EA021178B1 - Фитазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения - Google Patents

Фитазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA021178B1
EA021178B1 EA201171450A EA201171450A EA021178B1 EA 021178 B1 EA021178 B1 EA 021178B1 EA 201171450 A EA201171450 A EA 201171450A EA 201171450 A EA201171450 A EA 201171450A EA 021178 B1 EA021178 B1 EA 021178B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
sequences
polypeptide
phytase
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA201171450A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201171450A1 (ru
Inventor
Дэвид П. Уэйнер
Арне И. мл. Солбак
Райан Макканн
Original Assignee
Верениум Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43126780&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA021178(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Верениум Корпорейшн filed Critical Верениум Корпорейшн
Publication of EA201171450A1 publication Critical patent/EA201171450A1/ru
Publication of EA021178B1 publication Critical patent/EA021178B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фитазам, кодирующим их полинуклеотидам, применениям полинуклеотидов и полипептидов по изобретению, а также к получению и выделению таких полинуклеотидов и полипептидов. В частности, изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью в условиях высоких температур, и фитазам, которые сохраняют активность после воздействия высоких температур. Изобретение дополнительно относится к фитазам, которые обладают повышенной лабильностью в желудке. Фитазы по изобретению можно применять в пищевых продуктах для повышения питательной ценности богатых фитатом ингредиентов. Фитазы по изобретению могут быть приготовлены в виде пищевых продуктов или кормов или пищевых или кормовых добавок, например, чтобы фитазы способствовали расщеплению фитата.

Description

(57) Изобретение относится к фитазам, кодирующим их полинуклеотидам, применениям полинуклеотидов и полипептидов по изобретению, а также к получению и выделению таких полинуклеотидов и полипептидов. В частности, изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью в условиях высоких температур, и фитазам, которые сохраняют активность после воздействия высоких температур. Изобретение дополнительно относится к фитазам, которые обладают повышенной лабильностью в желудке. Фитазы по изобретению можно применять в пищевых продуктах для повышения питательной ценности богатых фитатом ингредиентов. Фитазы по изобретению могут быть приготовлены в виде пищевых продуктов или кормов или пищевых или кормовых добавок, например, чтобы фитазы способствовали расщеплению фитата.
Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно 35 И.З.С. §119 (е) на основании предварительной заявки на выдачу патента США с регистрационным номером (υδδΝ) 61/180283, поданной 21 мая 2009. Вышеупомянутая заявка непосредственно включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме и для всех целей.
Ссылка на список последовательностей, представленный с помощью ЕРЗЛУЕВ
Настоящая заявка подана в электронном виде на сервере υδΡΤΘ ЕН8-АЕВ, что признано законным и указано в МРЕР §1730 11.В.2(а)(А), и такой электронный документ включает представленный в электронном виде список последовательностей (8Ер ГО). Полное содержание такого списка после довательностей включено в настоящее описание в виде ссылки для всех целей. Список последовательностей обозначен в поданном в электронном виде текстовом файле следующим образом:_
Название файла Дата создания Размер (байты)
т3 70_17МО_5едиепсе_11зе1пд. ТхТ 20 мая 2010 58575 байт
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к фитазам, кодирующим их полинуклеотидам, к применению полинуклеотидов и полипептидов по изобретению, а также к получению и выделению таких полинуклеотидов и полипептидов. В частности, изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью в условиях высокой температуры, и к фитазам, которые сохраняют активность после воздействия высоких температур. Изобретение, кроме того, относится к фитазам, которые обладают повышенной лабильностью в желудке. Фитазы по изобретению можно использовать в продуктах питания для повышения пищевой ценности богатых фитатом ингредиентов. Фитазы по изобретению могут быть получены в виде продуктов питания или кормов или пищевых или кормовых добавок, например, для содействия в расщеплении фитата. Продукты питания или корма по изобретению могут быть в форме гранул, жидкостей, порошков и тому подобного. В одном из аспектов фитазы по изобретению стабильны по отношению к термической денатурации во время гранулирования; и такое свойство снижает стоимость фитазного продукта при сохранении эффективности ίη νίνο и выявлении активности в кормах.
Уровень техники
Минеральные вещества являются необходимыми элементами для роста всех организмов. Поступающие с пищей минеральные вещества могут быть получены из множества источников, включая растения. Например, семена растений являются богатым источником минеральных веществ, так как они содержат ионы, которые находятся в комплексе с фосфатными группами молекул фитиновой кислоты. Такие связанные с фитатами минеральные вещества в некоторых случаях могут удовлетворять пищевые потребности у некоторых видов используемых в сельском хозяйстве организмов, таких как жвачные животные с многокамерным желудком. Соответственно, в некоторых случаях жвачным животным требуется меньше добавок в рацион неорганического фосфата и минералов, поскольку микроорганизмы в рубце продуцируют ферменты, которые катализируют превращение фитата (миоинозитгексафосфата) в инозит и неорганический фосфат. В ходе указного процесса минералы, которые были в комплексе с фитатом, высвобождаются. Однако большинство видов используемых в сельском хозяйстве организмов неспособны эффективно утилизировать связанные с фитатом минеральные вещества. Поэтому, например, при производстве животноводческой продукции с использованием животных с однокамерным желудком (например, свиней, птиц и рыб) в корм обычно добавляют минеральные вещества и/или антибиотики, которые изменяют среду флоры в пищеварительном тракте потребляющего организма, увеличивая скорость роста.
В связи с вышесказанным существует множество обременяющих проблем - связанных с питанием, стадиями переработки ех νίνο, здравоохранением и медициной, сохранением окружающей среды и использованием ресурсов - которые связаны с недостаточным гидролизом фитата при многих применениях. Ниже приведены неограничивающие примеры следующих проблем.
1) Добавление в рацион неорганических минералов является дорогостоящим.
2) Присутствие негидролизованного фитата нежелательно и создает проблемы при многих применениях ех νίνο (например, вызывая нежелательный осадок).
3) Добавление в рацион антибиотиков создает угрозу для здоровья человека и животных, подобную увеличению распространенности устойчивых к антибиотикам патогенов.
4) Выделение с экскрементами не всасываемых минералов в окружающую среду нарушает и повреждает экосистемы окружающих почв, воды в рыбоводческом хозяйстве и в целом поверхностных вод.
5) Ценные питательные возможности многих потенциальных пищевых продуктов в значительной степени остаются неиспользованными и растраченными впустую.
Следовательно, содержащие фитаты пищевые продукты требуют добавления экзогенных питательных веществ и/или источника фитазной активности для повышения недостаточных пищевых возможностей при потреблении очень большим количеством видов организмов.
Следовательно, существует необходимость в средствах достижения эффективного и экономичного
- 1 021178 гидролиза фитата при различных применениях. В частности, существует необходимость в средствах оптимизации гидролиза фитата при коммерческих применениях. В конкретном аспекте существует необходимость в оптимизации коммерческих способов обработки, которые повышают питательные возможности содержащих фитаты пищевых продуктов, используемых для потребления человеком и сельскохозяйственными животными.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активность, к кодирующим их полинуклеотидам, к применениям полинуклеотидов и полипептидов по изобретению и способам получения и выделения таких полинуклеотидов и полипептидов. В одном из аспектов изобретение относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью в условиях высокой температуры, и к фитазам, которые сохраняют активность после воздействия высоких температур. Фитазы по изобретению можно использовать в продуктах питания для повышения пищевой ценности богатых фитатом ингредиентов. Фитазы по изобретению могут быть получены в виде продуктов питания или кормов или пищевых или кормовых добавок, например, для содействия в расщеплении фитата. Продукты питания или корма по изобретению могут быть в форме гранул, таблеток, пилюль, жидкостей, порошков, спреев и тому подобного. В одном из аспектов фитазы по изобретению стабильны по отношению к термической денатурации во время гранулирования; и такое свойство снижает стоимость фитазного продукта при сохранении эффективности ίη νίνο и выявлении активности в кормах.
Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим (а) (ί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, обладающий фитазной активностью, и которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентична последовательности 8ЕО ГО N0:1, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание;
(ίί) полинуклеотид, кодирующий полипептид, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентичен последовательности 8Е0 ГО N0:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание; или (a) (ί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, обладающий фитазной активностью, и которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99%, или более идентична последовательности 8Е0 ГО N0:1, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание;
(ίί) полинуклеотид, кодирующий полипептид, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентичен последовательности 8Е0 ГО N0:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание; или (ίίί) последовательность нуклеиновой кислоты по (ί) или (ίί), при этом идентификационную информацию о последовательности получают в результате анализа с использованием алгоритма сравнения последовательностей или визуального просмотра, и, необязательно, алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВЬА8Т, версию 2.2.2, при этом используют следующие настройки фильтра Ыа51а11-р Ь1а81р-бпг ра1аа -Р Р, и все другие параметры устанавливают по умолчанию;
(b) нуклеиновую кислоту по п.(а), где по меньшей мере одной мутацией является мутация: А109У, А232Р, А236Н, А236Т, А248Ь, А248Т, А274Р, Α274Ι, А274Ь, А274Т, А274У, А429Р, С155У, Ό139Υ, Е113Р, Ρ147Υ, Р194Ь, 0171М, 01718, О257А, О257К, О353С, О395Е, 0395Ι, О395Ь, О395Ц, О395Т, 067А, Н263Р, Н272\, Ι107Η, Ι107Ρ, 1108А, П08Ц, Ι108Κ, Ι1088, Ι108Υ, Ι174Ρ, Ι174Ρ, Ι4270, Ι4278, Ι427Τ, К151Н, К151Р, Ь126К, Ь146К, Ь146Т, Ь150Т, Ε150Υ, Ь157С, Ь157Р, Ь1678, Ь192Р, Ь216Т, Ε235Ι, Ь2448, Ε269Ι, Ь269Т, Ь296Т, Ь3798, Ь379У, Ь50\, М51А, М510, М51Ь, М48К, М48М, М48К, М61К, №66Р, №39Е, №48К, \2'48\\2 Р100А, Р145Ц Р149Ц Р149Н Ρ217Ό, Р2170, Р217Ц Р2178, Р2548, Р269Ц Р343Е, Р343ф Р343Ь, Р343Н Р343К, Р343У, Ц137Р, Ц137Ь, Ц137У, Ρ137Υ, Ц246\, Ц247Н, Ц275Н, 0.30912 Ц377К, Ц3818, 0861Е 8102А, 8102Υ, 81730, 8173Н, 8173У, 81970, 8208Р, 8211Н, 8218Ι, 8218Υ, 8389Н, 8389У, Т163Р, Т282Н, Т291У, Т291\, Т341И, Т48Р, Т48Н, Т48], Т48К, Т48Ь, Т48М, Т48У, Т48\, Τ48Υ, У162Ь, У162Т, У191А, У422М, \265Ь, Υ79Ι Ε Υ79Η Υ798 или Υ79\;
(c) нуклеиновую кислоту по п.(Ь), где полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну из мутаций: С226И, Ό164Κ, 0179К, М59У, О275У, Т163К или Τ349Υ; или (ά) последовательности, полностью комплементарные указанным. Все указанные нуклеиновые кислоты являются нуклеиновыми кислотами по изобретению, кодирующими полипептиды по изобретению.
В одном из аспектов алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм ВЬА8Т, версию 2.2.2, где используют установки фильтра Ь1а81а11-р Ь1а81р-б пг ра1аа-РР, и все другие параметры устанавливают по умолчанию.
В одном из аспектов в последовательностях нуклеиновых кислот по изобретению отсутствует гомологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальную последовательность, последовательность пробелка или последовательность промотора. В другом аспекте нуклеиновые кислоты по изобретению дополнительно содержат гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, при этом, необязательно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состо- 2 021178 ит из последовательности, кодирующей гетерологичную сигнальную последовательность, метку, эпитоп или последовательность промотора. В другом аспекте гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует гетерологичную сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из Νконцевого и/или С-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ЭС) или эндомембрану или в эндоплазматическую сеть (ЭС) или систему эндомембран растений, или гетерологичная последовательность кодирует сайт рестрикции. В еще одном аспекте гетерологичная промоторная последовательность содержит или состоит из конститутивного или индуцируемого промотора или специфичного для типа клеток промотора или специфичного для растения промотора или специфичного для кукурузы промотора.
В одном из аспектов фитазная активность включает катализ преобразования фитата (миоинозитгексафосфата) в инозит и неорганический фосфат; или гидролиза фитата (миоинозитгексафосфата). В другом аспекте фитазная активность включает катализ гидролиза фитата в корме, пищевом продукте или напитке или в корме, пищевом продукте или напитке, содержащем корм для животных на основе зерновых культур, сусле или пиве, тесте, фруктах или овощах; или катализ гидролиза фитата в клетке микроорганизма, клетке гриба, клетке млекопитающего или клетке растения.
В одном из аспектов фитазы по изобретению являются термоустойчивыми и, необязательно, полипептид сохраняет фитазную активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100°С до примерно -80°С, примерно от -80°С до примерно -40°С, примерно от -40°С до примерно -20°С, примерно -20°С до примерно 0°С, примерно от 0°С до примерно 37°С, примерно от 0°С до примерно 5°С, примерно от 5°С до примерно 15°С, примерно от 15°С до примерно 25°С, примерно от 25°С до примерно 37°С, примерно от 37°С до примерно 45°С, примерно от 45° С до примерно 55 °С, примерно от 55° С до примерно 70°С, примерно от 70°С до примерно 75°С, примерно от 75°С до примерно 85°С, примерно от 85°С до примерно 90°С, примерно от 90°С до примерно 95°С, примерно от 95°С до примерно 100°С, примерно от 100°С до примерно 105°С, примерно от 105°С до примерно 110°С, примерно от 110°С до примерно 120°С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. В одном из аспектов фитазы по изобретению являются термостабильными, и, необязательно, фитаза сохраняет активность при температуре в диапазоне примерно от -100°С до примерно -80°С, примерно от -80°С до примерно -40°С, примерно от -40°С до примерно -20°С, примерно от -20°С до примерно 0°С, примерно от 0°С до примерно 3 7°С, примерно от 0°С до примерно 5°С, примерно от 5°С до примерно 15°С, примерно от 15°С до примерно 25°С, примерно от 25°С до примерно 37°С, примерно от 37°С до примерно 45°С, примерно от 45°С до примерно 55°С, примерно от 55°С до примерно 70°С, примерно от 70°С до примерно 75°С, примерно от 75°С до примерно 85°С, примерно от 85 °С до примерно 90°С, примерно от 90°С до примерно 95°С, примерно от 95°С до примерно 100°С, примерно от 100°С до примерно 105°С, примерно от 105°С до примерно 110°С, примерно от 110°С до примерно 120°С, или при 95, 96, 97, 98°С, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше.
В другом варианте фитазы по изобретению являются термоустойчивыми или термоактивными при кислом рН - примерно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или меньше, или полипептид фитазы является термоустойчивым или термоактивным примерно при рН 7, рН 7,5, рН 8,0, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10, рН 10,5, рН 11,0, рН 11,5, рН 12,0, рН 12,5 или выше.
Изобретение относится к кассетам экспрессии, векторам, носителям для клонирования, векторам экспрессии и клонирующим векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим входящую в их состав нуклеиновую кислоту по изобретению (которые включают нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению), при этом, необязательно, кассета экспрессии, носитель для клонирования или вектор содержит или является вирусным вектором, плазмидой, фагом, фагмидой, космидой, фосмидой, бактериофагом или искусственной хромосомой, вирусный вектор содержит или является аденовирусным вектором, ретровирусным вектором или вектором на основе аденоассоциированного вируса, или кассета экспрессии, носитель для клонирования или вектор содержит или является бактериальной искусственной хромосомой (ВАС), полученным из бактериофага Р1 вектором (РАС), дрожжевой искусственной хромосомой (УАС) или искусственной хромосомой млекопитающих (МАС).
Изобретение относится к трансформированным клеткам, трансдуцированным клеткам, клеткамхозяевам и тому подобному, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению (включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению) или кассету экспрессии, вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению, при этом, необязательно, клетка является бактериальной клеткой, клеткой млекопитающего, клеткой гриба, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой.
Изобретение относится к трансгенным животным, отличным от человека, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению (включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению) или кассету экспрессии, вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению, при этом, необязательно, животным является мышь, крыса, коза, кролик, овца, свинья или корова.
- 3 021178
Изобретение относится к трансгенным растениям (включая части растений, например, обработанные или собранные, например, листья, стебли, корни или плоды) или семенам, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению или имеющим находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению (включая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению) или кассету экспрессии, вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению, при этом, необязательно, растение является растением кукурузы, растением картофеля, растением томата, растением пшеницы, растением масличной культуры, растением рапса, растением сои или растением табака, и, необязательно, семя является семенем кукурузы, зерном пшеницы, семенем масличной культуры, семенем рапса, семенем сои, ядром кокосового ореха, семенем подсолнечника, семенем кунжута, арахиса или семенем растения табака. В альтернативных вариантах растение или семя, полученное из семени или растения по изобретению, или растение или семя по изобретению могут включать зерновые культурные растения, например кукурузу, люцерну, подсолнечник, Вгаккюа, сою, сахарный тростник, хлопчатник, сафлор, арахис, сорго, пшеницу, овес, рожь, просо, ячмень, рис, хвойные растения, бобовые культуры, например горох, бобы и сою, содержащие крахмал клубни/корни, например картофель, батат, маниок, колоказию, канну и сахарную свеклу и тому подобное, или растением может быть растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои или растение табака или фуражное и/или кормовое растение для животного или для жвачного животного, или растение может быть или включает фуражное или кормовое растение, например сенокосное растение, кукурузу, просо, сою, пшеницу, гречиху, ячмень, люцерну, рожь, однолетние травы, сорго, суданскую траву, травы саванны или ценхрус реснитчатый; или семя представляет собой семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличной культуры, семя рапса, семя сои, ядро кокосового ореха, семя подсолнечника, семя кунжута, арахис или семя арахиса, семя люцерны, семя хлопчатника, семя сафлора, семя сорго, зерно овса, семя ржи, семя проса, семя ячменя, зерно риса, семя гороха или семя растения табака, или растением является кукуруза, люцерна, подсолнечник, Вгаккюа, соя, сахарный тростник, хлопчатник, сафлор, арахис, сорго, пшеница, овес, рожь, просо, ячмень, рис, хвойные растения, горох, бобы, соя, картофель, батат, маниок, колоказию, канну или сахарную свеклу.
Изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим нуклеиновую кислоту, которая является антисмысловой по отношению к нуклеиновой кислоте по изобретению и кодирующей по меньшей мере одну мутацию, указанную в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание, при этом, необязательно, антисмысловой олигонуклеотид имеет длину примерно от 10 до 50, примерно от 20 до 60, примерно от 30 до 70, примерно от 40 до 80, примерно от 60 до 100 или примерно от 50 до 150 оснований. Изобретение также относится к рибозимам и/или интерферирующей РНК (например, ми-РНК или микроРНК), содержащей антисмысловые последовательности по изобретению.
Изобретение относится к способам ингибирования трансляции мРНК фитазы в клетке, включающим введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида по изобретению.
Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим (a) (ί) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновыми кислотами по изобретению;
(ίί) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию, указанную в таблице 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание; или (ш) полипептид по п.(1) или (ίί), при этом идентификационную информацию о последовательности получают в результате анализа с использованием алгоритма сравнения последовательностей или с помощью визуального просмотра;
(b) полипептид по п.(а), при этом по меньшей мере одной мутацией является мутация: А109У, А232Р, А236Н, А236Т, Л248Ь, А248Т, Л274Р, Α274Ι, А274Ь, А274Т, А274У, А429Р, С155У, Ό139Υ, Е113Р, Ρ147Υ, Р194Ь, О171М, 01718, О257А, О257К, О353С, О395Е, Ο395Ι, О395Ь, О395Ц, О395Т, О67А, Н263Р, Н272А, Ι107Η, Ι107Ρ, Ι108Α, 1108Ц, Ι108Κ, Ι1088, Ι108Υ, Ι174Ρ, Ι174Ρ, 1427О, Ι4278, Ι427Τ, К151Н, К151Р, Ь126К, Ь146К, Ь146Т, Ь150Т, Ε150Υ, Ь157С, Ь157Р, Ь1678, Ь192Р, Ь216Т, Ε235Ι, Ь2448, Ε269Ι, Ь269Т, Ь296Т, Ь3798, Ь379У, Ь50А, М51А, М51О, М51Ь, Ν148Κ, Ν148Μ, Ν148Κ, Ν161Κ, Ν266Ρ, Ν339Ε, Ν348Κ, Ν348Α, Р100А, Р145Ь, Р149Ь, Ρ149Ν, Ρ217Ό, Р217О, Р217Ь, Р2178, Р2548, Р269Ь, Р343Е, Ρ343Ι, Р343Ь, Ρ343Ν, Р343К, Р343У, Ц137Р, Ц137Ь, Ц137У, Ρ137Υ, Ц246А, Ц247Н, Ц275Н, Ц309Р, Ц377К, Ц3818, 08611. 8102А, 8102Υ, 8173О, 8173Н, 8173У, 8197О, 8208Р, 8211Н, 8218Ι, 8218Υ, 8389Н, 8389У, Т163Р, Т282Н, Т291У, Т291А, Т341И, Т48Р, Т48Н, Т48Т, Т48К, Т48Ь, Т48М, Т48У, Т48А, Τ48Υ, У162Ь, У162Т, У191А, У422М, А265Ь, Υ79^ Υ79Ν, Υ798 или Υ79Α; или (c) полипептид по п.(Ь), при этом полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну из мутаций: С226И, Ό164Κ, О179К, М59У, Ц275У, Т163К или Τ349Υ.
В одном из аспектов фитазная активность включает катализ превращения фитата (миоинозитгексафосфата) в инозит и неорганический фосфат; или гидролиза фитата (миоинозитгексафосфата). В другом аспекте фитазная активность включает катализ гидролиза фитата в корме, пищевом продукте или напитке или в корме, пищевом продукте или напитке, содержащем корм для животных на основе зерновых
- 4 021178 культур, сусло или пиво, тесто, фрукты или овощи; или катализ гидролиза фитата в клетке микроорганизма, клетки гриба, клетке млекопитающего или клетке растения.
Изобретение относится к полипептидам по изобретению, которые обладают фитазной активностью, активность которых является термоустойчивой и, необязательно, полипептид сохраняет фитазную активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100°С до примерно -80°С, примерно -80°С до примерно -40°С, примерно от -40°С до примерно -20°С, примерно от -20°С до примерно 0°С, примерно от 0°С до примерно 5°С, примерно от 5°С до примерно 15°С, примерно от 15°С до примерно 25°С, примерно от 25°С до примерно 37°С, примерно от 37°С до примерно 45°С, примерно от 45°С до примерно 55°С, примерно от 55°С до примерно 70°С, примерно от 70°С до примерно 75°С, примерно от 75°С до примерно 85°С, примерно от 85°С до примерно 90°С, примерно от 90°С до примерно 95°С, примерно от 95°С до примерно 100°С, примерно от 100°С до примерно 105°С, примерно от 105°С до примерно 110°С, примерно от 110°С до примерно 120°С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. Термоустойчивые полипептиды по изобретению могут сохранять активность, например, фитазную активность, после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100°С до примерно -80°С, примерно от -80°С до примерно -40°С, примерно от 40°С до примерно -20°С, примерно от -20°С до примерно 0°С, примерно от 0°С до примерно 5°С, примерно от 5°С до примерно 15°С, примерно от 15°С до примерно 25°С, примерно от 25°С до примерно 37°С, примерно от 37°С до примерно 45°С, примерно от 45°С до примерно 55°С, примерно от 55°С до примерно 70°С, примерно от 70°С до примерно 75°С, примерно от 75°С до примерно 85°С, примерно от 85°С до примерно 90°С, примерно от 90°С до примерно 95°С, примерно от 95°С до примерно 100°С, примерно от 100°С до примерно 105°С, примерно от 105°С до примерно 110°С, примерно от 110°С до примерно 120°С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. В некоторых вариантах термоустойчивые полипептиды по изобретению сохраняют активность, например, фитазную активность, после воздействия температуры в описанных выше диапазонах, примерно при рН 3,0, примерно рН 3,5, примерно рН 4,0, примерно рН 4,5, примерно рН 5,0, примерно рН 5,5, примерно рН 6,0, примерно рН 6,5, примерно рН 7,0, примерно рН 7,5, примерно рН 8,0, примерно рН 8,5, примерно рН 9,0, примерно рН 9,5, примерно рН 10,0, примерно рН 10,5, примерно рН 11,0, примерно рН 11,5, примерно рН 12,0 или выше.
Изобретение относится к полипептидам по изобретению, которые обладают фитазной активностью, активность которых является термостабильной. Например, полипептид по изобретению может быть термостабильным. Термостабильный полипептид по изобретению может сохранять связывающую и/или ферментативную активность, например, фитазную активность, в условиях, включающих диапазон температур примерно от -100°С до примерно -80°С, примерно от -80°С до примерно -40°С, примерно от -40°С до примерно -20°С, примерно от -20°С до примерно 0°С, примерно от 0°С до примерно 37°С, примерно от 0°С до примерно 5°С, примерно от 5°С до примерно 15°С, примерно от 15°С до примерно 25°С, примерно от 25°С до примерно 37°С, примерно от 37°С до примерно 45°С, примерно от 45°С до примерно 55°С, примерно от 55°С до примерно 70°С, примерно от 70°С до примерно 75°С, примерно от 75°С до примерно 85°С, примерно от 85°С до примерно 90°С, примерно от 90°С до примерно 95°С, примерно от 95°С до примерно 100°С, примерно от 100°С до примерно 105°С, примерно от 105°С до примерно 110°С, примерно от 110°С до примерно 120°С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. Термостабильные полипептиды по изобретению могут сохранять активность, например фитазную активность, в диапазоне температур примерно от -100°С до примерно -80°С, примерно от -80°С до примерно -40°С, примерно от -40°С до примерно -20°С, примерно от -20°С до примерно 0°С, примерно от 0°С до примерно 5°С, примерно от 5°С до примерно 15°С, примерно от 15°С до примерно 25°С, примерно от 25°С до примерно 37°С, примерно от 37°С до примерно 45°С, примерно от 45°С до примерно 55°С, примерно от 55°С до примерно 70°С, примерно от 70°С до примерно 75°С, примерно от 75°С до примерно 85°С, примерно от 85°С до примерно 90°С, примерно от 90°С до примерно 95°С, примерно от 95°С до примерно 100°С, примерно от 100°С до примерно 105°С, примерно от 105°С до примерно 110°С, примерно от 110°С до примерно 120°С, или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или выше. В некоторых вариантах термостабильные полипептиды по изобретению сохраняют активность, например фитазную активность, при температурах в описанных выше диапазонах примерно при рН 3,0, примерно рН 3,5, примерно рН 4,0, примерно рН 4,5, примерно рН 5,0, примерно рН 5,5, примерно рН 6,0, примерно рН 6,5, примерно рН 7,0, примерно рН 7,5, примерно рН 8,0, примерно рН 8,5, примерно рН 9,0, примерно рН 9,5, примерно рН 10,0, примерно рН 10,5, примерно рН 11,0, примерно рН 11,5, примерно рН 12,0 или выше.
Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность по изобретению и (а) не имеющим гомологичной сигнальной последовательности (лидерного пептида) или последовательности пробелка; (Ь) не имеющим сигнальной последовательности (лидерного пептида) и дополнительно содержащим гетерологичную сигнальную последовательность (лидерный пептид); (с) аминокислотную последовательность по п.(а) или (Ь) и дополнительно содержащим гетерологичную последовательность, при этом, необязательно, гетеро- 5 021178 логичная последовательность содержит или состоит из гетерологичной сигнальной последовательности или метки или эпитопа, или гетерологичная последовательность содержит пептид для идентификации. В одном из аспектов гетерологичная сигнальная последовательность содержит или состоит из Ν-концевого и/или С-концевого удлинения для направления в эндоплазматическую сеть (ЭС) или эндомембрану, или в эндоплазматическую сеть (ЭС) или эндомембранную систему растения, или гетерологичная аминокислотная последовательность содержит или состоит из сайта-мишени фермента. В другом аспекте полипептид по изобретению дополнительно содержит дополнительные аминокислотные остатки между сигнальной последовательностью (лидерной последовательностью или лидерным пептидом) и ферментом.
В одном из аспектов фитазная активность любого полипептида по изобретению включает (имеет) удельную активность: примерно при 37°С в диапазоне примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка; или, примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка; или при 37°С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка; или при 37°С в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка. В одном из аспектов термоустойчивая фитазная активность включает удельную активность после воздействия температуры примерно 37°С в диапазоне примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37°С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37°С в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка. В одном из аспектов термостабильная фитазная активность включает удельную активность в условиях, включающих температуру примерно 37°С, в диапазоне примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37°С в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка; или термостабильная фитазная активность включает удельную активность при 37°С в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка.
