JPS63251095A - 新規融合蛋白質およびその精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子技術による混成遺伝子の調製の可能性は、組換え
蛋白質の製造に当り新たな道を開く。所望の蛋白質をコ
ードする遺伝子配列とリガンドに対ｊ、て高い親和性を
有する蛋白質フラグメント（親和性ペプチド）をコー・
ドする遺伝子配列とを結合することにより、親和性ペプ
チドを使用する一工程で所望の組換え蛋白質を融合蛋白
質の形態において精製することが可能である。部位を制
限した変異により、親和性ペプチドと所望の組換え蛋白
質との結合点に特定の化学的または酵素的な開裂部位を
導入することも可能であり、その結果融合蛋白質を適当
な親和性樹脂により精製し７た後に、所望の組換え蛋白
質を化学的または酵素的開裂により回収することができ
る。斯かる精製方法は、例えば５ｃｉｅｎｃｅ　１９８
．１０５６−１０６３　（１９７７）　　（Ｉｔａｋｕ
ｒａらによる）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０＋６８４８−６８５
２　（１９８３）　（Ｇｅｒｍｉｎｏ　らによる）　、
ＮｕｃｌｅｉｃΔｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１３＋　１１．
５１−１１６２　（１９８５）　　（Ｎｉｌｓｓｏｎら
による）　、Ｇｅｎｅ　３２．３２１−３２７　（１９
８４）　（Ｓｍｉｔｈらによる）ならびにヨーロッパ特
許公開番号第１５０１２６号および第１８４３５５号に
より知られている。

本発明により、少なくとも２個の隣接するヒスチジン残
基を有する親和性ペプチドが、ニトリロトリ酢酸（ＮＴ
Ａ）樹脂−にでの金属キレートアフィニティークロマト
グラフィーによる組（傳え蛋白質の精製に特に適してい
ることが見出された。これらの′ｉＡ、相性ベプナドは
、公知のペプチドよ、まず第一にそれらがＮＴΔ樹脂に
より天然および変性蛋白質の精製を問題なく可能にする
点において区別できる。

従って本発明は、隣接するヒスチジン残基を含む１種ま
たは２種の親和性ペプチドおよびこの１種または２種の
親和性ペプチドに直接的または間接的に結合される生物
学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質からなる融合蛋
白質、組換えＤＮＡ技術によるそれらの製造方法ならび
にＮＴＡ樹脂上での金属キレートアフィニティークロマ
トグラフィーによるそれらの精製方法に関するものであ
る。

本発明は、また、該融合蛋白質をコードする遺伝子、こ
れらの遺伝子を含む発現ベクター、これらの発現ベクタ
ーにより形質転換された微生物、ならびに前記遺伝子、
発現ベクターおよび形質転換微生物の製造方法に関する
ものである。

本発明による融合蛋白質の親和性ペプチドは、一般式 ％式％ （式中Ｒ１は、水素、１個のアミノ酸または数個のアミ
ノ酸の配列を示し、Ｒ２は、Ｑ、　Ｑ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ
−ＧＩＶ−Ａｒｇ−またはローＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓを示し、およびＱは、ペプチド結合、
１個のアミノ酸または数個の、最大３０個のアミノ酸の
配列を示す）で定義される。

本発明による融合蛋白質の特に好ましい親和性ペプチド
は、次式のペプチド配列を有するものである。

Ｍｅｔ−旧Ｓ−旧Ｓ。

Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−１１ｉｓ−Ｈｉｓ＋ ｎｅｔ、−）１ｔｓ−ｔｌｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ＋Ｍｅ
ｔ−Ｈｉｓ−１１ｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−旧Ｓ。

Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−１＋１ｓ−
１１ｉｓ。

Ｍｅｔ−）１ｉｓ−旧５−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇ
ｉトＧｌｙ−Ａｒｇおよび Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−旧５−Ａｌａ−Ｇｕｙ−Ａｓｐ−八ｓ
ｐ−Δ５ｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　。

本発明による融合蛋白質の親和性ペプチドは、生物学的
に活性なポリペプチドまたは蛋白質に直接的または間接
的に結合され得る。単一の親和性ペプチドを用いる場合
には、同ペプチドは生物学的に活性なポリペプチドまた
は蛋白質のアミノ末端アミノ酸またはカルボキシ末端ア
ミノ酸のいずれかに結合され得る。２個の親和性ペプチ
ドを用いる場合には、それらの１個は、生物学的に活性
なポリペプチドまたは蛋白質のアミン末端アミノ酸に結
合され、他方は生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋
白質のカルボキシ末端アミノ酸に結合される。

間接的結合の場合には、親和性ペプチドは、適当な選択
的開裂部位を含み、それを介し、それらは所望の生物学
的に活性なポリペプチドまたは蛋白質に結合される。好
適な選択的開裂部位としては、好ましくはアミノ酸配列
−（Ａｓｐ）　ｎ−Ｌ３’Ｓ−（式中、ｎは２，３また
は４を示す）または−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−が考えられ、これらはそれぞれブロテアーゼであるエ
ンテロキナーゼおよび凝集ファクタＸａにより特異的に
認識され得る。このような親和性ペプチドは、次にそれ
自体公知の方法により酵素的に開裂することができる。

直接的結合の場合には、親和性ペプチドは、所望の生物
学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質に結合して残る
。すなわち、親和性ペプチドは、化学的または酵素的に
開裂することができない。

この形態の結合は、所望のポリペプチドまたは蛋白質の
活性が親和性ペプチドの存在により不利な影響を受けな
い場合には有利である。本発明によるこのような融合蛋
白質は多くの免疫的な処理に用いることができる。これ
らは、例えば感染症の検出用試薬として用いることがで
きる。これらは、生理学的に適合し得る担体物質と混合
することができるので、これらは疾患予防のワクチンと
しても使用し得る。

本発明による融合蛋白質に関連して用いられる「生物学
的に活性なポリペプチドまたは蛋白質」なる用語は、そ
れら自体が生物学的に活性なポリペプチドもしくは蛋白
質、または生物学的に活性なポリペプチドもしくは蛋白
質の調製に用い得るポリペプチドもしくは蛋白質に関す
るものである。

生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質としてはた
とえば、マラリア表層抗原、特にプラスモジウム・ファ
ルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆｏｌｃｉｐａｒ
ｕｍ）の５．１表層抗原、ＣＳ蛋白質およびｐ１９０蛋
白質、リンホカイン、インターフェロン、インシュリン
およびインシュリン前駆体、ＩＩＩＶ−１および１１１
Ｖ−２のエンベロープおよび構造蛋白質、成長ホルモン
ならびに成長ホルモン分泌因子などが考えられる。本発
明による融合蛋白質の特に好ましい生物学的に活性なポ
リペプチドまたは蛋白質は、ヒト免疫インターフェロン
のアミノ酸配列およびヒト免疫インターフェロンの部分
配列を有するもの、特に、次式のアミノ酸配列： Ｇｌｎ−八５ｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ＶａＩ−Ｌｙｓ−Ｇ
Ｉｕ−ＡＩａ−ＧＩｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−１１ｉ
ｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−へｓｎ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＧＩｙ−
ｒＩｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇ
Ｉｕ−ＧＩｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌ
ｅ−Ｍｅｔ−Ｇ　ｌｎ−５ｅｔ−Ｇ　Ｉｎ−Ｉｌｅ−Ｖ
ａ　ｌ　−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−しｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｐ−ＧＩｎ−５ｅｒ−ｒｌｅ−Ｇｆｎ−Ｌ、
ｙｓ−５ｅｒ−Ｖａｌ−ＧＩｕ−Ｔｈｒ−ｒｌｅ−Ｌｙ
ｓ−ＧＩｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−ＶａＩ−Ｌｙｓ
−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−八ｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ
　Ｉｕ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−
５ｅｒ−Ｖａ　１−　Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ｖａ　ｌ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ｉ
　Ｉｅ−１１ｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｉｎ−
Ｖａ　１−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−
Ｐｒｏ−ＡＩａ−ＡＩａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＧＩｙ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ＧＩｎ−Ｍｅ
ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−へｒｇ−Ｇｌｙ−へｒｇ−Ａｒｇ
−へ１ａ−Ｓｅｔ−Ｇｌｎ。

Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ　ｌ−Ｌｙｓ−
Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ　−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇ
１ｙ４１ｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓ
ｐ−八５ｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−八５ｎ−Ｔｒｐ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｓｐ−八ｒｇ−Ｌ
ｙｓ４１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇ　］　ｎ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−
Ｉｌｅ−Ｖａ　Ｉ　−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ−Ｐｈｅ
−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−八ｓｐ−ＧＩｎ−５ｅｒ−Ｉｌｅ−
ＧＩｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−八５ｐ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−
Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｖａ　Ｉ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｇｌｎ−へｒｇ−Ｌｙｓ−へＩａ−
Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−ＧＩｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−Ｍｅｔ−ＡＩａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａ−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＧＩｙ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−１，ｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−ＧＩｎ−Ｍｅｔ
−Ｌｅｕおよび Ｇｌｎ−八５ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇ
Ｉｕ−ＡＩａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ
−Ｓｅｒ−八５ｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ
ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−＾５ｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ　−Ｉ
Ｉ　ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　ｌｎ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｎ−Ｉｌ
ｅ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ　−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ　−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉｎ−５ｅｒ−Ｉ　ｌｅ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｇｌ　ｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　１　ｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−八ｓｎ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−八５
ｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−へ５ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−八ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−ＩＩｅ−ｆｉｔｓ−ＧＩｕ−Ｌｅｕ−ＩＩｅ−Ｇ
Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−３ｅ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−＾１ａ　−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ　
１ｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｍｅ　ｔ−Ｌｅｕを有するもの、ならびにマウ
スジヒドロ葉酸塩還元酵素のアミノ酸配列を有するもの
である。

本発明による融合蛋白質の調製は、文献に記載されてい
る組換えＤＮＡ技術の方法に従って行なうことができる
。好ましくは、所望の親和性ペプチドをコードするヌク
レオチド配列を最初に合成し、次いでこれを所望の生物
学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質をコードするヌ
クレオチド配列に結合する。

こうして得られた混成遺伝子の発現ベクター、例えばプ
ラスミドｐＤｓ８／ＲＢＳ　Ｕ　、　Ｓｐｈ　Ｉ　；　
ｐＤＳ５／ＲＢＳ　Ｔｌ　。

３Ａ＋５八；　ｐＤＳ７８　／ＲＢＳ　ＩｆまたはｐＤ
Ｓ５６／ＲＢＳ　ＩＩおよび他の市販のまたは一般に人
手可能なプラスミドへの組込みもまた、それ自体公知の
方法により行われる。加えて、Ｍａｎｉａｔｉｓらによ
る教本（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ″、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、１９８２）を参照することが出来る。

本発明による融合蛋白質の発現方法は、また、それ自体
公知であり、前述の教本に詳細に記載されている。これ
らは、次の方法を包含している：（ａ）　　前述の混成
遺伝子が発現制御配列に有効に結合されている発現ベク
ター・−による適当な宿主生物、有利にはＨ，ｃｏｌｉ
の形質転換；α〉）　こうして得られた宿主生物の適当
な生育条件下における培養；および （Ｃ）　　宿主生物からの所望の融合蛋白質の抽出およ
び単離 宿主生物としては、グラム陰性およびグラム陽性の細菌
、例えばＨ，ｃｏｌｉおよびＢ、５ｕｂｔｉｌｊｓの株
が考えられる。Ｅ、ｅｏｌｉ　Ｍ２Ｓ株（第３１頁参照
）は、本発明の特に好ましい宿主生物である。しかしな
がら、上述のＢ、ｃｏｌｉ株とは別に、他の・一般に入
手可能なＥ、ｃｏｌｉ株、例えばＲ，ｃｏｌｉ　２９４
（ＡＴＣＣＮａ３１４４６）、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩ（
ＡＴＣＣＮｏ。３１３４３）およびＥ、ｃｏｌｉ　　Ｗ
３１１０（ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５）も用いることが
できる。

本発明による融合蛋白質の精製に用いる理想的な金属キ
レ−１−樹脂は、一般式 ％式％ （式中Ｘは２．３または４を示ず） の二Ｆリロトリ酢酸（ＮＴ八）樹脂である。

キャリア・マトリックスとしては、マフイニティーおよ
びゲルクロマトグラフィーに使われる物質１２例えば架
橋したデギストラン、アガロース（特に商標セファロー
ス（ＳｅｐｈａｒｏＳｅ■）として知られている）また
はポリアクリルアミドが考えられる。

スペーサとしてはアフィニティークロマトグラフィーで
既に知られているスペーサ基が考えられ、特に−〇−Ｃ
１ｌｚ−Ｃｔｌ　（ＯＨ）−ＣＩ□−基および一〇−Ｃ
ｏ−基が好ましい。

本発明による融合蛋白質の精製の為に特に好ましいＮＴ
Ａ樹脂は、式 ％式％ で示されるものであって、その調製は実施例１０に記載
されているようにして行なうことできる。

前述したＮＴＡ樹脂は、バッチ式または連続的に１桑作
するカラムにおいて、本発明による融合蛋白質の精製の
為に使用することができる。本発明による融合蛋白質の
充填前に、ＮＴＡ樹脂をそれ自体はニッケルとキレ−１
・形成しない緩衝液、好ましくはｐｆｌ　７．５のトリ
ス・ＩＩｃＩＩｃ法で好適に平衡化させる。平衡化緩衝
液（ならびに溶出緩衝液）は、変性剤または洗浄剤、例
えばグアニジン何１ｃＩ、原木またはトリトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）を含有することができる。このような変性剤ま
たは洗浄剤の添加は、本発明による融合蛋白質が水溶液
に極めて難溶であっても問題ない操作を可能にする。本
発明による融合蛋白質の溶出は、一定のｐＨ値、または
直線もしくは不連続的に下降するｐ、Ｈ勾配により行な
うことができる。至適溶出条件は、存在する不純物の量
と種類、精製される物質の量、カラムの大きさ等に依存
し、その場合に応じて好適に決定される。

以下の実施例は、本発明による融合蛋白質の調製、金属
キレートクロマトグラフィ・−によるそれらの精製、お
よび本発明により精製された融合蛋白質の酵素的開裂ｔ
こよる生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質の調
製を示す。

これらの実施例は、添付図面と関連させて読むと、より
良く理解されよう。これらの図中には以下の略号および
記号が示される。

Ｂ、　Ｂｇ、　Ｅ、　Ｈ，Ｎ、　Ｎａ、　Ｎｄ＋　　Ｐ
、、　Ｓ、　Ｓａ、　Ｓｃ。

ＸおよびＸｂは、それぞれ制限酵素１１ａｍＨＩ　＋　
Ｂｇｌ　　ＩＩ　＋ＥｅｏＲＩ　＋旧ｎｄＩｎ、　Ｎａ
ｅ　Ｉ　＋　Ｎａｒ　　Ｉ　、　Ｎｄｅ　Ｉ　＋　Ｐｓ
ｔ１＋　Ｓｐｈ　　Ｌ　Ｓａｌ　　Ｉ＋　Ｓｃａ　　Ｉ
＋　Ｘｈｏ　　ＩおよびＸｂａＩの開裂部位を示す。

ロ＝ヨ至コは、ｂｌａ＋１ａｃｌおよびｎｅｏ遺伝子の
プロモータを示し、Ｗは、ｂｌａ、　ｃａＬ　ｎｅｏお
よび１ａｅｌ遺伝子のりボゾーム結合部位を示し、口匡
ロコは、ターミネー・夕ｔｏおよびＴ１を示し、口＝ゴ
Ｓは、調節可能なプロモータ／オペレータ要素ＰＮ２５
Ｘ１０またはＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９を示し、［％
テコは、　リボゾーム結合部位ＲＢＳ　Ｉｆ、　５ｐｈ
１およびＲＢＳ　Ｉｌ、　３Ａ＋５Ａを示し、→は、こ
れらのりボゾーム結合部位の制御下にあるコード領域を
示し、口＝＝コは、本発明による親和性ペプチドおよび
選択的開裂部位をコードする領域を示し、Ｗは、２．４
または６のヒスチジン残基をコードする領域を示し、先
−一やは、複製に必要な領域（ｒｅｐｌ、）を示し、■
■園訃は、ジヒドロ葉Ｍ塩Ｍ元酵素（ｄｈｆｒＬクロラ
ムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ、Ｉａｃ
−リプレッサー（ｌａｃｌ）、β−ラクタマーゼ（ｂｌ
ａ）　、ネオマイシン　フォスフオドランスフェラーゼ
（ｎｅｏ）およびＴ−インターフェロンの種々の誘導体
のコード領域を示している。

策工皿 プラスミドρＤＳ８／ＲＢＳ　Ｕ　、　Ｓｐｈ　　Ｉの
図式的表示。

１１皿 プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　、　Ｓｐｈ　　Ｉ
のＸｂｏ　　Ｉ　／Ｘｂａ　１フラグメントのヌクレオ
チド配列。このフラグメントは、調節可能なプロモータ
／オペレータ要素ＰＨ２ＳＸ１０、リボゾーム結合部位
ＲＢＳ　ＩＩ、　ｓｐｈ　　Ｉ、ｄｈｆｒ遺伝子、ター
ミネータｔｏ、ｃａｔ遺伝子およびターミネータＴ１を
含む。第１図中に示されている制限酵素の開裂部位には
、上線が付してあり、一方、ＲＢＳ　ＩＩ、　Ｓｐｈ　
　Ｉの制御下にあるジヒドロ葉酸塩還元酵素の変異体を
コードする領域には下線が付しである。さらに、プラス
ミドｐＢＲ３２２に由来するプラスミドｐＤＳ８／ＩＩ
ＢＳＩＩ、　ｓｐｈ　　Ｉの部分は、ρＢＲ３２２の配
列と関連する番号を付して図式的に示した（Ｊ、Ｇ、５
ｕｔｃＩｉｆｆｅのＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒ
ｂｏｒ　Ｓｙｍｐ。

Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　４３、ｐｐ、７７−９０　
　［１９７９］　）。

第１回 プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳＩＩ、　３Ａ＋５Ａの図式
的表示。

第１皿 プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ　Ｉｆ　、　３Ａ　＋　５
Ａのヌクレオチド配列。第３図中に示されている制限酵
素の開裂部位には、上線が付してあり、一方、ＲＩＩＳ
　ＩＴ、　３Ａ＋５への制御下にあるクロラムフェニコ
ール　トランスフェラーゼの変異体をコードする領域に
は下線が付しである。

乎工皿 プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳ　ｆｆの図式的表示。

１−皿 プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ　ＩＩのヌクレオチド配
列。

第５図中に示されている制限酵素の開裂部位には、上線
が付してあり、一方、ＲＢＳ’　Ｉｆの制御下にあるジ
ヒドロ葉酸塩還元酵素の変異体をコードする領域には下
線が付しである。

