CN108611367B - 一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体 - Google Patents

Abstract

一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体本发明涉及生物制药领域，具体地说是涉及一种可高效表达人肝细胞生长因子的重组载体及其应用。本发明还涉及含有构建的增强信号肽提高蛋白表达量的药物及其组合物用于制备治疗下肢动脉缺血性疾病的用途。

Description

一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体

技术领域

本发明为生物制药领域，具体地说是涉及一种可高效表达人肝细胞生长因子的重组载体及其应用。

背景技术

缺血性疾病尤其是动脉缺血性疾病主要包括冠心病和肢体动脉硬化性闭塞症，其主要病因是动脉硬化。动脉硬化使血管内壁有脂肪、胆固醇等沉积，并伴随着纤维化与钙化等病变，逐渐造成血管管腔狭窄，血流供应不足，引起动脉缺血性疾病。世界卫生组织指出，目前全球每年有1700万人死于心脏病和其他心血管疾病，约占全球死亡人数的三分之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，预计到2020年这个数字将有可能突破2000万，现已成为危害人类健康的严重疾病。美国一项调查表明，心脏病占总死因的35%，其中冠心病死亡占24.1%，居前10位死因之首。八十年代以来，我国心血管病发病率和死亡率呈逐年上升趋势。据1984年报告，冠心病死亡粗率：城市为36.9/10万，农村为15.6/10万；而外周动脉缺血性疾病主要包括下肢动脉硬化性闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病肢体动脉闭塞症等，其主要症状为患肢乏力，疼痛，“间歇足性跛行”，持续性的静息痛，肌肉萎缩，出现溃疡或坏死，久治不愈，最后不得不截肢。在美国70岁以上人群中发病率为10%；目前每年约有10万人次接受治疗。在我国，本病已成为中老年人常见的周围血管闭塞性疾病。50岁以上人口的发病率为0.74%，每年有200万人患病。据美国匹兹堡大学医学中心研究显示，缺血性间歇性跛行患者10年累积截肢率<10%，10年累积手术血管重建率为18%，静息痛和缺血性溃疡发生率分别为23%和30%，危重肢体缺血患者１年病死率约为20%。

血管缺血性疾病共同的临床特点是痛苦难忍、疗程长、治疗难度大、治疗费昂贵，致残率和死亡率高等，严重影响患者的健康和正常生活工作。但是，目前对血管缺血性疾病尚无有效的治疗药物和方法，主要借助冠心病和外周血管的外科和介入治疗，如血管搭桥术，球囊成形术；支架术；射频消融术；心脏起搏术；激光血管成形术，动脉斑块切术，定向血管内膜斑块切除术，血栓抽吸术，冠状动脉内旋磨术，超声血管成形术等。但这些方法受严格的适应症限制，并发症多，预后差，有待于进一步研究和完善，尤其对血管病变数量和范围较大的疾病仍无法实施治疗。因此，临床上迫切需要安全而有效的新的治疗方法。

1982 年Michalopoulos等命名一种能刺激原代培养的肝细胞生长和脱氧核糖核酸(DNA)合成的肝源性因子为肝细胞生长因子(简称HGF)（Liver regeneration studieswith rat hepatocytes in primary culture.Cancer Res , 1982, 42 :4673-4682），1993 年Grant 等证实HGF在体内具有促血管新生作用（Scatter factor induces bloodvessel formation in vivo.Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90:1937-1941）。

由于HGF蛋白质本身体内的半衰期很短（HGF抗肾脏纤维化机制的研究进展，国外医学生理病理科学与临床分册，2005年，第25卷第3期），因此使用HGF蛋白治疗疾病，出现反复给药和用药量过多等问题。根据缺血性疾病的临床特征，大家开始考虑采用基因治疗的方法来使得HGF能直接、方便地应用到临床疾病的治疗。

由于裸质粒在血液中的半衰期较短，因此采用裸质粒局部注射的方法，裸质粒转染真核细胞后，表达的治疗性蛋白仅能在局部产生作用，因此安全性较高。目前，临床上已有采用促血管生长因子的裸质粒基因治疗缺血性疾病的案例，比如VEGF、FGF裸质粒（Theoretical base and investigational plan of the VIFCAD study-gene therapyfor refractory coronary artery disease in no-option patients usingtransendocardial bicistronic VEGF/FGF plasmid injection. Post Kardiol Interw;2006, 2：116-123）和HGF裸质粒。从目前报道来看，采用HGF进行基因治疗的血管生成活性均比VEGF和bFGF更强，安全性更高。因此，HGF在治疗血管缺血性疾病上会有更好的应用前景。

