KR101817253B1 - 피타제, 이를 코딩하는 핵산 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

피타제, 이를 코딩하는 핵산 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피타제, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조 및 단리에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고온 조건 하에서 피타제 활성을 가진 폴리펩티드, 및 고온에 노출된 후에도 활성을 보유하는 피타제를 제공한다. 본 발명은 추가로 위내 불안정성이 증가된 피타제를 제공한다. 본 발명의 피타제는 식량에 사용되어 피테이트가 풍부한 성분의 사료적 가치를 높일 수 있다. 본 발명의 피타제는 예를 들어, 피테이트 섭취를 돕기 위해 식품 또는 사료 또는 보충제로서 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 또는 사료는 펠릿, 액제, 분제 등의 형태일 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제는 펠릿화되는 동안 열적 변성에 대해 안정적이며, 이는 생체내 효능 및 사료에서의 활성 검출을 유지시키면서, 피타제 제품의 비용을 감소시켜 준다.

Description

피타제, 이를 코딩하는 핵산 및 그의 제조 및 사용 방법{PHYTASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THEM AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)하에 2009년 5월 21일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호("USSN") 제61/180,283호를 기초로 우선권의 이익을 주장한다. 상기 언급한 출원은 그 전문이 명백하게 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다.
EFS - WEB 을 통해 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 MPEP §1730 II.B.2.(a)(A)에 의해 허가받고 그에 기재되어 있는, USPTO EFS-WEB 서버를 통해 전자 출원된 것이며, 하기 서열 목록 전문이 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에서 참고로 인용된다. 서열 목록은 하기와 같이 전자 출원은 전자 제출된 서열(서열 번호) 목록을 포함한다. 서열 목록은 하기와 같이 전자 출원된 텍스트 문서로 확인된다:
Figure 112011101934958-pct00001
기술분야
본 발명은 피타제, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도뿐만 아니라, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조 및 단리에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고온 조건 하에서 피타제 활성을 가진 폴리펩티드, 및 고온에 노출된 후에도 활성을 보유하는 피타제를 제공한다. 본 발명은 추가로 위내 불안정성이 증가된 피타제를 제공한다. 본 발명의 피타제는 식량에 사용되어 피테이트가 풍부한 성분의 사료적 가치를 높일 수 있다. 본 발명의 피타제는 예를 들어, 피테이트 섭취를 돕기 위해 식품 또는 사료 또는 보충제로서 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 또는 사료는 펠릿, 액제, 분제 등의 형태일 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제는 펠릿화되는 동안 열적 변성에 대해 안정적이며; 이는 생체내 효능 및 사료에서의 활성 검출을 유지시키면서, 피타제 제품의 비용을 감소시켜 준다.
미네랄은 모든 생물체의 성장에 필수적 요소이다. 식이성 무기물은 식물을 비롯한 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 식물 종자는 피트산 분자의 포스페이트기와 복합체화되는 이온을 함유하고 있기 때문에, 무기물의 풍부한 공급원이다. 이와 같은 피테이트 결합 무기물은 몇몇 경우에 있어서, 목축 유기체중 소수의 종 예를 들어, 다위성 반추 동물의 식이적 요구를 충족시킬 수 있다. 따라서, 몇몇 경우에 있어서, 반추 동물은 그의 반추 위 중에 존재하는 미생물이 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 이노시톨 및 무기 포스페이트로의 전환을 촉진하는 효소를 생산하기 때문에, 무기 포스페이트 및 미네랄로 보충된 식이를 보다 적게 필요로 한다. 이 과정중 피테이트와 복합체화된 무기물이 방출된다. 그러나, 대부분의 목축 유기체 종들은 피테이트 결합 무기물을 효과적으로 이용할 수 없다. 그러므로, 예를 들어, 단위 동물(예를 들어, 돼지, 조류 및 어류)과 같은 가축의 양식에 있어서, 사료는 일반적으로 소비자인 유기체의 소화성 세균군 환경을 바꾸어 성장율을 증가시키는 무기물 및/또는 항생 물질로 보충된다.
그러므로, 다수의 경우에 있어서 피테이트의 불충분한 가수분해와 관련된 다수의 문제점 즉, 영양, 생체외 처리 단계, 건강 및 약물, 환경 보존 및 자원 관리에 관한 다수의 문제점이 존재한다. 다음은 이러한 문제점의 비제한적인 예이다.
1) 무기 미네랄을 식품에 보충하는 것이 비싸다는 점;
2) 가수분해되지 않은 피테이트의 존재는 다수의 생체외 분야에서 (예를 들어, 원치 않는 슬러지를 생성시키므로) 바람직하지 않고 오히려 문제가 된다는 점;
3) 항생제 내성 병원균의 양이 증가함으로 인하여 항생제를 식품에 보충하는 것은 인간과 동물에 의학적으로 위협이 된다는 점;
4) 흡수되지 않은 변의 미네랄을 환경 분출물로 방출시켜, 주변의 토양, 어류 양식수 및 표면수와 같은 생태계에 해를 입힌다는 점; 및
5) 다수의 잠재적인 식량중 가치있는 영양소 공급이 상당히 무제한적으로 낭비된다는 점.
결과적으로, 피테이트 함유 식량은 대다수의 유기체종에 의하여 소비됨에 따라서 결핍 영양소의 공급을 보충하기 위하여, 외인성 영양소 및/또는 피테이트 활성 공급원으로 보충되어야 할 필요가 있다.
결과적으로, 다양한 분야에서 피테이트를 효과적이고 비용면에서 효율적으로 가수분해시킬 수 있는 수단이 필요하다. 특히, 상업적으로 피테이트의 가수분해를 최적화시키는 수단이 필요하다. 특정 측면에서, 인간 및 목축 동물 소비용 피테이트 함유 식량에 영양소를 제공하는 것을 개선시키는 상업적 처리 방법을 최적화시킬 필요도 있다.
본 발명은 피타제 활성을 가진 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조 및 단리 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 고온 조건 하에서 피타제 활성을 가진 폴리펩티드, 및 고온에 노출된 후에도 활성을 보유하는 피타제를 제공한다. 본 발명의 피타제는 식량에 사용되어 피테이트가 풍부한 성분의 사료적 가치를 높일 수 있다. 본 발명의 피타제는 예를 들어, 피테이트 섭취를 돕기 위해 식품 또는 사료 또는 보충제로서 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 또는 사료는 펠릿, 정제, 환제, 액제, 분제, 분무제 등의 형태일 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제는 펠릿화되는 동안 열적 변성에 대해 안정적이며; 이는 생체내 효능 및 사료에서의 활성 검출을 유지시키면서, 피타제 제품의 비용을 감소시켜 준다.
본 발명은
(a) (i) 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하고, 서열 번호 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열로서, 여기서, 상기 폴리펩티드는 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 하나 이상의 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 핵산 서열;
(ii) 서열 번호 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드는 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 하나 이상의 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; 또는
(iii) 서열 동일성은 서열 비교 알고리즘을 이용한 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정되고, 임의로 서열 비교 알고리즘은 BLAST 버전 2.2.2 알고리즘이며, 여기서, 필터링 설정은 blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F로 설정되고, 다른 모든 옵션은 디폴트값으로서 설정되는 것인 (i) 또는 (ii)의 핵산 서열;
(b) 하나 이상의 돌연변이가 A109V, A232P, A236H, A236T, A248L, A248T, A274F, A274I, A274L, A274T, A274V, A429P, C155Y, D139Y, E113P, F147Y, F194L, G171M, G171S, G257A, G257R, G353C, G395E, G395I, G395L, G395Q, G395T, G67A, H263P, H272W, I107H, I107P, I108A, I108Q, I108R, I108S, I108Y, I174F, I174P, I427G, I427S, I427T, K151H, K151P, L126R, L146R, L146T, L150T, L150Y, L157C, L157P, L167S, L192F, L216T, L235I, L244S, L269I, L269T, L296T, L379S, L379V, L50W, M51A, M51G, M51L, N148K, N148M, N148R, N161K, N266P, N339E, N348K, N348W, P100A, P145L, P149L, P149N, P217D, P217G, P217L, P217S, P254S, P269L, P343E, P343I, P343L, P343N, P343R, P343V, Q137F, Q137L, Q137V, Q137Y, Q246W, Q247H, Q275H, Q309P, Q377R, Q381S, Q86H, S102A, S102Y, S173G, S173H, S173V, S197G, S208P, S211H, S218I, S218Y, S389H, S389V, T163P, T282H, T291V, T291W, T341D, T48F, T48H, T48I, T48K, T48L, T48M, T48V, T48W, T48Y, V162L, V162T, V191A, V422M, W265L, Y79H, Y79N, Y79S, 또는 Y79W인 (a)의 핵산;
(c) 상기 폴리펩티드가 C226D, D164R, G179R, N159V, Q275V, T163R, 또는 T349Y 중 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 (b)의 핵산; 또는
(d) 그에 전체적으로 상보성인 서열을 포함하는 단리된, 합성, 또는 재조합 핵산을 제공한다. 이들 핵산들 모두 "본 발명의 폴리펩티드"를 코딩하는 "본 발명의 핵산"이다.
한 측면에서, 서열 비교 알고리즘은 BLAST 버전 2.2.2 알고리즘이며, 여기서, 필터링 설정은 blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F로 설정되고, 다른 모든 옵션은 디폴트값으로서 설정된다.
한 측면에서, 본 발명의 핵산 서열에는 신호 서열, 프로단백질 서열, 또는 프로모터 서열을 코딩하는 동종성 핵산 서열이 존재하지 않는다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 핵산 서열은 추가로, 임의로 이종성 핵산 서열이 이종성 신호 서열, 태그, 에피토프, 또는 프로모터 서열을 코딩하는 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것인 이종성 핵산 서열로 구성된다. 또 다른 측면에서, 이종성 핵산 서열은 소포체(ER: endoplasmic reticulum) 또는 세포내막을, 또는 식물 소포체(ER) 또는 세포내막계를 표적으로 하는 N 말단 및/또는 C 말단 연장부를 포함하거나, 또는 그로 구성된 이종성 신호 서열을 코딩하거나, 이종성 서열을 제한 부위를 코딩한다. 추가의 또 다른 측면에서, 이종성 프로모터 서열은 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 세포 유형 특이성 프로모터, 또는 식물 특이성 프로모터, 또는 옥수수 특이성 프로모터를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
한 측면에서, 피타제 활성으로는 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 이노시톨 및 무기 포스페이트로의 분해의 촉매 작용, 또는 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 가수분해를 포함한다. 또 다른 측면에서, 피타제 활성으로는 사료, 식품, 또는 음료, 또는 시리얼계 동물 사료를 포함하는 사료, 식품, 또는 음료, 맥아즙, 맥주, 도우(dough), 과일 또는 야채에서 피테이트의 가수분해를 촉진하는 것; 또는 미생물 세포, 진균 세포, 포유 동물 세포 또는 식물 세포에서의 가수분해를 촉진하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제는 내열성이고, 임의로 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 37℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃ 또는 그 이상의 범위의 온도에 노출된 후에 피타제 활성을 보유한다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제는 열안정성이고, 임의로 피타제는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 37℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃ 또는 그 이상의 범위의 온도에서 활성을 보유한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 피타제는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5, pH 4.0, pH 3.5, pH 3.0 또는 그 이하의 산성 pH에서 내열성 또는 열활성이거나, 또는 피타제 폴리펩티드는 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11.0, pH 11.5, pH 12.0, pH 12.5 또는 그 이상의 pH에서 내열성 또는 열활성이다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하거나, 또는 그 안에 본 발명의 핵산(이는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함)이 포함되어 있는 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비히클, 발현 벡터, 및 클로닝 벡터를 제공하는데, 여기서, 임의로 발현 카세트, 클로닝 비히클 또는 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지 또는 인공 염색체를 포함하거나, 그러한 것이고, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함하거나, 그러한 것이고, 발현 카세트, 클로닝 비히클 또는 벡터는 박테리아 인공 염색체(BAC: bacterial artificial chromosome), 박테리오파지 P1 유래 벡터(PAC: bacteriophage P1-derived vector), 효모 인공 염색체(YAC: yeast artificial chromosome), 포유 동물 인공 염색체(MAC: mammalian artificial chromosome)를 포함하거나, 그러한 것이다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하거나, 그 안에 본 발명의 핵산(이는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함), 또는 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비히클, 발현 벡터, 또는 클로닝 벡터가 포함되어 있는 형질전환된 세포, 형질도입된 세포, 숙주 세포를 제공하는데, 여기서, 임의로 세포는 박테리아 세포, 포유 동물 세포, 진균 세포, 효모 세포 및 곤충 세포 또는 식물 세포이다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하거나, 그 안에 본 발명의 핵산(이는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함), 또는 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비히클, 발현 벡터, 또는 클로닝 벡터가 포함되어 있는 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 제공하는데, 여기서, 임의로 동물은 마우스, 래트, 염소, 토끼, 양, 돼지, 또는 소이다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하거나, 그 안에 본 발명의 핵산(이는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함), 또는 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비히클, 발현 벡터, 또는 클로닝 벡터가 포함되어 있는 트랜스제닉 식물(식물 일부, 예를 들어, 가공처리되거나, 수확된 잎, 줄기, 뿌리 또는 과실 포함), 또는 종자를 제공하는데, 여기서, 임의로 식물은 옥수수 식물, 감자 식물, 토마토 식물, 밀 식물, 오일시드 식물, 평지씨유 식물, 대두 식물 또는 담배 식물이고, 임의로 종자는 옥수수씨, 밀알, 오일시드, 평지씨, 대두 종자, 팜핵, 해바라기씨, 참깨씨, 땅콩 또는 담배 식물 종자이다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 종자 또는 식물로부터 생산된 식물 또는 종자, 본 발명의 식물 또는 종자는 작물 식물, 예를 들어, 옥수수, 알팔파, 해라바기, 브라씨카(Brassica), 대두, 사탕수수, 목화, 홍화, 땅콩, 수수, 밀, 귀리, 호밀, 기장, 보리, 벼, 침엽수, 콩과 식물 작물, 예를 들어, 완두, 콩과 식물 및 대두, 전분성 괴경/뿌리, 예를 들어, 감자, 고구마, 카사바, 타로, 칸나 및 사탕무 등일 수 있거나, 식물은 옥수수 식물, 감자 식물, 토마토 식물, 밀 식물, 오일시드 식물, 평지씨 식물, 대두 식물 또는 담배 식물, 또는 동물용 또는 반추 동물용 여물 및/또는 사료 식물일 수 있거나, 식물은건초, 옥수수, 기장, 대두, 밀, 메밀, 보리, 알팔파, 호밀, 일년생 목초, 수수, 수단 그래스, 벨트 그래스 또는 버펠 그래스인 여물 또는 사료 식물이거나, 또는 그를 포함할 수 있거나; 종자는 옥수수씨, 밀알, 오일시드, 평지씨, 대두 종자, 팜핵, 해바라기씨, 참깨씨, 땅콩 또는 땅콩 종자, 알팔파 종자, 목화씨, 홍화 종자, 수수 종자, 귀리 커넬, 호밀 종자, 기장 종자, 보리 종자, 쌀알, 완두 종자, 또는 담배 식물 종자이거나, 식물은 옥수수, 알팔파, 해바라기, 브라씨카, 대두, 사탕수수, 목화, 홍화, 땅콩, 수수, 밀, 귀리, 호밀, 기장, 보리, 벼, 침엽수, 완두, 콩, 대두, 감자, 고구마, 카사바, 타로, 칸나 또는 사탕무이다.
본 발명은 본 발명의 핵산에 대해 안티센스이고, 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 하나 이상의 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 핵산을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 여기서, 상기 임의로 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 10 내지 50개, 약 20 내지 60개, 약 30 내지 70개, 약 40 내지 80개, 약 60 내지 100개, 또는 약 50 내지 150개 염기인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 안티센스 서열을 포함하는 리보자임 및/또는 iRNA(예를 들어, siRNA 또는 miRNA)를 제공한다.
본 발명은 세포에 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하거나, 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 세포에서 피타제 메세지의 번역을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명은
(a) (i) 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열로서, 여기서, 폴리펩티드는 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 하나 이상의 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 아미노산 서열; 또는
(iii) 서열 동일성이 서열 비교 알고리즘을 이용한 분석 또는 시각적 조사에 의해 결정되는 것인 (i) 또는 (ii)의 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 돌연변이가 A109V, A232P, A236H, A236T, A248L, A248T, A274F, A274I, A274L, A274T, A274V, A429P, C155Y, D139Y, E113P, F147Y, F194L, G171M, G171S, G257A, G257R, G353C, G395E, G395I, G395L, G395Q, G395T, G67A, H263P, H272W, I107H, I107P, I108A, I108Q, I108R, I108S, I108Y, I174F, I174P, I427G, I427S, I427T, K151H, K151P, L126R, L146R, L146T, L150T, L150Y, L157C, L157P, L167S, L192F, L216T, L235I, L244S, L269I, L269T, L296T, L379S, L379V, L50W, M51A, M51G, M51L, N148K, N148M, N148R, N161K, N266P, N339E, N348K, N348W, P100A, P145L, P149L, P149N, P217D, P217G, P217L, P217S, P254S, P269L, P343E, P343I, P343L, P343N, P343R, P343V, Q137F, Q137L, Q137V, Q137Y, Q246W, Q247H, Q275H, Q309P, Q377R, Q381S, Q86H, S102A, S102Y, S173G, S173H, S 173V, S197G, S208P, S211H, S218I, S218Y, S389H, S389V, T163P, T282H, T291V, T291W, T341D, T48F, T48H, T48I, T48K, T48L, T48M, T48V, T48W, T48Y, V162L, V162T, V191A, V422M, W265L, Y79H, Y79N, Y79S, 또는 Y79W인 (a)의 폴리펩티드; 또는
(c) 폴리펩티드가 C226D, D164R, G179R, N159V, Q275V, T163R, 또는 T349Y 중 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 (b)의 폴리펩티드를 포함하는, 단리된, 합성 또는 재조합 피타제 폴리펩티드를 제공한다.
한 측면에서, 피타제 활성으로는 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 이노시톨 및 무기 포스페이트로의 분해의 촉매 작용, 또는 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 가수분해를 포함한다. 또 다른 측면에서, 피타제 활성으로는 사료, 식품, 또는 음료, 또는 시리얼계 동물 사료를 포함하는 사료, 식품, 또는 음료, 맥아즙, 맥주, 도우, 과일 또는 야채에서 피테이트의 가수분해를 촉진하는 것; 또는 미생물 세포, 진균 세포, 포유 동물 세포 또는 식물 세포에서의 가수분해를 촉진하는 것을 포함한다.
본 발명은 그의 활성이 내열성인 피타제 활성을 가지고, 임의로 폴리펩티드가 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃ 또는 그 이상의 범위의 온도에 노출된 후에도 피타제 활성을 보유하는 것인 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명에 따른 내열성 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃ 또는 그 이상의 범위의 온도에 노출된 후에도 활성, 예를 들어, 피타제 활성을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 내열성 폴리펩티드는 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 약 pH 7.0, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9.0, 약 pH 9.5, 약 pH 10.0, 약 pH 10.5, 약 pH 11.0, 약 pH 11.5, 약 pH 12.0 이상인 pH하에 상기 기술된 범위의 온도에 노출된 후에도 활성, 예를 들어, 피타제 활성을 보유할 수 있다.
본 발명은 그의 활성이 열안정성인 피타제 활성을 가진 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 열안정성일 수 있다. 본 발명에 따른 열안정성 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 37℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃ 또는 그 이상의 범위의 온도를 포함하는 조건 하에서 결합 및/또는 효소 활성, 예를 들어, 피타제 활성을 보유할 수 있다. 본 발명에 따른 열안정성 폴리펩티드는 약 -100℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -40℃ 내지 약 -20℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 37℃ 내지 약 45℃, 약 45℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 70℃ 내지 약 75℃, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 105℃, 약 105℃ 내지 약 110℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 또는 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 106℃, 107℃, 108℃, 109℃, 110℃, 111℃, 112℃, 113℃, 114℃, 115℃ 또는 그 이상의 범위의 온도에서 활성, 예를 들어, 피타제 활성을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 열안정성 폴리펩티드는 약 pH 3.0, 약 pH 3.5, 약 pH 4.0, 약 pH 4.5, 약 pH 5.0, 약 pH 5.5, 약 pH 6.0, 약 pH 6.5, 약 pH 7.0, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9.0, 약 pH 9.5, 약 pH 10.0, 약 pH 10.5, 약 pH 11.0, 약 pH 11.5, 약 pH 12.0 이상인 pH하에 상기 기술된 범위의 온도에서 활성, 예를 들어, 피타제 활성을 보유할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 아미노산 서열을 포함하고, (a) 동종성 신호 서열(리더 펩티드) 또는 프로단백질 서열이 결여되어 있거나; (b) 신호 서열(리더 펩티드)이 결여되어 있고, 이종성 신호 서열(리더 펩티드)을 추가로 포함하거나; (c) (a) 또는 (b)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이종성 서열을 추가로 포함하며, 여기서, 임의로 이종성 서열은 이종성 신호 서열, 또는 태그 또는 에피토프를 포함하거나, 그로 구성되는 것이거나, 이종성 서열이 식별 펩티드를 포함하는 것인, 단리된, 합성 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 한 측면에서, 이종성 신호 서열은 소포체(ER) 또는 세포내막을, 또는 식물 소포체(ER) 또는 세포내막계를 표적으로 하는 N 말단 및/또는 C 말단 연장부를 포함하거나, 또는 그로 구성되거나, 또는 이종성 아미노산 서열이 효소 표적 부위를 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 추가로 신호 서열(리더 서열 또는 리더 펩티드)와 효소 사이에 추가의 아미노산 잔기를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 임의의 폴리펩티드의 피타제 활성이 약 37℃에서 약 100 내지 약 1000 유닛/mg 단백질; 또는 약 500 내지 약 750 유닛/mg 단백질; 또는 약 37℃에서 약 500 내지 약 1200 유닛/mg 단백질; 또는 약 37℃에서 약 750 내지 약 1000 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함한다(가진다). 한 측면에서, 내열성 피타제 활성은 약 37℃ 온도에 노출된 후 약 100 내지 약 1000 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함하거나; 열안정성 피타제 활성은 약 500 내지 약 750 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함하거나; 열안정성 피타제 활성은 37℃에서 약 500 내지 약 1200 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함하거나; 열안정성 피타제 활성은 37℃에서 약 750 내지 약 1000 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함한다. 한 측면에서, 열안정성 피타제 활성은 약 37℃ 온도를 포함하는 조건 하에서 약 100 내지 약 1000 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함하거나; 열안정성 피타제 활성이 약 500 내지 약 750 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함하거나; 열안정성 피타제 활성이 37℃에서 약 500 내지 약 1200 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함하거나; 열안정성 피타제 활성이 37℃에서 약 750 내지 약 1000 유닛/mg 단백질 범위의 비활성을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나, 또는 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하고, 여기서, 임의로 글리코실화가 N 결합 글리코실화 또는 O 결합 글리코실화이고, 임의로 폴리펩티드가 효모 세포에서 발현된 후에 글리코실화되고, 여기서, 효소는 임의로 P. 파스토리스(P. pastoris) 또는 S. 폼베(S. pombe)이다.
한 측면에서, 폴리펩티드는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5, pH 4.0, pH 3.5, pH 3.0 또는 그 이하(보다 큰 산성 조건)를 포함하는 조건 하에서 피타제 활성을 보유한다. 별법으로, 본 발명의 폴리펩티드는 약 pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11.0, pH 11.5, pH 12.0, pH 12.5 또는 그 이상(보다 큰 염기성 조건) 하에서 피타제 활성을 보유할 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 단백질 제제로서, 여기서, 단백질 제제는 액제, 슬러리제, 분제, 스프레이제, 현탁제, 동결건조된 조성물/조제물, 고체, 겔탑, 환제, 임플란트, 겔제; 또는 약학적 제제, 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 그의 식이 보충제를 포함하는 것인 단백질 제제를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체를 제공하고; 한 측면에서, 이종이량체는 제2 도메인을 포함하고, 여기서, 임의로 제2 도메인이 폴리펩티드이고, 이종이량체가 융합 단백질이고, 임의로 제2 도메인이 에피토프 또는 태그이다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 고정화된 폴리펩티드를 제공하며; 여기서, 고정화된 폴리펩티드는 본 발명의 동종이량체 또는 이종이량체를 포함할 수 있고, 여기서, 임의로, 폴리펩티드는 세포, 소포체, 리포좀, 필름, 막, 금속, 수지, 중합체, 세라믹, 유리, 미소전극, 흑연 입자, 비드, 겔, 플레이트, 어레이, 모세관, 결정, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 응집체, 표면, 또는 다공성 구조물 상에, 또는 그 내부에 고정화된 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 고정화된 폴리펩티드를 포함하는 어레이(예를 들어, 마이크로어레이)를 제공하며, 여기서, 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 이종이량체, 또는 본 발명의 핵산, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체를 제공하고, 여기서, 임의로 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체이다. 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 하이브리도마를 제공한다.
본 발명은 (a) 본 발명의 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드가 발현될 수 있도록 하는 조건 하에서 (a)의 핵산을 발현시켜 재조합 폴리펩티드를 제조하는 단계를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 임의로 상기 방법은 추가로 숙주 세포를 (a)의 핵산으로 형질전환시킨 후, (a)의 핵산을 발현시킴으로써 형질전환된 세포에서 재조합 폴리펩티드를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적인 실시양태에서, 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결시킨 후, 숙주 세포내로 형질전환시킨다.
본 발명은 (a) 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) 피타제 기질를 제공하는 단계; 및 (c) (a)의 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체를 (b)의 기질과 접촉시키고, 기질 양의 증가 또는 반응 생성물 양의 감소를 검출하며, 여기서, 기질의 양이 감소하였거나, 또는 반응 생성물의 양이 증가하였다면, 이를 통해 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 검출하는 것인 단계를 포함하는, 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) 테스트 기질을 제공하는 단계; 및 (c) (a)의 폴리펩티드를 (b) 테스트 기질을 접촉시키고, 기질 양의 증가 또는 반응 생성물 양의 감소를 검출하며, 여기서, 기질의 양이 감소하였거나, 또는 반응 생성물의 양이 증가하였다면, 이를 통해 테스트 기질을 피타제 기질로서 확인하는 것인 단계를 포함하는, 피타제 기질을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 핵산이 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 허용하는 조건 하에서 핵산 또는 핵산을 포함하는 벡터를 발현시키며, 여기서, 핵산은 본 발명의 서열을 포함하는 것인 단계; (b) 폴리펩티드를 테스트 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (c) 테스트 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 측정하여 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 확인하는 단계를 포함하는, 화합물이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 본 발명의 피타제 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) 테스트 화합물을 제공하는 단계; (c) (a)의 폴리펩티드를 (b)의 테스트 화합물과 접촉시키고, 피타제의 활성을 측정하며, 여기서, 테스트 화합물의 부재하에서 측정된 피타제 활성과 비교하여 테스트 화합물의 존재하에서 측정된 피타제 활성이 변하였다면, 이를 통해 테스트 화합물이 피타제 활성를 조절한다는 것을 확인하며, 여기서, 임의로 피타제 활성은 피타제 기질를 제공하고, 기질 양의 증가 또는 반응 생성물 양의 감소를 검출함으로써 측정되고, 임의로, 테스트 화합물을 사용하지 않았을 때의 기질 또는 반응 생성물의 양과 비교하여, 테스트 화합물을 사용하였을 때의 기질의 양이 감소하였거나, 또는 반응 생성물의 양이 증가하였다면, 이를 통해 테스트 화합물이 피타제 활성의 활성제인 것으로 확인되고, 임의로, 테스트 화합물을 사용하지 않았을 때의 기질 또는 반응 생성물의 양과 비교하여, 테스트 화합물을 사용하였을 때의 기질의 양이 증가하였거나, 또는 반응 생성물의 양이 감소하였다면, 이를 통해 테스트 화합물이 피타제 활성의 억제제인 것으로 확인되는 단계를 포함하는, 피타제 활성의 조절제를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 제공하며, 여기서, 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열, 또는 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계; (b) 이노시톨-헥사포스페이트를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 (c) (a)의 폴리펩티드가 이노시톨-헥사포스페이트를 이노시톨 및 무기 포스페이트로 가수분해시킬 수 있는 조건 하에서 (a)의 폴리펩티드를 (b)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 임의로 상기 조건은 약 37℃ 내지 약 70℃, 약 50℃ 내지 약 80℃, 또는 약 60℃ 내지 약 90℃의 온도를 포함하고, 임의로 조성물은 피트산을 포함하는 것인, 이노시톨-헥사포스페이트를 이노시톨 및 무기 포스페이트로 가수분해시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 피타제 활성을 가진 폴리펩티드,를 제공하며; 여기서, 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열, 또는 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계; (b) 식물성 오일을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 (c) (a)의 폴리펩티드가 이노시톨-무기 포스페이트 결합을 절단할 수 있는 조건 하에서 (a)의 폴리펩티드를 (b)의 식물성 오일과 접촉시켜 식물성 오일을 탈검시키는 단계를 포함하는, 오일을 탈검시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 피타제 효소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키고, 여기서, 피타제는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계; (b) 피타제 효소가 발현될 수 있는 조건 하에서 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 식이 보충제로 적합한 조성물로 전환시키거나, 배양된 식물, 식물 부분 또는 식물 세포를 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 식이 보충제에 첨가하여 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 식이 보충제를 제조하는 단계를 포함하고, 여기서, 임의로 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 포함되어 있고, 임의로 벡터는 식물 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 조절 서열을 포함하고, 임의로 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 식이 보충제가 동물용이고, 임의로, 여기서, 동물은 단위 동물이고, 임의로 동물이 반추 동물이고, 임의로 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 식이 보충제가 전달 매트릭스, 펠릿, 정제, 겔제, 액제, 스프레이제, 분쇄형 곡물 또는 분제 형태인, 사료 또는 식품, 또는 사료 또는 식품 보충제, 또는 식품 또는 사료 첨가제, 또는 영양 보충제, 또는 식이 보충제를 제조하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 피타제 효소는 펠릿화 조건 하에서 내열성 또는 열안정성을 제공하도록 피타제 효소가 글리코실화되고, 임의로 곡물 배아 및 피타제 효소를 포함하는 혼합물을 펠릿화하여 입자를 얻음으로써 전달 매트릭스를 형성하고, 임의로, 증기의 적용을 포함하는 조건 하에서 펠릿을 제조하고, 임의로, 약 5분 동안 80℃를 초과하는 온도를 적용하는 것을 포함하는 조건 하에서 펠릿을 제조하고, 임의로, 펠릿이 적어도 350 내지 약 900 유닛/mg 효소의 비활성을 포함하는 피타제 효소를 포함한다.
본 발명은 식용 담체 및 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 식용 전달 매트릭스를 제조하고, 여기서, 매트릭스는 수성 매질에 놓이게 되면 피타제 효소를 쉽게 분산시키고 방출시키는 것인 단계; 및 (b) 식용 효소 전달 매트릭스를 동물 또는 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 임의로 식용 전달 매트릭스가 과립상 식용 담체를 포함하고, 임의로 식용 전달 매트릭스가 펠릿, 정제, 겔제, 액제, 스프레이 또는 분제 형태이고, 임의로 식용 담체가 곡물 배아, 건초, 알팔파, 티모시, 콩깍지, 해바라기씨 가루, 옥수수 가루, 콩가루 및 밀가루로 구성된 군으로부터 선택되는 담체를 포함하고, 임의로 식용 담체가, 오일이 제거된 곡물 배아를 포함하는 것인, 피타제 효소 보충제를 동물 또는 인간에게 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 동종이량체 또는 이종이량체를 포함하고, 여기서, 임의로 폴리펩티드는 글리코실화된 것이고, 임의로 피타제 활성은 내열성 또는 열안정성인, 동물 또는 인간용 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 식이 보충제를 제공한다. 한 측면에서, 한 측면에서, 식품, 사료, 식품 보충제, 사료 보충제, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 영양 보충제 또는 식이 보충제는 펠릿, 환제, 정제, 캡슐제, 겔제, 겔탑, 스프레이제, 분제, 동결건조된 제제, 약학적 제제, 액체 형태로, 슬러리제, 현탁제로서 제조되거나, 또는 중합체 코팅된 첨가제를 사용하여 제조되거나, 또는 과립상 형태로 제조되거나, 또는 분무 건조에 의해 제조된다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 동종이량체 또는 이종이량체를 포함하고; 여기서, 임의로 폴리펩티드는 글리코실화된 것이고, 임의로 피타제 활성은 내열성 또는 열안정성인, 식용 또는 흡수성 효소 전달 매트릭스(매트릭스들)를 제공한다. 한 측면에서, 식용 전달 매트릭스가 펠릿을 포함하거나, 식용 또는 흡수성 효소 전달 매트릭스가 펠릿, 환제, 정제, 캡슐제, 겔제, 겔탑, 스프레이제, 분제, 동결건조된 제제, 약학적 제제, 액체 형태, 현탁제 또는 슬러리로서 제조되거나, 또는 중합체 코팅된 첨가제를 사용하여 제조되거나, 또는 과립상 형태로 제조되거나, 또는 분무 건조에 의해 제조된다.
본 발명은 과립상의 식용 또는 흡수성 담체 및 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 동종이량체 또는 이종이량체를 포함하고; 여기서, 임의로 폴리펩티드는 글리코실화된 것이고, 임의로 피타제 활성은 내열성 또는 열안정성인 것이고, 임의로 펠릿은 펠릿 형태로, 환제, 정제, 캡슐제, 겔제, 겔탑, 스프레이제, 분제, 동결건조된 제제, 약학적 제제, 액체 형태로서, 현탁제 또는 슬러리로서 제조되거나, 또는 중합체 코팅된 첨가제를 사용하여 제조되거나, 또는 과립상 형태로 제조되거나, 또는 분무 건조에 의해 제조된 것인 식용 또는 흡수성 펠릿을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 동종이량체 또는 이종이량체를 포함하는 가루, 예를 들어, 콩가루로서, 임의로, 가루, 예를 들어, 콩가루는 펠릿, 환제, 정제, 캡슐제, 겔제, 겔탑, 스프레이제, 분제, 동결건조된 제제, 약학적 제제, 액체 형태로서, 현탁제 또는 슬러리로서 제조되거나, 또는 중합체 코팅된 첨가제를 사용하여 생산된 것인 가루, 예를 들어, 콩가루를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 피타제 폴리펩티드를 글리코실화시켜 동물의 소화계에서의 효소 불활성화에 대한 피타제 폴리펩티드의 내성을 증가시키는 단계를 포함하고, 임의로 글리코실화는 N 결합 글리코실화이고, 임의로 피타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포에서의 생체내 발현 결과로서 피타제 폴리펩티드가 글리코실화된 것이고, 임의로 세포가 진핵 세포이고, 임의로 진핵 세포가 진균 세포, 식물 세포, 또는 포유 동물 세포인, 동물의 소화계에서의 효소 불활성화에 대한 피타제 폴리펩티드의 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 피타제 활성을 가진 폴리펩티드을 제공하고; 여기서, 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계; (b) 옥수수 침지액 또는 수수 침지액을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 (c) (a)의 폴리펩티드가 이노시톨-무기 포스페이트 결합을 절단할 수 있는 조건 하에서 (a)의 폴리펩티드 및 (b)의 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 옥수수 및 수수 커넬을 가공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이종이량체를 포함하며; 여기서, 임의로 폴리펩티드는 글리코실화된 것이고, 피타제 활성이 내열성 또는 열안정성인 약학적 또는 식이 제제로서, 임의로 약학적 또는 식이 제제는 펠릿, 환제, 정제, 캡슐제, 겔탑, 스프레이제, 분제, 로션 또는 액체 형태로 제제화되거나, 중합체 코팅된 첨가제를 사용하여 또는 임플란트로서 생산되거나, 또는 과립상 형태로 제조되거나, 또는 분무 건조에 의해 제조된 것인 약학적 또는 식이 제제를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이종이량체; 및 (b) 표 2에 기재되어 있는 임의의 생성물, 또는 표 1에 열거되어 있는 조성물 중 임의의 것을 포함하는 조성물로서; 여기서, 임의로 폴리펩티드는 글리코실화된 것이고, 임의로 피타제 활성이 내열성 또는 열안정성인 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이종이량체를 포함하고; 여기서, 임의로 폴리펩티드는 글리코실화된 것이고, 임의로 피타제 활성이 내열성 또는 열안정성인, 내장식 인스턴트 음식 유닛(MRE: meal Ready-to-Eat), 음용수 또는 가수분해제를 제공한다.
본 발명은 골다공증을 개선하는(그의 진행을 늦추거나, 그를 치료 또는 예방하는) 것을 필요로 하는 개체에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 이종이량체를 포함하는 조성물을 유효량(유효 투여량)으로 투여하는 단계를 포함하며; 여기서, 임의로 폴리펩티드가 글리코실화된 것이고, 임의로 피타제 활성이 내열성 또는 열안정성인 골다공증을 개선하는(그 진행을 늦추거나, 그를 치료 또는 예방하는) 방법을 제공한다.
본 발명은 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 제공하는 단계, 및 폴리펩티드를 코딩하는 서열에서 하나 이상의 아미노산을 아르기닌, 히스티딘, 프롤린, 루신, 세린, 트레오닌, 또는 티로신으로 치환하는 단계를 포함하는, 피타제의 위내 불안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 하기 실시예 2에서 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 상기 방법에서 사용하기 위한 예를 들어, 본 발명의 서열 번호 2 또는 다른 피타제와 같은 예시적인 피타제를 제공한다.
본 발명은 (a) 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) (a)의 폴리펩티드로부터 변이체를 생성하며; 여기서, 각 변이체는 (a)의 폴리펩티드로부터 단일 아미노산 변경을 가지는 것인 단계; (c) 2개의 상이한 특성에 대해 (b)의 변이체를 스크리닝하는 단계; (d) (c)의 원하는 변이체를 선택하고, 각각의 선택된 변이체에서 단일 아미노산 변경을 확인하는 단계; (e) (d)의 선택된 단일 아미노산 변경의 상이한 조합을 포함하는 새로운 변이체를 생성하는 단계; (f) 2개의 변경된 특성에 대해 (c)의 변이체를 스크리닝하는 단계; 및 (g) 2개의 변경된 특성을 가진 (f)의 원하는 변이체를 선택하는 단계를 포함하는, 하기 실시예 2에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 효소의 2개 이상의 상이한 특성을 변경하는 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) (a)의 폴리펩티드로부터 변이체를 생성하며; 여기서, 각 변이체는 (a)의 폴리펩티드로부터 단일 아미노산 변경을 가지는 것인 단계; (c) 1개의 변경된 특성에 대해 (b)의 변이체를 스크리닝하는 단계; (d) 또 다른 변경된 특성에 대해 (b)의 변이체를 스크리닝하는 단계; (e) (c) 및 (d)의 원하는 변이체를 선택하고, 각각의 선택된 변이체에서 단일 아미노산 변경을 확인하는 단계; (f) (c) 및 (d)의 선택된 단일 아미노산 변경의 상이한 조합을 포함하는 새로운 변이체를 생성하는 단계; (g) 2개의 변경된 특성에 대해 (f)의 변이체를 스크리닝하는 단계; 및 (h) 2개의 변경된 특성을 가진 (g)의 원하는 변이체를 선택하는 단계를 포함하는, 효소의 2개 이상의 상이한 특성을 변경하는 대체 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 예를 들어, GSSM 진화, 진리어셈블리 진화, 및/또는 TMCA 진화에 의해 변이체를 생성하는 예시적인 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) (a)의 폴리펩티드로부터 변이체 피타제를 생성하며, 여기서, 각 변이체는 (a)의 폴리펩티드로부터 단일 아미노산 변경을 가지는 것인 단계; (c) 변경된 위내 안정성 및 변경된 내열성에 대해 (b)의 변이체 피타제를 스크리닝하는 단계; (d) 원하는 위내 안정성 및 내열성을 가진 (c)의 변이체를 선택하고, 각각의 선택된 변이체에서 단일 아미노산 변경을 확인하는 단계; (e) (d)의 선택된 단일 아미노산 변경의 상이한 조합을 포함하는 새로운 변이체 피타제를 생성하는 단계; (f) 변경된 위내 안정성 및 변경된 내열성에 대해 (e)의 변이체를 스크리닝하는 단계; 및 (g) 원하는 위내 안정성 및 내열성을 가진 (f)의 변이체를 선택하는 단계를 포함하는, 실시예 2에 상세히 기술한 바와 같이, 피타제의 내열성으로부터 위내 안정성을 분리해 내는 방법을 제공한다. (a) 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 제공하는 단계; (b) (a)의 폴리펩티드로부터 변이체 피타제를 생성하며, 여기서, 각 변이체는 (a)의 폴리펩티드로부터 단일 아미노산 변경을 가지는 것인 단계; (c) 변경된 위내 안정성에 대해 (b)의 변이체 피타제를 스크리닝하는 단계; (d) 변경된 내열성에 대해 (b)의 변이체 피타제를 스크리닝하는 단계; (e) 원하는 위내 안정성 또는 내열성을 가진 (c) 및 (d)의 변이체를 선택하고, 각각의 선택된 변이체에서 단일 아미노산 변경을 확인하는 단계; (f) (c) 및 (d)의 선택된 단일 아미노산 변경의 상이한 조합을 포함하는 새로운 변이체 피타제를 생성하는 단계; (f) 변경된 위내 안정성 및 변경된 내열성에 대해 (f)의 변이체를 스크리닝하는 단계; 및 (h) 원하는 위내 안정성 및 내열성을 가진 (g)의 변이체를 선택하는 단계를 포함하는, 피타제의 내열성으로부터 위내 안정성을 분리해 내는 대체 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 예를 들어, GSSM 진화, 진리어셈블리 진화, 및/또는 TMCA 진화에 의해 변이체를 생성하는 예시적인 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 방법에서 사용하기 위한 예를 들어, 본 발명의 서열 번호 2 또는 다른 피타제와 같은 예시적인 피타제를 제공한다. 본 발명은 위내 안정성을 내열성으로부터 분리해 내는 예시적인 돌연변이, 예를 들어, 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 돌연변이, 또는 그의 임의의 조합을 제공한다.
본 발명은 하기 실시예 2에 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 위내 불안정성 및 내열성이고, 10분 미만, 8분 미만, 6분 미만, 4분 미만, 또는 2분 미만인 시간 이내에 인공 위액(SGF: simulated gastric fluid) 중에서 완전히 분해되며, 약 75℃ 내지 약 85℃, 약 85℃ 내지 약 90℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 또는 약 80℃ 내지 약 86℃ 범위의 온도에 노출된 후에도 활성을 보유하는 것인 피타제를 제공하며, 예를 들어, 본 발명의 피타제는 하기 실시예 2에 상세히 기술되어 있다. 한 측면에서, 본 발명의 위내 불안정성 및 내열성 피타제는 4분 미만인 시간 이내에 인공 위액(SGF) 중에서 완전히 분해되고, 약 80℃ 내지 약 86℃ 범위의 온도에 노출된 후에도 활성을 보유한다.
본 발명의 하나 이상의 측면에 대한 상세한 설명은 하기 첨부 도면과 상세한 설명에 기술되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.
본원에서 인용되는 모든 공개 문헌, 특허, 특허 출원, 진뱅크(GenBank) 서열 및 ATCC 기탁물은 모든 목적을 위해 본원에서 명백하게 참고로 인용된다.
하기 도면은 본 발명의 측면을 설명하고, 특허청구범위에 대해 포함되는 본 발명의 범주를 제공하고자 하는 것은 아니다.
도 1은 30분 동안 다양한 온도에서 열 처리한 후, 본 발명의 예시적인 단일 돌연변이 서열을 가진, 본 발명의 정제된 폴리펩티드의 잔여 활성을 요약한 것을 도시한 것이다; 여기서, 본원에서 상세히 기술되는 바와 같이, 피타제 활성은 형광 기질을 사용하여 분석하였고, 그 보유율을 각각의 상응하는 비처리 샘플의 보유율과 비교하였다.
도 2는 써모사이클러 상에서 열 처리한 후, "조합된" 단일 잔기 돌연변이를 포함하는 본 발명의 정제된 폴리펩티드(다중 돌연변이를 포함하는 피타제)의 잔여 활성에 관한 요약을 도시한 것이며; 여기서, 도 1에 요약되어 있고, 하기 실시예 1에서 상세히 기술하는 바와 같이, 피타제 활성은 형광 기질을 사용하여 분석되고, 그 비율은 각각의 상응하는 비처리군 샘플의 비율과 비교하였다.
도 3은 하기 실시예 1에서 상세히 기술하는 바와 같이, 도 1의 그래프 작성을 위해 사용되는 데이터를 그래프로 요약해 놓은 것이다.
도 4는 모체 피타제 서열 번호 2의 서열, 및 하기에서 상세히 기술하는 바와 같이, 진리어셈블리(GeneReassembly)™ 라이브러리 구성물을 위해 선택된 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM: gene site saturation mutagenesis)로 생성된 서열 변형을 도시한 것이다.
도 5는 본원에서 상세히 기술되는 바와 같이, 모체 서열 번호 2에 다중 잔기 변형을 가진 예시적인 피타제를 도시한 것이다.
도 6은 본원에서 상세히 기술되는 바와 같이, 모체 서열 번호 2에 대하여 단일 잔기 변형을 가진 예시적인 피타제를 도시한 것이다.
도 7은 하기 실시예 1에서 상세히 기술되는 바와 같이, 형광 기질인 4-메틸움벨리페릴 포스페이트(MeUMB-포스페이트)를 사용하여 실시한, 본 발명의 예시적인 피타제 분석법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 8은 하기 실시예 1에서 상세히 기술되는 바와 같이, 형광 기질인 MeUMB-포스페이트를 사용하여 실시한, 본 발명의 예시적인 피타제 분석법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 9는 하기 실시예 1에서 상세히 기술되는 바와 같이, 도 8에 기술되어 있는 바와 같은, 예시적인 라이브러리 스크린에 대한 프로토콜을 개략적으로 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 피타제 사용을 도입할 수 있는 예시적인 알콜 공정을 도시한 것이다.
도 11a 및 11b는 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, appA 피타제(진뱅크 수탁 번호 M58708), appA-서열 번호 2 중간체, 및 서열 번호 2의 열안정성 및 SGF 불안정성을 요약한 것을 도시한 것이다.
도 12는 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 모체 피타제(서열 번호 2)의 정제된 hig 태깅된 버전 및 his 태깅되지 않은 버전에 관한 SGF 분석에 의해 측정된, his 태그가 SGF 안정성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 13은 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 글리코실화가 일어나지 않은 서열 번호 2 변이체(변이체 GLY1 - GLY4) 및 2개의 서열 번호 2 대조군의 내열성을 도시한 것이다.
도 14는 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 서열 번호 2-HIS 및 서열 번호 2-6X 변이체의 SGF 안정성을 도시한 것이다.
도 15는 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 서열 번호 2의 GSSM 진화로부터 얻은 선택된 돌연변이체의 SGF 활성 손실을 도시한 것이다.
도 16은 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 상이한 아미노산이 SGF 불안정성에 미치는 효과를 도시한 것이다.
도 17은 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, SGF 돌연변이에 대한 핫 스폿을 도시한 것이다.
도 18은 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 상이한 펩신 용량에서 서열 번호 2 HIS 및 변이체 O의 SGF 불안정성을 도시한 것이다.
도 19는 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 서열 번호 2 HIS 및 변이체 O의 반감기를 도시한 것이다.
도 20은 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, SGF 불안정성 피타제 변이체의 잔여 활성을 도시한 것이다.
도 21은 하기 실시예 2에서 상세히 기술되는 바와 같이, 서열 번호 2와 비교한, SGF 불안정성 변이체 피타제의 비활성을 도시한 것이다.
여러 도면에서의 유사 참조 기호가 유사 구성 요소를 나타낸다.
본 발명은 상기 기술한 바와 같은, 서열 번호 2에의 특정 잔기 변형을 포함하는 피타제 폴리펩티드, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 상기 기술한 바와 같은, 서열 번호 1에의 특정 염기쌍 변형을 포함하는 것 포함)뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 사용 방법에 관한 것이다. 도 6은 모체 서열 번호 2에의 단일 잔기 변형을 가진 예시적인 피타제를 도시한 것이고, 도 5는 모체 서열 번호 2에의 다중 잔기 변형을 가진 예시적인 피타제를 도시한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 피타제 활성은 임의의 피타제 활성을 가진 효소, 예를 들어, 피테이트의 분해를 촉진할 수 있는 효소, 예를 들어, 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 이노시톨 및 무기 포스페이트로의 분해의 촉매 활성과 같은 활성을 가진 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 피타제는 내열성 및 열저항성 효소를 포함한다.
본 발명의 피타제 및 피타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다수의 공정, 방법 및 조성물에 있어서 유용하다. 예를 들어, 피타제는 상기 기술한 바와 같이, 동물 사료 및 사료 보충제, 그리고 환경 또는 샘플로부터 과잉 피테이트를 분해 또는 제거하는 처리법에 사용될 수 있다. 상기 기술한 바를 포함하는, 본원에 교시된 바를 기초로 하는 다른 용도는 당업자에게 명백할 것이다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제 분자는-단독으로 또는 다른 시약(프로테아제, 아밀라제 등과 같은 효소를 포함하나, 이에 한정되지는 않음)과 함께- 식량 가공, 예를 들어, 원치않는 옥수수 슬러지 생성을 방지하기 위한 공정, 및 피테이트의 가수분해가 필요한 다른 분야에 사용된다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제 분자는 특히 가수분해되지 않은 피테이트가 세포외 가공(예를 들어, 식량 가공을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아님) 수행시 문제를 일으키는 경우에 이 가수분해되지 않은 피테이트를 제거 또는 감소시키는데 사용된다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제 분자는, 옥수수 및 사탕수수 커넬을 가공하여 경질의 커넬을 물에 침지시켜 이를 연화시키는 단계를 포함하는, EP 0321004-B1(Vaara et al.)에 기술된 바와 같은 방법에 사용된다. 이 과정에서 침출된 수용성 물질은 옥수수 침지액의 일 성분이 되며, 이는 증발에 의하여 농축된다. 옥수수 침지액중 가수분해되지 않은 피트산(대부분 칼슘 및 마그네슘 염의 형태임)은 인과 회합되어, 단백질 및 금속 이온과 함께 원치않는 슬러지를 축적한다. 이 슬러지는 옥수수 침지액의 증발, 운반 및 저장시 문제를 일으킨다. 본 발명의 피타제 분자는 이 슬러지를 가수분해하는데 사용된다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제는 종래 확인된 피타제 분자, 예를 들어, 진균 기원의 피타제 분자에 비하여 실질적으로 우수한 상업적 성능을 제공할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 효소는 약 4400 U/㎎, 또는 약 50 내지 100, 또는 50 내지 1000, 또는 100 내지 4000 U/mg 단백질의 값보다 더 클 수 있다.
본 발명은 또한 후술하는 바와 같이, 돌연변이 유발법 및 다른 방법에 의해 본 발명의 피타제의 특징들을 변경하는 방법을 제공한다.
핵산의 제조 및 조작
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 피타제를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함할 수 있거나, 또는 그 안에 포함하고 있는 발현 카세트, 벡터, 예를 들어, 발현 또는 클로닝 벡터, 클로닝 비히클, 예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리오파지 또는 인공 염색체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 사용하여 신규한 피타제 서열을 발견하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 예를 들어, 합성 결찰 리어셈블리법, 최적화된 유도 진화 시스템 및/또는 포화 돌연변이 유발법에 의하여 본 발명의 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 합성적으로 생성된, 모체 서열 번호 1의 변이체인 핵산 종류로서, 본 발명의 이들 핵산은 "모체" 서열 번호 1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 하나 이상의 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 것인 핵산 종류를 제공한다.
참조로, 모체 서열 번호 1은
Figure 112011101934958-pct00002
이다.
본 발명의 핵산은 예를 들어, cDNA 라이브러리의 클로닝 및 발현, 메세지 또는 게놈 DNA를 PCR 등으로 증폭시킴으로써 제조, 단리 및/또는 조작될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 상동성 유전자는 본원에 기술된 바와 같이 주형 핵산을 조작하여 변형될 수 있다. 본 발명은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 프로토콜 또는 장치를 이용하여 수행할 수 있으며, 이에 관하여는 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있다.
일반적인 기법
본 발명을 수행하는데 사용되는 핵산은 RNA, iRNA, 안티센스 핵산, cDNA, 게놈 DNA, 벡터, 바이러스 또는 그의 하이브리드인지 여부에 따라서, 다양한 공급원으로부터 분리되어, 유전자 조작되고, 증폭 및/또는 재조합적으로 발현/생성될 수 있다. 이러한 핵산으로부터 생성된 재조합 폴리펩티드는 각각 분리 또는 클로닝되어 목적 활성에 대하여 시험될 수 있다. 박테리아, 포유동물, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템을 비롯한 임의의 제조합 발현 시스템이 사용될 수 있다.
별법으로, 핵산은 예를 들어, 문헌 ([Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661]; [Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444]; [Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380]; [Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896]; [Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90]; [Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109]; [Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859]; 미국 특허 번호 제4,458,066호)에 기술되어 있는 바와 같이 주지된 화학적 합성 기법에 의하여 시험관내 합성될 수 있다.
핵산 조작 기법, 예를 들어, 서브클로닝, 프로브 표지화(예를 들어, 클레노우(Klenow) 중합효소, 닉 번역, 증폭을 사용한 무작위 프라이머 표지화), 서열 분석, 하이브리드화 등은 예를 들어, 문헌 ([Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)]; [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)]; [LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993)])와 같은 과학 문헌 및 특허 문헌에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 방법을 실시하는 데 사용되는 핵산을 얻고 처리하는 데 유용한 다른 수단은 게놈 샘플로부터 클로닝하고, 필요에 따라 예를 들어, 게놈 클론 또는 cDNA 클론으로부터 단리 또는 증폭된 삽입체를 스크리닝 및 재클로닝하는 것이다. 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 공급원에는 예를 들면, 포유 동물의 인공 염색체(MAC)(예를 들어, 미국 특허 제5,721,118호; 제6,025,155호 참조); 인간의 인공 염색체(예를 들어, 문헌 [Rosenfeld(1997) Nat. Genet. 15: 333-335] 참조); 효모의 인공 염색체(YAC); 박테리아의 인공 염색체(BAC); P1의 인공 염색체(예를 들어, 문헌 [Woon(1998) Genomics 50:306-316] 참조); P1 유래 벡터(PAC)(예를 들어, 문헌 [Kern(1997) Biotechniques 23:120-124] 참조); 코스미드, 재조합 바이러스, 파지 또는 플라스미드에 함유된 게놈 또는 cDNA 라이브러리가 포함된다.
대안적 측면에서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 어구는 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 공급원의 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA)를 를 의미하며, 펩티드 핵산(PNA: peptide nucleic acid), 또는 임의의 DNA 유사 또는 RNA 유사 물질인, 자연 공급 또는 합성 공급 물질 예를 들어, iRNA, 리보뉴클레오단백질(예를 들어, iRNP)에 대한 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있다. 상기 용어는 자연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 함유하는 핵산 즉, 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 합성 골격을 보유하는 핵산 유사 구조물을 포함한다(예를 들어, 문헌 ([Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197]; [Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698]; [Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156]) 참조).
한 측면에서, 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열이 그의 자연 환경에서는 인접하지 않는 "골격" 핵산에 인접해 있는 서열을 포함한다. 한 측면에서, 핵산은 핵산 "골격 분자"의 군집 중 핵산 삽입체 수가 5% 이상인 것을 나타낸다. 본 발명에 따른 "골격 분자"는 핵산, 예를 들어, 발현 벡터, 자가 복제성 핵산, 바이러스, 통합 핵산 및 관심의 대상이 되는 핵산 삽입체를 유지 또는 조작하는 데 사용되는 다른 벡터 또는 핵산을 포함한다. 한 측면에서, 풍부한 핵산은 재조합 골격 분자 군집 중 핵산 삽입체 수가 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%이상인 것을 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 번역된 폴리펩티드 또는 그 단편의 분비를 안내할 수 있는 리더 서열과 함께 적당한 단계에서 조립된다.
본 발명은 융합 단백질과 그들을 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 이종성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 소정의 특성, 예를 들어, 증가된 안정성 또는 정제 단순성을 부여하는 N 말단 식별 펩티드에 융합될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 더 많은 면역성 펩티드를 생산하여 재조합 방식으로 합성된 펩티드의 단리가 더 용이하게 하고, 항체 및 항체 발현 B 세포를 확인 및 단리할 수 있도록 하나 이상의 추가의 도메인이 연결된 융합 단백질로서 합성 및 발현될 수 있다. 검출 및 정제를 촉진하는 도메인에는 예를 들어, 금속 킬레이팅 펩티드, 예를 들어, 고정된 금속 상에서 정제될 수 있는 폴리히스티딘 트랙트 및 히스티딘-트립토판 모듈, 고정된 면역글로불린 상에서 정제될 수 있는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 확장/친화도 정제 시스템(Immunex Corp; 미국 워싱턴주 시애들 소재)에 이용되는 도메인이 포함된다. 분해 가능한 링커 서열, 예를 들어, 정제를 용이하게 할 수 있는 정제 도메인 및 모티프 포함 펩티드 또는 폴리펩티드 간의 인자 Xa 또는 엔테로키나제(Invitrogen; 미국 캘리포니아주 샌디애고 소재)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 6개의 히스티딘 잔기, 이어서 티오레독신 및 엔터로키나제 분해 부위에 연결된 에피토프 코딩 핵산 서열을 포함할 수 있다(문헌 ([Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797]; [Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404-414]) 참조). 히스티딘 잔기는 검출과 정제를 용이하게 하는 한편, 엔테로키나제 분해 부위는 융합 단백질의 나머지 부분으로부터 에티토프를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 코딩하는 벡터와 융합 단백질의 적용에 관한 기술은 과학 및 특허 문헌에 자세히 개시되어 있다(예를 들어, 문헌 [Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53] 참조).
한 측면엔서, "단리된"이란 용어는 물질이 그의 원래의 환경(예를 들어, 상기 물질이 천연 발생된 물질일 경우, 자연 환경)으로부터 제거된 상태를 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 천연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에 공존하는 물질들 중 일부 또는 전부로부터 분리된 동일의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일 성분일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리되어 있다고 볼 수 있다. 한 측면에서, "정제된"이라는 용어는 절대적인 순도를 요구하지 않으며; 오히려 상대적인 의미로 사용된 것이다. 라이브러리로부터 얻은 각각의 핵산은 통상 전기영동법에 의해 동질의 것으로 정제된 것이다. 이러한 클론으로부터 얻은 서열은 상기 라이브러리로부터 또는 전체 인간 DNA로부터 직접 수득할 수는 없다. 본 발명의 정제된 핵산은 유기체 중의 게놈 DNA의 나머지로부터 적어도 104-106배 만큼 정제된 것이다. 대안적 측면에서, "정제된"이라는 용어는 게놈 DNA의 나머지로부터 또는 라이브러리 또는 다른 환경 중의 다른 서열로부터 적어도 10, 또는 별법으로 102, 또는 103, 또는 104, 105배 만큼 정제된 핵산을 포함한다.
전사 및 번역 제어 서열
본 발명은 발현(예를 들면, 전사 또는 번역) 제어 서열(들), 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 작동 가능하게 연결되어 RNA 합성/발현을 유도 또는 조절하는 본 발명의 핵산(예를 들면, DNA) 서열을 제공한다. 발현 조절 서열은 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 박테리아 프로모터의 예에는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL 및 trp가 포함된다. 진핵 세포 프로모터의 예에는 CMV 최조기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 조기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인 I 프로모터가 포함된다.
박테리아에서 폴리펩티드를 발현 또는 과발현시키는 데 적합한 프로모터에는 E. 콜라이(E. coli) lac 또는 trp 프로모터, lacZ 프로모터, T3 프로모터, T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 프로모터, 람다 PL 프로모터, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK)와 같은 오페론 코딩 글리코분해 효소로부터의 프로모터, 및 산 포스파타제 프로모터가 포함된다. 진핵 세포 프로모터에는 CMV 최조기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 열 충격 프로모터, 조기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인 I 프로모터가 포함된다. 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스 내에서의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 프로모터도 사용할 수 있다.
발현 벡터 및 클로닝 비히클
본 발명은 본 발명의 핵산, 예를 들어, 본 발명의 피타제를 코딩, 본 발명의 폴리펩티드(및 핵산, 예를 들면, 안티센스)를 발현 및 과발현하는 서열을 포함하는 발현 시스템, 예를 들어, 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비히클을 제공한다. 본 발명의 발현 벡터 및 클로닝 비히클은 바이러스 입자, 배큘로바이러스, 파지, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 DNA(예를 들면, 백시니아, 아데노바이러스, 폴 폭스 바이러스, 슈도라비에스 및 SV40의 유도체), P1계 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체 및 관심의 대상이 되는 특정 숙주에 특이성을 가진 임의의 다른 벡터(예를 들어, 바실러스, 아스퍼질러스 및 효모)를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 많은 적합한 벡터가 당업자들에게 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 벡터의 예에는 다음과 같은 것들이 포함된다: 박테리아: pQE 벡터(Qiagen), p블루스크립트(pBluescript) 플라스미드, pNH 벡터, (람다-ZAP 벡터(Stratagene)); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T(Pharmacia); 진핵 세포성: pXT1, pSG5(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40(Pharmacia). 그러나, 숙주 내에서 재현 가능하고 생존 가능한 것이라면 임의의 다른 플라스미드 또는 다른 벡터도 사용할 수 있다. 카피 수가 낮거나 높은 벡터도 본 발명에 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 발현 벡터에 대한 대표적인 일례로서, 바이러스 입자, 배큘로바이러스, 파지, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 DNA(예를 들면, 백시니아, 아데노바이러스, 폴 폭스 바이러스, 슈도라비에스 및 SV40의 유도체), P1계 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체 및 관심의 대상이 되는 특정 숙주에 특이성을 가진 임의의 다른 벡터(예를 들어, 바실러스, 아스퍼질러스 및 효모)가 언급될 수 있다. 따라서, 예를 들어, DNA는 폴리펩티드의 발현을 위한 각종 발현 벡터들 중 어느 하나네 포함될 수 있다. 그러한 벡터로는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열을 포함한다. 많은 적합한 벡터가 당업자들에게 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 벡터의 예에는 다음과 같은 것들이 포함된다: 박테리아: pQE 벡터(Qiagen), p블루스크립트 플라스미드, pNH 벡터, (람다-ZAP 벡터(Stratagene)); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T(Pharmacia); 진핵 세포성: pXT1, pSG5(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40(Pharmacia). 그러나, 숙주 내에서 재현 가능하고 생존 가능한 것이라면 임의의 다른 플라스미드 또는 다른 벡터도 사용할 수 있다. 카피 수가 낮거나 높은 벡터도 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에서의 사용을 위한 예시적인 벡터는 f 인자 복제 기점을 포함한다. E. 콜라이에서의 f 인자(또는 성 인자: fertility factor)는 접합시에는 그를 높은 빈도로 전달하고, 그 스스로 박테리아 염색체는 더 낮은 빈도로 전달하는 플라스미드이다. 한 측면에서는 "포스미드" 또는 박테리아 인공 염색체(BAC) 벡터로 지칭되는 클로닝 벡터가 사용된다. 이는 E. 콜라이 f 인자로부터 유래된 것으로서, 게놈 DNA의 큰 세그먼트를 안정적으로 통합시킬 수 있는 것이다. 혼합된 미배양 환경 샘플로부터 얻은 DNA와 통합되고 나면, 이를 통해 안정적인 "환경 DNA 라이브러리의 형태로 큰 게놈 단편을 수득할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 또 다른 유형의 벡터는 코스미드 벡터이다. 코스미드 벡터는 게놈 DNA의 큰 절편을 클로닝하고 증식시키기 위해 최초로 고안된 것이다. 코스미드 벡터 내로의 클로닝은 문헌 ["Molecular Cloning: A laboratory Manual" (Sambrook et al, 1989)]에 상세히 기술되어 있다.
발현 벡터내의 DNA 서열은 적합한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 작동 가능하게 연결하여 RNA 합성을 유도한다. 이러한 특정 박테리아 프로모터로는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P R , P L 및 trp를 포함한다. 진핵 생물 프로모터로는 CMV 직 초기, HSV 티미딘 키나제, 조기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인 I을 들 수 있다. 적합한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업계의 일반적인 기술 수준 내에 있다. 또한, 발현 벡터는 번역 개시 및 전사 종결을 위한 리보좀 결합 부위를 함유한다. 또한, 상기 벡터는 발현을 증폭시키기 위해 적합한 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선별가능한 마커를 보유한 다른 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택할 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 하나 이상 함유할 수 있는데, 이들의 예로는 진핵 세포 배양물을 위한 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성 또는 E. 콜라이에서 테트라시클린 또는 앰피실린 내성을 들 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 서열, 및 해당 서열과 화합성인 숙주에서 구조 서열(즉, 단백질 코딩 서열, 예를 들어, 본 발명의 피타제)의 발현에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 카세트는 폴리펩티드 코딩 서열; 임의으로는 다른 서열, 예를 들어, 전사 종결 신호와 작동 가능하게 연결된 최소한의 프로모터를 포함한다. 발현시키는데 필요하거나 또는 도움이 되는 추가의 인자, 예를 들어, 인핸서 또한 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본원에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"이라는 것은 프로모터가 DNA 서열의 전사를 매개할 수 있도록 DNA 서열로부터 상류쪽에 프로모터가 결합되어 있는 것을 지칭한다. 따라서, 발현 카세트로는 또한 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 임의의 형태의 재조합 "나형 DNA" 벡터 등을 포함한다. 한 측면에서, "벡터"는 세포를 감염, 형질감염, 일시적으로 또는 영구적으로 형질 도입시킬 수 있는 핵산을 포함한다. 벡터는 나형 핵산, 또는 단백질 또는 지질과 함께 복합체를 형성하는 핵산일 수 있다. 벡터는 임의로 바이러스 또는 박테리아 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막(예를 들어, 세포막, 바이러스 지질 외피 등)을 포함한다. 한 측면에서, 벡터로는 DNA 단편이 결합하여 복제될 수 있는 레플리콘(예를 들어, RNA 레플리콘 및 박테리오파지)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 측면에서, 벡터는 RNA, 자율 자가 복제 환형 또는 선형 DNA 또는 RNA(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 등, 미국 특허 번호 제5,217,879호 참조)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 발현 및 비발현 플라스미드 둘 모두를 포함한다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 벡터"를 수용하는 것으로서 기술되어 있을 경우, 이는 염색체외 환형 및 선형 DNA 및 숙주의 염색체(들)에 통합된 DNA 둘 모두를 포함하는 것이다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되고 있는 경우, 벡터는 유사 분열하는 동안 자율 구조물로서 세포에 의해 안정하게 복제될 수 있거나, 숙주의 게놈 내에 통합된다.
발현 벡터는 프로모터, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적당한 서열을 포함할 수도 있다. 포유 동물의 발현 벡터는 복제 기점, 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 측면에 위치하는 비전사 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 필요한 비전사 유전자 요소를 제공하는 데 SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열이 사용될 수 있다.
한 측면에서, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별이 가능하도록 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 함유한다. 그러한 선별가능한 마커에는 디히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 또는 진핵 세포 배양물의 네오마이신 내성을 부여하는 유전자, E. 콜라이 및 S. 세레비지아(S. cerevisiae) TRP1 유전자에서 테트라시클린 또는 암피실린 내성을 부여하는 유전자가 포함된다. 프로모터 부위는 클로르암페니콜 트랜스퍼라제(CAT) 벡터 또는 선별가능한 마커를 가진 다른 벡터를 사용하는 임의의 원하는 유전자에서 선택될 수 있다.
진핵 세포 내의 폴리펩티드 또는 그 단편을 발현하는 벡터는 또한 발현 수준을 증가시키는 인핸서도 함유할 수 있다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 그것의 전사를 증가시키는 통상 길이 약 10 내지 약 300 bp의 DNA의 시스 작용 요소이다. 그 예에는 100 내지 270 bp의 복제 기점 뒷부분에 존재하는 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒷부분에 존재하는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다.
DNA 서열은 다양한 절차에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 적당한 제한 엔도뉴클레아제에 의한 삽입체 및 벡터의 분해 후에 벡터 내의 소정 위치에 결찰된다. 별법으로, 삽입체와 벡터 둘 모두에 존재하는 블런트 종단부(blunt end)를 결찰시킬 수 있다. 다양한 클로닝 기법이 당업계에 공지되어 있으며, 예로는 문헌 [Ausubel and Sambrook]에 기재되어 있다. 그러한 방법 등은 당업자의 기술 범주에 속하는 것으로 간주된다.
벡터는 플라스미드, 바이러스 입자 또는 파지 형태일 수 있다. 다른 벡터에는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합물로부터 유도된 벡터, 바이러스 DNA, 예를 들어, 백시니아, 아데노바이러스, 천연두 바이러스, 및 슈도라비에스가 포함된다. 원핵 및 진핵 숙주에 유용한 다양한 클로닝 및 발현 벡터가 예를 들어, 문헌 [Sambrook]에 기술되어 있다.
사용될 수 있는 특정 박테리아 벡터로는 주지의 클로닝 벡터인 pBR322(ATCC 37017), pKK223-3(스웨덴 웁살라에 소재하는 Pharmacia Fine Chemicals), GEM1(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 Promega Biotec), pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pD10, psiX174 p블루스크립트 II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5(Pharmacia), pKK232-8, 및 pCM7의 유전자 요소를 포함하는 상업적으로 이용가능한 플라스미드를 포함한다. 특정 진핵 생물 벡터로서는 pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia)을 포함한다. 그러나, 임의의 다른 벡터도 그것이 숙주 세포 내에서 복제 가능하고 생존할 수 있는 한 사용될 수 있다.
숙주 세포 및 형질전환된 세포
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어, 본 발명의 피타제를 코딩하는 서열을 포함하거나, 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비히클, 발현 벡터, 또는 클로닝 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 예를 들어, 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 포유 동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포를 비롯하여 당업자들에게 친숙한 임의의 숙주 세포일 수 있다. 예시적인 박테리아 세포로는 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia Coli), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 바실러스 섭틸리스( Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)를 비롯한, 에스케리키아, 바실러스, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라, 슈도모나스, 락토코쿠스 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속에 포함되는 임의의 종을 포함한다. 예시적인 진균 세포로는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)를 비롯한, 아스퍼질러스의 임의의 종을 포함한다. 예시적인 효모 세포로는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae), 또는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)를 비롯한, 피치아, 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 또는 슈완니오마이세스(Schwanniomyces)의 임의의 종을 포함한다. 예시적인 곤충 세포로는 초파리 S2(Drosophila S2) 및 스포도프테라 Sf9(Spodoptera Sf9)를 비롯한 스포도프테라 또는 초파리의 임의의 종을 포함한다. 예시적인 곤충 세포로는 초파리 S2 및 스포도프테라 Sf9를 포함한다. 예시적인 효모 세포로는 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지아, 또는 스키조사카로마이세스 폼베를 포함한다. 예시적인 동물 세포로는 CHO, COS 또는 보우스씨 흑색종 또는 임의의 마우스 또는 인간 세포주를 포함한다. 적절한 숙주를 선택하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
벡터는 임의의 다양한 기법, 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti 매개 유전자 전이를 이용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 방법으로는 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함한다(문헌 [Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)]).