第７図 プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ　ＩＩの図式的表示。

第８図 プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ　ＩＩのヌクレオチド配
列。

第７図中に示されている制限酵素の開裂部位には上線が
付してあり、一方、ＲＢＳ　ｎの制御下にある領域には
下線が付しである。

晃工皿 プラスミドｐＤＭ１．１の図式的表示。

第１Ｏ図 プラスミドｐＤＭｒ、１のヌクレオチド配列。第９図中
に示されている制限酵素の開裂部位には、上線が付して
あり、一方、ネオマイシン　フォスフオドランスフェラ
ーゼ（ｎｅｏ）およびＩａｃ−リプレッサ（ｌａｃｌ）
をコードする領域には下線が付しである。

第１１図 実施例において用いられるプラスミドを構築するために
使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。各
々において、２つのオリゴヌクレオチド゛が結合され、
アダプタとして示されている。

制限酵素Ｎａｅ　Ｉ、Ｎａｒ　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩの
開裂部位には上線が付しである。

第ｕ口 フラグメント１の構築および単離の図式的表示。

このフラグメントは、プラスミドｐＲｃ２３＃ＦＩ−９
００から単離され、Ｎ−末端アミノ酸としてＣｙｓ−Ｔ
ｙｒ−Ｃｙｓを有する組換えヒトインクフェロンの遺伝
子を含んでいる。

第Ｕ皿 フラグメント１をプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　
、　５ｐｈＩに組み込むことによるプラスミドｐＧｔ、
ｓの構築の図式的表示。このｐＧＬＳの図式的表示にお
いては、（Ｓｃ）は、フラグメント１が制限酵素Ｓｅａ
　Ｉの開裂部位を介して、プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ
Ｉ１．　ｓｐｈ　　Ｉと結合されている位置を示す。

築■園 フラグメント２の構築および単離の図式的表示。

このフラグメントは、Ｃ末端において８個のアミノ酸が
短縮され、ＩＦＮ−γ（−８）として示されるヒトイン
ターフェロンをコードしている。示されたヌクレオチド
配列において、相当する終止コドンには下線を付しであ
る。

承Ｕ別 制限酵素Ｅ、ｃｏＲＩおよびｌｌ１ｎｄＩＩＩの開裂部
位を介して、プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　Ｈ、Ｓｐｈ
　　Ｉにフラグメン１−２を組み込むことによるプラス
ミドｐＩＦＮ−γ−（−８）の構築の図式的表示。

μ則 フラグメント３の構築および単離の図式的表示。

このフラグメントは、調節可能なプロモータ／オペレー
タ要素ＰＨ２５に７ｏ、リボゾーム結合部位ＲＢＳｎ、
　Ｓｐｈ　　Ｉおよびアミノ酸配列Ｍｅｔ−ｔｌｉｓ−
Ｈ４ｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−八
ｒｇ−１，ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔをコードするアダプタ
３を有している。

１［＠ 制限酵素Ｘｈｏ　　ＩおよびＢａｍＨＸの開裂部位を介
してプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　Ｈ、Ｓｐｈ　　Ｉに
フラグメント３を組み込むことによるプラスミドｐＤＳ
８／ＲＢＳ　Ｈ。

ｓｐｈ　　Ｉ−旧ｓ、　Ｉｌｉｓ−Ｘａ−Ｂａｍｔｌ　
　Ｉの構築の図式的表示。

第−琲顧 ブラスミドｐＨ１ｓ、　ｌ１ｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−１の
構築に用いたフラグメント４の構築および単離の図式的
表示。

部−■刊− ブラスミドｐＨ１ｓ、　ｌ１ｔｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−Ｔ、
　ｐｈｉｓ、　ｌ１ｉｓ−ｒ！に−ＩＦＮ−Ｔ　（−８
）およびｐＨｉｓ、　Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−７（−８
）（Ａｓｎ）の構築に用いたフラグメント５の単ｈ［の
図式的表示。

ｍｌｑ図− プラスミドル旧ｓ、　Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−Ｔの構築
に用いたフラグメント６の単離の図式的表示。

影−１図 フラグメント４，５および６を結合することによるプラ
スミドｐＨｉｓ、　Ｈｉｓ−ＸａｉＦＮ−７の構築の図
式的表示。プラスミドｐＨ１ｓ、　１ｌｉｓ−Ｘａ−Ｉ
ＦＮ−７は、付加的アミノ酸配列としてＭｅｔ−ｔｌｉ
ｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇを有するＩＦＮ−Ｔ融合蛋白１（Ｉ（ｉｓ。

１１ｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−ｒ　）をコードする。

１箆阿 プラスミドｐｈｉｓ、　）ｌｉｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−７（
−８）の構築に用いたフラグメンｌ−７の構築および単
離の図式的表示。

一進路■ プラスミドｐｈｉｓ、　ｌ１ｉｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−γ（
−８）およびｐＨ１ｓ、　Ｈｉｓ−ＸａｉＦＮ−ｒ　（
−８）（八ｓｎ）の横築に用いたフラグメント８の単離
の図式的表示。

第−Ｍ劇− フラグメント５，７および８を結合することによるプラ
スミドｐＨ１ｓ、　）Ｉｉｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−７（−８
）の構築の図式的表示。プラスミドｐ）Ｉｉｓ、　ｆｉ
ｔｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−７（−８）は、８個のアミノ酸が
短縮され付加的なＮ−末端アミノ酸配列としてＭｅｔ−
）１ｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−１、ｙｓを有するＩＦＮ−７融合蛋白
ｇ（！（ｉｓ。

１１ｉｓ−Ｅｋ−ＴＦＮ−ｒ　（−８））をコードする
。

卯１飄吋 プラスミドｐＨ１ｓ、　Ｈｉｓ４ａ−ＩＦＮ−ｒ　（−
８）　（Ａｓｎ）の構築に用いたフラグメント９の構築
および単離の図式的表示。

部ヱ５−阿 フラグメント５，８および９を結合することによるプラ
スミドｐＨ１ｓ、　１ｌｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−７（−８
）　（八ｓｎ）の構築の図式的表示。このプラスミドは
、Ｃ−末端において８個のアミノ酸が短縮され、Ｎ−末
端においてアミノ酸配列Ｍｅｔ−ｔ＋１ｓ−ｔｌｉｓ−
ΔＩａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇが延
長され、更に２番目の位置においてアミノ酸Ａｓｐがア
ミノ酸Δｓｎに置換されているＩＦＮ−７融合蛋白質（
ｔｈｉｓ、　Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−７（−８）（Ａｓ
ｎ））をコードする。

第で一図 プラスミドｐ６ｘＨｉｓ７ＤＨＦＲの構築に用いたフラ
グメント１０の構築および単離の図式的表示。

第７ａ図− フラグメント１０と、複製領域を含むプラスミドｐＤ＄
７８／ＲＢＳ　ｎのＸｈｏ　　Ｉ／ＢａｍＨＩ　フラグ
メントとを結合することによるプラスミドｐ６ｘｌｌｉ
ｓ−ＤＩＩＦＲの構築の図式的表示。プラスミドｐ６ｘ
Ｈ４ｓ−ＤＨＰＲは、６個のヒスチジンをＮ−末端に有
するＤ　ＨＦ　Ｒ融合蛋白質［（Ｈｉｓ）＆−ｍＤＨＦ
Ｒ］をコードする。

庇ス釘４ プラスミドｐ４ｘｌｌｉｓ−ＤＨＰＲの構築に用いたフ
ラグメント１１の構築および単離の図式的表示。

■靭園 フラグメント１１と、複製領域を含むプラスミドｐＤＳ
７８／ＲＢＳ　Ｈのχｈｏ　　Ｉ／ＢａｍＨＩ　フラグ
メントとを結合することによるプラスミドｐ　４　ｘ　
ｔｌ　ｉ　ｓ　−Ｄ　ｔｌ　Ｆ　Ｒの構築の図式的表示
。プラスミドｐ４ｘＨｉｓ−ＤＨＰＲは、４個のヒスチ
ジンをＮ−末端に有するＤＨＰＲ融合蛋白質［（Ｈｉｓ
）　４−ｍＤＩＩＦＲ］をコードする。

乗■皿 プラスミドｐＲ，ＢＳ　ｌｌ−６χ旧Ｓの構築に用いた
フラグメント１２の構築および単離の図式的表示。

第３２図 フラグメント１２と、複製領域を含むプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳ　ｎのＸｂａ　Ｉ　／ＢａｍＨＩフラグメ
ントとを結合することによるプラスミドｐＲＢＳ　ＩＦ
　−６ｘＨｉｓの構築の図式的表示。

星刹皿 プラスミドｐＲＢＳ　Ｕ−４ｘＨｉｓの構築に用いたフ
ラグメント１３の構築および単離の図式的表示。

第…皿 フラグメント１３と、複製領域を含むプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳ　ＨのＸｂａ　Ｉ　／ＢａｍＨＩフラグメ
ントとを結合することによるプラスミドｐＲＢｓ　Ｕ　
−４ｘＨｉｓの構築の図式的表示。

第３５図 プラスミドｐＲＢＳ　ＩＩ　−２にｌｌ　ｉ　ｓの構築
に用いたフラグメント１４の構築および単離の図式的表
示。

星用回 フラグメント１４と、複製領域を含むプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳ　ＴＩのＸｂａ　　Ｉ／Ｂａｍｔｌ　Ｉ　
フラグメントとを結合することによるプラスミドｐＲＢ
Ｓ　ＩＩ　−２に旧Ｓの構築の図式的表示。

第Ｕ園 複製領域を含むプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ　Ｔｌの
Ｘｂａｌ　／Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントと、ｃａｔ遺伝
子を含むプラスミドｐＲＢＳ　ＩＩ　／６ｘＨｉｓのＢ
ｇｌ　Ｕ　／Ｘｂａ　ｒフラグメントとを結合すること
によるプラスミドｐＤＨＦＲ−６ｘＨｉｓの構築の図式
的表示。プラスミドｐＤＩＩＦＲ−６ｘＨｉｓは、６個
のヒスチジンをＣ−末端に有するＤＨＰＲ融合蛋白質［
Ｍｅｔ−ｍＤｌｌＦＲ−（）Ｉｉｓ）　ｂ　］をコード
する。

第３８図 複製領域を含むプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ　ＩＩの
Ｘｂａｌ　／Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントと、ｃａｔ遺伝
子を含むプラスミドｐＲＢＳ　Ｈ−２ｘＨｉｓのｒ３ｇ
ｌ　ＩＩ　／Ｘｂａ　Ｉフラグメントとを結合すること
によるプラスミドｐＤｔｌＦＲ−２ｘＨｉｓの構築の図
式的表示。プラスミドｐＤＨＦＲ−２ｘＨｉｓは、２個
のヒスチジンをＣ末端に有するＤＨＦＲ融合蛋白質［Ｍ
ｅｔ−ｍＤＨＦＲ−（ｌｌｉｓ）　ｔ　］をコードする
。

星回■ 複製領域を含むプラスミドｐ４ｘｌｌｉｓ−ＤＨＰＲの
Ｘｂａ１／Ｂｇｌｎフラグメントと、ｃａｔ遺伝子を含
むプラスミドｐＲＢｓ　ｌｌ−４ｘｌｌｉｓのＢｇｌ　
ＩＩ　／Ｘｂａ　Ｉフラグメントとを結合することによ
るプラスミドル４ｘ旧５−ＤＨＰＲ−４ｘＨｉｓの構築
の図式的表示。プラスミドｐ４ｘＨｉｓ−ＤＩＩＦＲ−
４ｘｌｆｉｓは、それぞれの場合に４個のヒスチジンを
Ｎ−およびＣ−末端に有するＤＨＰＲ融合蛋白質［（ｌ
ｌｉｓ）４−ｍＤｌｌＦＲ−（Ｈｉｓ）ａ　］をコード
する。

第、１０区 プラスミドρＧＬＳによりコードされるＩＦＮ−γ遺伝
子のヌクレオチド配列およびそれから導かれるアミノ酸
配列。

１蛙区 プラスミドｐＨｉｓ、　Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−７によ
りコードされるｒＦＮ−γ融合遺伝子のヌクレオチド配
列およびそれから導かれるアミノ酸配列。

策１ プラスミドｐＨ１ｓ、　１ｌｉｓ−Ｅｋ−ＩＮＦ−ｒ　
（−８）によりコードされるＩＦＮ−７融合遺伝子のヌ
クレオチド配列およびそれから導かれるアミノ酸配列。

第Ｕ回 プラスミドｐＨ１ｓ、　Ｈｉｓ−Ｘａ−ＴＦＮ−７（−
８）　（Ａｓｎ）によりコードされるＩＦＮ−７融合遺
伝子のヌクレオチド配列およびそれから導かれるアミノ
酸配列。

［実施例１］ 一１町又」χ用ユ」沿ｌΣ吐旺し旦Ｘ…ＬΩ（社）】≦
」−−シーで−なブラフ−３−にの孟朋 Ａ、基本修耶瓜 プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳＩ’Ｉ、　ｓｐｈ　　Ｉ　
　（第１図および第２図）　、ｐＤＳ５／ＲＢＳＩＩ　
、　３Ａ＋５Ａ　（第３図および第４図）　、ｐＤＳ７
８／ＲＢＳ　ＩＩ　　（第５図および第６図）ならびに
ρＤＳ５６／ＲＢＳ　Ｈ（第７図および第８図）を、特
定のプラスミドの構築のために用いた。これらのプラス
ミドにより形質転換されるＩＥ、ｃｏｌｉ細胞は、ブダ
ペスト条約の下に、ゲッチンゲン（ＧＫｔｔｉｎｇｅｎ
　）（ブラウンシュヴアイク（Ｒｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ）においては１９８７年１１月２１日から）のＤｅｕ
ｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｔ＋Ｍｉｋｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｎに１９８５年１０月３日（Ｅ、ｅｏ
ｌｉ　Ｎ１５（ｐＤＳ５／ＲＢＳ　ＩＩ　、　３Ａ＋５
Ａ　；　ｐＤ旧、１）、ＤＳＭ　Ｎｏ、３５１７］、１
９８６年８月６日（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｎ１５　（ｐＤＳ８
／ＲＢＳ　Ｉｆ　、　５ｐｈｌ；ｐＤ旧、１）、ＤＳＭ
　Ｎａ　３８０９　〕、１１９７８９９３３日Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｎ１５（ｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩＨｐＤＭＩ
、　１）、ＤＳＭ　Ｎｏ、４２３２　）および１９８７
年１２月２３日（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｎ１５　（ｐＤＳ５６
／ＲＢＳ１１；　ｐＤＭｌ、　１）、ＤＳＭ　Ｎｏ、４
３３０　）に寄託されている。

上記のベクターは、調節可能なプロモータ／オペレータ
要素ｐＨ！５Ｘ１０　（ＳｔＧｂｅｒらのＥＭＢＯＪ、
　　３゜３１．１３−３１４８　　（１９８４）　）ま
たはＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９　、およびリボゾーム
結合部位ＲＢＳＵ、　Ｓｐｂ　　Ｉ　、、ＲＢＳ　ｌ’
！。

３Ａ＋５ＡまたはＲ１３Ｓ　ＩＩを含んでいる。これら
のりボゾーム結合部位は、Ｅ、ｃｏｌｉファージＴ５の
プロモータＰＧｔＳのりポゾーム結合部位から誘導され
（Ｒ，Ｇｅｎｔｚの論文、ハイデルベルク大学、ＢＲＤ
　　［１９８４）　）　　、ＤＮＡ合成を経て得られた
。これらの発現シグナルの高い効率を考慮すると、上記
のプラスミドは、Ｉａｃ　リプレッサがオペレータに結
合して、プロモータ／オペレータ要素が抑制されている
場合にのみＥ、ｃｏｌｉ細胞中で安定に保たれ得る。ｌ
ａｃリブレッザは、　Ｉａｅ　Ｉ遺伝子内にコードされ
る。

ＰＮｔｓ）ｚｏおよびＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９は、
細胞中に十分な数のリプレッサ分子が存在する場合にの
み充分に抑制され得る。従って、リプレッサ遺伝子の発
現を増加させる変異プロモータを含む１ａＣＩｑ対立遺
伝子を使用した。このｌａｅ　Ｉ　ｑ対立遺伝子は、プ
ラスミドｐＤＭＮ、１　　中に存在する　（第９図およ
び第１０図）。このプラスミドは、ｌａｃ　Ｉ　ｉｊｉ
伝子に加えて選択マーカーとして使用され、かつカナマ
イシン耐性を細菌に与えるｎｅｏ遺伝子を有している。

ｐＤＭｌ、１は、上述のプラスミドと適合する。このよ
うな発現ベクターにより形質転換されるＥ、ｃｏｌｉは
、細胞中で発現ベクターが安定に保たれることを保証す
る為にｐＤＭＩ、１を含まねばならない。この系での誘
発は、所望の細胞密度において培地にｒＰＴＧを添加す
ることにより達成される。

Ｂ、ブラｊ（東上上り几慎邸ＩＩ　、−油５．土Ｘｂａ
　　ｌおよびＸｈｏ　Ｉの制限開裂部位の間にあり、複
製領域を含むと共に細胞にアンピシリン耐性を与えるβ
−ラクタマーゼの遺伝子を含むｐＤＳ８／ＲＢＳ１１．
５ｐｈｌ（第１図および第２図）の部分は、プラスミド
ｐＢＲ３２２から誘導される（ＢｏｌｉｖａｒらのＧｅ
ｎｅ２、９５−１１３　（１９７７）　；　５ｕｔｃｌ
ｉｆｆｅのＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｓ
ｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　４３．７７−９
０　（１９７９）　）。

プラスミドの残りの部分は、調節可能なブロモ−・り／
オペレータ要素ＰＮｔｓｘ７ｏ　（Ｓｔ’ｊｂｅｒらの
前出文献）およびそれに続いてＥｅｏＲＩ　／ＢａｍＨ
Ｉフラグメン１−の部分であるリボゾーム結合部位ＲＢ
Ｓ　１１．Ｓ、ｈ■を有している。マウス細胞系ΔＴ−
３０００のジヒドロ葉酸塩還元酵素（口１１ＰＲ）の遺
伝子（ＣｈａｎｇらのＮａ−ｔｕｒｅ　２７５．６１７
−６２４　　（１９７８）　ｓ　Ｍａｓｔｅｒｓ　らの
Ｇｅｎｅ２１、５９−６３　　（１９８３）　）　、Ｅ
、ｃｏ目ファージラムダのターミネータｔｏ　（Ｓｃｈ
ｗａｒｔｚらのＮａｔｕｒｅ　２７２．４１０−４１４
　　〔１９７８）　）　、クロラムフェニコール　アセ
チルトランスフェラーゼのプロモータを欠いた遺伝子（
ＭａｒｅｏｌｉらのＦＦ！ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１
１０．１１−１４　（１９８０〕）およびＥ、ｅｏｌｉ
　ｒｒｎＲオペロンのターミネ・−タＴ　１　（Ｂｒｏ
ｓｊｕｓらのＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１４８．
１０７−１２７（１９８１）　）が続いている。