天然HGF含有两种异构体，分别为HGF728和HGF723，二者有协同作用，能够更好地发挥体内的生物学作用（Hepatocyte growth factor and its variant with a deletionof five amino acids are distinguishable in their biological activity andtertiary structure.Biochem Biophys Res Commun. 1994 Apr 29;200:808-15）。

日本Anges公司采用HGF cDNA基因开发的HGF裸质粒，已经完成了在日本的治疗严重下肢动脉缺血性疾病的Ⅲ期临床试验研究，基本证明了其对外周血管疾病的疗效及安全性（Double-blind, placebo-controlled clinical trial of hepatocyte growthfactor plasmid for critical limb ischemia. Gene Ther, 2010,17:1152-1161）。

韩国Viromed公司采用pCK基因载体, 将天然HGF的外显子4和5之间的HGF基因组内含子序列插入到HGF cDNA后，形成的杂合基因，再用pCK基因载体构建的一种裸DNA质粒。当该质粒进入机体细胞后，在mRNA修饰过程中，可透导可变剪接，产生两段成熟mRNA，使得该质粒进入细胞后同时表达由HGF728和HGF723两种异型体，其特点为表达量较高，可用于治疗或预防缺血性疾病（高效表达两种不同类型肝细胞生长因子的杂合肝细胞生长因子基因.中国专利.ZL03806534.7）。目前该公司已经在美国完成了HGF裸质粒基因治疗严重下肢动脉缺血性疾病的II期临床试验研究，初步证明了其安全性和有效性（Safety andefficacy of plasmid DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factorin patients with critical limb ischemia. Gene Therapy. 2016, 23: 306–312）。

虽然韩国Viromed公司采用的HGF裸质粒基因治疗方案可同时表达具有协同作用的两种HGF异构体，从而具有更高的体内生物学活性的作用，是目前各方案中较好的，但其尚存在一些缺点：

1. 其采用的内含子序列较大，以及为了提高表达率引入启动子后的非结构基因序列过大，导致整个质粒较大，为约7.4kb，因此在没有外力帮助下，其转染真核细胞时效率较低；

2.由于重组质粒过大，转染率低，体内表达效率低，导致临床需要的较高的剂量（8-16mg/次），一方面导致生产成本高，病人用药费用高，负担重；另一方面高剂量用药引入的杂质更多，可能会导致毒副作用的增大，从而增加了临床风险。

3.两种异构体在不同细胞中，由于剪切机制的差异，导致表达比例不可控。

因此，从提高治疗效果，减少用量，控制目的产物的角度，临床上迫切需要能够高效表达HGF目的蛋白裸质粒产品。

另据文献报道（《生命的化学》2003 年 23卷 3期，信号肽对外源蛋白分泌效率的影响），信号肽的结构与组成会直接影响目的蛋白的分泌效率。

本发明同时通过选用改构的分泌肽提高目的蛋白的真实表达量，以及构建相对最小分子量的裸质粒来提高转染效率，从而提高治疗效果，降低用药剂量，降低生产成本和病人负担，并减小药品的毒副作用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供了一种简化的更小的能表达目的蛋白的重组质粒，该重组质粒所用的pSN载体是由本公司自行构建的，含有SV40启动子、SV40 polyA信号、卡那霉素抗性基因、ColE1复制起始点以及人肝细胞生长因子基因等原件，特点是在原核细胞中能够高效复制，在真核细胞中可高效表达，而且由于该质粒在启动子后不含有非结构基因，所以分子量在同类型表达质粒中较小。在没有脂质体等其他辅助手段的参与下，能够实现动物体内高效转染并高效表达HGF。

本发明的第二个目的是通过选用改构的信号肽--增强信号肽，以提高目的蛋白分泌量。

本发明的第三个目的是治疗缺血性疾病。

本项目是利用本公司自行构建的pSN基因载体和增强信号肽-HGF基因构建的裸DNA质粒，注射于缺血部位的肌肉内，转染横纹肌细胞，表达和分泌具有血管生长作用的肝细胞生长因子（HGF），在局部形成侧支循环，建立“分子搭桥”机制，增加缺血部位的血液供应，以达到治疗动脉缺血性疾病的目的。本品适应症为冠心病和下肢动脉缺血性疾病。近年来，基因治疗逐步从实验室走向临床应用，尤其是动脉缺血性疾病的基因治疗已取得重大进展，血管缺血性疾病的基因治疗已进入Ⅱ和Ⅲ期临床，表现出良好的应用前景。