В одном из аспектов полипептид по изобретению гликозилирован или содержит по меньшей мере один участок гликозилирования, при этом, необязательно, гликозилирование является Ν-связанным гликозилированием или О-связанным гликозилированием, и, необязательно, полипептид гликозилируется после экспрессии в дрожжах, которые, необязательно, являются дрожжами Р. ра81ог18 или 8. ротЬе.
В одном из аспектов полипептид сохраняет фитазную активность в условиях, включающих значение рН примерно рН 6,5, рН 6, рН 5,5, рН 5, рН 4,5, рН 4,0, рН 3,5, рН 3,0 или меньшее (более кислое значение) рН. Альтернативно полипептид по изобретению может сохранять фитазную активность в условиях, включающих значение рН примерно рН 7,5, рН 8, рН 8,5, рН 9, рН 9,5, рН 10,0, рН 10,5, рН 11,0, рН 11,5, рН 12, рН 12,5 или более высокое (более щелочное) значение рН.
Изобретение относится к препаратам белка, содержащим полипептид по изобретению, при этом препарат белка содержит жидкость, взвесь, порошок, спрей, суспензию, лиофилизированную композицию/препарат, твердое вещество, гелеобразные таблетки, пилюли, имплантат, гель; или фармацевтический препарат, пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, добавку к пище, добавку к корму, питательную добавку или добавку в рацион.
Изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид по изобретению, и в одном из аспектов гетеродимер содержит второй домен, при этом, необязательно, второй домен представляет собой полипептид и гетеродимер, является слитым белком, и, необязательно, второй домен является эпитопом или меткой.
Изобретение относится к иммобилизованным полипептидам, содержащим полипептид по изобретению, при этом иммобилизованный полипептид может содержать гомодимер или гетеродимер по изобретению, при этом, необязательно, полипептид иммобилизован внутри или на клетке, везикуле, липосоме, пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, планшете, матрице, капиллярной трубке, кристалле, таблетке, пилюли, капсулы, порошке, агломерате, поверхности или пористой структуре. В одном из аспектов изобретение относится к матрицам (например, микроматрицам), содержащим иммобилизованный полипептид, при этом полипептид содержит полипептид по изобретению или гетеродимер по изобретению, или нуклеиновую кислоту по изобретению или их сочетание.
Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с полипептидом по изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по изобретению, при этом, необязательно, антитело является моноклональным или поликлональным антителом. Изобретение относится к гибридомам, содержащим антитело по изобретению.
Изобретение относится к способам получения рекомбинантного полипептида, включающим: (а) получение нуклеиновой кислоты, при этом нуклеиновая кислота содержит последовательность по изобретению; и (Ь) экспрессию нуклеиновой кислоты по п.(а) в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии полипептида, с получением при этом рекомбинантного полипептида, и, необязательно, способ дополнительно включает трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой по п.(а) с после- 6 021178 дующей экспрессией нуклеиновой кислоты по п.(а) с получением при этом рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке-хозяине. В альтернативном варианте нуклеиновую кислоту функционально связывают с промотором перед трансформацией клетки-хозяина.
Изобретение относится к способам идентификации полипептида, обладающего фитазной активностью, включающим: (а) получение полипептида по изобретению; (Ь) получение субстрата фитазы; и (с) осуществление контакта полипептида или его фрагмента или варианта по п. (а) с субстратом по п. (Ь) и выявление уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции является показателем присутствия полипептида, обладающего фитазной активностью.
Изобретение относится к способам идентификации субстрата фитазы, включающим: (а) получение полипептида по изобретению; (Ь) получение тестируемого субстрата; и (с) осуществление контакта полипептида по п.(а) с тестируемым субстратом по п.(Ь) и выявление уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции позволяет идентифицировать тестируемый субстрат как субстрат фитазы.
Изобретение относится к способам определения того, связывается ли соединение специфично с полипептидом, включающим: (а) экспрессию нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, обеспечивающих возможность трансляции нуклеиновой кислоты в полипептид, при этом нуклеиновая кислота содержит последовательность по изобретению; (Ь) осуществление контакта полипептида с тестируемым соединением; и (с) определение того, связывается ли тестируемое соединение специфично с полипептидом, тем самым определяют, связывается ли соединение специфично с полипептидом.
Изобретение относится к способам идентификации модулятора фитазной активности, включающим: (а) получение полипептида фитазы по изобретению; (Ь) получение тестируемого соединения; (с) осуществление контакта полипептида по п.(а) с тестируемым соединением по п.(Ь) и измерение активности фитазы, при этом изменение фитазной активности, измеренной в присутствии тестируемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения обеспечивает определение того, что тестируемое соединение модулирует фитазную активность, при этом, необязательно, фитазную активность измеряют, получая субстрат фитазы и определяя увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции, и, необязательно, уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения свидетельствует о том, что тестируемое соединение является активатором фитазной активности, и, необязательно, увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения свидетельствует о том, что тестируемое соединение является ингибитором фитазной активности.
Изобретение относится к способам гидролиза инозитгексафосфата до инозита и неорганического фосфата, включающим: (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность по изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению; (Ь) получение композиции, содержащей инозитгексафосфат, и (с) осуществление контакта полипептида по п.(а) с композицией по п.(Ь) в условиях, в которых полипептид гидролизует инозитгексафосфат с образованием инозита и неорганического фосфата, при этом, необязательно, условия включают температуру примерно от 37°С до примерно 70°С, примерно от 50°С до примерно 80°С, или примерно от 60°С до примерно 90°С, и, необязательно, композиция содержит фитиновую кислоту.
Изобретение относится к способам дегуммирования масла, включающим: (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность по изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению; (Ь) получение композиции, содержащей растительное масло; и (с) осуществление контакта полипептида по п.(а) и растительного масла по п.(Ь) в условиях, в которых полипептид может расщеплять связь между инозитом и неорганическим фосфатом, таким образом осуществляя дегуммирование растительного масла.
Изобретение относится к способам получения корма, или продукта питания, или кормовой, или пищевой добавки, или добавки к пищевому продукту или корму, или добавки питательного вещества, или добавки в рацион, включающим: (а) трансформацию растения, части растения или растительной клетки полинуклеотидом, кодирующим полипептид фермента фитазы, при этом фитаза содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по изобретению; (Ь) культивирование растения, части растения или растительной клетки в условиях, в которых экспрессируется фермент фитаза, и (с) превращение растения, частей растения или растительной клетки в композицию, подходящую для продукта питания, корма, пищевой добавки, кормовой добавки, добавки к пище, добавки в корм, добавки питательного вещества или добавки в рацион, или добавление культивируемого растения, части растения или растительной клетки в
- 7 021178 пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, добавку к пище, добавку к корму, добавку питательного вещества или добавку в рацион с получением таким образом продукта питания, корма, пищевой добавки, кормовой добавки, добавки к пище, добавки в корм, добавки питательного вещества или добавки в рацион, при этом, необязательно, полинуклеотид находится в векторе экспрессии, и, необязательно, вектор содержит последовательность регуляции экспрессии, способную экспрессировать нуклеиновую кислоту в растительной клетке, и, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, добавка к пище, добавка в корм, добавка питательного вещества или добавка в рацион предназначены для животного, и, необязательно, при этом животное является животным с однокамерным желудком, и, необязательно, животным является жвачное животное, и, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, добавка к пище, добавка в корм, добавка питательного вещества или добавка в рацион имеет форму матрикса для доставки, гранулы, таблетки, геля, жидкостей, спрея, молотого зерна или порошка. В одном из аспектов фермент фитаза гликозилирован, чтобы обеспечить термоустойчивость или термостабильность в условиях гранулирования, и, необязательно, матрикс для доставки образуют гранулированием смеси, содержащей зародыш зерна и фермент фитазу, получая частицу, и, необязательно, гранулы получают в условиях, включающих применение пара, необязательно, гранулы получают в условиях, включающих применение температуры свыше 80°С в течение примерно 5 мин, и, необязательно, гранула содержит фермент фитазу, который имеет удельную активность по меньшей мере от 350 до примерно 900 единиц на миллиграмм фермента.
Изобретение относится к способам доставки добавки фермента фитазы в организм животного или человека, при этом указанный способ включает: (а) получение съедобного матрикса для доставки, содержащей съедобный носитель и фермент фитазу, содержащий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по изобретению, при этом матрикс легко распределяется и высвобождает фермент фитазу при помещении в водную среду, и (Ь) введение съедобного матрикса для доставки фермента животному или человеку, при этом, необязательно, съедобный матрикс для доставки содержит гранулированный съедобный носитель, и, необязательно, съедобный матрикс для доставки имеет форму гранул, таблеток, гелей, жидкостей, спреев или порошков, и, необязательно, съедобный носитель включает носитель, выбранный из группы, состоящей из зародыша зерна, сена, люцерны, тимофеевки, соевой шелухи, муки из семян подсолнечника, кукурузной муки, соевой муки и пшеничной муки, и, необязательно, съедобный носитель содержит зародыш зерна, который обеднен в отношении масла.
Изобретение относится к пищевому продукту, корму, пищевой добавке, кормовой добавке, добавке к пище, добавке в корм, добавке питательного вещества или добавке в рацион для животного или человека, содержащему полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной. В одном из аспектов пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, добавку к пище, добавку в корм, добавку питательного вещества или добавку в рацион производят в виде гранулы, пилюли, таблетки, капсулы, геля, гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лиофилизированного препарата, фармацевтического препарата, жидкой формы, в виде суспензии или взвеси, или получают, используя покрытые полимером добавки, или производят в гранулированной форме, или получают с использованием распылительной сушки.
Изобретение относится к съедобному или рассасываемому матриксу (матриксам) для доставки фермента, содержащему полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной. В одном из аспектов съедобный матрикс для доставки содержит гранулу, или съедобный или рассасываемый матрикс для доставки фермента производят в виде гранулы, пилюли, таблетки, капсулы, геля, гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лиофилизированного препарата, фармацевтического препарата, жидкой формы, в виде суспензии или взвеси или получают, используя покрытые полимером добавки, или производят в гранулированной форме или получают с использованием распылительной сушки.
Изобретение относится к съедобным или рассасываемым гранулам, содержащим гранулированный съедобный или рассасываемый носитель и полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной, и, необязательно, гранулу производят в форме гранулы или в виде пилюли, таблетки, капсулы, геля, гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лиофилизированного препарата, фармацевтического препарата, в жидкой форме, в виде суспензии или взвеси, или получают с использованием покрытых полимером добавок или производят в гранулированной форме или получают с использованием распылительной сушки.
Изобретение относится к продуктам питания, например соевому продукту, содержащему полипептид по изобретению или гомодимер или гетеродимер по изобретению, и, необязательно, продукт питания, например, соевый продукт питания, производят в виде гранулы, пилюли, таблетки, капсулы, геля, гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лиофилизированного препарата или в жидкой форме.
Изобретение относится к способам повышения устойчивости полипептида фитазы к ферментативной инактивации в пищеварительной системе животного, при этом способ включает гликозилирование
- 8 021178 полипептида фитазы, содержащего полипептид по изобретению, и таким образом повышение устойчивости полипептида фитазы к ферментативной инактивации в пищеварительной системе животного, и, необязательно, гликозилирование является Ν-связанным гликозилированием, и, необязательно, полипептид фитазы гликозилирован в результате экспрессии ίη νίνο в клетке полинуклеотида, кодирующего фитазу, и, необязательно, клетка является эукариотической клеткой, и, необязательно, эукариотическая клетка является клеткой гриба, клеткой растения или клеткой млекопитающего.
Изобретение относится к способам обработки зерна кукурузы и сорго, включающим: (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью, при этом полипептид содержит полипептид по изобретению; (Ь) получение композиции, содержащей жидкий кукурузный экстракт или жидкий экстракт сорго; и (с) осуществление контакта полипептида по п. (а) и композиции по п. (Ь) в условиях, в которых полипептид может расщеплять связь инозита с неорганическим фосфатом.
Изобретение относится к фармацевтическим препаратам или диетическим препаратам, содержащим полипептид или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной; и, необязательно, фармацевтический или диетический препарат приготовлен в виде гранулы, пилюли, таблетки, капсулы, гелеобразной таблетки, спрея, порошка, лосьона или жидкой формы, или получен с использованием покрытых полимером добавок или в виде имплантата или произведен в гранулированной форме или получен с использованием распылительной сушки.
Изобретение относится к композициям, содержащим полипептид или гетеродимер по изобретению; и (Ь) любой продукт, который указан в табл. 2, или любую из композиций, указанных в табл. 1; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной.
Изобретение относится к индивидуальному пайку в виде набора готовых к употреблению продуктов для одноразового приема пищи (МКЕ), напитку или гидратирующему средству, содержащему полипептид или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной.
Изобретение относится к способам облегчения (замедления прогрессирования, лечения или профилактики) остеопороза, включающим введение индивидууму, нуждающемуся в таком облегчении, эффективного количества (дозы) композиции, содержащей полипептид или гетеродимер по изобретению; при этом, необязательно, полипептид гликозилирован, и, необязательно, фитазная активность является термоустойчивой или термостабильной.
Изобретение относится к способам повышения лабильности фитазы в желудке, включающим получение полипептида, обладающего фитазной активностью, и замену одной или нескольких аминокислот в последовательности, кодирующей полипептид, аргинином, гистидином, пролином, лейцином, серином, треонином или тирозином. Кроме того, изобретение относится к характерным фитазам для использования в способе, например, с последовательностью 8ЕО ГО N0:2 или другим фитазам по изобретению, которые подробно описаны в примере 2 ниже.
Изобретение относится к способам изменения по меньшей мере двух разных свойств фермента, которые подробно описаны в примере 2 ниже, включающим (а) получение полипептида, обладающего ферментативной активностью; (Ь) создание вариантов из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а); (с) скрининг вариантов по п.(Ь) в отношении двух разных свойств; (й) отбор требуемых вариантов по п.(с) и идентификацию одного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте; (е) создание новых вариантов, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по п.(й); (Г) скрининг вариантов по п.(е) в отношении двух измененных свойств; и (й) отбор требуемых вариантов по п.(Г) с двумя измененными свойствами. Изобретение относится к альтернативным способам изменения по меньшей мере двух разных свойств фермента, включающим (а) получение полипептида, обладающего ферментативной активностью; (Ь) создание вариантов из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а);
(с) скрининг вариантов по п.(Ь) в отношении одного измененного свойства;
(й) скрининг вариантов по п.(Ь) в отношении другого измененного свойства; (е) отбор требуемых вариантов по п.(с) и (й) и идентификацию одного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте;
(Г) создание новых вариантов, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по пп.(с) и (й);
(д) скрининг вариантов по п.(Г) в отношении двух измененных свойств; и (Ь) отбор требуемых вариантов по п.(д) с двумя измененными свойствами.
Изобретение, кроме того, относится к характерным способам создания вариантов, например, с использованием методики ΟδδΜ-эволюции, эволюции посредством вторичной сборки генов (ОепеКеак8етЬ1у) и/или ТМСА-эволюции.
Изобретение относится к способам разделения стабильности фитазы в желудке и термоустойчивости фитазы, как подробно описано в примере 2 ниже, включающим (а) получение полипептида, обла- 9 021178 дающего фитазной активностью; (Ь) создание вариантов фитазы из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а); (с) скрининг вариантов фитазы по п.(Ь) в отношении измененной стабильности в желудке и измененной термоустойчивости; (б) отбор вариантов по п.(с) с требуемой стабильностью в желудке и термоустойчивостью, и идентификацию отдельного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте; (е) создание новых вариантов фитазы, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по п.(б); (ί) скрининг вариантов по п.(е) в отношении измененной стабильности в желудке и измененной термоустойчивости; и (б) отбор вариантов по π.(ί) с требуемой стабильностью в желудке и термоустойчивостью. Изобретение относится к альтернативным способам разделения стабильности в желудке и термоустойчивости фитазы, включающим (а) получение полипептида, обладающего фитазной активностью; (Ь) создание вариантов фитаз из полипептида по п.(а), при этом каждый вариант имеет одно аминокислотное изменение по сравнению с полипептидом по п.(а); (с) скрининг вариантов фитазы по п.(Ь) в отношении измененной стабильности в желудке; (б) скрининг вариантов фитазы по п.(Ь) в отношении измененной термоустойчивости; (е) отбор вариантов по пп.(с) и (б) с требуемой стабильностью в желудке или термоустойчивостью, и идентификацию отдельного аминокислотного изменения в каждом выбранном варианте; (ί) создание новых вариантов фитазы, содержащих разные сочетания выбранных отдельных аминокислотных изменений по пп.(с) и (б); (д) скрининг вариантов по π.(ί) в отношении измененной стабильности в желудке и измененной термоустойчивости; и (к) отбор вариантов по п.(б) с требуемой стабильностью в желудке и термоустойчивостью. Изобретение, кроме того, относится к типичным способам создания вариантов, например, с использованием методики ΟδδΜ-эволюции, эволюции посредством вторичной сборки генов (ОеиеКеаккешЫу) и/или ТМСА-эволюции. Изобретение относится к характерным фитазам для применения в способах, например, с последовательностью δΕΟ ГО N0:2, и другим фитазам по изобретению. Изобретение относится к характерным мутациям, которые разделяют стабильность в желудке и термоустойчивость, например, мутациям, указанным в табл. 4, 5, 6, 7, 9, или любому их сочетанию.
Изобретение относится к фитазам, которые являются лабильными в желудке и термоустойчивыми, подробно описанным в примере 2 ниже, при этом фитаза полностью разрушается в стимулированном желудочном соке (δΟΡ) менее чем за 10 мин, менее чем за 8 мин, менее чем за 6 мин, менее чем за 4 мин или менее чем за 2 мин, и фитаза сохраняет активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от 75°С до примерно 85°С, примерно от 85°С до примерно 90°С, примерно от 90°С до примерно 95°С, или примерно от 80°С до примерно 86°С, например, фитазы по изобретению, которые подробно описаны в примере 2 ниже. В одном из аспектов лабильные в желудке и термоустойчивые фитазы по изобретению полностью разрушаются в стимулированном желудочном соке (δΟΡ) менее чем за 4 мин и фитаза сохраняет активность после воздействия температуры в диапазоне примерно от 80°С до примерно 86°С.
Подробности одного или нескольких аспектов изобретения указаны на сопровождающих чертежах и в описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения.
Все публикации, патенты, заявки на выдачу патентов, последовательности в ОепВапк и депозиты в АТСС, указанные в настоящем описании, тем самым специально включены в виде ссылки для всех целей.
Краткое описание чертежей
Следующие далее чертежи являются иллюстративными по отношению к аспектам изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения, который определен формулой изобретения.
Фиг. 1 иллюстрирует суммарные данные об остаточной активности очищенных полипептидов по изобретению, примеров последовательностей с единичными мутациями по изобретению после тепловой обработки при разных температурах в течение 30 мин; при этом фитазную активность анализировали с использованием флуоресцирующего субстрата и скорости сравнивали со скоростями для каждого соответствующего необработанного образца; как подробно описано в примере 1, ниже.
Фиг. 2 иллюстрирует суммарные данные об остаточной активности очищенных полипептидов по изобретению, содержащих смешанные отдельные мутации остатков (фитазы, содержащие множественные мутации), после тепловой обработки в термоциклере; при этом фитазную активность анализировали с использованием флуоресцирующего субстрата, и скорости сравнивали со скоростями для каждого соответствующего необработанного образца; как суммарно показано на фиг. 1; и как подробно описано в примере 1, ниже.
На фиг. 3 графически суммированы данные, используемые для построения графика на фиг. 1, которые подробно описаны в примере 1, ниже.
Фиг. 4 иллюстрирует последовательность исходной фитазы δΕΟ ГО N0:2 и созданные с использованием сайт-направленного насыщающего мутагенеза генов (ΟδδΜ) модификации последовательности, выбранные для конструирования библиотеки ОепеКеа88етЬ1у™, которые подробно описано ниже.
Фиг. 5 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих модификации нескольких остатков по сравнению с исходной последовательностью δΕΟ ГО N0:2, которые подробно описаны в настоящем описании.
- 10 021178
Фиг. 6 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих модификации одного остатка по сравнению с исходной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, которые подробно описаны в настоящем описании.
Фиг. 7 схематично иллюстрирует анализ примеров фитаз по изобретению с использованием флуоресцирующего субстрата 4-метилумбеллиферилфосфата (МеИМВ-фосфата); как подробно описано в примере 1 ниже.
Фиг. 8 схематично иллюстрирует анализ примеров фитаз по изобретению, в котором используют флуоресцирующий субстрат МеИМВ-фосфат; как подробно описано в примере 1, ниже.
Фиг. 9 схематично иллюстрирует протокол примера скрининга библиотеки, как описано на фигуре 8 и как подробно описано в примере 1 ниже.
Фиг. 10 иллюстрирует пример способа получения спирта, который может включать применение фитазы по настоящему изобретению.
Фиг. 11 и 11В иллюстрируют суммарные данные о термостабильности и лабильности в 8ОР фитазы аррА (ОепВапк, номер доступа М58708), промежуточных продуктов аррА-8ЕЦ ГО N0:2 и 8ЕЦ ГО N0:2, которые подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 12 иллюстрирует влияние Ык-метки на стабильность в 8ОР, которую определяли в анализах 8ОЕ с очищенными имеющими Ык-метку и не имеющими Ык-метку вариантами исходной фитазы (8ЕЦ ГО N0:2), как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 13 иллюстрирует термоустойчивость не имеющих гликозилирования вариантов последовательности 8Е0 ГО N0:2 (варианты 0ΕΥ1-0ΕΥ4) и двух контролей 8ЕЦ ГО N0:2, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 14 иллюстрирует стабильность в 80Р вариантов 8ЕЦ ГО N0:2-418 и 8ЕЦ ГО N0:2-6X, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 15 иллюстрирует утрату активности в 80Р мутантов, отобранных с использованием методики искусственной О88М-эволюции последовательности 8ЕЦ ГО N0:2, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 16 иллюстрирует влияние разных аминокислот на лабильность в 8ОР, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 17 иллюстрирует горячие точки мутаций, влияющих на лабильность в 8ОР, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 18 иллюстрирует лабильность в 8ОР 8ЕЦ ГО N0:2-418 и варианта О при разных дозах пепсина, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 19 иллюстрирует время полужизни последовательности 8ЕЦ ГО N0:2-418 и варианта О, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 20 иллюстрирует остаточную активность лабильных в 8ОР вариантов фитазы, как подробно описано в примере 2 ниже.
Фиг. 21 иллюстрирует удельную активность лабильного в 8ОР варианта фитазы по сравнению с 8Е0 ГО N0:2, как подробно описано в примере 2 ниже.
Сходными условными обозначениями на разных чертежах указаны подобные элементы.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к фитазным полипептидам, имеющим модификации конкретных остатков по сравнению с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, которая описана выше, и к кодирующим их полинуклеотидам (например, содержащим модификации конкретных пар оснований по сравнению с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:1, которая описана выше), а также к способам применения полинуклеотидов и полипептидов. Фиг. 6 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих одиночные модификации остатков по сравнению с исходной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2, и фиг. 5 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих множественные модификации остатков по сравнению с исходной последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2.
Фитазная активность полипептидов по изобретению может включать ферменты, обладающие фитазной активностью, например ферменты, способные катализировать расщепление фитата, например катализ расщепления фитата (миоинозитгексафосфата) до инозита и неорганического фосфата. Фитазы по изобретению включают термоустойчивые и терморезистентные ферменты.
Фитазы и полинуклеотиды, кодирующие фитазы по изобретению, применимы в ряде процессов, способов и композиций. Например, как обсуждается выше, фитазу можно использовать в корме для животных и кормовых добавках, а также при обработках, чтобы разрушить или удалить избыток фитата из окружающей среды или образца. Другие применения будут очевидны для специалистов в данной области на основе руководства, представленного в настоящем описании, включая руководства, обсуждаемые выше.
В одном из аспектов молекулы фитазы по изобретению - либо отдельно, либо в сочетании с другими реагентами (включая без ограничения ферменты, такие как протеазы, амилазы и тому подобные) применяют при обработке продуктов питания, например для предотвращения нежелательного кукурузного осадка, и в других применениях, при которых требуется гидролиз фитата.
В одном из аспектов молекулы фитазы по изобретению применяют для исключения или уменьше- 11 021178 ния присутствия негидролизованного фитата, особенно когда негидролизованный фитат приводит к проблемным последствиям в способах ех νίνο, включая без ограничения обработку продуктов питания. В одном из аспектов молекулы фитазы по изобретению применяют в способах, которые описаны в ЕР0321004-В1 (Уаага е! а1.), включая стадии обработки зерна кукурузы и сорго, при этом твердые зерна замачивают в воде для их размягчения. Растворимые в воде вещества, которые вымываются в ходе указанного процесса, становятся частью жидкого кукурузного экстракта, который концентрируют выпариванием. Негидролизованная фитиновая кислота в жидком кукурузном экстракте, главным образом в форме солей кальция и магния, связана с фосфором и осаждается в виде нежелательных осадков с белками и ионами металлов. Такой осадок создает проблемы при выпаривании, транспортировке и хранении жидкого кукурузного экстракт. Молекулы фитазы по изобретению применяют для гидролиза такого осадка.
В одном из аспектов фитазы по изобретению могут обеспечивать значительно более высокую прибыльность производства, чем ранее идентифицированные молекулы фитазы, например молекулы фитазы, полученные из грибов. В одном из аспектов ферменты по изобретению могут иметь активность примерно 4400 единиц/мг или больше чем примерно от 50 до 100, или от 50 до 1000, или от 100 до 4000 единиц/мг белка.
Изобретение также относится к способам изменения свойств фитазы по изобретению с помощью мутагенеза и другого способа, как подробно обсуждается ниже.
Создание и обработка нуклеиновых кислот
Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды и фитазы по изобретению. Изобретение также относится к кассетам экспрессии, векторам, таким как векторы экспрессии или клонирующие векторы, носителям для клонирования, таким как вирусный вектор, плазмида, фаг, фагмида, космида, фосмида, бактериофаг или искусственная хромосома, которые могут содержать или имеют находящуюся в них нуклеиновую кислоту по изобретению.
Изобретение также относится к способам обнаружения новых фитазных последовательностей с использованием нуклеиновых кислот по изобретению. Также предлагаются способы модификации нуклеиновых кислот по изобретению, например, с использованием вторичной сборки синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования, оптимизированной системы направленной эволюции и/или насыщающего мутагенеза.
В одном из аспектов изобретение относится к роду нуклеиновых кислот, которые являются синтетически созданными вариантами исходной последовательности 8ЕР ГО N0:1, при этом такие нуклеиновые кислоты по изобретению имеют по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с исходной последовательностью 8ЕР ГО N0:1, и кодируют по меньшей мере одну мутацию, указанную в таблице 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание.