적당한 경우, 가공된 숙주 세포는 프로모터를 활성화하거나, 형질전환체를 선택하거나, 본 발명의 유전자를 증폭시킬 수 있도록 적절히 변형된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 적합한 숙주 균주를 형질전환시키고, 적당한 세포 밀도로 숙주 균주를 성장시킨 후, 적당한 수단(예를 들면, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 선택된 프로모터를 유도하고, 원하는 폴리펩티드 또는 그의 단편이 제조될 수 있도록 추가의 기간 동안 그 세포를 배양할 수 있다.
세포를 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴한 후, 생성된 미정제 추출물을 추가 정제를 위해 보관할 수 있다. 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결 해동 순환법, 초음파처리법, 기계적 파괴법, 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 파괴시킬 수 있다. 그러한 방법은 당업자들에게 주지되어 있다. 발현된 폴리펩티드 또는 그의 단편은 황산암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 구성을 완성함에 있어서 필요에 따라 단백질 리폴딩 단계를 이용할 수 있다. 필요한 경우, 최종 정제 단계에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: high performance liquid chromatography)를 이용할 수 있다.
숙주 세포에서의 구성물은 재조합 서열에 의해 코딩된 유전자 생성물을 제조하는 데 통상의 방식으로 사용될 수 있다. 재조합 제조 방법에 사용된 숙주에 따라, 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 글리코실화시키거나 글리코실화시키지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 데 무세포 번역 시스템이 사용될 수 있다. 무세포 번역 시스템은 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 구성물로부터 전사된 mRNA를 사용할 수 있다. 일부 측면에서, DNA 구성물은 시험관내 전사 반응을 수행하기 이전에 선형화될 수도 있다. 이어서, 전사된 mRNA를 적절한 무세포 전사 추출물, 예를 들어, 토끼 망상 적혈구 추출물과 함께 인큐베이션시켜 원하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제조한다.
발현 벡터는 진핵 세포 배양물에 대한 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성과 같은, 또는 E. 콜라이에서의 테트라시클린 또는 암피실린 내성과 같은 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다.
본 발명의 핵산은 임의의 시험관내 발현 시스템 또는 생체내 발현 시스템에서 발현되거나 과발현될 수 있다. 박테리아, 곤충, 효모, 진균 또는 포유 동물 배양물을 포함하는, 임의의 세포 배양 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 발현 또는 과발현시킬 수 있다. 과발현은 프로모터, 인핸서, 벡터(예를 들어, 레플리콘 벡터, 이시스트론성 벡터(예를 들어, 문헌 [Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 295-8)] 참조), 배지, 배양 시스템 등을 적절히 선택함으로써 수행할 수 있다. 한 측면에서, 세포 시스템 내에서 선별 마커, 예를 들어, 글루타민 신테타제(예를 들어, 문헌 [Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66: 55-63] 참조)를 이용하는 유전자 증폭을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 과발현시킨다.
각종 포유 동물 세포 배양 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있으며, 포유 동물 발현 시스템의 예로는 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주(문헌 ["SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants" (Gluzman, 1981)]에 기술되어 있다), 및 화합성 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주, 예를 들어, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유 동물 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터와 인핸서를 포함할 것이며, 또한 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 5' 측면에 위치하는 비전사 서열을 포함할 수 있다. 필요한 비전사 유전자 요소를 제공하는 데 SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열이 사용될 수 있다.
관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포는 필요에 따라 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 유전자를 증폭하기 위해 변형된 종래의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 이전에 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용된 것들이며, 당업계의 숙련가에게는 자명한 것들이 될 것이다. 이어서, 특정 효소 활성을 보유하는 것으로 확인된 클론의 서열을 분석하여 활성이 증강된 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다.
핵산의 증폭
본 발명을 수행함에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 변형된 핵산은 예를 들어, 증폭에 의해 재생산될 수 있다. 본 발명은 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 그의 서브서열을 증폭시키기 위한 증폭 프라이머 서열 쌍을 제공하는데, 여기서, 프라이머 쌍은 예시적 서열 번호 1을 포함하는 핵산 서열, 및 상기 기술되어 있는 특정 서열 변형 중 적어도 하나를 증폭시킬 수 있다. 당업자는 이러한 서열 중 임의의 부분 또는 전장의 서열에 대한 증폭용 프라이머 서열 쌍을 디자인할 수 있다.
예를 들어, "모체" 서열 번호 1은 상기에 제시되어 있다. 따라서, 상기 모체 서열, 또는 상기 기술되어 있는 특정 서열 변형 중 적어도 하나를 가진 본 발명의 예시적인 서열 중 하나를 증폭시킬 수 있는 증폭용 프라이머 서열 쌍은 서열 번호 1의 잔기 1 내지 21(즉, ATGAAAGCGATCTTAATCCCA) 및 서열 번호 1의 마지막 21개의 잔기에 상보성인 가닥(TGCAGTTTGAGATCTCATCTA에 상보성인 가닥)일 수 있다.
또한 증폭 반응을 이용하여 샘플 중의 핵산의 양(예를 들어, 세포 샘플 중의 메세지의 양)을 정량하거나, 핵산을 표지화하거나(예를 들면, 어레이 또는 블롯에 부착하거나), 핵산을 검출하거나, 또는 샘플 중의 특정 핵산의 양을 정량할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서는, 세포 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리된 메세지를 증폭시킨다. 당업자는 적당한 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머를 선택하고 디자인할 수 있다. 증폭 방법은 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응, PCR(예를 들어, 문헌 ([PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990)] 및 [PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.]) 참조), 리가제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction)(예를 들어, 문헌 ([Wu (1989) Genomics 4:560]; [Landegren (1988) Science 241:1077]; [Barringer (1990) Gene 89:117]) 참조); 전사 증폭(예를 들어, 문헌 [Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173] 참조); 및 자립성 서열 복제(예를 들어, 문헌 [Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874] 참조); Q 베타 레플리카제 증폭(예를 들어, 문헌 [Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491] 참조), 자동화 Q 베타 레플리카제 증폭 분석(예를 들어, 문헌 [Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271] 참조) 및 다른 RNA 폴리머라제 매개 기법(예를 들어, NASBA(미국 온타리오주 미시소거 소재의 Cangene)을 포함한다; 또한, 문헌 ([Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel]; 미국 특허 번호 제4,683,195호 및 제4,683,202호; [Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564])를 참조한다.
서열 동일성 정도 측정
본 발명은 서열 번호 1과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 핵산을 포함하고, 구체적으로 열거된 상기 기술한 서열 번호 1에 대한 변형 중 적어도 하나를 포함하는, 단리된, 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다. 한 측면에서, 서열 동일성(상동성) 정도는 임의의 컴퓨터 프로그램 및 관련 파라미터, 예를 들어, 본원에 기술되어 있는 것과 같은 파라미터, 예를 들어, BLAST 2.2.2. 또는 FASTA 버전 3.0t78(디폴트 파라미터 포함)을 사용하여 측정될 수 있다.
상동성 서열은 또한 핵산 서열에서 우리딘이 티미딘으로 치환되어 있는 RNA 서열을 포함한다. 상동성 서열은 본원에 개시된 임의의 방법를 이용하여 얻거나, 서열화 오류를 보정하여 얻을 수 있다.
본원에서 확인된 다양한 서열 비교 프로그램이 본 발명의 이러한 측면에서 사용된다. 단백질 및/또는 핵산 서열 동일성(상동성)은 당업계에 공지된 임의의 다양한 서열 비교 알고리즘 및 프로그램을 사용하여 평가할 수 있다. 그러한 알고리즘 및 프로그램에는 TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, 및 CLUSTALW를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(문헌 ([Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988]; [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990]; [Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994]; [Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996]; [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990]; [Altschul et al. Nature Genetics 3:266-272, 1993])).
상동성 또는 동일성은 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)를 사용하여 측정할 수 있다. 그러한 소프트웨어는 다양한 결실, 치환 및 기타 변형 부위에 상동성 정도를 대입하여 유사한 서열을 매치시킨다. 2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 개념에서 용어 "상동성" 및 "동일성"은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 2 이상의 서열(들)이 동일하거나, 또는 임의의 수의 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수작업에 의한 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정된 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 대해 최대로 대응하도록 비교하여 정렬시켰을 때 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 2 이상의 서열(들)의 특정 퍼센트(%)를 나타내는 말이다. 서열 비교의 경우, 하나의 서열은 시험 서열을 비교할 참조 서열(본 발명의 예시적 서열)로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 부분 서열 좌표를 지정하며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나, 다른 파라미터를 지정할 수도 있다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 참조 서열과 비교한 시험 서열의 서열 동일성 비율을 계산한다.
본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 인접 잔기의 번호 중 어느 하나의 단편에 대한 참조를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 대안적 측면에서, 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후의 인접 위치의 동일 수의 참조 서열과 본 발명의 예시적 서열의 20 내지 전장 중 임의의 범위의 연속 잔기를 비교한다. 참조 서열이 본 발명의 예시적 서열과 필수의 서열 동일성, 예를 들면, 서열 번호 1, 서열 번호 2와 98%의 서열 동일성을 가지고, 상기 언급한 특정 서열 변형들 중 하나를 가지는 경우, 그 서열은 본 발명의 범주내 포함된다. 대안적 측면에서, 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후의 인접 위치의 동일 수의 참조 서열과 약 20 내지 600, 약 50 내지 200, 그리고 약 100 내지 150개 범위의 서브서열을 비교한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 주지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 국소 상동성 알고리즘(문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981])에 의해, 상동성 정렬 알고리즘(문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970])에 의해, 유사성 검색 방법(문헌 [person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988])에 의해, 그러한 알고리즘의 컴퓨터 실행[GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에 의해, 또는 수동식 정렬법 및 시각적 조사에 의해 수행될 수 있다. 상동성 또는 동일성을 측정하기 위한 다른 알고리즘으로는 예를 들어, BLAST 프로그램(국립 생명공학 정보 센터의 기본 국부 정렬 검색 도구(BLAST: Basic Local Alignment Search Tool), 예를 들어, BLAST, BLAST2, BLASTN 및 BLASTX) 이외에도, ALIGN, AMAS(다중 정렬된 서열 분석: Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS(단백질 다중 서열 정렬: Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET(정렬된 세그먼트 통계학적 분석 도구: Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BAND, BESTSCOR, BIOSCAN(생물학적 서열 비교 분석 노드: Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS(B 록스 개선형 검색자: B Locks IMProved Searcher), FASTA, 인터벌스 & 포인트(Intervals & Points), BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSU, LCONSENSU, WCONSENSU, 스미쓰-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, DARWIN, 라스베가스(Las Vegas) 알고리즘, FASTA(문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988]), FASTDB(문헌 [Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990]), FNAT(강제 뉴클레오티드 정렬 도구: Forced Nucleotide Alignment Tool), 프레임얼라인(Framealign), 프레임서치(FrameSearch), DYNAMIC, FILTER, FSAP(프리스텐스카이 서열 분석 패키지: Fristensky Sequence Analysis Package), GAP(전반 정렬 프로그램: Global Alignment Program), GENAL, GIBB, 겐퀘스트(GenQuest), ISSC(감도 서열 비교: Sensitive Sequence Comparison), LALIGN(국부 서열 정렬: Local Sequence Alignment), LCP(국부 컨텐트 프로그램: Local Content Program), MACAW(다중 정렬 구성 & 분석 워크벤치: Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP(다중 정렬 프로그램: Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA(패턴 유도형 다중 서열 정렬: Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA(유전자 알고리즘에 의한 서열 정렬: Sequence Alignment by Genetic Algorithm) 및 WHAT-IF를 포함한다. 본 발명을 수행하는 데 사용되는 다른 프로그램 및 데이터베이스로는 맥패턴(MacPattern)(EMBL), 디스커버리베이스(DiscoveryBase)(Molecular Applications Group), 진마인(GeneMine)(Molecular Applications Group), 100k(Molecular Applications Group), 맥100k(Mac100k)(Molecular Applications Group), 카탈리스트(Catalyst)(Molecular Simulations Inc.), 카탈리스트/SFIAPE(Catalyst/SFIAPE)(Molecular Simulations Inc.), 세리우스2.DB액세스(Cerius2.DBAccess)(Molecular Simulations Inc.), 히포겐(HypoGen)(Molecular Simulations Inc.), 인사이트 II(Insight II)(Molecular Simulations Inc.), 디스커버(Discover)(Molecular Simulations Inc.), CHARMm(Molecular Simulations Inc.), 펠릭스(Felix)(Molecular Simulations Inc.), 델피(DelPhi)(Molecular Simulations Inc.), 콴테MM(QuanteMM)(Molecular Simulations Inc.), 호몰로지(Homology)(Molecular Simulations Inc.), 모델러(Modeler)(Molecular Simulations Inc.), ISIS(Molecular Simulations Inc.), 콴타/프로테인 디자인(Quanta/Protein Design)(Molecular Simulations Inc.), 웹랩(WebLab)(Molecular Simulations Inc.), 웹랩 다이버시티 익스플로어(WebLab Diversity Explorer)(Molecular Simulations Inc.), 진 익스플로어(Gene Explorer)(Molecular Simulations Inc.), 시크폴드(SeqFold)(Molecular Simulations Inc.), MDL 이용가능 화학물질 디렉토리 데이터베이스(MDL Available Chemicals Directory database), MDL 약물 데이터 리포트 데이터베이스(MDL Drug Data Report data base), 종합 의약 화학 데이터베이스(Comprehensive Medicinal Chemistry database), 더웬트 월드 약물 인덱스 데이터베이스(Derwent's World Drug Index database), 바이오바이트마스터파일 데이터베이스(BioByteMasterFile database), 진뱅크 데이터베이스(GenBank database), 겐시크 데이터베이스(GenSeq database), 및 게놈퀘스트 데이터베이스(GenomeQuest database)를 포함한다. 본 개시 내용하에 다수의 다른 프로그램 및 데이터베이스가 당업자에게 자명할 것이다. 그러한 정렬 프로그램은 또한 실질적으로 동일한 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하는 게놈 데이터베이스를 스크리닝하는 데에도 사용될 수 있다. 다수의 게놈 데이터베이스를 예를 들어, NCBI(국립 생명공학 정보 센터: National Center for Biotechnology Information) 웹사이트를 통해 이용할 수 있다. 일부 기능상의 정보도 주석으로 달린 게놈 정보를 포함하는 데이터베이스는 다른 기관이 관리하고 있으며, 인터넷을 통하여도 입수할 수 있다.
본 발명을 수행하는 데 BLAST, BLAST 2.0 및 BLAST 2.2.2 알고리즘도 사용할 수 있다. 이들은 예를 들면, 문헌 ([Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402]; [Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410])에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 우선, 데이터베이스 서열 중의 동일 길이의 단어와 정렬시킬 때 약간의 양의 값을 가진 역치 스코어 T와 매치되거나 만족하는, 시험 서열 중의 길이 W의 짧은 단어를 확인하여 스코어가 높은 서열쌍(HSP: high scoring sequence pair)을 확인하는 것을 포함한다. T는 인접한 단어의 스코어 역치를 말한다(문헌 [Altschul (1990) 상기 문헌 동일]). 이러한 초기 인접 단어의 히트는 그들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾아내는 연구를 개시하는 데 근간으로서 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한 각 서열을 따라 두 방향으로 확장한다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(매치 잔기한 쌍의 보상 스코어; 항상 ＞0임)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각 방향으로의 단어 히트의 확장은 누적 정렬 스코어가 그 최대 달성치로부터 정량 X만큼 저하되었을 때, 하나 이상의 음의 스코어의 자기 정렬이 누적됨으로 인해 누적 스코어가 0 또는 그 이하가 되었을 때, 또는 어느 서열의 종단부에 이르렀을 때 중지한다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산의 경우, BLASTP 프로그램은 단어 길이 3, 및 기대값(E) 10을, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌 [Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 참조)는 정렬치(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. BLAST 알고리즘은 또한 두 서열간의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌 [Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 척도 중 하나는 최소 확률 총합(P(N))인데, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간의 매치가 우연히 일어날 확률을 나타내는 것이다. 예를 들면, 시험 핵산을 기준 핵산과 비교했을 때의 최소 확률 총합이 약 0.2 미만, 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다. 한 측면에서, 단백질 및 핵산 서열의 상동성은 기본 국부 정렬 검색 도구("BLAST")를 사용하여 평가한다. 예를 들면, 5종의 특정 BLAST 프로그램을 사용하여 다음 작업들을 수행할 수 있다: (1) BLASTP 및 BLAST3은 아미노산 시험 서열을 단백질 서열 데이터베이스와 비교하고; (2) BLASTN는 뉴클레오티드 시험 서열을 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 비교하며; (3) BLASTX는 시험 뉴클레오티드 서열(두 가닥)의 6 프레임 개념의 번역 생성물을 단백질 서열 데이터베이스와 비교하고; (4) TBLASTN는 시험 단백질 서열을 6개의 리드 프레임(두 가닥) 모두에서 번역된 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 비교하며; (5) TBLASTX는 뉴클레오티드 시험 서열의 6 프레임 번역을 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 6 프레임 번역과 비교한다. BLAST 프로그램은 유사한 단편을 확인함으로써 상동성 서열을 확인하는데, 그 단편은 본 명세서에서 시험 아미노산 또는 핵산 서열과 단백질 또는 핵산 서열 데이터베이스에서 얻을 수 있는 테스트 서열간의 "고 스코어링 세그먼트 쌍"을 말한다. 고 스코어링 세그먼트 쌍은 다수가 당해 기술분야에 공지되어 있는 스코어링 매트릭스에 의해 확인(즉, 정렬)될 수 있다. 사용된 예시적 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스이다(문헌 ([Gonnet et al., Science 256: 1443-1445,1992]; [Henikoff and Henikoff, Proteins 17: 49-61, 1993])). 별법으로, PAM 또는 PAM250 매트릭스도 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌 ([Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Mat벼s for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation] 참조).
본 발명의 한 실시양태에서는, 핵산이 본 발명의 범위 내에 드는 필수의 서열 동일성을 가진지 여부를 결정하는 데 NCBI BLAST 2.2.2 프로그램을 사용한다. BLAST 2.2.2 프로그램에는 약 38개의 설정 옵션이 있다. 본 발명의 이 측면에서는, 디폴트 필터링 설정(즉, 모든 파라미터를 디폴트 제외 필터링, 즉 OFF로 설정)을 제외하고는 모든 디폴트값을 사용하고, 그 대신에 필터링이 불가능한 "-F F"를 사용한다. 디폴트 필터링을 사용하면 종종 서열 길이가 짧음으로 인해 카링-앨슐(Karlin-Altschul) 위배를 초래한다.
본 발명의 이 예시적 측면에 사용되는 디폴트값은 다음과 같다:
"복잡도가 낮은 경우의 필터: 온(ON)
> 단어 크기: 3
> 매트릭스: Blosum62
> 갭 비용: 존재: 11
> 확장: 1"
"복잡도가 낮은 경우의 필터: 온
다른 디폴트 설정은 다음과 같다: 복잡도가 낮은 경우의 필터: 오프(OFF), 단백질의 경우 단어 크기 3, BLOSUM62 매트릭스, 갭 존재 패널티 -11 및 갭 확장 패널티 -1.
일부 측면에서, 서열 비교 알고리즘은 본 발명의 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 참조 서열을 비교하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 "모체" 서열 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2과, 또는 참조 서열과 비교함으로써 상동성 또는 구조 모티프를 확인할 수 있다. 서열 비교는 제1 서열이 제2 서열과 동일한지 여부를 결정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유형의 비교는 새로운 서열과 데이터베이스 내의 제1 서열 사이의 정확한 비교를 수행하는 데 제한되어서는 안된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 심지어 동일하지 않더라도, 2개의 뉴클레오티드 또는 단백질 서열의 비교를 위한 주지의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 2개의 테스트 서열 사이의 상동성 수준을 증가시키기 위하여 갭을 하나의 서열 내로 도입할 수 있다. 비교 동안 갭 또는 다른 특징을 서열 내로 도입할지 여부를 조정하는 파라미터가 보통은 컴퓨터 알고리즘 사용자에 의해 입력된다.
일단 두 서열의 비교가 실시되고 나면, 두 서열이 동일한지 여부를 결정하게 된다. 물론, "동일"이라는 용어는 절대적으로 동일한 서열에 한정되는 것은 아니다. 서열 비교을 통해 비교되는 서열들 간의 서열 동일성 수준을 나타내거나, 또는 구조적 모티프를 확인할 수 있거나, 또는 그러한 핵산 코드 및 폴리펩티드 코드와 비교되는 서열 내의 구조적 모티프를 확인할 수 있다. 서열 동일성 수준은 제1 서열내 서열 총 개수 중에서 동일한 서열들 간의 문자 비율을 계산함으로써 결정된다. 따라서, 100개의 뉴클레오티드로 구성된 제1 서열의 모든 문자가 제2 서열 내의 모든 문자와 같이 정렬되는 경우, 서열 동일성 수준은 100%가 될 것이다.
별법으로, 알고리즘은 참조 서열을 본 발명의 서열과 비교하여 서열이 하나 이상의 위치에서 상이한지의 여부를 결정할 수 있다. 비교 결과는 참조 서열 또는 본 발명의 서열에 관하여 삽입되거나, 결실되거나, 또는 치환된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 길이 및 동일성으로 제시될 수 있다. 다른 측면에서, 알고리즘은 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드 내의 특성을 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 식별자 특징은 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame), "개시 코돈"(예를 들어, 코돈 "ATG"), "TAATAA 박스", 또는 모티프, 예를 들어, 알파 나선, 베타 쉬트, 또는 기능성의 폴리펩티드 모티프, 예를 들어, 효소 활성 부위, 나선부-선회부-나선부 모티프, 류신 지퍼, 글리코실화 부위, 유비퀴틴화 부위, 알파 나선, 베타 쉬트, 코딩된 단백질의 분비를 유도하는 신호 펩티드 코딩 신호 서열, 전사 조절에 관여하는 서열, 예를 들어, 호메오박스, 산성 신장부, 효소 활성 부위, 기질 결합 부위 및 효소 절단 부위뿐만 아니라, 당업자에게 공지되어 있는 다른 모티프를 포함한다.
피타제 발현 억제
본 발명은 추가로 본 발명의 핵산 서열에 상보적인 핵산(예를 들어, 본 발명의 핵산 서열에 대한 안티센스 서열)(안티센스, iRNA, 리보자임을 포함하는 핵산을 포함)을 제공한다. 안티센스 서열은 피타제를 코딩하는 유전자의 수송, 스플라이싱 또는 전사를 억제할 수 있다. 상기 억제는 게놈 DNA 또는 메신저 RNA의 표적화를 통해 수행될 수 있다. 표적화된 핵산의 전사 또는 기능은, 예를 들어, 하이브리드화 및/또는 절단에 의해 억제될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 특히 유용한 억제제 세트는 피타제 효소의 생성 또는 기능을 방지 또는 억제하는 경우, 피타제 유전자 또는 메세지에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 회합은 서열 특이성인 하이브리드화를 통해 이루어질 수 있다. 또 다른 부류의 유용한 억제제는 피타제 메세지의 불활성화 또는 절단을 야기할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 그러한 절단을 야기하는 효소 활성을 가질 수 있으며, 그 예로 리보자임이 있다. 올리고뉴클레오티드는 상보적인 핵산을 절단할 수 있도록 화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 그러한 효소 또는 조성물에 접합될 수 있다. 다수의 상이한 올리고뉴클레오티드로 이루어진 풀을 원하는 활성을 가진 것에 대해 스크리닝할 수 있다
안티센스 올리고뉴클레오티드
본 발명은 본 발명의 새로운 피타제 서열 변형을 포함하고, mRNA를 표적화하여 피타제 활성을 억제할 수 있는 피타제 메세지에 결합이 가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 디자인하기 위한 전략은 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있으며, 당업자라면 본 발명의 신규한 제제를 사용하여 이러한 피타제 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. 예를 들면, 유효한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대하여 스크리닝하는 유전자 워킹법(walking)/RNA 지도화 프로토콜은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183]에는 유효한 안티센스 서열 선택을 위한 용이하고 신뢰성이 있는 방법을 제공하는 표준 분자 기법을 기초로 한 RNA 지도화 분석이 설명되어 있다. 문헌 [Smith (2000) Euro. J. Pharm. Sci. 11:191-198] 또한 참조한다.
천연 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 어떠한 길이도 가능한데, 예를 들어, 또 다른 측면에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 5∼100, 약 10∼80, 약 15∼60, 약 18∼40이다. 최적의 길이는 통상의 스크리닝에 의하여 결정될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 농도에서 존재할 수 있다. 최적의 농도는 통상의 스크리닝에 의하여 결정될 수 있다. 다양한 합성, 비-천연 뉴클레오티드 및 핵산 유사체가 공지되어 있는데, 이는 이와 같은 잠재적인 문제를 시사하고 있다. 비이온 골격, 예를 들어, N-(2-아미노에틸)글리신 유닛을 포함하는 펩티드 핵산(PNA)을 사용할 수 있다. 포스포로티오에이트 결합을 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO97/03211; WO96/39154; [Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197]; [Antisense Therapeutics, ed. Agarwal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여 제공된 합성 DNA 골격 유사체를 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드로는 상기 기술한 바와 같이 포스포로 디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트 및 모르폴리노 카르바메이트 핵산 등이 있다.
조합 화학 방법론을 사용하여 임의의 표적, 예를 들어, 본 발명의 센스 및 안티센스 피타제 서열에 대한 적절한 결합 친화도 및 특이성을 가진 특이성 올리고뉴클레오티드에 대하여 신속하게 스크리닝이 가능한 다수의 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 문헌 [Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584]를 참조한다.
억제 리보자임
본 발명은 새로운 피타제 서열 변형을 포함하고, mRNA를 표적화하여 피타제 효소 활성을 억제할 수 있는 피타제 메세지에 결합 가능한 리보자임을 제공한다. 리보자임을 디자인하고 표적화를 위한 피타제-특이성 안티센스 서열을 선택하는 전략은 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있으며, 당업자라면 본 발명의 신규한 시약을 사용하여 상기의 리보자임을 디자인할 수 있다. 리보자임은 표적 RNA를 분해하는 RNA의 효소 부분에 근접하게 보유되는 리보자임의의 표적 RNA 결합 부분을 통하여 표적 RNA에 결합함으로써 작용하게 된다. 그래서, 리보자임은 상보성 염기쌍을 통하여 표적 RNA를 인식하고 결합하며, 일단 정확한 부위에 결합되면, 효소 작용에 의하여 표적 RNA를 분해 및 불활성화시킨다. 이러한 방법으로 표적 RNA를 분해하면 코딩 서열에서 분열이 발생하는 경우 코딩된 단백질의 직접적인 합성 능력이 파괴된다. 리보자임이 결합하고, 그의 RNA 표적을 분열시킨 후, 이는 통상적으로 RNA로부터 방출되어 새로운 표적을 반복적으로 결합 및 분열시킬 수 있다.
특정의 환경에서, 리보자임의의 효소 성질은 기타의 기법, 예를 들어, 안티센스 기법(여기서 핵산 분자는 단순히 핵산 표적에 결합하여 그의 전사, 번역 또는 기타의 분자와의 결합을 방해함)에 비하여 유리할 수 있는데, 이는 치료적 처치를 수행하는데 필요한 리보자임의의 유효 농도가 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 낮을 수 있기 때문이다. 이러한 잠재적 이점은 리보자임이 효소 작용을 할 수 있는 능력을 지닌다는 것을 반영한다. 따라서, 단일의 리보자임 분자는 표적 RNA의 다수의 분자를 분열할 수가 있다. 또한, 리보자임은 통상적으로 높은 특이성 억제제이며, 억제의 특이성은 결합의 염기쌍 기전뿐만 아니라, 이것이 결합되는 RNA의 발현을 분자가 억제하는 기전에 의존한다. 즉, 억제는 RNA 표적의 분열에 의하여 야기되며, 그래서 특이성은 비표적화 RNA의 분열 속도에 대한 표적화 RNA의 분열의 속도의 비로서 정의된다. 이러한 분열 기전은 염기쌍에 관련된 것 이외의 요인에 의존하게 된다. 즉, 리보자임 작용의 특이성은 동일한 RNA 부위를 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 크게 될 수 있다.
효소 리보자임 RNA 분자는 해머헤드 모티프로 형성될 수 있으나, 이는 헤어핀, 간염 델타 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RN아제P 유사 RNA(RNA 가이드 서열과 결합된 것)의 모티프에서 형성될 수 있다. 이러한 헤머헤드 모티프의 예는 문헌 [Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses, 8:183]에 기재되어 있고, 헤어핀 모티프의 예는 문헌 ([Hampel (1989) Biochemistry 28:4929], 및 [Hampel (1990) Nuc . Acids Res . 18:299])에 기재되어 있으며, 간염 델타 바이러스 모티프의 예는 문헌 [Perrotta (1992) Biochemistry 31:16]에 기재되어 있고, RN아제P 모티프는 문헌 [Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849]에 기재되어 있고, 그룹 I 인트론의 예는 미국 특허 번호 제4,987,071호(Cech)에 기재되어 있다. 이러한 특이성 모티프의 인용은 제한하고자 하는 의도가 아니며, 당업자라면, 본 발명의 효소 RNA 분자가 1 이상의 표적 유전자 RNA 부위에 상보성인 특이성 기질 결합 부위를 가지며, 분자에 RNA 분열 활성을 부여하는 기질 결합 부위내에서 또는 이를 둘러싸는 뉴클레오티드 서열을 가진다는 것을 숙지하고 있을 것이다.
RNA 간섭(RNAi: RNA interference)
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 효소 서열을 포함하는, RNA 억제성 분자, 소위 "RNAi" 분자라 하는 RNA 억제성 분자를 제공한다. RNAi 분자는 이중 가닥 RNA(dsRNA: double stranded RNA) 분자를 포함한다. RNAi 분자, 예를 들어, siRNA 및/또는 miRNA는 피타제 효소 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다. 한 측면에서, RNAi 분자, 예를 들어, siRNA 및/또는 miRNA의 길이는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 이중체 뉴클레오티드이다.
본 발명은 어떠한 특정 작용 기전에 의해서도 제한되지 않지만, RNAi는 세포에 도입되어, 유사하거나 동일한 서열, 예를 들어, 내인성 mRNA의 단일 가닥 RNA(ssRNA: single stranded RNA)의 분해를 유도할 수 있다. 세포가 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 노출될 때, 상동성 유전자로부터 유도된 mRNA는 RNA 간섭(RNAi)이라고 불리는 과정에 의해 선택적으로 분해된다. RNAi 이면의 가능한 기본적인 기전은 특이적 유전자 서열과 매치되는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 짧은 간섭 RNA라 불리는 짧은 조각들로 분해하여, 그의 서열과 매치되는 mRNA를 분해하는 것이다. 한 측면에서, 본 발명의 RNAi는 유전자 침묵화 치료로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 문헌 [Shuey (2002) Drug Discov. Today 7: 1040-1046]을 참조한다. 한 측면에서, 본 발명은 RNAi 분자, 본 발명의 siRNA 및/또는 miRNA를 사용하여 RNA를 선택적으로 분해하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 마이크로 억제성 RNA(miRNA: micro-inhibitory)는 번역을 억제시키고, siRNA는 전사를 억제시킨다. 이 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 실시될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 RNAi 분자는 세포, 기관 또는 동물 내에서 기능 상실 돌연변이(loss of-function mutation)를 유발하는 데에 사용될 수 있다. RNA를 선택적으로 분해하기 위해, 이 RNAi 분자, 예를 들어, siRNA 및 miRNA를 제조하고 사용하는 방법에 관하여는 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,506,559호; 제6,511,824호; 제6,515,109호; 제6,489,127호를 참조한다.
핵산의 변형
본 발명은 본 발명의 핵산의 변이체, 예를 들어, 피타제 효소를 코딩하는 것들을 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 주형 핵산에 의하여 코딩된 피타제로부터 변형되거나, 또는 상이한 활성 또는 변형되거나 또는 상이한 안정도를 가진 피타제 효소를 생성하기 위하여 다양한의 조합으로 반복 또는 사용될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 유전자/메세지 발현, 메세지 번역 또는 메세지 안정도에서의 변형을 생성하기 위하여 다양한의 조합으로 반복 또는 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 세포의 유전자 조성은 예를 들어, 생체외 상동성 유전자의 변형후, 세포로의 그의 재삽입에 의하여 변형된다.
본 발명은 또한 유도 진화, 예를 들어, 다이버사 코포레이션(Diversa Corporation) 소유의 방법, 예를 들어, 디렉트에볼루션(DirectEvolution)(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,830,696호 참조); 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM)(예를 들어, 미국 특허 번호 제6,171,820호 및 제6,579,258호 참조), 유도 진화에서의 엑소뉴클레아제 매개 유전자 어셈블리(예를 들어, 미국 특허 번호 제6,361,974호 및 제6,352,842호 참조), 유도 진화에서의 종료 선택(예를 들어, 미국 특허 번호 제6,358,709호 및 제6,238,884호 참조), 재조합 기초 합성 셔플링(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,965,408호 및 제6,440,668호, 및 호주 특허 번호 AU724521 참조), 및 호열성 효소의 유도 진화(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,830,696호 및 제6,335,179호 참조)를 비롯한 돌연변이 유발법 및 다른 방법에 의하여 본 발명의 피타제의 특징을 변경하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 피타제의 특징은 a) 1 이상의 주형, 예를 들어, 본 발명의 피타제 핵산을 돌연변이 유발시켜 신규한 분자를 생성하는 단계; 및 b) 목적으로 하는 특성을 보유하는 신규한 분자의 자손 종을 선별하는 단계를 포함하는 디렉트에볼루션 프로토콜에 의해 변형된다. 유도 진화의 원동력은 처음에 출발 주형(예를 들어, "모체" 서열 번호 1 또는 본 발명의 임의의 서열)을 선택하는 것과, 선택된 돌연변이 유발 방법 및 사용된 스크리닝 방법에 달려있다. 그러므로, 본 발명은 a) 1 이상의 특정 분야, 예를 들어, 식량의 고온 제조에 있어서 우수한 활성을 보유하여, 이러한 특정 분야를 최적화시키는데 유용하고; b) 유도 진화에서 주형으로서 유용하여 더욱 개선된 신규한 분자를 얻을 수 있으며; c) 하이브리드화계 연구법과 같은 수단에 의하여 부가적인 관련 분자를 확인하는 도구로서 유용한, 신규한 피타제를 비롯한 피타제 활성의 신규하게 고활성이고, 생리적으로 효율적이며, 경제적인 공급원을 제공한다.
본 발명의 핵산은 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 무작위 확률적 방법, 또는 비확률적, 또는 "유도 진화"에 의하여 변형될 수 있다. 유전자의 무작위 돌연변이를 위한 방법은 당업계에서 주지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,830,696호를 참조한다. 예를 들면, 돌연변이 유발원을 사용하여 유전자를 무작위로 돌연변이시킬 수 있다. 돌연변이 유발원의 예로는 자외선광 또는 감마 조사, 또는 화학적 돌연변이 유발원, 예를 들어, 미토마이신, 아질산, 광활성화 소라렌즈, 단독으로 또는 조합한 것으로서, 이는 재조합에 의하여 수복되도록 하는 DNA 파괴를 유발하게 된다. 기타의 화학적 돌연변이 유발원의 예로는 중아황산나트륨, 아질산, 히드록실아민, 히드라진 또는 포름산 등이 있다. 기타의 돌연변이 유발원으로는 뉴클레오티드 전구체의 유사체, 예를 들어, 니트로소구아니딘, 5-브로모우라실, 2-아미노푸린 또는 아크리딘 등이 있다. 이러한 제제는 뉴클레오티드 전구체 대신에 PCR 반응에 첨가할 수 있으며, 이로써 서열을 돌연변이시키게 된다. 삽입성 약제, 예를 들어, 프로플라빈, 아크리플라빈, 퀴나크린 등을 사용할 수 있다.
분자생물학에서의 임의의 기법, 예를 들어, 무작위 PCR 돌연변이 유발(예를 들어, 문헌 [Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471] 참조), 또는 조합 다중 카세트 돌연변이 유발(예를 들어, 문헌 [Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196] 참조)을 사용할 수 있다. 또한, 핵산, 예를 들어, 유전자는 무작위 또는 "확률적" 단편화 후에 재조립될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,291,242호, 제6,287,862호, 제6,287,861호, 제5,955,358호, 제5,830,721호, 제5,824,514호, 제5,811,238호, 제5,605,793호를 참조한다. 또 다른 측면에서, 변형, 첨가 또는 결실은 오류 빈발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발, 어셈블리 PCR, 유성 PCR 돌연변이 유발, 생체내 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 순환적 앙상블 돌연변이 유발, 지수 앙상블 돌연변이 유발, 부위 특이적 돌연변이 유발, 유전자 리어셈블리, 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM), 합성 결찰 리어셈블리(SLR: synthetic ligation reassembly), 재조합, 반복적 서열 재조합, 포스포티오에이트 변형된 DNA 돌연변이 유발, 우라실 함유 주형 돌연변이 유발, 간극형 이중 가닥 돌연변이 유발, 점 부정합 수복 돌연변이 유발, 수복 결실 숙주 균주 돌연변이 유발, 화학적 돌연변이 유발, 방사능성 돌연변이 유발, 결실 돌연변이 유발, 제한 선택 돌연변이 유발, 제한 정제 돌연변이 유발, 인공 유전자 합성, 앙상블 돌연변이 유발, 키메라 핵산 다량체 생성, 및/또는 이들의 조합 또는 기타의 방법에 의해 도입된다.
하기의 문헌은 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 다양한 반복적 재조합 절차 및/또는 방법을 설명한다. 문헌 ([Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties", Tumor Targeting 4:1-4]; [Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896]; [Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling", Nature Biotechnology 17:793-797]; [Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding", Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290]; [Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling", Nature Biotechnology 17:259-264]; [Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution", Nature 391:288-291]; [Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15:436-438]; [Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509]; [Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines", Current Opinion in Biotechnology 8:724-733]; [Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling", Nature Medicine 2:100-103]; [Crameri et al. (1996) "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling", Nature Biotechnology 14:315-319]; [Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor "headpiece dimer", Journal of Molecular Biology 255:373-386]; [Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology, VCH Publishers, New York. pp. 447-457]; [Crameri and Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes", BioTechniques 18:194-195]; [Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides", Gene, 164:49-53]; [Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation", Science 270:1510]; [Stemmer (1995) "Searching Sequence Space", Bio/Technology 13:549-553]; [Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling", Nature 370:389-391]; 및 [Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecular evolution", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751]).
다양성을 생성하는 돌연변이법은 부위 유도 돌연변이 유발(문헌 ([Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview "Anal Biochem. 254 (2): 157-178]; [Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method", Methods Mol. Biol. 57:369-374]; [Smith (1985) "In vitro mutagenesis", Ann. Rev. Genet. 19:423-462]; [Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis", Science 229:1193-1201]; [Carter (1986) "Site-directed mutagenesis", Biochem. J. 237:1-7]; 및 [Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis", Nucleic & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)]); 주형을 포함하는 우라실을 사용한 돌연변이 유발(문헌 ([Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492]; [Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Methods in Enzymol. 154, 367-382]; 및 [Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245)]); 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발 (문헌 ([Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)]; [Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)]; [Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment", Nucleic Acids Res. 10:6487-6500]; [Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors", Methods in Enzymol. 100:468-500]; 및 [Zoller & Smith (1987) "Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template", Methods in Enzymol. 154:329-350]); 포소포로티오에이트 변형 DNA 돌연변이 유발(문헌 ([Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA", Nucl. Acids Res. 13:8749-8764]; [Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA", Nucl. Acids Res. 13:8765-8787 (1985)]; [Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis", Nucl. Acids Res. 14:9679-9698]; [Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis", Nucl. Acids Res. 16:791-802]; 및 [Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide", Nucl. Acids Res. 16:803-814])); 간극형 이중 가닥 DNA를 사용한 돌연변이 유발(문헌 ([Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation Construction", Nucl. Acids Res. 12:9441-9456]; [Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed Construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350-367]; [Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed Construction of mutations", Nucl. Acids Res. 16:7207]; 및 [Fritz et al. (1988) "Oligonucleotide-directed Construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro", Nucl. Acids Res. 16:6987-6999]))를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 추가의 프로토콜은 점 부정합 수복(문헌 [Kramer (1984) "Point Mismatch Repair", Cell 38:879-887]), 수복 결핍 숙주 균주를 사용한 돌연변이 유발(문헌 ([Carter et al. (1985) "Improved Oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors", Nucl. Acids Res. 13:4431-4443]; 및 [Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors", Methods in Enzymol. 154:382-403])), 결실 돌연변이 유발(문헌 [Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotide to generate large deletions", Nucl. Acids Res. 14:5115]); 제한 선택 및 제한 선택 및 제한 정제(문헌 [Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin", Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317:415-423]), 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발(문헌 ([Narnbiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein", Science 223:1299-1301]; [Sakamar and Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)," Nucl. Acids Res. 14:6361-6372]; [Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites", Gene 34:315-323]; 및 [Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis", Nucl. Acids Res. 13:3305-3316])), 이중 가닥 파괴 수복(문헌 [Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments", Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181]) 등을 포함한다.
상기 다수의 방법에 대한 추가의 세부 사항 또는 대체 프로토콜은 문헌 [Methods in Enzymology, Volume 154]에 기재되어 있으며, 이는 또한, 다양한 돌연변이 유발법을 사용한 경우의 문제점 해결을 위한 유용한 콘트롤이 기재되어 있다(문헌 (미국 특허 번호 제5,605,793호(Stemmer, 1997년 2월 25일, 발명의 명칭: "Methods for In Vitro Recombination); " 미국 특허 번호 제5,811,238호(Stemmer et al., 1998년 9월 22일, 발명의 명칭: "Methods for generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative selection and recombination); 미국 특허 번호 제5,830,721호(Stemmer et al., 1998년 11월 3일, 발명의 명칭: "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"), 미국 특허 번호 제5,834,252호(Stemmer, et al., 1998년 11월 10일, 발명의 명칭: "End-Complementary Polymerase Reaction"), 미국 특허 번호 제5,837,458호(Minshull, et al., 1998년 11월 17일, 발명의 명칭: "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"); WO95/22625(Stemmer and Crameri, 발명의 명칭: "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly); WO96/33207(Stemmer and Lipschutz, 발명의 명칭: "End Complementary Polymerase Chain Reaction"), WO97/20078(Stemmer and Crameri, 발명의 명칭: "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"), WO97/35966(Minshull and Stemmer, 발명의 명칭: "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"), WO99/41402(Punnonen et al., 발명의 명칭: "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"), WO99/41383(Punnonen et al., 발명의 명칭: "Antigen Library Immunization"), WO99/41369,(Punnonen et al., 발명의 명칭: "Genetic Vaccine Vector Engineering"), WO99/41368(Punnonen et al., 발명의 명칭: "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"), EP 752008(Stemmer and Crameri,, 발명의 명칭: "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"), EP 0932670(Stemmer, 발명의 명칭: "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"), WO99/23107(Stemmer et al., 발명의 명칭: "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"), WO99/21979(Apt et al., 발명의 명칭: "Human Papillomavirus Vectors"), WO98/31837(del Cardayre et al., 발명의 명칭: "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"), WO98/27230(Patten and Stemmer, 발명의 명칭: "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"), WO98/27230(Stemmer et al., 발명의 명칭: "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection"), WO00/00632(발명의 명칭: "Methods for Generating Highly Diverse Libraries"), WO00/09679(발명의 명칭: "Methods for Obtaining In Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences"), WO98/42832(Arnold et al., 발명의 명칭: "Recombination of Polynucleotide Sequence Using Random or Defined Primers"), WO99/29902(Arnold et al., 발명의 명칭: "Method for Creating Polynucleotides and Polypeptide Sequence"), WO98/41653(Vind, 발명의 명칭: "An In Vitro Method for Construction of a DNA Library"), WO98/41622(Borchert et al., 발명의 명칭: "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling") 및 WO98/42727(Pati and Zarling, 발명의 명칭: "Sequence Alterations using Homologous Recombination"))에 기재되어 있다.
(Patten et al.)의 1999년 9월 28일 출원된 발명의 명칭: "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES"(미국 시리얼 번호 제09/407,800호); (del Cardayre et al.)의 발명의 명칭: "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION"(미국 시리얼 번호 제09/166,188호: 1998년 7월 15일 출원); (미국 시리얼 번호 제09/354,922호: 1999년 7월 15일 출원); (Crameri et al.)의 1999년 9월 28일 출원된 발명의 명칭: "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION"(미국 시리얼 번호 제09/408,392호); Crameri et al.의 2000년 1월 18일 출원된 발명의 명칭: "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION"(PCT/US00/01203); (Welch et al.)의 1999년 9월 28일 출원된 발명의 명칭: "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING"(미국 시리얼 번호 제09/408,393호); (Selifonov et al.)의 2000년 1월 18일 출원된 발명의 명칭: "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDE HAVING DESIRED CHARACTERISTICS"(PCT/USOO/01202) 및 예를 들어, (Selifonov et al.)의 2000년 7월 18일 출원된 발명의 명칭: "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDE HAVING DESIRED CHARACTERISTICS"(미국 시리얼 번호 제09/618,579호); (Selifonov and Stemmer)의 2000년 1월 18일 출원된 발명의 명칭: "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SImulATIONS"(PCT/US00/01138); Affholter의 2000년 9월 6일 출원된 발명의 명칭: "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION"(미국 시리얼 번호 제09/656,549호)) 등에는 각종의 다양성 생성법에 대하여 추가의 세부사항 또는 대체 프로토콜이 기재되어 있다.
비확률적 또는 "유도 진화"의 예로는 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM), 합성 결찰 리어셈블리(SLR) 또는 이들의 조합 등이 있으며, 이들을 사용하여 본 발명의 핵산을 변형시킴으로써 새로운 또는 변형된 성질(예를 들어, 높은 산성 또는 알칼리 조건 하에서, 고온 또는 저온 등의 조건 하에서 활성임)을 가진 피타제를 생성할 수 있다. 변형된 핵산에 의하여 코딩된 폴리펩티드는 피타제 또는 기타의 활성에 대하여 테스트하기 이전에 활성에 대하여 스크리닝할 수 있다. 임의의 테스트 방법 또는 프로토콜, 예를 들어, 모세관 어레이 플랫폼을 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,361,974호; 제6,280,926호 및 제5,939,250호 참조한다.
포화 돌연변이 유발법, 또는 GSSM
본 발명은 또한 본원에, 및 미국 특허 번호 제6,171,820호 및 제6,579,258호에 기술되어 있는 포화 돌연변이 유발법, 또는 GSSM을 사용하여 효소를 제조하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 전범위의 단일 아미노산 치환이 각각의 아미노산 위치에서 나타나는, 예를 들어, 효소 활성 부위 또는 변형시키고자 표적화된 리간드 결합 위에서 나타나는 한 세트의 자손 폴리펩티드를 생성하기 위해 축퇴성 N,N,G/T 서열을 함유하는 코돈 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 피타제 효소 또는 본 발명의 항체에 점 돌연변이를 도입한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는
제1 상동성 서열, 축퇴성 N,N,G/T 서열 및 임의의 제2 상동성 서열을 연속적으로 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 얻은 하류 자손 번역 생성물은 폴리펩티드를 따라 각각의 아미노산 부위에서 모든 가능한 아미노산 변화를 포함하는데, 그 이유는 N,N,G/T 서열의 축퇴성은 모두 20개의 아미노산을 위한 코돈을 포함하기 때문이다. 한 측면에서, 이러한 하나의 축퇴성 올리고뉴클레오티드(하나의 축퇴성 N,N,G/T 카세트를 포함)는 전 범위의 코돈 치환에 대한 모체 폴리뉴클레오티드 주형내 각각의 원래의 코돈을 처리하기 위해 사용된다. 또 다른 측면에서, 2개 이상의 축퇴성 N,N,G/T 카세트를 사용하는데, 이는 전 범위 코돈 치환에 대한 모체 폴리뉴클레오티드 주형내 2개 이상의 원래의 코돈을 처리하기 위해 사용되며, 동일한 올리고뉴클레오티드이거나, 상이한 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 1 초과의 N,N,G/T 서열은 1 초과의 위치에 아미노산 돌연변이를 도입하는 하나의 올리고뉴클레오티드에 함유될 수 있다. N,N,G/T 서열의 이러한 다수성은 직접적으로 인접해 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 분리될 수도 있다. 또 다른 측면에서, 추가 또는 결실을 도입하기에 유용한 올리고뉴클레오티드는 단독으로 사용하거나, N,N,G/T 서열을 함유하는 코돈과 병용하여 아미노산 추가, 결실 및/또는 치환의 임의의 조합 또는 순열을 도입할 수 있다. 한 측면에서, 접촉성 N,N,G/T 트리플렛, 즉 축퇴성(N,N,G/T)n 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 2개 이상의 접촉성 아미노산 위치를 동시에 돌연변이시킬 수 있다. 또 다른 측면에서, N,N,G/T 서열보다 덜 축퇴성인 축퇴성 카세트를 사용한다. 예를 들어, 몇몇 경우, 단지 하나의 N을 포함하는 축퇴성 트리플렛 서열을 이용(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내에서)(여기서, 상기 N은 트리플렛의 제1, 제2 또는 제3 위치 내에 존재할 수 있다)하는 것이 바람직할 수 있다. 그의 임의의 순열 및 조합을 포함하는 임의의 다른 염기가 상기 트리플렛의 나머지 두 위치에서 사용될 수 있다. 별법으로, 몇몇 경우 축퇴성 N,N,N 트리플렛 서열을 사용(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내에서)하는 것이 바람직할 수 있다.
한 측면에서, 축퇴성 트리플렛(예를 들어, N,N,G/T 트리플렛 서열)을 사용함으로써 폴리펩티드내 각각의 아미노산 위치 및 모든 아미노산 위치내로 전 범위의 가능한 천연 아미노산(총 20개 아미노산의 경우)을 체계적으로 용이하게 생성할 수 있다(대안적 측면에서, 본 발명은 또한 아미노산 잔기, 또는 코돈, 위치당 모든 가능한 치환보다는 더 적은 수의 가능한 치환을 생성하는 것을 포함한다). 예를 들어, 100개 아미노산의 폴리펩티드의 경우, 2000개의 구별되는 종(즉, 1 위치당 20개의 가능한 아미노산 x 100개의 아미노산 위치)이 생성될 수 있다. 축퇴성 N,N,G/T 트리플렛을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 이용을 통해, 32개의 개별 서열은 20개의 가능한 천연 아미노산 모두를 코딩할 수 있다. 따라서, 모체 폴리뉴클레오티드 서열이 이러한 하나의 올리고를 이용하는 포화 돌연변이 유발을 수행하는 반응 용기에서는 20개의 구별되는 폴리펩티드를 코딩하는 32개의 구별되는 자손 폴리뉴클레오티드가 생성된다. 대조적으로, 부위 지정 돌연변이 유발법에서 비축퇴성 올리고뉴클레오티드를 이용하면 반응 용기당 단지 하나의 자손 폴리펩티드만이 생성된다. 비축퇴성 올리고뉴클레오티드는 임의로 개시된 축퇴성 프라이머와 함께 사용될 수 있다: 예를 들어, 비축퇴성 올리고뉴클레오티드는 작용성 폴리펩티드내에 특정 점 돌연변이를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이는 특이적인 침묵 점 돌연변이, 상응하는 아미노산 변화를 유발하는 점 돌연변이, 및 폴리펩티드 단편의 상응하는 발현 정지 코돈의 생성을 유발하는 점 돌연변이를 생성하는 수단을 제공한다.
한 측면에서, 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기는 20개 이상의 자손 폴리펩티드(예를 들어, 피타제 효소) 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 20개의 천연 아미노산 모두가 모체 폴리뉴클레오티드내에서 돌연변이된 코돈 위치에 상응하는 하나의 특이성 아미노산 위치에서 나타나도록 한다(다른 측면은 20기의 모든 천연 조합보다는 더 적은 수의 조합을 사용한다). 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기로부터 생성된 32배 축퇴성 자손 폴리펩티드를 클론 증폭(예를 들어, 발현 벡터를 이용하여 적합한 숙주, 예를 들어, E. 콜라이 숙주 내로 클로닝함)하고 발현 스크리닝할 수 있다. 개별 자손 폴리펩티드가 바람직한 특성 변화를 나타내는가에 대한 스크리닝에 의해 확인되는 경우(모체 폴리펩티드와 비교할 경우, 예를 들어, 알칼리성 또는 산성 조건 하에서 글루칸 가수분해 활성 증가), 그의 서열을 분석하여 그 내부에 함유된, 그에 상응하는 바람직한 아미노산 치환을 확인할 수 있다.
한 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 포화 돌연변이 유발법을 이용하여 모체 폴리펩티드내 각각의 아미노산 위치 및 모든 아미노산 위치를 돌연변이하면, 바람직한 아미노산 변화를 하나 이상의 아미노산 위치에서 확인할 수 있다. 이들 바람직한 아미노산 치환 모두 또는 그 일부의 조합을 함유하는 하나 이상의 새로운 자손 분자가 생성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 특이적이며 바람직한 아미노산 변화가 폴리펩티드내 3개의 아미노산 위치 각각에서 확인되는 경우, 순열은 각각의 위치(원래의 아미노산으로부터 변화는 없고, 2개의 바람직한 각각의 변화) 및 3개의 위치에서 3가지 가능성을 포함한다. 따라서, 3 x 3 x 3 또는 27개의 전체 가능성이 존재하는데, 이 가능성에는 이전에 조사한 7가지 가능성(6개의 점 돌연변이(즉, 3가지 위치 각각에서 2개의 가능성) 및 임의의 위치에서 변화 없음)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 부위 포화 돌연변이 유발법은 스크리닝과 함께 셔플링, 키메라화, 재조합 및 다른 돌연변이 과정과 함께 사용될 수 있다. 본 발명은 반복적인 방식의 포화 돌연변이 유발법을 포함하는 임의의 돌연변이 방법(들)의 용도를 제공한다. 한 예에서, 임의의 돌연변이 방법(들)의 반복적인 사용을 스크리닝과 함께 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이를 도입하여 전범위의 단일 아미노산 치환이 각각의 아미노산 위치에서 나타나는(유전자 부위 포화된 돌연변이 유발(GSSM)) 한 세트의 자손 폴리펩티드를 생성하는 독점적인 코돈 프라이머(축퇴성 N,N,N 서열을 함유함)의 용도를 제공한다. 사용된 올리고는 제1 상동성 서열, 축퇴성 N,N,N 서열 및 임의의 제2 상동성 서열을 연속적으로 포함한다. 이러한 올리고를 이용하여 얻은 하류 자손 번역 생성물은 폴리펩티드를 따라 각각의 아미노산 부위에서 모든 가능한 아미노산 변화를 포함하는데, 그 이유는 N,N,N 서열의 축퇴성은 모두 20개의 아미노산을 위한 코돈을 포함하기 때문이다.
한 측면에서, 이러한 하나의 축퇴성 올리고(하나의 축퇴성 N,N,N 카세트를 포함함)는 전 범위의 코돈 치환에 대한 모체 폴리뉴클레오티드 주형내 각각의 원래의 코돈을 처리하기 위해 사용된다. 다른 측면에서, 2개 이상의 축퇴성 N,N,N 카세트를 사용하는데, 이는 전 범위 코돈 치환에 대한 모체 폴리뉴클레오티드 주형내 2개 이상의 원래의 코돈을 처리하기 위해 사용되며, 동일한 올리고 이거나, 상이한 올리고이다. 따라서, 하나 이상의 N,N,N 서열은 하나 이상의 위치에 아미노산 돌연변이를 도입하는 하나의 올리고에 함유될 수 있다. N,N,N 서열의 이러한 다수성은 직접적으로 인접해 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 분리될 수도 있다. 또 다른 측면에서, 추가 또는 결실을 도입하기에 유용한 올리고는 단독으로 사용되거나, N,N,N 서열을 함유하는 코돈과 병용하여 아미노산 추가, 결실 및/또는 치환의 임의의 조합 또는 순열을 도입할 수 있다.
한 측면에서, 접촉성 N,N,N 트리플렛, 즉 축퇴성(N,N,N)n 서열을 함유하는 올리고를 이용하여 2개 이상의 접촉성 아미노산 위치를 동시에 돌연변이시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 N,N,N 서열보다 덜 축퇴성인 축퇴성 카세트의 용도를 제공한다. 예를 들어, 몇몇 경우, 단지 하나의 N을 포함하는 축퇴성 트리플렛 서열을 이용(예를 들어, 올리고 내에서)하는데, 이때 상기 N은 트리플렛의 제1, 제2 또는 제3 위치내에 존재할 수 있다. 그의 임의의 순열 및 조합을 포함하는 임의의 다른 염기는 상기 트리플렛의 나머지 두 위치에서 사용할 수 있다. 별법으로, 몇몇 경우 축퇴성 N,N,N 트리플렛 서열, N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열을 사용(예를 들어, 올리고 내에서)하는 것이 바람직할 수 있다.
그러나, 본 발명에서 개시한 바와 같이, 축퇴성 트리플렛(예를 들어, N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열)을 사용하는 것이 몇가지 이유 때문에 바람직하다. 한 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드내 각각의 아미노산 위치 및 모든 아미노산 위치내로 전 범위의 가능한 아미노산(총 20개 아미노산의 경우)의 치환을 체계적으로 및 상당히 용이하게 생성하는 수단을 제공한다. 따라서, 100개 아미노산의 폴리펩티드에서, 본 발명은 2000개의 구별되는 종(즉, 1 위치당 20개의 가능한 아미노산 x 100개의 아미노산 위치)을 체계적으로 및 상당히 용이하게 생성하는 방법을 제공한다. 축퇴성 N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열을 함유하는 올리고의 이용을 통해, 20개의 가능한 아미노산을 코딩하는 32개의 개별적인 서열을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 모체 폴리뉴클레오티드 서열이 이러한 하나의 올리고를 이용하는 포화 돌연변이 유발을 수행하는 반응 용기에서는, 20개의 구별되는 폴리펩티드를 코딩하는 32개의 구별되는 자손 폴리뉴클레오티드가 생성된다. 대조적으로, 부위 지정 돌연변이 유발법에서 비축퇴성 올리고뉴클레오티드를 이용하면 반응 용기당 단지 하나의 자손 폴리펩티드만이 생성된다.
또한, 임의로 본 발명은 개시된 축퇴성 프라이머와 함께 사용할 수 있는 비축퇴성 올리고의 용도를 제공한다. 몇몇 상황에서, 작용성 폴리펩티드내에 특정 점 돌연변이를 생성하는 비축퇴성 올리고를 이용하는 것이 유익하다. 이는 특이적인 침묵 점 돌연변이, 상응하는 아미노산 변화를 유발하는 점 돌연변이, 및 폴리펩티드 단편의 상응하는 발현 정지 코돈의 생성을 유발하는 점 돌연변이를 생성하는 수단을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기는 20개 이상의 자손 폴리펩티드 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 모두 20개의 아미노산이 모체 폴리뉴클레오티드내에서 돌연변이된 코돈 위치에 상응하는 하나의 특이성 아미노산 위치에서 나타나도록 한다. 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기로부터 생성된 32배 축퇴성 자손 폴리펩티드는 클론 증폭(예를 들어, 발현 벡터를 이용하여 적합한 E. 콜라이 숙주 내로 클로닝함)하고 발현 스크리닝할 수 있다. 개별 자손 폴리펩티드가 바람직한 특성 변화를 나타내는가에 대한 스크리닝에 의해 확인되는 경우, 그의 서열을 분석하여 그 내부에 함유된, 그에 상응하는 바람직한 아미노산 치환을 확인할 수 있다.
본원에 기술한 것과 같은 유전자 부위 포화 돌연변이 유발을 이용하여 모체 폴리펩티드내 각각의 아미노산 위치 및 모든 아미노산 위치를 돌연변이하면, 바람직한 아미노산 변화를 하나 이상의 아미노산 위치에서 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이들 바람직한 아미노산 치환 모두 또는 그 일부의 조합을 함유하는 하나 이상의 새로운 자손 분자가 생성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 특이적이며 바람직한 아미노산 변화가 폴리펩티드내 3개의 아미노산 위치 각각에서 확인되는 경우, 순열은 각각의 위치 및 3개의 위치에서 3가지 가능성(원래의 아미노산으로부터의 변화는 없고, 2개의 바람직한 각각의 변화)을 포함한다. 따라서, 3 x 3 x 3 또는 27개의 전체 가능성이 존재하는데, 이 가능성에는 이전에 조사한 7가지 가능성(6개의 점 돌연변이(즉, 3가지 위치 각각에서 2개의 가능성) 및 임의의 위치에서 변화 없음)을 포함한다.
따라서, 비제한적인 예에서, 본 발명은 예를 들어, 2개 이상의 관련 폴리펩티드가 적합한 숙주 내에 도입되어 하이브리드 폴리뉴클레오티드가 재조합 및 환원적 재분류에 의해 생성되는 것인 방법과 같이, 추가의 돌연변이 방법과 함께 병용되는 포화 돌연변이 유발법의 용도를 제공한다.
유전자의 전체 서열을 따라 돌연변이를 수행하는 것 이외에, 돌연변이 유발법이 폴리뉴클레오티드 서열내 임의의 수의 염기 각각을 대체하는 데 사용될 수 있는데, 돌연변이를 유발하고자 하는 염기의 수는 정수 15 내지 100,000개일 수 있는 것을 본 발명이 제공한다. 따라서, 분자를 따라 모든 위치를 돌연변이시키는 대신에, 모든 염기 또는 불연속 수의 염기(총 15 내지 100,000개의 부분 집합일 수 있음)를 돌연변이 유발시킬 수 있다. 한 측면에서, 개개의 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열을 따라 각각의 위치 또는 위치들의 군을 돌연변이 유발시키는데 사용할 수 있다. 돌연변이를 유발시키고자 하는 3개의 위치로 된 군은 코돈일 수 있다. 돌연변이는 돌연변이원성 카세트라 칭하기도 하는, 이종 카세트를 함유하는 돌연변이원성 프라이머를 이용하여 도입할 수 있다. 예시적인 카세트는 1개 내지 500개의 염기를 보유할 수 있다. 이와 같은 이종 카세트내 각각의 뉴클레오티드 위치는 N, A, C, G, T, A/C, A/G, A/T, C/G, C/T, G/T, C/G/T, A/C/T, A/C/T, A/C/G 또는 E인데, 이때 E는 A, C, G 또는 T가 아닌 임의의 염기이다(E는 디자이너 올리고라 칭할 수 있다).
일반적인 의미로, 포화 돌연변이 유발법은 돌연변이시키고자 하는 정해진 폴리뉴클레오티드 서열(이때, 돌연변이시키고자 하는 서열은 그 길이가 약 15 내지 100,000 염기임)내 완전한 세트의 돌연변이원성 카세트(이때, 각각의 카세트는 그 길이가 약 1 내지 500 염기일 수 있음)를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 따라서, 일군의 돌연변이(1 내지 100 돌연변이)가 돌연변이시키고자 하는 각각의 카세트에 도입된다. 한 카세트내로 도입하려는 돌연변이의 그룹화는 포화 돌연변이 유발법의 한 라운드의 적용중 제2 카세트 내로 도입하려는 돌연변이의 제2 그룹화와 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 이러한 그룹화는 결실, 부가, 특정 코돈의 그룹화 및 특정 뉴클레오티드 카세트의 그룹화에 의해 예시된다.
돌연변이시키고자 하는 한정된 서열은 전체 유전자, 경로, cDNA, 전체 오픈 리딩 프레임(ORF), 및 전체 프로모터, 인핸서, 리프레서/트랜스액티베이터, 복제 기점, 인트론, 오퍼레이터 또는 임의의 폴리뉴클레오티드 작용기를 포함한다. 일반적으로, 상기 목적을 위해 "한정된 서열"은 15 염기-폴리뉴클레오티드 서열, 및 길이가 15 염기 내지 15,000 염기(본 발명은 구체적으로 범위 내의 모든 정수를 언급한다)인 폴리뉴클레오티드 서열인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 코돈 그룹화의 선택에 대한 고려는 축퇴성 돌연변이원성 카세트에 의해 코딩된 아미노산의 유형을 포함한다.
한 측면에서, 돌연변이원성 카세트 내로 도입될 수 있는 돌연변이를 그룹화함으로써, 본 발명은 특이적으로 각각의 위치에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20개의 아미노산을 코딩하는 축퇴성 코돈 치환(축퇴성 올리고를 이용함)을 제공하며, 그것에 의해 코딩된 폴리펩티드의 라이브러리를 제공한다.
합성 결찰 리어셈블리( SLR )
본 발명은 새로운 또는 변형된 특성을 가진 폴리펩티드, 예를 들어, 본 발명의 피타제 효소 또는 항체를 생성하는, "합성 결찰 리어셈블리" 또는 간략하게는 "SLR," "유도 진화"로 통칭되는 비확률적 유전자 변형계를 제공한다. SLR은 비확률적으로 함께 올리고뉴클레오티드 단편을 결찰시키는 방법이다. 이러한 방법은 핵산 빌딩 블록이 셔플링, 연결 또는 무작위로 키메라를 만들지 않고, 대신 비확률적으로 조립된 확률적 올리고뉴클레오티드 셔플링과는 상이하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,773,900호; 제6,740,506호; 제6,713,282호; 제6,635,449호; 제6,605,449호; 제6,537,776호를 참조한다.
한 측면에서, SLR은 하기의 단계를 포함한다. (a) 주형 폴리뉴클레오티드 (여기서, 주형 폴리뉴클레오티드는 상동성 유전자를 코딩하는 서열을 포함함)를 제공하는 단계; (b) 다수의 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드 (여기서, 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드는 소정의 서열에서 주형 폴리뉴클레오티드와 교차 재조립되도록 조립하고, 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드는 변이체 서열을 측접하는 주형 폴리뉴클레오티드에 상동성을 가진 서열 및 상동성 유전자의 변이체인 서열을 포함함)를 제공하는 단계; (c) 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드를 주형 폴리뉴클레오티드와 합하여 빌딩 블록 폴리뉴클레오티드가 주형 폴리뉴클레오티드와 교차 재조립되어 상동성 유전자 서열 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계.
SLR은 재정렬시키고자 하는 폴리뉴클레오티드간의 높은 수준의 상동체의 존재에 의존하지는 않는다. 따라서, 이러한 방법을 사용하여 10100 종 이상의 상이한 키메라로 이루어진 자손 분자의 라이브러리(또는 세트)를 비확률적으로 생성할 수 있다. SLR은 101000 개 이상의 상이한 자손 키메라로 이루어진 라이브러리를 생성하는데 사용한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 디자인에 의하여 선택된 전체 조립 순서를 가진 종결된 키메라 핵산 분자 세트를 생성하는 비확률적 방법을 포함한다. 이러한 방법은 유용한 상호 혼화성 결찰 가능한 종단부를 가진 다수의 특이성 핵산 빌딩 블록을 디자인에 의하여 생성하는 단계, 이들 핵산 빌딩 블록을 조립하여 디자인된 전체 조립 순서를 얻는 단계를 포함한다. 재조립하고자 하는 핵산 빌딩 블록의 상호 혼화성 결찰 가능한 종단부는 빌딩 불록이 이들이 정해진 순서로 커플링시킬 수 있는 경우 이러한 규칙 조립 유형에 대하여 "유용한" 것으로 간주된다. 따라서, 핵산 빌딩 블록이 커플링될 수 있는 전체 어셈블리 순서는 결찰 가능한 종단부의 디자인에 의하여 구체화된다. 1 보다 많은 어셈블리 단계를 사용하고자 할 경우, 핵산 빌딩 블록이 커플링될 수 있는 전체 어셈블리 순서는 어셈블리 단계(들)의 순차적 순서에 의하여 구체화된다. 한 측면에서, 어닐링된 빌딩 조각을 효소, 예를 들어, 리가제(예를 들어, T4 DNA 리가제)로 처리하여 빌딩 조각의 공유 결합을 형성한다. 한 측면에서, 핵산 빌딩 블록이 셔플링, 연결 또는 키메라를 무작위로 생성하지 않는 대신 비확률적으로 조립되는 것을 제외하고는 확률적 셔플링과 다소 관련되어 있는 합성 결찰 리어셈블리(SLR)로 지칭되는 비확률적 방법을 사용하여 변이체를 형성할 수 있다.
SLR 방법은 셔플링시키고자 하는 폴리뉴클레오티드간의 높은 수준의 상동체의 존재에 의존하지 않는다. 본 발명은 10100 이상의 상이한 키메라로 이루어진 자손 분자의 라이브러리(또는 세트)를 비확률적으로 생성하는데 사용된다. SLR은 101000 이상의 상이한 자손 키메라로 이루어진 라이브러리를 생성하는데 조차 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 디자인에 의하여 선택된 전체 어셈블리 순서를 가진 종결된 키메라 핵산 분자 세트를 생성하는 비확률적 방법을 제공하며, 이러한 방법은 유용한 상호 혼화성 결찰 가능한 말단을 가진 다수의 특이성 핵산 빌딩 블록을 디자인에 의하여 생성하는 단계, 이러한 핵산 빌딩 블록을 조립하여 디자인된 전체 어셈블리 순서를 얻도록 하는 단계를 포함한다.
조립하고자 하는 핵산 빌딩 블록의 상호 화합성 결찰 가능한 종단부는, 빌딩 블록이 소정의 순서로 커플링될 수 있는 경우, 이와 같은 규칙의 어셈블리의 유형에 대하여 "유용한" 것으로 간주된다. 이로써 한 측면에서, 핵산 빌딩 블록이 커플링되는 전체 어셈블리 순서가 결찰 가능한 종단부의 디자인에 의하여 구체화되며, 1 보다 많은 어셈블리 단계를 사용하고자 하는 경우에는 핵산 빌딩 블록을 커플링시킬 수 있는 전체 어셈블리 순서는 어셈블리 단계(들)의 순차적 순서에 의하여 구체화된다. 본 발명의 측면에서, 어닐링된 빌딩 조각을 효소, 예를 들어, 리가제 (예를 들어, T4 DNA 리가제)로 처리하여 빌딩 조각의 공유 결합을 형성할 수 있다.
또 다른 측면에서, 핵산 빌딩 블록의 디자인은 종결된 키메라 핵산 분자의 자손 세트를 생성하기 위한 기초로서 작용하게 되는 선조 핵산 주형 세트의 서열의 분석시 얻는다. 이러한 선조 핵산 주형은 돌연변이 유발시키고자 하는, 즉 키메라 형성하거나 또는 셔플링 처리하고자 하는 핵산 빌딩 블록의 디자인에서 보조하는 서열 정보원으로서 작용하게 된다.
일례로서, 본 발명은 관련 유전자의 계열 및 그의 관련 생성물의 코딩된 계열의 키메라를 제공한다. 특정예에서, 코딩된 생성물은 효소이다. 본 발명에서 사용하기 위한 효소 및 폴리펩티드는 본 명세서에서 설명된 방법에 의하여 돌연변이 유발될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면에 따라, 다수의 선조 핵산 주형의 서열을 정렬하여 1 이상의 경계점을 선택하고, 여기서 경계점은 상동체의 영역에 위치할 수 있다. 경계점은 생성시키고자 하는 핵산 빌딩 블록의 경계를 탈선형화시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 선조 분자내에서 식별되고 선택된 경계점은 자손 분자의 어셈블리에서의 잠재적 키메라 생성점으로서 작용하게 된다.