本发明的优点是:

1.重组质粒较小，提高转染效率高；

2.采用SV40启动子，提高目的蛋白表达率高；

3.采用增强信号肽策略，提高目的蛋白分泌量，从而使本品用药剂量低；

4.安全性高：应用局部肌肉注射的方法，除注射部位外，目的基因在体内其它部位无法进行转染和表达；

5.表达HGF蛋白，有效地促进了血管生成和形成侧支循环，增加缺血部位的血流供应。

附图说明

图1是pSN-HGF/dHGF的结构图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这个实例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例一

1.重组质粒的构建

1.1 目的基因获得

根据Gene Bank（HGF728：NM_000601.5和HGF723：NM_001010932），获得HGF728和HGF723基因序列，通过基因合成四组序列，分别为：增强信号肽HGF728（序列为SEQ NO3）、增强信号肽HGF723（序列为SEQ NO4）、常规信号肽HGF728（序列为SEQ NO5）和常规信号肽HGF723（序列为SEQ NO6），并分别在基因两端设计NheI和XhoI酶切位点。

1.2 表达载体构建

分别将增强信号肽HGF728、增强信号肽HGF723、常规信号肽HGF728和常规信号肽HGF723目的基因片段和pSN表达载体，分别经限制性内切酶NheI和XhoI双酶切37℃过夜，并进行胶回收，然后用T4连接酶4℃过夜连接，即构建得到重组质粒pSN-HGF。将重组质粒转化到克隆菌株JM109中，从转化的卡那霉素抗性平板上挑取单克隆菌落提取质粒，并进行目的基因核苷酸序列测定，测序结果和理论序列一致，证明质粒构建成功。

2. 重组质粒制备

2.1质粒转化

利用氯化钙法制备E. coli DH5α感受态细胞，将4个重组质粒分别转化至E. coli DH5α中，涂布在含有50μg/mL 卡那霉素（Kan）的LB 平板，挑选阳性菌落在含卡那霉素50μg/mL 的LB 中培养。筛选出重组质粒体外表达量高且经限制性内切酶鉴别正确的菌种于-70℃以下保存，用于扩大培养。

2.2 摇瓶培养及种子液制备

2.2.1 种子的活化

（1）取-70℃保存的菌种经复苏后，划种LB（含50μg/mL Kan）平板，37℃培养过夜，成为活化种子。

（2）挑取以上平板的活化种子，接种于5 mL LB 培养基（含50μg/mL Kan）的试管中，37℃，230 转/ 分，培养过夜。

（3）取以上过夜培养种子按照1:20转接于100mL LB 培养基（含50μg/mL Kan）的摇瓶中，37℃，230 转/ 分，培养10 小时左右。

（4）取以上培养液按照1:20转接于1800mL LB 培养基（含50μg/mL Kan）的摇瓶中，37℃，230 转/ 分，培养过夜，作为上罐种子液。

2.2.2 发酵

（1）培养基与补料液

a)M9CA 培养基( 上罐培养基) ：

Na₂HPO₄： 90g

KH₂PO₄： 45g

NaCl ： 22.5g

NH₄Cl： 5g

上述组分溶于2L的蒸馏水中，调pH7.4，放入30L发酵罐中，补蒸馏水至18L，121℃，灭菌30 分钟。冷却后再无菌加入以下两种组份：

20％ Glucose 溶液：180mL( 每100mL 含1M MgSO₄ 20mL，1M CaCl₂ 1mL，维生素B1100mg)

20％ Casein acid 溶液：180mL

以上2 种组份无菌过滤后4℃后可保存1 周。

b) 补料液

Glucose ： 75g

酵母提取物： 30g

Tryptone ： 30g

MgSO₄·7H₂O ：3g

无菌过滤后，4℃可保存1 周。

（2）发酵各参数的控制

a) 温度：37℃

b) 溶氧和转速：当培养基中溶氧降至30％以下时，每次将转速提高50 转/分，直至达到600 转/分后，通入纯氧，溶解氧保持在30％左右。

c) pH ：自动流加30％氨水，使pH 保持在7.0 左右。

d) 葡萄糖的流加：根据发酵过程，流加分为2 个阶段，由菌体生长情况而定，2 小时左右流加含100 g葡萄糖的补料，3-5 小时流加含200 g葡萄糖的补料。

（3）30 升发酵罐发酵

取上述1.8 L扩大种子液按1 ∶ 10 接种量加入发酵罐，然后无菌加入卡那霉素540mg，37℃，通气量1.5 L/ 分，300 转/ 分，自动流加30％氨水，使pH 保持在7.0，培养2小时后开始流加含100 g葡萄糖的补料，4-5小时流加含200 g葡萄糖的补料，在OD600在60以上时，离心收集菌体。