Для информации исходная последовательность 8Е() ГО N0:1 представляет собой следующую последовательность:
аСдааадсда ЬсЬЬааЬссс аЬЬСЬЬаЬсЪ сЬЬсЬдаЬЬс сдЬЬаасссс дсааЬсЪдса 60
ЬЬсдсЬсада дЬдадссдда дсЬдаадсЪд дааадСдедд С.даЬЬдСсад ЬсдЬсаСддЬ 120
дЬдсдЬдсЬс саассааддс сасдсаасГд аЬдсаддаЬд Ъсассссада сдсаЪддсса 180
ассГддссдд ЬаааасЬддд ЪдадсЬдаса ссдсдсддЬд дЬдадсЬааЬ сдссЬаЬсЬс 240
ддасаЬЬасЬ ддсдЬсадсд ЬсЬддЬадсс дасддаЬЬдс ЪдссЬаааЬд ЬддсЬдсссд 300
садЪскддЬс аддЬсдсдаЪ ЪаЬЬдсЬдаЪ дЬсдасдадс дСасссдСаа аасаддсдаа 360
дссЬЬсдссд ссдддсЬддс ассЬдасЬдЬ дсааЬаассд ЬасаЬассса ддсадаЪасд 420
ЬссадЬсссд аЬссдЪЬаЫ; ЪааЪссЕсЬа аааасЕддсд ЬЬЬдссаасС ддаЬаасдсд 480
аасдЬдасЬд асдсдаЬссЬ сдададддса ддадддЬсаа ЬЬдсЬдасЬГ ЬассдддсаЪ 540
ЬаЬсааасдд сдЬСЬсдсда асЬддаасдд дГдсЬЬааЬЬ СЛссдсааЪс ааасЬЬдЬдс 600
сСЬааасдЬд адааасадда сдааадсЬдЬ ЬсаЬЬаасдс аддсаЬЬасс аЬсддаасЬс 660
ааддЬдадсд ссдасЬдЪдЬ сЬсаЬЬаасс ддЬдсддЬаа дссСсдсаЬс ааЬдсЬдасд 720
дадаЪаЬЬЬс ЬссСдсааса адсасаддда аСдссддадс сддддьдддд ааддаЬсасс 780
даЬЬсасасс адЪддаасас сЬЬдсЬаадЬ ЬЬдсаЬаасд сдсааЬЬЬда ЬЬЬдсЬасаа 840
сдсасдссад аддЬЬдсссд садссдсдсс ассссдЬЬаЬ ЬадаЬЬСдаЬ саадасадсд 900
ЬЬдасдсссс аЬссассдса аааасаддсд ЬаГддЬдЪда саЬЬасссас ЬЬсадЬдсЬд 960
ЬЬЬаЬсдссд дасасдаЬас ЪааСсЬддса ааЬсЪсддсд дсдсасСдда дсЬсаасЬдд 1020
асдсЕЬсссд дСсадссдда Ъаасасдссд ссаддСддЬд аасЬддЬдЕЕ ЬдаасдсЬдд 1080
сдЬсддсЬаа дсдаЬаасад ссадЬддаЬЬ саддСЬЬсдс ГддЬсЬЬсса дасЫЩасад 1140
садаЬдсдЬд аЬаааасдсс дсЬдЬсаЬЬа ааЕасдссдс ссддададдЬ дааасЬдасс 1200
сЬддсаддаЬ дЬдаададсд аааЬдсдсад ддсаЬдЬдСЬ сдЬЬддсадд ЬЬГЬасдсаа 1260
аЪсдЬдааЬд аадсасдсаЬ ассддсдЬдс адСЬЬдЬаа 1299
- 12 021178
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены, выделены и/или обработаны, например, с использованием клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации мРНК или геномной ДНК в ПЦР, и тому подобного. При практическом осуществлении способов по изобретению гомологичные гены могут быть модифицированы в результате обработки матричной нуклеиновой кислоты, как описано в настоящей публикации. Изобретение может быть осуществлено на практике в сочетании с любым способом или протоколом или устройством, известным в данной области, которые хорошо описаны в научной и патентной литературе.
Общие способы
Нуклеиновые кислоты, используемые при практическом осуществлении настоящего изобретения, будь то РНК, интерферирующая РНК, антисмысловая нуклеиновая кислота, кДНК, геномная ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, могут быть выделены из множества источников, генетически сконструированы, амплифицированы и/или экспрессированы/созданы с помощью рекомбинации. Рекомбинантные полипептиды, созданные из таких нуклеиновых кислот, могут быть по отдельности выделены или клонированы и тестированы в отношении требуемой активности. Можно использовать любую систему экспрессии рекомбинантов, включая системы экспрессии в клетках бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.
Альтернативно такие нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы ίη νίΐτο хорошо известными способами химического синтеза, которые описаны, например, в публикациях Абатк (1983), 1. Ат. Сйет. 8ос. 105: 661; Βе1οикον (1997), ШсШс Аабк Кек. 25: 3440-3444; Ргепке1 (1995) Ргее Кабю. ΒίοΙ. Меб. 19: 373-380; В1оттетк (1994) ВюсйетЦйу 33: 7886-7896; Ыагапд (1979) МеШ Еп/уто1. 68: 90; Βτο^η (1979) МеШ Еп/уто1. 68: 109; Веаисаде (1981) Те1га. Ьей. 22: 1859; патенте США Νο. 4458066.
Способы обработки нуклеиновых кислот, такие как, например, субклонирование, мечение зондами (например, случайно праймируемое мечение с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и тому подобные, хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, δатЪ^οοк, еб., ΜοΕαιΡίΓ СНтпд: а Ρπόοπ-ιΙοΓγ Мапиа1 (2пб еб.), νο1κ. 1-3, С.о1б §рйпд ΗπιΤογ ^аЪο^аΐο^γ, (1989); СпггеШ Ρτοΐο^Π ш Мο1еси1а^ ВюЦду, АикиЪе1, еб. 1ο1ιπ ^беу & Еюпк, 1пс., Νον Υο6< (1997); ^аЪο^аΐο^γ Тесйтциек ш ВюсйетШту апб Мο1еси1а^ ВюНду: НуЪпб1/а1юп \νί(1ι ШсШс Ас1б РгоЪек, Рай I. П^гу апб ШсШс Ашб Ртерага1юп, Туккеп, еб. Е1кеν^е^, Ν.Υ. (1993).
Другим используемым способом получения и обработки нуклеиновых кислот, используемых при практическом осуществлении способов по изобретению, является клонирование из геномных образцов, и при необходимости скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемой в способах по изобретению, включают библиотеки геномой или кДНК, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), смотри, например, патенты США № 5721118, 6025155; искусственных хромосомах человека, смотри, например, Κο^^οΗ (1997) Ν;·ιΙ. СепеР 15: 333-335; искусственных хромосомах дрожжей ^АС); искусственных хромосомах бактерий (ВАС); искусственных хромосомах Р1, смотри, например, \νοοπ (1998) Сеадтюк 50: 306-316; полученных из Р1 векторах (РАС), смотри, например, Кет (1997) Вю1есЬтциек 23: 12 0-124; космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах.
В альтернативных аспектах фразы нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к фрагменту любого из ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть однонитевыми или двунитевыми и могут представлять смысловую или антисмысловую нить, к пептидонуклеиновой кислоте (ΡNΑ) или к любому ДНК-подобному или РНК-подобному материалу, природного или синтетического происхождения, включая, например, интерферирующую РНК (ί-РНК), рибонуклеопротеины (например, ί-ΚΝΡ). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает подобные нуклеиновым кислотам структуры с синтетическими остовами, смотри, например, Ма1а (1997) Το\Κο1. Арр1. Ρ1ι;·ιπη;κοΡ 144: 189-197; §ΐ^аикк-δοикир (1997) ВюсЬетШту 36: 8692-8698; §атк!ад (1996) Апбкепке Νυс1ею Ас1б Эгид Ое\\ 6: 153-156.
В одном из аспектов рекомбинантные полинуклеотиды по изобретению содержат последовательности вблизи нуклеиновой кислоты остова, с которыми она не соседствует в своем природном окружении. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты составляют 5% или большее количество вставок нуклеиновых кислот в популяции молекул нуклеиновой кислоты остова. Молекулы остова по изобретению включают нуклеиновые кислоты, такие как векторы экспрессии, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, интегрируемые нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для поддержания или обработки представляющей интерес вставки нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты составляют 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или большее количество вставок нуклеиновых кислот в популяции рекомбинантных молекул остова.
В одном из аспектов нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению, находится в сборке в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента.
Изобретение относится к слитым белкам и кодирующим их нуклеиновым кислотам. Полипептид по
- 13 021178 изобретению может быть слит с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как Ν-концевые пептиды для идентификации, которые придают требуемые свойства, такие как повышенная стабильность или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды по изобретению также могут быть синтезированы и экспрессированы в виде слитых белков с одним или несколькими связанными с ними дополнительными доменами, например, для получения более иммуногенного пептида, для более легкого выделения рекомбинантно синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и тому подобного. Домены, облегчающие выявление и очистку, включают, например, хелатирующие металлы пептиды, такие как полигистидиновые участки и гистидин-триптофановые модули, которые способствуют очистке на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые способствуют очистке на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе удлинения РЬАО/аффинной очистки (1ттипех Согр, 8еа!!1е \УЛ) . Включение отщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (1пуйгодеп, 8ап Э|едо СА), между доменом для очистки и содержащим мотив пептидом или полипептидом для облегчения очистки. Например, вектор экспрессии может содержать кодирующую эпитоп последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина, за которыми следует тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназой (смотри, например, ХУППапъ (1995) ВюсйетМгу 34: 1787-1797; Побей (1998) Рго!еш Ехрг. РигК. 12: 404414). Остатки гистидина облегчают выявление и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство очистки эпитопа из остальной части слитого белка. Методики, имеющие отношение к векторам, кодирующим слитые белки, и применению слитых белков хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, Кго11 (1993) ΌΝΑ Се11. Вю1, 12: 441-53.
В одном из аспектов термин выделенный означает, что материал удалили из его исходного окружения (например, природного окружения, если он встречается в природе). Например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме животного, не является выделенным, но такой же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех существующих совместно с ним материалов в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут составлять часть вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут составлять часть композиции и при этом оставаться выделенными, в том смысле, что вектор или композиция не являются частью их природного окружения. В одном из аспектов термин очищенный не требует абсолютной чистоты; при этом имеется в виде относительное определение. Отдельные нуклеиновые кислоты, полученные из библиотеки, были обычным способом очищены до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из таких клонов, могут быть получены непосредственно либо из библиотеки, либо из суммарной ДНК человека. Очищенные нуклеиновые кислоты по изобретению очищали от остальной части геномной ДНК в организме по меньшей мере в 104-106 раз. В альтернативных аспектах термин очищенный также включает нуклеиновые кислоты, которые были очищены от остальной части геномной ДНК или от других последовательностей в библиотеке или от другого окружения по меньшей мере на один порядок, или альтернативно на два или три порядка, или на четыре или пять порядков.
Последовательности регуляции транскрипции и трансляции
Изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты (например, ДНК) по изобретению, функционально связанным с последовательностью(ями) регуляции экспрессии (например, транскрипции или трансляции), например, промоторами или энхансерами, для того чтобы управлять или модулировать синтез/экспрессию РНК. Последовательность регуляции экспрессии может находится в векторе экспрессии. Примеры бактериальных промоторов включают 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, др!, РК лямбда, РЬ и !гр. Примеры эукариотических промоторов включают немедленный ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК из ретровируса и промотор металлотионеина I мыши.
Промоторы, подходящие для экспрессии или сверхэкспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы 1ас или !гр Е. сой, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор др!, промотор РК лямбда, промотор РЬ лямбда, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (РОК), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК из ретровирусов и промотор металлотионеина-1 мыши. Также могут быть использованы другие промоторы, которые, как известно, регулируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.
Векторы экспрессии и носители для клонирования
Изобретение относится к системам экспрессии, например, кассетам экспрессии, векторам, носителям для клонирования и тому подобным, содержащим нуклеиновые кислоты по изобретению, например последовательности, кодирующие фитазы по изобретению, для экспрессии и сверхэкспрессии полипептидов по изобретению (и нуклеиновых кислот, например, антисмысловых). Векторы экспрессии и носители для клонирования по изобретению могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусную ДНК (например, вируса осповакцины, аденовируса, поксвирус птиц, вируса псевдобешенства и производных 8У40), основанные на Р1 искусственные хромосомы, дрожжевые плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы и
- 14 021178 любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (такие как Ваш11ик, АкрегдШик и дрожжи). Векторы по изобретению могут включать хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК. Большие количества подходящих векторов известны специалистам в данной области и коммерчески доступны. Примеры векторов включают: бактериальные: векторы рОЕ (01адеп). плазмиды рВ1иекспр!, векторы ρΝΗ, векторы лямбда-ΖΑΡ (§!га!адеие); р!гс99а, рКК223-3, рЭК540, рК1Т2Т (РЬагташа); эукариотические: рХТ1, р§05 (§!га!адеие), р8УК3, рВРУ, рМ§0, р8УЪ8У40 (РЬагташа). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор, при условии, что они реплицируются и жизнеспособны в хозяине. Низкокопийные или высококопийные векторы могут быть использованы в настоящем изобретении.
В качестве характерных примеров векторов экспрессии, которые можно использовать, можно отметить вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусную ДНК (например, вируса осповакцины, аденовируса, поксвирус птиц, вируса псевдобешенства и производных §У40), основанные на Р1 искусственные хромосомы, дрожжевые плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы и любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как ВасШик, АкрегдШик и дрожжи). Таким образом, например, ДНК может быть включена в любой из множества векторов экспрессии для экспрессии полипептида. Такие векторы содержат хромосомные, внехромосомные и синтетические последовательности ДНК. Большие количества подходящих векторов известны специалистам в данной области и коммерчески доступны. Следующие векторы предлагаются в качестве примера: бактериальные: векторы рСЕ (Οίадеп), плазмиды рВ1иекспр!, векторы ρNΗ, векторы лямбда-ΖΑΡ (§!га!адеие); р!гс99а, рКК223-3, рЭК540, рК1Т2Т (РЬагташа); эукариотические: рХТ1, р§05 (§!га!адеие), р8УК3, рВРУ, рМ§0, р8УЪ8У40 (РЬагташа). Однако можно использовать любую другую плазмиду или другой вектор, при условии, что они реплицируются и жизнеспособны в хозяине. Низкокопийные или высококопийные векторы могут быть использованы в настоящем изобретении.
Характерный вектор, используемый в настоящем изобретении, содержит точку начала репликации Г-фактора. Г-фактор (или фактор фертильности) в Е. соЬ представляет собой плазмиду, которая с высокой частотой осуществляет свой перенос во время конъюгации и с меньшей частотой перенос бактериальной хромосомы. В одном из аспектов используют клонирующие векторы, называемые фосмидами или векторами на основе бактериальных искусственных хромосом (ВАС). Такие векторы получены из Г-фактора Е. соЬ, который способен стабильно интегрировать большие участки геномной ДНК. В случае интеграции с ДНК из смешанного некультивируемого образца из окружающей среды можно получить крупные геномные фрагменты в форме стабильной библиотеки ДНК окружающей среды.
Другим типом вектора, используемым в настоящем изобретении, является космидный вектор. Космидные векторы исходно конструировали для клонирования и размножения крупных участков геномной ДНК. Клонирование в космидных векторах подробно описано в Мо1еси1аг С1ошид: А 1аЬога!огу Маииа1 (8атЬгоок е! а1., 1989).
Последовательность ДНК в векторе экспрессии функционально связана с соответствующей последовательностью(ями) регуляции экспрессии (промотором) для управления синтезом РНК. Конкретные известные бактериальные промоторы включают 1ас1, ΕκΖ, Т3, Т7, др!, Рк лямбда, Ръ и !гр. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промоторы §У40, ЬТК из ретровируса и промотор металлотионеина-Ι мыши. Выбор подходящего вектора и промотора хорошо известен специалистам в данной области. Вектор экспрессии также содержит сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор также может содержать последовательности, подходящие для усиления экспрессии. Области промотора могут быть выбраны из любого требуемого гена с использованием векторов с геном САТ (хлорамфениколтрансферазы) или других векторов с селектируемыми маркерами. Кроме того, векторы экспрессии могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов для обеспечения фенотипического свойства для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как ген дигидрофолатредуктазы или ген резистентности к неомицину в случае культуры эукариотических клеток или ген резистентности к тетрациклину или ампициллину в случае Е. соЬ.
В одном из аспектов кассеты экспрессии по изобретению содержат последовательность по изобретению и нуклеотидную последовательность, которая способна осуществлять экспрессию структурного гена (т.е., последовательность, кодирующую белок, такой как фитаза по изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Кассеты экспрессии включают, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с кодирующей полипептид последовательностью; и, необязательно, с другими последовательностями, например сигналами терминации транскрипции. Также могут быть использованы дополнительные факторы, необходимые или полезные для осуществления экспрессии, например энхансеры. В одном из аспектов термин функционально связанный, который использован в настоящем описании, относится к связи промотора выше по ходу транскрипции последовательности ДНК, так что промотор опосредует транскрипцию последовательности ДНК. Таким образом, кассеты экспрессии также включают плазмиды, векторы экспрессии, рекомбинантные вирусы, любую форму рекомбинантного вектора с голой ДНК и тому подобные. В одном из аспектов вектор содержит нуклеиновую кислоту,
- 15 021178 которая может инфицировать, трансфицировать, временно или постоянно трансдуцировать клетку. Вектор может быть в виде голой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты в комплексе с белком или липидом. Вектор, необязательно, содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, липидную оболочку вирусов и т.д.). В одном из аспектов векторы содержат, без ограничения, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), с которыми фрагменты ДНК могут быть связаны и могут стать реплицируемыми. В одном из аспектов векторы содержат, без ограничения, РНК, автономно самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы, и тому подобное, смотри, например, патент США № 5217879), и включают как экспрессирующие, так и неэкспрессирующие плазмиды. В том случае, когда рекомбинантный микроорганизм или культура клеток описаны как содержащие вектор экспрессии, они содержат как внехромосомные кольцевые и линейные ДНК, так и ДНК, которые были включены в хромосому(мы) хозяина. В том случае, когда вектор поддерживается клеткой-хозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться в клетках во время митоза в виде автономной структуры, либо может быть включен в геном хозяина.
Вектор экспрессии может содержать промотор, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор также может включать последовательности, подходящие для усиления экспрессии. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать точку начала репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах могут быть использованы последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсинга и полиаденилирования 8У40, чтобы обеспечить требуемые нетранскрибируемые генетические элементы.
В одном из аспектов векторы экспрессии содержат один или несколько селектируемых маркерных генов, чтобы обеспечить возможность селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие резистентность к неомицину в случае культуры эукариотических клеток, гены, придающие резистентность к тетрациклину или ампициллину клеткам Е. сой, и ген ΤΚΡ1 8. сегетыае. Области промотора могут быть выбраны из любого требуемого гена с использованием векторов с геном хлорамфениколтрансферазы (САТ) или других векторов с селектируемыми маркерами.
Векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках также могут содержать энхансеры для повышения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цисдействующие элементы ДНК, обычно длиной примерно от 10 до примерно 300 п.н., которые действуют на промотор, увеличивая его транскрипцию. Примеры включают энхансер 8У40, находящийся со стороны поздних генов от начала репликации от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, находящийся со стороны поздних генов от начала репликации, и энхансеры аденовирусов.
Последовательность ДНК может быть встроена в вектор различными способами. В общем, последовательность ДНК лигируют в требуемом положении в вектор после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции.
Альтернативно могут быть лигированы тупые концы вставки и вектора. В данной области известно множество способов клонирования, например способы, описанные Аи5иЬе1 и 8атЬгоок. Специалистам в данной области понятно, что описанные и другие способы входят в объем изобретения.
Вектор может быть в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, полученные из сочетания плазмид и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как ДНК вируса осповакцины, аденовируса, поксвируса птиц и вируса псевдобешенства. Множество клонирующих векторов и векторов экспрессии, используемых в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, 8атЬгоок.
Конкретные бактериальные векторы, которые могут быть использованы, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы, включая хорошо известные клонирующие векторы рВК322 (АТСС 37017), рКК223-3 (РЬатташа Рше СЬетюаЦ иррка1а, 8^екеп), СЕМ1 (Рготеда Вю1ес. МаФкоп, ЭД1, и8А) рЦЕ70, рЦЕ60, рЦЕ-9 (Ц1адеп), рЭ10. ρδίΧ174 рВЬекспр! II К8, ρΝΗ8Α, ρNΗ16а, ρNΗ18Α, ρNΗ46Α (81та!адепе), р!тс99а, рКК223-3, рКК233-3, рЭК540, рЫТ5 (РЬатташа), рКК232-8 и рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают р8У2САТ, рОС44, рХТ1, р8С (81та!адепе) р8УК3, рВРУ, рМ8С и р8УЬ (РЬатташа). Однако можно использовать любой другой вектор, при условии, что он реплицируется и является жизнеспособным в клетке-хозяине.
Клетки-хозяева и трансформированные клетки
Изобретение также относится к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, например последовательность, кодирующую фитазу по изобретению, или содержащей кассету экспрессии, вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор по изобретению. Клеткой-хозяином могут быть любые клетки-хозяева, известные специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бак- 16 021178 териальные клетки, клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Примеры бактериальных клеток включают клетки любого вида из родов ЕксЬейсЫа, ВасШик, 81герЮтусек, 8а1топе11а, Ркеиботопак, басЮсоссик и 81арЬу1ососсик, включая, например, ЕксЬепсЫа сой, басЮсоссик 1асбк, ВасШик киЫШк, ВасШик сегеик, 8а1топе11а 1урЫтийит, Ркеиботопак Йиогексепк. Примеры клеток грибов включают любой вид АкрегдШик, включая АкрегдШик шдег. Примеры дрожжевых клеток включают любой вид РюЫа, 8ассЬаготусек, 8сН|/окассНаготусек или 8сН\уаппютусек, включая РюЫа ракЮпк, 8ассЬаготусек сегеу1к1ае или 8сН|/окассНаготусек ротЬе. Примеры клеток насекомых включают любой вид 8робор1ега или ЭгокорНба, включая ЭгокорНба 82 и 8робор(ега 8ί9. Примеры клеток насекомых включают ЭгокорНба 82 и 8робор(ега 8ί9. Примеры дрожжевых клеток включают Рюйа ракЮпк, 8ассНаготусек сегеу1к1ае или 8сН|/окассНаготусек ротЬе. Примеры клеток животных включают клетки СНО, СО8 или меланомы Боуэса или любую линию клеток мыши или человека. Специалисты в данной области могут выбрать подходящего хозяина.
Вектор может быть введен в клетки-хозяева с использованием любого из множества способов, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генную пушку или Τίопосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную ΌΕΑΕ-декстраном, липофекцию или электропорацию (ЭауУ Б., ОФпег, М., Вайеу, Ь., Вакю МеШобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, (1986)).
В соответствующем случае сконструированные клетки-хозяева можно культивировать в обычной питательной среде, модифицированной соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов по изобретению. После трансформации подходящей линии хозяина и выращивания линии хозяина до соответствующей плотности клеток выбранный промотор можно индуцировать подходящими способами (например, сдвигом температуры или посредством химической индукции), и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени, чтобы обеспечить для них возможность продуцирования требуемого полипептида или его фрагмента.
Клетки могут быть собраны центрифугированием, разрушены физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Клетки микроорганизмов, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены любым обычным способом, включая циклы замораживания-размораживания, обработку ультразвуком, механическое разрушение или использование средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент могут быть извлечены и очищены из культур рекомбинантных клеток разными способами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. При необходимости можно использовать стадии рефолдинга белка для получения полной конфигурации полипептида. При необходимости можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) на конечных стадиях очистки.
Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать обычным способом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от используемого хозяина в способе получения рекомбинантов полипептиды, продуцируемые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированы или могут быть не гликозилированы. Полипептиды по изобретению также могут включать или не включать начальный остаток аминокислоты метионина.
Также могут быть использованы бесклеточные системы трансляции для получения полипептида по изобретению. Бесклеточные системы трансляции могут использовать мРНК, транскрибированные с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкция ДНК может быть линеаризована перед проведением реакции трансляции ш убго. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, чтобы получить требуемый полипептид или его фрагмент.
Векторы экспрессии могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов, чтобы получить фенотипический признак для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как ген дигидрофолатредуктазы или резистентности к неомицину в случае культуры эукариотических клеток, или таких как ген резистентности к тетрациклину или ампициллину в случае Е. сой.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть экспрессированы или сверхэкспрессированы в любой системе экспрессии ш убго или ш У1уо. Можно использовать любые системы культур клеток, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать рекомбинантный белок, включая культуры бактерий, насекомых, дрожжей, грибов или млекопитающих. Сверхэкспрессия может быть осуществлена при соответствующем выборе промоторов, энхансеров, векторов (например, использование векторов на основе репликонов, двухцистронных векторов (смотри, например, Оийи (1996) ВюсНет. ВюрНук. Рек. Соттип. 229: 295-8)), сред, систем культивирования и тому подобного. В одном из аспектов используют амплификацию генов с использованием маркеров для селекции, например, глутаминсинтетазы (смотри, например, 8апбегк (1987) Эеу. Вю1. 81апб. 66: 55-63), в клеточных системах для сверхэкспрессии полипептидов
- 17 021178 по изобретению.
Различные системы культур клеток млекопитающих можно использовать для экспрессии рекомбинантного белка, примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии С08-7 фибробластов почки обезьяны, описанные в публикации §У40-1гаик£огтеб кшиаи се11к киррой (Не герНсайои оГ еаг1у §У40 ти1аШк (СШ/таи 1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать совместимый вектор, например, линии клеток С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Векторы экспрессии млекопитающих будут содержать точку начала репликации, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности.
Последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсинга и полиаденилирования §У40, могут быть использованы для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
Клетки-хозяева, содержащие интересующие полинуклеотиды, можно культивировать в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобные, представляют собой условия, ранее используемые для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и такие условия будут очевидны для специалиста в данной области. Клоны, которые идентифицированы как клоны, обладающие активностью конкретного фермента, затем могут быть секвенированы, чтобы идентифицировать полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, обладающий повышенной активностью.
Амплификация нуклеиновых кислот
При практическом осуществлении изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты могут быть репродуцированы, например, в результате амплификации.
Изобретение относится к паре последовательностей праймеров для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, обладающие фитазной активностью, или их подпоследовательностям, при этом пара праймеров способна амплифицировать последовательности нуклеиновых кислот, включая иллюстративную последовательность 8Е0 ГО N0:1, и по меньшей мере одну из конкретных модификаций последовательности, указанных выше. Специалист в данной области может сконструировать пару последовательностей праймеров амплификации, например, для любой части или для полноразмерных последовательностей.
Исходная последовательность 8Е0 ГО N0:1 показана выше. Таким образом, пара последовательностей праймеров амплификации для амплификации данной исходной последовательности или одной из иллюстративных последовательностей по изобретению, имеющих по меньшей мере одну из конкретных модификаций последовательности, указанных в настоящем описании, могут представлять собой остатки 1-21 последовательности 8Е0 ГО N0:1 (т.е., АТСАААСССАТСТТААТСССА) и комплементарную нить последних 21 остатка последовательности 8Е0 ГО N0:1 (т.е., нить, комплементарную ТССАСТТТСАСАТСТСАТСТА).
Реакции амплификации также могут быть использованы для оценки количества нуклеиновой кислоты в образце (например, количества мРНК в образце клеток), мечения нуклеиновой кислоты (например, чтобы использовать ее на матрице или блоте), для выявления нуклеиновой кислоты или оценки количества конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном из аспектов изобретения амплифицируют мРНК, выделенную из клетки или библиотеки кДНК. Специалист в данной области может выбрать и сконструировать подходящие олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации также хорошо известны в данной области и включают, например, полимеразную цепную реакцию, ПЦР (смотри, например, РСК ргоЮсоК а дшбе Ю тебюбк аиб аррйсайоик, еб. 1итк, Асабетю Ргекк, КУ. (1990) и РСК к1га1еДек (1995), еб. Ιηηίκ, Асабетю Ргекк, 1ис., КУ., лигазную цепную реакцию (ЬСК) (смотри, например, \Уи (1989) Сеиотюк 4: 560; Ьаибедгеи (1988) §с1еисе 241: 1077; Ватидег (1990) Сеие 89: 117); транскрипционную амплификацию (смотри, например, Κ\\ό1ι (1989) Ргос. №И. Асаб. §ск И8А 86: 1173); и самоподдерживаемую репликацию последовательностей (смотри, например, Сиа1еШ (1990) Ргос. №И. Асаб. 8сЕ И8А 87: 1874); амплификацию с использованием репликазы 0-бета (смотри, например, διηίΐΐι (1997) 1. С1ш. МюгоЬю1. 35: 1477-1491), автоматизированный анализ амплификации с использованием репликазы 0-бета (смотри, например, Вигд (1996) Мо1. Се11. РгоЬек 10: 257-271) и другие опосредованные РНК-полимеразой способы (например, NА§ВА, Саидеие, Мюыккаида, ОгИапо); смотри также Вегдег (1987) Мебюбк Еи/уто1. 152: 3 07-316; §атЬгоок; АикиЬе1; патенты США № 4683195 и 4683202; §оокиаиаи (1995) Вю1есйио1оду 13: 563-564.
Определение степени идентичности последовательностей
Изобретение относится к выделенной, синтетической или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более высоко идентична последовательности 8Е0 ГО N0:1 и включающей по меньшей мере одну из конкретно указанных модификаций по сравнению с последовательностью 8Е0 ГО N0:1, обсуждаемых выше. В одном из аспектов степень идентичности последовательностей (гомологии) можно определить, использую лю- 18 021178 бую компьютерную программу и соответствующие параметры, включая программы, описанные в настоящей публикации, такие как ВЬЛ§Т 2.2.2. или ΡΑ8ΤΑ, версию 3.0(78. с параметрами по умолчанию.
Гомологичные последовательности также включают последовательности РНК, в которых уридины заменяют тимины в последовательностях нуклеиновых кислот. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любого из способов, описанных в настоящей публикации, или могут возникать в результате коррекции ошибки секвенирования.