통상적으로 유용한 경계점은 2 이상의 선조 주형에 의하여 공유된 (1 이상의 상동성 뉴클레오티드 염기로 이루어짐) 상동체의 부위가 되나, 경계점은 선조 주형의 절반 이상, 선조 주형의 2/3 이상, 선조 주형의 3/4 이상 또는 선조 주형의 거의 전부에 의하여 공유되는 상동체의 부위가 된다. 한 측면에서, 유용한 경계점은 선조 주형의 전부에 의하여 공유되는 상동체의 부위가 된다.
한 측면에서, 결찰 리어셈블리 방법은 소모성 라이브러리를 생성하기 위하여 소모적으로 수행된다. 환언하면, 모든 가능한 핵산 빌딩 블록의 규칙 조합은 종결된 키메라 핵산 분자의 세트에 나타난다. 동시에, 각각의 조합에서의 어셈블리 순서 (즉, 종결된 키메라 핵산 각각의 5'→3 서열에서의 각각의 빌딩 블록의 어셈블리 순서)는 디자인에 의하여 (또는 비확률적)이 된다. 이러한 방법의 비확률적 성질 때문에, 원치 않는 부산물의 가능성이 크게 감소된다.
또 다른 측면에서, 이러한 방법은 체계적으로, 예를 들어, 하나씩 체계적으로 스크리닝시킬 수 있는 구획을 사용하여 체계적인 구획화된 라이브러리를 생성하기 위하여 체계적으로 결찰 리어셈블리 방법이 수행된다. 즉, 본 발명은 순차적 단계의 어셈블리 반응을 선택적으로 그리고 현명하게 사용하여 커플링된 특이성 핵산 빌딩 블록의 선택적 그리고 현명한 사용을 통하여, 자손 생성물의 특이성 세트가 각각의 수개의 반응 용기내에서 생성될 수 있는 실험 디자인을 달성할 수 있다. 이는 체계적 검사 및 스크리닝 절차가 수행되도록 한다. 따라서, 이는 잠재적으로 매우 큰 수의 자손 분자가 더 작은 그룹으로 체계적으로 검사되도록 한다.
융통성이 크기는 하나, 마찬가지로 소모적이며 체계적인 방법으로 키메라화를 수행할 수 있는 능력으로 인하여, 특히 선조 분자 중에 낮은 수준의 상동체가 존재하는 경우, 본 발명은 다수의 자손 분자로 이루어진 라이브러리(또는 세트)의 생성을 제공하게 된다. 본 발명의 결찰 리어셈블리의 비확률적 성질로 인하여, 생성된 자손 분자는 디자인에 의하여 선택된 전체 어셈블리의 순서를 가진 종결된 키메라 핵산 분자의 라이브러리를 포함할 수 있다. 특정의 측면에서, 이러한 생성된 라이브러리는 103 초과 내지 101000 초과의 상이한 자손 분자종으로 이루어진다.
한 측면에서, 상기 기술한 바와 같이 생성된 종결된 키메라 핵산 분자 세트는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진다. 한 측면에 의하면, 이러한 폴리뉴클레오티드는 유전자이며, 이는 인공 유전자가 될 수 있다. 또 다른 측면에 의하면, 이러한 폴리뉴클레오티드는 유전자 경로가 되며, 이는 인공 유전자 경로가 될 수 있다. 본 발명에 의하여 생성된 1 이상의 인공 유전자가 인공 유전자 경로, 예를 들어, 진핵 유기체(식물 포함)내에서 작동 가능한 경로에 포함될 수 있다.
또 다른 예에서, 시험관내 방법으로 (예를 들어, 돌연변이 유발에 의해) 또는 생체내 방법으로 (예를 들어, 숙주 유기체의 유전자 스플라이싱 능력을 사용함으로써) 차후에 임의로 제거될 수 있는 빌딩 블록이 생성되는 단계의 합성 성질은 디자인 및 뉴클레오티드 (예를 들어, 코돈, 인트론 또는 제어 서열이 될 수 있는 1 이상의 뉴클레오티드)의 도입을 가능케 한다. 대부분의 경우에서, 이러한 뉴클레오티드는 유용한 경계점 생성의 잠재적 이점 이외에 다수의 기타의 이유로 인해서 바람직하게 되는 것으로 알려졌다.
따라서, 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 핵산 빌딩 블록을 사용하여 인트론을 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명은 기능성 인트론이 본 발명의 인공 유전자를 도입할 수 있게 된다. 또한, 본 발명은 기능성 인트론이 본 발명의 인공 유전자 경로에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 1(또는 그 이상의) 인공 도입된 인트론(들)을 포함하는 인공 유전자인 키메라 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
따라서, 본 발명은 1(또는 그 이상의) 인공적으로 도입된 인트론(들)을 포함하는 인공 유전자 경로인 키메라 폴리뉴클레오티드를 생성한다. 한 측면에서, 인공적으로 도입된 인트론(들)은, 천연 인트론이 유전자 스플라이싱에서 기능적으로 작용하도록 하는 유전자 스프라이싱에 대하여 1 이상의 숙주 세포에서 기능을 갖게 된다. 본 발명은 재조합 및/또는 스플라이싱을 위한 숙주 유기체에 도입시키고자 하는 인공 인트론 함유 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명을 사용하여 생성된 인공 유전자는 또 다른 핵산을 사용한 재조합에 대한 기질로서 작용한다. 마찬가지로, 본 발명을 사용하여 생성된 인공 유전자 경로는 또 다른 핵산을 사용한 재조합에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 한 측면에서, 재조합은 인공 인트론 함유 유전자와 핵산의 사이의 상동성 부위에 의하여 촉진되거나 또는 이 부위에서 발생하며, 이는 재조합 파트너로서 작용하게 된다. 한 측면에서, 또한, 재조합 파트너는 인공 유전자 또는 인공 유전자 경로를 비롯한 본 발명에 의하여 생성된 핵산이 될 수 있다. 재조합은 인공 유전자내에서 1 (또는 그 이상)의 인공적으로 도입된 인트론(들)에 존재하는 상동체의 부위에 의하여 촉진될 수 있거나 또는 이 부위에서 발생할 수 있다.
본 발명의 합성 결찰 리어셈블리 방법은 다수의 핵산 빌딩 블록을 사용하며, 각각의 블록은 2개의 결찰 가능한 종단부를 지닐 수 있다. 핵산 빌딩 블록 각각에서의 2개의 결찰 가능한 종단부는 2개의 블런트 종단부(즉, 각각이 0개의 뉴클레오티드의 오버행을 지님)가 존재하거나 또는 하나의 블런트 종단부와 하나의 오버행 또는 2개의 오버행을 지닐 수 있다.
이러한 목적에 유용한 오버행은 3' 오버행 또는 5' 오버행이 될 수 있다. 따라서, 핵산 빌딩 블록은 3' 오버행을 갖거나 또는 5' 오버행 또는 2개의 3' 오버행 또는 2개의 5' 오버행을 가질 수 있다. 최종 키메라 핵산 분자를 형성하기 위하여 핵산 빌딩 블록을 조립하는 전체 순서는 무작위가 아닌 의미있는 실험 디자인에 의하여 결정된다.
한 측면에서, 핵산 빌딩 블록은 2개의 단일 가닥 핵산(또는 단일 가닥 올리고로 지칭함)의 화학적 합성 및, 이들을 접촉에 의해 어닐링시켜 이중 가닥 핵산 빌딩 블록을 형성함으로써 생성된다.
이중 가닥 핵산 빌딩 블록은 다양한 크기를 지닐 수 있다. 이러한 빌딩 블록의 크기는 작거나 또는 클 수 있다. 빌딩 블록의 크기의 예로는 1개의 염기쌍(임의의 오버행을 포함하지 않음) 내지 100,000개의 염기쌍(임의의 오버행을 포함하지 않음) 등이 된다. 1 bp∼10,000 bp(이들 사이의 모든 정수 포함)의 하한 및 2 bp∼100,000 bp(이들 사이의 모든 정수 포함)의 상한을 가진 기타의 크기 범위도 제공된다.
본 발명에 대하여 유용한 이중 가닥 핵산 빌딩 블록을 생성할 수 있는 다수의 방법이 존재하며, 이들은 당업계에서 공지되어 있으며, 이는 당업자에 의하여 용이하게 수행될 수 있다.
한 측면에 의하면, 이중 가닥 핵산 빌딩 블록은 2개의 단일 가닥 핵산을 1차 생성하고, 이들을 어닐링 처리하여 이중 가닥 핵산 빌딩 블록을 생성함으로써 형성된다. 이중 가닥 핵산 빌딩 블록의 2개의 가닥은 오버행을 형성하는 임의의 것으로부터 떨어져 있는 모든 뉴클레오티드에서 상보성을 지닐 수 있으며, 이로써 임의의 오버행(들)로부터 떨어진 부정합을 포함하지 않게 된다. 또 다른 측면에 의하면, 이중 가닥 핵산 빌딩 블록의 2개의 가닥은 오버행을 형성하는 임의의 것으로부터 떨어져 있는 모든 뉴클레오티드보다 적은 것과 상보성을 가진다. 따라서, 이러한 측면에 의하면, 이중 가닥 핵산 빌딩 블록을 사용하여 코돈 축퇴를 도입할 수 있다. 한 측면에서, 코돈 축퇴는 1 이상의 N,N,G/T 카세트를 사용하여 또는 1 이상의 N,N,N 카세트를 사용하여 본 명세서에서 설명된 부위 포화 돌연변이 유발을 사용하여 도입된다.
본 발명의 생체내 재조합 방법은 특이성 폴리뉴클레오티드 또는 서열의 미지의 하이브리드 또는 대립유전자의 풀상에 맹검 수행될 수 있다. 그러나, 특이성 폴리뉴클레오티드의 실제의 DNA 또는 RNA 서열을 반드시 알아야만 하는 것은 아니다.
유전자의 혼합 모집단내에서의 재조합을 사용한 접근법은 임의의 유용한 단백질, 예를 들면, 인터류킨 I, 항체, tPA 및 성장 호르몬의 생성에 유용할 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여 변형된 특이성 또는 활성을 가진 단백질을 생성할 수 있다. 이러한 접근법은 하이브리드 핵산 서열, 예를 들면, 유전자의 프로모터 부위, 인트론, 엑손, 인핸서 서열, 31개의 미번역 부위 또는 51개의 미번역 부위의 형성에 이로울 수 있다. 따라서, 이러한 접근법을 사용하여 증가된 비율의 형질발현을 가진 유전자를 생성할 수 있다. 이러한 접근법은 또한 반복적인 DNA 서열의 연구에도 유용할 수 있다. 마지막으로, 이러한 접근법은 리보자임 또는 압타머를 돌연변이시키는데 유용할 수 있다.
한 측면에서, 본 명세서에서 설명된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변이체는 DNA, RNA 또는 단백질 완전 재조합과 같은 매우 복잡한 선형 서열의 유도 분자 진화가 가능케 되는 환원적 재분류, 재조합 및 선택의 반복된 사이클의 사용에 의하여 얻는다.
분자의 생체내 셔플링은 변이체를 제공하는데 유용하며, 다량체를 재조합하기 위하여 세포의 천연 성질을 이용하여 수행할 수 있다. 생체내 재조합이 분자 다양성으로의 주요한 천연 경로를 제공하는 반면, 유전자 재조합은 1) 상동체의 인식; 2) 재조합 키아즈마의 생성을 유도하는 가닥 분열, 가닥 침입 및 대사 단계; 최종적으로 3) 불연속 재조합된 분자로의 키아즈마의 분해를 비롯한 비교적 복잡한 방법을 유지한다. 키아즈마의 형성은 상동성 서열의 인식을 필요로 한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 제1의 폴리뉴클레오티드 및 제2의 폴리뉴클레오티드로부터 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법을 포함한다. 본 발명을 사용하여 적절한 숙주 세포로 부분 서열 상동체(예를 들어, 서열 번호 1)의 적어도 한 부분을 공유하는 적어도 제1의 폴리뉴클레오티드 및 제2의 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 부분 서열 상동체의 부위는 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 서열 인지를 초래하는 방법을 촉진한다. 본 명세서에서 사용한 용어 "하이브리드 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 방법으로부터 생성된 임의의 뉴클레오티드 서열이 되며, 이는 2 이상의 원래의 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 서열을 포함한다. 이러한 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자간의 서열 통합을 촉진하는 분자간 재조합 이벤트로부터 생성될 수 있다. 또한, 이러한 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자내의 뉴클레오티드 서열을 변형시키기 위하여 반복된 서열을 사용하는 분자내 환원적 재분류로부터 생성될 수 있다.
본 발명은 생물학적 활성인 하이브리드 폴리펩티드(예를 들어, 하이브리드 피타제)를 코딩할 수 있는 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 원래의 폴리뉴클레오티드는 생물학적 활성 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명의 방법은 생성된 하이브리드 폴리뉴클레오티드가 초기 생물학적 활성인 폴리펩티드로부터 유래한 활성을 예시하는 폴리펩티드를 코딩하도록 원래의 폴리뉴클레오티드의 서열을 통합하는 세포성 방법을 사용함으로써 신규한 하이브리드 폴리펩티드를 생성한다. 예를 들면, 원래의 폴리뉴클레오티드는 각종의 미생물로부터 특정의 효소를 코딩할 수 있다. 유기체 또는 변이체로부터 제1의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 효소는 특정한 환경 조건, 예를 들어, 높은 염도하에서 유효하게 작용하게 된다. 각종의 유기체 또는 변이체로부터 제2의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 효소는 각종의 환경 조건 하에서, 매우 높은 온도에서도 유효할 수 있다. 제1 및 제2의 원래의 폴리뉴클레오티드로부터의 서열을 포함하는 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 원래의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 효소 모두의 특성을 나타내는 효소를 코딩할 수 있다. 따라서, 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 효소는 제1 및 제2의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩된 효소 각각에 의하여 공유되는 환경적 조건 하에서, 예를 들어, 높은 염도 및 극단의 온도하에서 유효하게 작용할 수 있다.
상기 기술한 각종의 방법 이외에, 개선된 효소 성질을 가진 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 얻기 위하여 사용할 수 있는 각종의 방법이 공지되어 있다. 하기의 실시예는 관심의 대상이 되는 야생형 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 유발에 의하여 열안정성 또는 내열성 효소를 얻기 위한 절차의 사용이 예시되어 있다.
예를 들어, 한 측면에서, 본 발명은 문헌 [M. Lehmann et al. (in Biochimica et Biophysica Acta 1543:408-415, 2000)]에 기재된, 상동성 진균 피타제의 서열 정렬을 사용하여 공통의 피타제 아미노산 서열을 계산할 수 있는 "공통 접근법"과 같은 방법을 사용한다. 상응하는 공통 유전자의 구성, 재조합 형질발현 및 정제시, 얻은 재조합 피타제는 디자인에 사용된 모든 모 피타제의 온도보다 높은 미폴딩 온도(Tm) 15℃∼22℃를 나타낸다. 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 부위 유도 돌연변이 유발을 사용하여 Tm을 90.4℃로 추가로 승온시킨다. 열안정화 효과는 단백질의 전체 서열에 분포하며, 주로 표면 노출된 잔기에 영향을 미치는 다중 아미노산 교환에 기인한 것이다.
한 측면에서 본 발명은 문헌 [L. Jermutus et al. (J. of Biotechnology 85:15-24, 2001]에 기술되어 있는 것과 같은, 개선된 열 특성을 가진 효소를 얻기 위한 방법을 사용한다. 이러한 접근법에서, 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)의 피타제의 표면상의 이온 교환 및 수소 결합은 1차로 저장되어 상동성은 지니나, A. 니거(A. niger)로부터의 더욱 열안정한 효소내에 존재하는 것에 해당하게 된다. 그후, 전체 2차 구조 원소를 A. 니거 피타제의 결정 구조에 기초하여 동일한 부위내에서 교체한다. A. 니거 피타제의 상응하는 신장에 의하여 A. 테레우스 피타제의 표면상의 하나의 α 나선구조의 치환에 의하여 개선된 열안정성 및 불변의 효소 활성을 가진 구조계 키메라 효소(융합 단백질)를 생성한다.
한 측면에서, 본 발명은 바실러스 섭틸리스 p-니트로벤질 에스터라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 유발원성 PCR 중에 도입되고, (Stemmer)의 방법에 기초한 시험관내 재조합이 수행되는 6 세대의 무작위 돌연변이 유발은 저온에서 촉매 활성을 저해하지 않으면서 열안정성이 증가된 (Tm이 14℃ 이상 증가됨) 재조합 에스터라제를 생성한다고 기술하고 있는 문헌 [Giver et al. (Proc. Natl . Acad . Sci . USA 95:12809-12813, 1998)]에 기술된 것과 같은 방법을 사용한다.
한 측면에서, 본 발명은 최적의 성장 온도가 각각 100℃ 및 88℃인 초고온성 미생물인 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 및 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)로부터의 6량체 글루타메이트 데히드로게나제의 상동성에 기초한 모델링 및 직접 구조 비교를 사용하여 핵심 열안정성 특징을 결정하는 방법이 설명되어 있다. 덜 안정한 효소내에서 실질적으로 감소시키고자 하는 관찰된 인터서브유닛 이온쌍 네트워크는 더욱 안정한 효소내에서 발견되는 상호관계를 저장하기 위하여 그의 2개의 잔기의 돌연변이 유발에 의하여 변형된다. 이러한 단일 돌연변이가 열안정성에 불리한 영향을 미치기는 하나, 적소에서의 돌연변이 모두를 사용하여 야생형 효소에 비하여 104℃에서의 안정성이 4배 개선된 것으로 관찰되었고 기술하고 있는 문헌 [C. Vetriani et al. {Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:12300-12305, 1998)]에 기술된 것과 같은 방법을 사용한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 효소의 모든 활성 부위를 특정하기 위해 아스퍼길러스 니거 피타제의 결정 구조(2.5 Å 해상도에서)를 이용하는 과정이 기술되어 있다. 이어서, 다수의 아미노산 정렬을 이용하여 소정의 원하는 특성과 관련될 수 있는 비보존된 활성 부위 잔기를 확인하였다. 이 방법을 이용하면, A. 푸미가투스(A. fumigatus) 피타제의 Gln27(아스퍼길러스 니거의 Leu27과는 상이함)은 기질 결합 및/또는 방출과 관련이 있는 것으로 생각되며, A. 푸미가투스 피타제의 더 낮은 비활성에도 관련이 있는 것으로 생각된다(pH 5.0에서 26.5 대 196.6 U/mg 단백질). A. 푸미카투스 피타제의 Gln27의 Leu으로의 부위 지정 돌연변이 유발은 돌연변이체 효소의 비활성을 92.1 U/mg 단백질로 증가시켰다고 기술하고 있는 문헌 [A. Tomschy et al. {Protein Science 9:1304-1311, 2000)]에 기술된 것과 같은 방법을 사용한다.
트랜스제닉 식물 및 종자
본 발명은 본 발명의 핵산, 폴리펩티드, 발현 카세트, 클로닝 기전 또는 벡터, 또는 본 발명의 형질감염된 세포 또는 형질전환된 세포를 포함하는, 트랜스제닉 식물 및 종자를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 식물 제품, 예를 들어, 오일, 종자, 잎, 추출물 등을 제공한다. 트랜스제닉 식물은 쌍떡잎성(쌍떡잎식물) 또는 외떡잎성(외떡잎식물)일 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 트랜스제닉 식물 및 종자의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 구성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,309,872호를 참조한다.
본 발명의 피타제 분자의 재조합 발현, 또는 과발현은 하나 이상의 추가 분자, 예를 들어, 다른 효소와의 조합으로 달성될 수 있다. 이러한 접근법은 조합 생성물, 예를 들어, 본 피타제 분자뿐만 아니라, 하나 이상의 추가 분자를 포함하는 식물 또는 식물 부분을 생산하는 데 유용하다. 본 발명의 피타제 분자 및 추가 분자는 병용 치료법에 사용될 수 있다. 재조합 방법으로 발현된 생성된 분자는 균질 및/또는 정제된 형태로 사용될 있거나, 별법으로 상대적으로 미정제된 형태(예를 들어, 피테이트의 분해를 촉매하기 위한 다른 음식물과 혼합하는 경우 유용하게 소비할 수 있는 식물 부분으로서)로 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 식물 또는 식물 기관에서의 피타제 발현, 및 그의 제조 방법을 제공한다. 피타제 발현을 유도할 수 있는 조절 서열의 제어하에 피타제 코딩 유전자로 식물을 형질전환시키기 위한 DNA 발현 구성물을 제공한다. 이러한 조절 서열로는 식물에서 구성적으로, 또는 단계 및/또는 조직 특이적인 방식으로 전사를 유도할 수 있는 서열을 포함한다.
발현 방식을 부분적으로 식물 또는 그의 일부분의 용도에 따라 달라진다. 본 발명에 의해 제공되는 트랜스제닉 식물 및 식물 기관은 다양한 산업 공정에 직접적으로, 예를 들어, 동물 사료로 적용될 수 있거나, 또는 별법으로, 발현된 피타제는 추출되고, 원한다면, 적용 이전에 정제될 수 있다. 별법으로, 재조합 숙주 식물 또는 식물 부분은 직접 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 증량된 피타제를 함유하는 종자를 사용하여 피테이트의 가수분해 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 본 방법은 예를 들어, 분쇄형 또는 저작형의 트랜스제닉, 비야생형 종자를 피테이트 함유 기질과 접촉시키는 단계, 및 종자에 있는 효소가 반응 속도를 증가시킬 수 있도로 하는 단계를 포함한다. 종자를 피테이트 함유 기질에 직접 첨가함으로써 본 발명은 비용이 많이 들고 많은 문제를 안고 있는 효소 추출 및 정제 방법에 대한 해결 방안을 제공한다. 일례로, 본 발명은 효소 공급이 충분하지 않은 유기체에, 증량된 효소를 함유하는 종자의 형태로 효소를 제공하는 것인 처리 방법을 제공한다. 한 측면에서, 효소를 유기체에게 제공하는 시기는 피테이트 함유 식량을 소비하는 시기와 함께 조율된다.
식물에서의 피타제 발현은 다양한 수단에 의해 이루어질 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 외떡잎식물 종(예를 들어, 담배, 감자, 토마토, 피튜니아, 브라씨카) 및 외떡잎식물 종을 비롯한, 다수의 식물 종을 형질전환시키는 기술이 이용가능하다. 추가로, 예를 들어, 식물에서 외래 유전자를 발현시키는 전략법도 이용가능하다. 추가로, 식물 및 식물 세포에서 기능적으로 발현될 수 있는 키메라 유전자를 구성하는 데 유용한, 식물 유전자로부터 유래된 조절 서열이 확인되었다(예를 들어, 문헌 ([Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]; [Clark et al. (1990) Virology Dec;179(2):640-7]; [Smith et al. (1990) Mol. Gen. Genet. Dec;224(3):477-81])).
식물내로 유전자 구성물의 도입은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciences) 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 이용하는 형질전환을 포함하는 몇몇 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 이렇게 형질전환될 수 있는 식물 조직의 비제한적인 예로는 원형질체, 미세포자 또는 꽃가루, 및 잎, 줄기, 뿌리, 히드로코틸 및 코틸과 같은 외식편을 들 수 있다. 또한, DNA는 미세 주입법, 전기천공법, 입자 충격요법 및 DNA 직접 흡수법에 의해 원형질체 및 식물 세포내로 직접 도입할 수 있다.
단백질은 식물 내에서 다양한 발현 시스템에 의해 생성할 수 있다. 예를 들어, 구성적 프로모터, 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터(문헌 [Guilley et al., 1982])를 이용하여 실제로 트랜스제닉 식물의 모든 기관에 발현된 단백질을 축적시킬 수 있다. 별법으로, 본 발명에서 고도로 조직 및/또는 단계 특이성인 프로포터를 이용하면(문헌 ([Higgins, 1984]; [Shotwell, 1989])), 원하는 조직 및/또는 원하는 발생 단계로 발현을 편향시킬 수 있다. 본 발명은 예를 들어, 진균 피타제의 용도를 교시하는 미국 특허 번호 제5,770,413호(Van Ooijen et al.) 및 미국 특허 번호 제5,593,963호(Van Ooijen et al)에 개시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 피타제 분자를 식물에서 발현시키는 프로토콜을 사용한다.
코딩 서열 및 인접 서열의 변형
이종성 공급원으로부터 유래된 유전자의 식물에서의 트랜스제닉 발현은 식물에서 그의 발현을 달성하고 최적화하기 위해 상기 유전자를 변형하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 별개의 효소를 코딩하지만, 천연 미생물내에서 동일한 전사체에 의해 코딩되는 박테리아 ORF는 식물에서 별개의 전사체로서 최적으로 발현된다. 따라서, 한 측면에서, 이를 달성하기 위해, 각각의 미생물 ORF를 개별적으로 단리시키고, 상기 ORF의 5' 말단에 식물 프로모터 서열을, ORF의 3' 말단에 식물 전사 종결 인자를 제공하는 카세트내에서 클로닝시킨다. 단리된 ORF 서열은 개시 ATG 코돈 및 종결 STOP 코돈을 포함하지만, 개시 ATG 및 STOP 코돈 이외의 추가 서열도 포함할 수 있다. 또한, ORF는 절단될 수 있으나 필요한 활성은 여전히 보유할 수 있으며, 특히 활성을 보유하는 절단된 버전의 긴 ORF가 형질전환 유기체에서의 발현에서 바람직할 수 있다. 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있는 "식물 프로모터" 및 "식물 전사 종결 인자"는 식물 세포내에서 작동하는 임의의 프로모터 및/또는 전사 종결 인자를 포함한다. 이는 바이러스(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스)와 같은 비식물 공급원으로부터 유래될 수 있는 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
일부 경우에서, ORF 코딩 서열 및 인접 서열의 변형이 필요한 것은 아니다. 변형은 관심의 대상이 되는 ORF를 함유하는 단편을 단리시키고, 이를 식물 프로모터의 하부에 삽입하는 것만으로도 충분하다. 예를 들어, (Gaffney) 등(문헌 [Gaffhey et. al. {Science 261: 754-756 (1993))])은 슈도모나스 nahG 유전자를,코딩 서열은 변형시키지 않고, ATG의 상류에 위치하는 슈도모나스 유전자, 및 STOP 코돈의 하류에 위치하는 뉴클레오티드를 사용하여 nahG ORF에 연결시킨 채, CaMV 35S 프로모터 및 CaMV tml 종결 인자의 제어하에 트랜스제닉 식물내에서 성공적으로 발현시킨 바 있다. 바람직하게는, 가능한 한 소량의 인접 미생물 서열이 ATG의 상부 및 STOP 코돈의 하부에 연결되어야 한다. 사실상, 이러한 구성은 제한 부위의 이용가능성에 따라 달라질 수 있다.
다른 경우에서, 미생물 공급원으로부터 유래된 유전자의 발현은 발현에 있어 문제를 제공할 수 있다. 이들 문제의 특징은 당업계에서 잘 규명되어 있으며, 특히 특정 미생물 공급원으로부터 유래된 유전자에서는 통상적인 것이다. 이들 문제는 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 적용될 수 있으며, 현재 당업계에 주지되어 있는 기법을 사용하여 이들 유전자를 변형시킬 수 있다. 직면할 수 있는 문제는 다음과 같다:
코돈 선 호도
본 발명은 식물에서의 선호도를 위해 변형된 코돈을 가진 핵산을 제공한다; 일부 경우에서, 식물에서 선호 코돈 선호도는 특정 미생물에서의 선호 코돈 선호도와 상이하다. 클로닝된 미생물 ORF내의 코돈 선호도와 식물 유전자(및 특히 표적 식물로부터의 유전자)에서의 선호도를 비교하면 바람직하게는 변형되어야 하는 ORF내의 코돈을 확인할 수 있다. 전형적으로, 식물 진화는 외떡잎식물의 제3 염기 위치에서 뉴클레오티드 C 및 G를 강하게 선호하는 경향이 있는 반면에, 쌍떡잎식물은 흔히 상기 위치에 뉴클레오티드 A 또는 T를 사용한다. 유전자를 변형시켜 특정 표적 트랜스제닉 식물에 선호 코돈 선호도를 도입함으로써, 하기 기술하는 GC/AT 함량 및 변칙적 스플라이싱에 관한 다수의 문제를 해결할 수 있다.
GC / AT 함량
본 발명은 예를 들어, 식물에서의 선호도를 위해 그의 GC 함량이 변형된 핵산을 제공한다; 전형적으로 식물 유전자에서 GC 함량은 35%를 초과한다. A 및 T 뉴클레오티드가 풍부한 ORF 서열은 식물에서 몇 가지 문제를 일으킬 수 있다. 먼저, ATTTA 모티프는 메세지의 불안정화를 유발하는 것으로 사료되며, 반감기가 짧은 많은 mRNA의 3' 말단에서 발견된다. 둘째로, 메세지내의 부적절한 위치에서 AATAAA와 같은 폴리아데닐화 신호의 발생은 전사의 조기 중단을 유발하는 것으로 사료된다. 또한, 외떡잎식물은 AT가 풍부한 서열을 스플라이싱 부위로서 인식할 수 있다(하기 참조).
개시 메티오닌에 인접한 서열
본 발명은 뉴클레오티드가 변형 및/또는 첨가된 ATG에 인접해 있는 핵산을 제공한다; 식물은 그의 메세지가 한정된 리보좀 결합 부위를 지니지 않는다는 점에서 미생물과 구별된다. 오히려, 리보좀이 메세지의 5' 말단에 결합하여 전사가 개시되는 첫번째 이용가능한 ATG를 탐색하는 것으로 사료된다. 그럼에도 불구하고, ATG에 인접한 특정 뉴클레오티드에 대해 선호하고, 미생물 유전자의 발현은 ATG에 진핵성 공통 번역 개시 인자를 포함시킴으로써 증강될 수 있다. 클론테크(Clontech)(문헌 [Clontech (1993/1994 catalog, page 210)](이는 본원에서 참고로 인용된다))는 한 서열을 식물에서 E. 콜라이 uidA 유전자를 발현시키기 위한 공통 번역 개시 인자로서 제시한 바 있다. 또한, Joshi(문헌 [Joshi (N.A.R. 15: 6643-6653 (1987)](이는 본원에서 참고로 인용된다))는 ATG에 인접한 다수의 식물 서열을 비교하였고, 또 다른 공통 서열을 제시한 바 있다. 식물에서 미생물 ORF를 발현시키는 데 어려움에 직면한 상황하에서는 이들 서열 중 하나를 개시 ATG에 포함시켜 번역을 개선시킬 수 있다. 이러한 경우에, 공통의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 그의 두번째 AA 잔기의 변형으로 인해, 변형된 서열내에 포함시키기에 적절하지 않을 수 있다. 일부 측면에서, 개시 메티오닌에 인접한 바람직한 서열은 상이한 식물 종 간에 상이할 수 있다. 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에 위치한 14개의 옥수수 유전자에 대한 조사는 하기와 같은 결과를 제공한다:
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상기 분석은 뉴클레오티드 서열이 도입된 원하는 식물 종, 및 바람직한 뉴클레오티드를 포함하도록 변형된 ATG에 인접한 서열에 대해 수행될 수 있다.
변칙적 스플라이싱 부위의 제거
본 발명은 변칙적 스플라이싱 부위가 변형 또는 제거 또는 기능적으로 "넉 아웃"된 핵산을 제공한다: 비식물 공급원으로부터 클로닝되고, 식물에서의 발현을 위해서는 최적화되지 않은 유전자는 또한 식물에서 5' 또는 3' 스플라이싱 부위로서 인식되고 절단됨으로써 절단되거나 결실된 메세지를 생성할 수 있는 모티프를 함유할 수도 있다. 이들 부위는 당업계에 주지된 기법을 사용하여 제거할 수 있다.
코딩 서열 및 인접 서열을 변형시키기 위한 기법은 당업계에 주지되어 있다. 미생물 ORF의 초기 발현이 저조하고, 상기 기술한 서열에 대한 변경이 이루어지는 것이 바람직하다고 간주되는 경우에, 당업계에 주지된 방법에 따라 합성 유전자를 구성할 수 있다. 이들 방법은 예를 들어, 공개 특허 공보 제EP 0 385 962(Monsanto), EP 0 359 472(Lubrizol) 및 WO 93/07278(Ciba-Geigy)(이들 모두 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 대부분의 경우, 유전자 구성물의 발현은 유전자를 트랜스제닉 식물로 전달시키기 전에 일시적 분석 프로토콜(이는 당업계에 주지되어 있다)을 사용하여 분석하는 것이 바람직하다.
식물 프로모터
본 발명의 조성물은 예를 들어, 관심의 대상이 되는 식물에서의 형질전환 및 발현을 위한 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 DNA 구성물 또는 발현 카세트로 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산은 종결 신호에 작동 가능하게 연결된 관심의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 적절한 숙주 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있는 핵산 분자를 포함하는, 임의의 핵산 분자를 포함하는 "발현 카세트"일 수 있거나, 또는 그를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 핵산 서열)은 또한, 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위해 필요한 서열을 포함할 수 있다. 코딩 영역은 일반적으로 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하지만, 이는 또한 센스 또는 안티센스 방향으로 관심의 대상이 되는 기능성 RNA, 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 비번역 RNA를 코딩할 수도 있다. 관심의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라성일 수 있는데, 이는 그의 구성 성분 중 적어도 하나는 그의 다른 구성 성분 중 적어도 하나와 관련하여 이종성이라는 것을 의미한다. 발현 카세트는 또한 천연 발생이지만, 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 수득된 것인 발현 카세트일 수 있다. 그러나, 전형적으로 발현 카세트는 숙주와 관련하여 이종성이고, 즉, 발현 카세트의 특정 DNA 서열은 숙주 세포에서 천연적으로는 발생되지 않는 것이며, 형질전환 이벤트에 의해 숙주 세포 또는 숙주 세포의 조상으로 도입된 것임에 틀림없다. 발현 카세트 중 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터의 제어하에 있거나, 또는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출되었을 때에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 추가로, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관, 또는 발생 단계에 특이적일 수 있다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 발현 카세트로 식물을 형질전환시키는 것을 포함한다. 발현 카세트는 5'에서 3'으로의 전사 방향으로 전사 및 번역 개시 영역(즉, 프로모터) 및 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 발현 카세트는 임의로 식물에서 작용성인 전사 및 번역 종결 영역(즉, 종결 영역)을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 안정적인 형질전환체를 선별할 수 있도록 하는 선별가능한 마커 유전자를 포함한다. 본 발명의 발현 구성물은 또한 리더 서열 및/또는 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드의 유도성 발현을 가능하게 하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 유도성 발현을 가능하게 하는 서열에 대해서는 문헌 ([Guo et. al. (2003) Plant J. 34:383-92] 및 [Chen et. al. (2003) Plant J. 36:731-40])을 참조한다.
발현 구성물의 조절 서열은 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있다. "작동 가능하게 연결"이라는 것은 프로모터 서열이 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시 및 매개할 수 있도록 하는 의도의 프로모터와 제2 서열 사이의 기능적 결합이다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결이라는 것은 연결된 뉴클레오티드 서열이 인접하고 있는 것을 의미한다.
관심의 대상이 되는 식물에서 발현을 구동할 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다. 프로모터는 천연 프로모터이거나, 식물 숙주에 유사한 프로모터, 또는 외래 또는 이종성인 프로모터일 수 있다. 본원에서 사용될 때, "이종성" 및 "외인성"이라는 용어는 핵산 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA 서열) 또는 유전자를 지칭하고, 특정 숙주 세포에 외래인 공급원으로부터 기원하는 서열, 또는 같은 공급원으로부터 유래된 경우라도 그의 원래 형태로부터 변형된 서열을 의미한다. 따라서, 숙주 세포 중의 이종성 유전자는 특정 숙주 세포에 대해 내인성이지만, 변형된 것인 유전자를 포함한다. 상기 용어는 또한 천연 발생 DNA 서열의 비천연 발생 다중 카피를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 세포에 외래 또는 이종성이거나, 세포에 동종성이지만 그 요소가 보통은 발견되지 않는 숙주 세포 핵산내 위치에 있는 것인 DNA 세그먼트를 의미한다. 외인성 DNA 세그먼트의 발현으로 외인성 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 대안적 실시양태에서, "동종성" 핵산(예를 들어, DNA) 서열은 그가 도입되는 숙주 세포와 천연적으로 회합하고 있는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열이다.
포함시키고자 하는 프로모터의 선택은 효율, 선택가능성, 유도성, 원하는 발현 수준, 및 세포 또는 조직 선호성 발현을 포함하나, 이에 한정되지 않는 수개의 인자에 따라 달라질 수 있다. 적절하게 프로모터 및 다른 조절 영역을 선택하고 본 서열과 비교하여 그의 위치를 선정하여 배치함으로써 서열의 발현을 조절하는 것은 당업계의 숙련가에게는 통상의 문제이다.
일부 적합한 프로모터는 오직 전사만을 개시하거나, 또는 지배적으로는 특정 세포 유형에서만 그러하다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 세포 유형 또는 조직 선호성 프로모터는 우선적으로 표적 조직에서 발현을 유도하지만, 이는 또한 다른 세포 유형 또는 조직에서도 일부 발현을 유도할 수 있는 것이다. 식물 게놈 DNA에서 프로모터 영역을 확인하고 그의 특징을 규명하는 방법은 예를 들어, 하기 참조 문헌에 기술되어 있는 것을 포함한다: 문헌 ([Jordano, et. al, Plant Cell, 1:855-866 (1989)]; [Bustos, et. al, Plant Cell, 1:839-854 (1989)]; [Green, et. al, EMBO J. 7, 4035-4044 (1988)]; [Meier, et. al, Plant Cell, 3, 309-316 (1991)]; 및 [Zhang, et. al, Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996)]).
식물에서의 조직 선호성 조절 유전자 및/또는 프로모터 여러 개가 보고되어 있다. 일부 보고된 조직 선호성 유전자로는 종자 저장 단백질(예를 들어, 나핀, 크루시페린, 베타 콘글리시닌, 및 파세올린, 프롤라민, 글루텔린, 글로불린, 및 제인), 제인 또는 유체 단백질(예를 들어, 올레오신)을 코딩하는 유전자, 또는 지방산 생합성에 관여하는 유전자(아실 운반 단백질, 스테아로일 ACP 데새튜라제, 및 지방산 데새튜라제(fad 2-1)), 및 배아 발생 동안 발현되는 다른 유전자(예를 들어, Bce4, 예를 들어, 문헌 (EP 255378 및 [Kridl et. al, (1991) Seed Science Research, 1:209] 참조)를 포함한다.
기술된 조직 특이성 프로모터의 예로는 렉틴(문헌 ([Vodkin, Prog. Clin. Biol. Res., 138;87 (1983)]; [Lindstrom et. al, (1990) Der. Genet, 11:160])), 옥수수 알콜 데히드로게나제 1(문헌 [Dennis et. al. Nucleic Acids Res, 12:3983 (1984)]), 옥수수 집광성 복합체(예를 들어, 문헌 ([Simpson, (1986) Science, 233:34]; [Bansal (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654]) 참조), 옥수수 열 충격 단백질(예를 들어, 문헌 [Odell et. al, (1985) Nature, 313:810] 참조); 완두 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제(예를 들어, 문헌 ([Poulsen et. al, (1986) Mol. Gen. Genet, 205:193-200]; [Cashmore et. al, (1983) Gen. Eng. of Plants, Plenum Press, New York, 29-38]) 참조); Ti 플라스미드 만노핀 신타제(예를 들어, 문헌 [Langridge et. al, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223] 참조), Ti 플라스미드 노팔린 신타제(문헌 [Langridge et. al, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223]), 페츄니타 칼콘 이소머라제(예를 들어, 문헌 [vanTunen (1988) EMBO J. 7:1257] 참조); 콩 글리세린이 풍부한 단백질 1(예를 들어, 문헌 [Keller (1989) Genes Dev. 3:1639] 참조); 절단된 CaMV 35(예를 들어, [Odell (1985) Nature 313:810] 참조); 감자 파타틴(예를 들어, 문헌 [Wenzler (1989) Plant Mol. Biol. 13:347] 참조); 뿌리 세포(예를 들어, 문헌 [Yamamoto (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449] 참조); 옥수수 제인(예를 들어, 문헌 ([Reina (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425]; [Lopes et. al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247: 603-613]; [Kriz (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90]; [Wandelt (1989) Nucleic Acids Res., 17:2354]; [Langridge (1983) Cell, 34:1015]; [Reina (1990) Nucleic Acids Res, 18:7449]) 참조), ADP-gpp 프로모터(예를 들어, 미국 특허 번호 제7,102,057호 참조); 글로불린 1(예를 들어, 문헌 [Belanger (1991) Genetics 129:863] 참조); α 글로불린(문헌 [Sunilkumar, et. al. (2002), Transgenic Res. 11:347-359]); α 튜불린; cab(예를 들어, 문헌 [Sullivan (1989) Mol. Gen. Genet., 215:431] 참조); PEPC아제(예를 들어, [Hudspeth & Grula, (1989) Plant Molec. Biol, 12:579-589] 참조); R 유전자 복합체 회합 프로모터(문헌 [Chandler et. al., (1989) Plant Cell, 1:1175]); 완두 비실린 프로모터(문헌 ([Czako et. al., (1992) Mol. Gen. Genet, 235:33]; 미국 특허 번호 제5,625,136호); GTL1 프로모터(문헌 [Takaiwa et. al. (1991) Plant Mol. Biol. 16 (1), 49-58]); 칼콘 신타제 프로모터(문헌 [Franken et. al., (1991) EMBO J., 10:2605]); GY1 프로모터(문헌 [Sims & Goldburg (1989) Nuc. Acid Res. 17(11) 4368]) 등을 포함하며; 이들 모두는 본원에서 참고로 인용된다.
본 발명은 예를 들어, U.S. 4,943,674(이의 개시 내용이 본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 반정립시 또는 그 동안에 발현되어 과실 발생 단계를 거쳐 적어도 익기 시작할 때까지, 임의의 부류를 과실 선호성 프로모터를 비롯한, 과실 선호성 프로모터가 사용될 수 있다. 폴리갈락투로나제 유전자에 대한 프로모터는 과실 숙성시 활성을 띤다. 본 발명은 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,535,060호, 미국 특허 번호 제4,769,061호, 미국 특허 번호 제4,801,590호, 및 미국 특허 번호 제5,107,065호(이들의 개시 내용이 본원에서 참고로 인용된다)에 기술되어 있는 바와 같은 폴리갈락투로나제 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명은 (예를 들어, 곤충이 갉아먹어) 잎이 손상된 후의 잎 세포에서, 괴경에서(예를 들어, 파타틴 유전자 프로모터), 및 섬유 세포에서(발생상 조절된 섬유 세포 단백질은 E6이다(문헌 [John & Crow (1992) PNAS 89:5769-5773])의 발현을 유도하는 것을 비롯한, 임의의 조직 선호성 프로모터를 사용할 수 있다. E6 유전자는 비록 낮은 수준의 전사체가 잎, 및 꽃에서도 발견되지만, 섬유에서 가장 활성을 띤다.
본 발명은 예를 들어, 녹색 조직, 예를 들어, 잎 및 줄기에서 전사를 구동시키기 위해 광합성 조직에서 활성인 프로모터를 사용할 수 있고, 이는 오직 상기 조직에서만, 또는 지배적으로 상기 조직에서 발현을 구동시킬 때 적합하다. 별법으로, 본 발명은 식물 전체에 구성적으로, 또는 녹색 조직과 비교하여 차별적으로, 또는 발현이 일어나는 녹색 조직의 발생 단계와 비교하여 차별적으로, 또는 외부 자극에 대한 반응으로 발현을 부여하는 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명을 수행하는 데 사용되는 예시적인 프로모터로는 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제(RbcS) 프로모터, 예를 들어, 동부 낙엽송(라릭스 라리시나(Larix laricina))로부터의 RbcS 프로모터, 소나무 cab6 프로모터(문헌 [Yamamoto et. al. (1994) Plant Cell Physiol. 35:773-778]), 밀로부터의 Cab 1 유전자 프로모터(문헌 [Fejes et. al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:921-932]), 시금치로부터의 CAB 1 프로모터(문헌 [Lubberstedt et. al. (1994) Plant Physiol. 104:997-100]6), 벼로부터의 cab1R 프로모터(문헌 [Luan et. al. (1992) Plant Cell 4:971-981]), 옥수수로부터의 피루베이트 오르토포스페이트 디키나제(PPDK: pyruvate orthophosphate dikinase) 프로모터(문헌 [Matsuoka et. al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:9586-9590]), 담배 Lhcbl*2 프로모터(문헌 [Cerdan et. al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:245-255]), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) SUC2 수크로스-H+ 공수송체 프로모터(문헌 [Truernit et. al. (1995) Planta 196:564-570]), 및 시금치로부터의 틸라코이드 막 단백질 프로모터(psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS)를 포함한다. 줄기, 잎, 녹색 조직에서 전사를 구동하는 다른 프로모터는 미국 특허 공개 번호 제2007/0006346호(이들의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 일부 "조직 선호성" 프로모터의 조직 특이성이 절대적일 수는 없으며, 리포터 유전자, 예를 들어, Gus 또는 녹색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질로 테스트될 수 있다. 상이한 조직 선호성 프로모터의 조합에 의해 "노출성" 발현과 함께 조직 선호서 발현 또한 달성할 수 있다. 다른 조직 선호성 프로모터는 당업자에 의해 단리될 수 있다(미국 제5,589,379호를 참조한다).
한 측면에서, 식물 호르몬, 예를 들어, 옥신에 노출될 때 유도성이 되는 식물 프로모터는 본원에서 제공하는 것과 같은 핵산을 발현시키는 데에 사용된다. 예를 들어, 본 발명은 대두(글리신 맥스 L.(Glycine max L.))의 옥신 반응 요소 E1 프로모터 단편(AuxREs)(문헌 [Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407]); 옥신 반응성 아라비돕시스 GST6 프로모터(살리실산과 과산화수소에도 반응성이다)(문헌 [Chen (1996) Plant J. 10: 955966]); 담배로부터 유래된 옥신 유도성 parC 프로모터(문헌 [Sakai (1996) 37:906-913]); 식물 비오틴 반응 요소(문헌 [Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937]); 및 스트레스 호르몬인 앱사이신산에 반응성인 프로모터(문헌 [Sheen (1996) Science 274:1900-1902])을 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산은 또한 식물에 적용될 수 있는 화학 시약, 예로서, 제초제 또는 항생제에 노출될 때에 유도될 수 있는 식물 프로모터에 작동가능하게 연결될 수도 있다. 예를 들어, 에탄올을 비롯한 화학적 리간드의 존재하에서 활성화되는 유전자 발현 시스템은 예를 들어, 문헌 (WO 96/27673; WO 93/01294; WO 94/03619; WO 02/061102(이들 모두가 본원에서 참고로 인용된다))에서 살펴볼 수 있다. 벤젠설폰아미드 제초제의 안정제에 의해 활성화되는 옥수수 In2-2 프로모터가 사용될 수 있으며(문헌 [De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577]); 상이한 제초제의 안정제를 사용할 경우, 독특한 유전자 발현 패턴, 예로서, 뿌리, 배수 조직 및 어린 싹의 정점에 존재하는 분열 조직의 발현을 유도하게 된다. 예를 들어, 트랜스제닉 담배 식물이 아베나 사티바 L.(Avena sativa L.)(귀리)의 아르기닌 데카르복실라제 유전자(문헌 [Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473]); 에스트로겐, 예를 들어, 엑디손 수용체(WO 01/52620), 또는 살리실산 반응성 요소(문헌 [Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324])를 포함한다고 기재되어 있는 것과 같이, 코딩 서열은 예로서, 테트라사이클린 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 화학적으로 유도되는(예를 들어, 호르몬이나 살생물제로 유도되는) 프로모터, 즉, 목초지에 있는 트랜스제닉 식물에 적용될 수 있는 화학 물질에 반응성인 프로모터를 사용할 경우, 본 발명의 폴리펩티드의 발현은 식물의 특정 발달 단계에서 유도될 수 있다.
본 발명을 수행하는 사용될 수 있으며, 하기 문헌에 기술되어 있는 예시적인 구성적 프로모터로는 벼 액틴 1(문헌 ([Wang et. al. (1992) Mol. Cell. Biol., 12:3399]; 미국 특허 번호 제5,641,876호)); 다른 액틴 이소폼(문헌 ([McElroy et. al. (1990) Plant Cell 2: 163-171] 및 [McElroy et. al. (1991) Mol. Gen. Genet. 231: 150-160])); CaMV 35S(문헌 [Odell et. al. (1985) Nature, 313:810]); CaMV 19S(문헌 ([Lawton et. al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324]; 미국 특허 번호 제5,639,949)); nos(문헌 [Ebert et. al. (1987) PNAS USA 84:5745-5749]); Adh(문헌 [Walker et. al. (1987) PNAS USA 84:6624-6628]), 수크로스 신타제(문헌 [Yang & Russell (1990) PNAS USA 87:4144-4148]); 및 유비퀴틴 프로모터(예를 들어, 해바라기 - 문헌 [Binet et. al. (1991) Plant Science 79: 87-94]; 옥수수 - 문헌 [Christensen et. al. (1989) Plant Molec. Biol. 12: 619-632]; 및 아라비돕시스 - 문헌 ([Callis et. al., J. Biol. Chem. (1990) 265:12486-12493]; 및 [Norris et. al., Plant Mol. Biol. (1993) 21:895-906]))를 포함한다.
임의의 전사 종결 인자가 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있고, 예를 들어, 벡터, 발현 카세트 등에 사용될 수 있다. 트랜스진 범위 이상의 전사를 종결짓는 역할을 하며, mRNA 폴리아데닐화를 수정하는 역할을 한다. 종결 영역은 전사 개시 영역과 함께 천연의 것일 수 있거나, 작동 가능하게 연결된, 관심의 대상이 되는 DNA 서열과 함께 천연의 것일 수 있거나, 식물 숙주와 함께 천연의 것일 수 있거나, 또 다른 공급원으로부터 유래할 것일 수 있다(즉, 상기 프로모터, 관심의 대상이 되는 DNA 서열, 식물 숙주, 또는 그의 임의의 조합에 외래 또는 이종성). 적절한 전사 종결 인자는 식물에서 작용하는 것으로 알려져 있는 것이며, CAMV 35 S 종결 인자, tml 종결 인자, 노팔린 신타제 종결 인자 및 완두 rbcs E9 종결 인자를 포함한다. 이는 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물, 둘 모두에서 사용될 수 있다. 추가로, 유전자의 본래의 전사 종결 인자가 사용될 수 있다.
본 발명은 전사 단위 내의 것으로부터 유전자 발현을 증진시키기 위해 임의의 서열을 사용할 수 있고; 이러한 서열은 트랜스제닉 식물에서 그의 발현을 증가시키기 위해 본 발명의 유전자와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 인트론 서열이 특히, 외떡잎식물 세포에서 발현을 증진시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 옥수수 Adh1 유전자의 인트론은 옥수수 세포에 도입되었을 때 그의 동족 프로모터하에 있는 야생형 유전자의 발현을 유의적으로 증진시키는 것으로 나타났다.
바이러스로부터 유래된 다수의 비번역 리더 서열 또한 발현을 증진시키는 것으로 알려져 있으며, 이는 특히 쌍떡잎식물 세포에서 효과적이다. 특히, 담배 모자이크 바이러스(TMV: Tobacco Mosaic Virus, "W-서열"), 옥수수 황색 반점 바이러스(MCMV: Maize Chlorotic Mottle Virus), 알팔파 모자이크 바이러스(AMV: Alfalfa Mosaic Virus)로부터의 리더 서열이 발현을 증진시키는 데 효과적인 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌 ([Gallie et. al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987)]; [Skuzeski et. al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)])).
세포내에서 유전자 생성물의 표적화
예를 들어, 식물에서 유전자 생성물을 표적화하는 임의의 기전이 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있고, 그러한 기전은 식물에 존재하는 것으로 공지되어 있으며, 이러한 기전의 기능을 제어하는 서열의 특징도 상세하게 규명되어 있다. 유전자 생성무을 다른 세포 구획으로 표적화하는 서열의 특징이 규명되어 있다. 관심의 대상이 되는 단백질을 임의의 세포 구획, 예를 들어, 식물의 액포, 미토콘드리아, 퍼옥시좀, 단백질체, 소포체, 엽록체, 전분 과립, 녹말체, 아포플라스트 또는 세포벽으로 표적화하는 것이 아미노 말단 서열을 통해 이루어질 수 있다(예를 들어, 문헌 ([Unger et. al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)]; [Rogers et. al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-651]; 미국 특허 번호 제7,102,057호; WO 2005/096704(이들 문헌 모두 본원에서 참고로 인용된다)). 임의로, 신호 서열은 waxy로부터의 N 말단 신호 서열, γ 제인으로부터의 N 말단 신호 서열, 전분 결합 도메인, C 말단 전분 결합 도메인, 엽록체 표적 서열(이는 성숙 단백질을 엽록체로 유입한다)(문헌 ([Comai et. al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15104-15109]; [van den Broeck, et. al. (1985) Nature 313: 358-363]; 미국 특허 번호 제5,639,949호), 또는 호분 세포로부터의 분비 신호 서열(문헌 [Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)])일 수 있다. 추가로, 카르복시 말단 서열과 함께 아미노 말단 서열을 통해 유전자 생성물의 액포 표적화가 이루어진다(문헌 [ (Shinshi et. al. (1990) Plant Molec. Biol. 14: 357-368]).
한 측면에서, 선택된 신호 서열은 공지된 절단 부위를 포함하여야 하고, 구성되는 융합물은 절단에 필요한 절단 부위(들) 다음에 있는 임의의 아미노산을 고려하여야 한다. 일부 경우에서는 절단 부위와 트랜스진 ATG 사이에 소수의 아미노산을 첨가하거나, 또는 별법으로, 트랜스진 서열내의 일부 아미노산을 치환시킴으로써 상기와 같은 요건은 충족될 수 있다. 이러한 구성 기법은 당업계에 주지되어 있고, 임의의 세포 구획 어디에나 동등하게 적용가능하다.
한 측면에서, 상기 기술된 세포 표적화 기전은 그의 동족 프로모터와 함께 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 표적 신호가 유래하는 프로모터의 것과는 다른 발현 패턴을 가진 프로모터의 유전자 조절하에서도 특이적인 세포 표적 목적을 달성할 수 있도록 하기 위해 이종성 프로모터와 함께 사용될 수 있다.
요약하면, 트랜스제닉 식물, 종자, 기관, 또는 식물 부분에서 피타제의 재조합 발현을 달성할 수 있도록 하는 임의의 수단을 비롯한, 다양한 수단이 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다. 상기와 같은 트랜스제닉 식물 및 식물 부분은 재조합적으로 발현된 피타제의 공급원으로서 유용하며, 이는 피테이트 함유 공급원에 직접 첨가될 수 있다. 별법으로, 재조합 식물에서 발현된 피타제는 식물 공급원으로부터 추출될 수 있고, 원하는 경우, 피타제 기질과 접촉하기 이전에 정제될 수도 있다.
본 발명과 관련하여 (본 발명을 수행하는 데 사용되는) 선택될 수 있는 식물로는 식용 화훼를 생성하는 곡물, 예를 들어, 콜리플라워(브라씨카 올레라세아(Brassica oleracea)), 아티초크(시나라 스콜리무스(Cynara scolymus)), 과일, 예를 들어, 사과(말루스(Malus), 예를 들어, 도메스티쿠스(domesticus)), 바나나(무사(Musa), 예를 들어, 아쿠미나타(acuminata)), 베리(예를 들어, 커런트, 리브스, 예를 들어, 루브룸(rubrum)), 체리(예를 들어, 스윗 체리, 프루너스, 예를 들어, 아비움(avium)), 오이(쿠쿠미스, 예를 들어, 사티부스(sativus)), 포도(비티스, 예를 들어, 비니페라(vinifera)), 레몬(시트러스 리몬(Citrus limon)), 멜론(쿠쿠미스 멜로(Cucumis melo)), 견과류(예를 들어, 호두, 저글란, 예를 들어, 레기아(regis); 땅콩, 아라키스 하이포게아(Arachis hypogeae)), 오렌지(시트러스, 예를 들어, 막시마(maxima)), 복숭아(프루너스, 예를 들어, 페르시카(persica)), 배(피라, 예를 들어, 콤무니스(communis)), 자두(프루너스, 예를 들어, 도메스티카(domestica)), 딸기(프라가리아, 예를 들어, 모스차타(moschata)), 토마토(라이코페르시콘, 예를 들어, 에스쿨렌툼(esculentum)), 잎, 예를 들어, 알팔파(메디카고, 예를 들어, 사티바(sativa)), 양배추(예를 들어, 브라씨카 올레라세아), 꽃상추(치코레움, 예를 들어, 엔디비아(endivia)), 부추(알리움, 예를 들어, 포룸(porrum)), 양상치(락투카, 예를 들어, 사티바(sativa)), 시금치(스피나시아, 예를 들어, 올레라세아에(oleraceae)), 담배(니코티아나, 예를 들어, 타바쿰(tabacum)), 뿌리, 예를 들어, 칡(마란타, 예를 들어, 아룬디나세아에(arundinacea)), 무우(베타, 예를 들어, 불가리스(vulgaris)), 당근(다우쿠스, 예를 들어, 캐로타(carota)), 카사바(마니호트, 예를 들어, 에스쿨렌타(esculenta)), 순무(브라시카, 예를 들어, 라파(rapa)), 홍당무(라파누스, 예를 들어, 사티부스(sativus)), 참마(디오스코레아, 예를 들어, 에스쿨렌타), 고구마(이포모에아 바타타스(Ipomoea batatas)) 및 종자, 예를 들어, 콩(파세올러스, 예를 들어, 불가리스(vulgaris)), 완두(피섬, 예를 들어, 사티붐(sativum)), 대두(글리신, 예를 들어, 맥스(max)), 밀(트리티컴, 예를 들어, 아에스티붐(aestivum)), 보리(호데움, 예를 들어, 불가레(vulgare)), 옥수수(제아, 예를 들어, 메이스(mays)), 벼(오리자, 예를 들어, 사티바(sativa)), 평지씨(브라씨카 나푸스(Brassica napus)), 기장(패니컴 L.(Panicum L.)), 해바라기(헬리안투스 안누스(Helianthus annus)), 귀리(아베나 사티바), 괴경, 예를 들어, 콜라비(브라시카, 예를 들어, 올레라세아에), 감자(솔라넘, 예를 들어, 튜버로숨(tuberosum)) 등을 들 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드는 임의의 식물 또는 종자에서 발현되거나, 삽입될 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 식물은 쌍떡잎성 식물 또는 외떡잎식물일 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 외떡잎식물의 예로는 목초, 예를 들어, 목초지용 목초(블루 그래스, 포아(Poa)), 사료용 목초, 예를 들어, 페스투카(festuca), 호밀풀속(lolium), 온대형 목초, 예를 들어, 아그로스티스(Agrostis), 및 시리얼, 예를 들어, 밀, 귀리, 호밀, 소맥, 벼, 수수류, 및 옥수수(옥수수(corn))이 있다. 본 발명의 트랜스제닉 쌍떡잎식물의 예로는 담배, 콩과 식물, 예를 들어, 루핀(lupin), 감자, 사탕 무우, 완두, 콩 및 대두, 및 십자화과 식물(브라씨카세아에(Brassicaceae) 과), 예를 들어, 콜리플라워, 평지씨, 및 밀접하게 연관된 모델 유기체인 아라비돕시스 탈리아나가 있다. 따라서, 본 발명의 트랜스제닉 식물 및 종자는 아나카르디움(Anacardium), 아라키스(Arachis), 아스파라거스(Asparagus), 아트로파(Atropa), 아베나(Avena), 브라씨카(Brassica), 시트러스(Citrus), 시트룰러스(Citrullus), 캅시쿰(Capsicum), 카르타무스(Carthamus), 코코스(Cocos), 코페아(Coffea), 쿠쿠미스(Cucumis), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 엘라에이스(Elaeis), 프라가리아(Fragaria), 글리시네(Glycine), 고씨피움(Gossypium), 헬리안투스(Helianthus), 헤테로칼리스(Heterocallis), 호르데움(Hordeum), 히오스시아무스(Hyoscyamus), 락투카(Lactuca), 리눔(Linum), 롤리움(Lolium), 루피누스(Lupinus), 리코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 마니호트(Manihot), 마조라나(Majorana), 메디카고(Medicago), 니코티아나(Nicotiana), 올레아(Olea), 오리자(Oryza), 파니에움(Panieum), 판니세툼(Pannisetum), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피스타키아(Pistachia), 피숨(Pisum), 피루스(Pyrus), 프루누스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 리시누스(Ricinus), 세칼레(Secale), 세네시오(Senecio), 시나피스(Sinapis), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Solanum), 테오브로무스(Theobromus), 트리고넬라(Trigonella), 트리티쿰(Triticum), 비시아(Vicia), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna), 및 제아(Zea) 속으로부터의 종을 포함하나, 이에 한정되지 않는 광범위한 범위의 식물을 포함한다.
대안적 실시양태에서, 예를 들어, 목화, 판야 나무((Kapok), 세이바 펜탄듀라(Ceiba pentandura)), 사막 버드나무(desert willow), 크레어소트 덩굴(creosote bush), 윈터 팻(winterfat), 발사(balsa), 모시, 양마, 삼, 로젤, 주트, 사이잘 섬유 및 아마를 비롯한 섬유 세포를 포함하는 식물에서 발현된다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 트랜스제닉 식물은 임의의 고씨피움(Gossypium) 종, 예를 들어, G. 아르보레움(G. arboreum); G. 헤르바세움(G. herbaceum), G. 바르바덴세(G. barbadense), 및 G. 히르수툼(G. hirsutum)의 구성원을 포함하는 고씨피움 속의 구성원일 수 있다.
추가의 식물뿐만 아니라, 식물이 아닌 발현 시스템도 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다. 식물 종을 선택하는 것은 주로 식물 또는 그의 부분을 사용하는 의도, 및 식물 종의 형질전환에의 유순도에 의해 결정된다.
피타제 코딩 DNA 서열을 함유하는 발현 구성물을 표적 식물에 도입하는 데 여러 기법이 이용될 수 있다. 매우 광범위한 범위의 고등 식물 종을 형질전환시키는 기법이 주지되어 있고, 기술 및 과학 문헌상에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 ([Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477]; 미국 특허 번호 제5,750,870)을 참조한다. 그러한 기법으로는 또한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 전기천공 및 미세 주입법 또는 (코팅된) 입자 충격요법(문헌 [Potrykus, 1990])을 사용한 원형질체 형질전환을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 소위 직접 DNA 형질전환법이라 불리는 상기 방법들 이외에도, 예를 들어, (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV: Cauliflower Mosaic Virus)로부터의) 바이러스 벡터 및 (예를 들어, 아그로박테리움 속으로부터의) 박테리아 벡터(문헌 [Potrykus, 1990])와 같은 벡터를 포함하는 형질전환 시스템이 광범위하게 이용될 수 있다. 선별 및/또는 스크리닝 후, 형질전환된 원형질체, 세포 또는 식물 부분은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 전체 식물내로 재생될 수 있다(문헌 [Horsch et al., 1985]). 형질전환 및/또는 재생 기법을 선택하는 것은 본 발명에 있어 중요하지는 않다.
본 발명의 핵산 및 발현 구성물은 임의의 수단에 의해 식물 세포내로 도입될 수 있다. 본 발명의 수행에 대한 대안적 측면에서, 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 뉴클레오티드 구성물과 관련하여 "도입한다"라는 용어는 폴리뉴클레오티드가 식물의 세포 내부에 접근할 수 있도록 하는 방식으로 폴리뉴클레오티드를 식물에 제시한다는 의미를 가지는 것으로 한다. 1 초과의 폴리뉴클레오티드를 도입하고자 하는 경우, 이들 폴리뉴클레오티드를 단일 뉴클레오티드 구성물의 일부로서, 또는 별개의 뉴클레오티드 구성물로서 조립할 수 있고, 동일 또는 상이한 형질전환 벡터 상에 위치시킬 수 있다. 따라서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 단일 형질전환 이벤트로, 별개의 형질전환 이벤트로, 또는 예를 들어, 식물의 경우, 교배 프로토콜의 일부로서 관심의 대상이 되는 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 식물내로 도입하는 특정의 방법에 의존하지 않으며, 단지 폴리뉴클레오티드(들)가 식물의 적어도 하나의 세포 내부에 접근할 수 있도록 한다. 폴리뉴클레오티드를 식물내로 도입하는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 그 예로는 일시적 형질전환 방법, 안정적 형질전환 방법, 및 바이러스 매개 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"일시적 형질전환"이 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있고, 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 "일시적 형질전환"이란, 폴리뉴클레오티드가 식물내로 도입되지만, 식물의 게놈내 통합되는 것은 아닌 것을 의미하는 것으로 한다. 식물내로 도입된 폴리뉴클레오티드와 관련하여 "안정적으로 도입한" 또는 "안정적으로 도입된"이라는 것은 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있고, 일부 측면에서, 도입된 폴리뉴클레오티드가 식물 게놈내로 안정적으로 혼입됨으로써 식물이 폴리뉴클레오티드로 안정적으로 형질전환되었다는 것을 의미한다.
식물내로 도입된 폴리뉴클레오티드와 관련하여 "안정적 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환된"이라는 것은 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있고, 일부 측면에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 뉴클레오티드 구성물이 식물내로 도입되고, 식물의 게놈과 통합되어, 그의 자손에게 물려줄 수 있고, 더욱 특히, 여러 세대에 걸친 다음 세대의 자손에게 물려줄 수 있다는 것을 의미한다. 원하는 식물의 게놈내로 도입하면 효소는 내인성 전사 또는 번역 제어 요소에 의해 조절된다. 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물, 둘 모두에 대한 형질전환 기법은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 핵산은 본질적으로 임의의 식물에 원하는 특질을 부여하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 효소는 상기 효소가 원하는 경우가 될 때까지는 그의 기질과 접촉하지 않도록 하는 방식으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 효소는 식물 세포의 소포체내에서 표적화되고 보유될 수 있다. 세포의 소포체내에 효소를 보유하면 효소는 그의 기질과 접촉을 하지 못하게 된다. 이어서, 효소와 기질은 세포하 구조물을 파괴시킬 수 있는 임의의 수단, 예를 들어, 분쇄, 밀링, 가열 등을 통해 접촉할 수 있다. WO 98/11235, WO 2003/18766, 및 WO 2005/096704(이들 모두가 본원에서 참고로 인용된다).
트랜스진이 성공적으로 통합되었는지 여부에 관해 식물 세포 또는 조직을 확인하기 위해서 선별가능한 마커 유전자를 유전자 구성물에 첨가할 수 있다. 식물 세포에서의 유전자 도입 및 발현은 흔히 발생하는 이벤트가 아니기 때문에(이는 표적화된 조직 또는 세포 중 몇 퍼센트에서만 일어난다), 상기와 같은 작업은 필수적일 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 통상 식물에 독성을 띠는 제제, 예를 들어, 항생제 또는 제초제에 대한 내성을 제공하는 단백질을 코딩한다. 항생제 또는 제초제가 함유되어 있는 배지 중에서 성장시켰을 때, 오직 선별가능한 마커 유전자가 통합되어 있는 식물 세포만이 생존하게 될 것이다. 형질전환에 통상 사용되는 선별 마커로는 nptl1 유전자(이는 카나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여한다(문헌 ([Messing & Vierra. Gene 19: 259-268 (1982)]; [Bevan et. al, Nature 304:184-187 (1983)]))), bar 유전자(이는 제초제 포스피노드리신에 대한 내성을 부여한다(문헌 ([White et. al, Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990)], [Spencer et. al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)]))), hph 유전자(이는 항생제 히그로마이신에 대한 내성을 부여한다(문헌 [Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931])), dhfr 유전자(이는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다(문헌 [Bourouis et. al, EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)])), EPSPS 유전자(이는 글리포세이트에 대한 내성을 부여한다(미국 특허 번호 제4,940,935호 및 제5,188,642호).
별법으로, 양성 선별 시스템, 예를 들어, 만노스를 대사할 수 있는 능력을 제공하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 유전자를 사용하는 시스템을 사용하여 트랜스제닉 식물 물질을 확인할 수 있다(미국 특허 번호 제5,767,378호 및 제5,994,629호).
한 측면에서, 트랜스제닉 식물 또는 종자를 제조하는 방법은 프로모터 및 종결인자 서열을 위치시키는 것과 함께 본 발명의 서열 및 임의로, 마커 유전자를 표적 발현 구성물(예를 들어, 플라스미드) 내로 도입시키는 것을 포함한다. 이는 적합한 방법을 통하여 변형된 유전자를 식물 내로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 서열은 곤충, 질병, 가뭄에 대한 내성을 부여하고, 수율을 증가시키며, 곡물의 영양상의 정질을 개선시키고, 에탄올 수율을 개선시키는 등의 작용을 하는 물질과 조합될 수 있다.
예를 들어, 식물 세포 원형질체의 전기천공법 및 미세 주입법과 같은 기법을 사용하여 구조물을 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입시킬 수 있거나, 탄도학적 방법, 예를 들어, DNA 입자 충격요법을 사용하여 구조물을 식물 조직으로 직접 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스진을 밀 내로 도입하기 위해 입자 충격요법을 사용한 것에 관하여 논의하고 있는 문헌 ([Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203]; [Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30]; [Klein (1987) Nature 327:70-73]; [Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69]); 및 YAC를 식물 세포 내로 도입하기 위해 입자 충격요법을 사용한 것에 관한 문헌 [Adam (1997) 상기 문헌 동일]을 참조한다. 예를 들어, 예를 들면, 문헌 [Rinehart (1997) 상기 문헌 동일]에서는 트랜스제닉 목화 식물을 생성하기 위해 입자 충격요법을 사용하였다. 입자 가속 장치가 미국 특허 번호 제5,015,580호에 기재되어 있고, 바이오래드(BioRad)(Biolistics) PDS-2000 입자 가속 기구는 상업적으로 이용가능하며; 겉씨 식물의 입자 매개 형질전환을 기술하고 있는 미국 특허 번호 제5,608,148호(John); 및 미국 특허 번호 제5,681,730호(Ellis) 또한 참조한다.
한 측면에서, 원형질체는 핵산, 예를 들어, 발현 구성물과 함께 고정화되고 주입될 수 있다. 원형질체로부터 식물을 재생하는 것이 시리얼에서는 용이하지는 않지만, 원형질체 유래의 유도 캘러스로부터의 체성 배아 발생법을 사용하면 콩과 식물에서는 식물 재생이 가능하다. 조직화된 조직은 유전자 총 기법을 사용하여 나형 DNA로 형질전환될 수 있는데, 여기서, DNA는, 세포 크기의 100분의 1에 해당하는 발포체로서 DNA를 세포와 기관의 심부까지 운반하는 텅스텐 미립 추진체 상에 코팅되어 있다. 이어서, 형질전환된 조직은 일반적으로 체성 배아 발생법에 의해 재생할 수 있도록 유도된다. 이러한 기법은 옥수수 및 벼를 비롯한, 몇몇 시리얼 종 내에서 성공을 거두었다.
핵산, 예를 들어, 발현 구성물은 또한 재조합 바이러스를 사용하여 식물 세포에 도입될 수도 있다. 식물 세포는 바이러스 벡터, 예를 들어, 담배 모자이크 바이러스 유래의 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있고(문헌 [Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999]), 문헌 [Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants," Mol. Biotechnol. 5:209-221]을 참조한다.