Ｃ，ブラシ（廻」」力鍾ｆ訓ジ■−ニー３へ一±）Ａ制
限酵素Ｘｂａ　　ＩおよびＸｈｏ　Ｉの開裂部位の間に
あり、複製領域を含むと共に細胞にアンピシリン耐性を
与えるβ−ラクタマーゼの遺伝子を含むｐＤＳ５／ＲＢ
Ｓ　ＩＩ、　３Ａ＋５Δ（第３図および第４図）の部分
は、プラスミドｐＢＲ３２２から元来誘導される（Ｂｏ
ｌｉシーａｒらの前出文献、５ｕｔｃｌｉｆｆｅの前出
文献）、シかしながら、β−ラクタマーゼ遺伝子は、制
限酵素ＨｉｒｉｅｌＮおよびＰｓｔ、Ｉの開裂部位が除
去されるように修飾されている。しかし、ながら、ＤＮ
＾配列中のこれらの変更は、β−ラクタマーゼのアミノ
酸配列には何ら形容を与えない。このプラスミドの残り
の部分は、調節可能なプロモータ／オペレータ要素Ｐ８
□ＳＸ／。（Ｓｔｕｈｅｒらの前出文献）およびそれに
続＜　ＥｃｏＲＩ　／ＢａｍＨＩフラグメントの部分で
あるリボゾーム結合部位ＲＢＳ　ＩＩ、　３Ａ＋５Ａを
有している。

制限酵素Ｓａｔ　　Ｉ、　Ｐｓｔ　Ｉおよびｌ１ｉｎｄ
ｌｌｌの開裂部位、クロラムフェニコール　アセチルト
ランスフェラーゼのプロモータを欠いた遺伝子（Ｍａｒ
ｃｏｌｉらの前出文献）およびＥ、ｃｏｌｉ　ｒｒｎＢ
オペロンのターミネータＴ　Ｉ　（Ｂｒｏｓｉｕｓらの
前出文献）が続いている。

Ｄ、ブースミドＤＳ７８／ＲＢＳ　ＩＩＸｂａ　　Ｉお
よびＸｔ＋ｏ　　ｒの制限開裂部位の間にあり、複製領
域を含むと共に細胞にアンピシリン耐性を与えるβ−ラ
クタマーゼの遺伝子を含むｐＤＳ７Ｂ／ＲＢＳ■　（第
５図および第６図）の部分は、プラスミドｐＢＲ３２２
から元来誘導される（Ｂｏｌｉｖａｒらの前出文献；５
ｕｔｃｌｉｆｆｅの前出文献）。しかしながらβ−ラク
タマーゼの遺伝子は、プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ　Ｉ
Ｉ　、　３Ａ＋５Ａについて述べた方法において修飾さ
れる。このプラスミドの残りの部分は、調節可能なプロ
モータ／オペレータ要素Ｎ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９お
よびそれに続＜　ＥｃｏＲＩ　／ＢａｍＨＩフラグメン
トの部分であるリボゾーム結合部位ＲＢＳ　ＩＴを有し
ている。マウス細胞系ＡＴ−３０００のジヒドロ葉酸塩
還元酵素の遺伝子（、、Ｃｈａｎｇらの前出文献ＨＭａ
ｓｔｅｒｓ　らの前出文献）であって、構造遺伝子の末
端の直前に制限酵素Ｂｇｌ■の開裂部位を導入すること
により変更を受けたもの、ターミネータｔｏ　（Ｓｃｈ
ｗａｒｔｚらの前出文献）、クロラムフェニコール　ア
セチルトランスフェラーゼのプロモータを欠いた遺伝子
（Ｍａｒｃｏｌｉらの前出文献）およびターミネータＴ
　Ｉ　（Ｂｒｏｓｉｕｓらの前出文献）が続いている。

Ｅ、ブースミドＤＳ５６／ＲＢＳ　ＩＩプラスミドρＤ
Ｓ５６／ＲＢＳ　ＩＩ　　（第７図および第８図）は、
プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ　ＩＩ　、　３Ａ　＋　５
Ａに極めて類似している。しかしながら、これを対比す
ると、プラスミドｐＤｓ５６／ＲＢＳ　ＩＩは、発現シ
グナルとして、調節可能なプロモータ／オペレータ要素
Ｎ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９とリボゾーム結合部位ＲＢ
Ｓ　ＩＩとを含んでいる。さらに、ｐＤＳ５６／ＲＢＳ
　Ｕは、Ｅ、ｃｏｌｉファージラムダのターミネータｔ
ｒ＋　（Ｓｃｌｖａｒｔｚらの前出文献）を含んでいる
。

Ｆ、プラスミドＤ旧、１ プラスミドρＤＭＴ、１　（第９図および第１０図）は
、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞にカナマイシン耐性を与えるトラン
スボゾンＴｎ５由来のネオマイシン　フォスフオドラン
スフェラーゼの遺伝子（ＢｅｃｋらのＧｅｎｅ　１９．
３２７−３３６　（１９Ｂ２）　）およびｌａｃ　リプ
レッサーをコードする、プロモータの変異Ｉｑ（Ｃａｌ
ｏｓのＮａｔｕｒｅ　２７４＋７６２−７６５　　［１
９７８］）を伴ったｌａｃ　Ｉ遺伝子（Ｆａｒａ−ｂｏ
ｕｇｈのＮａｔｕｒｅ　２７４．７６５−７６９　　（
１９７Ｂ）　）を有している。さらに、プラスミドｐＤ
Ｍ１．１は、複製および娘細胞への安定した移行のため
に必要なすべての情報を含むプラスミドｐＡＣＹＣ１８
４（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎのＪ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　１３４．１１４１−１１５６　　（１９７８）
　）の領域を含んでいる。

［実施例２］ 々のプラスミドの　　に　いたＤＮＡア゛プ夏調班 Ａ、韮第１月」丑 リボゾーム結合部位ＲＢＳ　Ｕ、　Ｓｐｈ　　Ｉを免疫
インターフェロン（ＩＦＮ−γ）の遺伝子に適合させる
こと、この遺伝子を短縮すること、ＴＦＮ’−７および
ＩＦＮ−γ（−８）などのＩＦＮ−ｒフラグメントを親
和性ペプチドと結合することならびに少なくとも２つの
隣接するヒスチジン残基を有するＤ　ＩＩ　Ｆ　Ｒ融合
蛋白質を発現することを目的として、オリゴヌクレオチ
ドを化学的に合成し、それらを調製した後にホスホリル
化した。用いたアダプタのヌクレオチド配列を二重鎖Ｄ
ＮＡ配列として第１１図に示しである。

Ｂ、オリゴヌクレオチドの合成および調製オリゴヌクレ
オチドは、多重合成製Ｗ　（１９８５年５月２１日発行
のヨーロッパ特許出願番号第１８１号に記載されている
）により所定の粒径のガラス（ＣＰＧ）を担体物質とし
て用いて同時に調製した（Ｋｉｅｆｅｒ　らのＩｍｍｕ
ｎｏ、Ｍｅｔｈ、　３．６９−８３　　（１９８５）　
、Ｓｐｒ。

ａｔらのＴｅｔｒａｈｅｄｒ、　Ｌｅｔｔ、　２４．５
７７１−５７７４　（１９８３）、Ａｄａｍｓ　らのＪ
、Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１０５＋　６
６１−６６３〔１９８５）　）。凍結乾燥したオリゴヌ
クレオチドを水中に採取し、４　’Ｃにおいて１時１’
？ｊ７で溶解した。

Ｉ’ｌＮＡ濃度は、１００ｎｍ１００ｎ／ｍ１であった
。

Ｃ１±ニブメノー、上オ、」」チーρ」入夫−５り娑化
。

オリゴヌクレオチドをそれぞれ別々のバッチにおいて２
０μ！の５ＯｍＭ　トリス−ＩＣＩ　ｒｏｌ＋　８．５
および１０ｍＭ　ＭｇＣｌ□中で２ｐｍｏｌのｒ　（”
Ｐ　）　−ＡＴＰ（八ｍｅｒｓｈａｍ。

ブラウンシュヴアイク；５０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）お
よび１栄位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃ
ｏ−ＢＲｌｌ、バーゼル）と共に３７°Ｃで２０分間イ
ンキュベートした。次いで、５ｒｖｏｌのＩＩＴＰを加
え、更に３７゛Ｃで２０分間保った後、６５°Ｃに加熱
することにより反応を完結させた。こうして得られたホ
スホリル化オリゴヌクレオチドは、更に手を加えること
なく用いた。

［実施例３コ てｉ丞蔭−Ｕ前部ｐ週−染 Ａ、基オ刀訓■ プラスミドｐＧ　Ｌ　Ｓの構築のために、ＩＦＮ−７１
伝子を先ずアダプタｌ（第１１図）と結合させ（第１２
図）、単離した。次いで得られたフラグメント１をブラ
スミＦ：ｐＤｓ８／Ｒ８Ｓ　Ｈ、Ｓｐｈ　　Ｉ中ニ統合
Ｌ　タ（第１３図）。

Ｂ、　　７ラニｙ−／ノ」」−のＪ屏芙４ｕｇＯ）プラ
スミドｐＲＣ２３／ＩＦＩ−９００（：？　−ロソバ特
許公開第９９０８４号、１９８４年１月２５目公開）を
、ＤＮＡ　ｅ１度４００ｕｇ／ｍｌとして１０単位の制
限酵素ＮｄｅＩを用い、コア緩衝液（５０ｍＭ　ｌ−リ
ス−１１ｃＩ　、ｐＨ８，１０ｍＭ　Ｍｇ０１ｚ、５０
ｍＭ　ＮａＣＩ）中で３７゛ｃにて１時間消化した（体
積２０μｌ）。次いで試料をフェノールを用いて１度抽
出し、フェノールの残分をエーテルにより除去し、最終
的に６６％アルコールと０．３Ｍ酢酸カリウムを用いて
沈澱生成させた。沈澱物を５ｐｅｅｄ−νａＣ濃縮装置
中で２分間乾燥させ、そしてＴ４リガーゼ緩衝液（５０
ｍＭ　）リス−１１ＣＩ　、、ｐｌ＋　７．８．１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、５００　μ１１Ａ
ＴＰ）に溶解した。

２５μｍｏｌのホスホリル化したアダプタ１　（第１１
図）をＩ×リガーゼ緩衝液に溶解し、これを先の反応混
合液に加え、総体積が２５μｐとなるようにした。

連結反応は、ＬｕｌのＤＮＡリガーゼ（Ｉ　Ｗｈｉｔｅ
単位、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用
いて２２°Ｃで３時間行なった。連結反応を、試料を６
５゛Ｃで７分間加熱することにより停止させた６ＤＮＡ
をアルコールにより沈澱させ、上述のよ・うにして乾燥
させ、次いで５０μりのＮｅｏ　　Ｉ消化用緩衝液（５
０ｍＭ　トリス・ＩＣ１、ｐＨ８、ｌ０ｍＭ　ＭｇＣＩ
ｚ、５０ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　ＭＣＩ）に溶解さ
せた。これに１０単位のＮｃｏ　　Ｔを加え、この試料
を３７°Ｃで１時間インキュベートした。次いで、試料
を６５°Ｃで７分間加熱することにより酵素を失活させ
た。フェノール抽出の後、ＤＮＡを前述と同様にして沈
澱させ、この沈澱物を乾燥させた。

ＤＮＡをりＩ／ナウ緩衝液（５０ｍＭ　）リス・ｌｌＣ
ｌ　、　ｐｌ（７，２，１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，，１００
μ？’ｌ　１）ＴＴ）に溶解し、これにｄＡＴＰ、　ｄ
ＧＴＰ、　ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ　（最終濃度は各々
１００μＭ）ならびに１単位のフレナラ酵素（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加λ、更にこの試
料を２２°Ｃに１時間保った。反応を２μｉの０．２５
？ｌ　ＥＤＴＡを加えることにより停止させ、この試料
をフェノールで抽出し、ＤＮＡを前述と同様に１７でア
ルコールにより沈澱させ、Ｓｐｈ　　Ｉ消化ｍ　ｆＪｉ
液（５０ｍＭ　）リス−１１ＣＩ、ｐｌ＋　７．５．６
ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、５０ｍＭ　ＮａＣＩ　、６ｍＭ　　
２−メルカプトエタノール）に溶解した。１０単位のＳ
ｐＨＩを添加した後、この試料を３７°Ｃで１時間・イ
ンキュベートし、消化を前述と同様にして停止させ、フ
ェノール抽出を行ない、このＤＮＡをアルコールにより
沈澱させ、これを乾燥させた。ＩＩＮＡ沈澱物を１０μ
ｉの試料緩衝液に溶解し、ＤＮＡフラグメントを６％ポ
リアクリルアミドゲルにより分離した（溶出緩衝液；　
４０ｍＭ　！−リス・）ＩＣＩ　、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム、２１μｉＭ　ＨＤＴＡ　、ｐＨ７，８）　、　Ｈ
ａｅ　ＩＩＩによりン肖化したファージφＸ（Ｇｉｂｅ
ｏ−ＢＲＬ　、バーゼル）のＤＮ八を分子量の標準とし
て用いた。ＤＮＡを臭化エチジウム（Ｏ９５μｇ／ｄ）
にて着色し、ＩＪν光（波長３ｏ。

ｎｍ）により可視化し、ＩＦＮ−γをコードするバンド
をメスにてゲルから切り出した。ゲルの切片をアガロ−
スゲ１１０．７％アガロースゲル、操作緩衝液：９０ｍ
Ｍ　トリスホウ酸塩、９０ｍＭホウ酸、３ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　。

ｐＨ８，３）の４×４１ＩＩｌＩ＋大のくぼみに移した
。このくぼみを均一な電場が得られるようにＩＸＴＢＨ
中の０．７％液体アガロースにより封じた。試料の前面
にＮ＾４５メンブレン（Ｓｅｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ
　５ｃｈｕｌｌ、ダッセル、ＢＲＤ）の部分を配置し、
ＤＮＡをメンブレン上に電機泳動させた（５分間、１５
ν／ｃｍ）。蒸留水で洗浄した後、メンブレンを２５０
μ２の１．５Ｍ酢酸リチウム、５０ｍＭ　トリス・ＨＣ
Ｉ　（ｐＨ８）および１０ｍＭ　ＥＤＴＡを入れたエッ
ペンドルフ試験管に移した。これにより、ＤＮＡを６５
°ｄで２０分間溶出させた。メンブレンの小片を試験管
から除き、試料を２００μ！のフェノール（ｐＨ８）を
用いて１回抽出した。ＤＮＡを、２０μ！の５Ｍ酢酸リ
チウムおよび４４０μｌのイソプロパツールを加えた後
に沈澱させ、この沈澱物を８０％エタノールで洗浄し、
次いで乾燥させた。

次いで沈澱物を１０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　ト
リス・ＨＣＩ　、　ｐＨ７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に
溶解した。このようにして得たＤＮＡフラグメントにフ
ラグメント１の名称を与えた（第１２図）。

Ｃ，ブースミ）’　ＤＳ８　ＲＢＳＩＩ　　Ｓ　ｈ　Ｉ
　ノｘ、　！２ｐｌＩｌｏｌのプラスミドｐＤＳ８／Ｒ
ＢＳＩ［、ｓｐｈ　　Ｉを、最初に制限酵素Ｓｐｈ　　
ｔにより開裂させた。その後、得られた線状プラスミド
ＤＮＡを制限された世の制限酵素Ｓｃａ　　Ｉと共にイ
ンキエベートし、これによりＤＮＡを存在するＳｃａ　
　Ｔ開裂部位の約５０％においてのみ開裂させた。試料
をフェノールにより抽出し、エーテルにより抽出し、そ
してＤＮＡを前述のようにして沈澱させた。沈澱物を乾
燥させ、２０μｌの緩衝液（５０ｍＭ　）リス・ＨＣＩ
　、ｐＨ８）に溶解させ、１単位のａｒｐ（子牛腸管フ
ォスファターゼ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）を加えた。試料を３７゛Ｃで１時間インキュベー
トし、酵素をフェノール抽出により除去し、ＤＮＡを沈
澱させた。ＤＮＡを溶解させた後、ｃａｔ遺伝子の一部
、ターミネータＴ１、複製領域、ｂｌａ遺伝子、プロモ
ータＮ２５ｘ１０およびリボゾーム結合部位ＲＢＳ　Ｉ
Ｉ、　Ｓｐｈ　　Ｉを含んだ５ｃａ１　／Ｓｐｈ　Ｉフ
ラグメントを、１％アガロースゲルから単離して、前述
のようにしてＮＡ４５メンブレンに電気泳動的に移した
。ＤＮＡの溶出、アルコール沈澱および１０μ２のＴＥ
緩衝液への溶解を前述のようにして行なった。約１　ｐ
ｍｏｌの所望のベクターフラグメントが得られた。

Ｄ、プラスミドＧＬＳの　＼て ０．０５μｍｏｌのベクターフラグメント　（上記参照
）をリガーゼ緩衝液中で０．０５μｍｏｌの挿入ＤＮＡ
　（フラグメント１）と連結した。これと並行しで挿入
ＤＮＡを用いない対照連結を行なった。プラスミドｐＤ
ＭＩ　。

１を含むＥ、ｃｏｌｉ　Ｍ１５細胞を、形質転換のため
にＭｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、　６８．３２６−３３１（１９７！３）　＞に
従って前調製した。６５°Ｃで７分間加熱した後、連結
混合物を２００μ℃のこれらの適性細胞に加えた。試料
を水中に３０分間保持し、次いで４２°Ｃで２分間イン
キュベートし、０．５　ｄのＬＢ培地を加えた後、３７
°Ｃで９０分間インキュベートした。

次いで、細胞を１００μｇ７ｍｌのアンピシリンおよび
２５μｇ／ｒＩ１１のカナマイシンを含んだＬＢ寒天板
上に塗布し、培養装置中で３７°Ｃにて一夜インキエベ
ートした。対照連結の形質転換は、形質転換体を生じな
かった。一方、フラグメント１を用いた連結は、約２０
０のコロニーを生じた。各々のコロニーを殺菌したつま
ようじで取り出し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと
２５μｇ７ｍｌのカナマイシンを有する１０ｍ２のＬＢ
培地を入れた試験管に移し、振とう培養装置内に１２時
間保持した。その後、細胞を沈澱させ、プラスミドＤＮ
ＡをＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１５−１５２３　　
（１９７９）　）に従って単離した。

各々について、１μｇの単離されたプラスミドを、ＩＦ
Ｎ−Ｔ遺伝子およびターミネータＴＩを含むフラグメン
トがこれらのプラスミド中に存在するか否かを試験する
ために、ｓｐｈ　　ＩおよびＸｂａ　　Ｉで消化した。