В настоящем аспекте изобретения используют различные программы для сравнения последовательностей, указанные в описании. Идентичность (гомологию) последовательностей белков и/или нуклеиновых кислот можно оценить, используя любой (любую) из множества алгоритмов и программ для сравнения последовательностей, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают без ограничения ΤΒΡΑ8ΤΝ, ВЬА§ТР, ΡΑ8ΤΑ, ΤΡΑ8ΤΑ и СРи8ТАЬА (Реагкои аиб Ыртаи, Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8с1. υδΑ 85(8) :2444-2448, 1988; ΑΙίδΰΜ е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 215(3):403-410, 1990; ^отркои е1 а1., №с1ек Лабк Рек. 22 (2) :4673-4680, 1994; Ηί§§ίηκ е1 а1., Мебюбк Еи/уток 266:383-402, 1996; Л1(5с1ш1 е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 215(3) :403-410, 1990, Α1ίΚ€Μ е1 а1., Мпиге Сеиебск 3:266-272, 1993.
Гомология или идентичность может быть измерена с использованием компьютерной программы для анализа последовательностей (например, пакета компьютерных программ для анализа последовательностей из Сеиебск Сотри1ет Сгоир, итуеткИу оГ АГсоикш Вю1есЬио1оду Сеи1ег, 1710 итуеткИу Ανеиие, Маб1кои, VI 53705). Такая компьютерная программа подбирает пары сходных последовательностей посредством определения степени гомологии в случае различных делеций, замен и других модификаций. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют конкретный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании для максимального соответствия на протяжении окна сравнения или определенной области, который измеряют, используя любое количество алгоритмов сравнения последовательностей или используя выравнивание вручную и визуальный просмотр. В случае сравнения последовательностей одна последовательность может действовать в качестве эталонной последовательности (иллюстративная последовательность по изобретению), с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательности и устанавливают параметры программы алгоритма для сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы, установленные по умолчанию, или можно устанавливать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет идентичность последовательностей в процентах для тестируемых последовательностей по отношению к эталонной последовательности на основе параметров программы.
Окно сравнения в используемом в настоящем описании смысле включает обращение к любому одному из ряда участков непрерывно следующих друг за другом остатков. Например, в альтернативных аспектах изобретения непрерывно следующие друг за другом остатки в диапазоне от 20 до полной длины иллюстративных последовательностей по изобретению сравнивают с эталонной последовательностью с таким же количеством непрерывно следующих друг за другом положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Если эталонная последовательность имеет необходимую идентичность последовательности с иллюстративными последовательностями по изобретению, например, 98% идентичность последовательности с последовательностями 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:2, и последовательности имеют одну из специфичных модификаций последовательности, указанных выше, то такая последовательность входит в объем изобретения. В альтернативных вариантах подпоследовательности длиной в диапазоне примерно от 20 до 600, примерно от 50 до 200 и примерно от 100 до 150 сравнивают с эталонной последовательностью с таким же количеством непрерывно следующих друг за другом положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с использованием алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана (Αбν. Αрр1. Ма11., 2: 482, 1981), алгоритма выравнивания в отношении гомологии Нидлемана и Вунша (1. Мо1. Вю1., 48: 443, 1970), в результате поиска сходства способом Пирсона и Липмана (Ргос. N11. Αсаб. 8сЕ υδΑ, 85: 2444, 1988), с использованием компьютеризованных воплощений таких алгоритмов ΉΑΓ, ΒΕ8ΤΡΙΤ, ΡΑ8ΤΑ и ΤΡΑ8ΤΑ в пакете компьютерных программ А1ксоикш Сеиебск, Сеиебск Сотри1ег Сгоир, 575 8с1еисе Ότ., Маб1кои, VI) или посредством выравнивания вручную и визуального просмотра. Другие алгоритмы для определения гомологии или идентичности включают, например, кроме программы ΒΡΑ8Τ (основное средство поиска при локальном выравнивании, 11е №ιбоиа1 Сеи1ег Гог Вю1од1са1 бтГогтабоц такие как ΒΡΑ8Τ, ΒΡΑ8Τ2, ΒΡΑ8ΤΝ и ΒΡΑ8ΤΧ), ΑΜΟΚ ΑМΑ8 (анализ множественных выровненных последовательностей), ΑМР8 (множественное выравнивание последовательностей белка), Α88ΕΤ (средство статистической оценки выровненных участков), ΒΑΝΏ8, ΒΕ8Τ8^Ρ, ΒI08СΑN (узел сравнительного анализа биологических последовательностей), ВЫМР8 (усовершенствованное средство поиска блоков), ΡΑ8ΤΑ, 1и1е1Уа1к аиб Рош1к, ВМВ, €.'^8^6 V, СЬи8ΤΑΙ. V, С0^Е№и8, ЬС0№Е№и8, να0Ν8ΕΝ8υ8, алгоритм Смита-Ватермана, ΌΑΡνΙΝ, алгоритм
- 19 021178
Ьак Уедак, РА8ТА (Реагкоп апй Ыртап, Ргос. №и1. Асай. δα. И8А, 85: 2444, 1988), ΡΑδΤΌΒ (ВгиЙад еГ а1. Сотр. Арр. Вюкск 6: 237-245, 1990), ΡΝΑΤ (средство принудительного выравнивания нуклеотидов), РгатеаПдп, РгатекеагсЬ, ΟΥΝΑΜΚ.’. Р1ЬТЕК, Р8АР (пакет программ для анализа последовательностей РпкЮпкку), ОАР (программа глобального выравнивания), ΟΕΝΑΣ, ΟΙΒΒδ, ОепЦиекГ, 188С (чувствительное сравнение последовательностей), ЬАЫОЫ (локальное выравнивание последовательностей), ЬСР (программа локального содержания), МАСАА (автоматизированное средство для конструирования и анализа множественного выравнивания), МАР (программа множественного выравнивания), МВЬКР, МВЬКЫ, Р1МА (индуцированное структурой множественное выравнивание последовательностей), §АОА (выравнивание последовательностей на основе генетического алгоритма) и АНАТ-ΙΡ. Другие программы и базы данных, используемые при практическом осуществлении изобретения, включают без ограничения: МасРайегп (ЕМВЬ), О1ксоуегуВаке (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), ОепеМше (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), Ьоок (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), МасЬоок (Мо1еси1аг Аррйсайопк Огоир), Са1а1ук1 (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), Са1а1ук1/8НАРЕ (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), Сег1ик2.ЭВАссекк (Мо1еси1аг 8тш1аПопк 1пс.), НуроОеп (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), РЫдЫ II, (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), Э|ксоуег (Мо1еси1аг §1ти1айоп8 1пс.), СНАКМт (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), Рейх (Мо1еси1аг §1ти1айои8 1пс.), Эе1Р1й, (Мо1еси1аг §^ти1айоиκ 1пс.), ЦиайеММ, (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), Ното1оду (Мо1еси1аг 8тш1аРопк 1пс.), Мойе1ег (Мо1еси1аг 8тш1аРопк 1пс.), ΙδΙδ (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), Циайа/РгоГет Эемдп (Мо1еси1аг 8тш1аРопк 1пс.), АеЬЬаЬ (Мо1еси1аг §1ти1айопк 1пс.), АеЬЬаЬ Ойегкйу Ехр1огег (Мо1еси1аг §^ти1айоиκ 1пс.), Оепе Ехр1огег (Мо1еси1аг 8тш1аРопк 1пс.), 8ес.]Ро1й (Мо1еси1аг 8тш1а1юпк 1пс.), база данных МОЬ АуайаЫе Сйетюак ОйесЮгу (содержащая рекомендации по доступным химическим веществам), база данных МОЬ Эгид Эа1а Керой, содержащая информацию о лекарственных средствах, универсальная база данных по медицинской химии, база данных международных обозначений лекарственных средств Дервент, база данных ВюВуГеМакГегРйе, база данных ОепВапк, база данных Сеп8ес] и база данных ОепотеЦиекк Многие другие программы и базы данных могут быть очевидны для специалиста в данной области на основании настоящего описания. Такие программы выравнивания также можно использовать для скрининга геномных баз данных, чтобы идентифицировать полинуклеотидные последовательности, имеющие, по существу, идентичные последовательности. Некоторые геномные базы данных доступны, например, на веб-сайте ЫСВ1 (Ыайопа1 Сейег Гог Вю1ес1ию1оду Шогтайоп). Базы данных, содержащие информацию о геномах с комментариями, содержащими некоторую функциональную информацию, поддерживаются другими организациями и доступны в Интернете.
Алгоритмы ВЬА§Т, ВЬА8Т 2.0 и ВЬА8Т 2.2.2 также используют при практическом осуществлении изобретения. Такие алгоритмы описаны, например, в А1ксйи1 (1977) Ыис. Аайк Кек. 25: 3389-3402; А1ГксНи1 (1990) 1. Мо1. Вю1. 215: 403-410. Компьютерная программа для осуществления анализов ВЬА8Т общедоступна из Национального центра биотехнологической информации. Такой алгоритм включает сначала идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (Н8Р) посредством идентификации коротких слов длиной А в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторой пороговой оценке Т с положительным значением при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т называют порогом оценки слов в окружении (А1ксйи1 (1990), выше). Такие начальные совпадения слов в окружении действуют как затравка для инициации поисков, чтобы найти содержащие их более длинные Н8Р. Совпадения слов продлевают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока кумулятивная оценка выравнивания может увеличиваться. Кумулятивные оценки вычисляют, используя нуклеотидные последовательности, параметры М (награда в баллах для пары совпадающих остатков; всегда >0). В случае аминокислотных последовательностей используют матрицу для оценки, чтобы вычислить кумулятивную оценку в баллах. Удлинение совпадений слов в каждом направлении прекращают, когда: кумулятивная оценка выравнивания снижается на количество X от своего максимального достигнутого значения; кумулятивная оценка подходит к нулю или ниже нуля, вследствие накопления одного или нескольких отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; или достигается конец любой последовательности. Параметры алгоритма ВЬА8Т А, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе ВЬА8ТЫ (для нуклеотидных последовательностей) используют по умолчанию длину слова (А) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. Для аминокислотных последовательностей программа ВЬА§ТР использует по умолчанию длины слова 3 и ожидание (Е) 10 и матрицу для подсчета ВЬО§иМ62 (смотри НешкоГГ апй НейкоГГ (1989) Ргос. ЫаЙ. Асай. §ск И8А 89: 10915), выравнивания (В) 50, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4, и сравнение обеих нитей. Алгоритм ВЬА8Т также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (смотри, например, Каг1ш апй А1ксйи1 (1993) Ргос. Νηΐ1. Асай. δα. И8А 90: 5873). Одной мерой сходства, определяемой алгоритмом ВЬА8Т, является наименьшее суммарное правдоподобие (Р(Ы)), которое обеспечивает показатель вероятности, с которой случайно может встречаться совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшее суммарное правдоподобие при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее чем примерно 0,2, менее чем примерно 0,01, или менее чем примерно 0,001. В одном из аспектов гомологи последовательностей белков и нуклеиновых кислот оце- 20 021178 нивают, используя основное средство поиска при локальном выравнивании (ВЬАЗТ). Например, можно использовать пять конкретных программ ВЬАЗТ, чтобы решить следующую задачу: (1) ВЬАЗТР и ВЬАЗТ3 сравнивают запрашиваемую аминокислотную последовательность с базой данных последовательностей белков; (2) ВЬА§ТЫ сравнивает запрашиваемую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей; (3) ВЬАЗТХ сравнивает концептуальные продукты трансляции шести рамок в запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обеих нитях) с базой данных последовательностей белков; (4) ТВЬАЗТЫ сравнивает запрашиваемую последовательность белка с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслированных во всех шести рамках считывания (обе нити); и (5) ТВЬАЗТХ сравнивает трансляции шести рамок запрашиваемой нуклеотидной последовательности с трансляциями шести рамок нуклеотидных последовательностей в базе данных. Программы ВЬАЗТ идентифицируют гомологичные последовательности посредством идентификации сходных участков, которые называют в настоящем описании пары участков с максимальным сходством, между запрашиваемой аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты и тестируемой последовательностью, которая может быть получена из базы данных последовательностей белков или нуклеиновых кислот. Пары участков с максимальным сходством могут быть идентифицированы (т.е., выровнены) с помощью матриксов для подсчета, многие из которых известны в данной области. Примером используемой матрицы для подсчета является матрица ВЬОЗИМ62 (Ооиие1 с( а1., Зс1епсе 256: 1443-1445, 1992; НешкоГГапб НешкоГГ, РтоШпв 17: 49-61, 1993). Альтернативно можно использовать матрицы РАМ или РАМ250 (смотри, например, ЗсН\\аг1/ апб ИауНоГГ, ебв., 1978, Мабюев Гог ИеЮсбпд ИМапсе РекбюпвЫрв: Абав оГ Рто1еш Зециепсе апб 31гис1иге, ХУабипфоп: Ыабопа1 Вютебюа1 РевеагсН Роипбабоп).
В одном из аспектов изобретения для того, чтобы определить, обладает ли нуклеиновая кислота необходимой идентичностью последовательности, чтобы входить в объем изобретения, используют программы ВЬАЗТ 2.2.2 ЫСВ1 с опциями по умолчанию Ь1ав1р. Существует примерно 38 устанавливаемых параметров в программе ВЬАЗТ 2.2.2. В этом иллюстративном аспекте изобретения используют все значения по умолчанию, за исключением установок фильтра по умолчанию (т.е., все параметры устанавливают по умолчанию, за исключением фильтрования, которое установлено в положении ОРР); вместо этого используют установку -Р Р, которая отменяет фильтрование. Использованием фильтрования по умолчанию часто приводит к ошибкам Карлина-Альтшуля вследствие короткой длины последовательности.
Значения по умолчанию, используемые в таком иллюстративном аспекте изобретения, включают: Фильтр для низкой сложности: ΟΝ > размер слова: 3 > матрица: В1овит62 > стоимость делеции: существование: 11 > удлинение: 1 фильтр для низкой сложности: ΟΝ.
Другие установки по умолчанию: фильтр для низкой сложности ОРР, размер слова 3 для белка, матрица ВЬОЗиМ62, штраф за существование делеции -11 и штраф за удлинение делеции -1.
В некоторых аспектах алгоритм сравнения последовательностей можно использовать для сравнения последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности по изобретению с эталонной последовательностью. Например, алгоритм сравнения последовательностей может сравнивать нуклеотидные последовательности или аминокислотные последовательности по изобретению с исходной последовательностью ЗЕЦ ГО N0:1 и/или ЗЕЦ ГО N0:2, или с эталонными последовательностями, чтобы идентифицировать гомологи или структурные мотивы. Сравнение последовательностей можно осуществлять для определения того, является ли первая последовательность такой же, как и вторая последовательность. Важно отметить, что такой тип сравнения не ограничен осуществлением точного сравнения новой последовательности и первой последовательности в базе данных. Хорошо известные способы известны специалистам в данной области для сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не являются идентичными. Например, могут быть введены делеции в одну последовательность, чтобы повысить уровень гомологии между двумя тестируемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют, введены ли делеции или другие признаки в последовательность во время сравнения, обычно вводит пользователь алгоритмом сравнения.
После осуществления сравнения двух последовательностей определяют, являются ли две последовательности одинаковыми. Конечно, термин одинаковые не ограничен последовательностями, которые являются абсолютно идентичными. Сравнение последовательностей может показывать уровни идентичности последовательностей между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать структурные мотивы, или может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравнивают с такими кодами нуклеиновых кислот и кодами полипептидов. Уровень идентичности последовательностей определяют в результате вычисления доли признаков последовательностей, которые являются одинаковыми, в общем количестве последовательностей в первой последовательности. Таким образом, если каждый признак в первой 100-нуклеотидной последовательности, выровненный в каждым
- 21 021178 признаком во второй последовательности, то уровень идентичности последовательности может составлять 100%.
Альтернативно алгоритм может сравнивать эталонную последовательность с последовательностью по изобретению, чтобы определить отличаются ли последовательности в одном или нескольких положениях. Результат сравнения может показывать длину и идентичность встроенных, делетированных или замененных нуклеотидов или аминокислотных остатков по отношению к любой из последовательностей, либо эталонной, либо по изобретению. В других аспектах алгоритм можно использовать для идентификации признаков в нуклеиновой кислоте или полипептиде по изобретению. Например, идентифицируемый признак может включать открытую рамку считывания (ОРС), кодон инициации (например, кодон АТО), ТААТАА-бокс или такие мотивы как альфа-спирали, бета-слои или функциональные мотивы полипептидов, такие как активные участки ферментов, мотивы спираль-петля-спираль, лейциновые молнии, участки гликозилирования, сайты убиквитинилирования, альфа-спирали, бета-слои, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые направляют секрецию кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, кислые участки, активные участки ферментов, участки связывания субстрата и участки расщепления ферментами, а также другие мотивы, известные специалистам в данной области.
Ингибирование экспрессии фитазы
Изобретение, кроме того, относится к нуклеиновым кислотам, комплементарным (например, антисмысловым последовательностям) последовательностям нуклеиновых кислот по изобретению, включая нуклеиновые кислоты, содержащие антисмысловые последовательности, ί-ΡΗΚ, рибозимы. Антисмысловые последовательности способны ингибировать транспорт, сплайсинг или транскрипцию кодирующих фитазы генов. Ингибирование может осуществляться посредством целенаправленного воздействия на геномную ДНК или матричную РНК. Транскрипция или функция целевой нуклеиновой кислоты может быть ингибирована, например, в результате гибридизации и/или расщепления. Одна особенно используемая группа ингибиторов, предлагаемых в настоящем изобретении, включает олигонуклеотиды, которые способны связывать либо ген фитазы, либо мРНК, в любом случае предотвращая или ингибирование продукции или функции фермента фитазы. Связь может осуществляться благодаря специфичной гибридизации последовательностей. Другой используемый класс ингибиторов включает олигонуклеотиды, которые вызывают инактивацию или расщепление мРНК фитазы. Олигонуклеотид может обладать ферментативной активностью, которая вызывает такое расщепление, например, рибозимы. Олигонуклеотид может быть химически модифицирован или конъюгирован с ферментом или композицией, способной расщеплять комплементарную нуклеиновую кислоту. Можно проводить скрининг пула множества таких разных олигонуклеотидов в отношении олигонуклеотидов с требуемой активностью.
Антисмысловые олигонуклеотиды
Изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, содержащим новые модификации последовательности фитазы по изобретению, при этом такие антисмысловые олигонуклеотиды способны связывать мРНК фитазы, что может ингибировать фитазную активность посредством целенаправленного воздействия на мРНК. Способы конструирования антисмысловых олигонуклеотидов хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие фитазные олигонуклеотиды, используя новые регенты по изобретению. Например, протоколы прогулки по генам/картирования РНК для скрининга эффективных антисмысловых олигонуклеотидов хорошо известны в данной области, смотри, например, публикацию Но (2000) Мейюйк Еп/уто1. 314: 168-183, в которой описан анализ с использованием картирования РНК, который основан на стандартных молекулярных способах, для получения простого и надежного способа отбора эффективных антисмысловых последовательностей. Смотри также 8тКЬ (2000) Еиго. 1. РЬагт. 8сг 11: 191-198.
Природные нуклеиновые кислоты используют в качестве антисмысловых олигонуклеотидов. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть любой длины; например, в альтернативных аспектах антисмысловые олигонуклеотиды имеют длину примерно от 5 до 100, примерно от 10 до 80, примерно от 15 до 60, примерно от 18 до 40. Оптимальная длина может быть определена обычным скринингом. Антисмысловые олигонуклеотиды могут присутствовать в любой концентрации. Оптимальная концентрация может быть определена обычным скринингом. Известно широкое множество синтетических, не встречающихся в природе нуклеотидных аналогов и аналогов нуклеиновых кислот, которые могут решить такую возможную проблему. Например, можно использовать пептидонуклеиновые кислоты (ΡNА), содержащие неионные остовы, такие как ^(2-аминоэтил)глициновые единицы. Также могут быть использованы антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, которые описаны в \У0 97/03211; \У0 96/39154; Ма1а (1997) Тох1со1. Арр1. РЬагтасо1. 144: 189-197; Аийкепке ТЬегареийск, ей. Адаг\\а1 (Нитапа Ргекк, То1о\\а. N. 1.. 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие синтетические аналоги остовов ДНК, предлагаемые в изобретении, также могут включать нуклеиновые кислоты, содержащие фосфородитиоат, метилфосфонат, фосфорамидат, сложный алкилфосфотриэфир, сульфамат, 3'тиоацеталь, метилен(метилимино), 3'-Ы-карбамат и морфолинокарбамат, которые описаны выше.
Способы комбинаторной химии можно использовать для создания огромного количества олигонуклеотидов, которые могут быть легко подвергнуты скринингу в отношении специфичных олигонуклеоти- 22 021178 дов, которые обладают соответствующими аффинностями и специфичностями связывания по отношению к любой мишени, такой как смысловые и антисмысловые фитазные последовательности по изобретению (смотри, например, Оо1б (1995) ί. οί Βίο1. СЬет. 270: 13581-13584).
Ингибирующие рибозимы
Изобретение относится к рибозимам, содержащим новые модификации последовательности фитазы по изобретению, при этом рибозимы по изобретению способны связывать мРНК фитазы, что может ингибировать активность фермента фитазы посредством целенаправленного воздействия на мРНК. Способы конструирования рибозимов и отбора специфичной для фитазы антисмысловой последовательности для целенаправленного воздействия хорошо описаны в научной и патентной литературе, и специалист в данной области может сконструировать такие рибозимы, используя новые регенты по изобретению. Рибозимы действуют, связывая РНК-мишень посредством части рибозима, связывающей РНК-мишень, которая находится в непосредственной близости с ферментативной частью РНК, которая расщепляет РНК-мишень. Таким образом, рибозим распознает и связывает РНК-мишень РНК посредством спаривания комплементарных оснований и после связывания с правильным участком действует ферментативно, расщепляя и инактивируя РНК-мишень. Расщепление РНК-мишени таким образом будет нарушать ее способность направлять синтез кодируемого белка, если расщепление происходит в кодирующей последовательности. После того как рибозим связывается и расщепляет свою РНК-мишень, он обычно высвобождается из такой РНК и, следовательно, может многократно связывать и расщеплять новые мишени.
В некоторых случаях ферментативная природа рибозима может обеспечивать преимущества перед другими методиками, такими как методика на основе антисмысловых молекул (когда молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью, блокируя ее транскрипцию, трансляцию или связь с другой молекулой), так как эффективная концентрация рибозима, необходимая для осуществления терапевтического лечения, может быть ниже, чем концентрация антисмыслового олигонуклеотида. Такое потенциальное преимущество отражает способность рибозима действовать ферментативно. Таким образом, одна молекула рибозима способна расщеплять много молекул РНК-мишени. Кроме того, рибозим обычно является высоко специфичным ингибитором, при этом специфичность ингибирования зависит не только от механизма связывания на основе спаривания оснований, но также от механизма, благодаря которому молекула ингибирует экспрессию РНК, с которой он связывается. То есть ингибирование вызывается расщеплением РНК-мишени и, следовательно, специфичность определяют в виде отношения скорости расщепления РНК-мишени к скорости расщепления РНК, не являющейся мишенью. Такой механизм расщепления зависит от факторов дополнительных по отношению к факторам, вовлеченным в спаривание оснований. Таким образом, специфичность действия рибозима может быть выше, чем специфичность действия антисмыслового олигонуклеотида, связывающего такой же участок РНК.
Ферментативная молекула рибозимной РНК может быть образована в виде мотива головки молота, но также может быть образована в виде мотива шпильки, вируса гепатита дельта, интрона группы I или РНК, подобной РНКазе Р (в ассоциации с гидовой последовательностью РНК). Примеры таких мотивов в виде головки молота описаны в публикации Κοδδί (1992) Л1б8 КевеагсЬ апб Нитап Ке1гоу1ги8е8 8: 183; мотивы в виде шпильки описаны в Натре1 (1989) ВюсЬепщЦу 28: 4929, и Натре1 (1990) Шс. Лабе Ке8. 18: 299; мотив вируса гепатита дельта описан в Реггойа (1992) ВюсЬепщЦу 31: 16; мотив РНК-азы Р описан в Оиетег-Такаба (1983) Се11 35: 849; и интрон группы I описан СесЬ в патенте США № Νο. 4987071. Перечисление таких конкретных мотивов не предназначено для ограничения; специалистам в данной области будет понятно, что молекула ферментативной РНК по настоящему изобретению имеет участок специфичного связывания субстрата, комплементарный одной или нескольким областям РНК генамишени, и имеет нуклеотидную последовательность в данном участке связывания субстрата и вокруг него, которая придает молекуле активность в расщеплении РНК.
Интерференция РНК (РНК-и)
В одном из аспектов изобретение относится к ингибирующей молекуле РНК, так называемой молекуле РНК-и, содержащей ферментативную последовательность по изобретению. Молекула РНК-и содержит молекулу двунитевой РНК (днРНК). Молекула РНК-и, например, ми-РНК и/или микро-РНК, может ингибировать экспрессию гена фермента фитазы. В одном из аспектов молекула РНК-и, например ми-РНК и/или микро-РНК, имеет длину примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше нуклеотидов в дуплексе.
Хотя изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом действия, РНК-и может проникать в клетку и вызывать распад однонитевых РНК (онРНК) со сходными или идентичными последовательностями, включая эндогенные мРНК. Когда клетку подвергают воздействию двунитевой РНК (днРНК), мРНК гомологичного гена избирательно разрушается в ходе процесса, называемого интерференцией РНК (РНК-и). Возможным механизмом, лежащим в основе РНК-и, является разрушение двунитевой РНК (днРНК), совпадающей с последовательностью конкретного гена, на короткие кусочки, называемые короткими (малыми) интерферирующими РНК, которые запускают разрушение мРНК, которая совпадает с их последовательностью. В одном из аспектов РНК-и по изобретению используют для терапевтических средств, вызывающих сайленсинг генов, смотри, например, δЬиеу (2002) Эгид Э|5соу. Тобау
- 23 021178
7: 1040-1046. В одном из аспектов изобретение относится к способам избирательного разрушения РНК с использованием молекул РНК-и, например, ми-РНК и/или микро-РНК, по изобретению. В одном из аспектов ингибирующая микро-РНК (микро-РНК) ингибирует трансляцию, и ми-РНК ингибирует транскрипцию. Способ может быть осуществлен на практике ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο. В одном из аспектов молекулы РНК-и по изобретению можно применять для создания мутации с утратой функции в клетке, органе или в организме животного. Способы получения и использования молекул РНК-и, например, миРНК и/или микро-РНК, для избирательного разрушения РНК хорошо известны в данной области, смотри, например, патенты США № 6506559, 6511824, 6515109, 6489127.
Модификация нуклеиновых кислот
Изобретение относится к способам создания вариантов нуклеиновых кислот по изобретению, например, нуклеиновых кислот, кодирующих фермент фитазу. Такие способы можно повторять или использовать в различных сочетаниях, чтобы создать фитазные ферменты, обладающие измененной или другой активностью или измененной или другой стабильностью, отличными от активности и стабильности фитазы, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. Такие способы также можно повторять или использовать в различных сочетаниях, например, чтобы создать варианты экспрессии гена/мРНК, трансляции мРНК или стабильности мРНК. В другом аспекте генетический состав клетки изменяют, например, модификацией гомологичного гена ех νίνο с последующем повторным встраиванием в клетку.
Изобретение также относится к способам изменения характерных свойств фитазы по изобретению посредством мутагенеза и другого способа, включая направленную эволюцию, например, патентованные способы Э^етка ΟοτροταΙίοη (§ап ^^едο, СА); например, ΟίΐΌΗΕνοΙιιΙίοη; (смотри, например, патент США № 5830696; насыщающий мутагенез генных сайтов (ΟδδΜ) (смотри, например, патенты США № 6171820 и 6579258), опосредованную экзонуклеазой сборку генов в ходе направленной эволюции (смотри, например, патенты США № 6361974 и 6352842), селекцию концов при направленной эволюции (смотри, например, патенты США № 6358709 и 6238884), основанную на рекомбинации перетасовку в ходе синтеза (смотри, например, патенты США № 5965408 и 6440668 и патент Австралии № АИ724521) и направленную эволюцию термофильных ферментов (см., например, патенты США № 5830696 и 6335179).