별법으로, 핵산, 예를 들어, 발현 구성물은 적합한 T-DNA 측면에 위치하는 영역과 결합하여 통상의 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 벡터 내로 도입될 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병독성 작용은 세포가 상기 박테리아에 의해 감염되었을 때, 구성물 및 인접한 마커를 식물 세포 DNA에 삽입시키는 작용을 할 것이다. 이원성 벡터를 무력화시키고 사용하는 것을 포함하는, 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 형질전환 기법은 과학 문헌에 상세히 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 ([Horsch (1984) Science 233:496-498]; [Fraley (1983) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 80:4803 (1983)]; [Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springerlag, Berlin 1995)])를 참조한다. A. 투메파시엔스 세포의 DNA는 박테리아 염색체와 Ti(종양-유도성: tumor-inducing) 플라스미드라고 알려진 또 다른 구조물에 포함된다. 상기 Ti 플라스미드는 감염 과정에서 식물 세포로 전달되는 것으로서, T-DNA(길이 ~20kb)라고 불리는 DNA 신장부와, 감염 과정을 유도하는 일련의 vir(병독성) 유전자를 포함한다. A. 투메파시엔스는 식물의 상처를 통하여서만 감염될 수 있으며: 식물 뿌리나 줄기에 상처가 나면, 식물의 특정의 화학 신호를 내보내게 되고, 이에 반응하여, A. 투메파시엔스의 vir 유전자는 활성화되어, Ti 플라스미드로부터 식물의 염색체로 T-DNA를 전달하는데에 필요한 일련의 이벤트들을 유도한다. 이어서, 상기 TDNA는 상처를 통해 식물 세포로 유입된다. 하나의 가설로서는 식물 DNA가 복제 또는 전사될 때까지 T-DNA는 대기하고 있다가, 노출된 식물 DNA에 이 T-DNA가 삽입된다는 설이 있다. A. 투메파시엔스를 트랜스진 벡터로 사용하기 위해서는, T-DNA의 종양 유도 구획은 제거되어야 하며, 이때 T-DNA 경계 영역과 vir 유전자는 유지되어야 한다. 이어서, 상기 트랜스진은 T-DNA 경계 영역, 즉, 식물 세포로 운반되어 식물의 염색체 내에 통합되는 영역 사이에 삽입된다.
본 발명은 본 발명의 핵산을 사용하여 외떡잎식물, 예를 들어, 중요한 시리얼을 형질전환시키는 방법을 제공한다(문헌 [Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218]을 참조한다). 예를 들어, 게놈 DNA 내로의 T-DNA 통합에 관하여 논의하고 있는 문헌 ([Horsch, Science (1984) 233:496]; [Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803]; [Thykjaer (1997) 상기 문헌 동일]; [Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148])을 참조한다. 또한, 시리얼, 또는 다른 외떡잎식물의 세포 내에서 기능을 갖는 유전자를 포함하는 DNA의 안정한 통합화 방법에 관하여 논의하고 있는 미국 특허 번호 제5,712,135호(D'Halluin)도 참조한다.
한 측면에서, 제3 단계는 통합된 표적 유전자를 다음 세대에 전달할 수 있는 전체 식물을 선별 및 재생하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 재생 기법은 조직 배양 성장 배지에서의 특정의 식물 호르몬의 조작에 의존하며, 전형적으로는 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 항생제 및/또는 제초제 마커에 의존적이다. 배양된 원형질체로부터의 식물의 재생은 문헌 [[Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plant, Plant Protoplast, pp. 21-73, CRC Pres, Boca Raton, 1985])에 기술되어 있다. 재생은 또한 식물 캘러스, 외식편, 기관 또는 그의 일부로부터 이루어질 수도 있다. 이러한 재생 기법에 관하여는 일반적으로 문헌 [Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 기재되어 있다. 트랜스제닉 조직, 예를 들어, 미성숙 배아로부터 전체 식물을 얻기 위해서는, 이 조직들은 영양분과 호르몬을 함유하는 일련의 배지 중 제어된 환경 조건 하에 배양할 수 있는데, 이 과정을 조직 배양이라고 한다. 일단 전체 식물이 생산되고, 종자를 생산하게 되면, 자손 평가를 시작한다.
한 측면에서, 발현 카세트를 트랜스제닉 식물에 안정하게 도입한 후, 이를 유성 생식 교배에 의해 다른 식물 내로 도입할 수 있다. 교배할 종에 따라 다수의 품종 개량 기법 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981)]; [Crop Breeding, Wood D. R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983)]; [Mayo 0., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press, Oxford (1987)]; [Singh, D. P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986)]; 및 [Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986)])을 참조한다.
한 측면에서, 본 발명의 핵산의 트랜스제닉 발현을 통해 표현형이 변할 수 있기 때문에, 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 식물을 제2 식물과 유성 교배시켜 최종 생성물을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 종자는 본 발명의 두 트랜스제닉 식물 사이의 교배로부터, 또는 본 발명의 식물과 또 다른 식물 사이의 교배로부터 유래될 수 있다. 두 모체 식물이 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 피타제)를 발현하는 경우에, 원하는 효과(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하여, 개화 습성이 변경된 식물을 생산하는 것)는 증진될 수 있다. 원하는 효과는 표준 번식 수단에 의해 식물 다음 세대로 전달될 수 있다.
쌍떡잎 식물의 경우, 이원 벡터 시스템이 사용될 수 있다(문헌 [Hoekema et ai, 1983]; EP 0120516(Schilperoort et al)). 예를 들어, 아그로박테리움 균주를 이용할 수 있는데, 이는 독성 유전자를보유하는 vir 플라스미드를 함유하며 전달하려는 유전자 구성물을 함유하는 상용성 플라스미드를 함유한다. 이 벡터는 E. 콜라이 및 아그로박테리움 둘 모두에서 복제할 수 있으며, 본 발명과 관련되지 않은 구체적으로 변경된 이원 벡터 Bin19(문헌 [Bevan, 1984])로부터 유도된 것이다. 상기 예에서 사용된 이원 벡터는 T-DNA의 좌경계 및 우경계 서열의 사이 서열, 카나마이신 내성을 코딩하는 동일한 NPTII-유전자 및 필요한 유전자 구성물내 클론에 대한 다수의 클로닝 부위를 함유한다.
외떡잎 곡물의 형질전환 및 재생은 임의의 방법 또는 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있고; 외떡잎식물을 변형시켜 형질전환할 수 있고, 번식할 수 있는 식물은 형질전환된 세포로부터 재생할 수 있다. 대안적인 측면에서, 외떡잎식물은 아그로박테리움 형질전환에 의해 형질전환된다.
한 측면에서, 트랜스제닉 벼 식물은 선별 마커로서 하이그로마이신 내성을 코딩하는 박테리아 hph 유전자를 이용하여 수득할 수 있다; 상기 유전자는 전기천공법에 의해 도입할 수 있다. 한 측면에서, 트랜스제닉 옥수수 식물은 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(제초체 포스피노트리신을 불활성화하는 효소)를 코딩하는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 바 유전자를 미세입자 충격요법에 의해 옥수수 현탁액 배양물의 배아생성 세포내로 도입함으로써 수득할 수 있다. 한 측면에서, 예를 들어, 밀 및 보리와 같은 외떡잎 곡물의 호분 원형질체 내로 유전 물질을 도입할 수 있다. 한 측면에서, 밀 식물은 배아생성 현탁 배양물의 확립을 위해 오직 노화된 조밀한 결절성 배아생성 캘러스 조직만을 선택함으로써 배아생성 현탁 배양물로부터 재생된다. 한 측면에서, 이들 곡물을 위한 형질전환 시스템들을 병용하면 본 발명을 외떡잎식물에 적용할 수 있다. 이러한 방법 등은 또한 쌍떡잎식물의 형질전환 및 재생을 위해 적용될 수도 있다.
본 발명의 수행에서, 피타제 구성물의 발현은 재조합 DNA 기법 분야의 당업자에게 공지된 식물 폴리머라제에 의한 유전자의 전사, mRMA의 번역 등과 같은 상세한 사항을 포함한다. 본 발명의 실시양태를 수행하는 것과 관련된 일부 상세한 설명을 본원에 기술한다. 피타제의 발현을 유발하는 것으로 공지되어 있거나 확인된 조절 서열이 본 발명에 사용될 수 있다. 사용되는 조절 서열의 선택은 관심의 대상이 되는 표적 곡물 및/또는 표적 기관에 따라 달라질 수 있다. 이러한 조절 서열은 식물 또는 식물 바이러스로부터 수득할 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 조절 서열은 식물 또는 식물 부분의 용도에 따라 구성적, 또는 단계 및/또는 조직 특이성으로 식물에서 전사를 유도하는 활성이 있는 프로모터이다. 이들 프로모터로는 구성적 발현을 나타내는 프로모터, 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터(문헌 [Guilley et al., 1982]), 잎 특이성 발현을 위한 프로모터, 예를 들어, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 소형 서브유닛 유전자의 프로모터(문헌 [Coruzzi et al., 1984]), 뿌리 특이성 발현을 위한 프로모터, 예를 들어, 글루타민 신타제 유전자로부터 유래한 프로모터(문헌 [Tingey et al., 1987]), 종자 특이성 발현을 위한 프로모터, 예를 들어, 브라시카 나푸스(Brassica napus)로부터 유래된 크루시페린 A 프로모터(문헌 [Ryan et al., 1989]), 괴경 특이성 발현을 위한 프로모터, 예를 들어, 감자로부터 유래된 I류 파타틴 프로모터(문헌 ([Koster-Topfer et al., 1989]; [Wenzler et al., 1989])) 또는 과실 특이성 발현을 위한 프로모터, 예를 들어, 감자부터 유래하는 폴리갈락투로나제(PG) 프로모터(문헌 [Bird et al., 1988])를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
종결 서열 및 폴리아데닐화 신호와 같은 다른 조절 서열이 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있으며, 이들은 식물에서 그러한 기능을 수행하는 임의의 서열을 포함하며, 이러한 조절 서열의 선택은 당업자에게는 일반적인 일이다. 상기한 바와 같은 서열의 예로는 아그로박테리움 투메파시엔스(문헌 [Bevan, 상기 문헌 동일])의 노팔린 신타제(nos) 유전자의 3' 측접 영역이다. 또한, 제어 서열은 인핸서 서열, 예를 들어, CaMV의 35S 프로모터에서 발견된 것, 및 mRNA 안정화 서열, 예를 들어, 알팔파 모자이크 바이러스(AlMV: Alfalfa Mosaic Virus) RNA4의 리더 서열(문헌 [Brederode et al., 1980), 또는 유사한 방식으로 작용하는 임의의 다른 서열을 들 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 피타제는 발현된 단백질을 안정하게 하는 환경 내에서 발현된다. 세포 구획, 예를 들어, 세포질, 소포체, 액포, 단백질체 또는 세포간극의 선택은 본원 발명에서 상기한 바와 같은 안정한 환경을 생성하기 위해 이루어지며, 이들은 피타제의 생물리학적 파라미터에 따라 달라진다. 이러한 파라미터로는 최적 pH, 프로테아제에 대한 민감성 또는 바람직한 다수의 구획에 대한 민감성을 포함하나, 이에 한정되는 것을 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 피타제는 세포질에서 발현되고; 일부 측면에서는 세포의 세포질내에서 발현을 수행하기 위해, 발현된 효소는 분비 신호 펩티드 또는 임의의 다른 표적 서열을 함유하지 않아야 한다. 염색체 및 미토콘드리아 내에서 발현하기 위해, 발현된 단백질은 특이적인, 소위 이들 기관내로 도입되기 위한 일시적인 펩티드를 보유하여야 한다. 이를 획득하기 위해 관심의 대상이 되는 효소에 부착될 수 있는 표적 서열은 공지되어 있다(문헌 ([Smeekens et al., 1990]; [van den Broeck et al., 1985]; [Wolter et al., 1988])). 상기 효소의 활성이 액포 내에서 바람직한 경우, 분비 신호 펩티드가 존재하여야만 할 뿐만 아니라 이들 액포로 상기 효소를 유도하는 표적 서열도 존재하여야만 한다(문헌 [Tague et al., 1990]). 동일한 상황이 종자내 단백질체에 대해서도 적용된다. 관심의 대상이 되는 효소를 코딩하는 DNA 서열은 상기 효소가 세포내의 원하는 위치에서 그의 작용을 발휘할 수 있도록 하는 방식으로 변경되어야만 한다.
일부 실시양태에서, 피타제를 세포외에서 발현하는 경우, 본 발명의 발현 구성물은 분비 신호 서열을 이용한다. 식물 숙주 종에 상동성인(천연) 신호 서열, 즉 다른 식물 종으로부터 유래하거나 미생물로부터 유래한 신호 서열도 사용할 수 있다. 이러한 신호 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 본원에서 사용할 수 있는 적합한 신호 서열은 문헌 ([Blobel et al., 1979]; [Von Heijne, 1986]; [Garcia et al., 1987]; [Sijmons et al., 1990]; [Ng et al., 1994]; 및 [Powers et al., 1996])에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 관련 DNA 구성물의 모든 부분(프로모터, 제어 서열, 분비 서열, 안정화 서열, 표적 서열 또는 종결 서열)은 필요에 따라 당업계에 공지된 방법으로 변형하여 그들의 조절 특성에 영향을 준다. 본 발명을 통해 얻은 피타제를 함유하는 식물을 이용하여 피타제 수준이 더 높은 식물 또는 식물 기관을 얻을 수 있다. 예를 들어, 소모클로날 변이 기법 또는 교배 기법을 이용하여 상기한 바와 같은 식물 또는 식물 기관을 얻을 수 있다. 이러한 기법들은 당업자에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 피타제 및 다른 분자를 위해 매우 효율적인 과발현 시스템을 달성하는 방법(및 그의 생성물)을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 트리코더마에서 피타제 및 pH 2.5 산 포스파타제를 위한 매우 효유적인 과발현 시스템을 달성하는 방법(및 그의 생성물)을 제공한다. 이 시스템은 동물 사료 산업에서 특별한 유용성을 가진 효소 조성물을 생성한다. 이 방법에 관한 추가의 구체적인 내용은 공개 문헌을 통해 확인할 수 있는 것이거나, 당업자에게는 공지된 것이다. 비제한적인 특정 예에서, 비록 이러한 공개 문헌이 본 출원의 본 발명의 분자를 교시하지는 않지만, EP 0659215(WO 9403612 A1)(Nevalainen et al.)을 들 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 박테리아에서는 "RecA 의존" 현상일 수 있는 "재조합"이라 통칭되는 "분자간" 프로세스에 집중되는 생체내 재분류를 사용한다. 본 발명은 서열을 재조합하고 재분류하는 숙주 세포의 재조합 과정 또는 결실에 의해 세포 내에서 유사 반복 서열의 복잡성을 감소시킬 수 있는 환원 프로세스를 매개할 수 있는 세포의 능력에 의존할 수 있다. 이러한 "환원적 재분류" 프로세스는 "분자내" RecA-의존 프로세스에 의해 일어난다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 변이체 폴리뉴클레오티드는 환원적 재분류 과정을 통해 생성될 수 있다. 상기 방법은 구성적 서열(원래의 서열)을 함유하는 구성물, 적합한 벡터내로 그들의 삽입 및 적합한 숙주 세포내로 그들의 후속 도입을 포함한다. 개별적인 분자 아이덴티티의 재분류는 상동성 영역을 보유하는 구성물내 구성적 서열간의 조합 과정 또는 유사 반복 유닛간의 조합 과정에 의해 일어난다. 재분류 과정은 반복 서열의 복잡성과 정도를 재조합하고/하거나 감소시키며, 결과적으로 신규한 분자 종을 생성한다. 다양한 처리를 적용하여 재분류의 비율을 강화시킬 수 있다. 이들은 자외선을 이용하는 처리 또는 DNA를 손상시키는 화학물질 및/또는 강화된 수준의 "유전적 불안정성"을 나타내는 숙주세포주를 이용하는 것을 포함한다. 따라서, 재분류 과정은 자신의 진화를 유도하기 위해 상동성 재조합 또는 유사 반복 서열의 자연적인 특성을 포함할 수 있다.
본 발명은 반복 또는 "유사 반복" 서열을 사용할 수 있고; 이들 서열은 유전적 불안정성에서 일정 역할을 수행한다. 본 발명에서, "유사 반복부"는 그들의 최초 유닛 구조로 제한되지 않는 반복부이다. 유사 반복 유닛은 구성물 내에서 서열의 배열, 즉 유사 서열의 구성 유닛으로 나타낼 수 있다. 일단 결찰되면, 구성적 서열들 간의 접합은 실질적으로 볼 수 없고, 생성된 구성물의 유사 반복 특성은 현재 분자 수준에서 연속적이다. 생성된 구성물의 복잡성을 감소시키기 위해 세포가 수행하는 결실 과정은 유사 반복 서열들 사이에서 작동한다. 상기 유사 반복 유닛은 미끄럼 현상(slippage event)이 발생할 수 있는 주형의 실질적으로 무제한 레퍼토리를 제공한다. 따라서, 유사 반복 유닛을 함유하는 구성물은 결실(및 잠재적으로 삽입) 현상이 실질적으로 유사 반복 유닛의 어디에서도 일어나기에 충분한 분자 탄성을 효과적으로 제공한다.
일부 측면에서, 유사 반복 서열이 동일한 배향, 예를 들어, 머리에서 꼬리 또는 그 반대로 모두 결찰되는 경우, 세포는 개별적인 유닛을 구별할 수 없다. 결과적으로, 감소 과정은 서열 전체에서 일어날 수 있다. 대조적으로, 예를 들어, 상기 유닛이 머리에서 꼬리 보다는 오히려 머리에서 머리로 존재하는 경우, 역위는 인접 유닛의 말단을 나타내어 결실 형성은 불연속 유닛의 상실을 초래할 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 서열은 동일한 배향으로 존재한다. 유사 반복 서열의 무작위 배향은 재분류 효율의 상실을 초래하지만, 상기 서열들의 일정한 배향은 최대 효율을 제공할 것이다. 그러나, 동일한 배향의 더 적은 수의 인접 서열은 효율을 감소시키지만, 이는 신규 분자의 효과적인 회복을 위해 충분한 탄성을 여전히 제공할 수 있다. 구성물은 동일한 배향의 유사 반복 서열로 제조하여 더 높은 효율을 제공할 수 있다.
서열은 임의의 다양한 방법을 이용하여 머리에서 꼬리 배향으로 조립될 수 있는데, 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다:
(a) 단일 가닥을 제조하는 경우, 배향을 제공하는 폴리A 머리 및 폴리T 꼬리를 포함하는 프라이머를 이용할 수 있다. 이는 RNA로부터 제조된 프라이머의 최초 몇몇 염기를 보유함으로써 달성되며, 향후 RN아제 H를 용이하게 제거한다.
(b) 독특한 제한 절단 위치를 포함하는 프라이머를 이용할 수 있다. 다중 위치, 다수의 독특한 서열 및 반복된 합성 및 결찰 단계가 필요할 것이다.
(c) 상기 프라이머 내부의 몇몇 염기는 티올화할 수 있고, 엑소뉴클레아제를 사용하여 적절히 절단된 분자를 생성한다.
일부 측면에서, 재분류된 서열의 회수는 감소된 RI를 이용하는 클로닝 벡터의 확인에 의존한다. 이어서, 재분류된 코딩 서열은 증폭에 의해 회수할 수 있다. 생성물은 재클로닝하고 발현한다. 감소된 RI를 이용하는 클로닝 벡터의 회수는
1) 구성물의 복잡성이 감소되는 경우, 단지 안정하게 유지되는 벡터의 이용;
2) 물리적인 과정에 의해 짧아진 벡터의 물리적 회수. 이 경우, 클로닝 벡터는 표준 플라스미드 분리 과정을 이용하여 회수하고 아가로즈 겔 또는 표준 과정을이용하는 저분자량 컷오프를 가진 칼럼 상에서 크기 분별한다;
3) 삽입체 크기가 감소되는 경우 선택할 수 있는 개입된 유전자를 함유하는 벡터의 회수; 및
4) 발현 벡터 및 적절한 선택을 이용하는 직접 선택 기법의 이용에 의해 수행될 수 있다.
관련 유기체로부터 유래된 코딩 서열(예를 들어, 유전자)는 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있고, 높은 정도의 상동성을 나타낼 수 있고, 꽤 다양한 단백질 생성물을 코딩할 수 있다. 이러한 유형의 서열은 본 발명에서 유사 반복부로서 특히 유용하다. 그러나, 후술하는 예시적인 프로토콜을 통해 거의 동일한 원래의 코딩 서열(유사 반복부)의 재분류를 확인하였지만, 이 과정은 상기와 같은 거의 동일한 반복부로 한정되는 것은 아니다.
일단 형성되면, 구성물은 공지된 프로토콜에 따라 아가로즈 겔 상에서 크기 분별하거나 그리하지 않을 수 있고, 클로닝 벡터 내에 삽입하고 적합한 숙주 세포내로 형질감염시킨다. 이어서, 세포는 증식시키고, "환원적 재분류"를 수행한다. 재분류를 과정의 속도는 필요에 따라 DNA를 손상시킴으로써 촉진시킬 수 있다. RI의 감소가 "분자내" 메카니즘에 의해 반복 서열 사이의 결실 형성에 의해 매개되는지, 또는 "분자간" 메카니즘을 통해 재조합 유사 현상에 의해 매개되는지 여부는 중요하지 않다. 최종 결과는 분자들의 모든 가능한 조합으로의 재분류이다.
한 측면에서, 본 발명의 방법은 셔플링된 풀의 라이브러리 구성원을 스크리닝하는 추가의 단계를 포함하는데, 이 단계는 결합하거나, 또는 상호작용하거나 또는 특정 반응을 촉진(예를 들어, 피테이트 가수분해의 촉진)할 수 있는 능력을 가진 개개의 셔플링된 라이브러리 구성원을 확인한다.
한 측면에서, 이러한 라이브러리로부터 확인된 폴리펩티드는 치료 목적, 진단 목적, 연구 목적 및 관련 목적(예를 들어, 촉매, 수용액의 삼투압을 증가시키기 위한 용질 등)을 위해 사용할 수 있고/있거나, 셔플링 및/또는 선택의 1회 이상의 추가 사이클을 수행할 수 있다.
또 다른 측면에서, 재조합 또는 재분류 이전 또는 재조합 또는 재분류 도중에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 기술한 방법에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드에 대해 최초 폴리뉴클레오티드 내로 돌연변이의 도입을 촉진하는 제제로 처리하거나 그러한 과정을 수행할 수 있다. 이러한 돌연변이의 도입은 생성되는 하이브리드 폴리뉴클레오티드 및 그로부터 코딩되는 폴리펩티드의 다양성을 증가시킨다. 돌연변이 유발을 촉진하는 제제 또는 과정으로는 (+)-CC-1065, 또는 (+)-CC-1065-(N3-아데닌, 문헌 [Sun and Hurley, 1992] 참조)와 같은 합성 유사체; DNA 합성을 억제할 수 있는 N-아세틸화된 또는 탈아세틸화된 4'-플루오로-4-아미노비페닐 부가반응 생성물(예를 들어, 또한 문헌 [van de Poll et al., 1992] 참조); 또는 DNA 합성을 억제할 수 있는 N-아세틸화된 또는 탈아세틸화된 4-아미노비페닐 부가반응 생성물(문헌 [van de Poll et al., 1992, pp. 751-758] 참조); DNA 복제를 억제할 수 있는 3가 크롬, 3가 크롬 염, 폴리시클릭 방향족 탄화수소("PAH") DNA 부가반응 생성물, 예를 들어, 7-브로모메틸-벤즈[a]안트라센("BMA"), 트리스(2,3-디브로모프로필)포스페이트("트리스-BP"), 1,2-디브로모-3-클로로프로판("DCBP"), 2-브로모아크롤레인(2BA), 벤조[a]피렌-7,8-디하드로디올-9-10-에폭사이드("BPDE"), 백금(II) 할로겐 염, N-히드록시-2-아미노-3-메틸이미다조[4,5-f]-퀴놀린("N-히드록시-IQ"), 및 N-히드록시-2-아미노-1-메틸-6-페닐이미다조[4,5-f]-피리딘("N-히드록시-PhIP")을 들 수 있는데, 이로 제한되는 것은 아니다. PCR 증폭을 느리게 하거나 정지시키기 위한 예시적인 수단은 UV 광 (+)-CC-1065 및 (+)-CC-1065-(N3-아데닌)으로 구성된다. 특히 포함된 수단은 DNA 부가반응 생성물 또는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 풀로부터 유래한 DNA 부가반을 생성물을 포함하는 폴리뉴클레오티드인데, 이는 추가의 프로세싱 이전에 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용액을 가열하는 것을 포함하는 과정에 의해 방출되거나 제거될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 하이브리드 또는 재분류된 폴리뉴클레오티드를 생성하는 본 발명의 조건 하에서 야생형 단백질을 코딩하는 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 처리함으로써 생물학적 활성을 보유하는 재조합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이를 도입하여 전범위의 단일 아미노산 치환이 각각의 아미노산 위치에서 나타나는(유전자 부위 포화된 돌연변이 유발(GSSM)) 한 세트의 자손 폴리펩티드를 생성하는 독점적인 코돈 프라이머(축퇴성 N,N,G/T 서열을 함유함)의 용도를 제공한다. 사용된 올리고는 제1 상동성 서열, 축퇴성 N,N,G/T 서열 및 임의의 제2 상동성 서열을 연속적으로 포함한다. 이러한 올리고를 이용하여 얻은 하류 자손 번역 생성물은 폴리펩티드를 따라 각각의 아미노산 부위에서 모든 가능한 아미노산 변화를 포함하는데, 그 이유는 N,N,G/T 서열의 축퇴성은 모두 20개의 아미노산을 위한 코돈을 포함하기 때문이다.
한 측면에서, 이러한 하나의 축퇴성 올리고(하나의 축퇴성 N,N,G/T 카세트를 포함함)는 전 범위의 코돈 치환에 대한 모체 폴리뉴클레오티드 주형내 각각의 원래의 코돈을 처리하기 위해 사용된다. 다른 측면에서, 2개 이상의 축퇴성 N,N,G/T 카세트를 사용하는데, 이는 전 범위 코돈 치환에 대한 모체 폴리뉴클레오티드 주형내 2개 이상의 원래의 코돈을 처리하기 위해 사용되며, 동일한 올리고 이거나, 상이한 올리고이다. 따라서, 하나 이상의 N,N,G/T 서열은 하나 이상의 위치에 아미노산 돌연변이를 도입하는 하나의 올리고에 함유될 수 있다. N,N,G/T 서열의 이러한 다수성은 직접적으로 인접해 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드 서열(들)에 의해 분리될 수도 있다. 또 다른 측면에서, 추가 또는 결실을 도입하기에 유용한 올리고는 단독으로 사용되거나, N,N,G/T 서열을 함유하는 코돈과 병용하여 아미노산 추가, 결실 및/또는 치환의 임의의 조합 또는 순열을 도입할 수 있다.
한 측면에서, 접촉성 N,N,G/T 트리플렛, 즉 축퇴성(N,N,G/T)n 서열을 함유하는 올리고를 이용하여 2개 이상의 접촉성 아미노산 위치를 동시에 돌연변이시킬 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 N,N,G/T 서열보다 덜 축퇴성인 축퇴성 카세트의 용도를 제공한다. 예를 들어, 몇몇 경우, 단지 하나의 N을 포함하는 축퇴성 트리플렛 서열을 이용(예를 들어, 올리고 내에서)하는데, 이때 상기 N은 트리플렛의 제1, 제2 또는 제3 위치내에 존재할 수 있다. 그의 임의의 순열 및 조합을 포함하는 임의의 다른 염기는 상기 트리플렛의 나머지 두 위치에서 사용할 수 있다. 별법으로, 몇몇 경우 축퇴성 N,N,N 트리플렛 서열 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열을 사용(예를 들어, 올리고 내에서)하는 것이 바람직할 수 있다.
그러나, 본 발명에서 개시한 바와 같이, 축퇴성 트리플렛(예를 들어, N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열)을 사용하는 것이 몇가지 이유 때문에 바람직하다. 한 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드내 각각의 아미노산 위치 및 모든 아미노산 위치내로 전 범위의 가능한 아미노산(총 20개 아미노산의 경우)의 치환을 체계적으로 및 상당히 용이하게 생성하는 수단을 제공한다. 따라서, 100개 아미노산의 폴리펩티드에서, 본 발명은 2000개의 구별되는 종(즉, 1 위치당 20개의 가능한 아미노산 x 100개의 아미노산 위치)을 체계적으로 및 상당히 용이하게 생성하는 방법을 제공한다. 축퇴성 N,N,G/T 또는 N,N,G/C 트리플렛 서열을 함유하는 올리고의 이용을 통해, 20개의 가능한 아미노산을 코딩하는 32개의 개별적인 서열을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 모체 폴리뉴클레오티드 서열이 이러한 하나의 올리고를 이용하는 포화 돌연변이 유발을 수행하는 반응 용기에서는, 20개의 구별되는 폴리펩티드를 코딩하는 32개의 구별되는 자손 폴리뉴클레오티드가 생성된다. 대조적으로, 부위 지정 돌연변이 유발법에서 비축퇴성 올리고뉴클레오티드를 이용하면 반응 용기당 단지 하나의 자손 폴리펩티드만이 생성된다.
또한, 임의로 본 발명은 개시된 축퇴성 프라이머와 함께 사용할 수 있는 비축퇴성 올리고의 용도를 제공한다. 몇몇 상황에서, 작용성 폴리펩티드내에 특정 점 돌연변이를 생성하는 비축퇴성 올리고를 이용하는 것이 유익하다. 이는 특이적인 침묵 점 돌연변이, 상응하는 아미노산 변화를 유발하는 점 돌연변이, 및 폴리펩티드 단편의 상응하는 발현 정지 코돈의 생성을 유발하는 점 돌연변이를 생성하는 수단을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기는 20개 이상의 자손 폴리펩티드 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하여 모두 20개의 아미노산이 모체 폴리뉴클레오티드내에서 돌연변이된 코돈 위치에 상응하는 하나의 특이성 아미노산 위치에서 나타나도록 한다. 각각의 포화 돌연변이 유발 반응 용기로부터 생성된 32배 축퇴성 자손 폴리펩티드는 클론 증폭(예를 들어, 발현 벡터를 이용하여 적합한 E. 콜라이 숙주 내로 클로닝함)하고 발현 스크리닝할 수 있다. 개별 자손 폴리펩티드가 바람직한 특성 변화를 나타내는가에 대한 스크리닝에 의해 확인되는 경우, 그의 서열을 분석하여 그 내부에 함유된, 그에 상응하는 바람직한 아미노산 치환을 확인할 수 있다.
본원에 기술한 것과 같은 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM)을 이용하여 모체 폴리펩티드내 각각의 아미노산 위치 및 모든 아미노산 위치를 돌연변이하면, 바람직한 아미노산 변화를 하나 이상의 아미노산 위치에서 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이들 바람직한 아미노산 치환 모두 또는 그 일부의 조합을 함유하는 하나 이상의 새로운 자손 분자가 생성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 특이적이며 바람직한 아미노산 변화가 폴리펩티드내 3개의 아미노산 위치 각각에서 확인되는 경우, 순열은 각각의 위치 및 3개의 위치에서 3가지 가능성(원래의 아미노산으로부터의 변화는 없고, 2개의 바람직한 각각의 변화)을 포함한다. 따라서, 3 x 3 x 3 또는 27개의 전체 가능성이 존재하는데, 이 가능성에는 이전에 조사한 7가지 가능성(6개의 점 돌연변이(즉, 3가지 위치 각각에서 2개의 가능성) 및 임의의 위치에서 변화 없음)을 포함한다.
다른 측면에서, 부위 포화 돌연변이 유발법은 스크리닝과 함께 셔플링, 키메라화, 재조합 및 다른 돌연변이 과정과 함께 사용할 수 있다. 본 발명은 반복적인 방식의 포화 돌연변이 유발법을 포함하는 임의의 돌연변이 방법(들)의 용도를 제공한다. 한 예에서, 임의의 돌연변이 방법(들)의 반복적인 사용을 스크리닝과 함께 수행할 수 있다.
따라서, 비제한적인 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 추가의 돌연변이 방법, 예를 들어, 2개 이상의 관련 폴리펩티드가 적합한 숙주 내에 도입되어 하이브리드 폴리뉴클레오티드가 재조합 및 환원적 재분류에 의해 생성되는 과정과 함께 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM)에 의해 유도될 수 있다.
유전자의 전체 서열을 따라 돌연변이를 수행하는 것 이외에, 돌연변이 유발법은 폴리뉴클레오티드 서열내 임의의 수의 염기 각각을 대체하는 데 사용될 수 있는데, 돌연변이를 유발하고자 하는 염기의 수는 정수 15 내지 100,000개일 수 있다. 따라서, 분자를 따라 모든 위치를 돌연변이시키는 대신에, 모든 염기 또는 불연속 수의 염기(총 15 내지 100,000개의 부분 집합일 수 있음)를 돌연변이 유발시킬 수 있다. 개개의 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열을 따라 각각의 위치 또는 위치들의 군을 돌연변이 유발시키는데 사용할 수 있다. 돌연변이를 유발시키고자 하는 3개의 위치로 된 군은 코돈일 수 있다. 돌연변이는 돌연변이원성 카세트라 칭하기도 하는, 이종 카세트를 함유하는 돌연변이원성 프라이머를 이용하여 도입할 수 있다. 예시적인 카세트는 1개 내지 500개의 염기를 보유할 수 있다. 이와 같은 이종 카세트내 각각의 뉴클레오티드 위치는 N, A, C, G, T, A/C, A/G, A/T, C/G, C/T, G/T, C/G/T, A/C/T, A/C/T, A/C/G 또는 E인데, 이때 E는 A, C, G 또는 T가 아닌 임의의 염기이다(E는 디자이너 올리고라 칭할 수 있다).
일반적인 의미로, 포화 돌연변이 유발법은 돌연변이시키고자 하는 정해진 폴리뉴클레오티드 서열(이때, 돌연변이시키고자 하는 서열은 그 길이가 약 15 내지 100,000 염기임)내 완전한 세트의 돌연변이원성 카세트(이때, 각각의 카세트는 그 길이가 약 1 내지 500 염기일 수 있음)를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 따라서, 일군의 돌연변이(1 내지 100 돌연변이)가 돌연변이시키고자 하는 각각의 카세트에 도입된다. 한 카세트내로 도입하려는 돌연변이의 그룹화는 포화 돌연변이 유발법의 한 라운드의 적용중 제2 카세트 내로 도입하려는 돌연변이의 제2 그룹화와 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 이러한 그룹화는 결실, 부가, 특정 코돈의 그룹화 및 특정 뉴클레오티드 카세트의 그룹화에 의해 예시된다.
돌연변이시키고자 하는 한정된 서열은 전체 유전자, 경로, cDNA, 전체 오픈 리딩 프레임(ORF), 및 전체 프로모터, 인핸서, 리프레서/트랜스액티베이터, 복제 기점, 인트론, 오퍼레이터 또는 임의의 폴리뉴클레오티드 작용기를 포함한다. 일반적으로, 상기 목적을 위해 "한정된 서열"은 15 염기-폴리뉴클레오티드 서열, 및 길이가 15 염기 내지 15,000 염기(범위 내의 모든 정수)인 폴리뉴클레오티드 서열인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 코돈 그룹화의 선택에 대한 고려는 축퇴성 돌연변이원성 카세트에 의해 코딩된 아미노산의 유형을 포함한다.
한 측면에서, 돌연변이원성 카세트 내로 도입될 수 있는 돌연변이를 그룹화함으로써, 본 발명은 특이적으로 각각의 위치에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20개의 아미노산을 코딩하는 축퇴성 코돈 치환(축퇴성 올리고를 이용함)을 제공하며, 그것에 의해 코딩된 폴리펩티드의 라이브러리를 제공한다.
대안적 측면에서, 본 발명의 핵산은 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 비롯한, DNA를 포함한다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥이며, 단일 가닥인 경우, 코딩 가닥 또는 비코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 별법으로, 본 발명의 핵산은 RNA를 포함할 수 있다.
상세히 후술하는 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열이다. 본 발명의 핵산 서열은 추가의 코딩 서열, 예를 들어, 리더 서열 또는 프로단백질 서열 및 비코딩 서열, 예를 들어, 인트론 또는 코딩 서열의 비코딩 서열 5' 및/또는 3'을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 사용하는 바, "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 추가의 코딩 및/또는 비코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다.
별법으로, 본 발명의 핵산 서열은 통상적인 기법, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발법, 또는 당업자에게 친숙한 다른 기법을 이용하여 돌연변이를 유발시켜본 발명의 폴리뉴클레오티드 내로 침묵 변이를 도입할 수 있다. 본원에 사용한 용어 "침묵 변이"는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 변경시키지 안는 변화를 포함한다. 이러한 변화는 숙주 유기체 내에서 빈번하게 발생하는 코돈 또는 코돈 쌍을 도입함으로써 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 생성된 폴리펩티드의 수준을 증가시키기 위해 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 내에 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단을 일으키는 뉴클레오티드 변화를 보유하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 뉴클레오티드 변화는 부위 지정 돌연변이 유발법, 무작위 화학적 돌연변이 유발법, 엑소뉴클레아제 III 결실, 및 다른 재조합 DNA 기법을 이용하여 도입할 수 있다.
필요에 따라, 프로브가 상보 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있도록 하는 조건은 상보적인 서열을 함유하는 것으로 공지된 샘플로부터 유래하는 상보적인 서열뿐만 아니라 상보적인 서열을 함유하지 않는 대조 서열과 프로브를 접촉시킴으로써 결정할 수 있다. 하이브리드화 조건, 예를 들어, 하이브리드화 완충액의 염 농도, 하이브리드화 완충액의 포름알데히드 농도, 또는 하이브리드화 온도를 변경시켜 프로브가 상보적인 핵산에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 조건을 확인하는 것이 가능하다.
샘플이 핵산이 단리되는 유기체를 함유하는 경우, 프로브의 특이적 하이브리드화가 검출된다. 하이브리드화는 프로브를 검출가능한 제제, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 염료 또는 검출가능한 생성물의 형성을 촉진할 수 있는 효소로 표지함으로써 검출할 수 있다.
샘플내에 상보적인 핵산의 존재를 검출하기 위해 표지된 프로브를 이용하는 다수의 방법은 당업자에게는 친숙한 것들이다. 이들 방법으로는 서던 블롯, 노던 블롯, 콜로니 하이브리드화 과정 및 도트 블롯을 들 수 있다. 이들 각각의 과정에 대한 프로토콜은 문헌 ([Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997] 및 [Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989])에 제시되어 있다.
별법으로, 1 초과의 프로브(핵산 샘플내에 존재하는 임의의 상보적인 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 하나의 프로브)를 증폭 반응에 사용하여 샘플이 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 유기체(예를 들어, 핵산이 그로부터 단리된 것인 유기체)를 포함하는지 여부를 결정할 수 있다. 전형적으로, 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 증폭 반응은 PCR 반응을 포함할 수 있다. PCR 프로토콜은 문헌 [Ausubel and Sambrook, 상기 문헌 동일]에 기술되어 있다. 증폭은 리가제 연쇄 반응, 3SR, 또는 가닥 치환 반응을 포함할 수 있다(문헌 ([Barany, F., "The Ligase Chain Reaction in a PCR World," PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991]; [E. Fahy et al, "Self-sustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR", PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991]; 및 [Walker G.T. et al., "Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique", Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992]) 참조). 이러한 방법에서, 샘플내의 핵산을 프로브와 접촉시키고, 증폭 반응을 수행하고, 생성된 임의의 증폭 생성물은 검출한다. 증폭 생성물은 반응 생성물에 대해 겔 전기영동을 수행하고, 브롬화에티듐과 같은 삽입제로 겔을 염색함으로써 검출할 수 있다. 별법으로, 하나 이상의 프로브는 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사성 증폭 생성물의 존재는 겔 전기영동 이후 방사선 촬영법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 서열 종단부에 인접하여 존재하는 서열로부터 유래된 프로브를 염색체 워킹 방법에 사용하여 상기한 바와 같은 핵산 서열에 인접하여 위치하는 게놈 서열을 포함하는 클론을 확인할 수 있다. 이러한 방법을 통해 추가의 단백질을 코딩하는 유전자를 숙주 유기체로부터 단리시킬 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 프로브로서 관련 핵산을 확인하고 단리시키는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 관련 핵산은 핵산이 그로부터 단리된 것인 유기체 이외의 유기체로부터 유래된 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 예를 들어, 다른 유기체는 관련 유기체일 수 있다. 이러한 방법에서, 프로브가 관련 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 조건 하에서 핵산 샘플을 프로브와 접촉시킨다. 이어서, 관련 유기체로부터 유래하는 핵산에 대한 프로브의 하이브리드화는 상기한 방법 중 임의의 방법을 이용하여 검출한다.
핵산 하이브리드화 반응에서, 특정 수준의 엄격도에 도달하기 위해 사용한 조건은 하이브리드화되는 핵산의 특성에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 핵산의 하이브리드화 영역의 길이, 상보성의 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들어, GC 대 AT 함량) 및 핵산 유형(예를 들어, RNA 대 DNA)은 하이브리드화 조건을 선택하는데 고려할 것들이다. 추가로 고려할 사항은 핵산중 하나가 예를 들어, 필터에 고정화되었는가 하는 것이다.
하이브리드화는 낮은 정도의 엄격도, 중간 정도의 엄격도 또는 높은 정도의 엄격도 조건 하에서 수행될 수 있다. 핵산 하이브리드화의 예로서, 고정된 변성 핵산을 함유하는 중합체 막을 먼저 0.9 M NaCl, 50 mM NaH2PO4(pH 7.0), 5.0 mM Na2EDTA, 0.5% SDS, 10X 덴하르트(Denhardt) 및 0.5 mg/ml 폴리리보아데닐산을 함유하는 용액 중에서 45℃하에 30분 동안 사전하이브리드화한다. 이어서, 약 2 x 107 cpm(비활성 4-9 x 108 cpm/㎍)의, 32P로 종단부가 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 상기 용액에 첨가한다. 12 내지 16시간 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 막을 0.5% SDS를 함유하는 1X SET(150 mM NaCl, 20 mM 트리스 히드로클로라이드(pH 7.8), 1 mM Na2EDTA) 중에서 실온하에 30분 동안 세척하고, 이어서 올리고뉴클레오티드 프로브를 위해 Tm(용융 온도)-10℃에서 새로운 1X 세트 중에서 30분 동안 세척하였다. 이어서, 상기 막을 방사능 사진 촬영 필름에 노출시켜 하이브리드화 신호를 검출한다.
검출가능한 프로브에 하이브리드화하는 cDNA 또는 게놈 DNA와 같은 핵산을 확인하기 위해 사용한 하이브리드화 조건의 엄격도를 변경함으로써, 상기 프로브에 대해 상이한 수준의 상동성을 가진 핵산을 확인하고 단리시킬 수 있다. 엄격도는 프로브의 용융 온도 이하의 여러 온도에서 하이브리드화를 수행함으로써 변형시킬 수 있다. 용융 온도(Tm)는 완전하게 상보적인 프로브에 표적 서열의 50%가 하이브리드화하는 (정해진 이온 세기 및 pH 하의) 온도이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브의 Tm과 동일하거나, 그보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택된다. 프로브의 용융 온도는 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다: 길이가 14 내지 70 뉴클레오티드인 프로브의 경우, 용융 온도(Tm)는 다음과 같이 계산된다: Tm = 81.5 + 16.6(log[Na+]) + 0.41(분획 G+C)-(600/N), 이때 N은 프로브의 길이이다. 하이브리드화가 포름알데히드를 함유하는 용액 내에서 수행되는 경우, 용융 온도은 다음 식을 이용하여 계산된다: Tm = 81.5 + 16.6(log[Na+]) + 0.4(분획 G+C)-(0.63% 포름알데히드) - (600/N), 이때 N은 프로브의 길이이다. 사전하이브리드화는 6X SCC, 5X 덴하르트 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍의 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA, 또는 6X SSC, 덴하르트 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍의 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA 50% 포름알데히드 내 중에서 수행될 수 있다. SSC 및 덴하르트 용액에 대한 공식은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]에 개시되어 있다.
하이브리드화는 상기 열거한 사전하이브리드화 용액에 검출가능한 프로브를 첨가함으로써 수행된다. 상기 프로브가 이중 가닥 DNA를 함유하는 경우, 이는 하이브리드화 용액에 첨가하기 이전에 변성된다. 프로브가 그것과 상보적인 서열 또는 상동성인 서열을 함유하는 cDNA 또는 게놈 DNA에 하이브리드화할 수 있는 충분한 시간 동안 필터는 하이브리드화 용액과 접촉시킨다. 길이가 200 뉴클레오티드보다 긴 프로브일 경우, 하이브리드화는 Tm보다 낮은 15 내지 25℃에서 수행될 수 있다. 더 짧은 프로브, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브인 경우, 하이브리드화는 Tm보다 낮은 5 내지 10℃에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 6X SSC 중에서 하이브리드화하는 경우, 하이브리드화는 약 68℃에서 수행된다. 통상적으로, 50% 포름알데히드를 포함하는 용액 중에서 하이브리드화하는 경우, 하이브리드화는 약 42℃에서 수행된다. 상기한 모든 하이브리드화는 높은 정도로 엄격한 조건하에 있는 것으로 간주된다.
하이브리드화후, 필터를 세척하여 임의의 비특이적으로 결합된 검출가능한 프로브를 제거한다. 또한, 필터를 세척하는 데 사용된 엄격도는 하이브리드화되는 핵산의 성질, 하이브리드화되는 핵산의 길이, 상보성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들어, GC 대 AT 함량) 및 핵산 유형(예를 들어, RNA 대 DNA)에 따라 달라질 수 있다. 점진적으로 엄격도가 증가하는 세척의 예는 하기와 같다: 2X SSC, 0.1% SDS, 실온에서 15분(낮은 정도의 엄격도); 0.1X SSC, 0.5% SDS, 실온에서 30분 내지 1시간(중간 정도의 엄격도); 0.1X SSC, 0.5% SDS, 하이브리드화 온도 내지 68℃에서 15분 내지 30분(높은 정도의 엄격도); 및 0.15 M NaCl, 72℃에서 15분(매우 높은 정도의 엄격도). 최종적으로, 낮은 정도의 엄격도 조건하의 세척은 실온에서 0.1X SSC에서 수행된다. 상기 예들은 단지 필터를 세척하는 데 사용될 수 있는 조건의 세트들을 제시한 것에 불과하다. 당업자는 상이한 엄격도 조건하의 세척을 위해 다수의 조건들을 이용할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 일부 다른 예는 하기에서 제공한다.
상기 프로브에 하이브리드화하는 핵산은 방사선 촬영법 또는 다른 종래의 기법에 의해 확인할 수 있다.
상기 방법을 변형하여 프로브 서열에 대해 감소된 수준의 상동성을 가진 핵산을 확인할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 프로브에 대해 상동성이 감소된 핵산을 얻기 위해, 덜 엄중한 조건을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화 온도는 Na+ 농도가 약 1 M인 하이브리드화 완충액 중에서 68℃로부터 42℃까지 5℃씩 감소될 수 있다. 하이브리드화후, 상기 필터를 하이브리드화 온도에서 2X SSC, 0.5% SDS로 세척할 수 있다. 이들 조건은 50℃보다 높은 온도의 "중간 정도"의 조건 및 50℃보다 낮은 온도의 "낮은 정도"의 조건인 것으로 간주된다. "중간 정도"의 하이브리드화 조건에 대한 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 55℃에서 수행되는 경우이다. "낮은 정도의 엄격도"의 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 45℃에서 수행되는 경우이다.
별법으로, 하이브리드화는 42℃에서 완충액, 예를 들어, 6X SSC와 같이 포르아미드를 함유하는 완충액 중에서 수행될 수 있다. 이 경우, 하이브리드화 완충액 중 포름아미드의 농도는 50%로부터 0%까지 5%씩 감소시켜 프로브에 대해 감소된 수준의 상동성을 가진 클론을 확인할 수 있다. 하이브리드화후, 상기 필터를 50℃에서 6X SSC, 0.5% SDS로 세척할 수 있다. 이들 조건은 25% 초과의 포름아미드의 경우 "중간 정도"의 조건이며, 25% 미만의 포름아미드의 경우 "낮은 정도"의 조건인 것으로 간주된다. "중간 정도"의 하이브리드화 조건에 대한 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 30%의 포름아미드에서 수행되는 경우이다. "낮은 정도의 엄격한" 하이브리드화 조건에 대한 구체적인 예는 상기 하이브리드화가 10% 포름아미드에서 수행되는 경우이다.
예를 들어, 상기 기술한 방법들을 사용하여 서열 번호 1에 기술된 바와 같은 핵산 서열와 적어도 약 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 또는 적어도 80%의 상동성을 가진 서열, 그와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그의 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개의 연속된 염기를 포함하는 단편, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 상보적인 서열을 가진 핵산 서열을 단리시킬 수 있다. 상동성은 정렬 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 상동성 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술한 코딩 서열 중 하나의 천연 발생 대립유전자 변이체인 코딩 서열을 가질 수 있다. 이러한 대립유전자 변이체는 서열번호 1에 기술한 것과 같은 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다.
추가로, 상기 방법을 이용하여 서열 정렬 알고리즘(예를 들어, 디폴트 파라미터를 이용하는 FASTA 버전 3.0t78 알고리즘)을 이용하여 측정된 바와 같이, 서열 번호 2에 기술한 것과 같은 서열, 그와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속된 아미노산을 포함하는 단편을 가진 폴리펩티드와 적어도 약 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 70%의 상동성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 단리시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 서열 번호 1에 기술한 것과 같은 서열, 그와 실질적으로 동일한 서열, 또는 그의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 150개의 연속된 아미노산을 포함하는 단편을 포함하는 단리 또는 정제된 폴리펩티드이다. 상기한 바와 같이, 이러한 폴리펩티드는 코딩 서열이 적합한 숙주 세포 내에서 코딩된 폴리펩티드의 발현을 구동할 수 있는 서열에 작동 가능하게 연결되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 벡터 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 프로모터, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 번역 개시 및 전사 종결 인자를 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 발현을 증폭시키기 위한 적합한 서열을 포함할 수 있다.
박테리아 내에서 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하기에 적합한 프로모터로는 E. 콜라이 lac 또는 trp 프로모터, lacI 프로모터, lacZ 프로모터, T3 프로모터, T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 P R 프로모터, 람다 P L 프로모터, 당분해 효소, 예를 들어, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK)를 코딩하는 오페론으로부터 유래하는 프로모터 및 산 포스파타제 프로모터를 포함한다. 균류 프로모터로는 α인자 프로모터를 포함한다. 진핵생물 프로모터로는 CMV 최조기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 열 충격 프로모터, 조기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인 I 프로모터를 포함한다. 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스내 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 다른 프로모터도 사용할 수 있다.
또한, 포유 동물의 발현 벡터는 복제 기점, 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 측면에 위치하는 비전사 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 필요한 비전사 유전자 요소를 제공하는 데 SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열이 사용될 수 있다.
진핵 세포 내의 폴리펩티드 또는 그 단편을 발현하는 벡터는 또한 발현 수준을 증가시키는 인핸서도 함유할 수 있다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 그것의 전사를 증가시키는 통상 길이 약 10 내지 약 300 bp의 DNA의 시스 작용 요소이다. 그 예에는 100 내지 270 bp의 복제 기점 뒷부분에 존재하는 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒷부분에 존재하는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다.
추가로, 발현 벡터는 전형적으로 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별이 가능하도록 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 함유한다. 그러한 선별가능한 마커에는 디히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 또는 진핵 세포 배양물의 네오마이신 내성을 부여하는 유전자, E. 콜라이 및 S. 세레비지아 TRP1 유전자에서 테트라시클린 또는 암피실린 내성을 부여하는 유전자가 포함된다.
적어도 하나의 미생물로부터 유래된 DNA로부터 관심의 대상이 되는 표적 DNA를 선택적으로 단리시키는 데 사용되는 프로브 DNA는 공지된 활성의 효소에 대한 DNA의 전장의 코딩 영역 서열 또는 부분 코딩 영역 서열일 수 있다. 원래의 DNA 라이브러리는 특정 효소 활성을 가진 효소를 코딩하는 DNA 서열의 적어도 일부분을 포함하는 프로브의 혼합물을 이용함으로써 프로빙될 수 있다. 이들 프로브 또는 프로브 라이브러리는 단일 가닥일 수 있고, 프로빙된 미생물 DNA는 단일 가닥형으로 전환될 수 있다. 적합한 프로브는 스크리닝하려는 특정 효소 활성과 유사하거나 동일한 활성을 가진 효소를 코딩하는 DNA로부터 유래된 것이다.
상기 프로브 DNA는 적어도 약 10개 또는 적어도 15개의 염기일 수 있다. 한 측면에서, 전체 코딩 영역이 프로브로서 사용될 수 있다. 적어도 하나의 DNA에 의해 표적 DNA가 선택적으로 단리되는 하이브리드화 조건은 적어도 약 50%의 서열 동일성의 하이브리드화 엄격도, 더욱 특히, 적어도 약 70%의 서열 동일성을 제공하는 엄격도를 제공하도록 디자인될 것이다.
상기 프로브 DNA는 특이적인 결합 쌍의 한 파트너(즉, 리간드)로 "표지화"할 수 있고, 상기 쌍의 다른 파트너는 그의 공급원으로부터 유래하는 표적이 용이하게 분리될 수 있도록 고체 매트릭스에 결합된다. 상기 리간드 및 특이적인 결합 파트너는 임의의 배향으로 (1) 항원 또는 합텐 및 항체 또는 그의 특이적인 결합 단편; (2) 비오틴 또는 이미노비오틴 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘; (3) 당 및 그에 대해 특이적인 렉틴; (4) 효소 및 그에 대한 억제제; (5) 아포효소 및 보조인자; (6) 상보성 동종중합체 올리고뉴클레오티드; 및 (7) 호르몬 및 그에 대한 수용체로부터 선택될 수 있다. 상기 고체상은 (1) 유리 또는 중합체 표면; (2) 중합체 비드가 충전된 칼럼; 및 (3) 자성 또는 상자성 입자로부터 선택될 수 있다.
적합한 DNA 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, 상기 DNA 서열은 삽입체 및 벡터를 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 후 벡터 내의 원하는 위치로 결찰된다. 별법으로, 삽입체 및 벡터 둘 모두의 블런트 종단부를 결찰시킬 수도 있다. 다양한 클로닝 기법은 문헌 ([Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997] 및 [Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989])에 개시되어 있다. 그러한 방법 등은 당업자의 기술 범주내 포함되는 것으로 간주된다.
상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 또는 파지 형태일 수 있다. 다른 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합물로부터 유도된 벡터, 바이러스 DNA, 예를 들어, 백시니아, 아데노바이러스, 천연두 바이러스, 및 슈도라비에스가 포함된다. 원핵 및 진핵 숙주에 유용한 다양한 클로닝 및 발현 벡터가 예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있다.
사용될 수 있는 특정 박테리아 벡터로는 주지의 클로닝 벡터인 pBR322(ATCC 37017), pKK223-3(스웨덴 웁살라에 소재하는 Pharmacia Fine Chemicals), GEM1(미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 Promega Biotec), pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pD10, psiX174 p블루스크립트 II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5(Pharmacia), pKK232-8, 및 pCM7의 유전자 요소를 포함하는 상업적으로 이용가능한 플라스미드를 포함한다. 특정 진핵 생물 벡터로서는 pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia)을 포함한다. 그러나, 임의의 다른 벡터도 그것이 숙주 세포 내에서 복제 가능하고 생존할 수 있는 한은 사용될 수 있다.
숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 포유 동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포를 비롯하여 당업자들에게 친숙한 임의의 숙주 세포일 수 있다. 적절한 숙주의 대표적인 예로서, 박테리아 세포, 예를 들어, E. 콜라이, 스트렙토마이세스, 바실러스 섭틸리스, 바실러스 세레우스, 살모넬라 타이피뮤리움 및 슈도모나스, 스트렙토마이세스 및 스타필로코쿠스 속에 포함되는 다양한 종, 진균 세포, 예를 들어, 아스퍼질러스, 효모, 예를 들어, 피치아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지아, 또는 스키조사카로마이세스 폼베를 비롯한, 피치아, 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 또는 슈완니오마이세스의 임의의 종, 곤충 세포, 예를 들어, 초파리 S2(Drosophila S2) 및 스포도프테라 Sf9, 동물 세포, 예를 들어, CHO, COS 또는 보우스씨 흑색종, 및 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 적절한 숙주를 선택하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
벡터는 임의의 다양한 기법, 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti 매개 유전자 전이를 이용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 방법으로는 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함한다(문헌 [Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)]).
적당한 경우, 가공된 숙주 세포는 프로모터를 활성화하거나, 형질전환체를 선택하거나, 본 발명의 유전자를 증폭시킬 수 있도록 적절히 변형된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 적합한 숙주 균주를 형질전환시키고, 적당한 세포 밀도로 숙주 균주를 성장시킨 후, 적당한 수단(예를 들면, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 선택된 프로모터를 유도하고, 원하는 폴리펩티드 또는 그의 단편이 제조될 수 있도록 추가의 기간 동안 그 세포를 배양할 수 있다.
세포를 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴한 후, 생성된 미정제 추출물을 추가 정제를 위해 보관할 수 있다. 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결 해동 순환법, 초음파처리법, 기계적 파괴법, 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 파괴시킬 수 있다. 그러한 방법은 당업자들에게 주지되어 있다. 발현된 폴리펩티드 또는 그의 단편은 황산암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 구성을 완성함에 있어서 필요에 따라 단백질 리폴딩 단계를 이용할 수 있다. 필요한 경우, 최종 정제 단계에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용할 수 있다.
또한, 다양한 포유 동물 세포 배양 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유 동물 발현 시스템의 예로는 원숭이 신장 섬유아세포(문헌 [Gluzman, Cell, 23: 175 (1981)]에 기술되어 있다)의 COS-7 세포주, 및 화합성 벡터로부터 유래하는 단백질을 발현할 수 있는 다른 세포주, 예를 들어, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다.
숙주 세포내의 구성물이 재조합 서열에 의해 코딩된 유전자 생성물을 제조하는 종래 방법이 사용될 수 있다. 재조합체 제조 방법에 사용되는 숙주에 따라, 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 제조되는 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있거나, 또는 글리코실화되지 않을 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 최초 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 단백질의 재조합 발현에 관한 추가의 상세한 내용은 당업자가 이용할 수 있는 것들이다. 예를 들어, 문헌 [Protein Expression : A Practical Approach (Practical Approach Series by S. J. Higgins (Editor), B. D. Hames (Editor) (July 1999) Oxford University Press; ISBN: 0199636249]은 광범위한 유기체 내에서 단백질을 발현시키기 위한 충분한 지침을 당업자에게 제공하고 있다.
별법으로, 본 발명의 폴리펩티드는 종래 펩티드 합성기에 의해 합성할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장의 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다; 따라서, 상기 단편은 전장 폴리펩티드의 제조를 위한 중간체로서 사용될 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 본 발명의 핵산 서열은 다양한 유기체에서의 발현을 위해 최적화할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 서열은 관심의 대상이 되는 유기체, 예를 들어, S. 세레비지아와 같은 진균 또는 E. 콜라이와 같은 박테리아 내에서 코돈 선호도에 맞게 최적화된다. 코돈 선호도 목적으로 핵산 서열을 최적화시키는 것은 당업계에 주지되어 있으며, 이는 특정 아미노산을 코딩하기 위해 유기체가 선호하는 특정 코돈을 선택하는 것을 의미한다. 다수의 유기체에 대한 최적화된 코돈 선호도 표가 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Transfer RNA in Protein Synthesis by Dolph L. Hatfield, Byeong J. Lee, Robert M. Pirtle (Editor) (July 1992) CRC Press; ISBN: 0849356989]를 참조한다. 따라서, 본 발명은 또한 유기체의 코돈 선호도에 맞게 적합화된 본 발명의 핵산도 포함한다.
또한, 본 발명의 핵산 서열의 최적화된 발현은 코딩되는 단백질의 발현이 증가하도록 핵산을 지정 또는 무작위 돌연변이 유발법에 의해 돌연변이 유발하는 것을 의미한다. 본 발명의 핵산의 돌연변이 유발법은 단백질의 발현 수율을 직접적으로 또는 간접적으로 증가시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 기술된 돌연변이 유발 기법을 이용하여 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 또는 핵산의 코딩 영역을 돌연변이시켜 RNA 또는 단백질 수준에서 안정성을 증가시킬 수 있고, 이를 통해 단백질 수율을 증가시킬 수 있다.
폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 구성물로부터 전사된 mRNA를 이용함으로써 본 발명의 폴리펩티드 중 하나를 제조하는 데 무세포 번역 시스템 또한 사용될 수 있다. 일부 측면에서, DNA 구성물은 시험관내에서 전사 반응을 수행하기 이전에 선형화될 수 있다. 이어서, 전사된 mRNA를 적합한 무세포 번역 추출물, 예를 들어, 토끼 망상세포 추출물과 함께 인큐베이션시켜 원하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제조한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 변이체에 관한 것이다. "변이체"라는 용어는 이들 폴리펩티드의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 구체적으로, 변이체는 본 발명의 폴리펩티드, 및 그와 실질적으로 동일한 서열의 아미노산과는 하나 이상의 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단(이들은 임의의 조합으로 존재할 수도 있음)에 의해 상이할 수 있다.
변이체는 천연 발생된 것이거나, 시험관내에서 생성된 것일 수 있다. 특히, 이러한 변이체는 유전자 조작 기법, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발법, 무작위 화학적 돌연변이 유발법, 엑소뉴클레아제 III 결실 방법 및 표준 클로닝 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 별법으로, 이러한 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체는 화학적 합성 또는 수정된 방법을 이용하여 생성할 수 있다.
변이체를 생성하는 다른 방법 또한 당업자에게는 친숙한 것들이다. 이들은 천연 단리물로부터 얻은 핵산 서열을 변형시켜 산업적 용도 또는 실험실 용도로의 그의 가치를 강화시키는 특징을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 생성하는 방법을 포함한다. 이러한 방법으로 천연 단리물로부터 얻은 서열과 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 가진 다수의 변이체 서열이 생성되고 그 특징이 규명될 수 있다. 전형적으로, 이러한 뉴클레오티드 차이를 통해 천연 단리물로부터의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드와 관련하여 아미노산 변화가 형성된다.
예를 들어, 변이체는 오류 빈발 PCR을 사용하여 생성할 수 있다. 오류 빈발 PCR에 있어서, PCR은 DNA 폴리머라제의 복제 신뢰도가 낮은 조건 하에서 수행하여 높은 비율의 점 돌연변이가 PCR 생성물의 전체 길이를 따라서 수득되도록 한다. 오류 빈발 PCR은 예를 들어, 문헌 ([Leung, D.W., et al., Technique , 1:11-15, 1989)] 및 [Caldwell, R. C. and Joyce G.F., PCR Methods Applic, 2:28-33, 1992])에 기술되어 있다. 간략하면, 이러한 방법에 있어서는 PCR 생성물의 전체 길이를 따라서 높은 비율의 점 돌연변이를 달성하기 위하여 돌연변이시키고자 하는 핵산을 PCR 프라이머, 반응 완충액, MgCl2, MnCl2, Taq 폴리머라제 및 적절한 농도의 dNTP와 혼합시킨다. 예를 들어, 반응은 20 fmole의 돌연변이시키고자 하는 핵산, 30 pmole의 각각의 PCR 프라이머, 5O mM KCl, 10 mM Tris HCl(pH 8.3) 및 0.01%의 젤라틴을 포함하는 반응 완충액, 7 mM MgCl2, 0.5 mM MnCl2, 5 유닛의 Taq 폴리머라제, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 및 1 mM dTTP를 사용하여 수행할 수 있다. PCR은 94℃ 1분, 45℃ 1분 및 72℃ 1분의 30 사이클 동안 수행할 수 있다. 그러나 이러한 파라미터는 적절하게 변화시킬 수 있음을 알 것이다. 돌연변이된 핵산을 적절한 벡터 내로 클로닝하고, 돌연변이된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 활성을 평가한다.
변이체는 또한 관심의 대상이 되는 임의의 클로닝된 DNA에서의 부위 특이적 돌연변이를 생성하기 위하여 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발법은 예를 들어, 문헌 [Reidhaar-Olson, J.F. and Sauer, R.T., et al., Science, 241:53-57, 1988]에 기재되어 있다. 간략하게는, 이러한 방법에 있어서 클로닝된 DNA 내로 도입되는 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 복수 개의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 합성하고 돌연변이시키고자 하는 클로닝된 DNA 내로 삽입한다. 돌연변이된 DNA를 포함하는 클론을 회수하고, 그가 코딩하는 폴리펩티드의 활성을 평가한다.
변이체의 또 다른 생성 방법은 어셈블리 PCR이다. 어셈블리 PCR은 작은 DNA 단편의 혼합물로부터 유래되는 PCR 생성물의 어셈블리를 포함한다. 다수의 상이한 PCR 반응이 동일한 바이알에서 동시에 일어나는데, 하나의 반응 생성물은 또 다른 반응 생성물을 프라이밍한다. 어셈블리 PCR은 계류 중인 미국 특허 출원 시리얼 번호 제08/677,112호(출원일: 1996년 7월 9일, 발명의 명칭: "DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or interrupting a Synthesis or Amplification Process")에 기술되어 있다.
변이체를 생성하는 또 다른 방법은 유성 PCR 돌연변이 유발법이다. 유성 PCR 돌연변이 유발법에 있어서, 서열 상동성에 기초한 DNA 분자의 무작위 단편화, 이어서 PCR 반응에서의 프라이머 연장에 의한 교차의 고정의 결과로서, 시험관내에서 강제 상동성 재조합은 상이하지만 고도로 관련된 DNA 서열의 DNA 분자 사이에서 일어난다. 유성 PCR 돌연변이 유발법은 문헌 [Stemmer, W.P., PNAS, USA, 91:10747- 10751, 1994]에 기술되어 있다. 간략하게는, 이러한 방법에 있어서, 재조합시키고자 하는 복수 개의 핵산을 DN아제로 분해하여 평균 크기가 50-200개의 뉴클레오티드인 단편을 생성한다. 원하는 평균 크기의 단편을 정제하고 PCR 혼합물에 재현탁시킨다. PCR은 핵산 단편 사이의 재조합을 촉진시키는 조건 하에서 수행한다. 예를 들어, PCR은 0.2 mM의 각각의 dNTP, 2.2 mM MgCl2, 5O mM KCL, 10 mM Tris HCl(pH 9.0), 및 0.1% 트리톤(Triton) X-100의 용액 중 10-30 ng/ℓ의 농도로 정제 단편을 재현탁함으로써 수행할 수 있다. 100:1의 반응 혼합물당 2.5 유닛의 Taq 폴리머라제를 첨가하고 하기 계획을 사용하여 PCR을 수행한다: 94℃에서 60초 동안, 94℃에서 30초 동안, 50-55℃에서 30초 동안, 72℃에서 30초(30-45회) 및 72℃에서 5분. 그러나, 이러한 파라미터는 적절하게 변화시킬 수 있음을 알 것이다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드가 PCR 반응물에 포함될 수 있다. 다른 측면에서는 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편이 제1 PCR 반응물 세트에 사용될 수 있으며, Taq 폴리머라제가 그 후의 PCR 반응물 세트에 사용될 수 있다. 재조합 서열을 단리시키고, 그가 코딩하는 폴리펩티드의 활성을 평가한다.
변이체는 또한 생체내 돌연변이 유발법으로 생성될 수 있다. 일부 측면에서, 관심의 대상이 되는 서열에서의 무작위 돌연변이는 DNA 수복 경로 중 하나 이상의 경로에 돌연변이를 수반하는 박테리아 균주, 예를 들어, E. 콜라이 균주에서 관심의 대상이 되는 서열을 증식시킴으로써 생성한다. 이러한 " 돌연변이 유발 유전자" 균주는 야생형 모체의 무작위 돌연변이 비율보다 높은 무작위 돌연변이 비율을 가진다. 이러한 균주 중 하나에서 DNA를 증식시키면 최종적으로는 DNA 내에서 무작위 돌연변이가 일어난다. 생체내 돌연변이 유발법에 사용하기에 적합한 돌연변이 유발 유전자 균주는 PCT 공개 공보 번호 WO 91/16427(공개일: 1991년 10월 31일, 발명의 명칭: "Methods for Phenotype Creation from multiple Gene Populations")에 기술되어 있다.
변이체는 또한 카세트 돌연변이 유발법을 사용하여 생성될 수 있다. 카세트 돌연변이 유발법에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자의 작은 영역을 천연 서열과는 상이한 합성 올리고뉴클레오티드 "카세트"로 대체한다. 올리고뉴클레오티드는 종종 완전히 및/또는 부분적으로 무작위화된 천연 서열을 포함한다.
또한, 순환적 앙상블 돌연변이 유발법을 사용하여 변이체를 생성할 수 있다. 순환적 앙상블 돌연변이 유발법은 그의 구성원이 아미노산 서열면에서 상이한 것이고, 표현형에 있어 관련이 있는 돌연변이체의 다양한 군집을 생성하도록 개발된 단백질 조작용(단백질 돌연변이 유발) 알고리즘이다. 이 방법에서는 피드백 기전을 이용하여 조합 카세트 돌연변이 유발의 연속 라운드를 제어한다. 순환적 앙상블 돌연변이 유발법은 예를 들어, 문헌 [Arkin, A.P. and Youvan, D.C., PNAS, USA, 89:7811-7815, 1992]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 변이체는 지수 앙상블 돌연변이 유발법을 사용하여 생성한다. 지수 앙상블 돌연변이 유발법은 높은 비율의 유일한 기능적 돌연변이체로 조합 라이브러리를 생성하는 공정인데, 여기서, 소수의 잔기로 이루어진 군을 동시에 무작위하여 각각의 변경된 위치에서 기능성 단백질이 되게 하는 아미노산을 확인한다. 지수 앙상블 돌연변이 유발법은 예를 들어, 문헌 [Delegrave, S. and Youvan, D. C, Biotechnol . Res ., 11.:1548-1552, 1993]에 기술되어 있다. 무작위 및 부위 지정 돌연변이 유발법은 문헌 [Arnold, F. H., Current Opinion in Biotechnology, 4:450-455, 1993]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 변이체는 계류 중인 미국 특허 출원 시리얼 번호 제08/677,112호(출원일: 1996년 7월 9일, 발명의 명칭: "Method of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or interrupting a Synthesis or Amplification Process"), 및 계류 중인 미국 특허 출원 시리얼 번호 제08/651,568호(출원일: 1996년 5월 22일, 발명의 명칭: "Combinatorial Enzyme Development")에 기술되어 있는 것과 같이, 독특한 폴리펩티드를 코딩하는 복수 개의 핵산 중 일부를 함께 융합시켜 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 핵산 서열을 생성하는 것인 셔플링 방법을 사용하여 생성한다.
본 발명의 폴리펩티드의 변이체는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 하나 이상이 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(예를 들어, 보존적 아미노산 잔기)로 치환되며, 이 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩된 것이거나, 그러한 것이 아닐 수 있다.