全ての分析されたＤＮＡ試料は約１ｋｂの上記ＤＮＡフ
ラグメントを含んでいた。これらのプラスミドにｐＧＬ
Ｓの名称を与えた（第１３図）。

Ｅ、ＧＬＳに　′入　れた１ＦＮ−゛　　云　の自己１
′−正しいＩＦＮ−７配列がプラスミドｐＧＬＳに存在
するか否かを検出するために、二重鎖環状プラスミドＤ
ＮＡを、〔γ−”Ｐ　）　−ＡＴＰにより標識付けされ
た起動配列（プライマ）を用いて配列決定した。この起
動配列は、プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　、　Ｓ
ｐｈ　　Ｉの１９９−２１８位のヌクレオチドを含み、
ｓｐｈ　　Ｉ開裂部位のＡＴＧから６ヌクレオチド手前
で終っている。

Ｑ、３μｍｏｌの単離されたプラスミドＤＮＡをアルコ
ールにより沈澱させ、沈澱物を８０％エタノールで１回
洗浄し、乾燥さ干゛、最後に８　ｕ　Ｅ　Ｏ）１／４７
Ｅ緩衝液に溶解させた。２μｍｏｌの起動配列を加えた
後゛に、試料を４２°Ｃで５分間インキュベー１−　し
た。次いでＤＮＡをＳａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、Δｅａｄ。

Ｓｃｉ、　１１Ｓ４７４．５４６３−６５６７　（１９
７７）　）に従って配列決定した。

放射的に標識した°゛プライマ″用いたため、すべての
反応は、非標識のデオキシヌクレオチド三リン酸塩を用
いて行なった。ＤＮＡの配列分析は、正しいＩＦＮ−Ｔ
配夕１１がプラスミドｐＧＬＳに組込まれていたことを
示した（アミノ酸配列は第４０図参照）。

［実施例４］ Ｌ九とえｔ」すＬ五−仁穂少揉策 Ａ、恭−オ］ｖＷ央 プラスミドｐＩＦＮ−Ｔ　（−８）を構築するために、
まずアダプタ２（第１１図）をＩＦＮ−ｒ遺伝子中の各
１１ｉ訂■開裂部位に結合させた。このアダプタ中の翻
訳停止コドンのために、ＩＦＮ−γ蛋白質のＣ−末端領
域では８個のアミノ酸が短縮されている（第１４図）６
かくして得られたフラグメント２を、次いでプラスミド
ｐＤＳ８／ＲＢＳ　ｆ［、Ｓｐｈ　　Ｉに組み込んだ（
第１５図）、。

Ｂ、フラグメ！」ユ９」−毀 ３　ｐｍｏｌのプラスミドｐＧＬＳを、１５単位の旧ｎ
ｆｌで消化した（体積５０μ！、１時間、３７’Ｃ）。

次いで制限酵素を失活させ（７分間、６５７Ｃ）　、試
料をフェノールで抽出し、エーテルで抽出し、酢酸カリ
ウムおよびアルコールにより沈澱させ、乾燥（，７た。

沈澱物を５０ｉｔ１．のりガーゼ緩衝液に溶解させ、１
００１００ｐのホスホリル化オリゴヌクレオチド（アダ
プタ２）を、１０μｌの旧ｎｆｌ開裂プラスミドｐＧ［
、Ｓと混合し、２５μｐのリガーゼ緩衝液と１単位のＴ
４−ＤＮＡリガーゼを加えた後に２２゛Ｃで１２時間イ
ンキュベートした。上述したように、試料を加熱するこ
とにより反応を停止させ、ＤＮＡを沈澱゛させた。

これに引続いて、制限酵素ＥｅｏＲＩ　（１５単位）お
よび旧ｎｄＩＩＩ　（２０単位）を用いて消化を３７゛
Ｃで２０時間行なった。加熱による失活、フェノール抽
出、エーテルによる抽出およびアルコール沈澱の後、試
料を１０μ℃の試料用緩衝液に溶解させ、ＤＮ／Ｉフラ
グメントを６％ポリアクリルアミドゲル中で分離した。

エチジウムブロマイドにより着色した後、ＤＮＡハンド
をｔｔＶ光（３００ｎｍ）の下で可視化した。　ＩＦＮ
−γ遺伝子を含んだバンドを殺菌したメスによりゲルか
ら切り出し、そして前述のようにしてＮＡ４５メンブレ
ン上に電気泳動させた。ＤＮＡを前述のようにして溶出
させ、これにフラグメント２の名称を与えた（第１４図
）。

Ｃ，ノーラスミＬＰ且旦辻乙ＲＢジ用ニーΣｐ、ｊｉ［
４λ■２μｍｏｌのプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ
　、　Ｓｐｈ　　Ｉを１０単位のＥｃｏＲＩおよび１０
単位のＨｉｒ＋ｄｌｌｌにより体積５０μＰ中で３７゛
Ｃにて１時間消化した。酵素の熱不活性化およびアルコ
ール沈澱の後、ＤＮＡ沈澱物を１０μｌの試料用緩衝液
に溶解させた。１％アガロースゲル中での電気泳動の後
、ターミネータｔｏ、　ｃａｔ、遺伝子、ターミネータ
Ｔ１、複製領域、ｈｌａ遺伝子およびプロモータＰＨ□
Ｓ　Ｘ　／　０を含んだＥｅｏＲＩ〆旧ｎｄ■フラグメ
ントをゲルから切り出し、前述のようにして溶出させた
。

Ｄ、二Ａラノユエ」中漬−，，Ｉ上町ｐ、、！！Ｌめて
て一１０ｕｌの単離されたＢｃｏＲＩ　／ｌ１ｔｎｄ　
ｍベクターフラグメントおよび単離されたフラグメント
２の半分を１単位のＴ４リガーゼと共にインキュベ−１
−した（２０°Ｃ１３時間）。これに並行してフラグメ
ント２を加えない対照連結を行なった。連結を前述のよ
うに試料を加熱することにより停止させた。

形質転換は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（前出文献）に従
って、プラスミドｐＤＭ［，１を含んだＥ、ｃｏｌｉ旧
５株を用いて行なった。細胞を１００μｇ／ｄのアンピ
シリンと２５μｇ／ｒａｉのカナマイシンを含んだＬＢ
寒天プレート上に塗布した。このプレートを培養装置内
で３７°Ｃにおいて１５時間保った。

対照プレート（一対照連結）上には形質転換体が見出さ
れなかった。ベクターＤＮＡとフラグメント２とを用い
た連結は、約５００のコロニーを生じた。各コロニーを
殺菌したつまようじにより拾い、ｉｏｏ　ｉのＬＢ培地
中に移し、前述のように生育のために置いた。プラスミ
ドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｆｉｍとＤｏｌｙの方法（前出
文献）に従って単離した。各々の場合について、弔離さ
れ、ＴＥ緩衝液中に溶解された４μ℃のプラスミドＤＮ
Ａを、各々の場合について２単位のＥｃｏＲＩおよび旧
ｎｄｌｌＩを用い前述のようにして開裂させた。約４５
０ｂｐの所望の長さを持ったフラグメントを全ての試験
プラスミドから切り出すことが出来た。これらのプラス
ミドに、ｐｌＦＮ−γ（−８）の名称を与えた（第１５
図）、。

Ｅ、プラスミド　■ＦＮ−（−８）の配置＼斤配列分析
を実施例３に記載したようにして行なった。しかしなが
ら、起動配列として、プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳＩＩ
、　ｓｐｈ　　Ｉの９２８−８９６位のヌクレオチドを
含み、従って、ターミネータｔｏの前方に組み込まれた
ＤＮＡフラグメントの配列決定を可能とするオリゴヌク
レオチドを用いた。配列分析により、８個のアミノ酸が
（カルボキシル末端において）短縮されたＩＦＮ−Ｔ蛋
白質をコードするＩＦＮ−Ｔ遺伝子の所望の配列を確認
した。

［実施例５］ 八−基生負！徂 プラスミドｐＤｓ８／ＲＢＳＩ１．５ｐｉｔ　　ｒ−１
１ｉｓ、Ｉｌｉｓ−Ｘａ−ＢａｍＨＩを構築するために
、２個の隣接したヒスチジンおよびファクタＸａの開裂
部位を含む親和性ペプチドをコードするアダプタ３（第
１１図）をリボゾーム結合部位ＲＢＳＩ［、ｓｐｈ　　
Ｉに結合させた。次に、プロモータＰＮ□ＳＸ／。およ
び該親和性ペプチドを含むフラグメント３（第１６図）
を単離し、プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　、ｓｐ
ｈ　Ｉに組込んだ（第１７図）。

Ｂ、フラグメント３のｇｊ　リ ２ｐｍｏｌのプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　、　
Ｓｐｈ　Ｉを制限酵素ｓｐｈ　Ｉによって開裂させた。

６５°Ｃで７分間インキュベートして反応を終了させ、
試料をフェノール、および次いでエーテルにより抽出し
、ＤＮＡをアルコールおよび酢酸カリウムで沈殿させた
。沈殿物を１０μ！のりガーゼ緩衝液に取り上げ、リガ
ーゼ緩衝液に溶解した２５ρｍｏｌのホスホリル化した
アダプタ３（第１１図）を添加し、１単位のＴａＤＮＡ
リガーゼを添加した後、２２°Ｃで３時間インキュベー
トした。反応を加熱（７分間、６５°Ｃ）によって終了
させ、フェノール抽出およびその後のエーテルによる処
理の後、ＤＮＡをアルコールおよび酢酸カリウムで沈殿
させた。沈殿物を３０μ２の緩衝液に溶解し、各々１０
単位の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈ。

■を添加し、混合液を、３７°Ｃで２時間インキュベー
トした。次に、ポリアクリルアミドゲル用に１０倍に濃
縮した３、５μ２の試料緩衝液を試料に添加し、混合液
を、６５℃で７分間インキュベートした。

ＤＮ八を６％のポリアクリルアミドゲル中で分離し、Ｘ
ｈｏ　　ＩおよびＢａｍＨＩで遊離させたフラグメント
をメスで切断した。ＤＮＡを前記と同様にして溶出させ
、これにフラグメント３の名称を与えた（第１６図）。

ＣブースミドＤＳ８　ＲＢＳＩＩ　Ｓ　ｈ　Ｉの８１２
　ｐｍｏｌのプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　、　
ｓｐｈ　Ｉを、各々１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びＸｈｏ　Ｉで開裂させた。酵素を熱不活性化した後、
試料をフェノール、および次いでエーテルで抽出し、Ｄ
ＮＡをアルコールおよび酢酸カリウムで沈殿させた。沈
殿物を、ｐＨ８の５０μ２の５０ｍＭ　）リス・ＨＣｌ
に再けん濁させ、１単位のＣＬＰ　（前記参照）を添加
し、試料を、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。

酵素の熱不活性化後、試料緩衝液を添加した後、ＤＮＡ
を６％のポリアクリルアミドゲル中で分離し、プラスミ
ド体を前記と同様にしてゲルから溶出させた。

前記フラグメント３を、ベクタ体に連結させた（２２°
Ｃ１２単位の７４ＤＮＡ　リガーゼ、２５μ℃のりガー
ゼ緩衝液）。これと並行して、フラグメント３を添加す
ることなく対照の連結を行なった。前記と同様にして連
結バンチをプラスミドｐＤＭＩ、１を含むＥ、ｃｏｌｉ
　Ｍ２Ｓ株に形質転換させ、１００　ｕｇ／ｍ１のアン
ピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んだ
ＬＢプレートに塗布した。対照の連結の形質転換は、形
質転換体を与えなかった。フラグメント３を伴なう連結
バッチの形質転換は、約１００のコロニーを与えた。各
々のコロニーを、前記と同様にして１００戚のしＢ培地
中で生育させ、ＢｔｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法
（前出文献）に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。全
てのプラスミドは、アダプ夕によって新たに導入される
Ｎａｅ　　［およびＮａｒ　　１のための開裂部位（第
１７図参照）を含んでいた。

プラスミドＤＮＡの配列分析を、前記（実施例３、Ｆ）
と同様にして行ない、アダプタ３がベクタ中に正しく組
み込まれていたことを確認した。これらのプラスミドに
、ｐＤＳ８／ＲＢＳ　Ｕ　、　Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｈｌｓ、
　Ｉｌｉｓ−Ｘａ−ＢａｍＨＩの名称を与えたく第１７
図）。

（実施例６〕 ２二ラエ糺トＰ」し１ξ己（−（需、−１Ｋｐ二Ｉす７
（二（−ｐ−土蓮屋へ一蒸木煎一巽坦 プラスミドｐＨ４ｓ、Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−γを構築
するために、以下のＤＮＡフラグメントを単離し、互い
に結合させた（第２１図）： ■）　アダプタ４　（第１１図）と結合するプラスミド
ｐＧＬＳのＩＦＮ−γ遺伝子（フラグメント４、第１８
図）； ２）　プロモータＰＮ２５Ｘ／＋１、リボゾーム結合部
位ＲＢＳ　ＩＩ　、Ｓｐｈ　Ｉおよび隣接するヒスチジ
ンおよびファクタＸａの認識部位をコードする領域を含
むプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　Ｈ、Ｓｐｈ　Ｉ　−）
１ｉｓ、旧Ｓ−Ｘａ−ＢａｍＨＩのシグナルユニット　
（フラグメント６、第２０図）；および ３）　プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ　ＩＩ　、３Ａ＋５
八由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する複製領域（フ
ラグメント５、第１９図）。

」Ｌ−２−ラーグノヨイ↓−、ｊＱＪ牙製、２ｐ丘ｏ１
のプラスミドｐＧＬＳを、制限酵素Ｎｄｅ　Ｉで開裂さ
せた。酵素の熱不活性化後、試料をフェノール、および
次いでエーテルで抽出し、ＤＮＡを前記と同様にして沈
殿させた。沈殿物を、１０μ！のりガーゼ緩衝液に溶解
させた。リガーゼ緩衝液に溶解させた５０μｍｏｌのホ
スホリル化したアダプタ・１（第１１図）を、Ｎｄｅ　
　Ｉ＝開裂プラスミドｐＧＬＳに添加し、試料を、２単
位のりガーゼと共にインキュベートした（２２°Ｃ１３
時間）。リガーゼの熱不活性化後、試料をフェノールお
よび次いでエーテルで抽出し、ＤＮＡを前記と同様にし
て沈殿させた。

沈殿物を溶解させ、ＤＮＡを制限酵素Ｎａｒ　［および
Ｘｂａｌで開裂させた。試料緩衝液を添加し、混合物を
６５°Ｃで７分間加熱し、６％のポリアクリルアミドゲ
ル中でＤＮ八を分離した後、ＩＦＮ−γ遺伝子を含んだ
ＮａｒＩ／　Ｘｂａ　　Ｉフラグメントを前記と同様に
して単離した。このフラグメントに、フラグメント４の
名称を与えた（第１８図）。

Ｃ１フラノ−仁Ｚ」二跨事」製 ２ｐｎ＋ｏｌのプラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ　ＩＩ　、
　３Ａ＋５八を制限酵素Ｘｈｏ　ＩおよびＸｂａ　Ｉで
開裂させた。該混合物を前記と同様に調製し、ＤＮＡを
６％ポリアクリルアミドゲル中で分離した。ｂｌａ遺伝
子および複製領域を含んだフラグメントを、前記と同様
にゲルから単離した。このフラグメンｌ−に、フラグメ
ント５の名称を与えた（第１９図）６ 上＝２土グ％７上りの」 ２ｐｍｏｌのプラスミドｐＤＳ８／ＲＩＩＳ　ｎ　、ｓ
ｐｈ　Ｉ−旧３Ｊｘｓ−Ｘａ−ＢａｍＨＩを、制限酵素
Ｘｔ＋ｏ　ｒおよびＮａｒ　Ｉで開裂させた。試料を調
製し、ゲル電気泳動後、プロモータＰＨ１ＳＸ１０、リ
ボゾーム結合部位ＲＢＳ　ＩＩ、５ｐｈＩならびに隣接
するヒスチジンをコードする領域およびファクタＸａの
ための認識部位を含むフラグメント６を単離した（第２
０図）。

旦−ブ文ノ逮−丘、Ｐμ七ユニー１貝−Ｘ、え一ゼＮ−
工」、立てそれぞれ０．５　ｐｍｏｌのフラグメント４
（第１８図）、フラグメント５　（第１９図）およびフ
ラグメント６（第２０図）を、２単位のＴ、ＤＮＡ　リ
ガーゼと共にリガーゼ緩衝液中でインキュベートした（
２２°Ｃ１５時間）。酵素の熱不活性化後、バッチを前
記と同様にして、プラスミドｐＤＭ１．１を含んだＥ、
ｃｏｌｉＭ１５株に形質転換させ、形質転換混合物を１
００μｇ／　ｒｎｌのアンピシリンおよび２５μｇ７ｍ
ｌのカナマイシンを含んだＬＢ寒天プレートに塗布した
。３７°Ｃで一夜インキユベートした後、約１００の形
質転換体が得られた。各々のコーニーを前記と同様にし
て１００ｍ１のＬＢ培地中で生育させ、プラスミドを旧
ｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出文献）に従っ
て単離した。

全てのプラスミドを、制限酵素Ｘｈｏ　　Ｉ　、、Ｂａ
ｍ１ｌ　１およびＸｂａ　Ｉを用いて開裂させ、フラグ
メントを６％のポリアクリルアミドゲル中で分析した。

制限酵素分析は、プラスミドが３個の所望のフラグメン
トを含んでいたことを示した。配列分析を前記（実施例
３、Ｆ）と同様にして行なったところ、アダプタ４がＩ
ＦＮ−７遺伝子に正しく融合されていたことを示した。

これらのプラスミドに、ｐＨ１ｓ＋Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＰ
Ｎ−Ｔの名称を与えた（第２１図）。これらのプラスミ
ドからコードされるＩＦＮ−γ融合蛋白質（アミノ酸配
列は第４１図参照）に、旧ｓ、Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−
γの名称を与えた。

〔実施例７〕 プラスミドｐＨ３ｓ、Ｈｉｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−ｒ　（−
８）を構築するために、以下の３個のＤＮＡフラグメン
トを互いに結合させた（第２４図）： １）　アダプタ５（第１１図）の働きにより、エンテロ
キナーゼ（ＥＫ）の認識部位をコードする領域まで延長
された、プロモータＰＨ２ＳＸ１０％　リボゾーム結合
部位ＲＢＳ　ｎ、ｓｐｈ！および隣接するヒスチジンを
コードする領域を含むプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　Ｉ
Ｉ　、　Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｈｌｓ、　Ｈｉｓ−Ｘａ−Ｂａ
ｍＨＩ由来のフラグメント　（フラグメント７、第２２
図）； ２）　　ＩＦＮ−γ（−８）のための遺伝子を含むプラ
スミドρＩＦＮ−γ（−８）由来のフラグメント　（フ
ラグメント８、第２３図）；および ３）　複製領域およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する
プラスミドρ０５５／ＲＢＳ　ｎ　、　３Ａ＋５Ａ由来
のフラグメント　（フラグメント５、第１９図）最後に
命名されたフラグメントの調製は、実施例６に述べられ
ている。