В одном из аспектов характерные признаки фитазы модифицируют, используя протокол ^^^есίΕνοΙιιΟοη. включающий: а) осуществление мутагенеза одной или нескольких молекулярных матриц, например, нуклеиновых кислот фитазы по изобретению с созданием новых молекул, и Ь) отбор среди таких полученных в результате видов новых молекул с более желательными признаками. Эффективность направленной эволюции зависит от начального выбора исходных матриц (например, исходной последовательности 8ЕС ГО N0:1 или любой последовательности по настоящему изобретению), а также от выбранного способа(ов) мутагенеза и используемого способа(ов) скрининга. Таким образом, изобретение относится к новым высоко активным, физиологически эффективным и экономичным источникам фитазной активности, включая новые фитазы, которые: а) обладают наилучшими активностями в случае одного или нескольких конкретных применений, таких как высокотемпературное производство продуктов питания, и, следовательно, применимы для оптимизации таких конкретных применений; Ь) применимы в качестве матриц для направленной эволюции с целью получения еще более улучшенных новых молекул; и с) применимы в качестве средств идентификации дополнительных родственных молекул такими способами, как способы, основанные на гибридизации.
Нуклеиновая кислота по изобретению может быть изменена любыми способами. Например, с использованием случайных или стохастических способов или нестохастических способов или способов направленной эволюции. Способы создания случайной мутации в генах хорошо известны в данной области, смотри, например, патент США № 5830696. Например, можно использовать мутагены, чтобы вызвать случайные мутации гена. Мутагены включают, например, ультрафиолетовый свет или гаммаизлучение или химический мутаген, например, митомицин, азотистую кислоту, фотоактивируемые псоралены, отдельно или в сочетании, чтобы индуцировать разрывы ДНК, поддающиеся репарации посредством рекомбинации. Другие химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие мутагены являются аналогами предшественников нуклеотидов, например, нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. Такие средства могут быть добавлены в реакционную смесь для ПЦР вместо предшественника нуклеотида, таким образом вызывая мутации в последовательности. Также можно использовать интеркалирующие средства, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и тому подобные.
Можно использовать любой способ молекулярной биологии, например, случайный мутагенез на основе ПЦР, смотри, например, Рюе (1992) Ргос. Ναΐΐ. Асай. 8ст И8А 89: 5467-5471; или комбинаторный множественный кассетный мутагенез, смотри, например, Статей (1995) ВюЮсНпицюк 18: 194-196. Альтернативно, нуклеиновые кислоты, например, гены, могут быть подвергнуты повторной сборке после случайной или стохастической фрагментации, смотри, например, патенты США № 6291242, 6287862, 6287861, 5955358, 5830721, 5824514, 5811238, 5605793. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводят с использованием склонной к ошибкам ПЦР, перетасовки, сайтспецифичного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, ПЦР-сборки, основанного на ПЦР мута- 24 021178 генеза, имитирующего половой процесс, мутагенеза ίη νίνο, кассетного мутагенеза, рекурсивного множественного мутагенеза, экспоненциального множественного мутагенеза, сайт-специфичного мутагенеза, вторичной сборки генов, насыщающего мутагенеза генных сайтов (О88М), вторичной сборки синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования (8ЬК), рекомбинации, рекурсивной рекомбинации последовательностей, мутагенеза модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенеза с использованием содержащей урацил матрицы, мутагенеза содержащих пробелы дуплексов, мутагенеза по механизму репарации точечных ошибочных спариваний, мутагенеза с использованием дефицитного по репарации штамма хозяина, химического мутагенеза, радиогенного мутагенеза, делеционного мутагенеза, мутагенеза на основе рестрикции-селекции, мутагенеза на основе рестрикции-очистки, синтеза искусственных генов, множественного мутагенеза, создания химерных мультимеров нуклеиновых кислот и/или сочетания указанных и других способов.
В следующих публикациях описано множество методик и/или способов рекурсивной рекомбинации, которые могут быть включены в способы по изобретению: 81еттег (1999) Мо1еси1аг Ьгеейшд оГ у!гп8С8 Гог 1агдейпд апй оЛег сНп1са1 ргорегйе8 Титог Тагдейпд 4:1-4; №88 (1999) №1иге Βίο!ес1то1оду 17:893-896; С1апд (1999) ЕуойЮоп оГ а су!окте И8шд ΌΝΆ Гатйу вЬиШшд №Циге Вю!есНпо1оду 17:793-797; Мт81ш11 (1999) Рго!ет еуойЮоп Ьу то1еси1аг Ьгеейшд СиггеШ Оршюп ίη Скеписгй Вю1оду 3:284-290; СЬЙ8Йап8 (1999) Ойес!ей еуоййюп оГ Лунийте к1па8е Гог Л2Т рко8рЬогу1акоп И8шд ΌΝΆ Гатйу 81шГГ1тд №1иге Вю!ес1то1оду 17:259-264; Сгатек (1998) ΌΝΆ 81шГГкпд оГ а Гатйу оГ депе8 Ггот й|уег8е 8рес1е8 ассе1ега1е8 ййес!ей еуоййюп №йиге 391:288-291; Сгатек (1997) Мо1еси1аг еуоййюп оГ ап аг8епа!е йеЮхКюайоп райтаау Ьу ΌΝΆ 8ЙиГЯтд, №йиге Вю!ес1то1оду 15:436-438; Ζ1ι;ηι§ (1997) Όίгес!ей еуоййюп оГ ап еГГескуе Гисо81йа8е Ггот а да1ас!о81йа8е Ьу ΌΝΆ 8йий1тд апй 8сгеетпд Ргос. №й1. Асай. 8с1. И8А 94:4504-4509; Райеп е! а1. (1997) Аррйсакоп8 оГ ΌΝΑ 8йи£Гйпд !о РНагтасеийсак апй Уассше8 СиггеШ Оршюп ш Вю!ес1то1оду 8:724-733; Статей е! а1. (1996) Соп8кисйоп апй еуоййюп оГ апйЬойу-рйаде ИЬгаке8 Ьу ΌΝΑ 8ЙиГГйп§ №йиге Мейюше 2:100-103; Статей е! а1. (1996) ’йтргоуей дгееп Ппоге8сеп! ргсйет Ьу то1еси1аг еνο1ийοп И8шд ΌΝΑ 8ЙиГГйпд №йиге Вю!ес1то1оду 14:315-319; Оа!е8 е! а1. (1996) АГйпйу 8е1есйуе 18о1айоп оГ йдапй8 Ггот рерййе НЬгайе8 Лгоидй й18р1ау оп а 1ас герге88ог 1еайр1есе Л тег 1опгпа1 оГ Мо1еси1аг Вю1оду 255:373-386; 81еттег (1996) 8ехиа1 РСК апй А88етЬ1у РСК Л: Т1е Епсус1орей1а оГ Мо1еси1аг Вю1оду. УСН РиЬЙ8Йег8, №\у Уогк. рр.447-457; Статей апй 81еттег (1995) СотЬтаЮгкй ти1йр1е са88ейе тп!адепе818 сгеа!е8 а11 Не регти1айоп8 оГ ти!ап! апй \уйй!уре са88ейе8 В|оТескп1цие8 18:194-195; 8Юттег е! а1. (1995) 8шд1е-8Юр а88етЬ1у оГ а депе апй епйге р1а8ийй Гогт 1агде питЬег8 оГ ойдойеохуйЬопис1еоййе8 Оепе, 164:49-53; 8Юттег (1995) Т1е Ενο1ийοп оГ Мо1еси1аг СотрШайоп 8с1епсе 270: 1510; 8Юттег (1995) 8еагсйтд 8ецпепсе 8расе ВЮ/Тес1по1оду 13:549553; 8Юттег (1994) КарЮ еνο1ийοп оГ а ргсйет ш уйго Ьу ΌΝΑ 8ЙиГГйпд №йиге 370:389-391; апй 8Юттег (1994) ΌΝΑ 8ЙиГГйпд Ьу гапйот ГгадтеШайоп апй геа88етЬ1у: Л уйго гесотЫпайоп Гог то1еси1аг еуо1икоп. Ргос. Ν311. Асай. 8сг И8А 91:10747-10751.
Основанные на мутагенезе способы создания разнообразия включают, например, сайтспецифичный мутагенез (Ьшд е! а1. (1997) Арргоасйе8 !о ΌΝΛ ти1адепе818: ап оуег\ае\у Апа1 Вюсйет. 254(2): 157-178; Эа1е е! а1. (1996) ОИдопис1еокйе-йЮесЮй гапйот тп!адепе818 И8шд Не рйо8рйогоЛюа1е тейюй МеЛой8 Мо1. Вю1. 57:369-374; 8тйй (1985) Ы уйго ти1адепе818 Апп. Кеу. Оепе!. 19:423-462; Во!8!ет & 8йогйе (1985) 8каЮд1е8 апй аррйсайоп8 оГ т уйго ти1адепе818 8аепсе 229:1193-1201; Сайег (1986) 8йе-ййесЮй ти1адепе818 Вюсйет. ί. 237:1-7; апй Кипке1 (1987) Тйе еГйаепсу оГ ойдопис1еоййе йпес!ей ти1адепе818 ш №с1ею Аай8 & Мо1еси1аг ВЮ1оду (Еск8Юш, Р. апй Ьй1еу, Ό. М. ί. ей8., 8рйпдег Уег1ад, Вегйп)); мутагенез с использованием содержащих урацил матриц (Кипке1 (1985) КарИ апй еГйаеп! 8Йе-8ресйю ти1адепе818 \уй1югй ркепо!ур1с 8е1есйоп Ргос. №й1. Асай. 8сг И8А 82:488-492; Кипке1 е! а1. (1987) КарЮ апй еГПаеп! 8йе-8реайс ти1адепе818 \уй1югй ркепо!ур1с 8е1есйоп МеЛой8 ш Еп/уток 154, 367-382; апй Ва88 е! а1. (1988) Ми!ап! Тгр герге88ог8 \\ЙН пе\у ^NΑ-Ь^пй^пд 8ресШаке8 8аепсе 242:240-245); сайт-специфичный мутагенез с использованием олигонуклеотидов (МеЛой8 ш Еп/уток 100: 468-500 (1983); МеЛой8 ш Еп/уто1. 154: 329-350 (1987); Ζο11е^ & 8тй1 (1982) Ойдопис1еоййейкесЮй тп1адепе818 и8шд М13-йепуей уес!ог8: ап еГПаеп! апй депега1 ргосейиге Гог Не ргойисйоп оГ ропй ти1айоп8 ш апу ^NΑ Ггадтеп! №с1ею АЫй8 Ке8. 10:6487-6500; Ζο11е^ & 8тй1 (1983) Ойдопис1еоййейгсес!ей тп1адепе818 оГ ^NΑ Ггадтеп!8 с1опей шЮ М13 уес!ог8 МеЛой8 ш Еп/уто1. 100:468-500; апй Ζο11е^ & 8тй1 (1987) Ойдопис1еокйе-йкесЮй ти1адепе818: а 81тр1е тейюй и8шд !\\ό ойдопис1еоййе рптег8 апй а 8шд1е-8капйей ^NΑ !етркйе Ме!1юй8 ш Еп/уто1. 154:329-350); мутагенез модифицированной фосфоротиоатом ДНК ти1адепе818 (Тау1ог е! а1. (1985) Т1е и8е оГ рйο8рйο^οΐй^οаЮ-тοййϊей ^NΑ ш ге8йюйоп еп/уте геасйоп8 !о ргераге тскей ^NΑ Νϋθ1. Аай8 Ке8. 13: 8749-8764; Тау1ог е! а1. (1985) Т1е гарМ депегайоп оГ ойдопис1еоййе-ййес1ей ти1айоп8 а! Шдк Ггецпепсу и8шд рйο8рйο^ο!й^οа!е-тοй^Лей ^NΑ №с1. Ас1й8 Ке8. 13: 8765-8787 (1985); Nакатауе (1986) Iпй^Ь^!^οп оГ ге8йюйоп епйопис1еа8е Να Ι с1еауаде Ьу р11о8р1юго!11юа!е дгоир8 апй Й8 аррйсайоп !о оИдопис1еоййе-ййес1ей тп!адепе818 №с1. Аай8 Ке8. 14: 9679-9698; 8ауег8 е! а1. (1988) Υ-Т Ехопис1еа8е8 ш рйο8рйο^ο!й^οа!е-Ьа8ей ойдопис1еоййе-ййес1ей ти1адепе818 Νϋθ1. Аай8 Ке8. 16:791-802; апй 8ауег8 е! а1. (1988) 8йапй 8ресШс с1еауаде оГ р1о8р11ого!1иоа!е-соп!аттд ^NΑ Ьу геаскоп \\ЙН ге8!псйоп епйопис1еа8е8 ш Не рге8епсе оГ ейийтт Ьгоппйе Νϋθ1. Аай8 Ке8. 16: 803-814); мутагенез с использованием дуплексной ДНК с пробелами (Кгатег е! а1.
- 25 021178 (1984) ТНс дарреб бир1сх ЭНА арргоасН !о оПдопис1соббс-бйсс!сб тиГайоп сопкйисйоп №с1. Аабк Кек. 12: 9441-9456; Кгатсг & Рн!/ (1987) Мебюбк ίη Еп/уто1. 0Пдопис1соббс-бйсс!сб сопкйисйоп оГ ти1абопк νί;·ι дарреб бир1сх ЭКА 154:350-367; Кгатсг с! а1. (1988) бпргоусб сп/утабс ίη уНго геасбопк ίη 11с дарреб бир1сх ^NΑ арргоасН !о оПдопис1соббс-бйсс!сб сопк!гисбоп оГ ти!а!юпк №с1. Аабк Кек. 16: 7207; апб Ρηίζ с! а1. (1988) 0Пдопис1соббс-бйсс!сб сопк!гисбоп оГ ти!а!юпк: а дарреб бир1сх ргоссбигс \\а!1юи! сп/утабс геасбопк ίη уНго №с1. Аабк Кек, 16: 6987-6999).
Дополнительные протоколы, используемые в способах по изобретению, включают репарацию точечных ошибочных спариваний (Кгатсг (1984) Рот! М|кта!сН Керай Сс11 38: 879-887), мутагенез с использованием дефицитных по репарации линий хозяев(Сайсг с! а1. (1985) бпргоусб обдопис1соббс кйс-бйссКб ицЦадспскР икшд М13 усс!огк №с1. Аабк Кек. 13: 4431-4443; апб Сайсг (1987) бпргоусб обдопис1еоббс-бйсс!сб ти1адепск1к икшд М13 усс!огк Мебюбк ίη Еп/уто1. 154: 382-403), делеционный мутагенез (ЕдН!сбаг/абсН (1986) Икс оГ оНдопис1соббск !о дспсга!с 1агдс бс1с11опк №с1. Аабк Кек. 14: 5115), рестрикцию-селекцию и рестрикцию-селекцию и рестрикцию-очистку (\с11к с! а1. (1986) бпрог!аисс оГ Нубгодсп-Ьопб ГогтаПоп ίη кШЫбюпд Не 1гапк111оп к!а!с оГ киЬббкбГ' РЫ1. Тгапк. К. 8ос. Ьопб. А 317: 415-423), мутагенез посредством общего синтеза гена (ШтЫаг с! а1. (1984) То!а1 куШНсЫк апб с1опшд оГ а дспе собшд Гог Не йЬопис1сакс 8 ргоКш 8аспсс 223: 1299-1301; 8акатаг апб КНогапа (1988) То!а1 куШНсЫк апб схргсккюп оГ а дспе Гог Не а-киЬипй оГ Ьоуше гоб ои!сг кедтеп! диатпс пис1сойбс-Ьшбтд ргоКш (йаикбисш) N^1. Аабк Кек. 14: 6361-6372; \с11к с! а1. (1985) Саккс!!с тШадспек® ап сГбасп! тебюб Гог дспегабоп оГ ти1бр1с ти!абопк а! бейпсб кПек Оспе 34:315-323; апб 0гипбк1гот с! а1. (1985) 0Ндопис1еоббс-бйсс!сб ицЦадспскР Ьу писгокса1с к1ю!-дип дспе куп1Нск1к №с1. Аабк Кек. 13: 33053316), репарацию двунитевых разрывов (МапбесЫ (1986); Агпо1б (1993) Рго1сш епдшсейпд Гог ипикиа1 спупоптеШк Сиггсп! 0р1топ ίη Вю!сс1то1оду 4:450-455. 0Ндопис1еоббс-бйсс!сб боиЬ1с-к!гаиб Ьгсак геран ίη р1акпибк оГ ЕксбенсНа сой: а тебюб Гог кНе-крсабс тШадспекю Ргос. №6. Асаб. 8а. И8А 83:7177-7181).
Дополнительные подробности или альтернативные протоколы многих описанных выше способов можно найти в публикации Мебюб ίη Еп/уто1оду У. 154, в которой также описаны применимые контроли для решении проблем поиска ошибок при различных способах мутагенеза. Смотри также патент США № 5605793, 81сштсг (25 февраля 1997), Мебюбк Гог Ιη Уйго КссотЬшайоп; патент США № 5811238, 8!сшшсг с! а1., (22 сентября 1998) Мебюбк Гог Оспегабпд Ро1упис1еойбск Наушд Эекисб СНагас!снкбск ЬуНегабус 8с1ссбоп апб КесотЫпабоп; патент США № 5830721, 8!сшшсг с! а1., (3 ноября 1998), ^NΑ Ми1адспск1к Ьу Капбот Ргадтсп!абоп апб КсаккстЫу; патент США № 5834252, 8!сшшсг с! а1., (10 ноября 1998) Еп6-Сошр1сшсп1цгу Ро1утегакс Ксасбоп; патент США № 5837458, МбЫшП с! а1., (17 ноября 1998), Мебюбк апб СотроЫюпк Гог Сс11и1аг апб Мс1аЬойс Епдшсейпд; \0 95/22625, 8!сшшсг апб Статен, Мшадспекю Ьу Капбот Ргадтсп!абоп апб КсаккстЫу; \0 96/33207 Ьу 8!сшшсг апб барксНи!/ Епб Сотрйтсгиагу Ро1утегакс СНат Ксасбоп; \0 97/20078 Ьу 8!сшшсг апб Статен Мебюбк Гог Оспсгабпд Ро1упис1соббск Наушд Оскисб СНагас!снкбск Ьу Йегайус 8с1ссйоп апб КесотЫпайоп; \0 97/35966 Ьу МбакНиб апб 8!сшшсг, Мебюбк апб СотрокПюпк Гог Сс11и1аг апб Мс1аЬойс Епдшсейпд; \0 99/41402 Ьу Риииопсп с! а1. Тагдейпд оГ Оспсбс Уассшс Усс!огк; \0 99/41383 Ьу Риппопсп с! а1. Апбдсп ЫЬгагу бпРпшт/абоп; \0 99/41369 Ьу Риппопсп с! а1. Оспсбс Уассшс Усс!ог Епдшсейпд; \0 99/41368 Ьу Риппопсп с! а1. 0рбпи/абоп оГ Iшшиηοшοби1аΐο^у Ргорсгйск оГ Оспейс Уассшек; ЕР 752008 Ьу 8!сшшсг апб Статен, Ω^ Мшадспекю Ьу Капбот Ргадтсп!абоп апб КсаккстЫу; ЕР 0932670 Ьу 8!сшшсг Еуобапд Сс11и1аг Ω^ Ир1аке Ьу Кссигкгус 8сцпеисс КесотЬбаабоп; \0 99/23107 Ьу 8!сшшсг с! а1., МобШсайоп оГ У1гик Тгорйпа апб Нок! Капдс Ьу У1га1 Оспотс 8йиГйшд; \0 99/21979 Ьу Ар! с! а1., Нитап РарШотауник Усс!огк; \0 98/31837 Ьу бе1 Сагбауге с! а1. ЕуоНабоаа оГ \Но1с Сс11к апб 0гдапюпак Ьу Кссигкгус 8сцпеисс КссοшЬ^ηаΐ^οη; \0 98/27230 Ьу Райсп апб 8!сшшсг, Мебюбк апб СопарокР боаак Гог Ро1урср!1бс Епдшсейпд; \0 98/27230 Ьу 8!сшшсг с! а1., Мебюбк Гог 0рбпи/абоп оГ Оспе ТНегару Ьу Кссигкгус 8сцпеисс 8йиГйшд апб 8с1ссйоп, \0 00/00632, Мебюбк Гог Оспегайпд ШдН1у Огуегке ЫЬгайск, \0 00/09679, Мебюбк Гог 0Ыа1тпд ίη УПго КесотЬтеб Ро1упис1сойбс 8сциеисс Вапкк апб Кски1йпд 8сцисисск, \0 98/42832 Ьу Агпо1б с! а1., КесотЫпайоп оГ Ро1угшс1соббс 8сциеисск Икшд Капбот ог ЭсПисб Рпшсгк, \0 99/29902 Ьу Агпо1б с! а1., Мебюб Гог Сгсайпд Ро1упис1еойбс апб Ро1урср!1бс 8сдиепсск, \0 98/41653 Ьу Ушб, Ап ίη УПго Мебюб Гог Сопк!гисбоп оГ а ^NΑ ЫЬгагу, \0 98/41622 Ьу ВогсНсг! с! а1., Мебюб Гог Сопк!гисбпд а ЫЬгагу Икшд 8йиГйтд, апб \0 98/42727 Ьу Рай апб 2агбид,8сцисисс АИегайопк икшд Ното1одоик КссοшЬ^иаΐ^οη.
В заявках на выдачу патентов США приведены дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к различным способам создания разнообразия, включая 8йиГйшд оГ собой айсгеб дспек, Райсп с! а1., поданную 28 сентября 1999 (США, номер регистрации 09/407,800); Еуо1ибоп оГ №Йо1с сс11к апб огдашктк Ьу гссигкгус кесщепсе гесотЫпабоп, бе1 Сагбаугс с! а1., поданную 15 июля 1998 (США, номер регистрации 09/166188) и 15 июля 1999 (США, номер регистрации 09/354922); 0йдопис1еойбс тсб1а!сб пис1сю ааб гесотЫпабоп, Статен с! а1., поданную 28 сентября 1999 (США, номер регистрации 09/408392) и 0Ндопис1сойбс тсб1а!сб пис1сю ааб гесотЫпабоп, Статей с! а1., поданную 18 января 2000 (РСТ/И800/01203); Икс оГ собоп-уанеб ойдопис1еойбс куи!Нск1к Гог купЫсйс кйиГйшд, \с1сН с! а1., поданную 28 сентября 1999 (США, номер регистрации 09/408393);
- 26 021178
МеШойк Гог такшд сйагас!ег Чппдх. ро1упис1еоййе8 апй ро1урерййе8 Ьаушд йейгей сНагасЮгкИс®, 8ейГопоу е! а1., поданную 18 января 2000, (РСТ/И800/01202) и, например, Ме!йоЙ8 Гог такшд сйагас!ег Чппдх, ро1упис1еоййе8 апй ро1урерййе8 Наутд йейгей сНагасЮгкНс®, ЗеНГопоу е! а1., поданную 18 июля 2000 (США, номер регистрации 09/618579); Ме!НоЙ8 оГ рори1айпд йа!а Чгискне Гог и§е ш еуоМюпагу 81ти1айоп8, ЗеНГопоу апй 8!еттег, поданную 18 января 2000 (РСТ/и800/01138); и 8шд1е-5!гапйей пис1ею ас1й 1етр1а1е-тей1а1ей гесотЫпаНоп апй пис1ею ашй Ггадтеп! ко1а1юп, ЛГНоНег, поданную 6 сентября 2000 (США, номер регистрации 09/656549).
Нестохастические способы или способы направленной эволюции включают, например, насыщающий мутагенез генных сайтов (О88М), вторичную сборку синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования (8ЬК) или их сочетание, используют для модификации нуклеиновых кислот по изобретению, чтобы создать фитазы с новыми или измененными свойствами (например, активность в высоко кислотных или щелочных условиях, при высоких или низких температурах и тому подобных). Полипептиды, кодируемые модифицированными нуклеиновыми кислотами, могут быть подвергнуты скринингу в отношении активности перед тестированием в отношении фитазной или другой активности. Можно использовать любой способ или протокол тестирования, например, использовать капиллярные матрицы. Смотри, например, патенты США № 6361974, 6280926, 5939250.
Насыщающий мутагенез или С88М
Изобретение также относится к способам получения фермента с использованием насыщающего мутагенеза генных сайтов или О88М, описанного в настоящей публикации, а также в патентах США № 6171820 и 6579258.
В одном из аспектов используют кодонные праймеры, содержащие вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т, чтобы ввести мутации в полинуклеотид, например, фермент фитазу или антитело по изобретению, так чтобы создать набор получаемых в результате полипептидов, в котором представлен полный диапазон одиночных аминокислотных замен в каждом положении аминокислоты, например, может быть модифицирован остаток аминокислоты на активном участке фермента или на участке связывания лиганда. Такие олигонуклеотиды могут содержать следующие друг за другом первую гомологичную последовательность, вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т и, необязательно, вторую гомологичную последовательность. Дочерние получаемые в результате использования таких олигонуклеотидов закодированные ниже продукты трансляции включают все возможные аминокислотные изменения в каждом аминокислотном сайте вдоль полипептида, поскольку вырожденность последовательности Ν,Ν,Ο/Т включает кодоны для всех 20 аминокислот. В одном из аспектов один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий, например, одну вырожденную кассету Ν,Ν,Ο/Т) используют для того, чтобы подвергнуть каждый оригинальный кодон в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используют по меньшей мере две вырожденных кассеты - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо нет, для того, чтобы подвергнуть по меньшей мере два оригинальных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Например, в одном олигонуклеотиде может находиться более одной последовательности Ν,Ν,Ο/Т, чтобы ввести аминокислотные мутации в более чем одном участке. Несколько таких последовательностей Ν,Ν,Ο/Т могут непосредственно соседствовать или могут быть разделены одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте олигонуклеотиды, пригодные для введения добавлений и делеций, могут быть использованы либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ο/Т, чтобы ввести любое сочетание или перетасовку аминокислотных добавлений, делеций и/или замен.
В одном из аспектов одновременный мутагенез в двух или более следующих друг за другом положениях аминокислот осуществляют, используя олигонуклеотид, который содержит следующие друг за другом триплеты Ν,Ν,Ο/Т, т.е. вырожденную последовательность (Ν,Ν,Ο/Γχ В другом аспекте используют вырожденные кассеты, имеющие меньшую вырожденность, чем последовательность Ν,Ν,Ο/Т. Например, в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета, содержащей только один Ν, при этом указанный Ν может быть в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки, можно использовать в остальных двух положениях триплета. Альтернативно в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной триплетной последовательности Ν,Ν,Ν.
В одном из аспектов использование вырожденных триплетов (например, триплетов Ν,Ν,Ο/Т) обеспечивает возможность системного и простого создания полного диапазона возможных природных аминокислот (всего 20 аминокислот) во всех без исключения аминокислотных положениях в полипептиде (в альтернативных аспектах способы также включают создание не всех возможных замен в одном положении аминокислотного остатка или кодона). Например, в случае полипептида длиной 100 аминокислот можно создать 2000 разных видов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). В результате использования олигонуклеотида или группы олигонуклеотидов, содержащих вырожденный триплет Ν,Ν,Ο/Т, 32 индивидуальных последовательности могут кодировать все 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинук- 27 021178 леотидную последовательность подвергают насыщающему мутагенезу с использованием по меньшей мере одного такого олигонуклеотида, создают 32 отдельных дочерних полинуклеотида, кодирующих 20 отдельных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида в сайтспецифичном мутагенезе приводит к образованию только одного дочернего полипептидного продукта в реакционном сосуде. Невырожденные олигонуклеотиды, необязательно, можно использовать в сочетании с описанными вырожденными праймерами; например, невырожденные олигонуклеотиды можно использовать для создания специфичных точечных мутаций в рабочем полинуклеотиде. Такой подход обеспечивает средство создания специфичных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующим аминокислотным изменениям, и точечных мутаций, которые вызывают образование стоп-кодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептида.
В одном из аспектов каждый реакционный сосуд для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 дочерних полипептидных молекул (например, фермента фитазы), такие что, все 20 природных аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, подвергнутого мутагенезу в исходном полинуклеотиде (в других аспектах используют не все 20 природных сочетаний). 32-кратные вырожденные дочерние полипептиды, созданные в каждом реакционном сосуде для насыщающего мутагенеза, могут быть подвергнуты клональной амплификации (например, клонированы в подходящем хозяине, например, хозяине Е. сой, с использованием, например, вектора экспрессии) и подвергнуты скринингу экспрессии. Когда при скрининге обнаруживают, что индивидуальный дочерний полипептид проявляет подходящее изменение свойства (по сравнению с исходным полипептидом, такое как повышенная активность в гидролизе глюкана в щелочных или кислых условиях), полипептид может быть секвенирован, чтобы идентифицировать имеющуюся в нем соответствующую благоприятную аминокислотную замену.