2.2.3 重组质粒纯化

（1）破菌：采用碱裂解的方法进行破菌。

（2）澄清：粗过滤去除大块不溶物，然后采用0.45µm滤芯过滤澄清。

（3）前处理浓缩：使用300kD分子量的中空纤维超滤，浓缩缩小体积。

（4）层析一：采用凝胶过滤层析（Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare），在高盐情况下分离质粒DNA及RNA。

（5）层析二：采用亲和层析（PlamidselectXtra，GE Healthcare）在高盐情况下分离超螺旋质粒DNA和开环质粒DNA。

（8）层析三：采用离子交换层析（Source 30 Q，GE Healthcare）进行精纯化并去除内毒素。

（9）超滤浓缩：采用300kD中空纤维进行浓缩，无菌过滤即得原液。

3.重组质粒检测

3.1 质粒含量测定

取重组质粒样品，用注射用水稀释至30μg/mL，取样品3mL，放入石英比色皿中，在紫外分光光度计测定260nm波长处吸光值，测定三次，取平均值用于质粒含量的计算，质粒含量（μg/mL）=吸光值×50μg/mL×稀释倍数。结果4种质粒的含量均在2.0-2.2mg/mL范围内。测定结果见表1。

表1. 4种质粒含量测定结果

3.1

3.2 超螺旋比例测定

取重组质粒样品，用注射用水稀释至0.1mg/mL，取稀释后样品5μl与1μL 6×上样缓冲液混合，取分子量标准6μL，分别点样于1.0%琼脂糖凝胶的加样孔中，72V恒压电泳，电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像仪中观察并拍照，计算样品的超螺旋比例。测定结果4种质粒的超螺旋比例在94.0-96.0%范围内。测定结果见表2。

表2. 4种质粒超螺旋比例测定结果

3.3 纯度检查

取4种重组质粒样品，用注射用水稀释至30μg/mL，检测HPLC纯度，具体色谱条件如下：

色谱柱为DNA-NPR, 50%B液平衡，基线平衡后，上样100μL，流速为0.5mL/min，检测波长为260nm，梯度洗脱条件为：50%B液平衡5min，50%B—80%B梯度洗脱30min，80%B液洗脱5min。检测结果为4种质粒的HPLC纯度在95.50-97.60%范围内。测定结果见表3。

表3. 4种质粒纯度检查结果

3.4 HGF蛋白表达量检测

3.4.1 重组质粒转染HEK293T细胞

（1）细胞准备：取待转染的HEK293T细胞，接种于24孔细胞培养板中，500μl/孔，放入37℃、5% CO₂培养箱中过夜培养，使其在转染日细胞汇合率为90~95%。

（2）质粒转染：对于每孔细胞，使用50μL DMEM无血清培养基稀释2μLLipofectamine 2000；对于每孔细胞，使用50μl DMEM无血清培养基稀释质粒，分别加入4种重组质粒；室温孵育5min后，将稀释后的DNA和稀释后的Lipofectamine2000轻轻混匀。并在室温保温20min。实验组为：培养基+质粒+转染试剂；阴性对照组为：培养基+转染试剂；以上实验组和对照组分别按照100μL/孔加入准备转染的细胞中。放入37℃、5%的CO₂中培养48h，收集转染上清。

3.4.2 HGF表达量测定

采用HGF检测试剂盒（R&D）进行定量检测，最后在酶标仪450nm处测吸光值，计算HGF含量并进行分析。测定结果见表4。

表4. 4种质粒HGF表达量测定结果

从表中可以看出，增强信号肽pSN-HGF728和增强信号肽pSN-HGF723的HGF表达量为常规信号肽pSN-HGF728和常规信号肽pSN-HGF723的4倍以上。

实施例二

重组质粒对下肢动脉缺血性疾病的治疗的评价

为评价本发明治疗下肢缺血性疾病的效果，切除兔子股动脉，建立兔子下肢缺血模型，第10天后，将动物随机分为阴性对照组（0.9%生理盐水）、增强信号肽pSN-HGF728给药组（剂量均为1mg/1mL），增强信号肽pSN-HGF723质粒给药组（剂量为1mg/1mL），常规信号肽pSN-HGF728给药组（剂量均为1mg/1mL），常规信号肽pSN-HGF723质粒给药组（剂量为1mg/1mL），分别将质粒和生理盐水注射于兔子缺血下肢肌肉内，分为4个点，每点注射0.2ml，注射一次，30天后观察其治疗效果，其结果如下：