보존적 치환은 유사한 특징을 가진 또 다른 아미노산에 의해 폴리펩티드 내의 주어진 아미노산이 치환되는 것이다. 전형적으로는 하기와 같은 치환이 보존적 치환으로서 간주된다: 지방족 아미노산, 예를 들어, Ala, Val, Leu 및 Ile의 또 다른 지방족 아미노산으로의 치환; Ser의 Thr으로의 치환, 또는 반대의 경우; 산성 잔기, 예를 들어, Asp 및 Glu의 또 다른 산성 잔기로의 치환; 아미드 기를 보유하는 잔기, 예를 들어, Asn 및 Gln의 아미드 잔기를 보유하는 또 다른 잔기로의 치환; 염기성 잔기, 예를 들어, Lys 및 Arg의 또 다른 염기성 잔기로의 치환; 및 방향족 잔기, 예를 들어, Phe, Tyr의 또 다른 방향족 잔기로의 치환.
다른 변이체는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 변이체이다.
또 다른 변이체는 폴리펩티드가 또 다른 화합물, 예를 들어, 상기 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 회합되어 있는 변이체이다.
추가의 변이체는 추가의 아미노산이 폴리펩티드, 예를 들어, 리더 서열, 분비 서열, 프로단백질 서열 또는 폴리펩티드의 정제, 농축 또는 안정화를 용이하게 하는 서열에 융합된 변이체를 의미한다. 일부 측면에서, 유도체 및 유사체는 본 발명의 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하고, 단편, 유도체 또는 유사체가 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성 폴리펩티드를 생성할 수 있도록 유도체 및 유사체는 프로단백질을 포함할 수 있다.
숙주 세포 내에서 고수준의 단백질 발현을 달성하기 위한 코돈 최적화
본 발명은 코돈 선호도를 변형시키기 위해 피타제 코딩 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에서 그의 발현을 증가 또는 감소시키기 위하여 피타제를 코딩하는 핵산에 있어서 코돈을 변형시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 숙주 세포에서 그의 발현이 증가하도록 변형된 피타제를 코딩하는 핵산, 그렇게 변형된 피타제 효소, 및 변형된 피타제의 제조 방법을 추가로 제공한다. 본 방법은 피타제 코딩 핵산에 있어서 "비선호," 또는 "저선호" 코돈을 확인하는 단계 및 하나 이상의, 상기와 같은 비선호 또는 저선호 코돈을, 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 코딩하는 "선호 코돈"으로 치환하는 단계를 포함하며, 핵산에 있어서 적어도 하나의 비선호 또는 저선호 코돈은 동일 아미노산을 코딩하는 선호 코돈으로 치환된다. 선호 코돈은 숙주 세포 내에서 유전자의 코딩 서열에 과출현하는 코돈이고, 비선호 또는 저선호 코돈은 숙주 세포 내에서 유전자의 코딩 서열에 적게 출현하는 코돈이다.
본 발명의 핵산, 발현 카세트 및 벡터를 발현시키는 숙주 세포로는 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명은 이러한 세포들 모두에서의 코돈 선호도를 최적화시키는 방법, 코돈 변경된 핵산 및 상기 코돈 변경된 핵산에 의해 생산된 폴리펩티드를 제공한다. 예시적인 숙주 세포로는 그람 음성 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 및 슈도모나스 플루오레센스; 그람 양성 박테리아, 예를 들어, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토코커스 락티스, 락토코커스 크레모리스(Lactococcus cremoris), 바실러스 섭틸리스를 포함한다. 예시적인 숙주 세포로는 또한 진핵 세포 유기체, 예를 들어, 각종 효모, 사카로마이세스 세레비지아, 스키조사카로마이세스 폼베, 피치아 파스토리스, 및 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 아스퍼질러스 니거를 비롯한, 사카로마이세스 종, 및 포유동물 세포 및 세포주 및 곤충 세포 및 세포주를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 유기체 및 종에서 발현이 최적화된 핵산 및 폴리펩티드도 포함한다.
예를 들어, 박테리아 세포로부터 단리된 피타제를 코딩하는 핵산 코돈은 핵산이 상기 피타제가 유래되는 것인 박테리아와는 상이한 박테리아 세포, 효모, 진균, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포 내에서 최적으로 발현될 수 있도록 변형된다. 코돈을 최적화시키는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 (미국 특허 번호 제5,795,737호; [Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118]; [Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188]; [Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253])을 참조한다. 마우스 시스템내 코돈을 최적화하는 것에 관하여 기술하는 문헌 [Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253]; 효모내 코돈을 최적화하는 것에 관하여 기술하는 문헌 [Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24]; E. 콜라이내 코돈을 최적화하는 것에 관하여 기술하는 문헌 [Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409]; E. 콜라이 내에서의 분비에 영향을 미치는 코돈 선호도를 최적화하는 것에 관하여 기술하는 문헌 [Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264]를 참조한다.
인간을 제외한 트랜스제닉 동물
본 발명은 본 발명의 핵산, 폴리펩티드, 발현 카세트 또는 벡터 또는 형질감염 또는 형질전환된 세포를 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 제공한다. 인간을 제외한 트랜스제닉 동물은 예를 들어, 본 발명의 핵산을 포함하는 염소, 토끼, 양, 돼지, 소, 래트 및 마우스일 수 있다. 이러한 동물은 예를 들어, 피타제 활성을 연구하기 위한 생체내 모델로서, 또는 생체내에서 피타제 활성을 변화시키는 제제를 스크리닝하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 인간을 제외한 트랜스제닉 동물내에서 발현되는 폴리펩티드의 코딩 서열은 구성적으로 디자인될 수 있거나, 또는 조직 특이적, 발달 특이적 또는 유도성 전사 조절 인자의 제어하에 있도록 디자인될 수 있다. 인간을 제외한 트랜스제닉 동물은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 디자인될 수 있고, 생성될 수 있다; 예를 들어, 형질전환된 세포 및 난자 및 트랜스제닉 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지 및 소를 제조 및 사용하는 것에 관하여 기술하고 있는 미국 특허 번호 제6,211,428호; 제6,187,992호; 제6,156,952호; 제6,118,044호; 제6,111,166호; 제6,107,541호; 제5,959,171호; 제5,922,854호; 제5,892,070호; 제5,880,327호; 제5,891,698호; 제5,639,940호; 제5,573,933호; 제5,387,742호; 제5,087,571호를 참조한다. 예를 들어, 트랜스제닉 낙농 동물의 우유 중 재조합 단백질을 생성하는 것에 관하여 기술하는 문헌 [Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157]; 트랜스제닉 염소의 생산에 관하여 입증한 문헌 [Baguisi(1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461] 또한 참조한다. 미국 특허 번호 제6,211,428호에는 뇌에서 DNA 서열을 포함하는 핵산 구성물을 발현하는 인간을 제외한 트랜스제닉 포유 동물의 제조 및 사용 방법이 기술되어 있다. 미국 특허 번호 제5,387,742호에는 클로닝된 재조합 또는 합성 DNA 서열을 수정된 마우스 난자에 주입하고, 이 주입된 난자를 가임신 암컷 마우스에 착상시킨 다음, 그의 세포가 알츠하이머병의 병상과 관련된 단백질을 발현하는 것인 트랜스제닉 마우스를 분만일까지 생육시키는 것이 기술되어 있다. 미국 특허 번호 제6,187,992호에는 그의 게놈이 아밀로이드 전구체 단백질(APP: amyloid precursor protein)을 코딩하는 유전자의 파괴를 포함하는 것인 트랜스제닉 마우스의 제조 및 사용 방법이 기술되어 있다.
"넉 아웃 동물"은 또한 본 발명의 방법을 실시하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명의 트랜스제닉 또는 변형된 동물로는, 피타제가 발현하지 못하도록, 피라제가 발현될 수 없도록 조작된 "넉 아웃 동물," 예를 들어, "넉 아웃 마우스"를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 피타제를 코딩하는 이종성 서열(예를 들어, 서열 번호 2에 대해 구체적으로 열거되어 있는 서열 변형물)을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 유기체를 제공한다. 본 발명의 트랜스제닉 동물을 제조하는 각종 방법이 이용될 수 있다. 일반적으로는, 3가지 방법이 이용될 수 있다. 제1 방법으로서는, 전핵(pronuclear) 단계의 배아("단세포 배아")를 암컷으로부터 수거하고, 배아에 트랜스진을 미세 주입하는데, 이 경우에 트랜스진은 생성된 성숙 동물의 생식세포 및 체세포의 염색체에 통합될 것이다. 제2 방법에서는, 배아 줄기 세포를 단리시키고, 전기천공, 플라스미드 형질감염 또는 미세 주입으로 그 내부에 트랜스진을 도입한 다음, 줄기 세포를 배아에 재도입하는데, 이 때 줄기 세포들은 콜로니화되어 배선으로 된다. 포유 동물 종의 미세 주입 방법은 미국 특허 번호 제4,873,191호에 기술되어 있다.
추가의 또 다른 예시적인 방법에서는, 트랜스진을 포함하는 레트로바이러스로 배아 세포를 감염시킴으로써, 배아의 생식 세포는 그 내부 염색체에 통합된 트랜스진을 가지게 된다. 트랜스제닉시키고자 하는 동물이 조류일 경우, 조류 수정란은 일반적으로 난관에서 처음 20시간 동안 세포 분열하기 때문에, 전핵으로의 접근이 불가능한 바, 수정란의 전핵으로의 미세 주입에는 문제가 있다. 따라서, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,162,215호에 개시된 바와 같이 조류 종인 경우에는, 상기 일반적으로 개시된 트랜스제닉 동물 제조 방법 중에서 레트로바이러스 감염이 바람직하다. 그러나, 미세 주입을 조류 종에 이용하고자 하는 경우에는, 문헌 [Love et al., (Biotechnol., 12, Jan 1994)]의 공개된 방법을 이용함으로써 이전의 알을 낳은 지 약 2.5시간 후에 죽인 암탉으로부터 배아를 얻고, 트랜스진을 배반의 세포질에 미세 주입하며, 성숙시까지 숙주 쉘에서 배아를 배양한다. 트랜스제닉시키고자 하는 동물이 소 또는 돼지인 경우, 미세 주입은 난의 불투명성으로 인해 종래의 차등 간섭 대비 현미경으로는 핵의 확인이 어렵기 때문에 문제가 될 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 보다 잘 시각화될 수 있도록 먼저 난을 원심분리하고 전핵을 분리할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 "인간을 제외한 동물"은 소과 동물, 돼지류, 양류 및 조류 동물(예를 들어, 소, 돼지, 양, 닭)을 포함한다. 본 발명의 "인간을 제외한 트랜스제닉 동물"은 인간을 제외한 동물의 생식 계열에 "트랜스진"을 도입하여 제조한다. 다양한 발생 단계에 있는 배아 표적 세포를 사용하여 트랜스진을 도입할 수 있다. 배아 표적 세포의 발생 단계에 따라서 상이한 방법이 사용된다. 접합자가 미세 주입을 위한 최적의 표적이다. 유전자 전달의 표적으로서 접합자를 사용하는 것은 대부분의 경우에 주입된 DNA가 제1 분열 전에 숙주 유전자 내로 도입된다는 점에서 중요한 이점을 가진다(문헌 [Brinster et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:4438-4442, 1985]). 그 결과, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물의 모든 세포는 도입된 트랜스진을 보유한다. 이는 일반적으로는 생식 세포의 50%가 트랜스진을 보유하고 있는 바, 트랜스진이 시조의 자손에게로 효과적으로 전달되었다는 것을 반영한다.
한 측면에서, "트랜스제닉"이라는 용어는 동물의 세포 모두에 외인성 유전 물질을 포함하는 동물을 의미하는 데 사용된다. "트랜스제닉" 동물은 생식에 사용된 세포내에 외인성 유전 물질을 포함하는 이종 교배한 2가지 키메라 동물에 의해 생성될 수 있다. 생성된 자손의 25%는 트랜스제닉 동물, 즉, 대립 유전자의 모든 세포 내에 외인성 유전 물질을 포함하는 동물이고, 생성된 동물의 50%는 하나의 대립 유전자 내에 외인성 유전 물질을 포함하며, 25%는 외인성 유전 물질을 포함하지 않는다.
한 측면에서, 본 발명을 수행하는 데 미세 주입 방법이 사용된다. 트랜스진을 분해하고, 예를 들어, 겔 전기영동으로 임의의 벡터 DNA가 없도록 정제한다. 한 측면에서, 트랜스진은 전사에 관여하는 세포 단백질과 상호작용하는 작동적으로 결합된 프로모터를 포함하여, 궁극적으로는 구성적 발현을 이끈다. 이와 관련하여 유용한 프로모터는 시토메갈로바이러스(CMV), 몰로니 백혈병 바이러스(MLV: Moloney leukemia virus), 및 헤르페스 바이러스로부터 유래된 프로모터뿐만, 아니라, 메탈로티오닌, 골격 액틴, P 에놀피루베이트 카르복실라제(PEPCK: P-enolpyruvate carboxylase), 포스포글리세레이트(PGK), DHFR, 및 티미딘 키나제를 코딩하는 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 라우스 육종 바이러스와 같은 바이러스 장말단 반복부(LTR: long terminal repeat)에 대한 프로모터를 사용할 수 있다. 트랜스제닉시키고자 하는 동물이 조류일 경우, 바람직한 프로모터는 닭 β-글로빈 유전자, 닭 리소자임 유전자 및 조류 백혈병 바이러스에 대한 프로모터를 포함한다. 배아 줄기 세포의 플라스미드 형질감염에 유용한 구성물은 전사를 자극하는 인핸서 요소, 스플라이스 수용체, 종결 및 폴리아데닐화 신호, 그리고 번역을 가능하게 하는 리보좀 결합 부위와 같은, 당업계에 공지된 추가의 조절 요소들을 사용한다.
상기 기술한 바와 같이 인간을 제외한 동물에게 트랜스진을 도입하는 데 레트로바이러스 감염이 사용될 수 있다. 발생 중인 인간을 제외한 배아를 시험관내에서 배반포기까지 배양할 수 있다. 이 시기 동안, 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 표적이 될 수 있다(문헌 [Jaenich, R., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 73:1260-1264, 1976]). 투명대를 제거하기 위해 효소 처리함으로써 할구를 효과적으로 감염시킬 수 있다(문헌 [Hogan, et al. (1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.]). 트랜스진을 도입하는 데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 트랜스진을 보유하는 복제 결함의 레트로바이러스이다(문헌 ([Jahner, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 6927-6931, 1985]; [Van der Putten, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 6148-6152, 1985])). 바이러스 생산 세포의 단층 상에서 할구를 배양하여 쉽고 효과적으로 형질감염시킨다(문헌 [Van der Putten, 상기 문헌 동일]; [Stewart, et al., EMBO J. 6: 383-388, 1987]). 별법으로, 후기 단계에서 감염을 실시할 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생산 세포를 할강에 주입할 수 있다(문헌 [D. Jahner et al., Nature 298: 623-628, 1982]). 대부분의 시조는, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 형성한 세포의 서브세트에서만 도입이 일어나기 때문에 트랜스진에 대해 모자이크일 것이다. 또한, 시조는 게놈의 상이한 위치에서 트랜스진의 각종 레트로바이러스 삽입을 포함할 수 있으며, 이는 일반적으로 자손에서 분리될 것이다. 또한, 중간잉태기 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염으로, 비록 효율이 낮기는 하지만, 트랜스진을 생식 계열에 도입할 수 있다([D. Jahner et al., 상기 문헌 동일]).
트랜스진 도입을 위한 표적 세포의 제3의 유형은 배아 줄기 세포(ES: stem cell)이다. ES 세포는 시험관내에서 배양된 이식전 배아로부터 수득하여 배아와 융합시킨다(문헌 ([M. J. Evans et al., Nature 292:154-156, 1981]; [M. O. Bradley et al., Nature 309:255-258, 1984]; [Gossler, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:9065-9069, 1986]; 및 [Robertson et al., Nature 322:445-448, 1986])). 트랜스진은 DNA 형질감염에 의해 또는 레트로바이러스 매개의 형질도입에 의해 효과적으로 ES 세포 내로 도입될 수 있다. 이렇게 형질전환된 ES 세포는, 이후에 인간을 제외한 동물로부터 유래된 배반포와 조합될 수 있다. 이후, ES 세포는 배아를 콜로니화하고, 생성된 키메라 동물의 생식 계열에 기여한다(리뷰를 위해 문헌 [Jaenisch, R., Science 240: 1468-1474, 1988] 참조).
한 측면에서, "형질전환된"이란 재조합 핵산 기법에 의해 이종성 핵산 분자가 그 안으로 도입된 세포(그의 조상 세포로 도입된 세포)를 의미한다. "이종성"이란 또 다른 종으로부터 기원하거나, 또는 그의 원래의 형태 또는 세포에서 주로 발현되는 형태에서 변형된 핵산 서열을 의미한다.
한 측면에서, "트랜스진"는 숙련된 기술로 세포내로 삽입된 DNA의 임의의 조각으로서, 이 세포로부터 발생한 유기체 게놈의 일부가 된다(즉, 안정하게 통합되거나, 또는 안정한 염색체외 성분이 됨). 그러한 트랜스진은 트랜스제닉 유기체에 대해 부분적으로 또는 완전하게 이종성(즉, 외래)인 유전자를 포함하거나, 또는 유기체의 내인성 유전자에 대해 상동성인 유전자를 나타낼 수 있다. DNA로 전사된 후 게놈 내로 도입되는 RNA 서열을 제공하여 형성된 트랜스진도 이 정의내에 포함된다. 본 발명의 트랜스진은 피타제 또는 피타제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하며, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물에서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "트랜스제닉"이라는 용어는 또한 게놈이 조기 배아 또는 수정란의 시험관내 조작으로 변형되거나 또는 특이적인 유전자 넉 아웃을 유도하는 임의의 유트랜스제닉 기법에 의해 변경된 임의의 유기체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "유전자 넉 아웃"이라는 용어는 당업자들에게 공지된 임의의 트랜스제닉 기술을 통해 달성되는, 기능을 완전히 상실하게 하여 생체내에서 유전자를 표적 파괴하는 것을 의미한다. 한 측면에서, 게놈 넉 아웃을 가진 트랜스제닉 동물은, 상동성 재조합으로 기능하지 않게 하고자 하는 유전자에 표적화된 삽입으로 표적 유전자가 기능하지 않게 된 것이다.
한 측면에서, "트랜스제닉"이라는 용어는 내인성 유전자가 작용하지 않게 된(즉, "넉 아웃") 것 또는 도입된 트랜스진을 보유하는 유기체를 생성할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 트랜스제닉 기법을 포함한다.
본 발명의 수행에 사용되는 트랜스진은 피타제 활성을 가진 폴리펩티드 또는 피타제를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 서열이다. 한 측면에서, 서열번호 1에 기술된 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2에 기술된 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 가진 폴리뉴클레오티드는, 본원에서 정의하는 의미를 가진 트랜스진이다. 적절한 경우, 피타제 활성 가진 단백질을 코딩하지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 핵산 서열에 차이가 있는 DNA 서열 또한 본원에서 사용할 수 있으며, 이들은 절단된 형태, 대립 변이체 및 종간 상동체일 수 있다.
한 측면에서, 배아를 미세 주입하거나, 형질감염된 배아 줄기 세포로 콜로니화하거나, 또는 트랜스진을 함유하는 레트로바이러스로 감염시킨 후에(본원 다른 곳에서 언급된 조류 종에서의 본 발명의 수행는 제외), 배아를 가임신 암컷의 난관에 이식한다. 트랜스진에 특이적인 프로브를 사용하여 혈액 또는 조직 샘플을 써던 블롯으로 분석하여 트랜스진의 도입에 대해 자손을 테스트한다. PCR이 특히 유용하다. 양성 자손(G0)을 이종교배하여 자손(G1)을 형성하고, 조직 샘플의 노던 블롯으로 분석하여 트랜스진 발현에 대해 분석한다.
한 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 동물에서 약 15%, 약 20%, 또는 약 20%, 내지 약 50% 이상 만큼 인 섭취를 증가시키고/거나, 트랜스제닉 유기체의 퇴비 중 오염물의 양을 감소시키는 방법을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 수행에 사용될 수 있는 것으로서 주시되는 동물은 일반적으로 애완 동물(예를 들어, 개과, 고양이과, 조류 종 등)을 비롯한 가축으로 간주되는 동물 및 식량 가공에 유용한 동물, 즉 조류, 예를 들어, 육용 및 산란용 닭 및 칠면조, 예를 들어, 새끼 양과 같은 양, 예를 들어, 육우 및 젖소와 같은 소, 어류 및 돼지이다. 한 측면에서, 이종성 DNA 서열, 또는 동물에 대해 일반적으로 내인성인 하나 이상의 추가의 DNA 서열(본원에서는 총체적으로 "트랜스진"라 고 지칭한다)이 동물의 생식 세포 내로 염색체 통합된 경우, 이들 동물을 "트랜스제닉" 동물로서 언급한다. 트랜스제닉 동물(그 자손 포함)은 체세포의 염색체 내로 우연히 통합된 트랜스진을 가질 것이다.
스크리닝 방법 및 "온라인" 모니터링 장치
본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서, 각종 장치 및 방법을 본 발명의 폴리펩티드 및 핵산과 함께 이용하여, 예를 들어, 피타제 활성에 대한 폴리펩티드를 스크리닝할 수 있거나, 활성의 잠재적인 조절인자(예를 들어, 효소 활성을 강화 또는 억제시키는 조절인자)로서의 화합물에 대해 스크리닝할 수 있거나, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 본 발명의 핵산에 하이브리드화하는 핵산을 스크리닝할 수 있다.
고정된 효소 고체 지지체
피타제 효소, 그의 단편 및 상기 효소 및 단편을 코딩하는 핵산을 고체 지지체에 고정시킬 수 있다. 이는 대체로 산업 공정에서의 피타제의 사용에 있어서 경제적이고 효과적이다. 예를 들어, 특정 화학 반응에서 사용되는 피타제 효소(또는 그의 활성 단편)의 조합 또는 칵테일을 고체 지지체에 부착시켜 처리 통에 잠기게 할 수 있다. 효소 반응이 일어날 수 있다. 이어서, 반복 사용을 위해서 고체 지지체를 그에 고정된 효소와 함께 통 밖으로 꺼낼 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 분리된 핵산을 고체 지지체에 고정시킨다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 고체 지지체는 겔, 수지, 중합체, 세라믹, 유리, 미소전극 및 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 본 발명에 유용한 고체 지지체는 겔을 포함한다. 겔의 일부 예로는 세파로스, 젤라틴, 글루타르알데히드, 키토산으로 처리된 글루타르알데히드, 알부민 글루타르알데히드, 키토산 크산탄, 토요펄(toyopearl)(중합체 겔), 알기네이트, 알기네이트 폴리리신, 카라기난, 아가로스, 글리옥실 아가로스, 자기 아가로스, 덱스트란 아가로스, 폴리(카르바모일 술포네이트) 히드로겔, BSA PEG 히드로겔, 인산화된 폴리비닐 알콜(PVA: polyvinyl alcohol), 모노아미노에틸-N-아미노에틸(MANA: monoaminoethyl-N-aminoethyl), 아미노, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명에 유용한 또 다른 고체 지지체는 수지 또는 중합체이다. 수지 또는 중합체의 일부 예로는 셀룰로스, 아크릴아미드, 나일론, 레이온, 폴리에스테르, 음이온 교환 수지, 앰버라이트(AMBERLITE)™ XAD-7, 앰버라이트™ XAD-8, 앰버라이트™ IRA-94, 앰버라이트™ IRC-50, 폴리비닐, 폴리아크릴, 폴리메타크릴레이트, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명에 유용한 또 다른 유형의 고체 지지체는 세라믹이다. 일부 예로는 비다공성 세라믹, 다공성 세라믹, Si02, Al203을 포함한다. 본 발명에 유용한 또 다른 유형의 고체 지지체는 유리이다. 일부 예로는 비다공성 유리, 다공성 유리, 아미노프로필 유리 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 사용될 수 있는 또 다른 유형의 고체 지지체는 미소전극이다. 일례는 폴리에틸렌이민 코팅된 자철광이다. 흑연 입자를 고체 지지체로서 사용할 수 있다. 고체 지지체의 또 다른 예는 세포, 예를 들어, 적혈구이다.
고정화 방법
효소 또는 그의 단편, 또는 핵산을 고체 지지체 상에 고정시키는 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법의 일부 예로는, 예를 들어, 정전기적 액적 생성, 전기화학적 수단, 흡착, 공유 결합, 가교 결합, 화학 반응 또는 공정, 캡슐화, 포획, 알긴산칼슘, 또는 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)를 이용한 방법을 포함한다. 유사한 방법이 문헌 ([Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Edited by S. P. Colowick and N. O. Kaplan. Volume 136]; 및 [Immobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Edited by G. F. Bickerstaff. Series: Methods in Biotechnology, Edited by J. M. Walker])에 기술되어 있다.
모세관 어레이
본 발명의 방법에서 모세관 어레이, 예를 들어, 기가매트릭스(GIGAMATRIX)™(미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 Diversa Corporation)가 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드는 모세관 어레이를 비롯한, 어레이에 고정화되거나 도포될 수 있다. 어레이는 조성물(예를 들어, 소분자, 항체 및 핵산 등)의 라이브러리가 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드에 결합하거나 또는 그의 활성을 조정하는 능력을 갖는지 여부를 스크리닝하거나 모니터하는데에 사용될 수 있다. 모세관 어레이는 샘플을 수용하고 스크리닝하는 또 다른 시스템을 제공한다. 예를 들어, 샘플 스크리닝 기기는 인접 모세관 어레이로 형성된 다수의 모세관을 포함하는데, 여기서, 각각의 모세관은 샘플을 보유하기 위한 루멘을 한정하는 적어도 하나의 벽을 포함한다. 본 기기는 추가로 어레이내 인접하는 모세관 사이에 배치되어 있는 틈새 간 물질과, 틈새 간 물질내 형성된 하나 이상의 참조 표지를 포함할 수 있다. 모세관 어레이에서 결합되도록 적합화된 모세관인, 샘플을 스크리닝하기 위한 모세관은 샘플을 여기시키기 위해 루멘으로 제공되는 여기 에너지를 여과하기 위해 샘플을 보유하는 루멘을 한정하는 제1 벽과, 여과 물질로 형성된 제2 벽을 포함할 수 있다.
폴리펩티드 또는 핵산, 예를 들어, 리간드 또는 기질은 제1 성분으로 모세관 어레이를 이루는 적어도 일부의 모세관으로 도입될 수 있다. 모세관 어레이를 이루는 각각의 모세관은 제1 성분을 보유하기 위한 루멘을 한정하는 적어도 하나의 벽을 포함할 수 있다. 제1 성분 후방의 모세관으로 기포가 도입될 수 있다. 제2 성분이 모세관으로 도입될 수 있는데, 여기서, 제2 성분은 기포에 의해 제1 성분으로부터 분리되어 진다. 관심의 대상이 되는 샘플은 검출 가능한 입자로 표지된 제1 액체로서 모세관 어레이를 이루는 모세관으로 도입될 수 있는데, 여기서, 모세관 어레이의 각각의 모세관은 제1 액체와 검출 가능한 입자를 보유하기 위한 루멘을 한정하는 적어도 하나의 벽을 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 벽은 검출 가능한 입자를 적어도 하나의 벽에 결합시키기 위한 결합 물질로 코팅되어 있다. 본 방법은 추가로 모세관 튜브로부터 제1 액체를 제거하는 단계(여기서, 결합된 검출 가능한 입자는 모세관내 유지된다), 및 제2 액체를 모세관 튜브로 도입시키는 단계를 포함할 수 있다.
모세관 어레이는 루멘을 한정하는 적어도 하나의 외벽을 포함하는 개별 모세관을 복수 개 포함할 수 있다. 모세관의 외벽은 함께 융합된 하나 이상의 벽일 수 있다. 유사하게, 벽이 액체 또는 샘플을 보유하기 위한 루멘을 형성하는 한, 원통형, 사각형, 육각형 또는 임의의 다른 기하학적 형상의 루멘으로 정의될 수 있다. 모세관 어레이를 이루는 모세관들은 서로 인접하여 존재함으로써 평면 구조를 형성할 수 있다. 모세관들은 융합되거나(예로서, 모세관들이 유리로 이루어진 경우), 아교 접합되거나, 결합되거나 또는 측면끼리 클램프로 죄거나 하여 함께 결합될 수 있다. 모세관 어레이는 임의의 개수의 개별 모세관, 예컨대, 100 내지 4,000,000 개의 모세관으로 형성될 수 있다. 모세관 어레이는 약 100,000 개 이상의 개별 모세관들이 함께 결합된 마이크로티터 플레이트를 형성할 수 있다.
어레이 또는 "바이오칩"
본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드는 어레이에 고정화되거나 도포될 수 있다. 어레이는 조성물(예를 들어, 소분자, 항체, 핵산 등)의 라이브러리가 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드에 결합하거나 또는 그의 활성을 조정하는 능력을 갖는지 여부를 스크리닝하거나 모니터하는데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 한 측면에서, 모니터링되는 파라미터는 피타제 유전자의 전사체 발현이다. 세포의 전사체들 중 하나 이상 또는 그 모두는 세포의 전사체, 세포의 전사체를 나타내는 핵산 또는 세포의 전사체에 상보적인 핵산을 포함하는 샘플의 하이브리드화에 의해, 또는 어레이 또는 "바이오칩" 상에 고정된 핵산에의 하이브리드화에 의해 측정될 수 있다. 마이크로칩 상의 핵산의 "어레이"를 사용함으로써, 세포의 전사체 중 일부 또는 그 전부를 동시에 정량 분석할 수 있다. 별법으로, 게놈 핵산을 포함하는 어레이는 또한 본 방법의 방법에 의해 제조된 새로 조작된 균주의 유전자형을 측정하는 데 사용될 수도 있다. "폴리펩티드 어레이"는 또한 다수의 단백질을 동시에 정량 분석하는 데 사용될 수도 있다.
대안적 측면에서, 본 발명의 "어레이" 또는 "마이크로어레이" 또는 "바이오칩" 또는 "칩"은 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드 또는 펩티드 이외에도 복수 개 표적 요소를 포함할 수 있으며; 각각의 표적 요소는 하기에 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 기판 표면의 지정된 영역 상에 고정된 하나 이상의 폴리펩티드(항체 포함) 또는 핵산을 지정된 양만큼 포함할 수 있다.
본 발명은 임의의 공지된 "어레이"(이는 " 마이크로어레이" 또는 "핵산 어레이" 또는 "폴리펩티드 어레이" 또는 "항체 어레이" 또는 "바이오칩"으로 지칭되기도 한다) 또는 그 변형물을 사용함으로써 실시될 수 있다. 어레이는 총괄적으로 복수 개의 "스폿(spot)" 또는 "표적 요소"이며, 각각의 표적 요소는 샘플 분자, 예를 들어, mRNA 전사체에의 특이적 결합을 위해 기판 표면의 지정된 영역 상에 고정된 하나 이상의 생물학적 분자, 예컨대, 올리고뉴클레오티드를 지정된 양만큼 포함한다.
본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서, 임의의 공지된 어레이 및/또는 어레이 제조 및 사용 방법을 전부 또는 일부, 또는 그의 변형물을, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,277,628호; 제6,277,489호; 제6,261,776호; 제6,258,606호; 제6,054,270호; 제6,048,695호; 제6,045,996호; 제6,022,963호; 제6,013,440호; 제5,965,452호; 제5,959,098호; 제5,856,174호; 제5,830,645호; 제5,770,456호; 제5,632,957호; 제5,556,752호; 제5,143,854호; 제5,807,522호; 제5,800,992호; 제5,744,305호; 제5,700,637호; 제5,556,752호; 제5,434,049호에 개시된 바와 같이 도입할 수 있다; 예를 들어, WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958 또한 참조한다; 예를 들어, 문헌 ([Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174]; [Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092]; [Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407]; [Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32]) 또한 참조한다. 미국 특허 출원 공개 번호 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765 또한 참조한다.
폴리펩티드 및 펩티드
본 발명은 서열 번호 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지고, 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 하나 이상의 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 서열 번호 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지고, 표 4, 5, 6, 7, 9에 열거되어 있는 하나 이상의 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다. 참고로, 서열 번호 2의 합성적으로 생성된 "모체"는 하기와 같다:
Figure 112011101934958-pct00004
Figure 112011101934958-pct00005
실시예 1에 기술된 바와 같이, 진리어셈블리™ 라이브러리 구성을 위해 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM)으로 생성된 서열 변형을 보이며, 예를 들어, 서열 번호 1에 의해 코딩된 모체 피타제 서열 번호 2의 서열이 도 4에 제시되어 있다. 서열 번호 1에 의해 코딩된 모체 피타제 서열 번호 2에 실시예 2에 기술된 바와 같이, 추가로 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM) 서열 변형, 부위 지정 돌연변이 유발법(SDM: site directed mutagenesis) 및 TMCA 라이브러리 구성을 수행하였다.
한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 피타제 활성을 가진다. 대안적 측면에서, 이는 또한 예를 들어, 표지화 프로브, 항원, 저항원(toleragen), 모티프, 피타제 활성 부위로서 유용할 수 있다.
대안적 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 합성 폴리펩티드이거나, 재조합적으로 통해 생성된 폴리펩티드이다. 펩티드 및 단백질은 시험관내 또는 생체내에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용함으로써 제조되고 단리될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 전체적으로 또는 부분적으로 당업계에 주지되어 있는 화학적 방법을 사용함으로써 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223]; [Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232]; [Banga, A.K., Therapeutic Peptides 및 Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA])를 참조한다. 예를 들어, 펩티드 합성은 다양한 고체상 기법을 사용함으로써 수행될 수 있고(예를 들어, 문헌 ([Roberge (1995) Science 269:202]; [Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3 13]) 참조), 예를 들어, ABI 431A 펩티드 합성기(ABI 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer))를 사용하여 제조사가 제공하는 설명서에 따라 자동화 기법으로 합성할 수 있다.
본 발명의 효소 및 폴리뉴클레오티드는 단리된 형태로 제공될 수 있거나, 균질하게 정제될 수 있다. 본 발명의 피타제 폴리펩티드는 수개의 표준 방법 중 임의의 것을 사용함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, 피타제 폴리펩티드는 (본원에 기술된 바와 같이) 표준 재조합 발현 시스템에서 제조될 수 있거나, (비록 소형 피타제 펩티드 단편으로 제한되기는 하지만) 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 상기 폴리펩티드가 천연적으로 발현되는 유기체로부터 정제될 수 있다. 유용한 재조합 발현 방법은 포유 동물 숙주, 미생물 숙주, 및 식물 숙주를 포함한다.
대안적 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열이거나, 또는 별법으로, 이들 중 임의의 것의 단편, 일부 또는 서브유닛, 및 천연 발생 또는 합성 분자인 "아미노산" 또는 "아미노산 서열"을 포함한다.
대안적 측면에서, 본 발명의 "재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 폴리펩티드 또는 단백질: 예를 들어, 원하는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외인성 DNA 구성물에 의해 형질전환된 세포로부터 제조된 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다(의미한다). 본 발명의 "합성" 핵산(올리고뉴클레오티드 포함), 폴리펩티드 또는 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 화학적 합성법에 의해 제조된 것을 포함한다. 대안적 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의하여 상호 연결된 아미노산, 즉, 펩티드 균등체(peptide isostere)를 포함하고, 20개의 유전자에 의해 코딩된 아미노산을 제외한 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 천연 과정, 예를 들어, 번역 후 프로세싱에 의해, 또는 당업계에 주지되어 있는 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 변형은 폴리펩티드중 임의의 부위, 예를 들어, 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형이 주어진 폴리펩티드 중 몇몇 부위에서 동일하거나 또는 상이한 정도로 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한 주어진 폴리펩티드는 여러 유형의 변형, 예를 들어, 아세틸화, 아실화. ADP 리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 부분의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티딜이노시톨의 공유 결합, 가교 폐환화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스톨릴화, 산화, 페길화, 단백 분해성 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 및 아르기닐화와 같이 전달-RNA 매개된 아미노산의 단백질로의 첨가를 가질 수 있다.
대안적 측면에서, "합성" 폴리펩티드 또는 단백질은 화학적 합성법에 의해 제조된 것이다. 고체상 화학적 펩티드 합성법 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 단편을 합성하는 데에 사용될 수 있다. 그러한 방법은 1960년대 초부터 당업계에서 공지되어져 왔으며(문헌 [Merrifield, R. B., J. Am . Chem . Soc., 85:2149-2154, 1963] 참조) (또한, 문헌 [Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2 ed., Pierce Chemical Co., Rockford, I11., pp. 11-12)]도 참조), 최근에는 시판되는 실험실용 펩티드 디자인 및 합성 키트(Cambridge Research Biochemicals)에 사용되어 왔다. 이러한 시판되는 실험실용 키트는 일반적으로 문헌 [H. M., Geysen et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., USA , 81: 3998 (1984)]의 교시 내용을 이용하며, 전부가 단일 플레이트에 연결된 다수의 "막대" 또는 "핀"의 선단에서 펩티드를 합성한다. 이러한 시스템이 이용되는 경우, 막대 또는 핀의 플레이트를 거꾸로 뒤집어, 핀 또는 막대 선단에 적절한 아미노산을 부착 또는 고정하기 위한 용액을 함유하는 상응하는 웰 또는 저장소의 제2 플레이트에 삽입한다. 이러한 프로세스 단계를 반복하여, 즉 막대 및 핀의 선단을 거꾸로 뒤집어 적절한 용액에 삽입하는 단계를 반복하여, 아미노산을 원하는 펩티드로 만들 수 있다. 또한, 다수의 이용가능한 FMOC 펩티드 합성계를 사용할 수 있다. 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드의 모델 431 A™(Applied Biosystems, Inc. Model 431 A)™ 자동 펩티드 합성기를 사용하여 고체 지지체 상에서 폴리펩티드 또는 단편의 어셈블리를 실시할 수 있다. 이러한 장치는, 다른 공지 기법을 사용하여 커플링될 수 있는 일련의 단편을 합성하거나, 또는 직접 합성하여 본 발명의 펩티드에 쉽게 접근할 수 있게 한다.
대안적 측면에서, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 글리코실화된 것이다. 글리코실화는 번역 후 화학적으로 또는 세포 생합성 기전에 의해서 첨가될 수 있으며, 세포 생합성 기전에서는 서열에 대해 고유하거나, 또는 펩티드로서 첨가되거나 핵산 코딩 서열에서 첨가될 수 있는 공지의 글리코실화 모티프를 사용한다. 글리코실화는 O 결합 또는 N 결합 글리코실화, 또는 이들의 조합일 수 있다.
대안적 측면에서, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는"모방체" 및 "펩티드모방체" 형태를 포함한다. 한 측면에서, "모방체" 및 "펩티드모방체"라는 용어는 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및/또는 작용 특징을 가진 합성된 화학적 화합물을 의미한다. 모방체는 전적으로 합성된 아미노산의 비천연 유사체로 구성되거나, 또는 부분적으로 천연물인 펩티드 아미노산과 부분적으로 비천연물인 아미노산의 유사체로 된 키메라 분자이다. 모방체는 또한 보존적 치환이 모방체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한, 임의의 양으로 천연 아미노산 보존성 치환을 도입할 수 있다. 보존적 변이체인 본 발명의 폴리펩티드에 대해서는, 토상의 실험으로 모방체가 본 발명의 범주 내에 포함되는지 여부, 즉, 그 구조 및/또는 작용이 실질적으로 변경되지 않았는지 여부를 결정한다. 따라서, 한 측면에서, 모방체 조성물은 그가 피타제 활성을 가진 한, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
대안적 측면에서, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이, 서열 번호 2에의 특정 변형, 및 활성, 예를 들어, 효소 활성을 변형시키거나 변형시키지 않을 수 있는 치환을 포함하는 서열을 가진다. 대안적 측면에서, 보존적 치환은 유사한 특징을 가진 또 다른 아미노산에 의해 폴리펩티드 내의 주어진 아미노산이 치환되는 것이다. 대안적 측면에서, 하기와 같은 치환이 보존적 치환이다: 지방족 아미노산, 예를 들어, Ala, Val, Leu 및 Ile의 또 다른 지방족 아미노산으로의 치환; Ser의 Thr으로의 치환, 또는 반대의 경우; 산성 잔기, 예를 들어, Asp 및 Glu의 또 다른 산성 잔기로의 치환; 아미드 기를 보유하는 잔기, 예를 들어, Asn 및 Gln의 아미드 잔기를 보유하는 또 다른 잔기로의 치환; 염기성 잔기, 예를 들어, Lys 및 Arg의 또 다른 염기성 잔기로의 치환; 및 방향족 잔기, 예를 들어, Phe, Tyr의 또 다른 방향족 잔기로의 치환.
본 발명의 폴리펩티드 모방체 조성물은 비천연 구조 성분의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적인 측면에서, 본 발명의 모방체 조성물은 다음 3가지 구조성 기 중 하나 또는 전부를 포함한다: a) 천연 아미드 결합("펩티드 결합") 연결 이외의 잔기 연결기; b) 천연 아미노산 잔기 대신에 비천연 잔기; 또는 c) 2차 구조 모조를 유도하는 잔기, 다시 말하면 2차 구조(예를 들어, 베타 선회부, 감마 선회부, 베타 쉬트, 알파 나선 형태 등을 유도 또는 안정화시키는 잔기. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 그 잔기의 전부 또는 일부가 천연 펩티드 결합 이외의 화학 수단으로 연결된 경우 모방체로서 특징지울 수 있다. 개개의 펩티드모방체 잔기는, 펩티드 결합, 기타 화학 결합 또는 커플링 수단, 예를 들어, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이작용성 말레이미드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)로 연결될 수 있다. 전형적인 아미드 결합("펩티드 결합") 연결에 대해 대체될 수 있는 연결기로는, 예를 들어, 케토메틸렌(예를 들어, -C(=O)-NH- 대신에 -C(=O)-CH2-), 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2O), 티오에테르(CH2-S), 테트라졸(CN4-), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드 또는 에스테르 등이 있다(예를 들어, 문헌 [Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357,"Peptide Backbone Modifications,"Marcell Dekker, NY]를 참조한다).
본 발명의 폴리펩티드는 천연 아미노산 잔기 대신에 비천연 잔기를 전부 또는 일부 포함함으로써 모방체로 특징지울 수 있다. 비천연 잔기는 과학 및 특허 문헌에 기재되어 있다. 천연 아미노산 잔기의 모방체로서 유용한 몇몇 예시적인 비천연 조성물과 가이드라인이 하기에 개시되어 있다. 방향족 아미노산의 모방체는, 예를 들어, D- 또는 L-나프틸알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2 티에네일알라닌; D- 또는 L-1,-2, 3-, 또는 4-피레네일알라닌; D- 또는 L-3 티에네일알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌; D-p-플루오로페닐알라닌; D- 또는 L-p-비페닐페닐알라닌; K- 또는 L-p-메톡시비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌; 및, D- 또는 L-알킬알라닌[여기서, 알킬은 치환 또는 비치환된 메틸 에틸 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-이소틸, 이소펜틸임], 또는 비산성 아미노산으로 치환하여 형성할 수 있다. 비천연 아미노산의 방향족 고리는, 예를 들어, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다.
산성 아미노산의 모방체는, 예를 들어, 음전하를 유지하는 비-카르복실레이트 아미노산; (포스포노)알라닌; 황산화된 트레오닌 등으로 치환하여 만들 수 있다. 카르복실 측쇄기(예를 들어, 아스파르틸 또는 글루타밀)는, 예를 들어, 1-시클로헥실-3(2-모르폴리닐(4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3(4-아조니아-4,4-디메톨펜틸)카르보디이미드 등의 카르보디이미드(R'-N-C-N-R')와 반응시켜 선택적으로 변형시킬 수 있다. 아스파르틸 또는 글루타밀은 암모늄 이온과 반응시켜 아스파라기닐 및 글루타미닐기로 전환시킬 수 있다. 염기성 아미노산의 모방체는, 예를 들어, (리신 및 아르기닌 외에) 아미노산 오르니틴, 시트룰린, 또는 (구아니디노)-아세트산 또는 (구아니디노)알킬 아세트산[여기서, 알킬은 상기 기술한 바와 같음]으로 치환하여 형성할 수 있다. 아스파라긴 또는 글루타민 대신에 (예를 들어, COOH 대신에 CN-부분을 함유하는) 니트릴 유도체로 대체할 수 있다. 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기는 상응하는 아스파르틸 또는 글루타밀 잔기로 탈아민화될 수 있다. 아르기닐을, 예를 들어, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 또는 닌히드린을 비롯한 하나 이상의 통상적인 시약과 반응시켜 아르기닌 잔기 모방체를 형성할 수 있으며, 상기 시약을 위해서는 알칼리 조건을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 티로실을, 예를 들어, 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 티로신 잔기 모방체를 형성할 수 있다. N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 티로실 종과 3-니트로 유도체를 형성할 수 있다. 시스테인 잔기 모방체는, 시스테이닐 잔기를, 예를 들어, 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공하기 위해서 알파-할로아세테이트(예를 들어, 2-클로로아세트산) 또는 클로로아세트아미드 및 상응하는 아민과 반응시켜 형성할 수 있다. 시스테인 잔기 모방체는 또한, 시스테이닐 잔기를, 예를 들어, 브로모-트리플루오로아세톤, 알파-브로모-베타-(5-이미도졸릴)프로피온산; 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설피드; 메틸 2-피리딜 디설피드; p-클로로머큐리벤조에이트; 2-클로로머큐리-4-니트로페놀; 또는 클로로-7-니트로벤조-옥사-1,3-디아졸과 반응시켜 형성할 수 있다. 리시닐을, 예를 들어, 숙신산 또는 기타 카르복실산 무수물과 반응시켜 리신 모방체를 형성할 수 있다(그리고, 아미노 말단 잔기를 변화시킬 수 있다). 리신 및 기타 알파-아미노-함유 잔기 모방체는, 이미도에스테르, 예를 들어, 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로히드라이드, 트리니트로-벤젠설폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온과의 반응 및 트랜스아미다제-촉매의 글리옥실레이트와의 반응으로 형성할 수 있다. 메티오닌 모방체는, 예를 들어, 메티오닌 설폭시드와 반응시켜 형성할 수 있다. 프롤린의 모방체는, 예를 들어, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 3- 또는 4-히드록시 프롤린, 데히드로프롤린, 3- 또는 4-메틸프롤린 또는 3,3-디메틸프롤린을 포함한다. 히스티딘 잔기 모방체는 히스티딜을, 예를 들어, 디에틸프로카르보네이트 또는 파라 브로모펜아실 브로마이드와 반응시켜 형성할 수 있다. 기타 모방체는, 예를 들어, 프롤린과 리신의 히드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘의 알파 아미노기의 메틸화; N 말단 아민의 아세틸화; 주쇄 아미드 잔기의 메틸화 또는 N 메틸 아미노산으로의 치환; 또는 C 말단 카르복실기의 아미드화로 형성된 것들을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 잔기, 예를 들어, 아미노산을 반대 키랄성의 아미노산(또는 펩티드모방체 잔기)으로 치환할 수 있다. 따라서, L 구조(키랄 실체의 구조에 따라 R 또는 S로서도 불리울 수 있음)로 천연 발생하는 임의의 아미노산을 동일한 화학 구조 유형 또는 펩티드모방체이지만, 키랄성이 반대인 D 아미노산(R 형태 또는 S 형태로서 언급될 수도 있음)이라 불리우는 아미노산으로 치환할 수 있다.
본 발명은 전사후 프로세싱(예를 들어, 인산화, 아실화 등)과 같은 천연 프로세스나, 또는 화학적 변형 기법으로 본 발명의 폴리펩티드를 변형시키는 방법과, 생성된 변형 폴리펩티드를 제공한다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 비롯한 폴리펩티드 내의 임의의 곳에서 일어날 수 있다. 동일한 종류의 변형이 소정의 폴리펩티드의 몇몇 부위에서 동일한 정도 또는 다향한 정도로 존재할 수 있음을 알 것이다. 또한, 소정의 폴리펩티드는 여러 종류의 변형을 포함할 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 부분의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티닐이노시톨의 공유 결합, 가교 폐환화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스톨릴화, 산화, 페길화, 단백 분해성 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 및 아르기닐화와 같이 전달-RNA 매개된 아미노산의 단백질로의 첨가를 포함한다. 예를 들어, 문헌 ([Creighton, T. E., Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1993)]; [Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)])을 참조한다.
고상 화학 펩티드 합성법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 단편을 합성할 수 있다. 이러한 방법은 1960년대 초반부터 당업계에 공지되었으며(문헌 [Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154, 1963]) (또한, 문헌 [Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, I11., pp. 11-12)] 참조), 최근에는 시판되는 실험실용 펩티드 디자인 및 합성 키트(Cambridge Research Biochemicals)에 사용되어 왔다. 이러한 시판되는 실험실용 키트는 일반적으로 문헌 [H. M., Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3998 (1984)]의 교시 내용을 이용하며, 전부가 단일 플레이트에 연결된 다수의 "막대" 또는 "핀"의 선단에서 펩티드를 합성한다. 이러한 시스템이 이용되는 경우, 막대 또는 핀의 플레이트를 거꾸로 뒤집어, 핀 또는 막대 선단에 적절한 아미노산을 부착 또는 고정하기 위한 용액을 함유하는 상응하는 웰 또는 저장소의 제2 플레이트에 삽입한다. 이러한 프로세스 단계를 반복하여, 즉 막대 및 핀의 선단을 거꾸로 뒤집어 적절한 용액에 삽입하는 단계를 반복하여, 아미노산을 원하는 펩티드로 만들 수 있다. 또한, 다수의 이용가능한 FMOC 펩티드 합성계를 사용할 수 있다. 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드의 모델 431 A™ 자동 펩티드 합성기를 사용하여 고체 지지체 상에서 폴리펩티드 또는 단편의 어셈블리를 실시할 수 있다. 이러한 장치는, 다른 공지 기법을 사용하여 커플링될 수 있는 일련의 단편을 합성하거나, 또는 직접 합성하여 본 발명의 펩티드에 쉽게 접근할 수 있게 한다.
한 측면에서, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이, 서열 번호 2에의 특정 변형을 포함하는 서열, 및 추가로 "실질적으로 동일한" 아미노산 서열, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해서 상이하며, 특히, 상기 치환은 분자의 활성 부위가 아닌 위치에서 일어나고, 단, 이 폴리펩티드는 그의 기능적 특성을 본질적으로 보유하고 있는 것인 서열을 가진다. 한 측면에서, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이, 서열 번호 2에의 특정 변형, 및 하나의 아미노산을 동일한 부류에 속하는 또 다른 아미노산으로 치환하는 보존적 아미노산 치환(예를 들어, 하나의 소수성 아미노산, 예를 들어, 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌을 다른 아미노산에 대해 치환하거나, 하나의 극성 아미노산을 다른 아미노산에 대해 치환하는 것, 예를 들어, 아르기닌을 리신에 대해, 글루탐산을 아스파르트산에 대해, 또는 글루타민을 아스파라긴에 대해 치환)을 포함하는 서열을 가진다. 한 측면에서, 하나 이상의 아미노산이 예를 들어, 본 발명의 피타제로부터 결실될 수 있으며, 그 결과, 이 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유의적으로 변성시키지 않으면서 상기 폴리펩티드의 구조가 변형될 수 있거나, 별법으로는 고의적으로 이 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유의적으로 변성시킬 수 있다. 예를 들어, 피타제의 생물학적 활성에 필요하거나, 또는 별법으로 필요하지 않은 아미노 또는 카르복실 말단 아미노산이 제거 및/또는 첨가될 수 있다. 본 발명의 변형된 폴리펩티드 서열은 임의의 다수 방법, 예를 들면, 변형된 폴리펩티드 서열을 피타제 기질과 접촉시키는 단계 및 변형된 폴리펩티드가 분석법에서 그의 특이적인 기질의 양을 감소시키는지 여부, 또는 기능성 피타제 폴리펩티드와 기질의 효소 반응에 따른 생체 생성물의 양을 증가시키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 의해, 피타제의 생물학적 활성에 대해 분석될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 논의(기술)한 바와 같이, 서열 번호 2와 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지며, 특정의 열거되어 있는 서열 변형들 중 하나를 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
이러한 본 발명의 아미노산 서열 변이체는 소정의 변이 성질, 즉, 이 변이체를 천연 발생 형태와 동떨어지게 만드는 특징, 예를 들어, 피타제 서열의 대립 형질 또는 종간 변이에 따른 특성을 특징으로 할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 변이체는 천연 발생 유사체와 동일한 정성적인 생물학적 활성을 나타낸다. 별법으로, 상기 변이체가 변형된 특징을 가진지 여부에 대하여 선별될 수 있다. 한 측면에서, 아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 위치 또는 부위가 예정되어 있는 경우, 돌연변이 자체는 예정되어 있을 필요가 없다. 예정되어 있을 필요가 없다. 예를 들어, 정해진 위치에서의 돌연변이를 최적으로 수행하기 위해서는, 표적 코돈이나 영역에서 무작위 돌연변이 유발법이 수행될 수 있는 것이며, 발현된 피타제 변이체는 원하는 활성을 최적으로 조합한 활성을 가진지 여부에 대하여 스크리닝될 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 공지의 서열을 가진 DNA내 소정 위치에 치환 돌연변이를 일으키는 기술은 주지되어 있으며, 그 예로서는 M13 프라이머 돌연변이 유발법 및 PCR 돌연변이 유발법이 있다. 돌연변이체를 스크리닝하는 방법은 예로서, 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 이노시톨 및 무기 포스페이트로의 전환을 촉진하는 것; 또는 피테이트(미오-이노시톨-헥사포스페이트)의 가수분해에 대한 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 대안적 측면에서, 아미노산 치환은 단일 잔기에서 일어날 수 있으며; 삽입은 약 1개 내지 20개의 아미노산에서 일어날 수 있는데, 다만, 더욱 큰 부분이 삽입될 수도 있다. 결실은 약 1개 내지 20개, 30개, 40개, 50개, 60개 또는 70개 또는 그 이상의 잔기 범위에서 일어날 수 있다. 최적의 특성을 가진 최종 유도체를 얻기 위해서는, 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 변화들은 분자가 최소한으로 변형된 소수의 아미노산에서 발생된다. 그러나, 더욱 큰 변화는 임의의 환경에서 허용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 생화학적 농축 또는 정제 방법을 통해 수득될 수 있다. 잠재적으로 상동성인 폴리펩티드 또는 단편의 서열은 단백 분해성 분해, 겔 전기영동 및/또는 미세서열 분석에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 변이체를 확인하기 위한 분석법이다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기 단편 또는 변이체가 본 발명의 폴리펩티드의 효소적 활성을 보유하고 있는지 여부를 제시하는 생화학적 반응을 촉진하는 데 사용될 수 있다.
단편 또는 변이체가 본 발명의 폴리펩티드의 효소적 활성을 보유하고 있는지 여부를 확인하기 위한 예시적인 분석법은 폴리펩티드 단편 또는 변이체가 기능을 할 수 있는 조건 하에서 이 폴리펩티드 단편 또는 변이체를 기질 분자와 접촉시키는 단계, 및 기질 수준의 감소 또는 폴리펩티드와 기질 사이의 반응을 통한 특정 반응 생성물 수준의 증가를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드를 피타제로서 사용하기 위한 공정을 제공한다.
본 발명은 변형된 신호 서열(이는 또한 신호 펩티드(SP: signal peptide)또는 리더 펩티드로도 지칭됨), 또는 이종성 신호 서열을 포함하거나, 포함하지 않는 피타제를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 변형된 또는 이종성 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD: catalytic domain)을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 도입된 변형된 또는 이종성 SP, 프리프로 도메인 및/또는 CD는 예를 들어, 키메라 단백질 중의 이종성 도메인으로서, 또는 화학적 결합제에 의해 첨가된 융합 단백질의 일부일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 효소는 벡터, 예를 들어, pPIC 시리즈 벡터(Invitrogen: I미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)에 이종성 SP 및/또는 프리프로를 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명의 폴리펩티드는 추가로 다른 피타제, 또는 비피타제 공급원으로부터 유래된 서열과 같은 이종성 서열, 또는 전체적으로 합성인 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 핵산은 내인성의 변형된 또는 이종성 신호 서열(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)에 대한 코딩 서열 및 이종성 서열(즉, 본 발명의 신호 서열(SP), 프리프로 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)과 자연적으로 결합하고 있지 않은 서열)을 포함한다. 이종성 서열은 3' 말단 종단부, 5' 말단 종단부, 및/또는 SP, 프리프로 도메인 및/또는 CD 코딩 서열의 양쪽 종단부 상에 존재할 수 있다.
"프리프로 " 도메인 서열 및 신호 서열을 확인하는 방법은 주지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2): 115-136]을 참조한다. 예를 들어, 프리프로 서열을 확인하기 위해서, 단백질은 세포외 공간으로부터 정제되고, N 말단 단백질 서열은 결정되어 가공되지 않은 형태의 것과 비교된다. 신호 서열을 인지하는 다양한 방법에 관하여는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하기 위한 신호 펩티드는 시그날P(SignalP)라고 불리는 방법에 의해 확인된다. 시그날P는 신호 펩티드 및 그의 절단 부위 모두를 인지하는 통합된 신경망을 사용한다; 문헌 [Nielsen (1997) "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites." Protein Engineering 10:1-6]을 참조한다.
본 발명은 폴리펩티드 골격 구조, 2차 또는 3차 구조, 예를 들어, 알파 나선 또는 베타 쉬트 구조가 변형된 피타제 효소를 제공한다. 한 측면에서, 전하 또는 소수성은 변형될 수 있다. 한 측면에서, 측쇄의 벌크가 변형된다. 기능 또는 면역원성 아이덴티티에 일어난 실질적인 변화는 덜 보존적인 치환부를 선택함으로써 일어나게 된다. 예를 들어, 변형이 일어난 구역에 존재하는 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어, 알파 나선 또는 베타 쉬트 구조; 활성 위치에 있을 수 있는 분자의 전하 또는 소수성 위치; 또는 측쇄에 더욱 많은 영향을 미치는 치환이 일어날 수 있다. 본 발명은 (a) 소수성 잔기, 예를 들어, 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들어, 루실, 이소루실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐에 대해(또는 ∼에 의해) 치환되는 경우; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 기타 잔기에 대해(또는 ∼에 의해) 치환되는 경우; (c) 양전기성을 띠는 측쇄를 가진 잔기, 예를 들어, 리실, 아르기닐 또는 히스티딜이 음전기성을 띠는 잔기, 예를 들어, 글루타밀 또는 아스파틸에 대해 (또는 ∼에 의해) 치환되는 경우; 또는 (d) 벌크한 측쇄를 가진 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 아미노산, 예를 들어, 글리신에 대해(또는 ∼에 의해) 치환될 경우의 본 발명에 따른 폴리펩티드에서의 치환을 제공한다. 변이체는 피타제의 특성이 필요에 따라 변형되도록 선택될 수 있지만, 이 변이체는 동일한 정성적인 생물학적 활성(즉, 피타제 효소 활성)을 나타낼 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제는 에피토프 또는 정제용 태그, 신호 서열 또는 다른 융합 서열 등을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제는 무작위 펩티드에 융합되어 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 본원에서, "융합된" 또는 "작동 가능하게 연결된"이란, 피타제 활성의 안정성이 파괴되는 것을 최소화하도록 무작위 펩티드 및 피타제 효소가 함께 연결되어 있음을 의미하는 것이다. 상기 융합 폴리펩티드(또는 이 융합 폴리펩티드를 코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드)는 추가의 성분, 예를 들어, 다수의 루프에 존재하는 다수의 펩티드를 포함할 수도 있다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제는 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, 이종성 SP, 당질 결합 모듈, 피타제 효소 촉매 도메인, 링커 및/또는 비피타제 촉매 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드이다. 본 발명은 생물학적으로 활성인 하이브리드 폴리펩티드(예를 들어, 하이브리드 피타제 효소)를 코딩할 수 있는, 키메라 폴리펩티드 생성 수단을 제공한다. 한 측면에서, 원래의 폴리뉴클레오티드는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명의 방법은 원래의 폴리뉴클레오티드 서열을 통합하여, 결과로 생성된 하이브리드 폴리뉴클레오티드가 생물학적으로 활성인 원래의 폴리펩티드로부터 유래된 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하도록 만드는, 세포 과정을 사용함으로써 신규의 하이브리드 폴리펩티드를 생산한다. 예를 들어, 원래의 폴리뉴클레오티드는 상이한 미생물로부터 유래된 특정 효소를 코딩할 수 있다. 하나의 유기체로부터 유래하는 제1 폴리뉴클레오티드 또는 그의 변이체에 의해 코딩되는 효소는 예를 들어, 특정 환경 조건, 예를 들어, 고염도하에서 효율적으로 작용할 수 있다. 상이한 유기체로부터 유래하는 제2 폴리뉴클레오티드 또는 그의 변이체에 의해 코딩되는 효소는 상이한 환경 조건, 예를 들어, 초고온하에서 효율적으로 작용할 수 있다. 상기 제1 및 제2 원래의 폴리뉴클레오티드로부터 유래하는 서열들을 함유하는 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 원래의 폴리뉴클레오티드들에 의해 코딩되는 두 가지 효소들의 특징을 모두 나타내는 효소를 코딩할 수 있다. 따라서, 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 효소는 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 각각의 효소가 공유하는 환경 조건, 예를 들어, 고염도 및 초고온 하에서 효율적으로 작용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법으로부터 생성된 하이브리드 폴리펩티드는 원래의 효소에서는 살펴볼 수 없는 특화된 효소 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 피타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 재조합 및/또는 환원적 재분류를 수행한 후, 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 생성된 하이브리드 폴리펩티드는, 원래의 효소 각각으로부터 유래하는 특화된 활성, 예를 들어, 히드롤라제, 히드롤라제, 펩티다제, 포스포릴라제 등과 같은 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 하이브리드 폴리펩티드는 원래의 모체 폴리펩티드와 하이브리드 폴리펩티드를 구별할 수 있는 화학적 작용, 예를 들어, 하이브리드 폴리펩티드가 작용을 하는 온도, pH 또는 염 농도에서 작용을 하는지 여부를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 방법으로부터 생성된 하이브리드 폴리펩티드는 원래의 효소에서는 살펴볼 수 없는 특화된 효소 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 피타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 재조합 및/또는 환원적 재분류를 수행한 후, 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 생성된 하이브리드 폴리펩티드는, 원래의 효소 각각으로부터 유래하는 특화된 히드롤라제 활성에 대해, 즉, 히드롤라제가 작용하는 결합 유형 및 히드롤라제가 작용을 하는 온도에 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 피타제는 원래의 피타제와 하이브리드 피타제를 구별할 수 있는 화학적 작용, 예를 들어, (a) 아미드 (펩티드 결합), 즉, 프로테아제; (b) 에스테르 결합, 즉, 에스터라제 및 리파제; (c) 아세탈, 즉, 글리코시다제, 및 예를 들어, 하이브리드 폴리펩티드가 작용을 하는 온도, pH 또는 염 농도에서 작용을 하는지 여부를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은
1) 작동 가능하게 연결되어 있는 적어도 제1 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결되어 있는 제2 폴리뉴클레오티드를 적합한 숙주 세포에 도입시키며, 여기서, 적어도 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 부분적인 서열 상동성을 가진 적어도 하나의 영역을 공유하는 것인 단계;
2) 서열의 재조직을 촉진하여 작동 가능하게 연결된 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에서 숙주 세포를 성장시키는 단계;
3) 하이브리드 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 하이브리드 폴리펩티드를 발현시키는 단계;
4) 증진된 생물학적 활성의 확인을 촉진하는 조건 하에서 하이브리드 폴리펩티드를 스크리닝하는 단계; 및
5) 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리시키는 단계에 의해, 생물학적으로 활성인 하이브리드 폴리펩티드를 생산하는 방법 및 증진된 활성에 대해 상기 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
각종 효소 활성에 대해 스크리닝하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 본 명세서 전역에 걸쳐 논의된다. 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 단리시킬 때 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 피타제 활성의 열 불활성화에 대해 증가된 내성을 나타내며, 장기간의 저장 기간 중에도 그들의 피타제 활성을 보유하는 안정화된 수성 액상 제제를 제조하는 방법(및 이 방법으로 제조된 생성물)을 제공한다. 상기 액상 제제는 안정화제로서 요소 및/또는 소르비톨과 글리세롤과 같은 폴리올의 첨가에 의해 안정화된다. 또한, 단위 동물을 위한 사료, 그의 제조 방법도 제공되는데, 이들은 상기한 바와 같이 안정화된 수성 액상 제제를 사용함으로써 이루어진다. 상기 방법에 대한 더 자세한 설명은 공개 문헌을 통해 확인할 수 있으며/있거나, 당업자에게 공지되어 있다. 비제한적인 특정 예에서, 공개적으로 이용할 수 있는 참조문헌들이 본 출원의 본 발명의 분자를 교시하고 있지 않음에도 불구하고, 이렇게 공개적으로 이용할 수 있는 문헌으로는 EP 0626010(WO 9316175 A1)(Barendse et al.)을 포함한다.
항체 및 항체 기반 스크리닝법
본 발명은 본 발명의 피타제에 특이적으로 결합하는 단리된, 합성 또는 재조합 항체를 제공한다. 이들 항체는 본 발명의 피타제 또는 관련 폴리펩티드를 단리, 확인 또는 정량하는 데 사용될 수 있다. 이들 항체는 본 발명의 효소 활성을 억제시키는 데 사용될 수 있다. 이들 항체는 본 발명의 폴리펩티드들과 관련된 폴리펩티드, 예를 들어, 관련 피타제 효소를 단리시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들 또는 그의 단편으로부터 유래하거나, 이를 모델링하거나 또는 실질적으로 이것에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드로서, 항원이나 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)]; [Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273]; [Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97])을 참조한다). 항체라는 용어는 항원에 결합하는 능력을 가진 항원 결합부, 즉, "항원 결합 부위"(예를 들어, 단편, 서브서열, 상보성 결정 부위(CDR: complementarity determining region))를 포함하며, 그 예로서는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 2개의 Fab 단편이 힌지부에서 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)을 이루는 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 부위(CDR)를 포함한다. 단일 쇄 항체도 또한 "항체 "라는 용어에 포함된다.
이 항체를 면역침전, 염색(예를 들어, FACS), 면역친화도 칼럼 등에 사용할 수 있다. 필요에 따라, 면역화 후에 폴리펩티드 또는 핵산의 단리, 증폭 또는 클로닝, 및 폴리펩티드의 본 발명의 어레이로의 고정화로 특정 항원을 코딩하는 핵산 서열을 형성할 수 있다. 또는, 본 발명의 방법을 사용하여 변형시키고자 하는 세포가 생성하는 항체의 구조를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 친화도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또한, 항체를 제조 및 변형시키는 능력은 본 발명의 방법으로 세포내로 조작된 표현형일 수 있다.
면역화, 항체(폴리클로날 및 모노클로날)의 제조 및 단리 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 과학 문헌 및 특허 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌 ([Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991)]; [Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites")]; [Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986)]; [Kohler (1975) Nature 256: 495]; [Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York]) 참조. 동물을 이용하는 전통적인 생체내 방법 이외에, 예를 들어, 재조합 항체 결합 부위를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 시험관 내에서 항체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70]; [Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45])를 참조한다.
본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 형성하는 데 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 생성된 항체를 면역친화도 크로마토그래피 절차에 사용하여 폴리펩티드를 단리 또는 정제하거나, 또는 폴리펩티드가 생물학적 샘플 내에 존재하는지를 결정할 수 있다. 이러한 절차에서는, 추출물과 같은 단백질 제제 또는 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킨다.
면역친화도 절차에서는, 비드 또는 기타 칼럼 매트릭스와 같은 고체 지지체에 항체를 부착시킨다. 항체가 본 발명의 폴리펩티드 중 하나와 특이적으로 결합하는 조건 하에서 단백질 제제를 항체와 접촉시켜 둔다. 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거한 후에, 특이적으로 결합된 폴리펩티드를 용리시킨다.
생물학적 샘플 중의 단백질이 항체에 결합하는 능력은, 당업자들에게 친숙한 각종 임의의 절차를 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 형광성 제제, 효소 표지 또는 방사성동위원소와 같은 검출가능한 표지로 항체를 표지하여 결합을 측정할 수 있다. 또는, 항체의 샘플로의 결합은 검출가능한 표지를 가진 2차 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 구체적인 분석으로는 ELISA 분석, 샌드위치 분석, 방사성면역분석 및 웨스턴 블롯 등이 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해 형성된 폴리클로날 항체는, 폴리펩티드를 동물에게 직접 주사하거나, 또는 폴리펩티드를 동물(예를 들어, 인간 이외의 동물)에게 투여하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 항체는 폴리펩티드 자체에 결합할 것이다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드의 단편만을 코딩하는 서열이라도 전체 천연 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 형성하는 데 사용될 수 있다. 또한 이러한 항체를 사용하여 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다.
모노클로날 항체의 제조에 대해서는, 연속 세포주 배양으로 생성된 항체를 제공하는 임의의 기법을 이용할 수 있다. 예로는 하이브리드화 기법, 트리오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법 및 EBV-하이브리도마 기법 등이 있다(예를 들어, 문헌 [Cole (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)] 참조).
단일 가닥 항체의 생성에 대해 기술된 기법(예를 들어, 미국 특허 4,946,778호 참조)을 적용하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일 가닥 항체를 제조할 수 있다. 또는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 이들 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 인간화된 항체를 발현할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해 생성된 항체를 기타 유기체 및 샘플로부터 얻은 유사한 폴리펩티드에 대해 스크리닝하는 데 사용할 수 있다. 이러한 기법에서는, 유기체에서 유래한 폴리펩티드를 항체와 접촉시키고, 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 검출한다. 상기 기술한 임의의 절차를 이용하여 항체 결합을 검출할 수 있다.
키트
본 발명은 조성물, 예를 들어, 본 발명의 핵산, 발현 카세트, 벡터, 세포, 폴리펩티드(예를 들어, 피타제) 및/또는 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 이 키트는 또한 본 발명에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법 및 산업상 용도를 교시하는 지시 자료를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 효소 폴리펩티드 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 생성할 수 있다. 생성된 항체를 면역친화 크로마토그래피 절차에 사용하여 폴리펩티드를 단리 또는 정제하거나, 또는 폴리펩티드가 생물학적 샘플 내에 존재하는지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 절차에서는, 추출물과 같은 단백질 제제 또는 생물학적 샘플을 서열 번호 2의 폴리펩티드, 이와 실질적으로 동일한 서열 또는 상기 기술한 서열의 단편 중 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킨다.
면역친화도 절차에서는, 비드 또는 기타 칼럼 매트릭스와 같은 고체 지지체에 항체를 부착시킨다. 항체가 서열 번호 2의 폴리펩티드, 이와 실질적으로 동일한 서열 또는 그의 단편 중 하나와 특이적으로 결합하는 조건 하에서 단백질 제제를 항체와 접촉시켜 둔다. 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거한 후에, 특이적으로 결합된 폴리펩티드를 용리시킨다.