В одном из аспектов после мутагенеза всех без исключения положений аминокислот в исходном полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, как описано в настоящей публикации, благоприятные аминокислотные изменения могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении. Могут быть созданы одна или несколько новых дочерних молекул, которые содержат сочетание всех или части таких благоприятных аминокислотных замен. Например, если идентифицированы 2 конкретных благоприятных аминокислотных изменения в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменения по сравнению с исходной аминокислотой и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, всего существует 3x3x3 или 27 возможностей, включая 7, которые были исследованы ранее 6 одиночных точечных мутаций (т.е., 2 в каждом из трех положений) и без изменения в любом положении.
В еще одном аспекте мутагенез с насыщением сайтов можно использовать вместе с перетасовкой, химеризацией, рекомбинацией и другими способами мутагенеза наряду с использованием скрининга. Настоящее изобретение относится к применению любого способа(ов) мутагенеза, включая насыщающий мутагенез, альтернативным образом. В одном из примеров используют многократное применение любого способа(ов) мутагенеза в сочетании со скринингом.
Изобретение также относится к применению собственных кодонных праймеров (содержащих вырожденную последовательность Ν,Ν,Ν), чтобы ввести точечные мутации в полинуклеотид, так чтобы создать группу дочерних полипептидов, в которых представлен полный диапазон одиночных аминокислотных замен в каждом аминокислотном положении (насыщающий мутагенез генных сайтов (С88М)). Используемые олигонуклеотиды состоят из следующих друг за другом первой гомологичной последовательности, вырожденной последовательности Ν,Ν,Ν и в одном из аспектов, но не обязательно, второй гомологичной последовательности. Дочерние закодированные ниже продукты трансляции, полученные в результате использования таких олигонуклеотидов, включают все возможные аминокислотные изменения в каждом аминокислотном сайте вдоль полипептида, поскольку вырожденность последовательности Ν,Ν,Ν включает кодоны для всех 20 аминокислот.
В одном из аспектов один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий одну вырожденную кассету Ν,Ν,Ν) используют для того, чтобы подвергнуть каждый оригинальный кодон в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используют по меньшей мере две вырожденных кассеты Ν,Ν,Ν - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергнуть по меньшей мере два оригинальных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Таким образом, в одном олигонуклеотиде может находиться более одной последовательности Ν,Ν,Ν, чтобы ввести аминокислотные мутации в более чем одном участке. Несколько таких последовательностей Ν,Ν,Ν могут непосредственно соседствовать или могут быть разделены одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте олигонуклеотиды, пригодные для введения добавлений и делеций, могут быть использованы либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность Ν,Ν,Ν, чтобы ввести любое сочетание или перетасовку аминокислотных добавлений, делеций и/или замен.
В конкретном примере возможен одновременный мутагенез в двух или более следующих друг за другом положениях аминокислот с использованием олигонуклеотида, который содержит следующие друг за другом триплеты Ν,Ν,Ν, т.е. вырожденную последовательность (Ν,Ν,Ν)η.
- 28 021178
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению вырожденных кассет, имеющих меньшую вырожденность, чем последовательность Ν,Ν,Ν. Например, в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета, содержащей только один Ν, при этом указанный Ν может быть в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки, можно использовать в остальных двух положениях триплета. Альтернативно в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета Ν,Ν,Ν, последовательности триплета Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν,Ο/С.
Однако понятно, что использование вырожденного триплета (такого как последовательность триплета Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν,Ο/С), которое раскрыто в настоящем изобретении, имеет преимущества по нескольким причинам. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам систематичного и довольно простого получения замены полного диапазона возможных аминокислот (всего 20 аминокислот) во всех без исключения аминокислотных положениях в полипептиде. Таким образом, в случае полипептида длиной 100 аминокислот изобретение обеспечивает путь систематического и довольного простого создания 2000 разных видов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). Понятно, что благодаря использованию олигонуклеотида, содержащего вырожденную последовательность триплета Ν,Ν,Ο/Т или Ν,Ν,Ο/С, получают 32 индивидуальных последовательности, которые кодируют 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают насыщающему мутагенезу с использованием одного такого олигонуклеотида, создают 32 отдельных дочерних полинуклеотида, кодирующих 20 отдельных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида в сайт-специфичном мутагенезе приводит к образованию только одного дочернего полипептидного продукта в реакционном сосуде.
Настоящее изобретение также относится к применению невырожденных олигонуклеотидов, которые, необязательно, могут быть использованы в сочетании с описанными вырожденными праймерами. Понятно, что в некоторых случаях, предпочтительно, использование невырожденных олигонуклеотидов, чтобы создать специфичные точечные мутации в рабочем полинуклеотиде. Такой подход обеспечивает средство создания специфичных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующим аминокислотным изменениям, и точечных мутаций, которые вызывают образование стопкодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептида.
Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения каждый реакционный сосуд для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 дочерних полипептидных молекул, таких что все 20 аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, подвергнутого мутагенезу в исходном полинуклеотиде. 32кратные вырожденные дочерние полипептиды, созданные в каждом реакционном сосуде для насыщающего мутагенеза, могут быть подвергнуты клональной амплификации (например, клонированы в подходящем хозяине Е. сой, с использованием вектора экспрессии) и подвергнуты скринингу экспрессии. Когда при скрининге обнаруживают, что индивидуальный дочерний полипептид проявляет подходящее изменение свойства (по сравнению с исходным полипептидом), полипептид может быть секвенирован, чтобы идентифицировать имеющуюся в нем соответствующую благоприятную аминокислотную замену.
Понятно, что после мутагенеза всех без исключения положений аминокислот в исходном полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза, как описано в настоящей публикации, благоприятные аминокислотные изменения могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении. Могут быть созданы одна или несколько новых дочерних молекул, которые содержат сочетание всех или части таких благоприятных аминокислотных замен. Например, если идентифицированы 2 конкретных благоприятных аминокислотных изменения в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменения по сравнению с исходной аминокислотой и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, всего существует 3x3x3 или 27 возможностей, включая 7, которые были исследованы ранее 6 одиночных точечных мутаций (т.е., 2 в каждом из трех положений) и без изменения в любом положении.
Таким образом, в не ограничивающем примере настоящее изобретение относится к применению насыщающего мутагенеза в сочетании с дополнительными способами мутагенеза, такими как способ, при котором два или более родственных полинуклеотида вводят в подходящую клетку-хозяина, так что образуется гибридный полинуклеотид в результате рекомбинации и редукционной пересортировки.
Кроме осуществления мутагенеза вдоль полной последовательности гена в настоящем изобретении предлагается применение мутагенеза для замены каждого из любого количества оснований в полинуклеотидной последовательности, при этом количество оснований, подвергаемых мутагенезу, в одном из аспектов является любым целым числом от 15 до 100000. Таким образом, вместо мутагенеза каждого положения вдоль молекулы можно подвергать мутагенезу любое или определенное количество оснований (в одном из аспектов группу, насчитывающую от 15 до 100000). В одном из аспектов отдельный нуклеотид используют для мутагенеза каждого положения или группы положений вдоль полинуклеотидной последовательности. Группой из 3 положений, подвергаемых мутагенезу, может быть кодон. Му- 29 021178 тации могут быть введены с использованием мутагенного праймера, содержащего гетерологичную кассету, также называемую мутагенной кассетой. Примерные кассеты могут иметь от 1 до 500 оснований. В каждом положении нуклеотида в таких гетерологичных кассетах может быть Ν, А, С, Ο, Т, А/С, Α/Ο, А/Т, С/Ο, С/Т, Ο/Т, С/О/Т, Α/Ο/Т, А/С/Т, Α/С/О или Е, где Е означает любое основание, которое не является А, С, О или Т (Е может быть назван конструирующим олигонуклеотидом).
В общем смысле насыщающий мутагенез заключается в мутагенезе полного набора мутагенных кассет (при этом каждая кассета в одном из аспектов имеет длину примерно 1-500 оснований) в определенной подвергаемой мутагенезу полинуклеотидной последовательности (при этом последовательность, подвергаемая мутагенезу, в одном из аспектов имеет длину примерно от 15 до 100000 оснований). Таким образом, группу мутаций (в диапазоне от 1 до 100 мутаций) вводят в каждую кассету, подвергаемую мутагенезу. Группа мутаций, вводимых в одну кассету, может отличаться или может быть такой же, как и вторая группа мутаций, вводимых во вторую кассету, во время использования одного раунда насыщающего мутагенеза. Примерами таких групп являются делеции, добавления, группировки конкретных кодонов и группировки конкретных нуклеотидных кассет.
Определенные последовательности, подвергаемые мутагенезу, включают целый ген, каскад генов, кДНК, полную открытую рамку считывания (ОРС) и полный промотор, энхансер, репрессор/трансактиватор, точку начала репликации, интрон, оператор или любую функциональную группу полинуклеотидов. В общем, определенные последовательности для такой цели могут представлять собой любой полинуклеотид, который является состоящим из 15 оснований полинуклеотидной последовательностью и полинуклеотидными последовательностями длиной от 15 оснований до 15000 оснований (в настоящем изобретении специально включено каждое целое число в указанном диапазоне). При выборе групп кодонов в рассмотрение включены типы аминокислот, кодируемых вырожденной мутагенной кассетой.
Согласно одному примеру группы мутаций, которые могут быть введены в мутагенную кассету, настоящее изобретение, в частности, относится к вырожденным заменам кодонов (с использованием вырожденных олигонуклеотидов), которые кодируют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 аминокислот в каждом положении, и библиотеке полипептидов, кодируемых таким образом.
Вторичная сборка синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования (8ЬК)
Изобретение относится к системе нестохастических модификаций генов, называемой вторичной сборкой синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования, или просто δΕΚ, способом направленной эволюции для создания полипептидов, например, фитазных ферментов или антител по изобретению с новыми или измененными свойствами. δΕΚ представляет собой способ лигирования олигонуклеотидных фрагментов вместе не случайным образом. Настоящий способ отличается от стохастической перетасовки олигонуклеотидов тем, что строительные блоки нуклеиновой кислоты не перетасовывают, не составляют или не химеризуют случайным образом, а собирают нестохастически. Смотри, например, патенты США № 6773900, 6740506, 6713282, 6635449, 6605449, 6537776.
В одном из аспектов δΕΚ включает следующие стадии: (а) получение матричного полинуклеотида, при этом матричный полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую гомологичный ген, (Ь) получение множества полинуклеотидов строительных блоков, при этом полинуклеотиды строительных блоков конструируют так, чтобы обеспечить вторичную сборку в результате кроссинговера с матричным полинуклеотидом в предварительно определяемой последовательности, и полинуклеотид строительного блока содержит последовательность, которая является вариантом гомологичного гена, и последовательность, гомологичную матричному полинуклеотиду, фланкирующую вариант последовательности; (с) объединение полинуклеотида строительного блока с матричным полинуклеотидом, так чтобы полинуклеотид строительного блока участвовал во вторичной сборке в результате кроссинговера с матричным полинуклеотидом с образованием полинуклеотидов, содержащих варианты последовательности гомологичного гена.
δΕΚ не зависит от наличия высоких уровней гомологии между полинуклеотидами, подвергаемыми вторичной сборке. Таким образом, данный способ можно использовать для нестохастического создания библиотек (или наборов) дочерних молекул, содержащих более 10100 разных химер. δΕΚ можно использовать для создания библиотек, содержащих более 101000 разных дочерних химер. Таким образом, аспекты настоящего изобретения включают нестохастические способы получения набора окончательно сформированных химерных молекул нуклеиновой кислоты, имеющих общий порядок сборки, который выбран намеренно. Настоящий способ включает стадии намеренного создания множества конкретных строительных блоков нуклеиновых кислот, имеющих пригодные взаимно совместимые концы, которые могут быть лигированы, и сборку таких строительных блоков нуклеиновых кислот, так что достигается запланированный общий порядок сборки. Взаимно совместимые лигируемые концы строительных блоков нуклеиновой кислоты, которые необходимо собрать, считают пригодными для такого типа упорядоченной сборки, если они способны связывать строительные блоки в предварительно определяемом порядке. Таким образом, общий порядок сборки, в котором строительные блоки нуклеиновой кислоты могут быть связаны, устанавливается конструированием лигируемых концов. Если используют более одной стадии сборки, то общий порядок сборки, в котором строительные блоки нуклеиновой кислоты
- 30 021178 могут быть связаны, также устанавливается последовательными порядком стадий сборки. В одном из аспектов подвергнутые отжигу строительные кусочки обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4), с получением ковалентного связывания строительных кусочков. В одном из аспектов нестохастический способ, называемый вторичной сборкой синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования (8ЬК), который в некоторой степени родственен стохастической перетасовке, за исключением того, что строительные блоки нуклеиновых кислот не перетасовываются или не связываются или не подвергаются химеризации случайным образом, а собираются нестохастически, можно применять для создания вариантов.
Способ 8ЬК не зависит от наличия высокого уровня гомологии между полинуклеотидами, подвергаемыми перетасовке. Изобретение можно использовать для нестохастического создания библиотек (или наборов) дочерних молекул, содержащих более 10100 разных химер. Вероятно 8ЬК можно даже использовать для создания библиотек, содержащих более 101000 разных дочерних химер.
Таким образом, в одном из аспектов изобретения предлагается нестохастический способ получения набора окончательно сформированных химерных молекул нуклеиновой кислоты, имеющих общий порядок сборки, который выбран намеренно, и такой способ включает стадии намеренного создания множества конкретных строительных блоков нуклеиновой кислоты, имеющих пригодные взаимно совместимые концы, которые могут быть лигированы, и сборку таких строительных блоков нуклеиновых кислот, так что достигается запланированный общий порядок сборки.
Взаимно совместимые лигируемые концы строительных блоков нуклеиновой кислоты, которые необходимо собрать, считают пригодными для такого типа упорядоченной сборки, если они способны связывать строительные блоки в предварительно определяемом порядке. Таким образом, в одном из аспектов общий порядок сборки, в котором строительные блоки нуклеиновой кислоты могут быть связаны, устанавливается конструированием лигируемых концов, и если используют более одной стадии сборки, то общий порядок сборки, в котором строительные блоки нуклеиновой кислоты могут быть связаны, также устанавливается последовательным порядком стадий сборки. В одном из аспектов изобретения подвергнутые отжигу строительные кусочки обрабатывают ферментом, таким как лигаза (например, ДНК-лигаза Т4), с получением ковалентного связывания строительных кусочков.
В другом аспекте дизайн строительных блоков нуклеиновой кислоты определяют после анализа последовательностей набора матриц нуклеиновых кислот-предшественников, которые служат в качестве основы для получения дочернего набора окончательно сформированных химерных молекул нуклеиновых кислот. Таким образом, такие матрицы нуклеиновых кислот-предшественников случат в качестве источника информации о последовательностях, которая помогает в конструировании строительных блоков нуклеиновых кислот, которые подвергают мутагенезу, т.е. химеризации или перетасовке.
В одном из примеров изобретение относится к химеризации семейства родственных генов и кодируемого ими семейства родственных продуктов. В конкретном примере кодируемыми продуктами являются ферменты. Ферменты и полипептиды, используемые в изобретении могут быть подвергнуты мутагенезу согласно способам, описанным в настоящей публикации.
Таким образом, согласно одному из аспектов изобретения последовательности множества матриц нуклеиновых кислот-предшественников выравнивают, чтобы выбрать одну или несколько пограничных точек, и такие пограничные точки могут быть локализованы в области гомологии. Пограничные точки могут быть использованы для того, чтобы установить границы создаваемых строительных блоков нуклеиновой кислоты. Таким образом, пограничные точки, идентифицированные и выбранные в молекулахпредшественниках, служат в качестве потенциальных точек химеризации при сборке дочерних молекул.
Обычно пригодной пограничной точкой является область гомологии (состоящая по меньшей мере из одного гомологичного основания нуклеотида), которая является общей по меньшей мере для двух матриц-предшественников, но пограничной точкой может быть область гомологии, которая является общей по меньшей мере для половины матриц-предшественников по меньшей мере двух третей матрицпредшественников по меньшей мере трех четвертых матриц-предшественников или почти всех матрицпредшественников. В одном из аспектов подходящей пограничной точкой является область гомологии, которая является общей для всех матриц-предшественников.
В одном из аспектов способ вторичной сборки с использованием реакции лигирования осуществляют тщательно, чтобы создать исчерпывающую библиотеку. Другими словами, все возможные упорядоченные сочетания строительных блоков нуклеиновой кислоты представлены в наборе окончательно сформированных химерных молекул нуклеиновой кислоты. В тоже время порядок сборки (т.е. порядок сборки каждого строительного блока в 5'- 3'-последовательности каждой окончательно сформированной химерной нуклеиновой кислоте) в каждом сочетании осуществляют намеренно (или не стохастически). Вследствие нестохастической природы способа вероятность получения нежелательных побочных продуктов сильно снижается.
В другом аспекте способ предусматривает, что процесс сборки лигированием осуществляют систематично, например, чтобы создать систематически разделенные на отделы библиотеки, при этом отделы могут быть подвергнуты систематическому скринингу, например, поочередно. Другими словами изобретение предусматривает, что посредством избирательного и продуманного использования конкретных
- 31 021178 строительных блоков нуклеиновых кислот, вместе с избирательным и продуманным использованием последовательных пошаговых реакций сборки может быть осуществлен дизайн эксперимента, в случае которого получают конкретные наборы дочерних продуктов в каждом из нескольких реакционных сосудов. Это позволяет проводить систематический анализ и скрининг. Таким образом, это позволяет систематически исследовать потенциально очень большие количества дочерних молекул в небольших группах.
Вследствие возможности осуществлять химеризацию таким образом, который является очень гибким и, кроме того, также полным и систематическим, особенно когда имеет место низкий уровень гомологии среди молекул-предшественников, настоящее изобретение предусматривает создание библиотеки (или набора), состоящей из большого количества дочерних молекул. Вследствие нестохастической природы вторичной сборки лигированием по настоящему изобретению образованные дочерние молекулы могут составлять библиотеку окончательно сформированных химерных молекул нуклеиновых кислот, имеющих общий порядок сборки, который выбран преднамеренно. В конкретном аспекте такая созданная библиотека состоит из более чем 103 - более чем 101000 разных видов дочерних молекул.
В одном из аспектов набор окончательно сформированных химерных молекул нуклеиновых кислот, полученный как описано в настоящей публикации, состоит из полинуклеотида, кодирующего полипептид. Согласно одному из аспектов такой полинуклеотид представляет собой ген, который может быть искусственно созданным человеком геном. Согласно другому аспекту такой полинуклеотид представляет собой каскад генов, который может быть каскадом искусственно созданных генов. Изобретение предусматривает, что один или несколько искусственных генов, созданных благодаря изобретению, могут быть включены в искусственный каскад генов, такой как каскад, функциональный в эукариотическом организме (включая растение).
В другом примере синтетическая природа стадии, на которой создают строительные блоки, позволяет конструировать и вводить нуклеотиды (например, один или несколько нуклеотидов, которые могут быть представлены, например, кодонами или интронами или регуляторными последовательностями), которые позднее, необязательно, могут быть удалены в способе ш νίΙΐΌ (например, в результате мутагенеза) или в процессе, происходящем ш νί\Ό (например, благодаря использованию способности к сплайсингу генов организма хозяина). Понятно, что во многих случаях введение таких нуклеотидов также может быть желательным по многим другим причинам, кроме вероятной пользы создания применимой пограничной точки.
Таким образом, согласно другому аспекту изобретение предусматривает, что строительный блок нуклеиновой кислоты можно использовать для введения интрона. Таким образом, изобретение предусматривает, что функциональные интроны могут быть введены в искусственный ген по изобретению. Изобретение также предусматривает, что функциональные интроны могут быть введены в искусственный каскад генов по изобретению. Соответственно, изобретение относится к созданию химерного полинуклеотида, который представляет собой искусственный ген, содержащий один (или несколько) искусственно введенных интронов.
Соответственно, изобретение также относится к созданию химерного полинуклеотида, который представляет собой каскад искусственных генов, содержащих один (или несколько) искусственно введенный интрон (интроны). В одном из аспектов искусственно введенный интрон (интроны) функционален в одной или нескольких клетках-хозяевах в отношении сплайсинга генов почти таким же образом, как и природные интроны функциональны в сплайсинге генов. Изобретение относится к способу получения искусственных содержащих интроны полинуклеотидов, вводимых в организмы-хозяева для рекомбинации и/или сплайсинга.
Искусственный ген, полученный с использованием изобретения, также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. Подобным образом каскад искусственных генов, полученный с использованием изобретения, также может служить в качестве субстрата для рекомбинации с другой нуклеиновой кислотой. В одном из аспектов рекомбинации способствует или рекомбинация происходит в области гомологии между искусственным содержащим интрон геном и нуклеиновой кислотой, которая служит в качестве партнера в рекомбинации. В одном из аспектов партнером в рекомбинации также может быть нуклеиновая кислота, созданная по изобретению, включая искусственный ген или каскад искусственных генов. Рекомбинацию может облегчать или рекомбинация может происходить в областях гомологии, которые существуют в одном (или нескольких) искусственно введенных интронах в искусственном гене.
В способе вторичной сборки синтезированных последовательностей с использованием реакции лигирования по изобретению используют множество строительных блоков нуклеиновой кислоты, каждый из которых может иметь два лигируемых конца. Два лигируемых конца в каждом строительном блоке нуклеиновой кислоты могут представлять собой два тупых конца (т.е., каждый имеет выступающий конец длиной в ноль нуклеотидов) или один тупой конец и один выступающий конец или два выступающих конца.
Применимым для такой цели выступающим концом может быть выступающий 3'-конец или выступающий 5'-конец. Таким образом, строительный блок нуклеиновой кислоты может иметь выступающий
- 32 021178
3'-конец или альтернативно выступающий 5'-конец, или альтернативно два выступающих 3'-конца, или альтернативно два выступающих 5'-конца. Общий порядок, в котором строительные блоки нуклеиновой кислоты собирают с образованием конечной химерной молекулы нуклеиновой кислоты, определяют благодаря продуманному дизайну эксперимент, и он не является случайным.
В одном из аспектов строительный блок нуклеиновой кислоты создают в результате химического синтеза двух однонитевых нуклеиновых кислот (также называемых однонитевыми олигонуклеотидами) и их контакта, так чтобы обеспечить их отжиг с образованием двунитевого строительного блока нуклеиновой кислоты.
Двунитевой строительный блок нуклеиновой кислоты может иметь разную длину. Размеры таких строительных блоков могут быть маленькими или большими. Примеры размеров строительного блока находятся в диапазоне от 1 пары оснований (не включая выступающие концы) до 100000 пар оснований (не включая выступающие концы). Также предполагаются другие диапазоны размеров, которые имеют нижний предел от 1 п.н. до 10000 п.н. (включая все целые числа в указанном диапазоне), и верхние пределы от 2 п.н. до 100000 п.н. (включая все целые значения в указанном диапазоне).
Существует много способов, с использованием которых можно создавать двунитевой строительный блок нуклеиновой кислоты, который применим в изобретении; и такие способы известны в данной области и могут быть легко осуществлены специалистом в данной области.
Согласно одному аспекту двунитевой строительный блок нуклеиновой кислоты получают, сначала создавая две однонитевых нуклеиновых кислоты и обеспечивая им возможность для отжига с образованием двунитевого строительного блока нуклеиновой кислоты. Две нити двунитевого строительного блока нуклеиновой кислоты могут быть комплементарными по каждому нуклеотиду, кроме тех, которые образуют выступающий конец; таким образом не создавая ошибочных спариваний, кроме любого выступающего конца(ов). Согласно другому аспекту две нити двунитевого строительного блока нуклеиновой кислоты комплементарны не по каждому, а по меньшему количеству нуклеотидов, кроме тех, которые образуют выступающий конец. Таким образом, согласно данному аспекту двунитевой строительный блок нуклеиновой кислоты можно использовать для введения вырожденности кодонов. В одном из аспектов вырожденность кодонов вводят с применением сайт-насыщающего мутагенеза, описанного в настоящей публикации, используя одну или несколько кассет Ν,Ν,Ο/Τ или альтернативно используя одну или несколько кассет Ν,Ν,Ν.
Способ рекомбинации ίη νίνο по изобретению можно осуществлять вслепую на пуле неизвестных гибридов или аллелей конкретного полинуклеотида или последовательности. Однако необходимо знать реальную последовательность ДНК или РНК конкретного полинуклеотида.
Способ использования рекомбинации в смешанной популяции генов может быть использован для создания любых полезных белков, например, интерлейкина I, антител, 1РА и гормона роста. Такой способ можно использовать для создания белков, обладающих измененной специфичностью или активностью. Способ также может быть применим для создания гибридных последовательностей нуклеиновой кислоты, например, областей промоторов, интронов, экзонов, энхансерных последовательностей, 31 нетранслируемой области или 51 нетранслируемой области генов. Таким образом, данный способ можно использовать для создания генов, обладающих повышенной скоростью экспрессии. Данный способ также можно использовать в исследовании повторяющихся последовательностей ДНК. Наконец, такой способ может быть применим для осуществления мутаций рибозимов и аптамеров.
В одном из аспектов варианты полинуклеотидов и полипептидов, описанные в настоящей публикации, получают благодаря использованию многократных циклов редукционной пересортировки, рекомбинации и селекции, которые обеспечивают возможность требуемой молекулярной эволюции линейных последовательностей высокой сложности, таких как ДНК, РНК или белки, в результате рекомбинации.
Перетасовка молекул ίη νίνο применима для получения вариантов и может быть осуществлена с использованием природного свойства клеток рекомбинировать мультимеры. Хотя рекомбинация ίη νίνο обеспечивала основной природный путь к молекулярному разнообразию, генетическая рекомбинация остается относительно сложным процессом, который включает 1) распознавание гомологов; 2) расщепление нитей, инвазию нитей и метаболические стадии, приводящие к получению рекомбинантной хиазмы; и наконец 3) разрешение хиазмы на дискретные рекомбинантные молекулы. Образование хиазмы требует распознавания гомологичных последовательностей.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения гибридного полинуклеотиды по меньшей мере из первого полинуклеотида и второго полинуклеотида. Изобретение можно применять для получения гибридного полинуклеотида посредством введения по меньшей мере первого полинуклеотида и второго полинуклеотида, которые имеют по меньшей мере одну область с частичной гомологией последовательностей (например, 8ЕО ГО Ν0:1) в подходящую клетку-хозяина. Области частичной гомологии последовательностей стимулируют процесс, который приводит к узнаванию последовательности с получением гибридного полинуклеотида. Термин гибридный полинуклеотид в используемом в настоящем описании смысле представляет собой любую нуклеотидную последовательность, которая получена способом по настоящему изобретению и содержит последовательность по меньшей мере двух исходных полинуклеотидных последовательностей. Такие гибридные полинуклеотиды могут возникать в
- 33 021178 результате событий межмолекулярной рекомбинации, которая стимулирует интеграцию последовательностей между молекулами ДНК. Кроме того, такие гибридные полинуклеотиды могут быть результатом процессов внутримолекулярной редукционной пересортировки, в которых используют повторяющиеся последовательности для изменения нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК.
Изобретение относится к способам создания гибридных полинуклеотидов, которые кодируют биологически активные гибридные полипептиды (например, гибридную фитазу). В одном из аспектов исходные полинуклеотиды кодируют биологически активные полипептиды. Способом по изобретению получают новые гибридные полипептиды, используя клеточные процессы, которые приводят к интеграции последовательности исходных полинуклеотидов, так что полученный в результате гибридный полинуклеотид кодирует полипептид, проявляющий активности, производные от активностей исходных биологически активных полипептидов. Например, исходные полинуклеотиды могут кодировать конкретный фермент из разных микроорганизмов. Фермент, кодируемый первым полинуклеотидом из одного организма или вариантом, может, например, эффективно функционировать в конкретных условиях окружающей среды, например, в условиях высокой солености. Фермент, кодируемый вторым полинуклеотидом из другого организма или вариантом, может эффективно функционировать в других условиях окружающей среды, таких как экстремально высокие температуры. Гибрид полинуклеотид, содержащий последовательности из первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, которые проявляет свойства обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может эффективно функционировать в условиях окружающей среды, в которых функционирует каждый из ферментов, кодируемых первым и вторым полинуклеотидами, например, в условиях высокой солености и экстремальных температур.
Кроме различных способов, описанных выше, в данной области известны различные способы, которые можно использовать, чтобы получить гибридные полинуклеотиды с усиленными ферментативными свойствами. Следующие примеры иллюстрируют применение таких способов для получения термостабильных или термоустойчивых ферментов посредством мутагенеза полинуклеотида, кодирующего представляющие интерес фермент дикого типа.