（1）缺血部位新生血管和侧枝循环观察结果：将以上五组给药组分别注射于下肢缺血模型大腿肌肉内。给药后30日，行选择性髂内动脉造影术，测量缺血部位新生侧支血管数量。增强信号肽pSN-HGF728质粒给药组、增强信号肽pSN-HGF723质粒给药组、常规信号肽pSN-HGF728质粒给药组、常规信号肽pSN-HGF723质粒给药组和阴性对照组组缺血部位新生侧支血管数量分别为82±4.82、75±9.53、67±8.47、62±5.58和43±3.71，给药前后血管增加数的组间比较表明，增强信号肽pSN-HGF728与增强信号肽pSN-HGF723质粒给药组，常规信号肽pSN-HGF728与常规信号肽pSN-HGF723质粒给药组，均比阴性对照组新生侧支血管数量有明显增多，且增强信号肽质粒给药组明显优于普通信号肽质粒给药组。表明增强信号肽pSN-HGF728与增强信号肽pSN-HGF723质粒给药组，常规信号肽pSN-HGF728与常规信号肽pSN-HGF723质粒给药组均能有效地促进缺血部位侧支循环形成作用，增强信号肽质粒给药组作用明显优于常规信号肽质粒给药组。

（2）缺血下肢髂内动脉血流测定结果：在给药后30日时，增强信号肽pSN-HGF728质粒给药组、增强信号肽pSN-HGF728质粒给药组、常规信号肽pSN-HGF728质粒给药组、常规信号肽pSN-HGF723质粒给药组和阴性对照组组髂内动脉最大血流量分别为63.39±5.69、60.52±4.22、56.36±7.25、55.36±3.17和47.15±3.26ml/min。增强信号肽pSN-HGF728质粒给药组与增强信号肽pSN-HGF723质粒给药组的髂内动脉血流最大，明显大于常规信号肽pSN-HGF728与常规信号肽pSN-HGF723质粒给药组和阴性对照组。

以上结果显示，在同等剂量下，增强信号肽pSN-HGF728与增强信号肽pSN-HGF723质粒给药组，比常规信号肽组具有更好的缺血性疾病动物模型治疗效果，且二者的治疗效果相似。

序列表

<110> 北京诺思兰德生物技术股份有限公司

<120> 一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5187

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag 60

gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240

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aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 2400

ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 2460

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gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 3120

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ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 3360

gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 3420

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tag 2283

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gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatc ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg 540

ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag 600

tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat ggggagagtt atcgaggtct catggatcat 660

acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga caccacaccg gcacaaattc 720

ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc 780

cagccgaggc catggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta ctgtgcaatt 840

aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac aactgaatgc 900

atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa tggaattcca 960

tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag 1020

tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt 1080

tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg 1140

tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa 1200

acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaagactt acatcgtcat 1260

atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat 1320

gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga ttattgccct 1380

atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca tcccgtaata 1440

tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata 1500

ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat aaacatatct gcggaggatc attgataaag 1560

gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttcccttctc gagacttgaa agattatgaa 1620

gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga agaggagatg agaaatgcaa acaggttctc 1680

aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggatcagatc tggttttaat gaagcttgcc 1740

aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta tggatgcaca 1800

attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggatt gatcaactat 1860

gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat 1920

catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga 1980

tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga 2040

atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt 2100

tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg atacacaaaa ttattttaac atataaggta 2160

ccacagtcat ag 2172

Claims (5)

1.一种重组载体，其包括编码N末端连接有增强信号肽的人肝细胞生长因子(HGF)的核酸序列，SV40启动子，SV40 Poly A终止序列，卡那霉素抗性基因，以及ColE1 origin序列；其中，所述核酸序列如SEQ ID NO:3或4所示。

2.权利要求1所述的重组载体，其中，所述增强信号肽的序列如下所示：

mwvtkllpalllqhvllhllllpiaipyaegtpvtpvmwvtkllpalllqhvllhllllpiaipyaeg。

3.权利要求1所述的重组载体，其含有在大肠杆菌中复制的所有调控元件。

4.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的重组载体，以及任选的药物上可接受的载体。

5.权利要求1所述的重组载体用于制备治疗缺血性疾病的药物的用途。