예를 들어, 효소 피타제 활성을 검출하기 위한 분석에서 본 발명의 효소에 대해 특징적인 생물학적 활성을 보유하는 지에 대해, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 서열, 그의 변이체 및 돌연변이체를 측정할 수 있다(문헌 [Food Chemicals Codex, 4th Ed.]). 이러한 효소는 절단형의 피타제와, 서열 번호 2에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 서열의 결실 및 삽입 변이체와 같은 변이체를 포함한다. 이들 피타제는 내열성을 가진다. 즉, 피타제는 70℃에서 30분간 처리 후에 약 90%, 75℃에서 30분간 처리 후에 약 50%의 잔여 특이적 활성을 가진다. 본 발명의 피타제의 내열성은, 사료를 고온에서 성형, 과립화 또는 펠릿화할 수 있기 때문에 사료 첨가제로서 효소를 사용하는 데 유리하다.
예를 들어, 한 측면에서 본 발명은 식용가능한 펠릿화된 효소 전달 매트릭스와, 예를 들어, 영양 보충제로서 동물에게 피타제를 전달하기 위한 사용 방법을 제공한다. 효소 전달 매트릭스는, 예를 들어, 동물의 소화액과 같은 수성 매체 중에서 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 그의 30개 이상의 인접 아미노산을 가진 것과 같은 피타제 효소를 쉽게 방출한다. 본 발명의 효소 전달 매트릭스는, 함유되어 있는 재조합 효소를 수성 매체 중에 쉽게 분산시키는, 오일을 제거한 곡물 배아, 건초, 알팔파, 티모시, 콩깍지, 해바라기씨 가루, 밀가루 등과 같은 성분으로부터 선택된 과립상 식용 담체로 제조한다. 사용시, 펠릿화된 식용 효소 전달 매트릭스를 동물에게 투여하여 피타제를 동물에게 전달한다. 적절한 곡물계 기질은 임의의 적절한 식용 곡물, 예를 들어, 밀, 옥수수, 대두, 사탕수수, 알팔파, 보리 등을 포함하거나 또는 이로부터 유도될 수 있다. 일례의 곡물계 기질은 옥수수계 기질이다. 기질은 동물 사료용으로 허가된 곡물의 임의의 적절한 부분, 예를 들어, 곡물 배아, 예를 들어, 옥수수 배로부터 유도될 수 있으며, 이는 습식 또는 건식 분쇄 공정으로 얻을 수 있다. 곡물 배아는, 예를 들어, 압착에 의해 또는 헥산이나 기타 용매 추출에 의해 오일을 제거한 곡물 배아로부터 얻은 사용한 배아를 포함할 수 있다. 별법으로, 곡물 배아는 추출기로 추출된다. 즉 압착하여 오일을 제거한다.
본 발명의 효소 전달 매트릭스는 별개의 복수의 입자, 펠릿 또는 과립의 형태로 존재할 수 있다. "과립"은, 예를 들어, 펠릿화, 압출, 또는 매트릭스로부터 수분을 제거하기 위한 유사한 압착으로 압축 또는 압착된 입자를 의미한다. 이와 같은 입자의 압축 또는 압착은 입자의 입자내 응집을 촉진한다. 예를 들어, 곡물계 기질을 펠릿 분쇄기에서 펠릿화하여 과립을 제조할 수 있다. 이렇게 하여 제조된 펠릿은 동물 사료의 보조물로서 사용하기 적절한 과립 크기로 분쇄하거나 가루로 만든다. 매트릭스는 그 자체가 동물 사료에서의 사용이 허가된 것이므로, 동물 사료에서 효소를 전달하기 위한 희석제로서 사용할 수 있다.
효소 전달 매트릭스는 과립도가 약 4∼약 400 메쉬(USS), 또는 약 8∼약 80 메쉬, 또는 약 14∼약 20 메쉬 범위인 과립의 형태일 수 있다. 용매 추출로 곡물 배아가 사용되면, 펠릿화기에서 옥수수유와 같은 윤활제의 사용이 필요할 수 있지만, 일반적으로 배가 축출기로 추출되는 경우에 윤활제는 필요하지 않다. 본 발명의 기타 측면에서, 예를 들어, 곡물계 기질을 다이를 통해 압출하고 압출물을 적절한 과립도로 분쇄하는 것과 같은 다른 압착 또는 압축 공정으로 매트릭스를 제조한다.
효소 전달 매트릭스는 매트릭스 과립의 응집성을 향상시기키 위한 응집제로서 다당류 성분을 더 포함할 수 있다. 응집제는 매트릭스 과립 내의 곡물 단백질 간의 결합을 증가시키는 추가의 히드록실 결합을 제공하는 것으로 생각된다. 또한, 추가의 히드록실기는 단백질의 전분에 대한 수소 결합과 단백질의 기타 단백질에 대한 수소 결합을 증가시켜 기능하는 것으로 생각된다. 응집제는 효소 전달 매트릭스의 과립의 응집성을 향상시키는 데 적절한 임의의 양으로 존재할 수 있다. 적절한 응집제는 하나 이상의 덱스트린, 말토덱스트린, 전분, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀가루, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 등을 포함한다. 예를 들어, 매트릭스(효소는 포함하지 않음)에서의 곡물 배아 및 응집제의 비율은 78% 옥수수 배 분말 및 20 중량% 옥수수 전분이다.
본 발명의 효소 방출 매트릭스는 생체분해성 물질로 만들어지기 때문에, 예를 들어, 곰팡이에 의해서 매트릭스가 변질될 수 있다. 이러한 곰팡이 형성을 방지하거나 또는 억제하기 위해서, 매트릭스는 효소 방출 매트릭스에 곰팡이가 생기는 것을 억제하는 데 충분한 양으로 존재하는 프로피오네이트염과 같은 곰팡이 억제제를 포함하여, 냉장을 필요로 하지 않는 안정한 제제로 전달 매트릭스를 제공할 수 있다.
한 측면에서 본 발명의 효소 전달 매트릭스 및 방법에 포함된 피타제 효소는, 고온 및/또는 수증기를 사용하여 펠릿화된 효소 전달 매트릭스를 제조하는 제조 과정에서 피타제의 불활성화에 대한 내성이 있도록, 본 명세서에 개시된 바와 같이 내열성 피타제이다. 본 발명의 효소 전달 매트릭스를 함유하는 사료의 소화 과정에서, 수성 소화액은 활성 효소를 방출시킬 것이다. 다른 종류의 내열성 효소 및 내열성인 영양 보충제를, 임의의 종류의 수성 조건 하에 방출하기 위한 전달 매트릭스 중에 혼입할 수 있다.
다양한 상이한 목적으로, 예를 들어, 동물 사료에 향료나 영양 보충제를 첨가하기 위해서, 또는 동물 사료 보충제 및 효소가 위장 조건 하에서 방출되는 것을 지연시키기 위해서 본 발명의 효소 매트릭스 입자에 코팅을 도포할 수 있다. 또는, 예를 들어, 매트릭스 입자로부터의 효소의 방출을 늦추거나 또는 효소가 방출되는 조건을 제어하는 것이 바람직한 경우에는, 기능적 목적을 달성하기 위해서 코팅을 도포할 수 있다. 코팅 물질의 조성은, 감수성인 제제(예를 들어, 열, 산 또는 염기, 효소 또는 기타 화학물질)에 의해 선택적으로 분해되게 하는 것일 수 있다. 별법으로, 상이한 분해제에 감수성인 2종 이상의 코팅을 매트릭스 입자에 연속적으로 도포할 수 있다.
본 발명은 또한 효소 방출 매트릭스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 이 방법은 효소 방출 매트릭스로서 사용하기 적절한 입도를 가진 곡물계 기질의 분리된 복수의 입자를 제공하는 것을 포함하며, 상기 입자는 본 발명의 피타제 효소를 포함한다. 이 방법은 효소 방출 매트릭스의 입자를 과립으로 압착 또는 압축하는 것을 포함할 수 있으며, 이것은 펠릿화로 가능하다. 곰팡이 억제제 및 응집제를 사용하는 경우에는, 적절한 시기에 첨가할 수 있으며, 곡물계 기질의 펠릿화 이전에 원하는 비율로 곡물계 기질과 혼합할 수 있다. 펠릿 분쇄 사료 중 수분 함량은 완성 제품 중의 수분 함량에 대해서 상기 기술한 바와 같은 범위일 수 있거나, 약 14% 내지 15%, 또는 약 10% 내지 20%일 수 있다. 수성 효소 제제 형태의 공급 원료에 수분을 첨가하여 공급원료가 이러한 수분 함량을 갖도록 할 수 있다. 펠릿 분쇄기의 온도를 수증기를 사용하여 약 82℃로 할 수 있다. 펠릿 분쇄기는 공급원료에 충분히 작용하여 펠릿을 제공하는 임의의 조건 하에 조작할 수 있다. 펠릿화 공정 그 자체는 효소 함유 조성물로부터 수분을 제거하는 비용 측면에서 효과적인 공정이다.
한 측면에서, 펠릿 분쇄기를 82℃에서 100 lb/분의 압력 하에 1/8 인치 ×2 인치 다이를 이용하여 조작하여 펠릿을 제공한 다음, 펠릿 분쇄 제분기에서 가루로 만들어 8 메쉬 스크린을 통과할 수 있지만 20 메쉬 스크린에는 보유되는 입도를 가진 다수의 분리된 입자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 내열성 피타제는 최적 온도가 높으며, 높은 열 저항성 또는 내열성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 피타제는 일반적으로 최적 이상이라고 생각되는 온도에서 효소 반응을 실시할 수 있다. 본 발명의 피타제는 고온에 노출된 후에 효소 반응을 실시할 수 있다(내열성은, 고온이 효소 활성을 불활성화시키거나 또는 감소시킬 수 있다고 하더라고, 야생형 피타제가 이전에 고온에 노출된 후에도 활성인 온도에서 효소 활성을 보유하는 능력임, 또한 상기 내열성의 정의 참조). 본 발명에 따른 피타제를 코딩하는 유전자는 서열 번호 2의 피타제와 다른 특성(최적 pH, 최적 온도, 내열성, 용매에 대한 안정성, 특이적 활성, 기질에 대한 친화도, 분비 능력, 번역 속도, 전사 제어 등의 측면에서)을 가진 피타제의 제조(예를 들어, 본 명세서에 개시된 GSSM 및/또는 TMCA 기술을 사용함)에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 본 명세서에 개시된 방법으로 제조한 변이체 피타제의 스크리닝에 사용하여 소정의 활성, 예를 들어, 개선되거나 변형된 열안정성 또는 내열성을 가진 것들을 결정할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,830,732호는 피타제의 내열성을 결정하는 스크리닝 분석을 개시한다.
이러한 스크리닝 분석의 시험관내 일례는 피타제 활성의 검출을 위한 하기 분석이다: 효소 제제 150 ㎕를 1 mM CaCl2가 보충된 100 mM 트리스 HCl 완충액, pH 7.5 중에서 2 mM 나트륨 피테이트 600 ㎕와 30분 동안 37℃에서 항온처리하여 피타제 활성을 측정할 수 있다. 항온처리 후에 5% 트리클로로아세트산 750 ㎕를 첨가하여 반응을 중단한다. 착색 시약(5.5% 황산 중 1.5% 몰리브덴산암모늄 4부피 및 2.7% 황산제1철 1부피; Shimizu, 1992) 1500 ㎕를 첨가한 후에 700 nm에서 포스페이트 표준물에 대해 방출된 포스페이트를 분광광도계로 측정하였다. 효소 활성 1 단위는 분석 조건 하에 1분당 1 μmol Pi를 유리시키는 데 필요한 효소의 양으로서 정의된다. 특이적 활성은 단백질 1 ㎎당 효소 활성 단위로 표시할 수 있다. 본 발명의 효소는 피테이트의 유리 포스페이트 및 이노시톨로의 가수분해에 대한 효소 활성을 가진다.
한 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 신규 피타제 분자(예를 들어, 서열 번호 2의 특이적인 변형을 가진 단백질) 중 하나 이상과 피테이트를 접촉시키는 것을 포함하는 피테이트의 가수분해 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 피트산 복합체로부터 무기질이 방출되면서 피테이트가 이노시톨 및 유리 포스페이트로 가수분해되는 것을 촉진하는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 효소의 분해 유효량과 피테이트 기질을 접촉시키는 것을 포함한다. 용어 "분해 유효량"이란 효소와 접촉하지 않은 피테이트와 비교하여 피테이트의 50% 이상을 분해시키는 데 필요한 효소의 양을 의미한다. 피테이트의 80%가 분해될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피테이트 중 포스포-모노-에스테르 결합을 가수분해하는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 피타제 분자의 유효량을 투여하여 이노시톨 및 유리 포스페이트를 산출하는 것을 포함한다. 한 측면에서, "유효량"이란 효소와 접촉하지 않은 피테이트와 비교하여 포스포-모노-에스테르 결합의 50% 이상을 가수분해하는 데 필요한 효소의 양을 의미한다. 한 측면에서, 결합의 80% 이상이 가수분해된다.
특정 측면에서, 필요에 따라 피타제 분자를 다른 시약, 예를 들어, 다른 촉매와 병용하여 피테이트 분자 및/또는 기질 공급원(들)의 다른 분자의 화학 변화(예를 들어, 가수분해)를 실시할 수 있다. 이 측면에 따르면, 피테이트 분자 및 추가의 시약(들)은 서로 억제하지 않을 것이다. 피타제 분자 및 추가의 시약(들)은 전체로서 부가 효과를 나타낼 수 있다. 또는, 피타제 분자 및 추가의 시약(들)은 전체로서 상승 효과를 나타낼 수 있다.
기질 피테이트 분자의 관련 공급원은 식량, 잠재적인 식량, 식량의 부산물(시험관내 부산물 및 생체내 부산물, 예를 들어, 생체외 반응 산물 및 동물 배설 산물), 식량 전구체 및 피테이트의 임의의 다른 물질 공급원을 포함한다.
비제한적인 측면에서, 유기체는 재조합 피타제를 소비할 수 있으며, 재조합 피타제는 소비시 활성을 보유한다. 또 다른 예에서, 트랜스제닉법을 사용하여, 예를 들어, 제어 방식으로 재조합 피타제를 발현할 수 있다(이 방법은 시간 특이적 및 조직 특이적인 방식으로 트랜스제닉 분자의 발현을 제어하는 데 이용할 수 있다).
한 측면에서, 소비시 공급원 물질(예를 들어, 트랜스제닉 식물원 또는 재조합 원핵 세포 숙주) 중의 피타제 활성이 증가될 수 있다. 이러한 활성 증가는, 예를 들어, 전구-형태의 전구체 피타제 분자를 유의적으로 활성이 높은 더욱 성숙한 형태의 효소로 전환시킬 때 발생할 수 있으며, 이러한 전환은, 예를 들어, 피타제 공급원의 섭취 및 소화로부터 생길 수 있다. 피테이트 기질의 가수분해는, 피타제를 피테이트와 접촉시키면 임의의 시점에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 가수분해는 기질 또는 효소나 또는 양자의 섭취 전 또는 섭취 후 또는 섭취 전후에 일어날 수 있다. 또한, 피테이트 기질을 피타제 외에, 공급원 물질로부터 직접 또는 정제한 후에 적용할 수 있는 하나 이상의 추가의 시약(예를 들어, 또 다른 효소)과 접촉시킬 수 있다는 것도 이해할 것이다.
피타제 공급원 물질(들)을, 예를 들어, 피타제 공급원(들) 및 피테이트 공급원(들)의 시험관내 또는 생체내 분쇄 또는 저작시 피테이트 공급원 물질(들)과 직접 접촉시킬 수 있음을 알 것이다. 별법으로, 피타제 효소를 공급원 물질(들)로부터 정제하거나, 또는 피테이트 기질을 공급원 물질(들)로부터 정제하거나, 또는 피타제 효소 및 피테이트 기질 모두를 공급원 물질(들)로부터 정제한 후에 피타제 효소를 피테이트 기질과 접촉시킬 수 있다. 효소(들) 또는 기질(들) 또는 쌍방을 포함하는 정제 및 비정제된 시약의 조합물을 사용할 수 있다.
하나 이상의 공급원 물질을 피타제 활성원으로서 사용할 수 있다는 것을 알 것이다. 이것은 공급원 물질(들)로부터 적기에 시약(들)을 방출하기 위한 한 방법으로 유용한 데, 이 방법에서는, 예를 들어, 섭취된 공급원 물질이 생체내에서 분해되거나 또는 공급원 물질이 시험관내 적용으로 처리됨에 따라 공급원 물질 유래의 상이한 시약으로부터의 방출이 차등적으로 일어난다. 피타제 활성을 가진 하나 이상의 공급원 물질을 사용하는 것은, 예를 들어, 상이한 프로세싱 적용 단계에서 일정한 범위의 pH 값, 온도, 염도 및 시간 간격과 같은 직면할 수 있는 일정 범위의 조건 및 변동 하에 피타제 활성을 얻는 데 도움이 된다. 피타제 및/또는 피테이트 및/또는 기타 물질의 하나 이상의 형태 또는 이성체에 의해 예시되는 바와 같이 상이한 시약을 얻기 위해서 상이한 공급원 물질을 사용하는 것은 도움이 된다.
단일 공급원 물질, 예를 들어, 트랜스제닉 식물 종(또는 그의 식물 부분)이 피타제 및 피테이트의 공급원 물질일 수 있으며; 효소 및 기질은 상기 단일 공급원내에서 차등적으로 구획화될 수 있으며(예를 들어, 분비되거나, 분비되지 않음), 상이한 식물 부분 또는 기관 또는 조직내에서 또는 동일한 식물 세포 부분 또는 기관 또는 조직내의 세포하 구획에서 차등 발현되고/거나 차등적으로 존재할 수 있음을 알 것이다. 내부에 함유된 피타제 분자를 정제하는 것은 하나 이상의 바람직한 식물 일부 또는 기관 또는 조직이나 세포하 구획을 단리시키고/거나 추가의 처리를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 증가량의 효소를 함유하는 종자를 사용하여 생체내 및/또는 시험관내 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 이 방법은 트랜스제닉된 비야생형 종자를, 예를 들어, 분쇄된 형태로 반응 혼합물에 첨가하는 단계 및 종자 내의 효소가 반응 속도를 증가시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은, 종자를 반응 혼합물에 직접 첨가하여 효소의 추출 및 정제와 관련된 고 비용의 귀찮은 공정에 대한 해소책을 제공한다. 충분한 효소 공급이 결여된 유기체에게 증가된 효소량을 포함하는 하나 이상의 식물 종(예를 들어, 트랜스제닉 식물 종)으로부터 얻은 종자의 형태로 효소를 투여하는 처리 방법을 제공한다. 이 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다. 비제한적인 구체적인 예로서, 공개적으로 입수가능한 문헌은 미국 특허 5,543,576호(Van Ooijen et al.) 및 미국 특허 제5,714,474호(Van Ooijen et al.)을 포함하지만, 이들 참조 문헌 중에는 본 발명의 분자가 교시되어 있지 않고, 그 대신 진균 피타제의 사용이 교시되어 있다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제 분자는 재조합 소화계 생명형(또는 미생물 또는 식물상)을 형성하고, 상기 재조합 소화계 생명형을 동물에게 투여하는 데 유용하다. 경우에 따라서, 단독으로 또는 다른 효소 및/또는 소화계에서 효소 활성을 제공할 수 있는 다른 생명형과 병용하여 투여할 수 있으며, 상기 다른 효소 및 생명형은 재조합체일 수도 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들어, 크실란분해(xylanolytic) 박테리아와 함께 투여할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 이산화황을 함유하는 온수 중에서 옥수수 또는 사탕수수 커넬을, 예를 들어, 옥수수 또는 사탕수수 내에 존재하는 피틴이 실질적으로 분해되는 양으로 존재하는 하나 이상의 피틴 분해 효소를 포함하는 효소 제제의 존재 하에 침지하는 방법을 제공한다. 효소 제제는 피타제 및/또는 산 포스파타제와 경우에 따라 기타 식물 물질 분해 효소를 포함할 수 있다. 침지 시간은 12∼18시간일 수 있다. 침지 과정 중에 중간 분쇄 단계를 도입하여, 침지 시간을 단축할 수 있다. 한 측면에서, 피타제 및 산 포스파타제와 같은 하나 이상의 피틴 분해 효소를 포함하는 효소 제제의 존재 하에 이산화황을 함유하는 온수 중에 옥수수 또는 사탕수수 커넬을 침지하여 피트산 및 피트산의 염을 제거하거나 또는 상당히 감소시킨다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,914,029호(Caransa et al.) 및 EP 0321004호(Vaara et al.)와 같이, 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 빵 반죽에 피타제 분자를 첨가하는 것을 포함하는, 비점착성 및 탄성과 같은 바람직한 물성을 가진 빵 반죽과 특정 부피와 같은 양호한 품질의 빵 제품을 얻는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제 분자를 작업중인 빵 반죽 제제에 첨가한 다음, 성형하여 굽는다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 예를 들어, JP 03076529(Hara et al.)와 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 개량된 대두 식량을 제조하는 방법을 제공한다. 대두를 본 발명의 피타제 분자와 혼합하여 대두로부터 피트산을 제거함으로써, 소비 유기체에 필수적인 미량 영양소를 공급한다는 면과 단백질의 소화성 면에서 개량된 대두 식량을 제조할 수 있다. 한 측면에서, 대두유의 제조시 본 발명의 피타제 분자를 대두에 첨가하거나 또는 접촉시켜 피트산 함량을 감소시킨다. 비제한적인 예로서, 가열하면서 대두유를 효소와 함께 교반하거나, 또는 고정된 효소를 사용하여 교반 용기 중에 혼합형 반응을 실시함으로써 적용 공정을 가속화시킬 수 있다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 예를 들어, JP 59166049(Kamikubo et al.)와 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 유체 형태의 동물 사료 또는 물을 음용하기 위한 혼합 제품의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 미네랄 혼합물 및 비타민 혼합물과 본 발명의 신규 피타제 분자를 사용하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 사료 중에 피틴 결합된 포스페이트를 최적으로 이용하면서, 동시에 중요한 미네랄/비타민 성분의 침전 및 파괴 위험 없이 소비 유기체를 위한 필수 영양소를 옳바른 용량으로 구성한 혼합물을 얻을 수 있다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 예를 들어, EP 0772978(Bendixen et al.)과 같이, 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
본 발명의 피타제 분자는 곰팡이의 사용 및/또는 곡물 및/또는 기타 식물을 주 성분으로 하는 기타 알콜성 및 비알콜성 음용 식량(즉, 음료)을 제조하는 데 사용할 수 있다. 이들 음용 식량으로는 리큐르, 와인, 혼합 알콜 음료(예를 들어, 와인 쿨러, 아이리쉬 커피와 같은 다른 알콜성 커피 등), 맥주, 맥아 음료(near beer), 쥬스, 추출물, 균질물 및 퓨레 등이 있다. 한 측면에서, 본 발명에 개시된 피타제 분자를 사용하여 이러한 음용성 식량 제조에 적절한 곰팡이 및/또는 곡물 및/또는 기타 식물의 트랜스제닉 형태를 형성할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명에 개시된 피타제 분자는 음용성 식량의 제조 공정 및/또는 최종 내용물의 추가의 성분으로서 사용된다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 이노시톨의 함량이 증가되고 피틴의 함량이 감소된 정제 청주(refined sake)를 얻는 수단을 제공한다. 청주는, 직접적인 효과 및/또는 심인성 효과를 통해 간질환, 아테롬성경화증 및 기타 질병에 대한 예방 작용을 나타낼 수 있다. 한 측면에서, 청주는 원료로서 피타제 활성이 높은 쌀 코지(Koji) 곰팡이를 증식시켜 쌀 코지로부터 제조한다. 본 발명의 피타제 분자는 활성이 증가된 유용한 곰팡이(예를 들어, 트랜스제닉 곰팡이)를 제조하는 데 사용되고 및/또는 외부적으로 첨가되어 코지 곰팡이의 효과를 증대시킬 수 있다. 끓는 밥에 균주를 첨가하면, 통상의 절차로 코지가 생성된다. 일례에서, 제조된 코지를 사용하고, 전체 쌀은 2 단계로 제조하며, 15℃의 일정한 청주 온도에서 청주를 제조하여 피틴의 양은 감소되고 이노시톨의 양은 증가된 목적하는 정제 청주를 얻는다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 예를 들어, JP 06153896(Soga et al.) 및 JP 06070749(Soga et al.)와 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 저 비용으로 위액 또는 장액에 의해 소화되지 않고 섭취한 칼슘을 비롯한 미네랄의 흡수를 촉진할 수 있는 흡수촉진제(absorbefacient)를 얻는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 미네랄 흡수촉진제는 활성 성분으로서 피트산의 부분 가수분해물을 함유한다. 피트산의 부분 가수분해물은, 본 발명의 신규 피타제 분자를 사용하여 피트산 또는 그의 염을 가수분해하여 생성할 수 있다. 피타제 분자를 이용한 치료는 단독 치료 및/또는 (최종 효과를 억제 또는 증대시키기 위한) 병행 치료로 실시될 수 있으며, 그 다음 모든 포스페이트 라디칼을 유리시키지 않는 범위 내에서 가수분해를 억제한다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 예를 들어, JP 04270296(Hoshino)과 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 부가적인, 또는 바람직하게는 상승적인 피테이트 가수분해 활성을 가진 효소 조성물을 제조하는 방법(및 이로부터 얻은 생성물)을 제공하며, 상기 효소 조성물은 본 발명의 신규한 피타제 분자와 병행 치료에 유용한 조성물을 얻기 위한 하나 이상의 추가의 시약을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 병행 치료는 상이한 위치 특이성을 가진 2 이상의 피타제, 즉 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 및 6-피타제의 임의의 조합물을 사용하여 실시할 수 있다. 상이한 위치 특이성의 피타제를 조합하면 부가 효과 또는 상승 효과가 얻어진다. 이러한 피타제 조합물을 포함하는 식품 및 사료 또는 식품 및 사료 첨가제와 같은 조성물은, 그 제법과 같이 본 발명에 포함된다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 예를 들어, W0 9830681(Ohmann et al.)과 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 병행 치료는, pH 2.5:5.0에서의 활성 프로필이 약 0.1:1.0 내지 10:1, 또는 약 0.5:1.0 내지 5:1, 또는 약 0.8:1.0 내지 3:1, 또는 약 0.8:1.0 내지 2:1의 낮은 비율로, pH 2.5에서 피테이트 가수분해 활성을 가진 산 포스파타제를 사용하여 실시할 수 있다. 효소 조성물은 열 처리를 통해 보다 높은 상승적 피테이트 가수분해 효율을 나타낼 수 있다. 효소 조성물은 피테이트 가수분해를 개선시키기 위한 식량(음용성 및 고형 식품, 사료 및 가축 먹이 제품)의 처리에 유용하다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명 또는 대체 프로토콜은 예를 들어, 진균(특히 아스퍼질러스 피타제의 사용을 교시하는 미국 특허 번호 제5,554,399호(Vanderbeke et al.) 및 미국 특허 번호 제5,443,979호(Vanderbeke et al.)과 같이, 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다당류에 작용하는 하나 이상의 추가의 효소와 함께 신규한 피테이트 작용 효소로 구성된 조성물을 제조하는 방법(및 이로부터 얻은 생성물)을 제공한다. 이러한 다당류는 아라비난, 프럭탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락투로난, 글루칸, 만난, 크실란, 레반, 푸코이단, 카라기난, 갈락토카롤로스, 펙틴, 펙트산, 아밀로스, 풀루란, 글리코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 덱스트란, 푸스툴란, 키틴, 아가로스, 케라탄, 콘드로이틴, 더마탄, 히알루론산, 알긴산, 및 에리토르스, 트레오스, 리보스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 알로스, 알토스, 글루코스, 만노스, 글루코스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 에리트룰로스, 리불로스, 크실룰로스, 프시코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스, 글루쿠론산, 글루콘산, 글루카르산, 갈락투론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민 및 뉴라민산으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 알도스, 케토스, 산 또는 아민을 포함하는 다당류로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 신규 피타제 분자, 셀룰라제(크실라나제를 포함할 수 있음), 경우에 따라 프로테아제, 그리고 경우에 따라 하나 이상의 추가의 시약을 포함하는 상승적 피테이트 가수분해 활성을 가진 조성물을 제조하는 방법(및 이로부터 얻은 생성물)을 제공한다. 대안적인 측면에서, 이러한 병행 처리는 식량, 목재 제품(예를 들어, 종이 제품)의 처리에, 그리고 세정 용액 및 고체로서 유용하다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제 분자는 셀룰로스 성분과 함께 사용하는 데 유용하다. 다수의 셀루로스분해 박테리아의 셀룰라제는 셀룰로좀이라 불리우는 별개의 복수 효소 복합체로 조직된다는 것이 알려져 있다. 셀룰로좀의 복수의 서브유닛은 다수의 작용 도메인으로 구성되며, 이들은 서로 또는 셀룰로스 기질과 상호작용한다. 이들 서브유닛 중 하나는 특징적인 새로운 종류의 비촉매적 스캐폴딩 폴리펩티드를 포함하여, 각종 셀룰라제 및 크실라제 서브유닛을 응집성 복합체로 선택적으로 통합시킨다. 셀룰로좀 도메인의 키메라 작제물 및 셀룰로좀 하이브리드를 이해하여 적용하면 셀룰로스 생물량을 더욱 양호하게 사용할 수 있으며, 조사, 의학 및 산업에서의 광범위한 신규 용도를 제공할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제는 펄프와 종이 산업에 전통적으로 사용된 환경적으로 유해한 화학물질의 사용 감소가 바람직한 생물펄핑 및 생물표백 분야에서 - 단독 처리 또는 병행 처리에- 유용하다. 폐수 처리는, 생물학적 효소가 색상 제거뿐만 아니라 잠재적으로 유독한 물질의 유용한 생물생성물로의 생물전환에 효과적인 것으로 밝혀진 또 다른 광범위한 적용 분야를 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제는 유기체의 소화계의 치료에 있어서- 단독 치료 또는 병행 치료로- 하나 이상의 효소 활성을 제공할 수 있는 생명형을 형성하는 데 유용하다. 치료하고자 하는 구체적인 관련 유기체는 반추 동물이 아닌 유기체를 포함하지만, 반추 동물 유기체가 이러한 치료로 이익을 얻을 수 있다. 특히, 이러한 방법은 단독으로 또는 다른 생물학적 분자(예를 들어, 크실라나제)와 함께 실시되어 다수의 생물학적 분자를 발현하는 재조합 숙주를 생성할 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 본 발명의 피타제 분자 및/또는 본 발명의 피타제 분자를 발현하는 재조합 숙주는, 단독으로 또는 다른 생물학적 분자, 및/또는 소화계에서 효소 활성을 제공할 수 있는 생명형과 함께 투여할 수 있으며, 상기 다른 효소 및 생명형은 재조합체일 수도 그렇지 않을 수도 있음을 알 것이다. 예를 들어, 크실란분해 박테리아와 함께 투여할 수 있다.
예를 들어, 많은 유기체는 피테이트 외에도 헤미셀룰로스를 적절히 소화할 수 없다. 헤미셀룰로스 또는 크실란은 식물 물질의 주성분(35%)이다. 반추 동물의 경우에는 식이 크실란의 약 50%가 분해되지만, 반추 동물 이외의 동물과 인간의 하부 위장에서는 소량의 크실란만이 분해된다. 루멘에서 주요 크실란분해 종은 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens) 및 박테리오이드 루미니콜라(Bacteroides ruminicola)이다. 인간 결장에서, 박테리오이드 오바터스(Bacteroides ovatus) 및 박테리오이드 프라길리스(Bacteroides fragilis) 아종 "a" 는 주요 크실란분해 박테리아이다. 크실란은 화학적 복합체이며, 이를 분해하기 위해서는 복수의 효소가 필요하다. 위장 박테리아에 의한 이들 효소의 발현은 종마다 크게 다르다. 부티리비브리오 피브리솔벤스는 세포외 크실라나제를 만들지만, 박테리오이드 종은 세포 결합된 크실라나제 활성을 가진다. 위장 박테리아로부터 유래한 크실란분해 효소의 생화학적 특성은 완전히 규명되지 않았다. 크실로시다제 유전자가 B. 피브로솔벤스 113으로부터 클로닝되었다. B.피브리솔벤스 49로부터 클로닝된 크실라나제 유전자를 사용한 DNA 하이브리드화로 얻은 데이타 결과는, 이 유전자가 다른 B.피브리솔벤스 종에 존재할 수 있음을 시사한다. Bact.루미니콜라로부터의 클로닝된 크실라나제를 Bact. 프라길리스 및 Bact.유니포미스로 전달하여 고도로 발현시켰다. Bact. 오바터스로부터 얻은 아라비노시다제 및 크실로시다제 유전자를 클로닝하였으며, 이들 활성은 단일, 이작용성의 신규 효소에 의해 촉진되는 것으로 보인다.
한 측면에서, 본 발명의 피타제는는 1) 적절한 숙주(예를 들어, Bact. 프라길리스 또는 Bact. 유니포미스)로 전달하고; 2) 생성된 재조합 숙주에서 적절한 발현을 달성하며; 3) 재조합 숙주를 유기체에 투여하여 피테이트를 분해하는 처리된 유기체의 능력을 향상시키는 데 유용하다. 유전 및 생화학 분야의 계속되는 연구 결과 위장 레벨에서의 소화 조작을 위한 지식 및 식견을 얻었으며 결장의 섬유 소화에 대한 이해를 높였다.
이 방법과 관련된 추가의 상세한 설명은 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 본 발명은 미국 특허 번호 제5,624,678호(Bedford et al.), 미국 특허 번호 제5,683,911호(Bodie et al.), 미국 특허 번호 제5,720,971호(Beauchemin et al.), 미국 특허 번호 제5,759,840호(Sung et al.), 미국 특허 번호 제5,770,012호(Cooper), 미국 특허 번호 제5,786,316호(Baeck et al.), 미국 특허 번호 제5,817,500호(Hansen et al.)에 기술되어 있는 것과 같은 방법을 도입할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 피타제 분자를 개시된 시약(들)에 첨가하여 추가의 피타제 활성을 가진 제제를 얻을 수 있음을 교시하고 있다. 한 측면에서, 시약(들) 및 추가의 피타제 분자는 서로 억제하지 않는다. 한 측면에서, 시약(들) 및 추가의 피타제 분자는 전체적인 부가 효과를 가질 수 있다. 한 측면에서, 시약(들) 및 추가의 피타제 분자는 전체적인 상승 효과를 나타낼 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 히드록실화된 비타민 D3 유도체를 포함하는 사료 조성물을 동물에게 투여하여 동물, 특히 가금류에서 정강 연골형성이상을 치료 및 예방하고 피테이트 인 이용을 향상시키기 위한 방법(및 이로부터 얻은 생성물)을 제공한다. 비타민 D3 유도체는 피테이트 인 이용의 향상을 위해 인과 칼슘을 낮은 농도로 함유하는 사료 형태로 동물에게 투여할 수 있다. 따라서, 비타민 D3 유도체는, 피테이트 인 이용을 추가로 향상시키기 위해서 본 발명의 신규한 피타제 분자와 함께 투여할 수 있다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명 또는 대체 프로토콜은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,516,525호(Edwards et al.) 및 미국 특허 번호 제5,366,736호(Edwards et al.), 미국 특허 번호 제5,316,770호(Edwards et al.)과 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 1) 쉽게 흡수되어 유기체의 체내에서 이노시톨의 형태로 이용되는 피틴을 포함하고; 2) 배설 물질 중 인의 양을 감소시킬 수 있으며; 3) 따라서 환경 오염을 개선하는 데 유용한 식량을 얻는 방법(및 이로부터 얻은 식량)을 제공한다. 상기 식량은 피틴 함유 곡물, 락트산 생산 미생물, 및 본 발명의 신규한 피타제 분자의 혼합물로 구성된다. 한 측면에서 상기 식량은, 피틴 함유 곡물(예를 들어, 쌀겨)을, 호산성을 갖고, 락트산을 생성하지만 부티르산은 생성하지 않으며, 병원성이 없는 효과적인 미생물군 및 피타제와 혼합하여 제조한다. 효과적인 미생물 군의 예로는, 예를 들어, 액티노마이시스(actinomyces) 군에 속하는 스트렙토마이시즈 종(Streptomyces sp .) (미국 모식균 배양 수집소 ATCC 3004) 및 락토바실러스(lactobacilli) 군에 속하는 락토바실러스 종(IFO)(IFO 3070) 등이 있다.
또한, 효과적인 미생물 군의 예시적인 첨가량은 곡물 물질을 기준으로 박테리아 체중에 대하여 0.2 wt.%이다. 한 측면에서, 피타제 첨가량은 곡물 물질 중 피틴을 기준으로 약 1∼2 wt.%이다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명 또는 대체 프로토콜은 예를 들어, JP 08205785(Akahori et al.)와 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 식물성 단백질의 용해도를 개선시키는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 식물성 단백질원 중 단백질을 가용화시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하나 이상의 피타제 효소의 유효량으로 식물성 단백질원을 처리하는 단계 및 하나 이상의 단백질분해 효소의 유효량으로 식물성 단백질원을 처리하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 피타제 및 하나 이상의 단백질분해 효소를 포함하는 동물 사료 첨가제를 제공한다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명 또는 대체 프로토콜은 예를 들어, EP 0756457(WO 9528850 A1)(Nielsen and Knap)과 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 2∼6의 pH 범위에서 식물성 단백질원 물질을 물에 분산시키는 단계 및 그 내부에 본 발명의 피타제 분자를 혼합하는 단계를 포함하는 식물 단백질 제제의 제조 방법을 제공한다. 가용성 단백질을 함유하는 산성 추출물을 분리하고 건조하여 소정의 특성을 가진 고체 단백질을 산출한다. 하나 이상의 프로테아제를 사용하여 단백질 특성을 개선시킬 수 있다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명 또는 대체 프로토콜은 예를 들어, 미국 특허 번호 제3,966,971호와 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 3가지 시약, 피타제, 사포닌 및 키토산을 혼합 비료에 첨가하여 토양 및/또는 혼합 비료 중 불활성 인을 활성화시키고, 질소 화합물의 이용율을 높이며, 병원성 곰팡이의 증식을 억제하는 방법(및 이로부터 얻은 생성물)을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 방법은 1) 배지 중에 피타제 함유 미생물(예를 들어, 본 발명의 신규한 피타제 분자를 과다발현하는 재조합 숙주)을, 예를 들어, 100 ㎖ 배지/100 kg 습식 혼합 비료로 첨가하고; 2) 별법으로, 예를 들어, 밀겨와 같은 피타제 함유 식물원을, 예를 들어, 0.2∼1 kg/100 kg 습식 혼합 비료로 첨가하고; 3) 예를 들어, 토탄, 쑥 및 유카 식물과 같은 사포닌 함유 공급원을, 예를 들어, 0.5∼3.0 g/kg으로 첨가하고; 4) 예를 들어, 분쇄된 새우, 게 껍질과 같은 키토산 함유 물질을, 예를 들어, 100∼300 g/kg 습식 혼합 비료에 첨가하여 혼합 비료를 처리하는 것을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 재조합 공급원인 3가지 시약, 피타제, 사포닌 및 키토산을 사용한다. 이러한 방법과 관련된 추가의 상세한 설명 또는 대체 프로토콜은 예를 들어, JP 07277865(Toya Taisuke)와 같이 공개 문헌에 개시되어 있고/거나, 당업자들에게 공지되어 있다.
일부 경우에서, 본 발명의 피타제 서열이 국소적으로, 예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형에서 전달 및 발현되는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 동물의 위장 내의 소화 효소 또는 피타제의 국소 발현은, 예를 들어, 각각 인 및 피테이트의 소화 및 섭취를 보조할 것이다. 핵산 서열을 타액선, 조직 및 세포 및/또는 위장의 상피 세포 내막에 직접 전달할 수 있다. 이러한 전달 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 전기천공, 바이러스 벡터 및 직접적인 DNA 섭취를 포함한다. 피타제 활성을 가진 임의의 폴리펩티드를 본 발명의 방법(예를 들어, 서브섹션 6.3.18에 구체적으로 개시된 것과 본 발명의 다른 섹션에 개시된 것)에 이용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 핵산 구성물은 숙주 조직 내 표적 세포로의 흡수에 적절한 형태로 존재하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산은 나출 DNA 또는 RNA 분자의 형태일 수 있으며, 이 때 분자는 하나 이상의 구조 유전자, 하나 이상의 조절 유전자, 안티센스 가닥, 삼중체 형성이 가능한 가닥 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 핵산 구성물은 적절한 조절 영역의 전사 및 번역 제어 하에 하나 이상의 구조 유전자를 포함할 것이다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 핵산 구성물은 형질감염 효율을 증가시키기 위해서 전달 비히클 내로 도입된 핵산을 포함하며, 여기서 전달 비히클은 건조된 친수성 부형제 물질을 포함하는 거대 입자 내에 분산되어 있다.
그러한 하나의 전달 비히클은 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스를 포함하며, 이들 바이러스는 자체 복제를 방지하기 위해서 불활성화되어 있지만 표적 숙주 세포에 결합하는 천연 바이러스 능력은 유지하고, 표적 숙주 세포의 세포질 내로 유전 물질을 전달하며, 입자 내에 혼입된 구조 또는 기타 유전자의 발현을 촉진한다. 매개된 유전자 전달을 위한 적절한 레트로바이러스 벡터는 문헌 ([Kahn et al., (1992) Circ . Res. 71: 1508-1517]에 개시되어 있다. 적절한 아데노바이러스 유전자 전달은 문헌 [Rosenfeld et al., (1991) Science 252: 431-434]에 개시되어 있다. 레트로바이러스 및 아데노바이러스 전달계는 모두 문헌 [Friedman (1989) Science 244: 1275-1281]에 개시되어 있다.
제2 유형의 핵산 전달 비히클은 음이온성 및 양이온성 리포좀 구성물을 비롯한 리포좀 형질감염 소포체를 포함한다. 음이온성 리포좀을 사용하려면, 핵산이 리포좀 내에 포집되어야 한다. 양이온성 리포좀에서는 핵산 포집이 필요하지 않으며, 그 대신 양이온성 리포좀은 핵산과 리포좀을 단순히 혼합하여 형성할 수 있다. 양이온성 리포좀은 DNA 및 RNA를 비롯한 음으로 하전된 핵산 분자에 활발히 결합하여 다수의 세포형에서 합리적인 형질감염 효율을 제공하는 복합체를 산출한다. 예를 들어, 문헌 [Farhood et al., (1992) Biochem . Biophys . Acta. 1111: 239-246]을 참조한다. 리포좀 소포체를 형성하는 예시적인 물질은, 문헌 [Felgner and Ringold (1989) Nature 337: 387-388]에 개시된 바와 같이, 디올레일포스파티딜 에탄올아민(DOPE) 및 디올레일옥시프로필-트리에틸암모늄(DOTMA)의 동몰량의 혼합물로 구성된 리포펙틴이다.
상기 2가지 유형의 전달계를 조합할 수 있다. 예를 들어, Kahn 등[상기 문헌 참조 (1992)]은, 레트로바이러스 벡터를 양이온 DEAE-덱스트란 소포 내에 조합하여 형질전환 효율을 추가로 증가시킬 수 있다고 교시한다. 또한 핵 단백질을 바이러스 및/또는 리포좀 전달 소포체로 혼입하여 형질감염 효율을 추가로 높일 수 있다. 문헌 [Kaneda et al., (1989) Science 243: 375-378]을 참조한다.
또 다른 측면에서, 단독의 활성 성분으로서 또는 하나 이상의 다른 제제 및/또는 효소와 함께 효소를 함유하는 소화 조제가 제공된다. 가축 또는 사육 동물의 소화 조제 중 효소 및 기타 제제의 사용은 동물의 건강 상태 및 기대 수명을 향상시킬 뿐만 아니라 가축의 건강 증진과 가축으로부터의 식량 생산을 보조한다.
본 발명은 또한 다수의 미네랄(예를 들어, 무기 인), 효소, 성장 인자, 약물 및 가축에게 전달하기 위한 기타 제제가 다량 보충되어 있는 가축 사료(예를 들어, 일부 가금류 사료)를 사용할 수 있다. 이들 보충제는 예를 들어, 곡물 내에 존재하는 천연 영양소 및 칼로리를 대신한다. 식품 자체로부터 유래하는 무기 인 보충제와 기타 보충제(예를 들어, 미량 미네랄 염, 성장 인자, 효소, 항생제)를 줄이거나, 제거함으로써, 사료는 더 많은 영양소와 에너지를 보유할 수 있다. 따라서, 남은 식이에는 이용가능한 에너지가 더 많아진다. 예를 들어, 곡물-종유 식이는 일반적으로 식이 1 kg당 약 3,200 kcal의 대사가능한 에너지를 포함하며, 미네랄 염은 대사성 에너지를 공급하지 않는다. 필요하지 않은 미네랄을 제거하고 곡물로 대체하면 식이 중 이용가능한 에너지를 높일 수 있다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 사용된 피타제를 함유하는 사료와 구별된다. 예를 들어, 한 측면에서, 유기체의 위장관에 의한 소화에 대해 내성이 있는 생체적합성 물질을 사용한다.
다수의 유기체, 예를 들어, 가금류 또는 조류(예를 들어, 닭, 칠면조, 거위, 오리, 앵무새, 공작, 타조, 꿩, 메추라기, 비둘기, 에뮤, 키위, 아비, 코카틸 앵무새, 소농, 카나리아, 펭귄, 홍학, 비둘기에서, 소화관은 딱딱한 생체적합성 물질(예를 들어, 바위 및 갑각류의 껍데기)을 저장, 사용하는 모래주머니를 포함하여 새가 소비한 종자 또는 기타 먹이의 분해를 돕는다. 이러한 일반적인 유기체 계열의 통상적인 소화관은 소낭(crop)이라 불리우는 작은 주머니를 포함하는 식도를 갖고 있어서, 단시간 동안 먹이가 저장된다. 소낭으로부터 진짜 식도(즉, 전위(proventriculus)로 먹이가 이동하여 내려가면, 염산 및 펩신이 소화 과정을 개시한다. 그 다음, 먹이는 알 모양으로 형성되고 강한 근육으로 두꺼운 벽을 이룬 모래주머니로 이동한다. 모래주머니의 주 기능은 먹이 입자를 분쇄하여 가루로 만드는 것으로서, 이는 새가 삼킨 소량의 미세한 자갈 또는 잔모래에 의해 도움을 받는 과정이다. 먹이는 모래주머니로부터 십이지장으로 이동한다. 새의 소장은 포유 동물, 의 것과 유사한다. 소장과 대장의 연결부에 약 4∼6 인치 길이의 2개의 맹장(즉, ceca)이 있다. 대장은 짧으며, 대개 약 3∼4 인치 길이의 직장으로 구성된다. 직장은 배설강으로 내보내고, 항문을 통해 변이 배설된다.
모래주머니 내에 존재하는 소비된(또는 그렇지 않으면 도입된) 딱딱한 생체적합성 물체는 각종 효소, 화학물, 치료제 및 항생제를 전달하기 위한 유용한 벡터이다. 이들 딱딱한 물체는 체류 기간이 몇시간 내지 몇일이며, 일정 기간이 지난 후엔 통과한다. 따라서, 본 발명은 유용한 소화제 또는 치료제를 유기체에게 전달하기 위한 코팅, 함침된(예를 들어, 함침된 매트릭스 및 막) 변형 식이 보조제를 제공한다. 이러한 식이 보조제는 모래주머니 내에 소화를 보조하기 위해 유기체가 통상적으로 섭취한 물체(예를 들어, 바위 또는 잔모래)를 포함한다. 본 발명은 유기체를 위한 소화 조제로서, 또는 치료제 또는 약제 또는 화학물질의 전달에 유용한 제제가 코팅되거나 또는 함침된 생체적합성 물체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 소화를 보조하는 제제의 방출을 위해 고안된 생체적합성 조성물을 포함하는 식이 보조제를 제공하며, 여기서 생체적합성 조성물은 경구 섭취 및 유기체의 소화관(예를 들어, 모래주머니)에서의 방출을 위해 고안된다. "생체적합성"이란, 물질이 숙주 유기체(예를 들어, 새)와 접촉시 물질의 거부를 초래하거나 또는 물질이 작동불가능해지는 데 충분한 양으로 유해 반응을 유발하지 않는 것을 의미한다. 이러한 작동불가성은, 예를 들어, 숙주 유기체로의 함침된 제제의 확산을 제한하는 물질 또는 독성 또는 감염에 의해 유기체의 사망율 또는 질병률의 증가를 초래하는 물질 주변에 섬유성 구조를 형성하여 일어날 수 있다. 생체적합성 물질은 비생체분해성 또는 생체분해성일 수 있다. 한 측면에서, 생체적합성 조성물은 위장관에 의한 분해 또는 소화에 저항성이 있다. 또 다른 측면에서, 생체적합성 조성물은 바위 또는 돌의 경도를 가진다.
본 발명에 유용한 비생체분해성 물질은 식이 제제의 부착 또는 함침을 허용하는 것이다. 이러한 비생체분해성 물질의 비제한적인 예로는 열가소성 물질, 예를 들어, 아크릴, 모드아크릴, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리에테르설폰 및 폴리비닐리덴 플루오라이드 등이 있다. 엘라스토머도 유용한 물질이며, 그 예로는 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리비닐 알콜 및 실리콘(에, 실리콘계 또는 실리카 함유) 등이 있다. 본 발명에서 제공되는 생체적합성 조성물은 블랜드, 공중합체 또는 이들의 조합물 형태로 혼합 또는 층화될 수 있는 물질을 다수 포함할 수 있다.
한 측면에서, "생체분해성" 물질은 조성물이 생체내에서 부식 또는 분해되어 더 작은 화학종을 형성한다는 것을 의미한다. 분해는, 예를 들어, 효소적, 화학적 또는 물리적 처리로 생길 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 적절한 생체분해성 물질은 폴리(락티드), 폴리(글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리에테르에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리카르보네이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 물질은 블랜드, 공중합체 또는 이들의 조합물 형태로 혼합 또는 층화될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 다수의 상이한 생체적합성 물질을 순차적으로 동물에게 제공하고 섭취시킬 수 있거나, 동일한 유기체에게 동시에 또는 각종 조합(예를 들어, 하나의 물질을 제공한 후에 다른 것을 제공함)으로 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체적합성 물질은 소화관을 통해 서서히 통과하도록 고안될 수 있다. 예를 들어, 거대 물질 또는 지방 물질은 소화관에서 더욱 서서히 이동하는 경향이 있으며, 따라서 소화관에서의 급속한 통과를 방지하기 위해 거대 크기를 가진 생체적합성 물질을 사용할 수 있다. 이러한 거대 물질은 비생체적합성 물질 및 생체분해성 물질의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 작은 비생체분해성 물질을 본 발명의 생체분해성 물질로 둘러싸서, 시간이 경과함에 따라 생체분해성 부분이 분해되면 비생체분해성 부분이 소화관을 통과하도록 할 수 있다. 또한, 임의의 수의 방향제를 본 발명의 생체적합성 물질에 제공하여 소비를 촉진할 수 있음이 인지된다.
임의의 수의 제제를 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여, 예를 들어, 폴리펩티드(예를 들어, 효소, 항체, 사이토킨 또는 치료 효과가 있는 소분자) 및 항생제를 포함하는 본 발명의 생체적합성 물질에 코팅할 수 있다. 구체적인 유용한 제제의 예가 하기 표 1 및 표 2에 제시되어 있다. 본 발명의 생체적합성 물질로 세포를 캡슐화하여 효소 또는 치료제를 전달하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포가 기공 내부에서 또는 기공을 통해 성장하기에 충분히 큰 기공을 갖으며, 소화관을 통해 취해질 수 있는 다공성 물질을 고안할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체적합성 물질은 다수의 세포형에 대한 지지체를 제공하는 다수의 미생물총(microflora) 환경(예를 들어, 상이한 다공성, pH 등)으로 구성될 수 있다. 세포는 특정 약물, 효소 또는 화학물질을 유기체에 전달하도록 유전자 조작될 수 있다. 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다.
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특정 제제는 일정 조건(예를 들어, 특정 pH, 활성화제의 존재 등) 하에 활성이 되거나 또는 활성화된 상태가 되도록 고안될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에서 프로-효소를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 프로-효소는 프로테아제(소화관 내에 존재하거나 또는 유기체의 소화관 내로 인공적으로 도입된 타액 프로테아제)로 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 생체적합성 조성물에 의해 전달된 제제는, 유기체에 의해 섭취되거나 또는 그렇지 않으면 유기체로 전달될 수 있는 활성화제를 첨가하여 활성화 또는 불활성화시킨다. 소화관에서 제제를 제어하기 위한 또 다른 기전은 적절한 소화 구획에서 활성화되는 환경 감수성 제제이다. 예를 들어, 제제는 낮은 pH에서는 불활성이지만 중성 pH에서는 활성일 수 있다. 따라서, 제제는 위에서는 불활성이고 장에서는 활성일 것이다. 대안으로, 제제는 미생물 특이성 인자(예를 들어, 장에 존재하는 미생물)의 존재에 반응하여 활성이 될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 유효 장점은, 예를 들어, (1) 1일 사료 또는 곡물로부터 동물(어류 포함)에 대한 미네랄 보충제(예를 들어, 무기 인 보충제), 효소 또는 치료약의 수요를 낮추거나 또는 가능하다면 제거하여 사료에 존재하는 칼로리 및 영양소의 양을 증가시킨다는 것과, (2) 가금류, 돼지, 소, 말, 양 및 고양이를 비롯한 가축 및 비가축의 건강 및 성장을 향상시킨다는 것을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물 중에 본 발명의 피타제 외에 다수의 효소를 사용할 수 있다. 이들 효소는 소비 식품의 적절한 소화, 또는 소화관을 통해 동물에게 전달되는 화학물질, 프로드럭 또는 기타 제제, 또는 화합물의 적절한 대사, 활성화 또는 유도체화에 필요한 효소를 포함한다. 본 발명의 조성물에 전달 또는 혼입할 수 있는 효소의 예로는, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 특히 락타제, 피타제, β-글루카나제, 구체적으로 엔도-β-1,4-글루카나제 및 엔도-β-1,3(4)-글루카나제, 셀룰라제, 크실로시다제, 갈락타나제, 특히 아라비노갈락탄 엔도-1,4-β-갈락토시다제 및 아라비노갈락탄 엔도-1,3-β-갈락토시다제, 엔도글루카나제, 특히 엔도-1,2-β-글루카나제, 엔도-1,3-α-글루카나제, 및 엔도-1,3-β-글루카나제, 펙틴 분해 효소, 특히 펙티나제, 펙틴에스테라제, 펙틴 리아제, 폴리갈락투로나제, 아라비난아제, 람노갈락투로나제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난-α-람노시다제, 펙테이트 리아제, 및 α-갈락투로니시다제, 만난아제, β-만노시다제, 만난 아세틸 에스테라제, 크실란 아세틸 에스테라제, 프로테아제, 크실라나제, 아라비녹실라나제 및 지질분해 효소, 예를 들어, 리파제, 피타제 및 쿠티나제로 구성된 군에서 선택된 사료 강화 효소를 포함한다. 서열 번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 피타제 외의 피타제를 본 발명의 방법 및 조성물에 사용할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 조성물(예를 들어, 식이 보조제)에 사용되는 효소는 열에 안정하고 내열성이며, 피테이트의 효소 가수분해를 촉진하는 피타제 효소이다. 즉, 이 효소는 단시간(즉, 5∼30초) 또는 장시간(예를 들어, 수 분 내지 수 시간) 50℃ 이상의 열에 노출된 후에도 재생되어 활성을 회복할 수 있다.
각각 "사료" 및 "식품"은 각각 동물 및 인간에 의해 섭취, 흡수, 소화되는 데 적절한 또는 그렇게 하기 위한 임의의 천연 또는 인공 식이, 식사 등 또는 이러한 식사의 성분을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "식이 보조제"란, 예를 들어, 치료제 또는 소화제를 동물 또는 유기체에게 제공하는 제제를 함유하는 조성물을 의미한다. "식이 보조제"는 통상적으로 유기체의 칼로리 섭취원이 아니며, 다시 말해서 식이 보조제는 유기체의 에너지원이 아니라, 전형적인 "사료" 또는 "식품" 외에 섭취되는 조성물이다.
본 발명의 각종 측면에서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가진 단백질의 30개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 재조합 피타제 단백질을 포함하는 사료 조성물 및 피테이트 함유 식량이 제공되다. 당업자들에게 공지된 바와 같이, 이러한 조성물은 비제한적인 각종 방법, 예를 들어, 중합체 코팅된 첨가제를 포함하는 펠릿형, 중합체 코팅된 첨가제를 포함하지 않는 펠릿형, 과립형 및 분무 건조로 제조할 수 있다. 비제한적인 예로서, 사료의 제조에 관해 교시되어 있는 문헌은 국제 공보 WO0070034 A1, WO0100042 A1, WO0104279 A1, WO0125411 A1, WO0125412 A1, 및 EP 1073342A를 포함한다.
제제 또는 효소(예를 들어, 피타제)는 각각 섭취 전에 또는 유기체의 위 또는 모래주머니에서 시험관내 또는 생체내 효과를 발휘할 수 있다. 조합 작용도 가능하다.
임의의 효소를 식이 보조제에 혼입할 수 있지만, 본 발명의 방법 및 조성물의 예로서 피타제를 참조한다. 본 발명의 식이 보조제는 효소(예를 들어, 피타제)를 포함한다. 일반적으로 피타제 조성물을 함유하는 식이 보조제는 액체거나 또는 무수물이다.
액체 조성물은, 바람직하게는 고도의 정제된 형태의 효소(예를 들어, 피타제) 이외에 어느것도 포함할 필요는 없다. 그러나, 일반적으로 글리세롤, 소르비톨 또는 모노 프로필렌 글리콜과 같은 안정제를 첨가한다. 액체 조성물은 또한 염, 당, 보존제, pH 조정제, 단백질, 피테이트(피타제 기질)와 같은 추가의 첨가제를 포함할 수 있다. 통상적인 액체 조성물은 수성 또는 오일계 슬러리이다. 지연 방출을 위해 액체 조성물을 생체적합성 조성물에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 생체적합성 물질(예를 들어, 생체분해성 또는 비생체분해성)이고, 예를 들어, 다공성 마이크로비드에 재조합 세포를 첨가하는 것을 포함하는 식이 보조제 조성물에 효소를 첨가한다.
무수 조성물은 분무 건조된 조성물일 수 있으며, 이 경우 조성물은 건조 형태의 효소 이외에 어떤 것도 포함하지 않아도 된다. 그러나, 일반적으로 무수 조성물은 식품 또는 사료 성분과 쉽게 혼합될 수 있고, 더욱 바람직하게는 사전혼합물의 성분을 형성할 수 있는, 소위 말하는 과립 형태이다. 효소 과립체의 입도는 혼합물 중 다른 성분의 입도와 적합한 것이 바람직하다. 이 과립체는 효소를 동물 사료에 혼입할 수 있는 안전하고 편리한 수단을 제공한다. 본 발명의 과립체는 생체적합성이거나, 비생체분해성인 생체적합성 과립체일 수 있다.
효소로 코팅된 본 발명의 응집 과립체는 고전단 혼합기에서 응집 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 흡수 과립체는 효소를 흡수하거나/효소로 코팅된 담체 물질의 코어를 보유하도록 하여 제조한다. 한 측면에서, 담체 물질은 동물의 모래주머니에서 돌 또는 잔모래의 역할을 촉진하는 생체적합성이고 비생체분해성이다. 응집 기법에 사용된 통상적인 충전제 물질은 염, 예를 들어, 황산이나트륨을 포함한다. 기타 충전제는 카올린, 활석, 규산알루미늄마그네슘 및 셀룰로스 섬유이다. 임의로, 덱스트린과 같은 결합제를 응집 과립체에 포함시킨다. 담체 물질은 생체분해성 물질 및 비생체분해성 물질(예를 들어, 바위, 돌, 세라믹, 각종 중합체)을 비롯한 임의의 생체적합성 물질일 수 있다. 임의로, 과립체를 코팅 혼합물로 코팅한다. 이러한 혼합물은 코팅제, 예를 들어, 소수성 코팅제, 예를 들어, 경화 팜유 및 우지와, 필요에 따라 기타 첨가제(예를 들어, 탄산칼슘 또는 카올린)를 포함한다.
한 측면에서, 식이 보조제 조성물(예를 들어, 피타제 식이 보조제 조성물)은 착색제, 아로마 화합물, 안정제, 비타민, 미네랄, 기타 사료 또는 식품 강화 효소 등과 같은 기타 대용물을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 첨가제는 예를 들어, 비타민, 미네랄 또는 사료 증진 효소와 같은 하나 이상의 화합물과 적절한 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 식이 보조제 조성물은 유효량의 하나 이상의 사료 증진 효소, 특히 α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 특히 락타제, 다른 피타제, β-글루카나제, 구체적으로 엔도-β-1,4-글루카나제 및 엔도-β-1,3(4)-글루카나제, 셀룰라제, 크실로시다제, 갈락타나제, 특히 아라비노갈락탄 엔도-1,4-β-갈락토시다제 및 아라비노갈락탄 엔도-1,3-β-갈락토시다제, 엔도글루카나제, 특히 엔도-1,2-β-글루카나제, 엔도-1,3-α-글루카나제, 및 엔도-1,3-β-글루카나제, 펙틴 분해 효소, 특히 펙티나제, 펙틴에스테라제, 펙틴 리아제, 폴리갈락투로나제, 아라비난아제, 람노갈락투로나제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난-α-람노시다제, 펙테이트 리아제, 및 α-갈락투로니시다제, 만난아제, β-만노시다제, 만난 아세틸 에스테라제, 크실란 아세틸 에스테라제, 프로테아제, 크실라나제, 아라비녹실라나제 및 지질분해 효소, 예를 들어, 리파제, 피타제 및 쿠티나제로부터 선택된 사료 강화 효소를 추가로 포함한다.
본 발명의 동물 사료 조제를 식이 전에 또는 식이와 동시에 단일 위를 가진 동물에게 보충한다. 한 측면에서, 본 발명의 식이 보조제를 식이과 함께 단일 위를 가진 동물에게 보충한다. 한 측면에서, 식이 보조제를 과립체 또는 안정화된 액체의 형태로 식이에 첨가한다.
본 발명의 식이 보조제 중 효소의 유효량은 약 10∼20,000; 약 10∼15,000, 약 10∼10,000, 약 100∼5,000, 또는 약 100∼약 2,000 FYT/식이 보조제 kg이다.
본 발명의 피타제를 사용한 다른 구체적인 예는 대두 처리에서의 사용과 이노시톨 또는 그의 유도체의 제조에서의 사용이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 동물 퇴비 중 피테이트 양을 낮추는 방법에 관한 것으로서, 여기서 동물에게는 본 발명의 피타제 유효량을 함유하는 식이 보조제가 제공된다. 본 발명의 시작 부분에 언급한 바와 같이, 한가지 중요한 효과는 인산염에 의한 환경 오염을 줄인다는 것이다.
또 다른 측면에서, 식이 보조제는 자기 담체이다. 예를 들어, 자기 담체(예를 들어, 다공성 자기 비드) 내에, 그 위에 또는 이를 통하여 분배된 효소(예를 들어, 피타제)를 함유하는 자기 담체를 피테이트가 많은 영역에 분포시키고 일정 시간이 경과한 후에 자석으로 수거할 수 있다. 이러한 비드의 분배 및 재수거는 추가의 오염을 줄이고 비드의 재사용을 가능하게 한다. 또한, 이러한 자기 비드를 사용하면 생체내에서, 예를 들어, 피타제 활성이 실시될 수 있는 소화관의 일정 지점에 식이 보조제를 위치시킬 수 있다. 예를 들어, 동물이 자기 담체의 식이 보조제를 소비한 후에 동물의 모래주머니 다음에 자석을 병치함으로써 소화 효소(예를 들어, 피타제)를 함유하는 본 발명의 식이 보조제를 동물의 모래주머니에 위치시킬 수 있다. 일정 기간이 지나면 자석을 제거하여 식이 보조제가 소화관을 통과할 수 있도록 한다. 또한, 자석 담체는 죽은 후에 유기체로부터 제거하거나 또는 수거를 보조하는 데 적절하다.
식이 보조제가 다공성 입자인 경우, 그러한 입자는 통상적으로 서서히 방출하는 것이 바람직한 물질로 함침되어 지연 방출 입자를 형성한다. 이러한 지연 방출 입자는 다공성 입자를 방출이 바람직한 물질로 함침하여 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 제1 분산상에 목적하는 물질을 먼저 용해시켜도 제조할 수 있다. 이 경우, 방출하고자 하는 물질을 제1 분산상에 먼저 용해시키는 방법으로 제조한 지연 방출 입자는 본 발명의 범위 및 취지 내에 있다. 다공성 중공 입자는, 예를 들어, 약제, 농업용 화학물질 또는 효소와 같은 지연 방출 물질로 함침될 수 있다. 특히, 효소로 함침된 다공성 중공 입자가 생체분해성 중합체로 제조되는 경우, 입자 자체는 농업용 화학물질 또는 비료로서 사용될 수 있으며, 환경에 유해한 영향을 미치지 않는다. 한 측면에서, 다공성 입자는 자기 특성을 가진다.
다공성 중공 입자는 생체반응기 지지체, 특히 효소 지지체로서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 리포좀과 같은 미세소포 내에 효소 제제를 캡슐화하여 수일, 바람직하게는 약 3∼20일 동안 용량이 방출되도록 하는 지연 방출 방법을 이용하여 식이 보조제를 제조하는 것이 유리하다. 별법으로, 제제(예를 들어, 효소)의 용량이 수일, 예를 들어, 2∼30일간 서서히 방출되는 지연 방출 중합체로의 혼입과 같이, 제제(예를 들어, 효소)는 지연 방출을 위해 제형화될 수 있으며, 동물의 수명을 연장시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 리포좀은 인지질 또는 기타 지질 물질로부터 유도된다. 리포좀은 수성 매체 중에 분산된 단층판 또는 다층판의 수화된 액정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 임의의 비독성의 생리적으로 허용가능하고 대사성인 지질을 사용할 수 있다. 리포좀 형태의 본 발명의 조성물은 제제 이외에 안정제, 보존제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 지질은 천연 및 합성의 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)이다. 리포좀의 형성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N. Y. (1976), p. 33 et seq.]를 참조한다.
식품 또는 사료 제제 또는 첨가제의 제조 과정에서 본 발명의 피타제를 사용하는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 즉, 피타제는 제조 과정에서는 피타제 활성을 나타내지만 최종 식품 또는 사료 제품에서는 활성이 아니다. 이 측면은, 예를 들어, 도우 제조 및 베이킹과 관련이 있다. 따라서, 피타제 또는 피타제를 발현하는 재조합 효모는, 자기 담체 내에, 그 위에 또는 이를 통해 함침시키고, 도우 또는 식품 매체 중에 분배시킨 다음, 자석으로 회수할 수 있다.
본 발명의 식이 보조제는 생체적합성(예를 들어, 생체분해성 또는 비생체분해성) 담체로서 단독으로 또는 기타 소화 첨가제와 함께 동물에게 투여할 수 있다. 본 발명의 식이 보조제는, 탑 드레싱으로서 또는 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로 제공하거나, 또는 주사로 또는 경피 수단으로 또는 기타 성장 관련 식용 화합물과 함께 쉽게 투여할 수 있으며, 조합물 중 각 화합물의 비율은 특정 유기체 또는 해결할 문제와 목적하는 반응 정도에 따라 달라진다. 임의의 소정 사례에서 투여되는 특정 식이 양은, 당업계에 공지된 바와 같이 투여할 구체적인 화합물, 해결할 문제, 피험체의 상태 및 피험체의 반응 또는 유효 성분의 활성을 변형시킬 수 있는 기타 관련 인자에 따라 조정한다. 일반적으로, 당업계에 공지된 바와 같이 1일 1회 용량 또는 1일 분할 용량을 사용할 수 있다.
동물 사료와 별도로 투여하는 경우, 당업계에 공지된 바와 같이 식이 보조제를 비독성의 약학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여 즉시 방출형 또는 지연 방출형 제제를 형성함으로써 식이 보조제 형태를 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 대두 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참기름 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용되는 경우, 화합물의 제형은 정제, 캡슐, 분말, 트로키제 또는 로젠즈이거나, 또는 미세분산성 형태로서의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용되는 경우, 제형은 연질 젤라틴 캡슐 또는 시럽이나 액체 현탁액, 에멀젼 또는 용액일 수 있다. 제형은 보조제, 예를 들어, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 용액 촉진제 등을 포함할 수 있다. 제형은 치료 측면에서 가치있는 다른 물질을 함유할 수 있다. 섭취시 효소 방출을 위해 고온에서 과립상 식용 담체를 제조하는 방법은 공계류중인 미국 특허 출원 09/910,579호(2001년 7월 20일 출원)에 개시되어 있다.
대안적 실시양태에서, 본 발명의 중요한 장점은, 1) 활성 성분이 적재된 생체적합성 조성물의 제조 용이성; 2) 이용할 수 있는 활성 성분 및/또는 중합체의 종류와 관련된 다용성; 3) 높은 수율 및 적재 효율; 및 4) 활성이 있는 온전한 활성제를 생체내에서 방출하는 서방형 제제의 제공과 이에 따른 장기간 동안의 활성제의 제어 방출을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 한 장점은 유기체의 소화관(예를 들어, 모래주머니)에 제제를 국소 전달함으로써 생길 수 있다. 한 측면에서, "내에 포함된"이란 제제를 장기간 동안 제어 방출하기에 유용한 조성물로 제제를 제형화하는 방법을 말한다.
본 발명의 지속 방출 또는 지연 방출 조성물의 대안적 실시양태에서는 제제(예를 들어, 효소 또는 항생제)의 유효량을 이용한다. 한 측면에서, 지속 방출 또는 지연 방출은 장시간 동안 생체적합성 물질로부터 제제를 점차적으로 방출하는 것을 의미한다. 지속 방출은 연속 또는 불연속, 1차 또는 비-1차일 수 있으며, 하나 이상의 생체분해성 또는 비생체분해성 조성물, 약물 적재, 부형제 선택 또는 기타 변형을 이용하여 달성할 수 있다. 그러나, 유기체가 일단 소비하면 신속하게 방출하는 "신속" 방출 조성물을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. "방출"이란 생체적합성 담체로부터 제제가 방출되는 것을 의미할 필요는 없다. 그 보다는, 한 측면에서 지연 방출은 생체적합성 조성물에 존재하는 제제의 지연 활성화 또는 계속적인 활성화를 포함한다. 예를 들어, 피타제는 효과를 나타내기 위해서 생체적합성 조성물로부터 방출되어야 하는 것은 아니다. 이 측면에서, 피타제는 생체적합성 조성물 상에 고정되어 있다.
동물 사료는 동물의 식이 요건에 부합하도록 일반적으로 사용되는 임의의 단백질 함유 유기 가루일 수 있다. 이러한 단백질 함유 분말의 대부분은 통상적으로 옥수수 가루, 콩가루 또는 옥수수가루/콩가루 혼합물로 주로 구성된다. 예를 들어, 가금류에게 공급되는 일반적인 시판품으로는 랜드 오레이크 아게 서비시즈(Land O 'Lakes AG Services)의 가금류 사료 제품인 에그 메이터 컴플리트(Egg Maker Complete)와, 아가와 인코포레이티드(Agwa, Inc.)의 제품인 컨트리 게임 앤드 터키 그로우어(Country Game and Turkey Grower) 등이 있다(또한, [The Emu Farmer's Handbook by Phillip Minnaar and Maria Minnaar] 참조). 이들 2종의 시판품은, 조성물에 필요한 보충제 인, 아연, 망간 및 철 섭취량을 줄이거나, 제거하기 위해 식이 보조제 및/또는 효소 피타제를 도입할 수 있는 동물 사료의 전형적인 예이다.