Например, в одном из аспектов в изобретении используют способы, которые описаны М. Ьейтапп е1 а1., (ВюсЫтюа е1 Вюрйукюа Ас1а 1543: 408-415, 2000), которые заключаются в консенсусном подходе, в случае которого используют выравнивание последовательностей гомологичных фитаз грибов для вычисления консенсусной аминокислотной последовательности фитаз. После конструирования соответствующего консенсусного гена, экспрессии рекомбинантов и очистки полученная рекомбинантная фитаза имела температуру разворачивания белка (Тт) на 15-22°С выше, чем температура всех исходных фитаз, используемых для конструирования. Сайт-специфичный мутагенез гена, кодирующего рекомбинантный белок, использовали для того, чтобы дополнительно повысить значение Тт до 90,4°С. Термостабилизирующий эффект объясняли наличием сочетания множественных аминокислотных изменений, которые были распределены по всей последовательности белка, и главным образом, подвергаемыми воздействиям экспонированными на поверхности остатками.
В одном из аспектов в изобретении применяют способы получения фермента с усиленными термическими свойствами, которые описаны Ь. 1егти1ик е1 а1., (1. οΓ Β^οίесЬηο1ο§у 85: 15-24, 2001). При использовании такого способа сначала восстанавливали ионные взаимодействия и водородные связи на поверхности фитазы АкрегдШик !еггеик, так чтобы они соответствовали взаимодействиям и связям, присутствующим в гомологичном, но более термостабильном ферменте А. тдег. Затем целые элементы вторичной структуры заменяли в аналогичной области на основании кристаллической структуры фитазы А. тдег. Замены одной α-спирали на поверхности фитазы А. (еггеик соответствующим участком фитазы А. тдег, приводили к основанному на структуре химерному ферменту (слитому белку) с повышенной термостабильностью и неизмененной ферментативной активностью.
В одном из аспектов изобретения применяют способы, которые описаны Ь. Сгоег е1 а1., (Ргос. №И. Асаб. §ст И8А 95: 12809-12813, 1998), которые описывают способ, благодаря которому шесть этапов случайного мутагенеза, осуществляемого в ходе мутагенной ПЦР полинуклеотида, кодирующего пнитробензилэстеразу ВасШик киЪййк, с последующей рекомбинацией ш νίίτο на основе способа Стеммера приводили к получению рекомбинантной эстеразы с повышенной термостабильностью (более чем на 14°С повышение Тт) без нарушения каталитической активности при более низких температурах.
В одном из аспектов в изобретении используют способы, которые описаны С. Vеί^^аη^ еί а1., (Ргос.
Асаб. 8ст И8А 95: 12300-12305, 1998), которые описывают способ, в котором основанное на гомологии моделирование и прямое сравнение структур гексамерных глутаматдегидрогеназ гипертермофилов Ρу^οсοссик Гигюкик и ΤНе^тοсοссик 1^ίο^а1^к, имеющих оптимальные температуры роста 100 и 88°С, соответственно, использовали для определения ключевых термостабилизирующих особенностей. Сеть межсубъединичных контактов на основе ионных пар, которые, как было обнаружено, уменьшены в менее стабильном ферменте, изменяли посредством мутагенеза двух его остатков, чтобы восстановить взаимодействия, обнаруженные в более стабильном ферменте. Хотя каждая отдельная мутация оказывала неблагоприятное влияние на термостабильность, в случае обеих мутаций наблюдали четырехкратное повышение стабильности при 104°С по сравнению с ферментом дикого типа.
- 34 021178
В одном из аспектов изобретения используют способы, которые описаны А. ТотвсНу е( а1. (Рто1ет Заепсе 9: 1304-1311, 2000), которые описали способ использования кристаллической структуры фитазы АвретдШив №§ет (с разрешением 2,5 ангстрем) для характеристики всех активных участков фермента. Затем использовали множественное выравнивание аминокислотных последовательностей, чтобы идентифицировать неконсервативные остатки в активных участках, которые могут коррелировать с данным представляющим интерес предпочтительным свойством. Используя такой способ, идентифицировали О1и27 фитазы А. Гит1§а1и5, который отличается от Ьеи27 А. гйдег и который вероятно вовлечен в связывание и/или высвобождение субстрата и ответственен за более низкую удельную активность фитазы А. ГипйдаШв (26,5 по сравнению с 196,6 единиц/мг белка при рН 5,0). Сайт-специфичный мутагенез О1п27 фитазы А. ГипйдаШв с получением Ьеи повышал удельную активность мутантного фермента до 92,1 единиц/мг белка.
Трансгенные растения и семена
Изобретение относится к трансгенным растениям и семенам, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид, кассету экспрессии, клонирующий механизм или вектор по изобретению, или к трансфицированной или трансформированной клетке по изобретению. Изобретение также относится к растительным продуктам, например, маслам, семенам, листьям, экстрактам и тому подобному, содержащим нуклеиновую кислоту и/или полипептид по изобретению. Трансгенное растение может быть двудольным (двудольное растение) или однодольным (однодольное растение). Изобретение также относится к способам получения и применения таких трансгенных растений и семян. Трансгенное растение или растительная клетка, экспрессирующая полипептид по настоящему изобретению, могут быть сконструированы любым способом, известным в данной области. См., например, патент США № 6309872.
Рекомбинантная экспрессия или сверхэкспрессия фитазных молекул по изобретению может быть достигнута в сочетании с одной или несколькими дополнительными молекулами, такими как, например, другие ферменты. Такой способ применим для получения комбинированных продуктов, таких как растение или часть растения, которая содержит молекулы фитазы, а также одну или несколько дополнительных молекул. Молекулы фитазы по изобретению и дополнительные молекулы можно использовать при комбинированной обработке. Полученные в результате рекомбинантно экспрессированные молекулы можно использовать в гомогенизированной и/или очищенной форме или альтернативно в относительно неочищенной форме (например, в виде пригодных к употреблению частей растений, которые полезны при смешивании с другими пищевыми продуктами для катализа расщепления фитата).
В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессии фитазы в трансгенных растениях или органах растения и к способам ее получения. Предлагаются экспрессирующие конструкции ДНК для трансформации растений геном, кодирующим фитазу, под контролем регуляторных последовательностей, которые способны управлять экспрессией фитазы. Такие регуляторные последовательности включают последовательности, способные управлять транскрипцией в растениях, либо конститутивно, либо специфичным для стадии и/или ткани образом.
Способ экспрессии зависит, отчасти, от применения растения или его частей. Трансгенные растения и органы растения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в различных промышленных способах, либо непосредственно, например, в кормах для животных, либо альтернативно экспрессированные фитазы могут быть экстрагированы и при необходимости очищены перед применением. Альтернативно рекомбинантное растение-хозяина или часть растения можно использовать непосредственно. В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к способам катализа реакций гидролиза фитата с использованием семян, содержащих повышенные количества фитазы. Способ включает осуществление контакта трансгенных семян не дикого типа, например, в измельченной или пережеванной форме, с содержащим фитат субстратом и обеспечение возможности для того, чтобы ферменты в семенах повысили скорость реакции. Благодаря непосредственному добавлению семян к содержащему фитат субстрату изобретение предлагает решение вопросов, связанных с дорогостоящим и проблематичным способом экстрагирования и очистки фермента. В одном примере настоящее изобретение относится к способам лечения, при которых в организм, не имеющий достаточного поступления фермента, вводят фермент в форме семян, содержащих повышенные количества фермента. В одном из аспектов время введения фермента в организм согласовано с потреблением содержащего фитат пищевого продукта.
Экспрессия фитазы в растениях может быть достигнута различными способами. В частности, например, доступны способы трансформации большого количества видов растений, включая виды двудольных растений (например, табак, картофель, томат, петунию, Вгавйса) и виды однодольных растений. Кроме того, например, доступна методика экспрессии чужеродных генов в растениях. Кроме того, идентифицированы регуляторные последовательности генов растений, которые подходят для конструирования химерных генов, которые могут быть функционально экспрессированы в растениях и в растительных клетках (например, К1ее (1987) Апп. Κον. оГ Р1ап1 РНув. 38: 467-486; С1агк е( а1. (1990) У1го1оду Иес; 179(2): 640-7; ЗтНЬ е1 а1. (1990) Мо1. Оеп. Оепек Иес; 224(3): 477-81).
Введение генных конструкций в растения можно осуществить, используя несколько способов, включая трансформацию с использованием АдтоЬайетшт (итеГааепв или АдгоЬайегшт г1й/одепев. Не ограничивающие примеры тканей растений, которые могут быть трансформированы таким образом,
- 35 021178 включают протопласты, микроспоры и пыльцу, и эксплантаты, такие как листья, стебли, корни, гипокотили и котили. Кроме того, ДНК может быть введена непосредственно в протопласты и растительные клетки или ткани с помощью микроинъекции, электропорации, бомбардировки частицами и прямого поглощения ДНК.
Белки могут быть получены в растениях с использованием множества систем экспрессии. Например, использование конститутивного промотора, такого как промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (Сш11еу е! а1., 1982), применимо для накопления экспрессированного белка фактически во всех органах трансгенного растения. Альтернативно, использованием промоторов, которые являются высокоспецифичными для ткани и/или высокоспецифичными для стадии, применимы в случае настоящего изобретения (Шддшк, 1984; 8Но1де11, 1989) для того, чтобы сместить экспрессию в сторону экспрессии в требуемых тканях и/или на требуемой стадии развития. В изобретении также используют протоколы экспрессии в растениях молекул фитазы по настоящему изобретению, которые описаны, например, в патенте США № 5770413 (Уаи 0оуеи е! а1.) и патент США № 5593963 (Уаи 0оуеи е! а1.), в которых содержатся руководства по применению фитаз грибов.
Модификация кодирующих последовательностей и близлежащих последовательностей
Трансгенная экспрессия в растениях генов, полученных из гетерологичных источников, может вовлекать модификацию таких генов для достижения и оптимизации их экспрессии в растениях. В частности, бактериальные ОРС, которые кодируют отдельные ферменты, но которые кодируются одним и тем же трансрикриптом в нативном микроорганизме, лучше всего экспрессируются в растениях на отдельных транскриптах. Таким образом, в одном из аспектов для достижения такой экспрессии каждую ОРС выделяют по отдельности и клонируют в кассете, которая обеспечивает последовательность растительного промотора на 5'-конце ОРС и растительный терминатор транскрипции на 3'-конце ОРС. Выделенная последовательность ОРС может содержать инициирующий кодон АТС и терминирующий стоп-кодон, но может включать дополнительную последовательность, кроме инициирующего АТС и стоп-кодона. Кроме того, ОРС может быть укорочена, но при этом все еще сохранять требуемую активность; в случае особенно длинных ОРС укороченные варианты, которые сохраняют активность, могут быть предпочтительны для экспрессии в трансгенных организмах. Растительные промоторы и растительные терминаторы транскрипции, которые можно применять при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают любые промоторы и/или терминаторы транскрипции, которые функциональны в растительных клетках. Такие промоторы и терминаторы включают промоторы и терминаторы транскрипции, которые могут быть получены из нерастительных источников, таких как вирусы (примером является вирус мозаики цветной капусты).
В некоторых случаях модификация кодирующих последовательностей ОРС и близлежащей последовательности не требуется. Достаточно выделить фрагмент, содержащий представляющую интерес ОРС, и встроить его ниже промотора растения. Например, Сайиеу е! а1., (Баеисе 261 754-756 (1993)) успешно экспрессировали ген иаНС Ркеиботоиак в трансгенных растениях под контролем промотора 3 58 СаМУ и терминатора 1т1 СаМУ без модификации кодирующей последовательности и с все еще связанными нуклеотидами гена Ркеиботоиак, расположенными выше АТС, и нуклеотидами ниже стоп-кодона, все еще связанными с ОРС иаНС. Предпочтительно, следует оставлять относительно небольшую последовательность микроорганизма, связанную выше АТС и ниже стоп-кодона. На практике такая конструкция может зависеть от доступности сайтов рестрикции.
В других случаях экспрессия генов, полученных из микробных источников, может создавать проблемы при экспрессии. Такие проблемы хорошо охарактеризованы в данной области и особенно распространены в случае генов, полученных из некоторых микроорганизмов. Такие проблемы могут быть применимы к нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, и может быть предпринята модификация таких генов с использованием способов, хорошо известных в данной области в настоящее время. Могут встречаться следующие проблемы.
Использование кодонов
Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, имеющим кодоны, модифицированные для использования в растениях; в некоторых случаях предпочтительное использование кодонов в растениях отличается от предпочтительного использования кодонов в некоторых микроорганизмах. Сравнение использования кодонов в клонированной ОРС микроорганизма с использованием в генах растений (и в конкретных генах растения-мишени) позволит идентифицировать кодоны в ОРС, которые, предпочтительно, следует изменить. Обычно эволюция растений была направлена на строгое предпочтение нуклеотидов С и С в третьем положении основания у однодольных растений, тогда как двудольные растения часто используют нуклеотиды А или Т в данном положении. Посредством модификации гена с целью включения, предпочтительно, используемого кодона конкретным целевым трансгенным видом, многие проблемы, описанные ниже, связанные с содержанием СС/АТ и незаконным сплайсингом, будут преодолены.
Содержание СС/АТ
Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, имеющим модифицированное содержание СС, например, для использования в растениях; гены растений обычно имеют содержание СС более чем 35%.
- 36 021178
Последовательности ОРС, которые богаты нуклеотидами А и Т, могут вызывать некоторые проблемы в растениях. Во-первых, полагают, что мотивы АТТТА вызывают дестабилизацию мРНК и найдены на 3'конце многих короткоживущих мРНК. Во-вторых, полагают, что встречаемость сигналов полиаденилирования, таких как ААТААА в неподходящих положениях в мессенджерах вызывает преждевременное укорочение транскрипции. Кроме того, однодольные могут узнавать АТ-богатые последовательности в сайтах сплайсинга (см. ниже).
Последовательности, близлежащие к инициирующему метионину
Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, имеющим модифицированные или добавленные нуклеотиды, близлежащие к АТС-растения отличаются от микроорганизмов тем, что их мРНК не имеют определенного сайта связывания рибосом. Полагают, что рибосомы связываются с 5'-концом мРНК и сканируют, выявляя первый доступный АТО, на котором начинается трансляция. Однако полагают, что существует предпочтение в некоторых нуклеотидам, близлежащих к ЛТО, и что экспрессия генов микроорганизмов может быть усилена включением эукариотического консенсусного инициатора трансляции в АТО. Фирма С1оп1есН (каталог 1993/1994, страница 210, включенный в настоящее описание в виде ссылки) предложила одну последовательность в качестве консенсусного инициатора трансляции для экспрессии гена шдА Е. соН в растениях. Кроме того, 1озЫ (публикация Ν.Α.Κ., 15: 6643-6653 (1987), включенная в настоящее описание в виде ссылки) сравнил многие последовательности растений, близлежащие к АТО и предложил другую консенсусную последовательность. В ситуациях, когда встречаются трудности в экспрессии ОРС микроорганизмов в растениях, включение одной из таких последовательностей на участке с инициирующим АТО может улучшать трансляцию. В таких случаях последние три нуклеотида в консенсусной последовательности могут быть не подходящими для включения в модифицированную последовательность вследствие их модификации во втором остатке АА. В некоторых аспектах предпочтительные последовательности, близлежащие к инициирующему метионину, могут отличаться у разных видов растений. Обзор 14 генов кукурузы, имеющихся в базе данных ОепВапк, привел к следующим результатам.
Положение перед инициирующим АТО в 14 генах кукурузы:
С т
А
О
ПО
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
4 6 2 5 0 3 4 3 2 3 14 3 2 3 6 0 6 5
0 10
1 1
7 2
6 1
П
Такой анализ может быть осуществлен для требуемого вида растения, в который включают нуклеотидную последовательность, и последовательность, близлежащая к АТО, может быть модифицирована, чтобы ввести предпочтительные нуклеотиды.
Удаление незаконных сайтов сплайсинга
Изобретение относится к нуклеиновым кислотам, в которых модифицированы или удалены или функционально нокаутированы незаконные сайты сплайсинга; гены, клонированные из отличных от растений источников и не оптимизированные для экспрессии в растениях, также могут содержать мотивы, которые могут распознаваться в растениях как 5'- или 3'-сайты сплайсинга, и могут расщепляться, таким образом создавая укороченные мРНК или мРНК, содержащие делеции. Такие сайты могут быть удалены способами, хорошо известными в данной области.
Способы модификации кодирующих последовательностей и близлежащих последовательностей хорошо известны в данной области. В тех случаях, когда начальная экспрессия ОРС микроорганизма является низкой и, как полагают, подходит для получения изменений в последовательности, как описано выше, конструирование синтетических генов может быть осуществлено согласно способам, хорошо известным в данной области. Такие способы описаны, например, в опубликованных патентных документах ЕР 0385962 (Мопзап1о), ЕР 0359472 (ЬиЪп7о1) и АО 93/07278 (С1Ъа-Ое1ду), которые все включены в настоящее описание в виде ссылки. В большинстве случаев, предпочтительно, анализировать экспрессии генных конструкций с использованием протоколов временного анализа (которые хорошо известны в данной области) перед их переносом в трансгенные растения.
Растительные промоторы
Композиции по изобретению могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, например промоторы, например, для трансформации и экспрессии в представляющем интерес растении. Последовательности нуклеиновых кислот могут быть представлены в виде конструкций ДНК или кассет экспрессии. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут представлять собой или содержать кассеты экспрессии, включающие любую молекулу нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией конкретной нуклеотидной последовательности в подходящей клетке-хозяине, содержащую промотор, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая функционально связана с сигналами терминации.
- 37 021178
Композиции (например, последовательности нуклеиновой кислоты) по изобретению также могут содержать последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности. Кодирующая область обычно кодирует представляющий интерес белок, но также может кодировать представляющую интерес функциональную РНК, например, антисмысловую РНК или нетранслируемую РНК, в смысловом или антисмысловом направлении. Кассета экспрессии, содержащая представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии также может представлять собой кассету экспрессии, которая встречается в природе, но была получена в рекомбинантной форме, применимой для гетерологичной экспрессии. Однако обычно кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е., конкретная последовательность ДНК кассеты экспрессии не встречается в природе в клетке-хозяине и должна быть введена в клетку-хозяина или предшественник клетки-хозяина в процессе трансформации. Экспрессия нуклеотидной последовательности в кассете экспрессии может быть под контролем конститутивного промотора или индуцируемого промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда на клетку-хозяина действует некоторый конкретный внешний стимул. Кроме того, промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа или стадии развития.
Настоящее изобретение охватывает трансформацию растений кассетами экспрессии, способными экспрессировать полинуклеотиды. Кассета экспрессии будет включать в 5'-3'-направлении транскрипции область инициации транскрипции и трансляции (т.е., промотор) и представляющий интерес полинуклеотид. Кассета экспрессии, необязательно, может содержать области терминации транскрипции и трансляции (т.е., область терминации), функциональную в растениях. В некоторых вариантах кассета экспрессии содержит селектируемый маркерный ген, обеспечивающий селекцию стабильных трансформантов. Экспрессирующие конструкции по изобретению также могут содержать лидерную последовательность и/или последовательность, обеспечивающую возможность индуцируемой экспрессии представляющего интерес полинуклеотида. См. публикации Сио е1 а1., (2003) (Р1аи1 1. 34: 383-92) и С1еи е1 а1., (2003) (Р1аи1 1. 36: 731-40), где описаны примеры последовательностей, обеспечивающих индуцируемую экспрессию.
Регуляторные последовательности экспрессирующей конструкции функционально связаны с представляющим интерес полинуклеотидом. Под функционально связанным подразумевают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, при этом последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. В общем, функционально связанная означает, что связанные нуклеотидные последовательности являются непрерывными.
Любой промотор, способный управлять экспрессией в представляющем интерес растении, может быть использован при практическом осуществлении изобретения. Промотор может быть нативным или аналогичным, или чужеродным, или гетерологичным по отношению к растению-хозяину. Термины гетерологичный и экзогенный при использовании в настоящем описании, относятся к последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности ДНК или РНК) или гену, относится к последовательности, которая происходит из источника, чужеродного по отношению к конкретной клеткехозяину, или если происходит из такого же источника, модифицирована в сравнении со своей исходной формой. Таким образом, гетерологичный ген в клетке-хозяине включает ген, который является эндогенным по отношению к конкретной клетке-хозяину, но был модифицирован. Термины также включают не встречающиеся в природе множественные копии природной последовательности ДНК. Таким образом, термины относятся к фрагменту ДНК, который является чужеродным или гетерологичным для клетки, или гомологичным для клетки, но в положении в нуклеиновой кислоте клетки-хозяина, в котором элемент обычно не встречается. Экзогенные фрагменты ДНК экспрессируются, давая экзогенные полипептиды. В альтернативных вариантах гомологичная последовательность нуклеиновой кислоты (например, ДНК) представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), связанную в природе с клеткой-хозяином, в которую ее вводят.
Выбор вводимых промоторов зависит от нескольких факторов, включая без ограничения эффективность, возможность селекции, индуцируемость, требуемый уровень экспрессии и предпочтительную для клетки или ткани экспрессию. Для специалиста в данной области модулирование экспрессии последовательности посредством соответствующего подбора и расположения промоторов и других регуляторных областей относительно такой последовательности является рутинной практикой.
Некоторые подходящие промоторы инициируют транскрипцию только или преимущественно в некоторых типах клеток. Таким образом, в используемом в настоящем описании смысле предпочтительный для типа клеток или ткани промотор представляет собой промотор, который управляет экспрессией, предпочтительной в ткани-мишени, но также может приводить к некоторой экспрессии в других типах клеток или тканях. Способы идентификации и характеристики промоторных областей в геномной ДНК растений включают, например, способы, описанные в следующих публикациях: 1огбаио, е1. а1., Р1аи1 Се11, 1:855-866 (1989); Вик1ок, е1. а1., Р1аи1 Се11, 1:839-854 (1989); Сгееи, е1. а1., ЕМВО 1. 7, 4035-4044 (1988); Ме1ег, е1. а1., Р1аи1 Се11, 3, 309-316 (1991); аиб Ζΐκ-πΐβ, е1. а1., Р1аи1 РЬукю1оду 110: 1069-1079 (1996).
Сообщалось о некоторых предпочтительных для тканей регулируемых генах и/или промоторах рас- 38 021178 тений. Некоторые встречающиеся в сообщениях предпочтительные для ткани гены включают гены, кодирующие запасные белки семян (такие как напин, круциферин, бета-конглицинин и фазеолин, проламины, глютелины, глобулины и зеины) зеины или белки жировых тел (такие как олеозин), или гены, вовлеченные в биосинтез жирных кислот (включая белок-носитель ацила, стеароил-АСР-десатуразу и десатуразы жирных кислот (Габ 2-1)), и другие гены, экспрессируемые во время развития зародыша (такие как Все4, смотри, например, ЕР 255378 и Кпб1 е!. а1, (1991) §ееб 8с1еисе КекеагсЬ, 1: 209).
Примеры тканеспецифичных промоторов, которые были описаны, включают промоторы лектина (Уобкш, Ргод. С1ш. Вю1. Кек., 138; 87 (1983); Ыибк!гот е!. а1. (1990) Эег. Οеие!, 11: 160), алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы (Оеитк е!. а1. ШсШс Аабк Кек, 12:3983 (1984)), светоулавливающего комплекса кукурузы (смотри, например, 81тркои, (1986) §аеисе, 233: 34; Ваика1 (1992) Ргос. Ν!1. Асаб. δα. И8А 89: 3654), белка теплового шока кукурузы (смотри, например, Обе11 е!. а1, (1985) Шине, 313: 810); малой субъединицы КиВР-карбоксилазы гороха (смотри, например, Рои1кеи е!. а1, (1986) Мо1. Οеи. Οеие!, 205: 193-200; СакЬтоге е!. а1, (1983) Οеи. Еид. оГ Р1аи!к, Р1еиит Ргекк, №\у Уогк, 29-38) ; маннопинсинтазы ТК плазмиды (смотри, например, Ьаидпбде е!. а1, (1989) Ргос. №И1. Асаб. δα. И8А, 86: 3219-3223), нопалинсинтазы ТКплазмиды (Ьаидпбде е!. а1, (1989) Ргос. №И. Асаб. δα. и$А, 86: 3219-3223), халконизомеразы петунии (смотри, например, уаи Тииеи (198 8) ЕМВО 1. 7: 1257); богатого глицином белка 1 бобов (смотри, например, Ке11ег (1989) Οеиек Эеу. 3: 1639); укороченный 35δ СаМУ (смотри, например, Обе11 (1985) №-11иге 313: 810); промотор пататина картофеля (смотри, например, \Уеи/1ег (1989) Р1аи! Мо1. Вю1. 13: 347; клеток корня (смотри, например, Уатато!о (1990) ШсШс Аабк Кек. 18: 7449); зеина кукурузы (смотри, например, Кеша (1990) №с1ею Аабк Кек. 18: 6425; Ьорек е!. а1. (1995) Мо1. Οеи. Οеие!. 247: 603613; Кп/ (1987) Мо1. Οеи. Οеие!. 207: 90; УапбеП (1989) №с1ею Аабк Кек., 17: 2354; Ьаидпбде (1983) Се11, 34: 1015; Кета (1990) №с1ею Аабк Кек, 18: 7449), промотор АЭР-дрр (смотри, например, патент США № 7102057); глобулина-1 (смотри, например, Ве1аидег (1991) Οеие!^ск 129: 863); α-глобулина (ЬниПкитаг, е!. а1. (2002), Тгаикдетс Кек. 11: 347-359); α-тубулина; саЬ (смотри, например, δиШνаη (1989), Мо1. Οеи. Οеие!., 215: 431); РЕРС-азы (смотри, например, Нибкре!Ь аиб ΟπιΕι, (1989) Р1аи! Мо1ес. Вю1., 12: 579-589); промоторы, связанные с комплексом генов К (СЬаиб1ег е!. а1., (1989) Р1аи! Се11, 1: 1175); промотор вицилина гороха (С/ако е!. а1., (1992) Мо1. Οеи. Οеие!, 235: 33; патент США № 5625136); промотор Ο^1 (Такапга е!. а1. (1991) Р1аи! Мо1. Вю1. 16 (1), 49-58); промоторы халконсинтазы (Ргаикеи е!. а1., (1991) ЕМВО I., 10: 2605); промотор ΟΥ1 (81тв аиб Οо1бЬи^д (1989) №ю. Ааб Кек. 17(11), 4368) и тому подобные; все публикации включены в настоящее описание в виде ссылки.
В изобретении можно использовать предпочтительные для плодов промоторы, включая любой класс предпочтительных для плодов промоторов, например, экспрессируемые при цветении и в течение периода от цветения до развития плода по меньшей мере вплоть до начала созревания, например, промоторы, обсуждаемые в патенте США 4943674, содержание которого включено в настоящее описание в виде ссылки. Промотор гена полигалактуроназы активен при созревании плода. В изобретении можно использовать ген полигалактуроназы, который описан, например, в патенте США № 4535060, патенте США № 4769061, патенте США № 4801590 и патенте США № 5107065, содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.
В изобретении можно использовать любые предпочтительные для ткани промоторы, включая промоторы, которые управляют экспрессией в клетках листа после повреждения листа (например, грызущими насекомыми), в клубнях (например, промотор гена пататина) и в клетках волокон (примером регулируемого в ходе развития белка клеток волокон является Е6 (боки аиб Сго\у (1992) ΡNΑδ 89: 5769-5773). Ген Е6 является наиболее активным в волокне, хотя низкие уровни транскриптов обнаружены в листе, семязачатке и цветке.
В изобретении можно использовать промоторы, активные в фотосинтетической ткани, например, чтобы управлять транскрипцией в зеленых тканях, таких как ткани листьев и стеблей, и такие промоторы являются подходящими, когда они управляют экспрессией только или преимущественно в таких тканях. Альтернативно, в изобретении можно использовать промоторы, обеспечивающие конститутивную экспрессию по всему растению или дифференцированно в зеленых тканях или дифференцированно в отношении стадии развития зеленой ткани, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние стимулы.