Ｂ、フラグメント７のれ＋１ ４　ｐｍｏｌのプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　、
　Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｈｌｓ、　ｌｌｉｓ−Ｘａ−ＢａｍＨ
Ｉを、制限酵素Ｎａｅ　１で開裂させた。次で、酵素を
熱不活性化させ、試料をフェノール、および次いでエー
テルで抽出し、ＤＮＡを前記と同様にして沈殿させた。

沈殿物を５０μ！のＴＩＥ緩衝液中に取り出した。１．
５μｍｏｌの開裂したＤＮＡを、３０ｐｎｏ　１のホス
ホリル化したアダプタ５（第１Ｉ図）および７単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼと共に２００μ２容量においてリガー
ゼ緩衝液中で、１４時間インキュベートした。酵素の熱
不活性化後、ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅｌおよびＸｈｏｌ
で開裂させた。次に、酵素を熱不活性化し、試料をフェ
ノール、および次いでエーテルで抽出し、ＤＮＡを前記
と同様に沈殿させた。

沈殿物を試料緩衝液中に取り出し、混合物を、６５°Ｃ
で７分間インキュベートした。その後、ＤＮＡを６％の
ポリアクリルアミドゲル中で分離した。プロモータＰＨ
２ＳＸ１０ｓ　リポゾーム結合部位ＲＢＳＩＩ。

ｓｐｈ　　Ｉならびに隣接するヒスチジンおよびエンテ
ロキナーゼの認識部位をコードする領域を含む０．２μ
ｍｏｌのＸｈｏ　　Ｉ　／Ｎｄｅ　Ｉラグメントを、前
記と同様にしてゲルから単離した。このＤＮＡフラグメ
ントに、フラグメント７の名称を与えた（第２２図）。

Ｃ，フラグメント８の調′１ ０．５　ｐｍｏｌのプラスミドｐｌＦＮ−ｒ　（−８）
を、制限酵素Ｎｄｅ　　ＩおよびＸｂａ　　Ｉで開裂さ
せた。次いで、酵素を熱不活性化させ、試料をフェノー
ル、および次いでエーテルで抽出し、ＤＮＡを前記と同
様にして沈殿させた。沈殿物を試料緩衝液中に取り出し
、該混合物を、６５°Ｃで７分間インキュベートした。

次に、ＤＮＡを６％のポリアクリルアミドゲル中で分離
した。　ＩＦＮ−ｒ　（−８）遺伝子、ターミネータＬ
６、ｃａｔ遺伝子およびターミネータＴＩを含む０．０
５μｍｏＪのＮｄｅ　　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉラグメントを
、前記と同様にしてゲルから単離した。このＤＮＡフラ
グメントに、フラグメント８の名称を与えた（第２３図
）。

Ｄ、プラスミド旧ｓ、Ｈｉｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−（−８）
の、）で０．００６　ｐｍｏｌのフラグメント５（第１
９図）　、０．０２μｍｏｆのフラグメント７（第２２
図）および０．００５μｍｏｌのフラグメント８（第２
３図）を、０．５単位のＴ、ＤＮＡリガーゼと共に３０
μ！容量のりガーゼ緩衝液中、１５°Ｃで３時間インキ
エベートした。酵素の熱不活性化後、バッチを前記と同
様にして、プラスミドｐＤＭ１．１を含んだＥ、ｃｏｌ
ｉ　Ｍ１５株中に形質転換させ、形質転換混合物をＬＯ
Ｏμｇ／１ａｉｌのアンピシリン、２５μｇ／ｄｔのカ
ナマイシンおよび５μｇ／ｗＪｌのクロラムフェニコー
ルを含んだＬＢプレート上に塗布した。このプレートを
、３７°Ｃで２４時間インキュベートした後、得られた
２つの形質転換体を、１００μｇ／ｌｎｉのアンピシリ
ン、２５μｇ／ｍ１のカナマ・イシンおよび５μｇ／ｒ
ｒｄｌのクロラムフェニコールを含む１０Ｉｎ１のＬＢ
培地中で生育させ、プラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｍお
よびＤｏｌｙの方法（前出文献）に従って単離した。プ
ラスミドを、６％ポリアクリルアミドゲル中、制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩ、ｌ１ｉｎｆｌ、Ｎｄｅ　Ｉ、Ｓｐｈ　
Ｉ　、、Ｘｂａ　ＩおよびＸｈｏ　Ｉにより、それらの
組成に関し、および０．７％アガロ−スゲ中で、それら
のサイズに関して分析した。両者のプラスミドは、互い
に正しい配向で所望の３つのＤＮＡフラグメントを含ん
でいた。前記したと同様に行なった（実施例３、Ｆ）配
列分析では、リボゾーム結合部位ＲＢＳ　ｎ　、ｓｐｈ
　Ｉとそれに続く要素がＩＦＮ−γ（−８）遺伝子に正
しく結合されていたことを示した。これらのプラスミド
に、ｐＨ１ｓ、ｔｆｉｓ−１’Ｅｋ−ＩＦＮ−ｒ　（−
８）の名称を与えた（第２４図）、これらのプラスミド
からコードされたＩＦＮ−γ融合蛋白質（アミノ酸配列
は第４２図参照）に、Ｈｉｓ、旧５−Ｅｋ−ＩＦＮ−Ｔ
　（−８）の名称を与えた。

［実施例８］ 一ンクーヲヒ、１１’二ｐＨｉニジ」す」二Ｘ旦二り旦
ｙ二Ｊ　（二□８９〜９す」−しｑ構−築 ん」４本釣〜非項 プラスミドｐＨｉｓ、１ｌｉｓ−ＸａｌＦＮ−ｒ　（−
８）　（Ａｓｎ）を構築するために、以下の３つのＤＮ
Ａフラグメントを互いに結合させた（第２６図）Ｘ １）　　ＩＦＮ−γ（−８）遺伝子を含んだプラスミド
ｐｌＦＮ−γ（−８）からのフラグメント　（フラグメ
ント８、第２３図、その調製方法は実施例７に述べられ
ている）； ２）上記１）に述べたフラグメントとの結合によりＩＦ
Ｎ−ｒ　（−８）の誘導体、ＩＦＮ−Ｔ　（−８）　（
Ａｓｎ）がコードされる様に、アダプタ６（第１１図）
によって、延長された、プロモータＰ、４□５Ｘ１０、
リボゾーム結合部位ＲＢＳ　ＩＩ　、Ｓｐｈ　Ｉおよび
隣接するヒスチジンおよびファクタＸａの認識部位をコ
ードする領域を含むプラスミドｒ＋Ｄｓ８／ＲＢＳＩＩ
　、ｓｐｈ　ｒ　−Ｈｌｓ、Ｈｉｓ−Ｘａ−ＢａｍＨＩ
由来のフラグメント　（フラグメンｌ−９、第２５図）
；および３）複製領域およびβ−ラクタマーゼのための
遺伝子を伴な・うプラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ　ＩＩ　
、　３Ａ＋５Ａ由来のフラグメント　（フラグメント５
、第１９図、その調製方法は実施例６に述べられている
） Ｂ、フラグメンヒｌｑ糎製 ２μｍｏ＋のプラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ　、　
Ｓｐｈ　Ｉ　−ｆｉｔｓ、　１ｌｊｓ−χａ−Ｂａｍｌ
ｌ　Ｉを、制限酵素Ｎａｒ　Ｉで開裂させた。次で、酵
素を熱不活性化させ、試料をフェノール、および次いで
エーテルで抽出し、ＤＮＡを前記と同様にして沈殿させ
た。沈殿物を５０μ２のＴＥ緩衝液中に取り出した。ｌ
ｐｍｏｌの開裂したＤＮＡを、３゜ｐｍｏｌのホスホリ
ル化したアダプタ６（第１１図）および５単位のＴ、　
ＤＮＡ　リガーゼと共に１５０μ！容量において、リガ
ーゼ緩衝液中、２０°Ｃで１４４時間インキュベートた
。酵素の熱不活性化後、ＤＮＡを制限酵素Ｎｄｅ　Ｉお
よびＸｈｏ　Ｉで開裂させた。次に、酵素の熱不活性化
後、試料をフェノール、および次いでエーテルで抽出し
、ＤＮＡを前記したと同様にして沈殿させた。沈殿物を
試料緩衝液中に取り出し、バッチを、６５°Ｃで７分間
インキエベートした。次で、得られたＤＮＡ混合物を、
６％のポリアクリルアミドゲル中で分離させた。プロモ
ータＰＨ２ＳＸ１０ｓ　リボゾーム結合部位１？Ｂｓ　
ＩＩ　、ｓｐｈ　Ｉならびに隣接するヒスチジン、ファ
クタＸａの認識部位および酸アミノＡｓｎをコードする
領域を有するＯ９２５ｐｍｏｌのＸｈｏ　Ｉ　／Ｎｄｅ
　Ｉフラグメントを、前記ゲルから単離した。このＤＮ
Ａフラグメントに、フラグメント９の名称を与えた（第
２５図）。

Ｃ１プラスミドｐ１０Ｓ、旧５−Ｘａ−ＩＦＮ−ｒ　（
−８）　（八ｓｎ）　　の組立て ０．００６　ｐｎ＋ｏｌのフラグメント５（第１９図）
　、０．００５μｍｏ１のフラグメント８（第２３図）
および０．０２μｍｏｌのフラグメント９　（第２５図
）を、３０μｌのりガーゼ緩衝液および０．５単位のＴ
、ＤＮＡ　リガーゼ中において、１５°Ｃで３時間イン
キュベートした。酵素の熱不活性化後、バッチを前記と
同様にして、プラスミドｐＤＭＩ、１を含んだＢ、ｃｏ
ｌｉ　Ｍ１５株中に形質転換させ、形質転換混合物を、
１００μｇ７ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇｏｄの
カナマイシンを含む１５Ｂプレート上に塗布した。プレ
ートを、３７°Ｃで一夜インキュベ・−トした後、２つ
のコロニーを、前記と同様にして、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含
む１０雁のＬＢ培地中で生育させ、プラスミドを、Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出文献）に従っ
て単離した。プラスミドを、６％ポリアクリルアミドゲ
ル中、制限酵素Ｈ３ｎｄｍ、旧ｎｆ　Ｉ　、　　Ｎｄｅ
　Ｉ、Ｓｐｈ　Ｉ　、　　Ｘｂａ　ＩおよびＸｈｏ　　
Ｉにより、それらの組成に関し、および０．７％アガロ
ースゲル中、それらのサイズに関して分析した。２つの
プラスミドの一方は、互いに正しい配向で所望の３つの
ＤＮＡフラグメントを含んでいた。このプラスミドの配
列分析を前記したと同様に（実施例３、Ｆ）行なったと
ころ、リボゾーム結合部位ＲＢＳＩ１．　Ｓｐｈ　　Ｉ
とそれに続く要素が［ＦＮ−γ（−８）　（Ａｓｎ）を
コードする領域に正しく結合していたことを示した。こ
のプラスミドに、ｐＨｉｓ。

１１ｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−Ｔ　（−８）　（Ａｓｎ）の
名称を与えた（第２６図）、このプラスミドからコード
されるＩＦＮ−Ｔ融合蛋白質（アミノ酸配列は第４３図
参照）に、旧Ｓ。

１１ｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−Ｔ　（−８）　（Ａｓｎ）の
名称を与えた。

［実施例９コ ブラスミド６ｘｌｌｉｓ−ＤＩＩＦＲの構築へ−玉圭煎
ｌ咀 プラスミドｐ６ｘｌｌｉｓ−ＤＨＦＲの構築のために、
以下のＤＮＡフラグメントを単離し、互いに結合させた
（第２８図）： ■）　プロモータＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９およびリ
ボゾーム結合部位ＲＢＳ　ｎを有し、アダプタ７（第１
１図）に結合されたプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ　Ｉ
Ｉのシグナルユニット　（フラグメント１０、第２７図
）；および ２）　プラスミドｐＤＳ７Ｂ／ＲＢＳ　Ｉ［の２つのＸ
ｈｏ　Ｉ　／Ｂａｍ１ｌ　ｌフラグメントの大きい方（
第２８図）Ｂ、フラグメント１０の調製 ２ｐｆｆｌｏｌのプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ　ＩＩ
を、制限酵素Ｂａｍ１ｌ　Ｉで開裂させた。酵素の熱不
活性化後、試料をフェノール、および次いでエーテルで
抽出し、ＤＮＡを前記と同様にして沈殿させた。沈殿物
を、１０μ２のりガーゼ緩衝液中に溶解させた。リガー
ゼ緩衝液に溶解された５０μｍｏｌのホスホリル化した
アダプタ７（第２７図）を、開裂させたプラスミドに添
加し、試料を２単位のりガーゼと共にインキュベー１−
シた（２２°Ｃ１３時間）。リガーゼを熱不活性化した
後、試料をフェノール、および次いでエーテルで抽出し
、ＤＮＡを前記と同様にして沈殿させた。沈殿物を溶解
し、ＯＮ八を制限酵素Ｘｈｏ　１およびＢａｍＨＩで開
裂させた。試料緩衝液を添加し、混合物を、６５°Ｃで
７分間加熱し、ＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲル中
で分離した後、前記と同様にしてプロモータＮ２５０Ｐ
ＳＮ２５０Ｐ２９　、リボゾーム結合部位ＲＢＳ　ｎお
よび６個のヒスチジンをコードする領域を有するＸｈｏ
　Ｉ　／　Ｂａｍｆ（ｌフラグメントを単離した。この
フラグメントに、フラグメント１０の名称を与えた（第
２７図）。

２１）＋１１０１のプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ　Ｉ
ｆを、制限酵素Ｘｈｏ　ＩおよびＢａｍＨＩで開裂させ
た。試料を調製し、ゲル電気泳動にかけた後、複製領域
を含むフラグメントを単離した（第２８図）。

旦−１１入え旦政姐堕」肚し■凪立工 それぞれＱ、ｌ　ｐｍｏｌの特定したフラグメントを、
２単位のＴ、ＤＮＡ　リガーゼと共にリガーゼ緩衝液中
でインキュベートした（２２°Ｃ１３時間）。酵素を熱
不活性化後、混合物を前記と同様にして、プラスミドｐ
ＤＭ１．ｌを含んだＥ、ｃｏｌｉ　Ｍ１５株中に形質転
換し、形質転換混合物を、１００　ｕｇ／ｄのアンピシ
リンおよび２５μｇ／−のカナマイシンを含んだＬ８寒
天プレート上に塗布し、プレートを、３７°Ｃで一夜イ
ンキユベートした。各々のコロニーを前記七同様の１０
　ｍｌのＬＢ培地中で生育させ、プラスミドをＢｉｒｎ
ｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出文献）によって単
離した。酵素Ｘｈｏ　ＩおよびＢａｍ）ｔ　Ｉを用いた
制限酵素分析は、プラスミドが２つの所望のフラグメン
トを含んでいたことを示した。前記と同様にして（実施
例３、Ｅ）、配列分析を行ない、アダプタ７かりボゾー
ム結合部位に正しく結合していたことを確認した。Ｄ　
１１　Ｐ　Ｒ融合蛋白質（ｌｌｉｓ）　６−ｍＤｌｌＦ
Ｒをコードするこれらのプラスミドに、ｐ６ｘｌｌｉｓ
−ＤＨＰＲの名称を与えた（第２８図）。

［実施例１０コ プラスミド４にＨｉｓ−Ｄ）ＩＦＲの　クブラスミド９
４ｘＨ３ｓ−ＤＨＦＲの構築を、プラスミドｐ６ｘｌｌ
　ｉｓ　−ＤＩＩＦＲの構築２−同様にして（実施例９
）行ない、以下のフラグメントを単離し、結合させた（
第３０図）＝ ■）　プロモータＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９およびリ
ボゾーム結合部位ＲＢＳ’ｎを持ち、アダプタ８（第１
１図）に結合されているプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ
■のシグナルユニット　（フラグメント１１、第２９図
）；および ２）プラスミドｐＤ３７８／ＲＢＳ　Ｈ（第３０図）の
２つのＸｈｏ　Ｉ　／ＢａｍＨＩフラグメントの大きい
方得られたプラスミドｐ４ｘｌｌｉｓ−ＤＩＩＦＲは、
ＤＩＩＦＲ融合蛋白質（）ｌｉｓ）　４−ｍＤＩＩＦＲ
’ａコードする。

［実施例１１１ プラス冬上パμ■二朕Ｖ１１ゆ、措ｊ Ａ、基本的襲項 プラスミドｐＲＢＳ　Ｈ−６ｘＨｉｓの構築のために、
以下のＤＮＡフラグメンＩ−を単離し、互いに結合させ
た（第３２図）： １）　ターミネータｔ。％　　ｃａｔｌ伝子およびター
ミネータＴ１を有し、アダプタ９（６個のヒスチジンを
コードする）によって延長されているプラスミドｐＤＳ
５６／ＲＢＳ　Ｈからの領域（フラグメント１２、第３
１図）；および ２）複製領域、ｂｌａ遺伝子、プロモータＮ２５０ＰＳ
Ｎ２５０Ｐ２９およびリボゾーム結合部位ＲＢＳ　ＩＩ
を有するプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ　ＩＩからのＸ
ｂａ　　Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメント（第３２図）Ｊト
＝７−之グーノーン−±、１？〜（７）　１ｌｎ−ｙツ
。

２ｐｍｏｌのプラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ　ＩＩを、
制限酵素ＨｉｎｄＩＩで開裂させた。試料を調製後、５
Ｑｐｍｏｌのホスホリル化したアダプタ９を、開裂し７
たプラスミドに添加し、試料を前記Ｕまたと同様にして
Ｔ、ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。この連
結パッチを行なった後、ＤＮ＾を、制限酵素Ｂａｍ１ｌ
　ＩおよびＸｂａ　　Ｉで開裂させ、前記と同様にして
、６個のヒスチジンをコードする領域、ターミネータｔ
ｏ、ｃａｔ遺伝子およびターミネータでＴ１を有するＢ
　ａ　ｍ　ＩｆＩ／χｂａｌフラグメントを単離した。

このフラグメントに、フラグメント１２の名称を与えた
（第３１図）。

Ｃ，ブラ人工上ｎ針６／ＲＢＳ　　ＩＩ　Ｏ）　Ｘｂａ
　Ｉ　／Ｂａｍ１ｌ　　Ｉ　７２ｐｍｏｌのプラスミド
ｐＤＳ５６／ＲＢＳ　ＩＩを、制限酵素Ｘｂａ　Ｉおよ
びＢａｍＨｌで開裂させ、複製領域、ｈｌａ遺伝子、プ
ロモータＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９およびリボゾーム
結合部位ＲＢＳ　Ｕを有するフラグメントを前記と同様
にして単離した（第３２図）。