본 발명은 특정 다이어트, 예를 들어, 애킨스 다이어트(Atkins' diet), 채식, 장수식, 비건식 또는 지역식(예를 들어, 전세계 다이어트 개발을 위한 것)을 위한 신규한 제제 및 식이 보충제 및 첨가제, 및 다이어트의 보충을 위한 방법을 제공한다. 특정 선택형 다이어트, 예를 들어, 애킨스, 채식, 장수식, 비건식 또는 지역식(예를 들어, 전세계 다이어트 개발을 위한 것)과 관련된 식품은 특정의 식품 부류, 예를 들어, 단백질 및 지방, 콩을 강조하거나, 개체에게 영양을 공급하는 실질적인 또는 단독의 공헌자로서 지역 고유의 농작물, 예를 들어, 시리얼, 벼, 콩 등에 의존한다. 이와 같은 다수의 시리얼계 농작물은 피트산 수준이 (3 내지 10배) 높다. 가공 식품, 예를 들어, 콩 단백질 가수분해물 등은 피트산을 높은 수준으로 보유하는 것으로 보이며, 이를 단백질 공급원으로서 영양바, 분말 및 다른 식품 또는 식품 보충제 및 성분에 포함시킬 경우, 상기와 같은 다이어트를 실시하는 개체가 경험하는 피트산 적재량은 증가하게 된다.
골 손실 예방 및 역전
본 발명은 또한 골 손실의 소견이 있는 개체, 골 손실을 앓는 개체, 및 예를 들어, 골다공증, 악액질과 같은 의학적 병태를 앓는 개체를 위한, 및 의학적 치료법, 예를 들어, 화학 요법을 위한(이는 필수 영양소의 적절한 흡수 또는 이용을 포함할 수 있다), 피타제, 예를 들어, 본 발명의 피타제를 비롯한 임의의 피타제를 포함하는, 식이 보충을 위한 보충제 및 첨가제로서 사용하고자 하는 신규한 약학적 제제 및 식이 제제, 및 식이 보충 방법을 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 단독으로, 또는 다른 보충제 또는 치료 요법과 함께, 예를 들어, 약제 등과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 식이 보충을 위한 제제, 식이 보충제 및 식이 보충 방법은 다른 식이 보충제, 또는 골다공증 치료 또는 예방용 약제와 함께, 예를 들어, 비타민 D3 및/또는 칼슘(이는 골 손실을 막는 것으로 입증되어 있다)과 함께 투여될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 피타제, 예를 들어, 임의의 피타제 또는 본 발명의 피타제, 및 비타민 D3 및/또는 칼슘을 포함하는 제제를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 피타제, 예를 들어, 임의의 피타제 또는 본 발명의 피타제를 포함하는 골 손실 예방용 제제를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 피타제, 예를 들어, 임의의 피타제 또는 본 발명의 피타제를 포함하는 골 손실 역전용 제제를 제공한다.
제제는 제약 조성물의 형태일 수 있거나, 또는 제약 첨가제일 수 있으며, 이들 어느 것이나 액체, 고체, 분말, 로션, 스프레이제, 또는 에어로졸 형태일 수 있다. 경구 투여용의 본 발명의 약학적 제제 및 제제는 적절하고 적합한 제형으로 당업계에 주지되어 있는 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제제화될 수 있다. 그러한 담체를 통해 제제는 환자가 복용하기에 적합한 단위 제형, 예로서, 정제, 환제, 분제, 당의정, 캡슐제, 액제, 로젠지, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등으로 제제화될 수 있다. 경구용 약학적 제제는 고체 부형제로서 제제화될 수 있고, 임의로는 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원한다면, 적합한 추가의 화합물을 첨가한 후, 과립 혼합물로 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득할 수 있다. 적합한 고체 부형제는 당질 또는 단백질 충진제이고; 이는 예를 들어, 당(락토스, 수크로스, 만닛톨, 또는 소르비톨 포함); 옥수수, 밀, 벼, 감자, 또는 다른 식물로부터의 전분; 셀룰로스, 예를 들어, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 또는 나트륨 카르복시 메틸셀룰로스; 및 검(아라비아 검 및 트라가칸트 검 포함); 및 단백질, 예를 들어, 젤라틴 및 콜라겐을 포함한다. 예를 들어, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산, 또는 그의 염, 예를 들어, 알긴산 나트륨과 같은 붕해제 또는 가용화제를 첨가할 수 있다.
본 발명은 수성 현탁제 제조에 적합한 부형제와 함께 혼합된, 피타제, 예를 들어, 본 발명의 피타제를 포함하는 수성 현탁제를 제공한다. 상기 부형제로는 현탁제, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검, 붕해제 또는 습윤제, 예를 들어, 천연 발생 포스파티드(예를 들어, 렉틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜과의 축합물(예를 들어, 헵타데카에틸렌 옥시세타놀), 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르를 포함하는 에틸렌 옥시드와 헥시톨의 축합물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트), 또는 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르를 포함하는 에틸렌 옥시드와 헥시톨 무수물의 축합물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 수성 현탁제는 또는 하나 이상의 방부제, 예를 들어, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어, 수크로스, 아스파르탐 또는 사카린을 포함할 수 있다. 제제는 삼투압이 조정될 수 있다.
약물 투여 요법은 당업계에 주지되어 있는 약동학적 파라미터, 즉, 활성제의 흡수율, 생체이용성, 대사, 제거율 등을 고려하여야 한다(예를 들어, 문헌 ([Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617]; [Groning (1996) Pharmazie 51:337-341]; [Fotherby (1996) Contraception 54:59-69]; [Johnson (1995) J. Pharm. Sci. 84:1144-1146]; [Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613]; [Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103-108]; [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Lippincott Williams & Wilkins]의 최신판) 참조). 최신 기술을 통해 의사는 각 개체 환자, 활성제, 및 치료하고자 하는 질환 또는 병태에 적합한 약물 투여 요법을 결정할 수 있다. 제제로서 사용된 유사 조성물에 대해 제공된 가이던스가 약물 투여 요법, 즉, 투약 스케줄 및 용량 수준을 결정하는 가이던스로서 사용될 수 있고, 본 발명의 방법(예를 들어, 골 손실 역전 방법, 또는 골 손실 예방 방법)을 위한 수행 방법은 적절하고 정확하다.
신체 단련 보충제
본 발명은 또한 운동 경기 훈련 또는 다른 집중 신체 단련, 예를 들어, 군인의 신체 단련을 받는 개체를 위한 피타제, 예를 들어, 임의의 피타제, 또는 본 발명의 피타제를 포함하는 신규한 식이 보충제 및 첨가제, 및 그의 사용 방법을 제공한다. 운동 경기 훈련 및 과도한 운동은 필수 영양소를 고갈시킬 수 있고, 식이 보충을 필요로 한다. 이러한 다이어트 및 상태에서는 공통적으로 최적의 영양 상태에 필요한 필수 미량 영양소, 예를 들어, 금속((K, Ca, Fe, Zn, Mn, Se) 및 이온(PO4)이 부족하다. 피트산이 풍부한 다이어트는 이러한 문제점들을 더 악화시키고, 이는 또한 피트산이 고도로 풍부한 식품에 따른 다이어트에 자발적으로 또는 경제적인 이유에서 강제적으로 의존함으로써 발생되는 만성 및 급성 병태를 일으킬 수 있다.
예를 들어, 각종의 저탄수화물("저탄수화물(low carb)") 다이어트를 따르는 개체는 대게 근육, 예를 들어, 다리 근육에 고통을 받는데, 그 예로서, 경련을 들 수 있다. 이에 대한 전형적인 조언으로는 추가로 그의 다이어트에 칼륨, 칼슘 및 다른 영양소를 첨가하는 것이다. 본 발명은 다이어트에의 피타제 보충을 사용하여(임의의 피타제, 또는 본 발명의 피타제 사용 포함) 다량 영양소 및 미량 영양소의 동원을 통해 손상된 영야 상태를 증진시키는 식이 보충용 조성물, 식이 보조제 및 보충제, 및 식이 보충 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 피타제 사용(예를 들어, 임의의 피타제, 또는 본 발명의 피타제 사용 포함)은 식품 및 보충제 공정에 직접 첨가되는 데 적합한 불안정성 또는 pH 안정성 프로파일을 가지고 있음을 입증할 수 있도록 및/또는 인간 또는 동물 위장관에서 안정성 및 활성이 증진되어 있음을 입증할 수 있도록 최적화된다.
본 발명은 또한 미네랄 보충을 받는 개체를 위한 피타제, 예를 들어, 임의의 피타제, 또는 본 발명의 피타제를 포함하는 신규한 식이 보충제 및 첨가제, 및 그의 사용 방법을 제공한다. 피트산 함량이 높은 식품을 쉽취하는 사람이 미네럴 보충을 할 경우 실제로 영양 이용성과 관련된 문제는 더 악화될 수 있다. 참조 문헌에 따르면, 피트산, 칼슘 및 아연의 복합체는 피트산 및 칼슘의 복합체보다 더욱더 불용성이 크다고 제시하고 있다. 사람들은 대체로 다중의 미네럴 보충제를 복용하고 있다. 피트산 함량이 높은 식품의 존재하에 미네럴 보충제를 조합하도록 고안된 구성에 피타제를 첨가하게 되면 이들 보충제는 효능은 더욱더 커질 수 있다.
대안적 측면에서, (임의의 피타제, 또는 본 발명의 피타제를 포함하는) 본 발명의 조성물 및 방법은
· 특정 식품군의 섭취로만 제한하는 체중 감량 프로그램, 채식주의자, 육류, 가지속의 각종 야채, 빵 등의 섭취를 제한하거나 배제하는 장수식 또는 비건식, 및 견과류 섭취를 주로 하는 다른 다이어트,
· 미네럴 섭취의 감소에 기초한 생리학적 증상을 완화시키기 위한 피트산 함량이 높은 식품으로 위주의 저탄수화물 다이어트 중인 개체를 위한 특정의 보충제,
· 군대 훈련 요법을 비롯한, 식이 섭취를 통해 수행능을 증진시키고자 하는 운동 경기 훈련 요법,
· 섭취를 하지 못하거나, 또는 식품군에 대해 제한이 된 환자를 위한 특별한 요구에 따른 맞춤형 병원식,
· 개발 도상국의 미량 영양소가 부족한 시리얼 및 콩과 식물로 이루어진 일상식,
· 학교의 점심 프로그램에 대한 보충제 또는 첨가제로서 사용된다.
본 발명은 또한 (임의의 피타제, 또는 본 발명의 피타제를 포함하는) 본 발명의 조성물 및 방법, 및 본 발명의 조성물 또는 방법을 상기 다이어트에 도입하는 것에 관한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 임의의 포장재, 표지, 제품 삽입물 등을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 천연 피타제, 또는 생산, 가공, 또는 예를 들어, 소화관과 같은 인간 또는 동물의 소화계를 거치는 통과를 위해 제제화된 또는 최적화된(예를 들어, 그를 위한 최적화된 순서를 가진 것) 본 발명의 최적화된 피타제를 제공한다. 피타제 효소는 대체 제제를 사용함으로써 최적화될 수 있다.
별법으로 본 발명의 피타제 효소, 또는 임의의 피타제는 가공하는 동안, 섭취하는 동안, 및 인간 소화관에 있는 동안 활성을 보유할 수 있도록 하기 위해 예를 들어, 유도 진화, 오류 빈발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발, 어셈블리 PCR, 유성 PCR 돌연변이 유발, 생체내 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 순환적 앙상블 돌연변이 유발, 지수 앙상블 돌연변이 유발, 부위 특이적 돌연변이 유발, 결찰 리어셈블리, GSSM™ 및 그의 임의의 조합을 사용하여 그의 서열의 조작에 의해 최적화될 수 있다.
조성물(예를 들어, 임의의 피타제 효소, 또는 본 발명의 피타제 효소를 포함하는 식이 제제)은 식이 효능을 제공하기 위해 다수의 방법으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은
· 포장된 식품 보충제, 예를 들어, 씹을 수 있는 정제 또는 영양바에서의 용도,
· 섭취하기 전, 수화될 수 있는 동결건조된 제품으로서의 용도,
· 가공 식품 산업에서 식이 제품, 예를 들어, 가공된 콩 제품과 함께 포장되거나, 또는 대두 단백질 가수분해물 및 성분으로서 판매되는 전체 식품으로부터의 다른 가공 분획을 함께 포함하는 제제로서 판매되는 용도,
· 상업용의 구운 제품에서의 용도,
· 아침식사용 시리얼에 분무식으로 쓸 수 있는 용도,
· 분무 투여되는(예를 들어, 비내 분무) 제제로의 용도,
· 지역 고유의 농작물, 즉, 시리얼 및 콩과 식물에서 발현되는 트랜스제닉 생성물로서(예를 들어, 미생물, 예를 들어, 박테리아의 트랜스제닉 생성물로서)의 용도,
· 트랜스제닉 유기체, 예를 들어, 미생물로서의 용도(예를 들어, 인간 또는 동물은 예를 들어, 인간 또는 동물의 섭취, 또는 소화관내로의 이식 후, 재조합 피타제, 예를 들어, 본 발명의 피타제를 제조(및 대안적 실시양태에서, 분비)할 수 있는 박테리아 또는 다른 미생물을 공급받는다)인 용도를 포함하는, 조성물(예를 들어, 임의의 피타제 효소, 또는 본 발명의 피타제 효소를 포함하는 식이 제제) 및 방법을 제공한다.
본 발명의 피타제 함유 제품 및 방법은 영양제 성능을 증진시킬 수 있고, 영양소 부족과 관련된 다양한 증상을 완화시킬 수 있는 능력에 증진된 영양제, 그와 상용성이 영양제, 또는 그 밖의 것으로서 상품화될 수 있다.
본 발명의 피타제 함유 제품 및 방법은, 중요한 식이 미네럴, 예를 들어, 아연, 구리, 철, 마그네슘, 주석, 및 칼슘을 킬레이트화시키는 피테이트의 항영양 효과를 완하시키는 데 사용된다. 따라서, 본 발명의 피타제 함유 제품 및 방법은, 섭취한 식품내 존재하는 금속 결합 효소 및 단백질의 침전을 막는 식이 보충제로서 사용된다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제 함유 제품 및 방법은 미네럴 생체이용성을 증가시키기 위해 인간의 일상식, 특히, 콩과 식물 및 시리얼이 풍부한 일상식에서 피테이트의 항영양 효과를 완하시키는 데 사용된다. 한 측면에서, 본 발명의 식이 보충제 중의 피타제는 피테이트로부터 오르토포스페이트의 부분적인 또는 완전한 가수분해적 제거를 촉진하는 데, 여기서, 피테이트가 완전하게 가수분해되면 1개의이노시톨 분자 및 6개의 무기 포스페이트 분자가 생성된다.
본 발명의 피타제 함유 제품 및 방법은 인간, 및 가금 및 어류를 비롯한 다수의 동물의 일상식에 적용될 수 있다. 예를 들어, 피타제 함유 식이 보충제 제품 및 본 발명의 식이 보충 방법은 상업적으로 중요한 종, 예를 들어, 돼지, 소, 양, 염소, 실험실용 설치류(래트, 마우스, 햄스터, 및 게르빌루스쥐), 모피 동물, 예를 들어, 밍크 및 여우, 및 동물원 동물, 예를 들어, 원숭이 및 영장류뿐만 아니라, 가축, 예를 들어, 고양이 및 개를 사용하여 실행될 수 있다. 상업적으로 중요한 전형적인 조류 종으로는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 에뮤, 타조, 아비, 키위, 비둘기, 앵무새, 코카틸 앵무새, 소농, 카나리아, 펭귄, 홍학, 및 메추라기를 포함한다. 상업적 양식 어류, 예를 들어, 송어 또한 본원에 개시된 식이 보조제로부터 도움을 받을 것이다. 도움을 받을 수 있는 다른 어류로는 예를 들어, 물고기(특히, 수족관 또는 수산 양식 환경에 있는 물고기, 예를 들어, 열대어), 금붕어 및 다른 관상용 잉어, 메기, 송어, 연어, 상어, 가오리, 가자미과 어류, 서대기, 틸라피아, 송사리, 구피, 몰리, 플래티피쉬, 검상꼬리송사리, 제브라피쉬, 및 미꾸라지를 포함한다.
본 발명의 피타제 함유 제품 및 방법은 또한 다양한 아가, 겔, 배지, 및 조직 및/또는 세포 배양에 사용되는 용액에 사용된다. 대두 가수분해물이 불균일하게 있는 것이 조직 및/또는 세포 배양을 사용할 경우, 직면하게 되는 문제가 될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 피타제 함유 제품 및 방법은 예를 들어, 세포 배양율 및 성능의 일관도를 증가시키기 위해 세포 배양 배지 첨가제 또는 처리법으로서 사용된다.
한 측면에서, 본 발명은 피타제, 예를 들어, 본 발명의 피타제를 포함하는 세포 배양용 가수분해물을 제공한다. 한 측면에서, 일관성이 있는 제품을 제공하기 위해 본 발명은 피타제 바이오마커를 사용함으로써 피타제를 포함하는, 세포 배양용의 가수분해물, 보충제 또는 다른 첨가제를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 방법은 가수분해물, 보충제 또는 다른 첨가제 배치 중의 여러 피타제 분자를 "스코어링"하거나, 또는 "마킹"한 후, 가수분해물, 보충제 또는 다른 첨가제 배치를 혼화하여 일관성있는 바이오마커 패턴을 달성하는 것을 포함할 것이다. 한 측면에서, 각 배치의 배양 성능은 미니 생체반응기(들)에서 측정되고, 각 바이오마커 및 배치의 성능과 상관관계에 있다. 한 측면에서, 평균이거나, 그보다 우수한 성능을 가진 고성능 제품을 생산하기 위해 혼합물을 제조한다. 한 측면에서, 이황화 결합에 의해 유발되는 2차 구조를 제거함으로써 많은 단백질의 생체이용성을 증가시키기 위해 티오레독신(TRX)을 첨가한다. 한 측면에서, 프로테아제 또한 본 발명의 가수분해물, 보충제 또는 첨가제에 첨가된다. 프로테아제는 혼화 공정을 (상기 논의된 바와 같이, 피타제를 사용하여 이루어지는 것과 같이) 지시하는 다른 바이오마커로 "스코어링"하거나, 또는 품질을 관리할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 가수분해물, 보충제 또는 첨가제에 대해 상기 기술된 것과 유사한 바이오마커 "스코어링" 또는 품질 관리 공정을 사용하여 일관성있는 제품을 제공하기 위해 피타제를 곡물에 첨가하는 방법을 제공한다.
군인의 전투 효율 및 사기 증진을 위한 효소가 증가된 일상식
한 측면에서, 본 발명은 군인의 전투 효율 및 사기 증진을 위한 효소가 증가된 일상식을 위한, 피타제, 예를 들어, 임의의 피타제, 또는 본 발명의 피타제를 포함하는 신규한 식이 보충제 및 첨가제 및 식이 보충 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 상기와 같은 식이 보충제 조성물은 동소에서 식품 폐기물은 제한하면서 안정적이고, 사용이 용이하고 바람직한 포맷으로 에너지, 체력 및 사기를 증진시키는 작용을 한다.
한 측면에서, 본 발명의 상기와 같은 식이 보충제 조성물 및 방법은 영양제를 효과적으로 전달하는 것을 포함한 군대 작전상의 도전 과제, 및 군인의 관련된 건강, 사기, 및 작전상 전투 효과를 다룬다. 본 발명은 인간 소화관에서 효과적으로 작용할 수 있도록 최적화된 효소를 제공한다. 이러한 효소는 영양소의 추출 및 에너지 발생을 증진시킬 뿐만 아니라, 영양 자급도 및 개체 포만감을 장기간 동안 유지시킬 수 있다.
피타제 이외의, 다른 효소, 예를 들어, 아밀라제, 크실라나제, 프로테아제, 리파제가 본 발명의 식이 보충제 조성물 및 방법을 실행하는 데 사용된다. 한 측면에서, 본 발명은 피타제, 예를 들어, 본 발명의 피타제, 및 또 다른 효소, 예를 들어, 아밀라제, 크실라나제, 프로테아제, 리파제 또는 이들의 조합을 포함하는, 제제, 식품 보충제, 식품, 내장식 인스턴트 음식 유닛(MRE), 음용수, 가수분해제 등을 제공한다. 식품과 함께 섭취하게 되면, 이들 효소는 중요한 영양소, 예를 들어, 인, 필수 금속 및 이온, 아미노산, 및 당의 유리를 증진시키는 것으로 나타났다. 추가로, 이들 효소를 함께 섭취할 경우, 식물 유래의 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 및 전분을 탈중합화시킴으로써 위장관 역학 및 흡수를 증가시킨다. 이러한 백서는 군인용 영양제 이용을 증진시키기 위해 군대식에 대한 보충제로서 이들 효소를 개발할 것을 제안하였다.
한 측면에서, 본 발명의 식품 보충을 통해 일반 항영양성을 지닌 식물 유래의 피테이트로부터 필수 포스페이트를 유리시킬 수 있고, 이를 통해 식품 에너지 수율 및 골 CaPO4 침착은 증가하게 된다. 한 측면에서, 피타제 및 잠재성이 있는 다른 영양 보충 효소는 소화관 pH 및 내인성 프로테아제의 활성을 견디어 낼 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 단련, 전투 또는 임의의 다른 스트레스가 많은 상황하에서 군인에게 제공되는 군대식(또는 임의의 식사, 예로서, 일반 소비자 식사 및 다이어트 보충 제품 포함)의 영양가, 소화율 및 에너지 함량을 유의적으로 개선시키는 군용식, 음용수, 식품, MRE, 가수분해제 등에 대한 효소 보충제를 제공한다. (MRE, 가수분해제 등 중의, 또는 그와 함께 하는) 상기 보충제는 사용 및 개인 운송이 용이하도록 제제화될 수 있다. 한 측면에서, 효소 보충제는 식품의 미관, 맛 및/또는 일관도를 손상시키지 않을 것이다. 한 측면에서, 제품은 건강을 증진시키고, 군인의 체력을 증강시킨다.
대안적 측면에서, 효소 보충제는 식이 효능을 제공하기 위해 다수의 방법으로 전달된다: 예를 들어, 본 발명은 일부 측면에서는,
· 포장된 식품 또는 음용수 보충제, 예를 들어, MRE, 군용식, 생존 키트, 가수분해제, 씹을 수 있는 정제 또는 영양바에서,
· 섭취하기 전, 수화될 수 있는 동결건조된 제품(예를 들어, 분말)으로서,
· 가공 식품 산업에서 식이 제품, 식품, 음용수, 예를 들어, 가공된 콩 제품과 함께 포장되거나, 또는 대두 단백질 가수분해물 및 성분으로서 판매되는 전체 식품으로부터의 다른 가공 분획을 함께 포함하는 제제로서 판매되는 경우에서,
· 구운 제품에서,
· 시리얼에 분무식으로 사용하는 경우에서,
· 제제, 예를 들어, 정제, 겔탑, 캡슐제, 스프레이 등으로 사용하는 경우에서의 본 발명의 피타제를 비롯한 피타제를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 섭취한 식사로부터 칼로리 및 다량 영양소 및 미량 영양소가 신속하게 유리될 수 있도록 하는 영양 보충을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 과도한 활동 및 불연속적인 기간의 타락과 같은 스트레스가 많은 상황하에 있는 개체의 에너지 및 체력을 강화시켜 준다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 원하는 환경, 예를 들어, 군대 환경하에서의 안정성, 반감기, 및 운반성은 유지시켜 주면서 인간 소화관에서 효과적으로 작용할 수 있도록 최적화되고 제제화된 효소를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 제품의 맛 특징, 가용성, 저작성 및 개인 운송율을 증가시키기 위한 제제를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 칼슘, 글루코스, CaCl2와 같은 다른 성분들을 추가로 포함한다. 제제 중의 CaCl2는 유리된 포스페이트와 결합할 수 있고, 이로써 골 침착 및 체중은 증가하게 된다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 각각 단백질, 셀룰로스, 및 헤미셀룰로스 분해를 위한 예를 들어, 프로테아제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제와 같은 다른 효소로 이루어진 제제를 추가로 포함한다. 이러한 효소는 단백질 및 전분의 이용가능성을 개선시킬 수 있고, 추갈 철이 풍부한 식품으로부터의 철 흡수를 증가시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 글루코스 및 크실로스계 중합체, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 전분이 풍부할 뿐만 아니라, 아미노산 중합체, 단백질이 풍부한 식물 물질로부터 유래된 식품을 가수분해하는 효소를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 식품 중의 다량체 물질의 가수분해를 촉진시키는데, 즉, 예를 들어, 다당류를 단량체 당으로, 또는 단백질을 아미노산 부분으로 분해하는 것과 같이, 중합체를 단량체로 완전히 분해되는 것을 촉진시킨다. 따라서, 이러한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 통해 칼로리 및 영양가가 완전한 완전 식품, 음용수 또는 군용식을 실제 수득할 수 있다. 한 측면에서, 효소 보충은 안정한 효소, 예를 들어, 각종의 히드롤라제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 아밀라제, 리파제, 아미다제, 프로테아제 및 다른 효소를 사용하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되는 효소는 주변 소화관 조건을 견디어 낼 수 있으며, 즉, 위 프로테아제의 존재하의 낮은 pH에서도 안정성을 유지할 수 있다.
피타제의 산업상 용도
상기 기술한 용도 이외에도, 본 발명은 신규한 본 발명의 피타제의 용도를 비롯한, 피타제의 신규한 산업상 용도를 제공한다.
포스페이트 환경 오염 감소
한 측면에서, 본 발명은 폐기물 또는 퇴비 더미에 첨가하여 "환경" 피트산을 전환시키기 위한, 피타제(본 발명의 피타제 포함)를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 이는 오염을 감소시키고 영양소의 이용성은 증가시키고자 하는 목적으로 사용된다. 본 발명은 또한 피타제를 토양, 천연 또는 인공 수역(예를 들어, 호수, 연못, 우물, 퇴비 보유 연못 등), 시립 하수, 임의의 하수 폐수 등에 첨가하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명은 폐기물 또는 하수, 예를 들어, 동물 퇴비 중의 피테이트 수준을 감소시키기 위한 조성물 및 방법으로서, 여기서, 상기 동물은 유효량의 피타제, 예를 들어, 본 발명의 피타제를 함유하는 식이 보조제를 공급받는 것인 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 예시적인 적용은 포스페이트 환경 오염을 감소시키는 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 피트산을 분해하여 오염을 감소시키는 임의의 적용에 사용될 수 있다.
농업 및 식물 성장에의 적용
한 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 피타제를 식물, 예를 들어, 실내 화분용 화초를 위한 비료 또는 식물 영양제(예를 들어, MIRACLEGROW™)에 첨가하는 것과 같은, 농업상 적용, 또는 다른 식물 성장에의 적용을 위한 피타제(본 발명의 피타제 포함)를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 농업상의 적용을 위해 본 발명의 조성물 및 방법을 사용할 경우의 사용자로는 유기 농부를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 인이 부족한 임의의 토양에 피타제를 첨가하는 데, 또는 특정 농작물 또는 적용을 위해 인 보충을 필요로 하는 경우에 사용될 수 있다. 인 배출이 식물 성장에 도움을 주기 때문에, 본 발명의 조성물 및 방법은 그 안에 조류 또는 식물 물질을 포함하고 있는 임의의 것에 피타제를 첨가하는 데 사용될 수 있다.
제품
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 피타제를 포함하는 각종 제품을 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 식물 제품을 함유하는 샴푸, 로션 또는 비누와 같은 미용상의 적용을 위한 피타제(본 발명의 피타제 포함)를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 피타제(본 발명의 피타제 포함)를 포함하는 조성물 및 피타제를 고정화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 고정된 피타제는 방출 조절현 기전에 작용한다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명은 토양, 예를 들어, 점토, 실내 화분용 화초 등에 적용하기 위한 방출 조절형(지효성) 피타제 제제를 제공한다. 한 측면에서, 피타제를 비드, 예를 들어, 폴리소브 비드에 고정화된다. 이러한 비드가 예를 들어, 농작물 또는 실내 화분용 화초를 위해 토양으로 전달될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 방출 조절형(지효성) 피타제 제제는 식이 보충제 및 첨가제에 사용된다.
바이오연료 및 바이오매스 전환
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 피타제를 포함하는 연료, 예를 들어, 바이오연료를 제공하는 것을 비롯한, 본 발명의 하나 이상의 피타제를 사용하는 포함하는 연료, 예를 들어, 바이오연료 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 피타제를 사용하는 것을 포함하는, 바이오매스 전환 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 발효 또는 알콜 생산 공정, 예를 들어, 에탄올 생산에서 피타제(본 발명의 피타제 포함)를 포함하는 조성물, 및 피타제를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 바이오에탄올 및 가솔린의 혼합물로서 석유계 제품의 사용에 대한 효율적이고 지속적인 대체물 또는 부속물을 제공하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 천연 바이오매스 전환을 비롯한 화학적 순환 과정에 참여하는 본 발명의 효소를 발현시키는 유기체를 제공한다. 추가로, 피타제(예를 들어, 본 발명의 효소)와 하나 이상의 전분 분해 효소, 예를 들어, 아밀라제 또는 글루코아밀라제의 조합하면 전분으로부터의 에탄올 생산은 개선된다. 본 발명은 중요한 신규의 "바이오매스 전환" 및 대체 에너지 산업 공정을 가능하게 하는 가장 효율적인 효소를 발견하고 이를 활용하는 방법을 제공한다.
바이오매스 전환 및 청정 바이오 연료의 생산
본 발명은 바이오매스 또는 임의의 리그노셀룰로스 물질(예를 들어, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌을 포함하는 임의의 조성물)을 사료, 식품 및 화학 물질이외에도 연료(예를 들어, 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오프로판올, 바이오메탄올, 바이오디젤)로 가공시키는 것인, 효소(본 발명의 피타제) 및 항체를 비롯한 폴리펩티드, 및 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명의 효소는 바이오매스(예를 들어, 리그노셀룰로스 물질, 곡물 또는 종유) 중 소화되기 어려운 피트산(피테이트)을 분해함으로써 소화가능한 인을 유리시키며; 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 피타제는 바이오매스를 처리하거나 전처리하는 데 사용된다.
따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 석유계 제품 사용에 대한 효율적이고 지속적인 대체물 또는 부속물을 제공하기 위해 바이오연료의 생산 및/또는 가공에서 사용될 수 있고; 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 바이오 연료 - 예를 들어, 바이오메탄올, 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오프로판올, 바이오디젤 등을 생산하는 효소의 혼합물과 함께 사용될 수 있고; 디젤 연료, 가솔린, 등유 등에 첨가될 수 있다. 본 발명은 천연 바이오매스 전환을 비롯한 화학적 순환 과정에 참여하는 본 발명의 효소를 발현시키는 유기체를 제공한다. 한 측면에서, 전환용 효소 및 전환 방법은 다당류, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 중합체를 대사 가능한(예를 들어, 발효 가능한) 탄소 부분으로 탈중합화시키는 것과 관련된 효율적인 바이오매스 가공을 위한 효소 앙상블에서 사용된다. 본 발명은 중요한 신규의 "바이오매스 전환" 및 대체 에너지 산업 공정을 가능하게 하는 가장 효율적인 효소를 발견하고 이를 활용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 바이오에탄올, 바이오프로판올, 바이오부탄올, 바이오프로판올, 바이오메탄올 및/또는 바이오디젤 및 가솔린의 혼합물과 같은, 석유계 제품의 사용에 대한 효율적이고 지속적인 대체물 또는 부속물을 제공하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 천연 바이오매스 전환을 비롯한 화학적 순환 과정에 참여하는 본 발명의 효소를 발현시키는 유기체를 제공한다. 본 발명은 중요한 신규의 "바이오매스 전환" 및 대체 에너지 산업 공정을 가능하게 하는 가장 효율적인 효소를 발견하고 이를 활용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 물질, 예를 들어, 바이오매스 물질, 예를 들어, 셀로올리고당, 아라비노크실란 올리고머, 리그닌, 리그노셀룰로스, 크실란, 글루칸, 셀룰로스 및/또는 발효가능한 당을 포함하는 조성물을 가공하기 위한 것으로서, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 상기 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 본 발명의 방법, 효소 및 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 제공하는데, 여기서, 임의로 물질은 농작물(예를 들어, 밀, 보리, 감자, 지팽이풀, 포플러 나무)로부터 유래되거나, 식물 또는 사료 생산 부산물이거나, 리그노셀룰로스 폐기물이거나, 또는 식물 잔류물 또는 폐지 또는 폐지 제품이고, 임의로 식물 잔류물은 줄기, 잎, 외피, 껍질, 옥수수 또는 옥수수 자루, 옥수수대, 옥수수 섬유, 건초, 짚 (예를 들어, 볏짚 또는 밀짚), 사탕수수 바가스, 사탕무 펄프, 시트러스 펄프, 및 시트러스 껍질, 목재, 목재 간벌, 목재 칩, 목재 펄프, 펄프 폐기물, 목재 폐기물, 대팻밥 및 톱밥, 구성 및 파괴 폐기물 또는 부스러기(예를 들어, 목재, 대팻밥 및 톱밥), 및 임의로 폐지로는 버려지거나 사용된 복사 용지, 컴퓨터 인쇄 용지, 공책 종이, 메모지, 타자 용지, 신문, 잡지, 판지 및 제지 포장재, 및 재생지 재질을 포함한다. 추가로, 당, 전분, 및/또는 셀룰로스를 함유하는 다른 물질과 함께 도시 폐기물, 예를 들어, 시립 고체 폐기물의 종이 조각, 시립 목재 폐기물, 및 시립 녹색 폐기물이 사용될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 물질, 예를 들어, 바이오매스 물질을 가공함으로써 바이오알콜, 예를 들어, 바이오디젤, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올을 생산할 수 있다.
별법으로, 본 발명의 폴리펩티드는 바이오매스 식물 물질 또는 그의 공급 원료에서 발현될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 (본 발명의 효소에 의해 공정처리된) 전환된 리그노셀룰로스 물질을 채취하고, 그를 발효에 의해 및/또는 화학적 합성에 의해 연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤)로 제조하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 생산된 당은 발효되고/거나, 비발효성 생성물은 기화된다.
본 발명의 방법은 또한 본 발명의 효소를 사용함으로써 조류, 순 식물성 오일, 식물성 폐유, 동물성 지방 및 그리스(예를 들어, 우지, 라드, 및 황색 그리스), 또는 하수를 전환시키고, 이를 발효에 의해 및/또는 화학적 합성 또는 전환에 의해 연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤)를 제조하는 것을 포함한다.
본 발명의 효소(예를 들면, 유기체, 예로서, 미생물, 예를 들어, 진균, 효모 또는 박테리아가 제조하고, 일부 측면에서는 분비하는 본 발명의 재조합 효소)는 임의의 바이오매스 전환 공정 중 임의의 단계, 예를 들어, 임의의 한 단계, 여러 단계에서 사용되거나, 그에 포함/통합될 수 있거나, 모든 단계에, 또는 하기의 모든 바이오매스 전환 공정 방법에, 또는 이들 바이오연료 대체물 모두에 포함될 수 있다:
· 직접 연소: 직접 가열하여 물질을 태우는 것으로서 이는 가장 간단한 바이오매스 기술이며; 이는 바이오매스 공급원이 가까이에 있다면 매우 경제적일 수 있다.
· 열분해: 이는 산소 부재하의 열에 의한 바이오매스의 열적 분해이다. 한 측면에서, 바이오매스를 화씨 약 800 내지 1400도의 온도로 가열하지만, 연소를 돕도록 하는 산소는 도입시키지 않음으로써 기체, 연료 오일 및 목탄을 수득한다.
· 기화: 바이오매스을 사용하여 가열 또는 혐기성 분해를 통해 메탄을 생산할 수 있다. 일산화탄소와 수소의 혼합물인 혼합 가스는 바이오매스로부터 유래될 수 있다.
· 매립 가스: 이는 매립지에 매장된 쓰레기의 부패(혐기성 분해 )에 의해 생성된다. 유기 폐기물이 분해될 때, 이는 천연 가수의 주성분인, 대략 50%의 메탄으로 구성된 기체를 생성하게 된다.
· 혐기성 소화: 이는 유기 물질을 천연 가수의 주성분인, 메탄과 이산화탄소의 혼합물로 전환시킨다. 한 측면에서, 바이오매스 예를 들어, 폐수(하수), 퇴비, 또는 식품 공정 폐기물을 물과 혼합하고, 공기를 포함하지 않는 소화조에 공급한다.
· 발효
· 알콜 발효: 연료 알콜은 셀룰로스 매스 및/또는 전분을 당으로 전환시키고, 당을 알콜로 발효시킨 후, 알콜수 혼합물을 증류에 의해 분리함으로써 생산된다. 공급 원료, 예를 들어, 전용 농작물(예를 들어, 옥수수, 밀, 보리, 감자, 스위치그래스, 미스캔터스(Miscanthus), 포플러 나무), 농업 잔류물 및 폐기물(예를 들어, 볏짚, 옥수수대, 밀짚, 사탕수수 바가스, 왕겨, 옥수수 섬유, 사탕무 펄프, 시트러스 펄프, 및 시트러스 껍질), 삼림 폐기물(예를 들어, 활엽수 및 침엽수 간벌, 임목 작업으로부터의 활엽수 및 침엽수 잔류물, 대팻밥, 및 톱밥), 도시 폐기물(예를 들어, 시립 고체 폐기물의 종이 조각, 시립 목재 폐기물, 시립 녹색 폐기물), 목재 폐기물(예를 들어, 제재소 폐기물, 펄프 제조 공장 폐기물, 구성 폐기물, 파괴 폐기물, 대팻밥, 및 톱밥), 및 당, 전분, 및/또는 셀룰로스를 함유하는 폐지 또는 다른 물질은 당으로 전환된 후, 효모를 통한 발효에 의해 알콜로 전환될 수 있다. 별법으로, 당을 함유하는 물질은 직접 발효에 의해 직접 알콜로 전환될 수 있다.
· 에스테르교환: 오일을 바이오디젤로 전환시키는 예시적인 반응을 에스테르교환이라고 명명한다. 에스테르교환 공정은 알콜(예로서, 메탄올)을, 식물성 오일, 동물성 지방, 또는 재생 그리스에 함유되어 있는 트리글리세리드 오일과 반응시켜 지방산 알킬 에스테르(바이오디젤) 및 글리세린을 형성한다. 상기 반응은 열 및 강염기 촉매, 예로서, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 필요로 한다.
· 바이오디젤: 바이오디젤은 식물성 오일, 동물성 지방, 또는 재생 그리스로부터 제조된 지방산 알킬 에스테르의 혼합물이다. 바이오디젤의 순수한 형태는 차량용 연료로서 사용될 수 있지만, 바이오디젤은 보통 디젤 사용 차량으로부터 생성된 미립자, 일산화탄소, 탄화수소 및 독성 기체의 수준을 감소시켜 주는 석유 디젤 첨가제로서 사용된다.
· 가수분해: 이는 본 발명의 효소에 의해 촉진되는, 화합, 예를 들어, 바이오매스, 예를 들어, 리그노셀룰로스 물질의 가수분해를 포함한다.
· 열병합: 이는 단일 연료 및 설비를 사용하여 1 초과 형태의 에너지를 동시에 생산하는 것이다. 한 측면에서, 바이오매스 열병합은 열병합이 열과 전기, 둘 모두를 생산하지 때문에 바이오매스 발생보다 더욱 큰 발전 가능성을 가지고 있다.
한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 임의의 유기 물질, 예를 들어, 바이오매스, 예를 들어, 임의의 농작물 또는 다른 재생 공급 원료, 농업 잔류물 또는 동물 배설물을 비롯한 식물 및 동물 유래의 조성물, 또는 시립 폐기물 및 산업 폐기물의 유기 성분들, 또는 구성 및 파괴 폐기물 또는 부스러기, 미생물, 예를 들어, 조류 또는 효모로부터 연료, 예를 들어, 바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤을 생산하기 위해 다른 효소, 예를 들어, 히드롤라제 또는 셀룰로스분해 활성을 가진 효소, 예를 들어, 글루카나제, 엔도글루카나제, 만나제 및/또는 다른 효소와 함께 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 리그노셀룰로스 바이오매스를 연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤)로 전환시키는 공정에 사용되거나, 다르게는 바이오물질을 가수분해하거나 분해시켜 이들을 바이오연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤)로서 사용될 수 있도록 하는 공정에 사용되거나, 바이오매스가 연료로 보다 용이하게 처리될 수 있도록 하는 공정에 사용된다.
대안적 측면에서, 본 발명의 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 비롯한 본 발명의 폴리펩티드는 알콜(예를 들어, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 메탄올)을 식물성 오일, 동물성 지방 또는 재생 그리스에 함유되어 있는 트리글리세리드 오일과 반응시켜 지방산 알킬 에스테르(바이오디젤) 및 글리세린을 형성하는 에스테르교환 공정에 사용된다. 한 측면에서, 바이오디젤은 대두유 또는 재생 쿠킹 오일로부터 제조된다. 동물성 지방, 기타 식물성 오일, 및 기타 재생 오일 또한 그의 가격과 이용가능성에 따라 바이오디젤을 생산하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 모든 종류의 지방과 오일 혼화물이 본 발명의 바이오디젤 연료를 생산하는 데 사용된다.
본 발명의 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 비롯한 본 발명의 효소는 또한 글리세린 정련에도 사용될 수 있다. 글리세린 부산물은 미반응 촉매와 산에 의해 중화되는 비누를 함유한다. 물 및 알콜이 제거되면 50% 내지 80%의 조 글리세린이 생산된다. 남은 오염 물질은 미반응 지방 및 오일이 포함되어 있고, 이는 본 발명의 폴리펩티드를 사용함으로써 공정처리될 수 있다. 본 발명의 바이오디젤 대규모 공장에서 글리세린은 약제 및 화장품 산업용으로서 추가로 99% 이상의 고순도로 정제될 수 있다.
본 발명의 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 비롯한 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 제조된 연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤)는 연소 특징을 개선시키는 데 연료 함산소물과 함께 사용될 수 있다. 산소를 첨가하면 보다 완전한 연소가 일어나고, 이를 통해 일산화탄소의 방출은 감소하게 된다. 석유 연료를 바이오연료(예를 들어, 본 발명의 연료)로 대체할 때 얻게 되는 또 다른 환경적 이점이 된다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 제조된 바이오연료는 가솔린과 함께 혼화되어 E10 혼화물(약 5% 내지 10%의 에탄올 및 약 90% 내지 95% 가솔린)을 형성할 수 있지만, 이는 이보다 고농도, E85로 사용될 수 있거나, 그의 순수한 형태로 사용될 수 있다. B100(순수한 바이오디젤) 이하로 다른 혼화 수준이 사용될 수 있기는 하지만, 본 발명의 조성물 및/또는 방법을 사용하여 제조된 바이오연료는 석유 디젤과 함께 혼화되어 B20 혼화물(20% 바이오디젤 및 80% 석유 디젤)을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 바이오매스, 예를 들어, 식물 유래 공급원, 예를 들어, 리그노셀룰로스 바이오매스를 포함하는 조성물로부터 바이오연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤 포함)를 제조하기 위해 본 발명의 효소를 사용하는 방법을 제공한다. 바이오매스 물질은 농작물로부터, 식품 또는 사료 생산시의 부산물로서, 또는 리그노셀룰로스 폐기물, 예를 들어, 식물 잔류물, 폐지, 또는 구성 및 파괴 폐기물 또는 부스러기로서 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드로 처리하는 데에 적합한 식물 공급원 또는 식물 잔류물의 예로서는, 켈프, 조류, 곡류, 종자, 줄기, 잎, 외피, 껍질, 옥수수 자루, 옥수수대, 짚, 사탕수수, 사탕수수 바가스, 풀(예를 들어, 인디안 풀, 예로서, 소르카스트럼 누탄스(Sorghastrum nutans); 또는 스위치그래스, 예를 들어, 패니컴(Panicum) 종, 예로서, 패니컴 비르게텀(Panicum virgatum) 등 뿐만 아니라, 목재, 목재 칩, 목재 펄프 및 톱밥을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드로 처리하는 데에 적합한 폐지의 일례로는 버려지는 복사 용지, 컴퓨터 인쇄 용지, 공책 종이, 메모지, 타자 용지 등과, 신문, 잡지, 판지 및 제지 포장재를 포함한다. 구성 및 파괴 폐기물 또는 부스러기의 일례로는 목재, 목재 토막, 대팻밥 및 톱밥을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 비롯한 효소, 및 본 발명의 방법은 바이오매스로부터 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 및/또는 디젤을 생산하는 보다 "전통적인" 방법, 예를 들어, 반응기 내에서 건조된 리그노셀룰로스 물질에 강산의 희석 용액과 금속 염으로 구성된 촉매로 처리하여 리그노셀룰로스 물질을 가수분해하는 단계를 포함하는 방법과 함께 사용될 수 있으며; 이는 셀룰로스 가수분해 활성화 에너지, 또는 반응 온도를 강하시킴으로써 당을 더 높은 수율로 수득할 수 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,660,506호 및 제6,423,145호를 참조한다.
본 발명의 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 비롯한 본 발명의 효소를 사용하는 것을 도입한 또 다른 예시적인 방법은 셀룰로스를 글루코스로 거의 탈중합화시키지 않으면서, 헤미셀룰로스를 주로 탈중합화시키도록 선택된 온도 및 압력에서, 헤미셀룰로스, 셀룰로스 및 리그닌을 함유하는 리그노셀룰로스 물질을 사용하여 수성 매질 중에서 가수분해의 첫번째 단계를 진행시킴으로써, 이 헤미셀룰로스, 셀룰로스 및 리그닌을 함유하는 리그노셀룰로스 물질을 가수분해시키는 단계를 포함한다. 이 단계를 통하여, 헤미셀룰로스와, 셀룰로스 및 리그닌을 함유하는 고체상을 탈중합화시켜 수득한 용해된 단당류를 액체 수성상이 함유하고 있는 슬러리를 얻을 수 있다. 가수분해의 두번째 단계는 적어도 대부분의 셀룰로스가 탈중합화되는 조건을 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 단계를 통하여 셀룰로스의 용해된/가용성 탈중합화 생성물을 함유하는 액체 수성상을 얻을 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,536,325호를 참조한다. 본 발명의 효소(본 발명의 혼합물, 또는 효소 "칵테일")는 이러한 대표적인 공정 중의 임의의 단계에 첨가될 수 있다.
본 발명의 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 비롯한 본 발명의 효소를 사용하는 것을 도입한 또 다른 예시적인 방법은 약 0.4% 내지 2%의 강산을 사용하는 묽은 산 가수분해 방법 중 하나 이상의 단계에 의해 리그노셀룰로스 함유 바이오매스 물질을 가공하는 단계; 및 산으로 가수분해된 바이오매스 물질의 미반응 고체 리그노셀룰로스 성분을 알칼리성 탈리그닌 처리법으로 처리하여, 생분해 열가소성 물질 및 유도체에 대한 전구체를 수득하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,409,841호를 참조한다. 본 발명의 효소는 이러한 예시적인 공정 중 임의의 단계에 첨가될 수 있다.
본 발명의 효소 혼합물 또는 "칵테일"을 비롯한 본 발명의 효소를 사용하는 것을 도입한 또 다른 예시적인 방법은 예비 가수분해 반응기 내에서 리그노셀룰로스 물질을 예비 가수분해시키는 단계; 산성 액체를 고체 리그노셀룰로스 물질에 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 이 혼합물을 반응 온도로 가열하는 단계; 리그노셀룰로스 물질이, 리그노셀룰로스 물질로부터 유래한 리그닌을 적어도 약 20% 함유하는 용해된 부분과 셀룰로스를 함유하는 고체 분획으로 분별시키기에 충분한 시간 동안 반응 온도를 유지시키는 단계; 반응 온도 또는 이에 가까운 온도에 있을 때 고체 분획으로부터 용해된 부분을 제거하는 단계(여기서, 고체 분획 중 셀룰로스는 효소 분해가 더욱 잘 이루어지게 만들어짐); 및 용해된 부분을 회수하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,705,369 호를 참조한다. 본 발명의 효소는 이러한 예시적인 공정의 임의의 단계에 첨가될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 효소 또는 방법을 사용하여 제조된 연료 등급의 알콜과 조합된 액체 탄화수소를 주성분으로 하는 모터 연료 조성물(예를 들어, 스파크 점화 모터용 연료 조성물)을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 효소를 사용하여 제조된 연료로서는 예를 들어, 석탄 가스 액체 또는 천연 가스 액체 에탄올 혼화물을 포함한다. 한 측면에서, 보조 용매는 바이오매스 유래 2 메틸테트라히드로푸란(MTHF)이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,712,866호를 참조한다.
한 측면에서, 리그노셀룰로스를 효소적으로 분해하는 방법, 예를 들어, 리그노셀룰로스 물질로부터 바이오연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤 포함)를 생산하는 방법은 또한 바이오매스 물질을 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,333,181호를 참조한다.
또 다른 측면에서, 셀룰로스 기질로부터 바이오연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤 포함)를 생산하는 방법은 (예를 들어, 반응 용기, 예를 들어, 반연속 고체 공급 생체반응기내) 셀룰로스 기질, 본 발명의 효소 및 발효제를 포함하는 슬러리 형태로 반응 혼합물을 제공하는 단계를 포함하고, 반응 혼합물을 발효 반응을 개시하고 유지시키는데 충분한 조건 하에서 반응한다(미국 특허 출원 번호 제20060014260호에 기재). 한 측면에서, 실험상 또는 이론상의 계산을 통해 최적의 공급 빈도를 결정할 수 있다. 한 측면에서, 최적화된 공급 빈도에 따라 일정 간격으로 반응 용기에 추가량의 셀룰로스 기질 및 효소를 제공한다.
본 발명의 바이오연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤 포함)를 생산하는 하나의 예시적인 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 제20050069998호; 제20020164730호에 기재되어 있고; 한 측면에서 리그노셀룰로스 바이오매스를 (예를 들어, 15-30 mm의 크기로) 분쇄하는 단계; 수득한 생성물을 반응기에서 1분 내지 10분의 시간 동안 (예를 들어, 190℃-230℃의 온도에서) 증기 노출 전처리하는 단계; 사이클론에서 전처리된 물질 또는 제조 관련 생성물을 수집하는 단계; 및 필터 프레스에서 여과하여 액체 및 고체 분획을 분리하여 발효 침전물에 고체 분획을 도입시키고, (예를 들어, 시트르산 염 완충액(pH 4.8)에 용해된) 본 발명의 하나 이상의 효소, 예를 들어, 셀룰라제 및/또는 베타 글루코시다제 효소를 가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 효소를 사용함으로써, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올또는 바이오프로판올을 포함하는 본 발명의 바이오연료(바이오알콜, 예를 들어, 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 또는 바이오프로판올, 또는 바이오디젤 포함)를 생산하는 또 다른 예시적인 방법은 적어도 헤미셀룰로스 및 셀룰로스를 포함하는 리그노셀룰로스 공급 원료를 함유하는 출발 물질을 전처리하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 상기 출발 물질로는 감자, 대두(평지씨), 보리, 호밀, 옥수수, 귀리, 밀, 비트 또는 사탕수수 또는 기타 성분 또는 폐기물 또는 식품 또는 사료 생산에 따른 부산물을 포함한다. 출발 물질("공급 원료")은 식물의 섬유 구조를 파괴하여 헤미셀룰로스 및 셀룰로스를 적어도 부분적으로 가수분해하는 조건에서 반응한다. 파괴 조건으로서는 예를 들어, 출발 물질을 약 5초 내지 60분 동안 평균 온도 180℃ 내지 270℃ 및 pH 0.5 내지 2.5에 두거나; 또는 약 5초 내지 120초 동안 온도 220℃ 내지 270℃ 및 pH 0.5 내지 2.5 에 두는 경우 또는 등가의 경우를 포함할 수 있다. 이로써, 본 발명의 효소, 예를 들어, 셀룰라제에 의해 분해될 수 있는 순응성이 증가한 공급 원료를 얻게 된다. 미국 특허 번호 제6,090,595호를 참조한다.
리그노셀룰로스 물질의 가수분해에서 본 발명의 효소를 사용하기 위한 예시적인 조건으로는 온도 약 30℃ 내지 48℃ 및/또는 pH 약 4.0 내지 6.0에서의 반응을 포함한다. 다른 예시적인 조건으로서는 온도 약 30℃ 내지 60℃ 및 pH 약 4.0 내지 8.0인 경우를 포함한다.
예를 들어, PCT 출원 번호 WO0043496 및 WO8100857에 기술되어 있는 바와 같이, 글루카나제(또는 셀룰라제), 만나제, 크실라나제, 아밀라제, 크산타나제 및/또는 글리코시다제, 예를 들어, 셀로비오히드롤라제, 만나제 및/또는 베타 글리코시다제는 바이오매스를 연료로 전환시키는 데, 및 에탄올을 생산하는 데 사용될 수 있다. 글루카나제(또는 셀룰라제), 만나제, 크실라나제, 아밀라제, 크산타나제 및/또는 글리코시다제, 예를 들어, 셀로비오히드롤라제, 만나제 및/또는 베타 글리코시다제를 피타제(예를 들어, 본 발명의 효소)와 조합하여 사용함으로써 발효 가능한 당 및 연료 에탄올로 전환될 수 있는 글루칸 함유 바이오매스를 생산할 수 있다. 아밀라제, 글루코아밀라제, 풀라나제, 글루코이소머라제, 알파 글루코시다제 등을 피타제(예를 들어, 본 발명의 효소)와 조합하여 사용함으로써 전분을 발효 가능한 당 및 연료 에탄올로 전환시킬 수 있다. PCT 출원 번호 WO2005/096804를 참조한다.
주정박 가공
또 다른 측면에서, 본 발명의 효소는 "주정잔액박(DDS: distillers dried solubles)," "주정박(DDS: distillers dried grains)," "축합형 주정 잔액박(CDS: condensed distillers solubles)," "습식 주정박(DWG: distillers wet grains)," 및 "주정혼합박(DDGS: distillers dried grains with solubles)"을 처리/가공 처리하는 데 사용될 수 있고; 주정박은 증류 공정의 시리얼 부산물일 수 있고, 이는 잔액박을 포함할 수 있다. 이 공정은 예를 들어, 가금류, 소, 돼지 및 다른 가축용의 사료용으로 사용될 수 있는 건식 분쇄형의 식물 부산물을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 효소는 곡물의 임의의 공급원, 예를 들어, 양조자로부터의 전통적인 공급원, 또는 별법으로, 에탄올 생산 공정(공장, 밀 등)으로부터의 것을 사용하는 공정을 비롯한, 임의의 증류 공정의 부산물인 곡물, 예를 들어, 시리얼을 처리/가공처리하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 효소는 증류기로부터의 매시를 건조시켜 처리/가공처리하는 데 사용될 수 있다; 이어서, 상기 매시는 다양한 목적으로, 예를 들어, 가축, 특히, 반추 동물용 여물로서 사용될 수 있고; 따라서, 본 발명은 가축, 특히, 반추 동물용 여물, 및 본 발명의 피타제를 포함하는 효소 가공처리된 여물을 가공처리하는 방법을 제공한다.
"주정잔액박(DDS)," "주정박(DDS)," "축합형 주정 잔액박(CDS)," "습식 주정박(DWG)," 및 "주정혼합박(DDGS)"을 가공하는 데 본 발명의 피타제는 단독으로, 또는 다른 효소와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 피타제는 도 10에 도시된 알콜 생산 공정 중 임의의 단계에서 사용될 수 있다. 본 발명의 피타제는 임의의 연료, 또는 잠재 연료 중에 존재하는 인, 예를 들어, "주정잔액박(DDS)," "주정박(DDS)," "축합형 주정 잔액박(CDS)," "습식 주정박(DWG)," 및 "주정혼합박(DDGS)"에서 발견되는 인의 생체이용성을 증가시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [C. Martinez Amezcua, 2004 Poultry Science 83:971-976]).
주정, 또는 음용가능한 알콜 생산
본 발명의 피타제는 또한 (바이오연료를 생산하기 바이오매스 가공에서 사용하는 것 이외에도) 알콜 생산-"주정" 알콜, 예를 들어, 맥주, 위스키 생산을 위해 주정박을 가공하는 데에도 사용될 수 있다. 본 발명의 피타제는 곡물, 예를 들어, 옥수수 가공을 위한 에탄올 공장에서 사용될 수 있다. 먼저 곡물(예를 들어, 옥수수)를 거친 조도로 분쇄하고, 뜨거운 물에 첨가함으로써 주정박을 제조할 수 있다. 냉각시킨 후, 효모를 첨가하고, 수일에서 1주일 동안 혼합물을 발효시킨다. 발효 후 남아있는 고체는 주정박이다. 본 발명의 피타제가 하기 공정의 임의의 단계에서 사용될 수 있다.
제제
본 발명은 피타제, 예를 들어, 본원에 기술되어 있는 피타제를 포함하는 신규한 제제, 및 본 발명의 신규한 피타제를 포함하는 제제를 비롯한 피타제 제제를 제공한다. 본 발명의 피타제는 단독으로, 또는 피타제들의 혼합물 또는 피타제와 다른 효소, 예를 들어, 크실라나제, 셀룰라제, 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 또는 산화 환원 효소, 예를 들어, 락카제, 퍼옥시다제, 카탈라제, 옥시다제, 또는 리덕타제의 혼합물로서 사용될 수 있거나, 제제화될 수 있다. 이는 고체 형태, 예를 들어, 분제, 동결건조된 제제, 과립제, 정제, 바, 결정, 캡슐제, 환제, 펠릿, 또는 액체 형태, 예를 들어, 수용액, 에어로졸, 겔제, 패스트, 슬러리제, 수성/유성 에멀젼, 크림제, 캡슐제, 또는 소포성 또는 미셀 현탁제로 사용되고 제제화될 수 있다. 본 발명의 제제는 하기 성분: 폴리올, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐알콜, 글리세롤, 당, 예를 들어, 수크로스, 소르비톨, 트레할로스, 글루코스, 프럭토스, 말토스, 만노스, 겔화제, 예를 들어, 구아 검, 카라기난, 알기네이트, 덱스트란, 셀룰로스 유도체, 펙틴, 염, 예를 들어, 염화나트륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화아연, 황산아연, 지방산 및 지방산 유도체의 염, 금속 킬레이터, 예를 들어, EDTA, EGTA, 시트르산 나트륨, 항미생물제, 예를 들어, 지방산 또는 지방산 유도체, 파라벤, 소르베이트, 벤조에이트, 효소, 예를 들어, 프로테아제의 영향을 차단하기 위해 추가의 조절화 화합물, 벌크 단백질, 예를 들어, BSA, 밀 가수분해물, 보레이트 화합물, 아미노산 또는 펩티드, 적절한 pH 또는 온도 조절화 화합물, 유화제, 예를 들어, 비이온성 및/또는 이온성 계면활성제, 산화 환원제, 예를 들어, 시스틴/시스테인, 글루타티온, 산화된 글루타티온, 환원 또는 항산화 화합물, 예를 들어, 아스코르브산, 왁스 또는 오일, 또는 분산제 중 임의의 것 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 효소 안정성을 개선시키기 위해 가교 및 단백질 변형, 예를 들어, 페길화, 지바산 변형, 글리코실화 또한 사용될 수 있다.
대사 파라미터 측정
본 발명의 방법은 세포의 유전 조성을 변화시켜 새로운 표현형을 가진 신규한 세포종을 발생시키기 위한 세포의 전체 세포 진화 또는 전체 세포 조작을 포함하며, 상기 유전 조성은 본 발명의 핵산을 세포에 첨가하여 변형된다. 새로운 표현형을 검출하기 위해서, "실시간" 또는 "온라인" 시간 틀에서 변형된 세포의 하나 이상의 대사 파라미터를 세포 중에서 모니터링한다. 한 측면에서, 다수의 세포, 예를 들어, 세포 배양물을 "실시간" 또는 "온라인"으로 모니터링한다. 한 측면에서, 다수의 대사 파라미터를 "실시간" 또는 "온라인"으로 모니터링한다.
대사 플럭스 분석(MFA: metabolic flux analysis)은 공지된 생화학 프레임워크에 기초한다. 1차 독립성 대사 매트릭스를, 세포내 대사물질에 대한 질량 보존의 법칙과 가성-정상 상태 가설(PSSH: pseudo-steady state hypothesis)을 기초로 설정한다. 본 발명의 수행에 있어서,
·모든 경로 기질, 생성물 및 중간 대사물질의 실체,
·경로 대사물질을 상호전환시키는 모든 화학 반응의 실체 및 경로 반응의 화학 양론,
·반응을 촉진하는 모든 효소의 실체, 효소 반응 속도론,
·경로 성분간의 조절 상호작용, 예를 들어, 알로스테릭 상호작용, 효소-효소 상호작용 등,
·효소의 세포내 구획화 또는 효소의 임의의 다른 초분자 조직화, 및
·대사물질, 효소 또는 효과기 분자 또는 이들의 이동에 대한 확산 배리어의 임의의 농도 구배의 존재를 비롯한 대사 네트워크가 설정된다.
제공된 종에 대해 대사 네트워크가 일단 정해지면, 온라인 대사체(metabolome) 데이타가 이용가능한 경우 행렬 개념에 의한 수학적 프리젠테이션을 도입하여 세포내 대사 플럭스를 추정할 수 있다.
대사 표현형은 세포 내의 전체 대사 네트워크의 변화에 좌우된다. 대사 표현형은 환경 조건, 유전 조절, 발육 상태 및 유전자형 등에 대한 경로 이용 변화에 좌우된다. 본 발명의 한 측면에서, 온라인 MFA 계산 후에, 세포의 동적 양상, 표현형 및 기타 성질을 경로 이용 조사로 분석한다. 예를 들어, 효모 발효 과정에서 글루코스 공급이 증가하고 산소가 감소된다면, 호흡 경로 이용이 감소 및/또는 정지되고, 발효 경로 이용이 우위를 차지할 것이다. 경로 분석 후에 세포 배양물의 생리학적 상태의 조절이 가능해진다. 본 발명의 방법은 기질 공급, 온도, 유발인자의 사용 등을 변화시키는 방법, 세포의 생리적 상태를 제어하여 바람직한 방향으로 이동시키는 방법을 결정하여 발효 조작법을 결정하는 것을 보조할 수 있다. 본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서, MFA 결과를 전사체 및 단백체 데이타와 비교하여 대사 조작 또는 유전자 셔플링 등에 대한 프로토콜 및 실험을 고안할 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서, 세포의 새로운 특성 또는 개선된 특성을 비롯한 임의의 변형되거나 또는 신규한 표현형을 부여하거나 검출할 수 있다. 대사 또는 성장의 임의의 측면을 모니터링할 수 있다.
mRAN 전사체의 발현 모니터링
본 발명의 한 측면에서, 조작된 표현형은 세포의 신규 전사체의 형성 또는 mRNA 전사체의 발현 증가나 감소를 포함한다. mRNA 전사체 또는 메세지를 임의의 공지된 방법, 예를 들어, 노던 블롯, 정량적 증폭 반응, 어레이에 대한 하이브리드화 등으로 검출 및 정량할 수 있다. 정량 증폭 반응은, 예를 들어, 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 즉 RT-PCR; 정량적 실시간 RT-PCR, 즉 "실시간 동적 RT-PCR"을 비롯한 정량적 PCR을 포함한다(예를 들어, 문헌 [Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114: 313-318; Xia (2001) Transplantation 72: 907-914] 참조).
본 발명의 한 측면에서, 조작된 표현형은 상동성 유전자의 발현을 넉 아웃시켜 형성한다. 유전자의 코딩 서열 또는 하나 이상의 전사 제어 성분, 예를 들어, 프로모터 인핸서를 넉 아웃시킬 수 있다. 따라서, 전사체의 발현을 완전히 제거하거나 또는 단지 감소시킬 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 조작된 표현형은 상동성 유전자의 발현 증가를 포함한다. 이러한 발현 증가는, 양성 제어 성분의 돌연변이를 유발하거나 또는 시스 또는 트랜스로 작용는 전사 조절 성분을 비롯한 음성 제어 성분을 넉 아웃시켜 실시할 수 있다.
앞서 상세히 설명한 바와 같이, 하나 이상의 세포 전사체 또는 세포 전사체 전부는, 어레이 상에 고정된 핵산으로의 하이브리드화로, 세포의 전사체, 또는 세포 전사체에 상보성이거나, 또는 이를 나타내는 핵산을 포함하는 샘플을 하이브리드화시키 측정할 수 있다.
폴리펩티드, 펩티드 및 아미노산 발현의 모니터링
본 발명의 한 측면에서, 조작된 표현형은 폴리펩티드의 발현 증가나 감소, 또는 세포에서의 새로운 폴리펩티드의 형성을 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 핵 자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance), 분광광도 방사선사진(단백질 방사성표지), 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막 크로마토그래피(TLC: thin layer chromatography), 고확산 크로마토그래피, 각종 면역학적 방법, 예를 들어, 면역침전, 면역확산, 면역전기영동, 방사성면역분석(RIA: radioimmunoassay), 효소 결합형 면역흡착 분석(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 면역 형광 분석, 겔 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE), 항체를 이용한 염색, 형광 활성화된 세포 분류기(FACS: fluorescent activated cell sorter), 열분해 질량 분광분석, 퓨리에-변환 적외선 분광분석, 라만 분광분석, GC-MS, 및 LC-정전분무 및 캡-LC-텐덤-정전분무 질량 분광분석 등으로 폴리펩티드, 펩티드 및 아미노산을 검출 및 정량할 수 있다. 미국 특허 제6,057,103호에 개시된 방법 및 그의 변형예를 이용하여 신규한 생활성을 스크리닝할 수 있다. 또한, 하기에 상세히 개시된 바와 같이, 하나 이상 또는 전체 세포 폴리펩티드를 단백질 어레이로 측정할 수 있다.
균일하게 13C-표지된 탄소원 화합물 및 미표지된 탄소원 화합물의 혼합물을 생체반응 네트워크에 공급하여 생합성으로 유도된 단백질원성 아미노산의 단편 13C 표지화를 모니터링할 수 있다. 생성된 표지화 패턴 분석으로 네트워크 토폴로지의 특성을 이해할 수 있으며, 아미노산의 대사 플럭스 비율을 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Szyperski (1999) Metab. Eng. 1: 189-197]을 참조한다.
하기 실시예는 본 발명을 한정하는 것이 아니라 예시하는 것이다. 실시예에 개시된 절차들은 본 발명의 특정 측면들을 실시하는 데 사용될 수 있는 전형적인 것들이지만, 당업계에 공지된 다른 절차를 사용할 수 있다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 예시적인 피타제의 활성에 대한 특징 규명
본 실시예는 모체 피타제 서열 번호 2의, 서열 변형이 있는 본 발명의 폴리펩티드(소위 "진화된" 피타제)의 피타제 활성, 및 예시적인 피타제 활성 분석법에 대한 특징 규명을 기술한다. 본 피타제 활성 분석법을 사용하여 폴리펩티드가 청구하는 본 발명의 범주내 포함될 정도의 충분한 활성을 가지고 있는지 여부를 측정할 수 있다.
본 발명의 GSSM으로 변형된 핵산 서열을 발현시킴으로써 본 발명의 폴리펩티드를 생성한 후, "진화된" 피타제 폴리펩티드-본 연구에서 단 하나의 잔기 돌연변이를 가진 예시적인 종-를 정제한 후, 30분 동안 다양한 온도에서 열 처리하였다(pH 7.0, 0.01% 트윈). 열 처리 단계 후, 형광 기질(180 ㎕) 4 mM DiFMUP(pH 5.5)를 사용하여 샘플(20 ㎕)을 분석하였다. 보유율을 각각의 상응하는 비처리 샘플의 보유율과 비교하였다. 결과는 도 1에 도시되어 있다.
또 다른 연구에서, "조합된" 단일 돌연변이를 포함하는 본 발명의 "진화된" 피타제, 즉, 다중 돌연변이를 포함하는 피타제를 LBCARB100™(LBcarb100) 중에서 30℃하에 밤새도록 성장시켰다. 100 ㎕의 각 배양물(조합된 돌연변이체)을 72℃ 내지 100℃에서 써모사이클러 상에서 열 처리하였다. 20 ㎕의 열 처리된 배양물을 180 ㎕의 4 mM DiFMUP(pH 5.5)와 혼합하였다. 도 2에 요약되어 있는 바와 같이, 보유율을 각각의 상응하는 비처리 샘플의 보유율과 비교하였다. 결과는 도 1에 도시되어 있다. 도 3에 도시되어 있는 표는 도 2의 그래프를 작성하는 데 사용된 데이터(소수점 아래 둘째 자리에서 반올림해 얻은 첫째 자리까지의 근사값)를 도표로 요약해 놓은 것이다.
샘플 1부터 21까지는 도 5에 차트로 도시되어 있는 바와 같이, 모체 서열 번호 2의 "조합된" 단일 돌연변이에 상응하는 것이며; "진화된" 피타제 10번은 GSSM에 의해 도입된 것이 아닌(서열 번호 2로부터의) 서열 잔기 변형을 가지고; 상기 돌연변이는 우연한 기회에 의해 도입된 것이며, 이는 본 발명의 예시적인 피타제의 열 안정성과 관련이 있을 수도 있거나, 또는 어떤 관련성도 없을 수 있다는 것에 주의한다. 또한, **는 표시된 예시적인 피타제 19, 20 및 21 C 말단 히스티딘 (6xHis) 태그(-RSHHHHHH)를 표시하는 것에 주의한다. 도 5는 본원에서 상세히 기술하는 바, 모체 서열 번호 2에 대한 다중 잔기 변형을 가진 예시적인 피타제를 도시한 것이다. 도 6은 본원에서 상세히 기술하는 바, 모체 서열 번호 2에 대한 단일 잔기 변형을 가진 예시적인 피타제를 도시한 것이다. 도 6은
도 7은 형광 기질 4-메틸움벨리페릴 포스페이트(MeUMB-포스페이트, 그의 구조 또한 도시되어 있다)를 사용한 본 발명의 예시적인 피타제 분석법을 개략적으로 도시한 것으로, 하기와 같다: (i) 20분 동안, 72℃, pH 4.5, 및 80℃, 생리학상 pH에서 피타제에 시험적 열 처리를 수행하고; (ii) 37℃, pH 4.5에서 잔여 활성을 시험하였다:
· 높은 pH 및 낮은 pH, 들 모두에서의 잔여 활성을 측정하고,
· 열 처리 후 야생형에 대한 상대적인 잔여 활성을 계산하였다.
도 8는 역시 형광 기질 MeUMB-포스페이트를 사용한 본 발명의 또 다른 예시적인 피타제 분석법을 개략적으로 도시한 것으로, 하기와 같다: (i) 30분 동안, 86℃, pH 5.5에서 피타제에 시험적 열 처리를 수행하고; (ii) 37℃, pH 4.5에서 잔여 활성을 시험하였다:
· 6X 변이체 대조군에 대한 상대적인 잔여 활성을 측정하고,
· 히트를 선택하고, 보다 높은 정도로 엄격한 조건에서 재분석하여 상위의 변이체를 선택하였다.
