgctttatg aagataaaca ataagggcaa gggcgctctt atcgcggcaa ttaccgccgc 420 ggcaacgcta ttgtcatgcg 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ggggtctttt tgttgtggtg ctgtgacgtg 480 ttgtccaacc gtattattcc ggactagtcc tccaggacct cgtctacgag gcgctgagcg 540 aggaatggcg caaaagggac ggcgagatca gcgacccatg ggccaacgac gaggcggacg 600 gataccagcc gccctcatac gagccggtca accccgaacg caggactccc cagacgccct 660 ccgatggcct gatctgacgt ccgaaaaaag gcgctgtgcg ccctttttaa atcttttata 720 aatcttttta cattctttta gcccctccgc agccttactc tcccaacggg tttcagccga 780 aacctacacc aaaaggggag cgaacctaca ccaaaagggg agcgaaccta caccaaaagg 840 ggagcgaacc tacaccaaaa ggggagctat atacaccttt tgttatttaa ggtgcaagtt 900 gtgctatgct gaggccatgt ccaatgagat cgtgaagttc agcaaccagt tcaacaacgt 960 cgcgctgaag aagttcgacg ccgtgcacct ggacgtgctc atggcgatcg cctcaagggt 1020 gagggagaag ggcacggcca cggtggagtt ctcgttcgag gagctgcgcg gcctcatgcg 1080 attgaggaag aacctgacca acaagcagct ggccgacaag atcgtgcaga cgaacgcgcg 1140 cctgctggcg ctgaactaca tgttcgagga ttcgggcaag atcatccagt tcgcgctgtt 1200 cacgaagttc gtcaccgacc cgcaggaggc gactctcgcg gttggggtca acgaggagtt 1260 cgcgttcctg ctcaacgacc tgaccagcca gttcacgcgc 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taccaaaaga tattgcggga 3000 aatgcagtgg ctgaatcttc tccattagaa catagggaga gaattttgtt agcagttcgt 3060 agttatcttg gagagaatat tgaatggact aatgaaaatg taaatttaac tataaactat 3120 ttaaataaca gattaaaaaa attataaaaa aattgaaaaa atggtggaaa cacttttttc 3180 aattttttta gatcttgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 3240 ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 3300 agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 3360 tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 3420 ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 3480 gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 3540 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 3600 gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 3660 aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 3720 aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 3780 ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 3840 gaagatcctt tgatcttttc tac 3863 <210> 38 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu terminator <400> 38 ccttctgctc gtagcgatta cttcgagcat tactgacgac aaagaccccg accgagatgg 60 tcggggtctt tttgttgtgg tgctgtgacg tgttgtccaa ccgtattatt ccgg 114

Claims (18)

  1. 형질전환용 플라스미드(transformation plasmid)가 pFGF110(서열 번호 14)의 염기 서열로 표시되는, 혐기성 균의 형질전환용 플라스미드.
  2. 형질전환용 플라스미드가 pFGF111(서열번호 15)의 염기서열로 표시되는, 혐기성균의 형질전환용 플라스미드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성 균을 포함하는 유전자 수송 담체(gene transport carrier).
  4. 제 3항에 있어서, 혐기성 균이 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균인, 유전자 수송 담체.
  5. 제 4항에 있어서, 비피도박테리움 속 균이 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)인, 유전자 수송 담체.
  6. 제 3항에 기재된 유전자 수송 담체를 포함하는 허혈성 질환의 치료용 의약 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 의약 조성물은 허혈성 질환 부위에서 상기 유전자 수송 담체의 생착(colonization) 및 증식 촉진제를 추가적으로 포함하는, 의약 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 생착 및 증식 촉진제가 말토오스(maltose), 락툴로오스(lactulose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 갈락토스(galactose), 글루코오스(glucose), 락토오스(lactose), 멜리비오스(melibiose), 멜레지토스(melezitose), 라피노스(raffinose)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 의약 조성물.
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