ビ旦んえ上林郵９支心旦鳥ｐＩ−泣に一各々０．ｌｐｍ
ｏｌの単離したフラグメントを、前記と同様にして（実
施例９、Ｄ）連結させ、次いで、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｍ２Ｓ
株（ｐＤＭ、１）中に形質転換させた。塗布およびイン
キュベート（実施例９、Ｄ）後、各々のコロニーを、前
記と同様にして１０滅の培地中で生育させ、プラスミド
をＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出文献）
に従って単離した。酵素Ｂａｍ１　ＩおよびＸｂａ　１
を用いて制限酵素分析は、プラスミドが２つの所望のフ
ラグメントを含んでいたことを示した。配列分析（実施
例３、■？、）によって、アダプタ９がプラスミドＤＮ
Ａ中に正しく導入されていたことを確認（７た。これら
のプラスミドに、ｐＲＢＳ　ＩＩ　ＩＦ３ｘＨ３ｓの名
称を与えス：。

［実施例１２］ 工ｉと翅凡吐隘し４−棋国史膿菌 プラスミドｐＲＢＳ　ｌｌ−４ｘＨ３ｓの構築を、プラ
スミドｐＲＢＳ　Ｕ−６ｘＨｉｓの構築（実施例１１）
と同様にして行ない、以下のＩ）ＮＡフラグメントを単
離し、互いに結合させた（第３４図）： １）　ターミネータｔｏ、　ｃａｔ遺伝子およびターミ
ネータてＴ１を有し、アダプタ１ｏ（４つのヒスチジン
をコードする）によって延長されたプラスミドｐＤＳ５
６／ＲＢＳ　ＩＩがらの領域（フラグメント１３、第３
３図）および ２）　複製領域、ｂｌａ遺伝子、ブ０　モータＮ２５０
ＰＳＮ２５０Ｐ２９およびリボゾーム結合部位ｐ［ｌＲ
３ｎを有すルア’　７　Ｘ　ミｔ’　ｐＤＳ５６／ＲＢ
Ｓ　ＨがラノＸｂａ　　ｌ／ＢａｍＨＩフラグメント（
第３４図）。

［実施例１３］ フート五處」ｊ伊ｌジＷニム」（１ジの−Ｕ（箔プラス
ミドｐＲＢｓ　ｌｌ−２ｘＨｉｓの構築を、プラスミド
ρＲＢＳ　Ｕ−６ｘｆｌｉｓの構築（実施例１１）と同
様にして行ない、以下のＤＮＡフラグメントを単離し、
互いに結合させた（第３６図）： １）　ターミネータｔｏ、、　ｃａｔ遺伝子およびター
ミネータＴ１を有し、アダプタ１１（２つのヒスチジン
をコードする）によって延長されたプラスミドｐＤｓ５
６／ＲＢＳ　Ｉ［からの令頁域（フラグメント１４、第
３５図）および ２）複製領域、ｂｌａ遺伝子、プロモータＮ２５０ＰＳ
Ｎ２５０Ｐ２９およびリボゾーム結合部位ｐＲＢｓ■を
有するプラスミドＩ）ＤＳ５６／ＲＢＳ　ＩＩからのＸ
ｂａ　Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメント（第３６図）。

［実施例１４］ プラスミドｐＤＨＦＲ−６ｘｌｌｉｓの構築のために、
以下のＤＮＡフラグメントを単離し、互いに結合させた
（第３７図）。

１）複製領域、ｂｌａ遺伝子、プロモータＮ２５０ＰＳ
Ｎ２５０Ｐ２９　、リボゾーム結合部位１？ＢＳ　ｆｆ
およびｄｈｆｒ遺伝子を有するプラスミドｐＤｓ７８／
ＲＢＳ　ＩＩからのＸｂａ　Ｔ　／Ｂｇｌ　Ｕフラグメ
ントおよび２）６つのヒスチジンをコードする領域、タ
ーミネータｔｏ、　ｃａｔ遺伝子およびターミネータＴ
１を有するプラスミドｐＲＢｓ　Ｕ−６ｘＨｉｓからの
Ｂｇｌ　Ｉ［へＢＡＩフラグメント 得られたプラスミドｐ　Ｄ　ＨＦ　Ｒ−６ｘ　ｆｌ　ｉ
　ｓは、ｄｈｆｒ融合蛋白質Ｎｅｔ−ｍ０ＨＦＲ−（１
１１Ｓ）　ｂをコードする。

２ｐｍｏｌのプラスミドｐＨ５７８７ＲＦ３Ｓ　ｆｆを
、制限酵素Ｘｂａ　ＩおよびＢｇｌ　（［を用いて開裂
させた。試料を調製後、前記と同様にして、複製領域、
ｂｌａ遺伝子、プロモータＮ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９
　、リボゾーム結合部位ＲＢＳ　ＩＩおよびｄｈｆｒ遺
伝子を有するＸｂａ　　ｌ　／Ｂｇｌ■フラグメントを
単離した。

２ｐｍｏｌのプラスミドｐＲＢＳ　ｌｌ−６ｘ旧Ｓを、
制限酵素８ｇｌ　ＵおよびｘＢａ　　Ｉを用いて開裂さ
せた。試料を調製後、前記と同様にして、６つのヒスチ
ジンをコードする領域、ターミネータｔｏ、　ｃａｔ遺
伝子およびターミネータＴ１を有するＢｇｌ　Ｕ　／Ｘ
ｂａ　Ｉフラグメントを単離した。

Ｄ、プラスミドＤＨＰＲ−６ｘＨｉｓの組立てそれぞれ
０．１ｐｍｏｌの単離されたフラグメントを、前記と同
様にして（実施例９、Ｄ）連結させ、Ｅ。

ｃｏｌｔ　Ｍ２Ｓ株（ｐＤＭｌ、１）中に形質転換させ
た。塗布およびインキュベート（実施例９、Ｄ）後、各
々のコロニーを、１０／ｄの前記培地中で生育させ、プ
ラスミドをＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前
出文献）に従って単離した。酵素Ｘｂａ　　ＩおよびＢ
ｇｌ　ＩＩを用いた制限酵素分析は、２つのフラグメン
トが、所望の様式で互いに結合していたことを示した。

これらのフラグメントに、ｐＤＩＩＦＲ−６ｘｔｌｉｓ
の名称を与えた。

［実施例１５］ １立入ｌ上飢旺Ｌハ肚し車重系 ＤＩＩＰＲ融合蛋白質ｎｅｔ−ｍＤＩＩＰＲ（ｌｌｉｓ
）　ｚをコードするプラスミドｐＤｔｌＦＲ−２ｘＨｉ
ｓの構築を、プラスミドｐＤＨＦＲ−６ｘＨｉｓ（実施
例１４）の構築と同様にして行ない、以下のＤＮＡフラ
グメントを単離し、互いに結合、させた（第３８図）： １）複製領域、ｂｌａ遺伝子、プロモータＮ２５０ＰＳ
Ｎ２５０Ｐ２９　、リボゾーム結合部位ＲＢＳ　Ｉｆお
よびｄｈｆｒ遺伝子を有するプラスミドおよび２）２つ
のヒスチジンをコードする領域、ターミネータｔｏ、　
ｃａｔ遺伝子およびターミネータＴ１を有するプラスミ
ドｐＲＢＳ　Ｕ−２ｘｌｌｉｓからのＢｇｌ　　ＩＩ　
／ＸＢａ　Ｉフラグメント。

［実施例１６］ プラスミド４ｘ）Ｉｔｓ−ＤＨＰＲ−４ｘ旧Ｓの構築Ｄ
ＨＰＲ融合蛋白質（Ｈｉｓ）　ｎ−ｍＤＨＦＲ−（ｌｌ
ｉｓ）　４をコードするプラスミドｐ４ｘＨｉｓ−ＤＩ
ＩＦＲ−４ｘｌｌｉｓの構築を、プラスミドｐＤＩＩＦ
Ｒ−６ｘＨｉｓの構築（実施例１４）と同様にして行な
い、以下のＤＮＡフラグメントを単離し、互いに結合さ
せた（第３９図）： １）複製領域、ｂｌａ遺伝子、プロモータＮ２５０ＰＳ
Ｎ２５０Ｐ２９　、リボゾーム結合部位ＲＢＳ　ｎ、４
ｘｌｌｉｓおよびｄｈｆｒ遺伝子を有するプラスミドｐ
４ｘｌｌｉｓ−ＤＨＦＲからのＸｂａ　　Ｉ　／Ｂｇｌ
　ＩＩフラグメントおよ２）４つのヒスチジンを＝２−
ドする領域、ターミネータｔｏ、ｃａｔ遺伝子およびタ
ーミネータＴｌを有するプラスミドｐＲＢＳ　ｌｌ−４
ｘＨｉｓからのＢｇｌ　ＩＩ　／ＸＢａ　Ｉフラグメン
ト。

Ｆ実施例１７コ とＬ設備、■封装 ４１．７ｇのブロム酢酸を、１５０ｄの２Ｎ水酸化ナト
リウム溶液に溶解し、０°Ｃに冷却した。これに４２ｇ
のＮＥ−Ｚ−Ｌ−リジンを２２５ｍＩＪ、の２Ｎ水酸化
ナトリウム溶液に溶解した溶液を撹拌しなから０゛Ｃで
ゆっくり滴下した。２時間後冷却を止め、混合物を一夜
撹拌した。反応混合物を、５０゛Ｃで２時間保も、次い
で、４５０　ｘｉのＩＮ塩酸を添加した。

混合物を冷却した後、分離された結晶を濾別した。

生成物をＩＮ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、同量のＩ
Ｎ塩酸で再沈殿させ、濾別した。白色結晶、ｍ、ｐ、　
１７２−１７４　°Ｃ（分力Ｙ）、　（ｑ）　ｖ　＝＋
９．９　”　　（ｃ＝１：０．ＩＮ　Ｎａ０Ｈ）のＮ−
［５−ベンゾイルオキシカルボニルアミノ−１−カルボ
キシペンチルクーイミノジ酢酸４０ｇを得た。

得られた７、９ｇのリジン誘導体を、４９ｄのＩＮ水酸
化すトリウム溶液に溶解し、スパチュラの先一杯分の５
％ｌ）ｄ　／　Ｃを添加後、室温、常圧下で水素添加し
また。触媒を濾別し、濾液を菓発させた。６６２ｇのＮ
−［５−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノジ
酢酸を得、その構造は、Ｎ１１２（ＣＨ２）４−ＣＩｌ
（ＣＯＯＩＩ）　−Ｎ−（Ｃｔｌ　ＺＣＯＯＩＩ）　Ｚ
であることをＮＭＲスペクトルによって確認した。

１００ｍ１のセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ■）Ｃ
Ｌ−６Ｂ（ファルマシア製）を、ガラス吸引濾過器上で
３、約６００ｄの水で２回洗浄し、次いで５００ｄ丸フ
ラスコ中、３０°Ｃで４時間、１６ｍ！の４Ｎ水酸化ナ
トリウム溶液および８．２２ｄのエビブロムヒドリンと
Ｆｉ一応させた。反応混合物の全量は２００　ｍｆ！、
であった。次いで活性化されたセファロースを濾別し５
、水で中性洗浄し、反応容器に戻した。６．５ｇのＮ−
（５−アミノ−１−カルボキシペンチルクーイミノジ酢
酸を５０ｍｆ／、の水に溶解し、１０．６ｇの固体炭酸
ナトリウムと共に活性化されたセファロースに添加した
。

混合物を、６０゛Ｃで一夜ゆっくりと撹拌した。次いで
、式〔セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ■）ＣＬ−６
Ｂ］　−０−ＣＨｚ−ＣＢ　（ＯＨ）　−Ｃ１ｌｚ−Ｎ
ｉｌ　−（Ｃ１ｌ　Ｚ）　４−ＣＨ　（ＣＯＯＩＩ）−
Ｎ−（ＣＩｌｚｃＯＯ１ｌ）　！（ＮＴＡ樹脂）を有す
る得られたキレート樹脂を、クロマ１−グラフィーカラ
ム中で順次、５００ｄの水、１００ｄのＮｉＳＯ４□　
６Ｂ２０　（２重■％）水溶液、２００戚の水、２００
滅の０．２Ｍ酢酸（０，２Ｍ　ＮａＣ１および０．１重
量／容器％（・ウィーン２０含有）および２００ｚβの
水で洗浄した。式〔セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
■）ＣＬ−６Ｂ）　−０−Ｃ）！Ｚ−ＣＩｌ（ＯＲ）−
Ｃ１１，−ＮＨ〜（ＣＨｚ）　ｎ−Ｃ１１（ＣＯＯＩＩ
）−Ｎ−（ＣＩＩ２ＣＯＯ−）　ｚＮｉ”の得られたキ
レート樹脂中のニッケルイオン濃度は約７．１マイクロ
モル／　ｍｌ！であった。

［実施例１８〕 構製−期影ユーを月尤全企肌」」タニよ一υＬ、和、牲
−久旦−Ｘ■外久スーイーニ カラム（直径１．６ｃｍ、　Ｋさ７．Ｏｃｍ）に、式［
セファロース（Ｓｃｐｂａｒｏｓｅ■）ＣＬ−６Ｂ）　
−０−ＣＨ２−ＣＩｌ（Ｏ１＋）−ＣＩｌ２−Ｎ）ｌ−
（Ｃ１１□）、−Ｃ１１（Ｃ００）１）−Ｎ（ＣＩｌ、
ＣＯＯ１ｌ）！　（ＮＴＡ樹脂）の金属を含まないキレ
−を樹脂を充填し、該樹脂をカラムの３倍容量の０゜Ｉ
Ｍ　ＮｉＳＯ４・５Ｈ！０でずずいでニッケル型にし、
次いで、カラムの３倍容量の０．２門酢酸で洗浄した。

次いで、この樹脂を０．１＋１１−リス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７，５）および０．５Ｍ　ＮａＣ１で平衡化した
（それぞれの流速：６０ｍ１／時間）。

ＩＢの精製ＩＦＮ−Ｔ（実施例３、アミノ酸配列は第４
０図参照）を、３戚の平衡緩衝液中に取りカラムにかけ
た。酵素免疫検定法（Ｇａｌｌａｔｉ、　Ｎ７．Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
。２０．９０７−９１４（１９８２））によって、２種
の内部蛋白質構造要素Ｇｕｙ−）１ｉｓ−５ｅｒおよび
Ｉ　１ｅ−１！１ｓ−Ｇｌｕにもかかわらず、ＮＴＡカ
ラムへの結合が起こらなかったことが分った。

〔実施例１９］ Ｎ豆−用脚（ζよ一４坦−ジ−５１国−ハ辻暉ニアｏ＞
連装プラスミドｐＤＭＩ、１およびｐＨ１ｓ、　ｔｌｉ
ｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−γを含むＥ、ｃｏｌｉ　Ｍ１５細胞
（実施例６）を、１００μｇ／ｍ１．のアンピシリンお
よび２５１ｆｇ／ｄのカナマイシンを含む１ｐのＬＢ培
地中、３７゛Ｃで、ＯＤ、。。、０．６の光学密度にな
るまで生育させた。次いでＩＰＴＧを添加しく最終濃度
０．５ｍ１１）、細胞をさらに４時間インキュベートし
た。続いて、細胞を、遠心分離（４０００Ｘｇ　、　１
０分間、４°Ｃ）によって培地から分離しく５ｇ湿重量
）　、　Ｌ５ｍｆｔの７Ｍグアニジン・ＩＩ　ＣＩおよ
び０．０１Ｍ硼酸ナトリウム　（ｐＨ８）（１時間、４
℃、磁気撹拌機）で抽出した。

かくして得られた粗抽出液を遠心分離しく１０，０００
Ｘｇ　、１５分、４°Ｃ）、上澄みを１０倍容量の０．
１１トリス・ＨＣＩ緩衝液（ｐ）ｌ　７．５）および０
．５　Ｍ　ＮａＣｌで希釈し、再び遠心分離しく１０．
０００Ｘｇ　、１５分、４°Ｃ）、実施例１８で述べた
と同一のＮＴＡカラムにポンプで送った。次いでカラム
を、ＵＶ検出器（２８０ｍｍ）が再び基底値を示すまで
平衡緩衝液で洗浄した。

Ｈｉｓ、　１ｌｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−７の溶出は、ｐＨ
値を５．５に低下させることによって行なった。酵素免
疫検定法（Ｇａｌｌａ目、Ｈｌ、前出文献）によってこ
の蛋白質が定量的にＮＴＡカラムに吸着し、ｐＨ値を低
下させることによってのみ溶出されることが分った。

５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＲＰ−
１８ＨＰＬＣによって、得られた蛋白質は、純粋なｌ１
ｉｓ。

１１ｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−７（純度〉９０％）であるこ
とが分つた。Ｅｄｍａｎ分解によって、期待したアミノ
末端配列Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉ
ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ　　・・・を確
認した。

［実施例２０］ ＮＴＡＩ　ヒによる旧ｓ、　ｌ１ｉｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−
の１−１実施例１９と同様の方法によって、旧ｓ、　Ｈ
ｉｓ−Ｅｋ−ＩＦＮ−Ｔ　（−８）　（実施例７）を、
Ｅ、ｃｏｌｉ中に発現させ、抽出しおよびＮＴＡカラム
を通じて精製した。この融合蛋白質は、またｐＨ７，５
でＮＴＡカラムに結合し、ｐＨ値を５．５に低下させる
ことによって純粋な形態（純度〉９０％）で溶出された
。Ｅｄｍａｎ分解によって、期待した配列Ｍｅｔ−Ｈｉ
ｓ−Ｈｉｓ−八１ａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−八５ｐ−Ａｓｐ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ　　・・・を確認した。

［実施例２１］ ＮＴＡカラムによるｌ１ｉｓ、旧５−Ｘａ−ＩＦＮ−（
−８）　（八ｓｎ）の■ 実施例１９と同様の方法によって、）Ｉｉｓ、Ｈｉｓ−
Ｘａ−ＩＦＮ−ｒ　（−８）　（Ａｓｎ）　（実施例８
）を、Ｅ、ｃｏｌｉ中に発現させ、抽出しおよびＮＴＡ
カラムを通じて精製した。この蛋白質をまたｐＨ７，５
でＮＴＡカラムに結合させ、ｐＨ値を５．５に低下させ
ることによって純粋な形態（純度〉９０％）で溶出した
。