상기 분석법을 사용하여(서열 번호 1의) GSSM 변이체가 코딩하는 폴리펩티드의 피타제 활성에 대해 분석함으로써 상기 GSSM 변이체의 라이브러리를 스크리닝하였다. 도 9는 (도 8에 도시되어 있는 것과 같은) 이러한 라이브러리 스크린에 대한 프로토콜을 개략적으로 도시한 것이며, 여기서, 스크리닝된 라이브러리의 크기는 24,576개의 변이체가 된다.
실시예 2: 내열성이 증가되고 위내 불안정성이 증가된 피타제 개발
본 실시예는 모체 피타제 서열 번호 2의, 추가의 서열 변형이 있는 본 발명의 폴리펩티드의 피타제 활성에 대한 개발 및 특징 규명을 기술한다. 본원에 기술된 진화된 피타제는 식물 발현 및 광범위한 상업화를 위해 최적화된 것이다. 피타제는 모체 피타제(서열 번호 2, 서열 번호 1에 의해 코딩된 것)와 비교하여 더 우수하거나, 또는 그와 동일한 내열성을 가졌고, 감소된 시험관내 위내 안정성(증가된 위내 불안정성)을 가졌다.
주형 선택:
선택된 GSSM 골격은 내열성 및 SGF 분해의 증거, 이 둘 모두를 가진다. (상기 실시예 1, 및 하기 표 3에 기술되어 있는 바와 같은) 13개의 내열성 피타제 분자의 SGF 특성을 테스트함으로써 평가를 시작하였다. 정제된 피타제에 대한 SGF 데이터는 단일 부위 내열성 모체 피타제 돌연변이N159V(서열 번호 2-N159V)를 비롯한, 모든 내열성 변이체는 2시간 동안에 걸쳐 최소한의 분해만이 일어난 것으로서 매우 안정적이라는 것을 나타낸다.
종래 연구/문헌에서는 (균주 K12로부터의) E. 콜라이 피타제 appA 유전자(진뱅크 수탁 번호 M58708)가 모체 피타제(서열 번호 2)보다 SGF 분해 가능성이 더 크다고 제시한 바 있다. SGF 안정성 현상을 이해하기 위한 노력으로, appA와 모체 피타제(서열 번호 2) 사이의 5개의 중간체 변이체를 SGF 불안정성에 대해 조사하였다. 데이터는 내열성과 SGF 불안정성 사이에 강한 상관관계가 있다고 제시한다(도 11a 및 11b). 보다 중요하게, 10분 동안의 인큐베이션 후, 모체 피타제(서열 번호 2)와 1개의 아미노산이 상이한 appA -7X는 모체 피타제(서열 번호 2)보다 SGF 중에서의 활성이 ~10% 초과로 손실된 것으로 나타났다. 이러한 새로운 데이터는 서열 번호 2에서 1개의 단일 돌연변이 변화가 SGF 내성 변화에 영향을 줄 수 있으며, 보다 중요하게는, SGF 분석법에서 모체 피타제(서열 번호 2)와 차별화될 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 새로운 증거에 기초하여 SGF 진화에 대한 벤치마크 대조군으로서 appA-7X를 선택하고, 서열 번호 2는 진화에 대한 GSSM 골격으로서 선택하였다.
단백질 정제가 특징 규명 과정 중에서 중요한 부분이 되는 바, 서열 번호 2를 his-태그(서열 번호 2-HIS) 및 비his 태그(서열 번호 2) 분자, 둘 모두로서 평가하였다. 모체 피타제(서열 번호 2)의 정제된 his 태그 버전 및 비his 태그 버전, 둘 모두에 대해 SGF 분석법을 수행하였다. 2개의 다른 펩신 용량0.15 mg/mL 및 0.75 mg/mL)을 사용하여 SGF 분석법을 수행하였다. 다양한 시점(7.5, 15, 30, 60, 90, 및 120분)에서 잔여 활성을 측정하였다. SGF 프로파일에 있어 2가지 버전 사이에는 어떤 유의적인 차이도 없었다(도 12).
Figure 112011101934958-pct00010
펩신 용량 0.75 mg/mL 및 0.15 mg/mL를 사용하여 서열 번호 2와, 서열 번호 2-6x을 거쳐 얻은 변이체 서열 번호 2-N159V의 정제된 피타제 분획을 SGF 안정성에 대해 테스트하였다; 데이터는 제시하지 않았다. 다양한 시점(7.5, 15, 30, 60, 90, 및 120분)에서 잔여 활성을 측정하였다. 두 용량 모두 SGF 안정성에 있어 변이체 사이에는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다. 서열 번호 2는 두 용량 모두에서 SGF 안정성이 가장 작았다.
SDS-PAGE 분석에 의한 SGF 분석법: SDS-PAGE에 의해 표 3에 열거되어 있는 모든 변이체를 SGF 안정성에 대해 테스트하였다(데이터는 제시하지 않음). SDS-PAGE 겔을 심플리 블루™ 세이프스테인(Simply Blue™ SafeStain)으로 염색하였다. SGF 분석법에서, 서열 번호 2는 60분간에 걸쳐 변성이 이루어진 반면, 서열 번호 2-N159V 및 다른 변이체에서는 2시간의 기간에도 어떤 유의적인 분해도 나타나지 않았다.
N 글리코실화 제거:
종래 연구에서는 N 글리코실화가 SGF 안정성을 개선시킬 수 있다고 제안된 바 있다. 그러므로, SFG 안정성을 감소시키기 위해 모체 서열 번호 2 분자 상의 2개의 N 글리코실화 부위를 제거하는 포화 유도 돌연변이 유발(SDM)을 수행하였다. 첫번째 N 글리코실화 인식 부위는 161번 위치의 아스파라긴(N) 또는 163번의 트레오닌(T)를 임의의 다른 아미노산으로 변화시킴으로써 제거할 수 있었다. 두번째 N 글리코실화 인식 부위는 339번 위치의 N 또는 341번 위치의 T를 같은 방법으로 제거할 수 있었다.
원하는 코돈 변화를 가진 프라이머를 구성한 후, 프라이머 및 주형(모체 서열)을 사용하여 PCR을 이용함으로써 원하는 코돈 변화를 가진 새로운 주형을 형성하는 SDM을 수행하였다. SDM을 수행하는 동안, 다른 19개의 가능한 아미노산도 모두 N 글리코실화 인식을 담당하는 4개의 잔기: 161번, 163번, 339번, 및 341번 부위 각각의 위치에서 치환되었다. 이어서, 4개의 위치에서 서열 번호 2와 가장 유사한 특징(비활성, 내열성, 및 pH 프로파일)을 보이는 돌연변이를 조합하여 어떤 N 글리코실화 인식 부위도 가지지 않는 변이체를 생성하였다. 모체 피타제(서열 번호 2)의 특성을 보유하는 상위 4개의 돌연변이는 N161K, T163R, N339E, 및 T341D였다. 동일 분자상의 두 N 글리코실화 인식 부위 모두를 제거하는 방식으로 이들 돌연변이를 조합하였다(표 4).
Figure 112011101934958-pct00011
4개의 글리코실화되지 않은 변이체를 구성하고, 피치아 파스토리스에서 발현시키고, 특징을 규명하였다. 10분간에 걸쳐 80℃에서 열 처리함으로써 서열 번호 2의 글리코실화되지 않은 변이체(변이체 GLY1 - GLY4) 및 2개의 서열 번호 2 대조군의 내열성(반감기)을 측정하였다. 피치아에서 발현된 서열 번호 2 및 글리코실화되지 않은 변이체(변이체 GLY1 - GLY4)는 거의 동일한 내열성을 가졌다. 그러나, (피치아 파스토리스에서 발현된) 서열 번호 2는 E. 콜라이에서 발현된 동일의 유전자(서열 번호 2-HIS)보다 더 큰 내열성을 가졌다. 리드 글리코실화되지 않은 변이체인 변이체 GLY3은 서열 번호 2와 동일한 내열성, pH 프로파일, 및 비활성을 가졌다(도 13). 내열성 데이터는 글리코실화가 내열성을 개선시켰다고 제안한 종래 연구로부터 얻은 놀라운 가설이었고, 따라서, 글리코실화되지 않은 변이체는 감소된 내열을 가질 것으로 예측되었다. 예측한 바와 같이, 내열성에 있어 E. 콜라이 및 피치아 파스토리스에서 발현된 서열 번호 2 사이에는 유의적인 차이가 있었다. 그러나, 만약 글리코실화가 인자가 아니라면, 내열성 차이는 아마도 피치아는 세포내 단백질 폴딩이고, E. 콜라이는 주변 단백질 폴딩이라는 두 발현 숙주의 상이한 단백질 폴딩 환경에 기인하는 것일 수 있다.
T163R 및 N339E 돌연변이를 후속 프로젝트(하기 TMCASM 진화 참조)에서의 SGF 불안정성인 상위 변이체내로 도입하였다.
글리코실화되지 않은 변이체(변이체 GLY1 - GLY4) 뿐만 아니라, 피치아에서 발현된 정제된 서열 번호 2의 피타제 활성 및 pH 프로파일을 37℃, pH 2, 2.5, 3, 4, 5, 및 6에서 피테이트에 대해 측정하였다. 데이터(제시되지 않음)는 글리코실화되지 않은 변이체가 서열 번호 2와 유사한 활성 및 pH 프로파일을 가지고 있다는 것을 시사한다.
서열 번호 2 SGF GSSM SM 스크린
서열 번호 2-HIS를 GSSM 주형으로서 선택하였다. GSSMSM(유전자 부위 포화 돌연변이 유발SM) 진화를 수행하였다(예를 들어, 미국 특허 번호 제6,171,820호 참조).
고처리량의 분석법 개발:
서열 번호 2 및 서열 번호 2-6X의 배양물을 384 웰 마이크로티터 플레이트에서 성장시키고, 자동 로봇 분석 포맷으로 SGF 안정성에 대해 테스트하였다. 플레이트를 30분 동안 65℃에서 열 처리하여 세포를 용해시켰다. 이어서, 배양물을 비처리 대조군 플레이트 및 SGF 처리 플레이트로 나누었다. SGF 처리 샘플의 활성을 비처리 대조군 샘플과 비교하였다. 시점 10, 20, 30, 및 40분에서의 데이터를 취하였다(도 14). 자동화 분석법으로부터 얻은 모체 피타제(전 세포 용해물)의 SGF 프로파일은 정제된 실험실용 크기의 소규모 SGF 분석법으로부터 얻은 결과와 흡사하였다.
고처리량의 분석법 결과
432개의 코돈으로 이루어진 전체 모체 서열(서열 번호 2, 출발 코돈 제외)을 돌연변이화시키고, (하기 기술하는 바와 같이 E. 콜라이에서) 발현시키고, 개발된 피타제 SGF 고처리량 분석법을 사용하여 SGF 분해 개선에 대해 스크리닝하였다. SGF 불안정성에 대해 69개의 상이한 잔기 위치의 신규한 돌연변이 132개가 확인되었다(표 5). 10분 경과시 적어도 8개의 단일 부위 돌연변이가 완전한 단백질 분해라는 SGF 요건을 충족시켰다. 그러나, 이들 돌연변이체들 대부분은 4℃ 이상까지 모체 피타제의 내열성 특성에 미치지는 못했다. 단지 돌연변이체 하나, Q247H만이 모체 피타제와 동일하거나, 그보다 미세하게 더 큰 내열성을 가졌고, 10분 이내에 SGF 중에서 완전히 분해되었다.
20분간에 걸쳐 진행된 연구에서 GSSM 스크린으로부터 선별된 돌연변이체의 SGF 활성 손실을 디플루오로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트 (DiFMUP), 50 mM 아세트산나트륨(pH 5.5), 0.75 mg/mL 펩신 상에서 측정하였다. 이들 SGF 돌연변이에 대한 특징 규명을 통해 완전한 분해가 이루어지는 완전 분해율을 3가지 카테고리, 고속(2분 미만), 중간 속도(~10-15분), 및 저속(≥20분)로 나누었다: 저속 SGF 돌연변이체는 모체 피타제(서열 번호 2)보다 약간 개선된 것으로 나타났다. 본 데이터는 활성 분석법이 피타제 붕괴를 측정하는 데 있어 감도가 보다 큰 방법이라는 것을 시사한다; 잔여 활성이 20%일 때, SDS-Page 겔 상에서는 피타제 밴드가 검출되지 않는다(데이터는 제시하지 않음).
2가지 방법으로 SGF 돌연변이체를 내열성에 대해 테스트하였다; a) 30분 동안 65℃에서 열 처리, 및 b) 30분 동안 50-70℃ 구배. 내열성 데이터는, 변이체 I427T 및 변이체 Q247H를 제외한 SGF 돌연변이 대부분이 ≥4℃에서 특성을 상실한다는 것을 나타낸다. 내열성 결핍 문제를 빠르게 극복하기 위해 급행 방법을 개발하였다; (상기 실시예 1로부터의) 내열성이 보다 큰 피타제 골격 내로 매우 유망한 SGF 돌연변이 수개를 도입하여 내열성을 획득하였는지 여부를 테스트하였다(급행 방법이라는 표제하에 상세하게 논의된다).
돌연변이 모두를 비교하고, 적합도 값 FT(내열성(%) - SGF(%) = FT)에 의해 상위 48개가 순위에 올랐다(표 6). 맞춤형 다중 부위 조합 어셈블리SM(TMCASM) 단계(하기 참조)에서의 조합을 위해 상위의 단일 부위 돌연변이가 주시된다.
본 데이터에 기초하여, 모체 피타제(서열 번호 2) 분자에서의 변화를 통해 다른 것보다도 SGF 불안정성 개선에 대해 더 바람직한 것인 특정의 아미노산 치환 및 잔기 위치가 제시되었다(도 16). 도 16에서, 아미노산 기호 아래에 있는 숫자는 본 분자가 원래의 단백질 중에 나타나는 횟수를 나타낸다. 예를 들어, 48번 위치의 잔기 트레오닌은 9개의 다른 아미노산(FYWMHKVIL)으로 변경될 수 있다. SGF 불안정성을 가장 빈번하게 증가시키는 3개의 아미노산 부가는 루신(14회), 프롤린(12회), 및 히스티딘(12회)이다. 추가의 일례로, 원래의 단백질에 존재하는 아르기닌(서열 번호 2에서 22회)은 또 다른 아미노산으로 치환되지 않으며, 이에 동반하여 SFG 불안정성이 증가한 것이 관찰되었다. 그러나, 원래의 단백질 중의 또 다른 아미노산을 대신하여 아르기닌으로 치환된 경우(7회), 각각의 경우 SGF 불안정성은 증가하였다. SGF GSSM 데이터는 SGF 돌연변이에 대한 핫스폿이 피타제 분자 중에 존재한다는 것을 나타내었다(도 17). 7개가 일렬로 나열되어 있는 가장 큰 일련의 돌연변이는 잔기 145-151 사이에 존재하였다. 또한 일렬로 3개의 잔기가 돌연변이화될 수 있는 세트가 3개 존재하였다. 수개의 아미노산 잔기는 바람직한 SGF 불안정성을 가지게 하는 아미노산 치환에 대해서는 무차별적이며, 가장 무차별적인 것은 T48ㄹ서, 이는 9개의 상이한 아미노산(F, Y, W, M, H, K, V, I, 및 L)에 의해 치환되었다. 48번 및 70번 위치의 H가 최상의 돌연변이이고, 이를 TMCA 라이브러리를 위한 후보물질로서 선택하였다.
Figure 112011101934958-pct00012
상당수의 GSSM 변이체는 SGF 요건(고속 분해 < 10%가 10분 후 SGF 잔존)을 충족시켰지만, 내열성 특성은 부족하였다(< 75%가 30분 동안 65℃에서의 열 처리 후 잔존). 중간 속도 및 저속으로 분해 돌연변이체는 내열성 요건을 충족시켰지만, SGF 요건은 충족시키지 못했다. GSSM 스크린으로부터 단지 변이체 56(Q247H)만이 SGF 및 내열성 특성, 둘 모두를 충족시켰다.
Figure 112011101934958-pct00013
상위 3개의 돌연변이 중 2개(Q246W 및 Q247H)가 모체 피타제(서열 번호 2)와 유사한 내열성 특성을 보였고, SGF 불안정성은 유의적으로 개선되었다. 3D 모델링을 사용하여, W246이 상기 단백질 표면 아래에 매립되어 있으며, 이로 인해 상기 단백질은 글루타민 측쇄 주변의 매우 조밀한 환경이 거대 트립토판 측쇄에 맞도록 적합화되어야 한다고 예측되었던 것을 관찰할 수 있다. 또한, 트립토판 잔기에는 측쇄 산소가 존재하지 않기 때문에 상기 단백질은 G255의 주쇄 질소와 함께 Q246 측쇄의 엡실론 산소 사이의 수소 결합 손실에 맞게 적합화되어야 한다. 또한, 구조 분석을 통해 H247의 주쇄는 매립되어 있는 반면, 이미디졸 측쇄는 표면쪽으로 스노클링하는 것으로 나타났다. 글루타민에서 히스티딘으로의 변경은 상대적으로 보존적인 변화이지만, 이를 통해 상기 부위내 새로운 표면에 접근가능한 기가 형성이 되는데, 이는 낮은 pH에서의 양성자 첨가 반응에 이용가능하며, 이를 통해 명백히 국소 수소 결합 네트워크는 변경될 것이고, 이는 잠재적으로는 상기 부위에서의 국소 단백질 구조를 파괴시키는 산성 스위치로서의 작용을 하면서 상기 단백질에서 산성 및 펩신 분해가 더 잘 이루어질 수 있도록 할 것이다.
급행 방법
리드 SGF 불안정성 변이체(Q247H 제외)에서 손실된 내열성 특성을 극복하기 위해, 급행 방법을 개시하여 원하는 특성: SGF 및 내열성, 이 둘 모두를 가진 피타제 분자를 디자인하였다. 이전 진환 연구(상기 실시예 1 참조)로부터의 내열성 피타제(서열 번호 2-N159V, 서열 번호 2-6X 및 서열 번호 2-9X)를 2회 진행되는 부위 지정 돌연변이 유발법(SDM)을 위한 골격으로서 선택하였다.
하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 1회차 SDM에서는 각각의 단일 SGF 돌연변이((T291V, A236T, 또는 L157P)를 3개의 내열성 골격 각각에 도입하였다(표 7).
Figure 112011101934958-pct00014
1회차 SDM으로부터 얻은 데이터에서는 골격 서열 번호 2-N159V로부터 제조된 변이체에서 SGF 불안정성이 개선된 것으로 나타났다. 그러나, 상기 SGF 돌연변이에서는 내열성 특성이 목표치 아래로 감소하였다. 다른 두 내열성 골격(서열 번호 2-6X 및 서열 번호 2-9X)의 변이체는 SGF 분해에 있어 단지 최소로 개선된 것으로 나타났다. 또한, 추가의 SGF 돌연변이를 서열 번호 2-N159V 골격에 부가한 결과, 내열성이 내열성 목표치 아래로 감소한 것이 관찰되었다.
둘 모두가 A236T 돌연변이를 포함하거나, 또는 포함하지 않는 것인 서열 번호 2-6X 및 서열 번호 2-9X 내로 SGF 돌연변이를 2개까지(T291V 및/또는 L192F) 도입함으로써 추가의 SGF 돌연변이를 다른 두 내열성 변이체에 부가하는 2회차 SDM을 수행하였다(하기 표 8 참조).
Figure 112011101934958-pct00015
상기 SDM으로부터 얻은 결과를 통해 모체 피타제(서열 번호 2)보다 조금 더 우수한 내열성을 가지고, SGF 중에서 10분 미만의 시간 동안 완전한 분해가 이루어지는 변이체인 변이체 0이 생성되었다. 예를 들어, T-O 및 T-10(분) 시점에서 상이한 용량의 SGF 펩신(0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 및 0 mg/mL 펩신)을 사용하고, SDS-PAGE 겔을 심플리 블루™ 세이프스테인으로 염색한 결과, 변이체 O은 0.3 mg/mL 및 0.2 mg/mL 펩신에서 10분 이내에 완전히 분해되는 것으로 나타났다. SGF 중에서 20분 동안(0.3 mg/mL 펩신) 다시 SDS-PAGE 상에서 진행시킨 결과, 서열 번호 2-HIS는 20분 후 분해되지 않는 반면, 변이체 O은 약 7.5분째 완전히 분해된 것으로 나타났다.
상이한 펩신 용량: 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 및 0.0 mg/mL 펩신에서의 변이체 O 및 서열 번호 2-HIS의 SGF 안정성을 측정하였다(도 18). 도 18에서, 서열 번호 2-HIS에 대한 0.3 mg/mL 펩신 용량을 벤치마크로서 그래프로 나타내었다. 용량 반응 실험을 통해 펩신이 완전한 분해를 위해서 필요하다는 것, 및 이는 산 처리와 상관관계에 있지 않다는 것으로 나타났다(도 18).
75℃에서 변이체 O 및 서열 번호 2-HIS의 반감기를 측정하였다(도 19). 정제된 모체 피타제(서열 번호 2-HIS) 및 피타제 변이체인 변이체 O을 2개의 상이한 완충액(100 mM 시트레이트(pH 5.5) 및 100 mM Tris(pH 7.2)) 중에서 45분까지(T-O, 5, 10, 15, 20, 30, 45분) 75℃에서 열 처리하였다. 100 ㎕의 100 μM DiFMUP, 50 mM 시트레이트(pH 5.5) 중에서 10 ㎕의 열 처리된 샘플을 그 활성에 대해 분석하였다. 활성의 T-O 활성과 비교하였다. 변이체 O은 SGF 및 내열성 요건을 충족시켰지만, 비활성은 원하는 목표치보다는 낮았다(도 19). 서열 번호 2-6X 골격의 비활성은 모체 피타제(서열 번호 2) 비활성의 2/3 정도 밖에 되지 않는다는 것을 제시한 이전 진화 연구(실시예 1)로부터 얻은 사전 지식이 있었기 때문에 비활성의 손실은 예측된 것이었다.
TMCA 방법을 강화시키고, 변이체 O 결핍을 극복하기 위해 본 방법에서는 주형으로서는 모체 피타제(서열 번호 2-HIS)를 사용하여 비활성을 유지하는 내열성 돌연변이화와 SGF 돌연변이를 조합하였다.
TMCA SM 진화
원하는 내열성뿐만 아니라, SGF 특성을 가진 변이체를 선별하기 위해 열 처리 단계를 포함하도록 고처리량의 분석법을 변형시켰다. 맞춤형 다중 부위 조합 어셈블리 (TMCA) 기술(PCT 공개 공보 번호 WO 09/018449 참조)을 사용하여 2개의 라이브러리를 작성하였다. TMCA 진화는 다중 부위에 있는 다양한 돌연변이의 상이한 조합을 가진 복수 개의 자손 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 포함한다. 본 방법은 하기 단계 중 적어도 하나 이상의 조합에 의해 부분적으로 수행될 수 있다:
("제1" 또는 "주형") 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 정보 수득. 예를 들어, 제1 또는 주형 서열은 야생형 서열(예를 들어, 서열 번호 2-N159V)이거나, 또는 돌연변이화된 서열(예를 들어, 하기 기술하는 "D164R 주형")일 수 있다. 서열 정보는 완전한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 유전자 또는 오픈 리딩 프레임)에 대한 것이거나, 또는 관심의 대상이 되는 일부 부위, 예를 들어, 결합, 결합 특이성, 촉매 활성, 또는 기질 특이성에 대한 부위를 코딩하는 서열에 대한 것일 수 있다.
제1 또는 주형 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 관심의 대상이 되는 3개 이상의 돌연변이 확인. 예를 들어, 돌연변이는 제1 또는 주형 서열내 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20개 이상의 위치에 존재할 수 있다. 그 위치는 절대적인 위치에 의해, 또는 주변 잔기 또는 상동성과 관련하여 미리 결정될 수 있다. 피타제 폴리펩티드의 TMCA를 위해, 효소 성능을 개선시켜 주는 상위 순위의 SGF 및 내열성 아미노산 변화를 관심의 대상이 되는 돌연변이로서 포함하였다. 돌연변이 위치 양측 측면에 존재하는 서열을 알 수 있다. 각 돌연변이 위치는 예를 들어, 상이한 아미노산에 대해 2개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원 및 미국 특허 번호 제6,171,820호; 제6,562,594호; 및 제6,764,835호에 기술되어 있는 바와 같이, 유전자 부위 포화 돌연변이 유발SM(GSSMSM) 기술을 사용함으로써 상기 돌연변이를 확인할 수 있다.
관심의 대상이 되는 돌연변이를 포함하는 프라이머 (예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드) 제공. 한 실시양태에서, 각각의 관심의 대상이 되는 돌연변이를 위해 프라이머를 제공한다. 따라서, 3가지 관심의 대상이 되는 돌연변이를 가진 제1 또는 주형 폴리뉴클레오티드는 상기 위치에서 3개의 프라이머를 사용할 수 있다. 프라이머는 또한, 관심의 대상이 되는 돌연변이가 임의의 뉴클레오티드 또는 천연 발생 아미노산의 범위, 또는 상기 범위의 서브세트 중에 존재하도록 축퇴성 위치를 포함하는 프라이머 풀로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 지방족 아미노산 잔기에 대한 돌연변이를 선호하는 프라이머 풀로서 제공될 수 있다.
프라이머는 정방향 또는 역방향 프라이머로서 제조될 수 있거나, 상기 프라이머는 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머로서 제조될 수 있다. 돌연변이가 함께 근접한 위치에 위치할 경우, 1 초과의 위치에 대한 돌연변이, 또는 다중 위치에 있는 돌연변이의 상이한 조합을 포함하는 프라이머를 사용하는 것이 편리할 수 있다.
주형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 제공. 예를 들어, 클로닝, 서열 분석 또는 발현을 위한 플라스미드 또는 벡터와 같이, 제1 또는 주형 폴리뉴클레오티드는 환형일 수 있거나, 수퍼코일형일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥("ssDNA") 일 수 있거나, 이중 가닥("dsDNA")일 수 있다. 예를 들어, TCMA 방법은 95℃에서 1분 동안 이루어지는 가열 단계에 수퍼코일형의("sc": supercoiled) dsDNA 주형을 사용한다(문헌 [Levy, Nucleic Acid Res ., 28(12):e57(i-vii)(2000)] 참조).
반응 혼합물 중 주형 폴리뉴클레오티드에의 프라이머 첨가. 프라이머가 주형 폴리뉴클레오티드에 어닐링할 수 하는 조건 하에서 프라이머 및 주형 폴리뉴클레오티드를 결합시킨다. TMCA 프로토콜의 한 실시양태에서, 단일 반응 혼합물 중 폴리뉴클레오티드에 프라이머를 첨가할 수 있지만, 다중 반응에도 첨가할 수 있다.
폴리머라제 연장 반응 수행. (예를 들어, "자손" 또는 "변형된 연장 폴리뉴클레오티드"로서의) 연장 생성물을 통상의 수단에 의해 증폭시킬 수 있다. 상기 생성물을 그 길이, 서열, 원하는 핵산 특성에 대해 분석할 수 있거나, 폴리펩티드로서 발현시킬 수 있다. 다른 분석 방법으로 계내 하이브리드화, 서열 스크리닝 또는 발현 스크리닝을 포함한다. 분석은 1회 이상 스크리닝하고, 원하는 특성에 대해 선별하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 생성물을 세포 또는 다른 발현 시스템 내로, 예를 들어, 무세포 시스템 내로 형질전환시킬 수 있다. 무세포 시스템은 DNA 복제, 수복, 재조합, 전사와 관련된 효소, 또는 번역을 위한 효소를 포함할 수 있다. 예시적인 숙주로는 박테리아, 효모, 식물 및 동물 세포 및 세포주를 포함하며, E. 콜라이, 슈도모나스 플루오레센스, 피치아 파스토리스 및 아스퍼질러스 니거를 포함한다. 예를 들면, E. 콜라이의 XL1-블루 또는 Stb12 균주를 숙주로서 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 상이한 돌연변이 조합 또는 다수의 돌연변이를 가진 생성물을 촉진시키기 위해 상이한 반응하에 동일 또는 상이한 프라이머와 함께 사용될 수 있다.
상기 기술한 예시적인 방법을 수행함으로써 본 프로토콜은 또한 TMCA 진화 방법에 의해 생산되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공하게 되며, 이후, 이를 원하는 특성에 관해 스크리닝하거나 선별할 수 있다. 자손 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 폴리펩티드로서 발현될 수 있으며, 임의로, 원하는 특성에 대해 스크리닝하거나 선별할 수 있다. 따라서, TMCA 진화 프로토콜의 본 실시양태는 폴리뉴클레오티드 및 코딩된 폴리펩티드뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제공한다. TMCA 진화 프로토콜의 본 실시양태는 추가로 라이브러리를 스크리닝하거나 선별하여 원하는 활성을 가진 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 수득하는 것으로 이루어진 라이브러리 스크리닝을 제공한다.
PCT 공개 공보 번호 WO 2009/018449에 기술된 TMCA 진화 프로토콜의 또 다른 실시양태는 복수 개의 변형된 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 (a) 단일 반응 혼합물 중 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 적어도 3개의 프라이머를 첨가하는데, 여기서, 적어도 3개의 프라이머는 중복되는 것이 아니며, 여기서, 적어도 3개의 프라이머들 각각은 다른 프라이머와는 다른 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 적어도 하나의 프라이머는 주형의 (-) 가닥에 어닐링할 수 있는 정방향 프라이머이고, 적어도 하나의 프라이머는 주형의 (+) 가닥에 어닐링할 수 있는 역방향 프라이머인 단계, 및 (b) 반응 혼합물을 폴리머라제 연장 반응할 수 있도록 하여 적어도 3개의 프라이머로부터 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함한다.
PCT 공개 공보 번호 WO 2009/018449에 기술된 TMCA 진화 프로토콜의 또 다른 실시양태는 리가제로 처리되지 않은 복수 개의 연장된 생성물로 세포를 형질전환시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 세포로부터 회수한다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 발현시키고, 그로부터 발현된 폴리펩티드를 분석함으로써 회수된 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 분석한다. 또 다른 실시양태에서, 관심의 대상이 되는 돌연변이를 포함하는 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 선별한다.
TMCA 진화 프로토콜의 또 다른 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드와 관련된 서열 정보를 수득하고, 주형 폴리뉴클레오티드와 함께 관심의 대상이 되는 돌연변이를 3개 이상 확인할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리머라제 연장에 의해 수득한 생성물을 분석한 후, 복수 개의 연장된 변형 생성물을 세포 내로 형질전환시킬 수 있다.
TMCA 진화 프로토콜의 한 실시양태에서, 폴리머라제 연장에 의해 수득된 생성물을 효소, 예를 들어, 제한 효소, 예를 들어, DpnI 제한 효소로 처리하여 주형 폴리뉴클레오티드 서열을 파괴시킨다. 처리된 생성물을 세포, 예를 들어, E. 콜라이 세포 내로 형질전환시킬 수 있다.
TMCA 진화 프로토콜의 한 실시양태에서, 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개 이상의 프라이머가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 각 프라이머는 단일 점 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 정방향 또는 2개의 역방향 프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드 상의 동일 위치에 다른 변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드 상의 상이한 위치에 적어도 2개의 변이를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 프라이머는 상이한 위치에 적어도 2개의 변이를 포함하고, 적어도 2개의 정방향 또는 2개의 역방향 프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드 상의 동일 위치에 다른 변이를 포함한다.
TMCA 진화 프로토콜의 한 실시양태에서, 정방향 프라이머는 정방향 군으로 분류되고, 역방향 프라이머는 역방향 군으로 분류되며, 정방향 군 중의 프라이머 및 역방향 군 중의 프라이머는 서로로부터 독립적으로 주형 폴리뉴클레오티드 상의 위치와는 상관없이 상응하는 군 중에서 동일한 농도로 정규화되며, 여기서, 정규화한 후 동량의 정방향 및 역방향 프라이머를 반응에 첨가한다. 이러한 정규화 방법은 몇몇 위치의 조합으로 편향될 수 있다. 이러한 편향은, 다중 프라이머를 포함하는 위치와 비교하여 단일 프라이머를 포함하는 하나의 위치에서의 프라이머 농도가 상대적으로 낮기 때문일 수 있다. "위치적 편향성"이란 프라이머가 그의 정방향 또는 역방향 프라이머 군 내의 나머지 다른 위치와 비교하여 단일의 위치로 혼입하려는 선호도를 강하게 보이는 생성된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이를 통해 단일 프라이머 위치 내에서는 고비율의 돌연변이를 갖지만, 그의 정방향 또는 역방향 프라이머 군 내의 또 다른 위치에서는 저비율의 돌연변이를 가질 수 있는 변형된 폴리뉴클레오티드 조합이 이루어질 수 있다. TMCA를 수행하는 목적이 주형에 대한 모든 가능한 변이 조합을 포함하는 자손 폴리뉴클레오티드를 생성하는 것이라면 상기와 같은 편향성은 바람직하지 못하다. 이러한 편향성은, 예를 들면, 각 위치의 풀로서 프라이머를 동일하게 정규화시킴으로써 보정할 수 있다.
TMCA 진화 프로토콜의 한 실시양태에서, 프라이머 정규화는 주형 폴리뉴클레오티드 상의 프라이머 위치에 따라 프라이머를 다중 군으로 조직화함으로써 수행하는데, 여기서, 상기 주형 상의 동일의 선택된 영역에 적용되는 프라이머를 하나의 군으로 하는 단계; 각 군 내의 분류된 프라이머를 동일 농도로 정규화시키는 단계; 하나의 군 내에 있는 정방향 프라이머를 정방향 군으로 풀링하고, 정방향 프라이머의 각 군들 간의 농도를 동일하게 정규화하는 단계; 하나의 군 내에 있는 역방향 프라이머를 역방향 군으로 풀링하고, 역방향 프라이머의 각 군들 간의 농도를 동일하게 정규화하는 단계; 및 동량의 풀링된 정방향 및 역방향 프라이머를 본 반응에 첨가함으로써 수행한다. 위치 조합에 있어 어떤 편향성도 관찰되지 않았다.
TMCA 진화 프로토콜의 한 실시양태에, 각각 축퇴성 위치를 포함하는 축퇴성 프라이머 세트를 제공하는데, 여기서, 관심의 대상이 되는 돌연변이는 축퇴성 위치에 있는 일련의 상이한 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 코돈에 상응하는 적어도 하나의 축퇴성 코돈, 및 주형 폴리뉴클레오티드 서열의 코돈에 인접한 서열에 상동성인 적어도 하나의 인접 서열을 포함하는 축퇴성 프라이머 세트를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 축퇴성을 가진 코돈은 N,N,N 이고, 이는 20개의 천연 발생 아미노산 중 임의의 것을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 축퇴성을 가진 코돈은 20개 미만의 천연 발생 아미노산을 코딩한다.
PCT 공개 번호 WO 2009/018449에 기술된 TMCA 진화 프로토콜의 또 다른 실시양태는 관심의 대상이 되는 돌연변이를 포함하는 복수 개의 변형된 폴리뉴클레오티드를 생산하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 (a) 단일 반응 혼합물 중 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드에 적어도 2개의 프라이머를 첨가하는데, 여기서, 적어도 2개의 프라이머는 중복되는 것이 아니며, 여기서, 적어도 2개의 프라이머들 각각은 다른 프라이머(들)와는 다른 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 여기서, 적어도 하나의 프라이머는 주형의 (-) 가닥에 어닐링할 수 있는 정방향 프라이머이고, 적어도 하나의 프라이머는 주형의 (+) 가닥에 어닐링할 수 있는 역방향 프라이머인 단계, 및 (b) 반응 혼합물을 폴리머라제 연장 반응할 수 있도록 하여 적어도 2개의 프라이머로부터 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계, (c) 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 효소로 처리하여 주형 폴리뉴클레오티드를 파괴시키는 단계, (d) 리가제로는 처리되지 않은 상기의 처리된 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 형질전환시키는 단계, (e) 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 세포로부터 회수하는 단계, 및 (f) 관심의 대상이 되는 돌연변이를 포함하는 복수 개의 연장된 변형 폴리뉴클레오티드를 선별하는 단계를 포함한다.
TMCA 기술을 사용하여, 빠른 처리 소요 시간을 위해, 및 과정을 간소화시키기 위해 소규모 라이브러리인 라이브러리 A를 작성하였다(5개 이하의 SGF 돌연변이 및 2개의 내열성 돌연변이를 포함하는 96개의 상이한 변이체, 표 9 참조). 라이브러리 A는 단일 주형, 서열 번호 2-N159V와 하기 표 10에 열거되어 있는 올리고를 사용하였다. 필요한 SGF 특성을 가지며 매우 내열성이 큰 변이체가 생성될 수 있는 가능성을 증가시키기 위해 TMCA 기술을 사용하여 보다 확장형인 두번째 라이브러리인 라이브러리 B를 작성하였다(7개 이하의 SGF 돌연변이 및 5개의 내열성 돌연변이를 포함하는 4096개의 상이한 변이체, 표 9 참조). 라이브러리 B는 각각 하기 표 11에 열거되어 있는 올리고를 사용하는 2개의 별개의 TMCA 반응에서는 2개의 주형으로서 서열 번호 2-N159V 및 "D164R 주형"을 사용하여 2개의 서브라이브러리를 작성하였다. "D164R 주형"은 라이브러리 A에서 생성되었고, 이는 D164R 돌연변이가 도입되어 있는 서열 번호 2-N159V 골격으로 구성되었다. 두 라이브러리 모두를 pQE60 벡터(Qiagen: 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 증폭시킨 후, (하기 기술하는) 숙주 PHY635 내로 형질전환시켜 1차 및 2차 피타제 활성을 확인하였다.
라이브러리를 스크리닝하여 총 8개의 유망한 내열성이며 SGF 불안정성인 히트가 발견되었다. 내열성이며(Tm이 모체 피타제인 서열 번호 2보다 ~5℃ 더 높았다, 표 13) SGF 불안정성인 변이체 5가 소규모 라이브러리에서 발견되었다(변이체 AA-EE, 표 12). 보다 규모가 큰 TMCA 라이브러리를 통해 10개의 후보물질이 생산되었는데, 단지 3개만이 변이체 AA-EE보다 큰 내열성을 가졌다(변이체 FF-HH의 Tm은 모체 피타제인 서열 번호 2보다 ~7.5℃ 더 높았다, 표 13). 특징 규명 및 스크리닝을 위해, 최상의 단일 부위 SGF 돌연변이도 포함하는 이들 변이체(변이체 56)를 모두 글리코실화된 버전 및 글리코실화되지 않은 버전으로서 피치아 파스토리에서 발현시켰다(글리코실화되지 않은 버전은 N 글리코실화 제거 연구로부터 2개의 돌연변이, T163R 및 N339E를 포함하였다, 상기 참조).
SGF 처리 동안 SGF 불안정성 피타제 변이체의 잔여 활성을 측정하였다(도 20). 정제된 모체 피타제(서열 번호 2), 변이체 56 및 변이체 AA-HH를 10분 동안에 걸쳐 펩신(1O U/㎍ 피타제)을 포함하는 SGF(pH 1.2)로 처리하였다. 피타제 안정성은 DiFMUP에 대한 활성에 대해 측정하였다. SGF 불안정성 피타제 변이체의 비활성을 서열 번호 2 피타제와 비교하였다(도 21). 정제된 모체 피타제(서열 번호 2) 및리드 피타제 변이체를 피테이트에 대한 활성에 대하여 테스트하였다. 정제된 단백질을 4 mM 피테이트, 100 mM 아세트산나트륨(pH 4.5), 37℃에서 분석하였다. SGF 및 내열성 특성에 있어 피치아에서 발현된 글리코실화된 버전 및 글리코실화되지 않은 버전의 리드 변이체 사이에는 어떤 유의적인 변화도 없었다(도 20 및 21). 종래 연구에서는 글리코실화된 변이체가 내열성이 더 크고, SGF에 대해 내성이 더 클 것이라고 예측된 바 있지만; 본 발명의 데이터에서는 다르게 제안되었다.
또한, 37℃ pH 2, 2.5, 3, 4, 5, 및 6에서의 피테이트에 대한 피타제 활성에 대해 글리코실화된 변이체, 글리코실화되지 않은 변이체, 및 모체 피타제(서열 번호 2)의 pH 프로파일을 작성하였다. 분석된 모든 피타제는 매우 유사한 pH 프로파일을 가지고 있었다(데이터는 제시하지 않음).
Figure 112011101934958-pct00016
Figure 112011101934958-pct00017
Figure 112011101934958-pct00018
Figure 112011101934958-pct00019
변이체 AA는 서열 번호 28이고(서열 번호 27에 의해 코딩됨), 변이체 BB는 서열 번호 32이고(서열 번호 31에 의해 코딩됨), 변이체 CC는 서열 번호 34이고(서열 번호 33에 의해 코딩됨), 변이체 DD는 서열 번호 36이고(서열 번호 35에 의해 코딩됨), 변이체 EE는 서열 번호 38이고(서열 번호 37에 의해 코딩됨), 변이체 FF는 서열 번호 24이고(서열 번호 23에 의해 코딩됨), 변이체 GG는 서열 번호 26이고(서열 번호 25에 의해 코딩됨), 변이체 HH는 서열 번호 40이고(서열 번호 39에 의해 코딩됨), 변이체 56는 서열 번호 30이다(서열 번호 29에 의해 코딩됨). 그러나, 서열 번호 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 및 39는 천연 신호 서열을 코딩하는 핵산을 포함하지 않으며, 서열 번호 4, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 및 40은 천연 신호 서열 아미노산(서열 번호 2 중 아미노산 1-22)을 포함하지 않는다는 점에 주의한다. 각각의 참조 서열에 출발 메티오닌(ATG)을 첨가하였다. 천연 신호 서열이 존재할 경우, (예를 들어, 표 12에 열거되어 있는) 상기 변이체에 대한 점 돌연변이의 위치를 계수하였다.
Figure 112011101934958-pct00020
정제된 모체 피타제(서열 번호 2) 및 9개의 리드 SGF 피타제 후보 물질을 피치아 파스토리스에서 발현시키고, 정제하고, 100 mM 시트레이트(pH 5.5) 중에서 투석시키고, 어플라이드 써모다이나믹스 N-DSCII(Applied Thermodynamics N-DSCII)를 사용하여 Tm에 대해 테스트하였다.
동물 연구를 위한 상위 4개의 변이체 선택
피타제 1 ㎍당 10 U인 펩신 용량을 사용하여 9개의 시점(0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 및 10분)에서 SGF SDS-PAGE 분석법을 수행하여 동물 시험에서 사용되는 대규모 발효를 위해 상기 특징 규명 데이터(제시되지 않음)를 기준으로 하여 4개의 변이체를 선택하였다. 선택된 4개의 리드에서는 5분 이내에 완전한 단백질 분해가 이루어진 것으로 나타났다.
선택된 리드:
변이체 56(서열 번호 30, 서열 번호 29에 의해 코딩됨)은 1개의 SGF 돌연변이 및 2개의 글리코실화되지 않은 돌연변이를 가진, 원래의 모체 피타제(서열 번호 2) 분자에 가장 가까운 변이체이다.
변이체 AA(서열 번호 28, 서열 번호 27에 의해 코딩됨)는 2개의 SGF 돌연변이, 2개의 내열성 돌연변이 및 2개의 글리코실화되지 않은 돌연변이를 가진다.
변이체 FF(서열 번호 24, 서열 번호 23에 의해 코딩됨)는 3개의 SGF 돌연변이, 4개의 내열성 돌연변이 및 2개의 글리코실화되지 않은 돌연변이를 가진다.
변이체 GG(서열 번호 26, 서열 번호 25에 의해 코딩됨)는 3개의 SGF 돌연변이, 5 내열성 돌연변이, 2개의 글리코실화되지 않은 돌연변이를 가진다.
리드 후보 물질의 발효:
동물 시험을 위해 리드(변이체 56, 변이체 AA, 변이체 FF, 및 변이체 GG)를 선택하고, 30 L 발효를 위해 크기를 확장시켜 각각의 단백질을 적어도 5 g씩 생산하였다. 활성 및 브래드포드 단백질 분석(Bradford Protein analysis)에 기초하여 각 변이체에 대해 ≥ 16 g의 단백질을 생산하였다. 회수된 샘플을 동결건조시킨 후, 재현탁시키고, 잠재적인 미생물 성장을 사멸시키기 위해 열 처리한 후, 다시 동결건조시켰다. 이들 샘플(표 14)을 동물 시험에 사용하였다. 2개의 선택된 변이체와 함께, 다른 SGF 불안정성 변이체로 이루어진 소규모 샘플(15-50mg)를 사용하여 실험실용 크기의 평가를 위해 사용하였다.
Figure 112011101934958-pct00021
방법
성장, 유도, 및 정제
E. 콜라이 피타제 발현(2 L 규모)
글리코실화 연구에서 사용된 것을 제외한, 모든 피타제 변이체를 E. 콜라이 균주 PHY635에서 발현시켰다(phy-균주: P1 파지 형질도입을 통해 E. 콜라이 균주 CU1867(ATCC 47092; appA 결핍) Rec A-를 제조함으로써 생성). 피타제 변이체의 출발 배양물을 ~18 hrs 동안 37℃에서 5 mL LBcarb100 중에서 성장시켰다. 2 L의 LBcarb100을 출발 배양물과 함께 밤새도록 인큐베이션시키고, 배양물이 ~OD6OO 0.5에 도달하였을 때 배양물을 1 mM IPTG로 유도하였다. 24 hrs의 인큐베이션 후, 20분 동안 원심분리(Sorvall RC 5C Plus Centrifuge; SLC-4000 회전 날개, 7000 RPM; 9220 RCF)하여 배양물을 펠릿화함으로써 배양물을 수거하였다. 세포를 50 mM Tris(pH 8.0) 중에 재현탁시키고, 마이크로플루이다이저(Microfluidics Model 11OL)를 사용하여 용해시켰다. 세포 파편을 제거하기 위해 전 세표 용해물을 30분 동안 원심분리하였다(Sorvall RC 5C Plus; F13S-14X50 회전 날개, 12500 RPM; 25642 RCF). 투명한 용해물을 멸균 여과시키고, AKTA FPLC 상의 히스트랩(HisTrap) FF 5 mL 칼럼을 통과시켜 피타제 단백질을 정제하였다. 2 M 이미디졸, 50 mM Tris pH 8.0 구배를 사용하여 피타제를 용리시켰다. 분획을 100 uM DiFMUP, 100 mM 아세트산나트륨(pH 5.5)에 대한 활성에 관해 테스트하고, 단백질 순도에 대해서 SDS 겔 분석을 수행하였다.
피치아 파스토리스 피타제 발현(1 L 규모)
글리코실화되지 않은 버전의 서열 번호 2(변이체 GLY1 - GLY4)와 함께 최종 리드 피타제 변이체(글리코실화된 버전 및 글리코실화되지 않은 버전의 변이체 AA - HH 및 변이체 56)를 피치아 파스토리스에서 발현시켰다(X-33). 피타제 변이체의 출발 배양물을 10 mL BMGY지오100(BMGYzeo100) 중에서 ~18 hrs 동안 30℃에서 성장시키고(~OD60015-20), 세포를 펠릿화하고, 0.5% MeOH를 포함하는 10 mL MES* 배지 중에 재현탁시켰다. 0.5% MeOH를 포함하는 1 L의 MES* 배지에 출발 배양물을 접종하고, 34일 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다(단백질 유도를 위해 매 24 hrs마다 5 mL MeOH를 첨가하였다). 분비된 단백질을 원심분리(SorvallRC 5C Plus Centrifuge; SLC-4000 회전 날개, 7000 RPM; 9220 RCF)에 의해 세포 매스로부터 분리하고, 농축시키고, 미니크롭스 접선 흐름 분리 모듈(MiniKros Tangential Flow Separation Module)(SpectrumLabs M215-600-01P)을 사용하여 완충액을 교환하였다(100 mM 아세트산나트륨(pH 5.5)). 순도를 개선시키기 위해 샘플을 AKTA FPLC 상의 히스트랩 FF 5 mL 칼럼을 통과시켰다. 1 M NaCl, 100 mM 아세트산나트륨 pH 5.5 구배를 사용하여 피타제를 용리시켰다. 분획을 100 uM DiFMUP, 100 mM 아세트산나트륨(pH 5.5)에 대한 활성에 관해 테스트하고, 단백질 순도에 대해서 SDS 겔 분석을 수행하였다.
피타제 특징 규명
단백질 내열성
시차주사 열량법 ( DSC : Differential Scanning Calorimetry ) - 어플라이드 써모다이나믹스 N-DSCII를 사용하여 피치아에서 발현된 피타제 변이체의 단백질 용융 온도(Tm)을 측정하였다. 단백질 샘플(~1.0 mg/mL)을 100 mM 시트레이트(pH 5.5) 중에서 투석하고, 테스트 챔버(600 ㎕)에 로딩하고 대조군 샘플(600 ㎕의 100 mM 시트레이트(pH 5.5))과 비교하고, 60℃에서 100%로, 및 (단백질 리폴딩 평가를 위해) 60℃로 다시 주사하였다.
변형된 Tm 측정 - 예비 특징 규명을 하는 동안 전 세포 용해물 및 정제되지 않은 단백질 샘플을 평가하여 SGF 불안정성 피타제의 내열성을 모체 피타제(서열 번호 2)를 비교하기 위해 개발된 고속 내열성 도구. 단백질 샘플을 96 웰 PCR 플레이트 상에 일렬로 어레이시키고(웰당 20 ㎕), PCR 기기 상에서 30분 동안 구배(60-80℃)로 열 처리하였다. 열 처리된 단백질 샘플(10 ㎕)을 형광 기질(190 ㎕의 100 uM DiFMUP, 50 mM 아세트산나트륨(pH 5.5))과 혼합하고, 5분 동안에 걸쳐 형광 변화(EX360nm/EM465nm)를 측정하였다. 50%의 활성이 남아있는 온도를 모체 피타제(서열 번호 2) 성능(50% 활성 온도)과 비교하였다.
SGF 분석법(규모 축소 변형)
피타제 분자의 SGF 불안정성을 측정하기 위해 상이한 시점에서 퀀칭된 다중 미니 반응물을 확립하였다. 대조군 T-0 참조로서 사전퀀칭된 SGF 반응물 또한 실제 실험과 유사하게 진행시켰다. 펩신(용량 0.15, 0.30, 및 0.75 mg/mL)을 포함하는 50 ㎕의 SGF(pH 1.2)(2 mg/mL NaCl, 7 ㎕/mL 진한 HCl) 중에서 10 ㎕의 단백질 샘플을 37℃에서 시간 경과에 따라 인큐베이션시켰다. 10 ㎕의 200 mM 탄산나트륨 완충액(pH 10.0)을 첨가하여 반응물을 퀀칭시켰다(상기 단계는 T-0 참조의 경우 단백질 샘플을 첨가하기 이전에 수행하였다).
SGF SDS 겔 분석 - 20 ㎕의 퀀칭된 SGF 반응물을 제거하고, 210 ㎕ SDS 샘플 완충액과 혼합하고, 10분 동안 끓인 후, 15 ㎕를 Tris-Gly SDS 페이지 겔 상에 로딩하였다. 180 V, 250 mA를 가하고, ~1시간 동안 또는 종결될 때까지 SDS 샘플 이동 완충액을 통해 진행시켰다.
SGF 활성 분석 - 10 ㎕의 퀀칭된 SGF 반응물을 제거하고, 기질(190 ㎕의 100 uM DiFMUP, 50 mM 아세트산나트륨(pH 5.5))과 혼합하고, 5분 동안에 걸쳐 형광 변화(EX360nm/EM465nm)를 측정하였다. 50%의 활성이 남아있는 온도를 모체 피타제(서열 번호 2) 성능(50% 활성 온도)과 비교하였다.
([ The United States Pharmacopeia 24, 2000. Simulated Gastric fluid , TS , In The National Formulary 19; Board of Trustees , Eds .; United States Pharmacopeial Convention , Inc ., Rockville , MD , p. 2235]로부터 개작된) SGF 분석법. 예열된 37℃의 950 ㎕ SGF(2 mg/mL NaCl, HCl를 사용하여 pH 1.2.로 적정됨) 중에서 50 ㎕의 5 mg/mL 피타제를 10 U 펩신/ug 테스트 단백질(760 ug/mL SGF)과 함께 10분 동안에 걸쳐 37℃에서 인큐베이션시켰다. 50 ㎕의 반응물을 제거하고, 이를 50 ㎕ 종결 용액(200 mM 탄산나트륨(pH 10.0))과 혼합하여 각 시점에서의 데이터를 취하였다. (SGF 분석법(규모 축소 변형) 하에 개략적으로 설명된 SGF SDS 겔 분석 및 SGF 활성 분석에 따라) 시점(종결 시점의 샘플)을 분석 종결시 및 분석 준비시까지 얼음상에서 유지시켰다.
피타제 비활성 분석
예열된 37℃의 4.0 mM 피테이트, 100 mM 아세트산(NaOH를 사용하여 pH 4.5로 적정됨) 중에서 피타제 샘플(50 ㎕)의 특히 활성에 대해 분석하였다. 50 ㎕ 반응물을 제거하고, 50 ㎕ 착색/종결 용액(20 mM 몰리브데넘산암모늄/5 mM 바나딘산암모늄/10% 질산 용액)과 혼합하여 반응을 퀀칭시켰다. 10분 동안 발색시킨 후, 그 시점에 415 nm에서 측정하고, 결과를 시간에 대해 플롯팅하였다. 반응율을 포스페이트 표준과 비교하여 상대적인 비율을 측정하였다.
단백질 농도를 기준으로 하여 상대적인 비율을 계산함으로써 비활성을 확인하였다. 260 nm/280 nm 분석에 의해 단백질 농도를 측정하였다(1 A OD280이 0.93 mg/mL인 것으로 상관관계에 있다). 동일한 피타제 활성을 가진 것을 SDS 겔 상에 로딩하고, 겔프로(GelPro) 겔 밀도측정 분석법을 사용하여 단백질 밴드 강도를 정량하여 피타제 리드 및 모체 피타제(서열 번호 2)의 활성 관계를 비교함으로써 2차 비교를 수행하였다.
피타제 pH 프로파일 분석
완충 능력 범위가 보다 광범위한(pH 2-6) 기질로 수정한 것을 제외하면, 상기 비활성 프로토콜과 동일한 프로토콜을 수행하였다. 기질: 4 mM 피테이트, 80 mM 말산, 80 mM 포름산, 및 80 mM 아세트산나트륨(상이한 pH(pH 단위 2, 2.5, 3, 4, 5, 및 6)으로 적정됨). 각 변이체에 대한 상대적인 비율을 pH 4인 최적에서의 활성과 비교하였다.
물질:
SGF 분석법
돼지 위 점막으로부터의 펩신(Sigma P-6887)
HCl(Fisher UN1789)
염화나트륨(Fisher S-271-1)
6,8-디플루오로-4-메틸움벨리페릴 포스페이트(DiFMUP)(Invitrogen-D22068)
4-20% 트리스-글리신 SDS-PAGE 겔(Invitrogen EC60255BOX)
노벡스(Novex) 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액(InvitrogenNovex LC2676)
노벡스 SDS 이동 완충액(Invitrogen LC2675)
심플리 블루™ 세이프스테인(Invitrogen LC6065)
피타제 비활성 분석법
벼로부터 유래된 도데카나트륨 피테이트(Sigma P-3168)
메타바나딘산암모늄(Acros Organics 194910500)
몰리브데넘산암모늄(Sigma A-7302)
인산칼륨, 2염기성(Fisher P288-500)
70% 질산(Sigma 380091)
25% 암모늄 용액(Atlas Chemical AA-3060)
단백질 정제
히스트랩™ FF 5 mL Ni-세파로스 칼럼(GE Healthcare 17-5255-01)
하이트랩(HiTrap)™ Q FF 5 mL 음이온 교환 칼럼(GE Healthcare 17-5156-01)
이미디졸(Sigma 1-0125)
본원에서 제공하는 바와 같은 다수의 실시양태를 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본원에서 제공하는 바와 같은 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 다양한 수정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시양태도 하기 특허청구범위 범주내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Verenium Corporation WEINER, David SOLBAK, Arne MCCANN, Ryan <120> PHYTASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THEM AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM <130> D1370-17WO <140> Not yet assigned <141> 2010-05-20 <150> 61/180,283 <151> 2009-05-21 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetically generated <400> 1 atgaaagcga tcttaatccc atttttatct cttctgattc cgttaacccc gcaatctgca 60 ttcgctcaga gtgagccgga gctgaagctg gaaagtgtgg tgattgtcag tcgtcatggt 120 gtgcgtgctc caaccaaggc cacgcaactg atgcaggatg tcaccccaga cgcatggcca 180 acctggccgg taaaactggg tgagctgaca ccgcgcggtg gtgagctaat cgcctatctc 240 ggacattact ggcgtcagcg tctggtagcc gacggattgc tgcctaaatg tggctgcccg 300 cagtctggtc aggtcgcgat tattgctgat gtcgacgagc gtacccgtaa aacaggcgaa 360 gccttcgccg ccgggctggc acctgactgt gcaataaccg tacataccca ggcagatacg 420 tccagtcccg atccgttatt taatcctcta aaaactggcg tttgccaact ggataacgcg 480 aacgtgactg acgcgatcct cgagagggca ggagggtcaa 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900 atcgccggac acgatactaa tctggcaaat ctcggcggcg cactggagct cgaatggacg 960 cttcccggtc agccggataa cacgccgcca ggtggtgaac tggtgtttga acgctggcgt 1020 cggctaagcg ataacagcca gtggattcag gtttcgctgg tcttccagac tttacagcag 1080 atgcgtgata aaacgccgct gtcattaaat acgccgcccg gagaggtgaa actgaccctg 1140 gcaggatgtg aagagcgaaa tgcgcagggc atgtgttcgt tggcaggttt tacgcaaatc 1200 gtgaatgaag cacgcatacc ggcgtgcagt ttgtaa 1236 <210> 36 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetically generated <400> 36 Met Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Met Gln Leu Met Gln Asp 20 25 30 Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu 35 40 45 Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg 50 55 60 Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln 65 70 75 80 Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys 85 90 95 Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr 100 105 110 Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 115 120 125 Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala 130 135 140 Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr 145 150 155 160 Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 165 170 175 Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 180 185 190 Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu 210 215 220 Gln His Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp 225 230 235 240 Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp 245 250 255 Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln 275 280 285 Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His 290 295 300 Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Glu Trp Thr 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe 325 330 335 Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser 340 345 350 Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu 370 375 380 Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile 385 390 395 400 Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 405 410 <210> 37 <211> 1236 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetically generated <400> 37 atgcagagtg agccggagct gaagctggaa agtgtggtga ttgtcagtcg tcatggtgtg 60 cgtgctccaa ccaaggccat gcaactgatg caggatgtca ccccagacgc atggccaacc 120 tggccggtaa aactgggtga gctgacaccg cgcggtggtg agctaatcgc ctatctcgga 180 cattactggc gtcagcgtct ggtagccgac ggattgctgc ctaaatgtgg ctgcccgcag 240 tctggtcagg tcgcgattat tgctgatgtc gacgagcgta cccgtaaaac aggcgaagcc 300 ttcgccgccg ggctggcacc tgactgtgca ataaccgtac atacccaggc agatacgtcc 360 agtcccgatc cgttatttaa tcctctaaaa actggcgttt gccaactgga tgtggcgaac 420 gtgagagacg cgatcctcga gagggcagga gggtcaattg ctgactttac cgggcattat 480 caaacggcgt ttcgcgaact ggaacgggtg cttaattttc cgcaatcaaa cttgtgcctt 540 aaacgtgaga aacaggacga aagctgttca ttaacgcagg cattaccatc ggaactcaag 600 gtgagcgccg actgtgtctc attaaccggt gcggtaagcc tcgcatcaat gctgacggag 660 atatttctcc tgcaacatgc acagggaatg ccggagccgg ggtggggaag gatcaccgat 720 tcacaccagt ggaacacctt gctaagtttg cataacgcgg tgtttgattt gctacaacgc 780 acgccagagg ttgcccgcag ccgcgccacc ccgttattag atttgatcaa gacagcgttg 840 acgccccatc caccgcaaaa acaggcgtat ggtgtgacat tacccacttc agtgctgttt 900 atcgccggac acgatactaa tctggcaaat ctcggcggcg cactggagct cgaatggacg 960 cttcccggtc agccggataa cacgccgcca ggtggtgaac tggtgtttga acgctggcgt 1020 cggctaagcg ataacagcca gtggattcag gtttcgctgg tcttccagac tttacagcag 1080 atgcgtgata aaacgccgct gtcattaaat acgccgcccg gagaggtgaa actgaccctg 1140 gcaggatgtg aagagcgaaa tgcgcagggc atgtgttcgt tggcaggttt tacgcaaatc 1200 gtgaatgaag cacgcacacc ggcgtgcagt ttgtaa 1236 <210> 38 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetically generated <400> 38 Met Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Met Gln Leu Met Gln Asp 20 25 30 Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu 35 40 45 Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg 50 55 60 Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln 65 70 75 80 Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys 85 90 95 Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr 100 105 110 Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 115 120 125 Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Asp Ala 130 135 140 Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr 145 150 155 160 Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 165 170 175 Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 180 185 190 Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu 210 215 220 Gln His Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp 225 230 235 240 Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp 245 250 255 Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln 275 280 285 Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His 290 295 300 Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Glu Trp Thr 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe 325 330 335 Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser 340 345 350 Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu 370 375 380 Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile 385 390 395 400 Val Asn Glu Ala Arg Thr Pro Ala Cys Ser Leu 405 410 <210> 39 <211> 1236 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetically generated <400> 39 atgcagagtg agccggagct gaagctggaa agtgtggtga ttgtcagtcg tcatggtgtg 60 cgtgctccaa ccaaggccat gcaactgatg caggatgtca ccccagacgc atggccaacc 120 tggccggtaa aactgggtga gctgacaccg cgcggtggtg agctaatcgc ctatctcgga 180 cattactggc gtcagcgtct ggtagccgac ggattgctgc ctaaatgtgg ctgcccgcag 240 tctggtcagg tcgcgattat tgctgatgtc gacgagcgta cccgtaaaac aggcgaagcc 300 ttcgccgccg ggctggcacc tgactgtgca ataaccgtac atacccaggc agatacgtcc 360 agtcccgatc cgttatttaa tcctctaaaa actggcgttt gccaactgga tgtggcgaac 420 gtgagacgtg cgatcctcga gagggcagga gggtcaattg ctgactttac ccgccattat 480 caaacggcgt ttcgcgaact ggaacgggtg cttaattttc cgcaatcaaa cttgtgcctt 540 aaacgtgaga aacaggacga aagctgttca ttaacgcagg cattaccatc ggaactcaag 600 gtgagcgccg acgatgtctc attaaccggt gcggtaagcc tcgcatcaat gctgacggag 660 atatttctcc tgtggcatgc acagggaatg ccggagccgg ggtggggaag gatcaccgat 720 tcacaccagt ggaacacctt gctaagtttg cataacgcgg tgtttgattt gctacaacgc 780 acgccagagg ttgcccgcag ccgcgccacc ccgttattag atttgatcaa gacagcgttg 840 acgccccatc caccgcaaaa acaggcgtat ggtgtgacat tacccacttc agtgctgttt 900 atcgccggac acgatactaa tctggcaaat ctcggcggcg cactggagct cgaatggacg 960 cttcccggtc agccggataa cacgccgcca ggtggtgaac tggtgtttga acgctggcgt 1020 cggctaagcg ataacagcca gtggattcag gtttcgctgg tcttccagac tttacagcag 1080 atgcgtgata aaacgccgct gtcattaaat acgccgcccg gagaggtgaa actgaccctg 1140 gcaggatgtg aagagcgaaa tgcgcagggc atgtgttcgt tggcaggttt tacgcaaatc 1200 gtgaatgaag cacgcatacc ggcgtgcagt ttgtaa 1236 <210> 40 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetically generated <400> 40 Met Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Met Gln Leu Met Gln Asp 20 25 30 Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu 35 40 45 Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg 50 55 60 Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln 65 70 75 80 Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys 85 90 95 Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr 100 105 110 Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 115 120 125 Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala 130 135 140 Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Arg His Tyr 145 150 155 160 Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 165 170 175 Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 180 185 190 Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asp Val Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu 210 215 220 Trp His Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp 225 230 235 240 Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp 245 250 255 Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln 275 280 285 Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His 290 295 300 Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Glu Trp Thr 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe 325 330 335 Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser 340 345 350 Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu 370 375 380 Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile 385 390 395 400 Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 405 410

Claims (62)

  1. 서열 번호 2에 비해 향상된 내열성 및 증가된 위내 불안정성을 갖는 단리된, 합성, 또는 재조합 피타제로서, 상기 피타제는 서열 번호 2와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, I427T, A232P, A236H, A236T, A274I, A274L, G257A, G67A, H263P, I174P, L157P, L167S, L296T, L50W, M51L, P149L, P217D, P217G, P217S, P343E, P343L, P343N, P343R, P343V, Q246W, Q275H, Q377R, S211H, S218Y, T291V, T48F, T48H, T48I, T48K, T48L, T48M, T48W, T48Y, Y79H, Y79N, Y79S, L192F 및 N339E에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 폴리펩티드인, 단리된, 합성, 또는 재조합 피타제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 C226D, D164R, G179R, N159V, Q247H, Q275V, T163R, 또는 T349Y 중 선택된 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 피타제.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 서열 번호 27에 의해 코딩되는 서열 번호 28의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 AA;
    (b) 서열 번호 31에 의해 코딩되는 서열 번호 32의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 BB;
    (c) 서열 번호 33에 의해 코딩되는 서열 번호 34의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 CC;
    (d) 서열 번호 35에 의해 코딩되는 서열 번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 DD;
    (e) 서열 번호 37에 의해 코딩되는 서열 번호 38의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 EE;
    (f) 서열 번호 23에 의해 코딩되는 서열 번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 FF;
    (g) 서열 번호 25에 의해 코딩되는 서열 번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 GG;
    (h) 서열 번호 39에 의해 코딩되는 서열 번호 40의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 HH;
    (i) 서열 번호 29에 의해 코딩되는 서열 번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 변이체 56;
    (j) A47F, T136H, N159V, C226D, V233W, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 A;
    (k) A47F, T136H, N159V, C226D, V233W, A236T, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 B;
    (l) A47F, T136H, L157P, N159V, C226D, V233W, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 C;
    (m) A47F, T136H, L157P, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 G;
    (n) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, A236T, Q275V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 H;
    (o) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 I;
    (p) A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233W, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 J;
    (q) A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233W, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 L;
    (r) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, Q275V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 M;
    (s) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, Q275V, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 N;
    (t) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, Q275V, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 O;
    (u) A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233W, A236T, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 P;
    (v) A47F, T136H, N159V, C226D, V233W, A236T, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 Q;
    (w) A47F, T136H, N159V, L192F, C226D, V233W, A236T, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 R;
    (x) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, A236T, Q275V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 S;
    (y) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, C226D, V233W, A236T, Q275V, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 T; 및,
    (z) A47F, T136H, N159V, D164R, G179R, L192F, C226D, V233W, A236T, Q275V, T291V, 및 T349Y의 돌연변이를 갖는 변이체 U
    에서 선택된 것인, 피타제.
  5. 제1항 또는 제2항의 피타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  6. 제5항의 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제5항의 핵산을 포함하는, 형질전환된 세포.
  8. 제1항 또는 제2항의 피타제를 포함하는 단백질 제제로서, 여기서, 단백질 제제는 액제, 슬러리제, 분제, 스프레이제, 현탁제, 동결건조된 조성물, 동결건조된 조제물, 고체, 겔탑, 환제, 임플란트, 겔제, 약학적 제제, 식품, 사료, 식품 보충제 또는 사료 보충제를 포함하는 것인 단백질 제제.
  9. 제1항 또는 제2항의 피타제를 포함하는 동물용 사료로서, 상기 사료는 펠릿, 환제, 정제, 캡슐제, 겔탑, 스프레이제, 분제, 슬러리제, 현탁제 또는 액제 형태로 제조되거나, 또는 중합체 코팅된 첨가제를 사용하여 제조되거나, 또는 과립상 형태로 제조되거나, 또는 분무 건조에 의해 제조되는 것인 동물용 사료.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 세포, 소포체, 리포좀, 필름, 막, 금속, 수지, 중합체, 세라믹, 유리, 미소전극, 흑연 입자, 비드, 겔, 플레이트, 어레이, 모세관, 결정, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 응집체, 표면, 또는 다공성 구조물 상에, 또는 그 내부에 고정화된 것인 피타제.
  11. (a) 제1항 또는 제2항의 피타제를 제공하는 단계;
    (b) 이노시톨-헥사포스페이트를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    (c) (a)의 피타제가 이노시톨-헥사포스페이트를 가수분해하여 이노시톨 및 무기 포스페이트를 생성할 수 있는 조건 하에서 (a)의 피타제를 (b)의 조성물과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 이노시톨-헥사포스페이트를 이노시톨 및 무기 포스페이트로 가수분해시키는 방법.
  12. 동물 사료의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    (i) 제1항 또는 제2항의 피타제를 제공하는 단계를 포함하고;
    (ii) 상기 (i)에서, 상기 피타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터에 포함되어 있거나;
    (iii) 상기 (ii)에서, 동물이 단위 동물(monogastric animal)이거나;
    (iv) 상기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나에서, 동물 사료가 전달 매트릭스, 펠릿, 정제, 겔제, 액제, 스프레이제, 분쇄형 곡물 또는 분제 형태이거나;
    (v) 상기 (i) 내지 (iv) 중 어느 하나에서, 피타제 효소가 글리코실화된 것이거나, 또는 펠릿화 조건 하에서 내열성 또는 열안정성을 제공하도록 피타제 효소가 글리코실화된 것이거나; 또는
    (vi) 상기 (iv) 또는 (v)에서, 곡물 배아 및 피타제 효소를 포함하는 혼합물을 펠릿화하여 입자를 얻음으로써 전달 매트릭스를 형성하는 것인 동물 사료의 제조 방법.
  13. 제1항 또는 제2항의 피타제를 포함하는 조성물.
  14. (a) 제5항의 핵산을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)의 핵산으로 숙주 세포를 형질 전환시킨 후에, 상기 (a)의 핵산을 발현시킴으로써 피타제를 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 (b)의 숙주 세포는 (i) 에스케리키아, 바실러스, 스트렙토마이세스, 살모넬라, 슈도모나스, 락토코쿠스, 및 스타필로코쿠스 속에 속하는 종에서 선택된 박테리아 세포, 에스케리키아 콜라이(Escherichia Coli), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 또는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); (ii) 아스퍼질러스 속에 속하는 진균 세포 또는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger); 및 (iii) 피치아, 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 또는 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 속에 속하는 효모 세포, 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae), 또는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)에서 선택되는 것인,
    제1항 또는 제2항의 피타제의 제조 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피타제는 발효, 에탄올 또는 알코올 제조 공정에 사용되는 것이고, 또한 상기 피타제는 에탄올 수율을 증가시키거나 칼슘 및 마그네슘의 염을 포함하는 슬러지를 가수분해시키고, 또는 피트산 및 피트산의 염을 제거 또는 감소시키는 것인 피타제.
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