１ｍｇのかくして得られたＨｉｓ−ｔｌｉｓ−Ｘａ−Ｉ
ＦＮ−Ｔ（−８）　（Ａｓｎ）を０．１Ｍ　Ｉ−リス・
）ＩＣＩ　（ｐＨ７，５）、０．５ＭＮａＣ１およびｌ
　ｍＭ　ＣａＣ１ｚに対して透析させた。透析物（５ｍ
ｌ　）を、１００μｍ　（＝　Ｉ　Ｕ’）の擬結ファク
ターＸａ　（ベーリンガー／マンハイム製）で処理し、
２２°Ｃで１６時間インキュベー゛トシた。旧３．Ｈｉ
ｓ−親和性ベプチドの酵素的分解を、５ＯＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって決定した。

塩類、ウシ血清アルブミン（市販ファクタＸａ製品の成
分）およびファクタＸａを分離するために、インキュベ
ート混合物を、まず、水に対して透析し、次に凍結乾燥
させ、続いてＲＰ−１８ＨＰＬＣカラム（Ｂｒｏｗｎｌ
ｅｅ　ＬａｂｓからのＮｕｃｌｅｏｓｉｌ、　５Ｃ１８
カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸に対して作用、ア
セトニトリルによる勾配、流速１ｄ／分）上でクロマト
グラフィーにかけた。次に得られた精製蛋白質から溶媒
を除去し、Ｅｄｍａｎ分解に付した。

期待したアミノ末端配列Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ　　・−がこの方法によって確認された。

この実験は、Ｈｉｓ−１１ｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−ｒ　（
−８）　（Ａｓｎ）のＮＨ２末端に於ける親和性配列が
、金属キレート親和性クロマトグラフィー後、はっきり
と開裂され得ることを示す。

［実施例２２］ ６Ｍグアニジン・ＨＣＩ！、　　のＮＴＡ樹脂による（
ｔｌｉｓＬ＋」町ハ■簾梨 実施例１９と同様の方法によって、（Ｈｉｓ）　ｓ−ｍ
ＤＩＩＦＲ（実施例９）をＥ、ｃｏｌｉ中に発現させた
。該細胞を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，
０）中の６Ｍグアニジン・ＨＣｆで抽出した（Ｉｇの細
胞に対して５ｄの緩衝液、１時間、２２°Ｃ，磁気撹拌
機）。

かくして調製した粗抽出物を、続いて遠心分離し、上澄
み液を実施例１８で述べたと同一のＮＴＡカラムにポン
プで送った。使用された緩衝液を除き、実施例１９と同
様にして、クロマトグラフィーを行なった。使用した緩
衝液は、それぞれの場合、以下のｐＨ値を有する０、１
　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中に６Ｍグアニジン何ＩＣ
！を含んでいた。蛋白質をＪＩ用するためムこｐＨ８−
０、非結合Ｆ、ｃｏｌｉ蛋白質を洗出するためにｐＨ６
，０および（ｔｌｉｓ）　６−ｍＤＩＩＦＲを溶出する
ためにｐＨ４，５，得られた溶出液を水に対して透析し
、次いで凍結乾燥した。　ＳＯ３−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって、得られた蛋白質は純粋な（ｔｌ
ｉｓ）ｓ−ｍＤＨＦＲ（純度〉９０％）であることが分
ったやＥｄｎ＋ａｎ分解によって、期待した配列Ｎｅｔ
−Ａｒｇ〜Ｇｌｙ−５ｅｒ−ＩＩ　１ｓ−ＩＩ　１ｓ−
ｔｌｉｓ−Ｈｉｓ−Ｉｔ　１ｓ−Ｉｔ　１ｓ−Ｇ　１ｙ
−３ｅｒ−Ｉｌｅ−ＭｅＬ　　・・・を確認した。

〔実施例２３〕 実施例１９と同様の方法によって、（ｌｌｉｓ）　、−
ｍＤＩｉＦＲ−（Ｉｌｉｓ）＝（実施例１６）を、Ｅ、
ｃｏｌｉ中に発現させ、抽出しおよびＮＴＡカラムを通
じて精製した。実施例２２において使用した段階勾配の
代わりに直線ｐＨ勾配溶出を使用した（ｐＨ８゜０−ｐ
Ｈ４，０，２時間）。

（ｔｌｉｓ）　４−ｍＤＩＦＲ−（Ｈｉｓ）　ａ融合蛋
白質はｐＨ４，９で溶出され、少なくとも９０％の純度
を有していた。

し実施例２４］ ｉ■采索沖９ゴリＡ渭脂＝（ζよ−る一門艷も、、、、
！、、ｌ＞ｕハエ、−（４１ｉ乏）、　、−９−１ｊ［
黙 実施例１９と同様の方法によって、Ｎｅｔ−ｍＤ）ＩＦ
Ｒ−（Ｈｉｓ）ａ　（実施例１４）を、Ｅ、ｃｏｌｉ中
に発現させた。

遠心分離で得た細胞を、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１７，５）　、６　Ｍ尿素で抽出しくＩｇの
細胞に対して１０ｍ２の緩衝液）、超音波処理した（１
０分間）。細胞破片を遠心分離した後、上澄み液を、抽
出緩衝液で平衡化したＮＴＡカラム（４，５ｃｍＸ２．
６ｃｍ）にかけた。抽出緩衝液を用いてカラムを洗浄後
、Ｍｅｔ−ｍＤＨＦＲ−（ｔｌｉｓ）ｂ融合蛋白質を、
１時間当り１８ｍ１のポンプ流速で５時間、ｐＨ７，５
（抽出緩衝液）からｐＨ４，８（６Ｍ尿素を含む０．０
５リン酸すトリウム緩衝液）の直線ｐｌ＋勾配を用いて
溶出させた。５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって、蛋白質を含んだフラクションを分析した。９
　ｍｇのＭｅしｍＤＩＩＦＲ−（Ｈｉｓ）　ｂ融合蛋白
質を純度＞９０％で得た。

［実施例２５１ 」遅朋１−は一！ｉ礪セ期Ｒ−（ｌｌｉＳ−斤ｑ樺製実
施例１９と同様の方法によって、ＭｅＬ−ｍＤＩＩＦＲ
−（ｌＩｉｓＬ　（実施例１５）を、Ｅ、ｃｏｌｉ中に
発現させた。

０．１Ｍ塩化カリウムおよび０．１％のトウイーン２０
を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液中（ｐＨ１８，
０）の遠心分離した細胞を、水浴中で１５分間、超音波
で処理した（Ｉｇの細胞に対して１０雁の緩衝液）。

次いで細胞破片を遠心分離し、清澄な」−澄み液を、抽
出緩衝液で、平衡化したＮＴＡカラム（４，６ｃｍ　Ｘ
　２．６（：ｍ）にかけた。カラムを抽出緩衝液で洗浄
し、Ｍｅｔ−ｍＤｌｆＰＲ−（Ｈｉｓ）　を融合蛋白質
を、１時間当り５０ｍ２のポンプ流速で１０時間、ｐｌ
（８，０（抽出緩衝液）からρ）１５．０　（０，１Ｍ
塩化カリウムおよびｏ、ｉ％ツイーン２０を含む０．０
５Ｍリン酸カリウム緩衝液）の直線ｐｌ＋勾配を用いて
？容出させた。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって、ピークフラクションの溶出液を分析した。

７　ｍｇのＭｅｔ−ｍＤｔｆＦＲ−（旧Ｓ）Ｚ融合蛋白
質を純度〉８５％で得た。

かくして得られた３■の融今蛋白質旧ｔ、ｍＤＩＩＦＲ
〜（ｌｌｉｓ）ｚｆＥ、６°Ｃで０．０５Ｍ　Ｉ＝リス
−１１０Ａ　（ｐＨ６，０）に対し２て透析した。次に
蛋白質溶液を、０．５　ＭＮａｏｌｌを用いてρＩｔ　
９　、　Ｏに調ｆｉむし、ウシｌＦｆ臓からの８．５単
位のカルボキシベプチターゼＡ　（Ｓｅｒｖａ、Ｆｅｉ
ｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、ｌｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　Ｂ
ＲＤ）の存在下、３７°Ｃでインキヱベートした。０分
、１５分、３０分、９０分および１８０分後、試料を取
り除き、）ＩＰＩ、Ｃによって、それらのヒスチジン含
有量を分析した。４８０分後、ｐＨ値を８．０に低下さ
せ、反応混合液を、０．０５Ｍ１ｊン酸カリウム緩衝液
（ｐｎａ）で平衡化したＮＴＡカラムにポンプで送った
。反応混合液に含まれている蛋白質は、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による流れの過程（ｆ　ｌｏ
ｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）において検出された。

さらに時間に伴なって増加するヒスチジン残基の量が、
１５分、３０分、９０分および１８０分後に蛋白質溶液
から取り除かれた試料中に検出された。

この実験は、ＮＴＡ樹脂上での精製後、カルボキシ末端
における親和性配列がはっきり取り除かれ得るというこ
とを示している。

【図面の簡単な説明】

第】５図は、プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ｎ　、ｓｐ
ｈ　ｌ、第２図は、プラスミドｐＤＳ８／ＲＢＳ　ＩＩ
　、Ｓｐｈ　ＩのＸ１１０■／χｂａＩフラグメントの
ヌクレオチド配列、第３図は、プラスミドｐＤＳ５／Ｒ
ＢＳ　ＩＩ　、　３Ａ＋５Ａ。 第４図は、プラスミドｐＤＳ５／ＲＢＳ　ＩＩ　、　３
Ａ＋５Ａ　ｃ７）ヌクレオチド配列、 第５図は、プラスミドｐＤｓ７８／ＲＢＳ　ＩＩ、第６
図は、プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳ　ｎのヌクレオチ
ド配列、 第７図は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ　Ｕ、第８図
は、プラスミドｐＤＳ５６／ＲＢＳ　Ｕのヌクレオチド
配列、 第９図は、プラスミドｐＤ？ｌＩ、１、第１０図は、プ
ラスミドｐＤＩ’ｌｌ、１のヌクレオチド配列、 第１１図は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、 第１２図は、フラグメント１の構築および単離、第１３
図は、プラスミドｐＧＬＳの構築、第１４図は、フラグ
メント２の構築および単離、第１５図は、プラスミドｐ
ｌＦＮ−γ（−８）の構築、第１６図は、フラグメント
３の構築および単離、第１７図は、プラスミドｐＤＳ８
／ＲＢＳ　Ｉ［、Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｈｌｓ。 １１ｉｓ−Ｘａ−Ｂａｍｆｌ　　Ｉの構築、第１８図は
、フラグメント４の構築および単離、第１９図は、フラ
グメント５の単離、 第２０図は、フラグメント６の単離、 第２１図は、プラスミドｐＨ１ｓ、　１ｌｉｓ−Ｘａ−
ＩＦＮ−７の構築、 第２２図は、フラグメント７の構築および単離、第２３
図は、フラグメント８の単離、 第２４図は、プラスミドｐｆｌｉｓ、Ｈｉｓ−Ｅｋ−Ｉ
ＦＮ−Ｔ　（−８）の構築、 第２５図は、フラグメント９の構築および単離、第２６
図は、プラスミドｐＨ１ｓ、Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦＮ−１
（−８）（Ａｎｓ）の構築、 第２７図は、フラグメント１０の構築および単ｋ【、第
２８図は、プラスミドｐ６ｘｌｌｉｓ−ＤＨＦＲの構築
、第２９図は、フラグメント１１の構築および単離、第
３０図は、プラスミドル４χ旧５−Ｄ）ＩＦＨの構築、
第３１図は、フラグメント１２の構築および単離、第３
２図は、プラスミドｐＲＢｓ　ＩＩ　−６ｘｌｌｉｓの
構築、第３３図は、フラグメント１３の構築および単離
、第３４図は、プラスミドｐＲＢＳ　ｎ　−４ｘＨｉｓ
の構築、第３５図は、フラグメント１４の構築および単
離、第３６図は、プラスミドｐＲＢＳ　ＩＩ　−２ｘＨ
ｉｓの構築、第３７図は、プラスミドｐＤＩＩＦＲ−６
ｘＨｉｓの構築、第３８図は、プラスミドｐＤＨＦＲＲ
−２ｘ旧Ｓの構築、第３９図は、プラスミドｐ４ｘ１１
ｉｓ−ＤＩＩＦＲ−４ｘ）ｌｉｓの構築、 第４０図は、プラスミドｐＧＬＳによりコードされるＩ
ＦＮ−γ遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミ
ノ酸配列、 第４１図は、プラスミドｐＨｉｓ、Ｈｉｓ−Ｘａ−ＩＦ
Ｎ−７によりコードされるＩＦＮ−γ融合遺伝子のヌク
レオチド配列および対応するアミノ酸配列、 第４２図は、プラスミドｐＨ１ｓ、Ｈｉｓ−Ｅｋ−ＩＦ
Ｎ−ｒ　（−８）によりコードされるＩＦＮ−γ融合遺
伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列、
第４３図は、プラスミドｐＨｉｓ、１ｌｉｓ−Ｘａ−Ｉ
ＦＮ−７（−８）（Ａｓｎ）によりコードされるＩＦＮ
−γ融合遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミ
ノ酸配列を各々示す図である。 第１図 ＰＮ２５”１０ 第２図（そのり ｉＱ　　　　　　　　　２０　　　　　　　　３０　　
　　　　　　４０　　　　　　　　　Ｓ。 ＯＣＣＴＣＣＡににＣＴ　にＣＣＡＴＣＣＣＴＡ　　Ａ
ＣＡＴＡＴＣＣＣＡ　　ＡＴＣ；にＴＴＡＣＴＴ　　Ａ
ＡＡＣ４ＡＣＣＣＡ５０　Ｃ；Ｃ，ＡＣＴＡＣごにＴ　
ＡＴＣＣＣＴＴ（Ａ’；ＣＡＴＡＣにＣＴ’１丁Ｇ　Ａ
にＴＴＡＣＡＴＡＡ　ＡＣＴＡＴＡＴＣＣＴｌｏｏ　　
ＧＡＡＣＴＴＴＣＴＴ　ＣＴＴＴにＣＴＣＡＡ　　ＡＣ
ＡＡＴＣＡＴＡＡ　　ＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴ　ＴＧＣＴ
ＴＴＣＡにＧ１５０　　ＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡ
ＴＡＡＴＡＣ−ＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＣＣＣ；Ｃ
ＡＴＡ　　ＡＣＡＡＴＴＴＧＡＡ６００　　ＧＡＣＴＡ
ＡＣＡＣに　　ＡＡＣＡＴ（：ＣＴＴＴＣＡＡにＴＴＣ
ＴＣＴ　ＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＡＴＧ８
５０　　ＣＡＴＴＴＴＴＡＴＡ　　ＡＣＡＣＣＡＴＣＣ
ＣＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＣＣＣＣ
ＣＡＡＣＣＴ９００　　ＴにＣＡＣＴＣＣＴＣ；　ＴＴ
ＣＡＴＡＣＡＴＣＣＡＩ：ＴＡＡＴＣＡＣＣＴＣＡ（：
ＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＡＴＴ９５０　　ＴＧＴＴＣ
ＡＣ：ＡＡＣにＣＴＣＧＣＴＴＧＣＣＣＣＣにＣにＣに
Ｔ　ＴＴＴＴＴＡＴＴＣＣ；　　ＴＣＭ；ＡＡＴＣＣＡ
ｌｏｏｏ　　ＡＣＣＴＡＣＣＴＴＣにＣＣＡにＡＴＴＴ
Ｔ　　ＣＡＬにＡＣＣＴＡＡ　　ＧＣＡＡＣＣＴＡＡＡ
　　ＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡ１０５０　　ＡＡＡＴＣＡＣ
’Ｖ：ＣＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＣＴＴＣ，ＡＴＡＴＡＴ
　ＣＣＣＡＡＴＣＣＣＡ　　ＴＣＣＴＡＡＡＣＡＡｌｌ
ｏｏ　　ＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＡ
ＣＴＴにＣＴＣＡＡ　　ＴＧＴＡＣＣＴＡＴＡ　ＡＣＣ
ＡＣＡＣＣＣτ１１５０　　ＴＣＡＣＣＴＣＣＡＴ　　
ＡＴＴＡＣＣＣＣＣＴ　　ＴｍＡＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡ
ＡＩ：ＡＡＡ　　ＡＡＴＡＡＣ；ＣＡＣＡ第４図（その
１） ｔｏ　　　　　　　　　　２０　　　　　　　　　３０
　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　５００　　
ＣＣＴＣＣＡＣ；ＣＣＴ　ＧＣＣＡＴＣＣＣＴＡ　　Ａ
ＣＡＴＡＴＣＣＣＡ　　ＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴ　　ＡＡ
ＡＣＡＡＣＣＧＡ５０　　ＣＣ：ＡＣＴＡＣＣＣＴ　Ａ
ＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＡＣにＣＴＴＴＣＡＣＴＴＡＣ
ＡＴＡＡ　　Ａに’Ｉ’ＡＴＡＴ（、ＣＴ１．００　　
にＡＡＣＴＴＴＣＴＴ　ＣＴＴＴＧＣＴＣＡＡ　　ＡＣ
ＡＡＴＣＡＴＡＡ　　ＡＡＡＡＴ”ＸＴＡＴＴ　　ＴＣ
ＣＴＴＴＣＡＣ；Ｇ１５０　　ＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣ：
　　ＴＣ−ＴＡＴＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴ’ｒＣ：
　ＴＣＡにＣＣＣＡＴＡ　　ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡ！１
５０　　ＴＴ”ｒＴＡＡＣＣＣＡ　ＣＴＴＡＴＴＣＣＴ
Ｃ：　ＣＣＣＴＴＡＡＡＣに　ＣＣ”ｒＣ（、ＣＣＴＡ
Ａ　ＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡｌｏｏｏ　　ＣＣＴＴＣＡ（
、にＣＡ　ＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡ　ＣＣＡＡＡＧＣＣＴ
ＣＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡ　ＣＴにＣ；ＣＣＣＴＴＴ１０
５０　　ＣＣＴＴＴＴＡＴＣＴ　ＣＴｒＧＴＴＴ（−Ｔ
ＣＧＧＴＯＡＡＣにＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＡＣＴＡ　（：
ＣＡＣＡＡＡＴＣＣｌｌｏｏ　　ＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣ
ＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣ（：　ＴＣＡ
ＴＣＡＣＣＣＴ　ＣＡＡＡＡＣＣＴＣτ１１５０　　Ｃ
ＡＣＡＣＡＴＣＣＡ　Ｃ，ＣＴＣＣＣＣＣ，ＡＣＡＣＣ
ＣＴＣＡＣＡＣ：　ＣＴＴ（、ＴＣＴＣＴＡ　　ＡＣＣ
ＣＣＡＴＣごＣ第４図（その２） １０　　　　　　　　２０　　　　　　　　３０　　　
　　　　　１１０　　　　　　　　５Ｏ１２００ＣＣＣ
ＡＣＣＭ：ＡＣＡＡＣＣＣＣ（：、ＴＣＡ　ＣにＣＣに
ＣＣ：ＴＣＡ　（：ＣＣＣＧ’ｒＣｒＴＣ：　ＣＣＣ；
ｃｃＴ（：ＴＣに１２５０　ＣＣＣＣＣＣＡにＣＣＡＴ
にＡＣＣＣＡｃＴ　ＣＡＣＣＴＡＣＣＧＡ　ＴＡＣＣＧ
にＡＣＴに　ＴＡＴＡＣＴＣＣＣ”ｒ１３００　ＴＡＡ
ＣＴＡＴＣＣＣＣ，ＣＡＴＣＡにＡＣＣＡＣＡＴＴＣＴ
ＡＣＴ　にＡにＡＣ；ＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣＣにＴ
１ｑ５０　ＡＣＣＣＣＴＡＴＣＡ　ＣＣＴＣＡＣＴＣＡ
Ａ　ＡＣにＣＣＣＴＡＡＴ　ＡＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＣ
ＡＧＡＡＴＣＡＣ；１６００　ＴＣＡＣＣ；ＡにＣＡＴ
　ＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣ（：、ＡＣ（：ＣＴＣＡＡに　
ＴＣＡ（：Ａ（：（：ＴＧに　ＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡ１
９００　ＣＣＴＡＡＣＡＣＡＣＣ；ＡＣＴＴＡＴＣＣＣ
ＣＡＣＴＣ：ＣＣＡＣ：ＣＡＣＣＣＡＣＴＣ，ＣＴ　Ａ
ＡＣＡＣにＡＴ”ｒＡ２１ＳＯＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧ　
にＡＴＣＴＣＡＡＣＡ　Ａ（：ＡＴＣＣＴＴＴＣ：　Ａ
ＴＣＴＴＴＴＣＴＡ　ＣＣにｃ（、”ｒＣＴＣＡ２２０
０　ＣＣＣＴＣＡＣＴ（、に　ＡＡＣＣＡＡＡＡＣＴ　
ＣＡＣＣＴＴＡＡＣ（２ＧＡＴＴＴＴＧにＴＣＡＴにＡ
ＣＡＴＴＡＴ２２５０　ＣＡＡＡＡＡにＣＡＴ　ＣＴＴ
ＣＡＣＣＴＡに　ＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡ　ＡＴＴＡＡＡ
ＡＡＴＣ；　ＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡ２１１００　ＴＴＣ
ＣＣＴＣ；ＡＣＴ　ＣＣＣＣＣ，ＴＯＣＴ（：　ＴＡＣ
，ＡＴＡＡＣＴＡ　ＣＣＡＴＡＣＣＣにＡ　Ｃ，にＣ，
ＣＴＴＡＣＣＡ２４５０　ＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡ　Ｃ，
ＴＣＣＴＣＣＡＡＴ　ＧＡＴＡＣＩ：ＣＣＣＡ　にＡＣ
ＣＣＡＣ（：ＣＴ　ＣＡＣＣにＣＣ’ｒＣＣ２５００Ａ
ＧＡＴＴ”ｒＡＴＣＡ　ＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＣＣ
ＡＣＣＣ（：ＣＡＡＣ；Ｃ（：ＣＣにＡに　ＣＣＣＡＣ
ＡＡにＴに２５５０　ＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴ’ｒＴＡ
ＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡにＴ　ＣＴＡＴＴＡＡＴ
ＴＧ　ＴＴＣＣＣににＣＡＡ第４図（−！−の３） ２６００　にＣＴＡＣＡにＴＡＡ　Ｃ；ＴＡにＴＴＣＣ
ＣＣＡＣＴＴＡＡＴＡにＴ　ＴＴＣＣＣＣＡＡＣＣ：　
ＴＴＣ，ＴＴＣＣＣＡＴ２６５０　ＴＣＣＴＡＣＡＣＣ
ＣＡＴＣＧＴＣ：ＣＴＣＴ　ＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＣ；
ＴＴＴＣＣＴＡＴＧ（：ＣＴＴＣＡＴＴＣＡ２７００　
Ｃ：ＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＣＡ　ＡＧＣ
Ｃ（：ＡＣＴＴＡ　ＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＣＡ”：’Ｃ
，ＴＴＣＴＣＣ２７５０ＡＡＡＡＡＡＣＣＣＧ　ＴＴＡ
ＣＣＴＣＣＴＴ　ＣＣにＴＣＣＴＣＣに　ＡＴＯＣＴＴ
（、’ｒＣＡ　ＣＡＡにＴＡＡＣＴＴ２４００　ににＣ
ＣＣＣＡＣＴ（：　ＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡ　ＴＧにＴＴ
ＡＴＣＣＣＡ（：ＣＡＣＴＣＣＡＴ　ＡＡＴＴＣＴＣＴ
ＴＡ２δ５０　ＣＴにＴＣＡＴＣＣＣＡＴＣＣＣＴＡＡ
ＣＡ　ＴＣＣＴ”１ＴＴＣＴに　ＴＣＡＣＴＣ；ＣＴＣ
Ａ　（：ＴＡＣＴＣＡＡＣＣ２９００ＡＡＣ；ＴＣＡＴ
ＴＣＴ　ＧＡＣＡＡＴＡＣＴＣＴＡＴＣ；ＣＣｃＣＣＡ
　ＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴ　ＣＴＴＣＣＣＣＣＧＣ２９５
０Ｃ：ＴＣＡＡＴＡＣＣに　　にＡＴＡＡＴＡＣＣに　
　ＣＣＣＣＡＣＡＴＡに　　ＣＡＣＡＡＣＴＴ７Ａ　　
ＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡ３０００　ＴＣＡＴＴにＣ：ＡＡ
Ａ　ＡＣＧＴＴＣＴＴＣＣＣＧ（：ＣＣＡＡＡＡＣＴＣ
ＴＣＡＡＣ，にＡＴ　ＣＴＴＡＣＣＣＣＴＣ３０５０Ｔ
ＴＣ；ＡＣＡＴＣＣＡ　ＣＴＴＣＣＡＴＣＴＡ　ＡＣＣ
ＣＡＣＴＣＣ７’　にＣＡＣＣＣＡＡＣＴ　ＣＡＴＣＴ
ＴＣＡｃＣ３１００ＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴ　ＴＴＣＡＣ
ＣＡに（１；　ＴＴＴＣＴＣＣＣＴに　ＡＣＣＡＡＡＡ
ＡＣＡ　ＣｃＡＡＣＣＣＡＡＡ３１５０　ＡＴＣＣＣ（
：ＣＡＡＡ　ＡＡＡＣ（：ＧＡＡＴＡ　ＡにＣ；（、Ｃ
Ｃ，ＡＣＡＣＣ，（：ＡＡＡＴＣＴＴＣ：　ＡＡＴＡＣ
ＴＣＡＴＡ３２００　ＣＴＣＴＴＣＣＴＴτＴＴＣＡＡ
ＴＡＴＴＡ　ＴＴＣ；ＡＡＣＣＡＴＴ　ＴＡＴＣＡＣＣ
ＣＴＴ　　ＡＴＴＣＴＣＴＣＡＴ１２５０　ＣＡＣＣＣ
ＣＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＴ　にＴＡＴＴＴＡにＡ
Ａ　ＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡ　ＡＴＡＣＧＣＣＴＴσ３３
００　ＣＣＣＣＣＡＣＡＴＴ　ＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡ　
ＣＴＣＣＣＡＣＣＴ（：　ＡＣＣＴＣＴＡＡＣＡ　ＡＡ
ＣＣＡＴＴＡＴＴ！３５０　　ＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴ　
ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡ　ＡＡＡＴＭ：ＣＣＣＴ　ＡＴＣ
ＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＣ；ＴＣＴ３４００　　Ｔ
ＣＡ 第５図 Ｎ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９ 第６図（その１） ５１　八人ＴＡＧＡＴＴＣＡ　　ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧ
　　ＧＡＴλ入ＣＡＡＴｒ　　ＴＣλＣＡＣＡＧＡＡ　
　’１１”ｒｃ入ＴＴＡ入入Ｇ７０１　で〒ＧＴＴＡＡ
ＣＣＴ　　ＡＧＴＴＴλＡＣＡＧ　　ＧＡＡＧ八丁Ｇへ
Ｔ！’　ＴＣＡＡＧＴＴｃＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣ７
５１ＣＴＡＡＡＧＣＴＡ’ｌ’　　ＧＣＡＴＴ’ｒＴＴ
ＡＴ　　ＡＡＧ入ＣＣＡＴにに　　ＧＡｆ？ｒＴＩＴＧ
ＣＴ　　ＧＧＣ’ｌ’ＴＴＡＧ入Ｔ８０１　　ＣＣＧＧ
ＣＣＪｌｉＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＣｃ＋ｒ　ＧＴＴＧＡ
ＴＡＧＡＴ　　ＣＣＡｃＴＡＡＴＧＡ　　ＣＣＴＣλＧ
入八ＣＴ８５へ　　ＣＣＡＴＣＴＧＧ入Ｔ　　ＴＴＧＴ
ＴＣＡＧＡＡ　　ＣＧＣｒＣＧＧＴＴＧ　　ＣＣにＣＣ
にＧＧＣＧ　ＴＴｌ’１ＴＴＡＴＴＧ９０１　　ＧＴＧ
ＡＧＡＡＴＣＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴ　　ＧＧＣＧＡＧ
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第１０図（その３） ２７００　ＡＴＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＣＣＣ
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１図（その１） （Ｓｐｈｌ）　　　　　（Ｎｄｅｌ：）（Ｈ１ｎｆ工）
　　　　　　　　　　　　　　　（ＨｉｎｄＩＩＩ）（
Ｓｐｈｌ）　　　　ＮａｅＸ　　　　　Ｎａｒ工（Ｂａ
ｍＨＩ）（Ｎａｚ工）　　　　　（ＮａａＩ） アゲブタ４　：　　　ＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴ
ＴＣＴＡＧＧＴＡＴ （ＮａａＩ）　　　　　　　　　　　　　（Ｎｄｅｌ）
（Ｎａｒ工ｌ　　　　　（ＮａａＩ） アタ′ブタ６：　　　ＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＴ
ＴＴＴＧＧＧＴＡで 第１Ｉ図（その２） （Ｂａｍ）！１） （ＢａｒｒＪＩｌ （Ｂａｍ８丁）　　ＢｇｌＩＺ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　（ＨｉｎｄＩＩＩ）（Ｂａｒｎｊ（工
）　　ＢｇｌＩＺ　　　　　　　　　（ＨｉｎｄＩＩＩ
）（ＢａｍＨＩ）　　ＢｇｌＩＺ　　　　（Ｈｉｎｄｌ
ＩＩ）アゲブタ１１：　　　　ＧＡＴＣＣ双■ヲｆｆ１
ｃＡｒｃＡｃＴ八ＧＴＣＴＡにＡ（ｉｒＡＧＴＧＡＴＴ
ｃＧＡＰＮ２５’／口 ２Ｚ昼２日 ＰＮＺＳ’１０　　　　　第１７図 マ ＰＮＺＳ’１０ Ｔ１　　　〔αｔ フラク゛メン１＼５ 第２０図 ＰＮ２５’１０ Ｔｌ　　　ｃ酎 ＰＮ２５”１０ フラク゛メント６ ＰＮ２５’１０ ＰＮ２５″１０ ＴＩ　　　【酎 ＰＨ６”１０ フラク゛メンドア 第２３図 ＰＮ２５”１０ 二ゴ歿鵠」」 第２４図 ｐｓｚｓｏＩＱ マ ＰＮ２５”／Ｑ Ｔ１　　　　　　〔ロト ＰＮ２５°１０ ＰＮ２５°１０ ＰＨ２５°／ａ 第３７図　Ｎ２５ＯＰＳＮ２５０Ｐ２９Ｎ２ＳＯＰＳＮ
２ＳＯＰ２９ 第３８図　　Ｎ２５０ＰＳＮ２ＳＯＰ２９Ｎ２５０ＰＳ
Ｎ２５０Ｐ２９ ＴＩ　　　　　　　　　　　　　　　　ＴｌＮ２５０Ｐ
ＳＮ２５０Ｐ２９ １０　　　　　　　　　　２Ｃ ＰｈａＡｓｎＡｌａＧｌｙＨｉｓＳｅｒＡｓｌｏｏ　　
　　　　　　　　１１０ ：Ｇｌｎ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　工１ａ　Ｖａｌ　Ｓｅ１り
０　　　　　　　　　　　２０〔 ＴＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡ’）ＰｈａＬ
ｙｓＡｓｐＡｓｐＧｉｎＳｅｒエコＧｌ−ｕ　Ａｓｐ　
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９：。 ｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ
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ｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　工１ｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙ
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工１ｅ　Ｌｙｓ旧Ｐｈｉ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　ＡｓｎＬＹ
Ｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ□ 第４１図（その１） Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　ＬＹＳ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｉ　ＬＹＳ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉ
ｎ　Ｓｅｒ工１ｅＧ：Ｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　
Ｇｌ、ｕ　ＴｈｒＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　＝
Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ第４２図（その１） Ｔｑ　ＩＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａ
、ｒｇ、Ｌｙｓ工１ｅ　：Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ工ｌ
ｅ　ＶａｌＳａｒ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｉ　Ｌｙｓ　
Ｌａｕ　Ｐｈｉ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ａ
ｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　５ｉｒＰｈａ　　Ｐｈａ　　Ａ
ｓｎ　　Ｓａｒ　　Ａｓｎ　　ＬＹＳ　ＬＹｇ　Ｌ’ｌ
Ｓ　　Ａｒｇ　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｆｎａ　　Ｇｌｕ
　　ＬＹＳ　　ｂｅｕ第４３図（その１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、隣接するヒスチジン残基を含む１種または２種の親
   和性ペプチドおよびこの１種または２種の親和性ペプチ
   ドに直接的または間接的に結合される生物学的に活性な
   ポリペプチドまたは蛋白質からなることを特徴とする融
   合蛋白質。 ２、該親和性ペプチドが式 Ｒ＾１−（Ｈｉｓ）＿２＿−＿４−Ｒ＾２ （式中Ｒ＾１は、水素、１個のアミノ酸または数個のア
   ミノ酸の配列を示し、Ｒ＾２は、Ｑ、Ｑ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
   ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−またはＱ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓ
   ｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−を示し、およびＱはペプチド結合
   、１個のアミノ酸または数個の、最大３０個のアミノ酸
   の配列を示す） を有することを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質
   。 ３、該親和性ペプチドが次式 Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ、 Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ、 Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ、Ｍｅｔ−Ｈ
   ｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ、Ｍｅｔ−Ｈｉ
   ｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ、Ｍｅｔ
   −Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−
   Ｇｌｙ−Ａｒｇまたは、 Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
   ｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのペプチド配列を有する
   ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の融合
   蛋白質。 ４、１つの親和性ペプチドが該生物学的に活性なポリペ
   プチドまたは蛋白質のアミノ末端アミノ酸またはカルボ
   キシ末端アミノ酸に直接的または間接的に結合している
   ことを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに
   記載の融合蛋白質。 ５、１つの親和性ペプチドが該生物学的に活性なポリペ
   プチドまたは蛋白質のアミノ末端アミノ酸に直接的また
   は間接的に結合し、かつ他の親和性ペプチドが該生物学
   的に活性なポリペプチドまたは蛋白質のカルボキシ末端
   アミノ酸に結合していることを特徴とする請求項１ない
   し請求項３のいずれかに記載の融合蛋白質。 ６、該親和性ペプチドが固定化ニッケルイオンに錯化す
   ることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか
   に記載の融合蛋白質。 ７、該生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質がヒ
   ト免疫インターフェロンのアミノ酸配列もしくはその部
   分配列またはマウスジヒドロ葉酸塩還元酵素のアミノ酸
   配列を有することを特徴とする請求項１ないし請求項６
   のいずれかに記載の融合蛋白質。 ８、微生物的に調製された融合蛋白質であることを特徴
   とする請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の融合
   蛋白質。 ９、Ｅ．ｃｏｌｉにより調製されることを特徴とする請
   求項１ないし請求項７のいずれかに記載の融合蛋白質。 １０、均質な形態であることを特徴とする請求項１ない
   し請求項９のいずれかに記載の融合蛋白質。 １１、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の融合
   蛋白質をコードすることを特徴とする遺伝子。 １２、請求項１１に記載の遺伝子が発現制御配列に有効
   に結合されていることを特徴とする発現ベクター。 １３、グラム陰性菌内で複製可能であることを特徴とす
   る請求項１２に記載の発現ベクター。 １４、Ｅ．ｃｏｌｉ内で複製可能であることを特徴とす
   る請求項１３に記載の発現ベクター。 １５、請求項１２ないし請求項１４に記載の発現ベクタ
   ーにより形質転換されている細菌。 １６、請求項１２ないし請求項１４に記載の発現ベクタ
   ーにより形質転換されているＥ．ｃｏｌｉ株。 １７、請求項１２ないし請求項１４に記載の発現ベクタ
   ーにより形質転換されているＥ．ｃｏｌｉ　Ｍ１５株。 １８、細菌宿主を請求項１２ないし請求項１４のいずれ
   かに記載の発現ベクターにより形質転換し、該形質転換
   体を適当な生育条件下で培養し、該融合蛋白質を単離す
   ることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか
   に記載の融合蛋白質の製造方法。 １９、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の融合
   蛋白質を含む溶液を下記構造 キャリア・マトリックス−スペーサーＮＨ−（ＣＨ＿２
   ）＿ｘ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ（ＣＨ＿２ＣＯＯ＾−）
   ＿２Ｎｉ＾２＾＋（式中、Ｘは２、３または４を示す） を有する金属キレート樹脂に接触させ、該負荷された樹
   脂を洗浄液を用いて処理することにより該融合蛋白質を
   溶出させることを特徴とする該融合蛋白質の精製方法。 ２０、該キャリア・マトリックスがセファロース（Ｓｅ
   ｐｈａｒｏｓｅ＾■）ＣＬ−６Ｂであることを特徴とす
   る請求項１９に記載の方法。 ２１、該スペーサが−Ｏ−ＣＯ−または −Ｏ−ＣＨ＿２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ＿２−であること
   を特徴とする請求項１９または請求項２０に記載の方法
   。 ２２、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の融合
   蛋白質を請求項１９ないし請求項２１のいずれかに記載
   の方法により精製し、次いで該親和性ペプチドを選択的
   開裂により除去することを特徴とする生物学的に活性な
   ポリペプチドまたは蛋白質の精製方法。 ２３、該親和性ペプチドの開裂にプロテアーゼを用いる
   ことを特徴とする請求項２２記載の方法。 ２４、プロテアーゼがファクターＸａであることを特徴
   とする請求項２３記載の方法。 ２５、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の融
   合蛋白質および生理学的に適合する担体物質を含むこと
   を特徴とするワクチン。 ２６、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の融
   合蛋白質を含むことを特徴とする感染症判定用試薬。 ２７、請求項２２ないし請求項２４のいずれかに記載の
   方法による生物学的に活性なポリペプチドの精製のため
   の請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の融合蛋白
   質の使用。