Примеры промоторов, используемых при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают промоторы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (Β^δ), такие как промотор КЬсδ лиственницы американской (Ьап\ 1апста), промотор саЬ6 сосны (УататоЮ е!. а1. (1994) Р1аи! Се11 РЬукю1. 35: 773-778), промотор гена СаЬ-1 пшеницы (Ре|ек е!. а1. (1990) Р1аи! Мо1. Вю1. 15: 921-932), промотор САВ-1 шпината (ЬиЬЬегк!еб! е!. а1. (1994) Р1аи! РЬукю1. 104: 997-1006), промотор саЬ1К риса (Ьиаи е!. а1. (1992) Р1аи! Се11 4: 971-981), промотор пируватортофосфатдикиназы (РРОК) кукурузы (Ма!киока е!. а1. (1993) Ргос. №И. Асаб. δ^. ^А 90: 9586-9590), промотор ЬЬсЬ1*2 табака (Сегбаи е!. а1. (1997) Р1аи! Мо1. Вю1. 33: 245-255), промотор совместного переносчика сахарозы-Н+ δυί'.’2 АгаЫборык бшПаиа (Тгиегш! е!. а1. (1995) Р1аи!а 196: 564-570) и промоторы белков тилакоидных мембран шпината (ркаЭ, ркаР, ркаЕ, РС, ΡΝΡ, а!рС, афЭ, саЬ, Γ^δ). Другие промоторы, которые управляют транскрипцией в стеблях, листьях и
- 39 021178 зеленой ткани, описаны в публикации патента США № 2007/0006346, включенного в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.
В некоторых вариантах тканевая специфичность некоторых предпочтительных для ткани промоторов может быть не абсолютной и может быть проверена с использованием репортерных генов, таких как Сик или зеленый флуоресцирующий белок, синий флуоресцирующий белок, желтый флуоресцирующий белок или красный флуоресцирующий белок. Также можно достичь предпочтительной для ткани экспрессии с использованием просачивающейся экспрессии с помощью сочетания разных предпочтительных для ткани промоторов. Другие предпочтительные для тканей промоторы могут быть выделены специалистом в данной области (смотри υ.8. 5589379).
В одном из аспектов используют растительные промоторы, которые являются индуцируемыми при воздействии на растение гормонами, такими как ауксины, чтобы экспрессировать нуклеиновые кислоты по изобретению. Например, в изобретении можно использовать фрагмент элементов ответа на ауксин промотора Е1 (АихКЕ) сои (С1усше тах Ь.) (Ьш (1997) Р1ап! РЬукю1. 115: 397-407); отвечающий на ауксин промотор С8Т6 АгаЫкорык (также чувствительный к салициловой кислоте и пероксиду водорода) (СЬеп (1996) Р1ап! I. 10: 955-966); индуцируемый ауксином промотор рагС табака (8ака1 (1996) 37: 906913); растительный элемент ответа на биотин (81гек (1997) Мо1. Р1ап1 М1кроЬе 1п1егас1. 10: 933-937); и промотор, отвечающий на гормон стресса абсцизовой кислоты (8Ьееп (1996) 8шепсе 274: 1900-1902).
Нуклеиновые кислоты по изобретению также могут быть функционально связаны с растительными промоторами, которые являются индуцируемыми при воздействии химических реагентов, которые могут быть применены по отношению к растению, таких как гербициды или антибиотики. Например, системы экспрессии генов, которые активируются в присутствии химического лиганда, включая этанол, можно найти в публикациях \УО 96/27673, \УО 93/01294, \УО 94/03619, \УО 02/061102, которые все включены в настоящее описание в виде ссылки. Можно использовать промотор 1п2-2 кукурузы, активируемый антидотами бензолсульфонамидных гербицидов (Эе Уеу1кег (1997) Р1ап! Се11 РЬукю1. 38: 568-577); применение разных антидотов гербицидов индуцирует отличающиеся картины экспрессии генов, включая экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристеме побегов. Кодирующая последовательность может быть, например, под контролем индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Ανеηа каЦуа Ь. (овса) (Макдгаи (1997) Р1ап! I. 11: 465-473); индуцируемого эстрогеном, например, рецептор экдизона (\УО 01/52620) или элемента ответа на салициловую кислоту (81апде (1997) Р1ап! I. 11: 1315-1324). Используя химически индуцируемые промоторы (например, индуцируемые гормонами или пестицидами), т.е., промоторы, отвечающие на химическое вещество, которое может быть применено по отношению к трансгенным растениям на полях, можно индуцировать экспрессию полипептидов по изобретению на конкретной стадии развития растения.
Примеры конститутивных промоторов, которые можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения и которые были описаны, включают промоторы актина 1 риса (\Уапд е!. а1. (1992) Мо1. Се11. Вю1., 12: 3399; патент США № 5641876); других изоформ актина (МсЕ1гоу е! а1. (1990) Р1ап! Се11 2: 163-171, и МсЕ1гоу е!. а1. (1991) Мо1. Сеп. Сепе!. 231: 150-160); 358 СаМУ (Оке11 е!. а1. (1985) Ыатге, 313: 810); 198 СаМУ (ЬаЩоп е!. а1. (1987) Р1ап! Мо1. Вю1. 9: 315-324; патент США № 5639949); пок (ЕЬей е!. а1. (1987) РЫА8 и8А 84: 5745-5749); АкЬ (\\ а1кег е!. а1. (1987) РЫА8 и8А 84: 6624-6628), синтазы сахарозы (Уапд апк Кикке11 (1990) ΡNΑ8 и8А 87: 4144-4148); и промоторы убиквитина (например, подсолнечника - Вше! е!. а1. (1991) Р1ап1 8шепсе 79: 87-94; кукурузы - СЬпкЮпкеп е!. а1. (1989) Р1ап! Мо1ес. Вю1. 12: 619-632; и АгаЫкорык - СаШк е!. а1., I. Вю1. СЬет. (1990) 265: 12486-12493; и \огпк е!. а1., Р1ап! Мо1. Вю1. (1993) 21: 895-906.
При практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать любой терминатор транскрипции, например можно использовать терминаторы в векторах, кассетах экспрессии и тому подобном. Они ответственны за терминацию транскрипции после трансгена и правильное полиаденилирование мРНК. Область терминации может быть нативной по отношению к области инициации транскрипции, может быть нативной по отношению к функционально связанной представляющей интерес последовательности ДНК, может быть нативной по отношению к растению-хозяину или может быть получена из другого источника (т.е., быть чужеродной или гетерологичной по отношению к промотору, представляющей интерес последовательности ДНК, растению-хозяину или любому их сочетанию). Подходящими терминаторами транскрипции являются терминаторы, которые, как известно, функционируют в растениях, и включают терминатор 358 САМУ, терминатор !т1, терминатор нопалинсинтазы и терминатор Е9 гЬск гороха. Такие терминаторы могут быть использованы как для однодольных, так и для двудольных растений. Кроме того, можно использовать нативный терминатор транскрипции генов.
В изобретении можно использовать любую последовательность для усиления экспрессии гена внутри транскрипционной единицы; и такие последовательности можно использовать вместе с генами согласно настоящему изобретению, чтобы повысить их экспрессию в трансгенных растениях. Например, было показано, что различные последовательности интронов усиливают экспрессию, в частности, в клетках однодольных растений. Например, обнаружено, что интроны гена АкЬ1 кукурузы значимо усиливают экспрессию гена дикого типа под контролем собственного промотора при введении в клетки кукуру- 40 021178 зы.
Ряд нетранслируемых лидерных последовательностей, полученных из вирусов, как известно, также усиливают экспрессию, и такие последовательности особенно эффективны в клетках двудольных растений. В частности, показано, что лидерные последовательности вируса табачной мозаики (ТМУ, последовательность), вируса хлоротической пятнистости кукурузы (МСМУ) и вируса мозаики люцерны (АМУ) эффективно усиливают экспрессию (например, ОаШе е). а1. №с1. Аайк Кек. 15: 8693-8711 (1987); 8ки/екк| е). а1. Р1ап) Мо1ес. Вю1. 15: 65-79 (1990)).
Направленный перенос генного продукта в клетке
Любой механизм направленного переноса генных продуктов, например, в растениях, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, и такие механизмы, как известно, существуют в растениях, и последовательности, контролирующие функционирование таких механизмов, охарактеризованы довольно подробно. Охарактеризованы последовательности, которые вызывают направленный перенос генных продуктов в другие компартменты клетки. Аминоконцевые последовательности могут быть ответственны за направление представляющего интерес белка в любой компартмент клетки, такой как вакуоль, митохондрия, пероксисома, белковые тельца, эндоплазматическая сеть, хлоропласт, крахмальное зерно, амилопласт, апопласт или клеточная стенка растения (например, Ипдег е). а1. Р1ап) Мо1ес. Вю1. 13: 411-418 (1989); Кодегк е). а1. (1985) Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А 82: 6512-651; патент США № 7102057; \У0 2005/096704, все публикации включены в настоящее описание в виде ссылки). Необязательно, сигнальная последовательность может представлять собой И-концевую сигнальную последовательность гена \уаху, ^концевую сигнальную последовательность γ-зеина, связывающего крахмал домена, С-концевого связывающего крахмал домена, направляющей в хлоропласт последовательности, которая импортирует зрелый белок в хлоропласт (Сота1 е). а1. (1988) 1. Вю1. СЬет. 263: 1510415109; уаи йеп Вгоеск, е). а1. (1985) №тге 313: 358-363; патент США № 5639949) или сигнальная последовательность секреции из клеток алейронового слоя (КоеЬ1ег апй Но, Р1ап) Се11 2: 769-783 (1990)). Кроме того, аминоконцевые последовательности вместе с последовательностями на карбоксильном конце ответственны за направление генных продуктов в вакуоли (81ипк1и е). а1. (1990) Р1ап) Мо1ес. Вю1. 14: 357368).
В одном из аспектов выбранная сигнальная последовательность должна содержать известный сайт расщепления, и при конструировании слияния следует учитывать аминокислоты после сайта (сайтов) расщепления, которые необходимы для расщепления. В некоторых случаях такая потребность может быть удовлетворена добавлением небольшого количества аминокислот между сайтом расщепления и АТО трансгена или, альтернативно, заменой некоторых аминокислот в последовательности трансгена. Такие способы конструирования хорошо известны в данной области и в равной мере применимы к любому компартменту клетки.
В одном из аспектов описанные выше механизмы для целенаправленного переноса в клетке могут быть использованы не только в сочетании с родственными им промоторами, но также в сочетании с гетерологичными промоторами, для того чтобы оказать влияние на конкретную цель направленного переноса в клетке под транскрипционным контролем промотора, который имеет картину экспрессии, отличную от картины экспрессии промотора, с которого получен направляющий сигнал.
В общем, можно использовать разные способы при практическом осуществлении настоящего изобретения, включая любые способы осуществления рекомбинантной экспрессии фитазы в трансгенном растения, семени, органе или любой части растения. Такие трансгенные растения и части растений применимы в качестве источников рекомбинантно экспрессированной фитазы, которая может быть добавлена непосредственно к содержащим фитаты источникам. Альтернативно, рекомбинантная экспрессированная в растении фитаза может быть экстрагирована из растительного источника и при необходимости очищена перед осуществлением контакта с субстратом фитазы.
В контексте настоящего изобретения растения, которые могут быть выбраны (использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения), включают без ограничения, культурные растения, которые дают съедобные цветки, такие как цветная капуста (Вгаккюа о1егасеа), артишок (Супаг ксо1утик), плоды, такие как яблоня (Ма1ик, например, йотекйсик), банан (Мика, например, аситтаП), ягоды (такие как смородина, КЬек, например, гиЬгит), вишни (такие как черешня, Ргипик, например, аушт), огурец (Сиситк, например, кайуик), виноград (УШк, например, уииГега), лимон (СЬгик Ьтоп), дыню (Сисипик те1о), орехи (такие как грецкий орех, Лщктк, например, гед1а; арахис, АгасЫк Ьуродеае), апельсин (СЬгик, например, тахта), персик (Ргипик, например, регкюа), грушу (Руга, например, соттишк), сливу (Ргипик, например, йотекйса), землянику (Ргадайа, например, токсЬа)а), томат (Ьусорегкюоп, например, екси1еп)ит), листья, такие как люцерна (Мейюадо, например, кайуа), капусту (например, Вгаккюа о1егасеа), эндивий (СюЬогеит, например, епйМа), лук-порей (АШит, например, роггит), салат-латук (Ьас)иса, например, кайуа), шпинат (8ршас1а, например, о1егасеае), табак (№сойапа, например, )аЬасит), корни, такие как маранта (МагаЫа, например, агипйтасеа), свеклу (Ве)а, например, уи1дайк), морковь Шаисик, например, саго)а), маниоку (МаЫЬо), например, екси1ейа), турнепс (Вгаккюа, например, гара), редис (КарЬапик, например, кайуик), ямс (Оюксогеа, например, екси1ейа), батат (1ротоеа Ьа)а)ак), и семена, такие как бобы (РЬакео1ик, например, уи1дайк), горох (РЬит, например, кайуит), соя (О1ус1п, напри- 41 021178 мер, тах), пшеница (ТгШсит, например, аекйуит), ячмень (Ногбеит, например, уи1даге), кукуруза (2еа, например, таук), рис (Огу/а, например, кайуа), рапс (Вгаккюа парик), просо (Ратсит Ь.), подсолнечник (НеПапШик аппик), овес (Ауепа кайуа), клубни, такие как кольраби (Вгаккюа, например, о1егасеае), картофель (8о1агшт, например, ШЬегокит) и тому подобные.
В одном из аспектов нуклеиновые кислоты и полипептиды по изобретению экспрессируют или встраивают в любое растение или семя. Трансгенные растения по изобретению могут быть двудольными или однодольными. Примерами однодольных трансгенных растений по изобретению являются травы, такие как мятлик луговой (мятлик обыкновенный, Роа), кормовые травы, такие как овсяница, плевел, травы умеренной зоны, такие как Адгокйк, и злаки, например, пшеница, овес, рожь ячмень, рис, сорго и кукуруза. Примерами двудольных трансгенных растений по изобретению являются табак, бобовые, такие как люпин, картофель, сахарная свекла, горох, бобы и соя, и крестоцветные растения (семейство Вгаккюасеае), такие как цветная капуста, рапс и близкородственный модельный организм АгаЫборкю ШаПаиа. Таким образом, трансгенные растения и семена по изобретению включают широкий спектр растений, включая без ограничения виды родов Апасагбшт, АгасЫк, Акрагадик, А(гора, Ауепа, Вгаккюа, Сйгик, СйгиНик, Саркюит, СайНатик, Сосок, СоГГеа, Сиситт, СисигЬйа, Оанснк, Е1ае1к, Егадапа, О1усте, Ооккуршт, НеПапШик, Не1егоса1Пк, Ногбеит, Нуоксуатик, ЬасШса, Ьшит, Ьо1шт, Ьиртик, Ьусорегкюоп Ма1ик, МапШой Ма)огапа, Мебюадо, ЫюоПапа, О1еа, Огу/а, Ратеит, РапткеШт, Регкеа, РЬакео1ик, Р1к1асЫа, Ртит, Ругик, Ргипик, РарНапик, Рютик, 8еса1е, 8епесю, 8тар1к, 8о1апит, 8огдНит, ТНеоЬготик, ТпдопеПа, ТпНсит, Ую1а, УШк, У1дпа и 2еа.
В альтернативных вариантах нуклеиновые кислоты по изобретению экспрессируются в растениях, которые содержат клетки волокон, включая, например, хлопчатник, хлопковое дерево (Карок, СеЛа реп(апбга), иву пустынную, креозотовый куст, терескен шерстистый, бальзу, рами, кенаф, коноплю, розель, джут, сизаль, абаку и лен. В альтернативных вариантах трансгенные растения по изобретению могут быть представителями рода Ооккуршт, включая представителей любого вида Ооккуршт, таких как О. агЬогеиш, О. йегЬасеиш, О. ЬагЬабепке и О. ЫгкиШт.
Дополнительные растения, а также нерастительные системы экспрессии можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения. Выбор вида растения, главным образом, определяется предполагаемым применением растения или его частей и тем, насколько вид растения поддается трансформации.
Доступны несколько способов введения экспрессирующей конструкции, содержащей кодирующую фитазу последовательность ДНК, в растения-мишени. Способы трансформации широкого множества видов высших растений хорошо известны и описаны в технической и научной литературе. Смотри, например, ХУейтд (1988) Апп. Реу. Оепей 22: 421-477; патент США № 5750870. Такие способы также могут включать без ограничения трансформацию протопластов с использованием опосредованного кальцием/полиэтиленгликолем способа, электропорации и микроинъекции или бомбардировки (покрытыми) частицами (Ройукик, 1990). Кроме указанных так называемых способов прямой ДНК-трансформации широко доступны системы трансформации с участием векторов, таких как вирусные векторы (например, вируса мозаики цветной капусты (СаМУ)) и бактериальные векторы (например, рода АдгоЬасйегшш) (Ройукик, 1990). После селекции и/или скрининга протопласты, клетки или части растения, которые были трансформированы, могут быть регенерированы в целые растения с использованием способов, известных в данной области (Ногксй е( а1., 1985). Выбор способа трансформации и/или регенерации не является решающим для настоящего изобретения.
Нуклеиновые кислоты и кассеты экспрессии по изобретению могут быть введены в растительную клетку любым способом. В альтернативных аспектах практического осуществления настоящего изобретения подразумевают, что термин введение в контексте полинуклеотида, например, представляющей интерес нуклеотидной конструкции, означает представление растению полинуклеотида таким образом, что полинуклеотид получает доступ внутрь клетки растения. Когда необходимо ввести более одного полинуклеотида, такие полинуклеотиды могут быть собраны в виде частей одной нуклеотидной конструкции или в виде отдельных нуклеотидных конструкций и могут находиться в одном и том же или в разных векторах для трансформации. Соответственно, такие полинуклеотиды могут быть введены в представляющую интерес клетку-хозяина в ходе одного события трансформации, в ходе отдельных событий трансформации или, например, в растениях в виде части протокола скрещивания. Способы по изобретению не зависят от конкретного способа введения одного или нескольких полинуклеотидов в растение, важно только, чтобы полинуклеотид(ды) получил доступ внутрь по меньшей мере одной клетки растения. Способы введения полинуклеотидов в растения известны в данной области, включая, без ограничения, способы временной трансформации, способы стабильной трансформации и опосредованные вирусами способы.
Временную трансформацию можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, и в некоторых аспектах в контексте полинуклеотида термин предназначен для обозначения того, что полинуклеотид вводят в растение, и он не интегрируется в геном растения. Стабильное введение или стабильно введенный в контексте полинуклеотида, вводимого в растение, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, и в некоторых аспектах термин означа- 42 021178 ет, что введенный полинуклеотид стабильно включается в геном растения, и следовательно, растение стабильно трансформировано полинуклеотидом.
Стабильная трансформация или стабильно трансформированный в контексте полинуклеотида, вводимого в растение, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, и в некоторых аспектах термин означает, что полинуклеотид, например, нуклеотидную конструкцию, описанную в настоящей публикации, вводят в растение, и она интегрируется в геном растения и способна передаваться по наследству его потомкам, более конкретно потомкам нескольких последующих поколений. Введение в геном требуемого растения может быть таким, что фермент регулируется эндогенными регуляторными элементами транскрипции или трансляции. Способы трансформации как однодольных, так и двудольных растений хорошо известны в данной области.
Нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать для придания требуемых свойств, по существу, любому растению. В одном из вариантов фермент по изобретению может быть экспрессирован таким образом, что фермент не будет вступать в контакт со своим субстратом, пока это не потребуется. Например, фермент по изобретению может быть направлен и может оставаться в эндоплазматической сети растительной клетки. Удерживание фермента в эндоплазматической сети клетки будет предотвращать контакт фермента с его субстратом. Затем фермент и субстрат могут быть приведены в контакт любым способом, позволяющим разрушать субклеточную структуру, таким как, измельчение, размалывание, нагревание и тому подобное. Смотри публикации АО 98/11235, АО 2003/18766 и АО 2005/096704, которые все включены в настоящее описание в виде ссылки.
Селектируемые маркерные гены могут быть добавлены к генной конструкции, чтобы идентифицировать растительные клетки или ткани, в которых был успешно интегрирован трансген. Это может быть необходимо потому, что осуществление включения и экспрессии генов в растительных клетках является редким событием, происходящим только в нескольких процентах тканей или клеток-мишеней. Селектируемые маркерные гены кодируют белки, которые обеспечивают резистентность к средствам, которые обычно являются токсичными для растений, таким как антибиотики или гербициды. Только растительные клетки, в которых был интегрирован селектируемый маркерный ген, буду выживать при выращивании в среде, содержащей соответствующий антибиотик или гербицид. Селектируемые маркеры, обычно используемые при трансформации, включают ген пр(11. который придает резистентность к канамицину и родственным антибиотикам (Меззшд апб У1егга. Оепе 19: 259-268 (1982); Веуап е1. а1, №Лиге 304: 184-187 (1983)), ген Ьаг, который придает резистентность к гербициду фосфинотрицину (АЬЪе е1. а1, №с1. Аабз Рез. 18: 1062 (1990), δреисе^ еЕ а1. ТЬеог. Арр1. Оепе1 79: 625-631 (1990)), ген ЬрЬ, который придает резистентность к антибиотику гигромицину (В1осЫп§ег апб Э|дде1тапп, Мо1. Се11 Вю1. 4: 2929-2931), ген бЫг, который придает резистентность к метотрексату (Воигошз е1. а1, ЕМВО ί. 2(7): 1099-1104 (1983)), ген ΕΡδΡδ, который придает резистентность к глифосату (патенты США № 4940935 и 5188642).
Альтернативно материал трансгенных растений можно идентифицировать с использованием системы позитивной селекции, такой как система, использующая ген манноза-6-фосфатизомеразы, который придает способность метаболизировать маннозу (патенты США № 5767378 и 5994629).
В одном из аспектов получение трансгенных растений или семян включает внедрение последовательностей по изобретению и, необязательно, маркерных генов в целевую экспрессирующую конструкцию (например, плазмиду) вместе с размещением последовательностей промотора и терминатора. Способ может включать перенос модифицированного гена в растение подходящим способом. Одну или несколько последовательностей по изобретению можно объединять с последовательностями, которые придают резистентность к насекомому, заболеванию, засухе, повышают урожай, улучшают питательные качества зерна, повышают выход этанола и тому подобное.
Например, конструкция может быть введена непосредственно в геномную ДНК растительной клетки с использованием таких способов, как электропорация и микроинъекция протопластов растительных клеток, или конструкции могут быть введены непосредственно в ткань растения с использованием баллистических способов, таких как бомбардировка содержащими ДНК частицами. Например, смотри публикации С’ЕпзЮи (1997) Р1ап1 Мо1. Вю1. 35: 197-203; Ра\\'1о\У8к1 (1996) Мо1. Вю1есЬпо1. 6: 17-30; К1еш (1987) №Лиге 327: 70-73; Такит1 (1997) Оепез ОепеЕ δу8ΐ. 72: 63-69, где обсуждается применение бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшеницу; и публикацию Абат (1997, выше) в отношении применения бомбардировки частицами для введения УАС в растительные клетки. Например, ШиеЕаг1 (1997, выше) использовал бомбардировку частицами для создания трансгенных растений хлопчатника. Устройства для ускорения частиц описано в патенте США № 5015580; и коммерчески доступно устройство для ускорения частиц ВюЮб (ВюПзЕсз) ΡΌδ-2000; смотри также патент США № 5608148 (1оЬп) и патент США № 5681730 (ЕШз), в котором описана опосредованная частицами трансформация голосеменных растений.
В одном из аспектов протопласты могут быть иммобилизованы и подвергнуты инъекции нуклеиновых кислот, например экспрессирующей конструкции. Хотя регенерация растений из протопластов является сложной в случае злаковых, регенерация растений возможна у бобовых растений с использованием соматического эмбриогенеза из полученного из протопластов каллуса. Организованные ткани могут быть трансформированы голой ДНК с помощью методики, в которой используют генную пушку, при
- 43 021178 этом ДНК наносят в виде покрытия на бомбардирующие микрочастицы из вольфрама, частицы с размером, составляющим 1/100 от размера клеток, которые переносят ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем в трансформированной ткани индуцируют регенерацию, обычно посредством соматического эмбриогенеза. Такой способ оказался успешным для нескольких видов злаковых, включая кукурузу и рис.
Нуклеиновые кислоты, например экспрессирующие конструкции, также могут быть введены в растительные клетки с использованием рекомбинантных вирусов. Растительные клетки могут быть трансформированы с использованием вирусных векторов, таких как, например, векторы, полученные из вируса табачной мозаики (Ροιι\\ΌΐΗη1 (1997) Р1аШ Μο1. Βίο1. 33: 989-999), смотри ΡοιΗ (1996) Ике οΓ νίπ·ι1 герН^пк Гэг (Не еxр^екк^οη οΓ деиек ίη р1айк, Μο1. Βίο!^Ηηο1. 5: 209-221.
Альтернативно нуклеиновые кислоты, например экспрессирующие конструкции, можно комбинировать с подходящими фланкирующими областями Т-ДНК и вводить в обычный вектор-хозяин АдгоЬас(египп ШтейНе^. Функции вирулентности хозяина АдгоЬасЮгтт ШтейНе^ будут управлять инсерцией конструкции и соседнего маркера в ДНК растительной клетки, когда клетка будет инфицирована бактериями. Методика опосредованной АдгоЬайегшт ШтейНего трансформации, включая обезвреживание и использованием бинарных векторов, хорошо описана в научной литературе. Смотри, например, НитксЬ (1984) Биегое 233: 496-498; Рга1еу (1983) Ргос. №ι(1. Асай. Зск ИЗА 80: 4803 (1983); Оеие ТгашГег ΐο Р1айк, ΡοΙιύΗιικ, ей. (Зргшдейад, Вег1ш 1995). ДНК в клетке А. ШтейНе^ находится в бактериальной хромосоме, а также в другой структуре, известной как Τί-плазмида (индуцирующая опухоли плазмида). Τί-плазмида содержит участок ДНК, называемый Т-ДНК (длиной ~20 т.н.), которая переносится в растительную клетку в процессе инфекции, и серия генов νίτ (вирулентности), которые управляют процессом инфекции. А. ШтейНего может инфицировать растение только через раны: когда образуются раны на корне или стебле растения, выделяются некоторые химические сигналы, в ответ на которые гены νίτ А. йтейстеш! становятся активированными и вызывают серию событий, необходимых для переноса Т-ДНК из Τί-плазмиды в хромосому растения. Затем Т-ДНК поступает в растительную клетку через рану. Одно из предположений состоит в том, что Т-ДНК выжидает, пока растительная ДНК реплицируется или транскрибируется, затем встраивается сама в подвергаемую воздействию ДНК растения. Чтобы использовать А. Йтеййеш! в качестве вектора трансгена, индуцирующий опухоли участок Т-ДНК необходимо удалить, сохраняя при этом области границ Т-ДНК и гены νίτ. Затем трансген встраивают между областями границ Т-ДНК, в которой он переносится в растительную клетку и интегрируется в хромосомы растения.
Изобретение относится к трансформации однодольных растений с использованием нуклеиновых кислот по изобретению, включая важные злаковые растения, смотри Ше1 (1997) Р1аШ Μο1. Βίο1. 35: 205218. Также смотри, например, публикации ΗογκΛ, ЗНеисе (1984) 233: 496; Рга1еу (1983) Ргос. №И. Асай. 8с1 иЗА 80: 4803; Τ1ιυ10^γ (1997) выше; Рагк (1996) Р1аШ Μο1. Βίο1. 32: 1135-1148, в которых обсуждается интеграция Т-ДНК в геномную ДНК. Смотри также патент США № 5712135 (Н'На11ит), в котором описан процесс стабильной интеграции ДНК, содержащей ген, который является функциональным в клетке злакового растения или другого однодольного растения.
В одном из аспектов третья стадия может заключаться в селекции и регенерации целых растений, способных передавать включенный ген-мишень следующему поколению. Такие способы регенерации основаны на манипулировании некоторыми фитогормонами в среде для роста культуры ткани, обычно опираясь на биоцидный и/или гербицидный маркер, который был введен вместе с требуемыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивируемых протопластов описана в Ενанк е( а1., РгоГОр1ак1к ΕοΗ-Κίοη апй СиЬиге, НаηйЬοοк οΓ Р1аШ Се11 СиЬиге, рр. 124-176, Μί-^ΜίΠίΕιη РиЬПкНшд ^тра^, Νον ΥοιΗ 1983; апй Втйтд, Редеηе^аΐ^οη οΓ Р1аШк, Р1аШ РгоЮр1ак1к, рр. 21-73, СРС Ргекк, Βοса Κπΐοη, 1985. Регенерация также может быть осуществлена из каллуса растения, эксплантатов, органов или их частей. Такие способы регенерации в общем описаны в публикации К1ее (1987) Апп. Рее. οΓ Р1аШ РЬук. 38: 467-486. Чтобы получить целые растения из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, их можно выращивать в контролируемых условиях окружающей среды в серии сред, содержащих питательные вещества и гормоны, способом, известным как культивирование ткани. После создания целых растений и получения семян начинают оценку потомства.
В одном из аспектов после стабильного включения кассеты экспрессии в трансгенные растения она может быть введена в другие растения при скрещивании половым путем. Можно использовать любой из множества стандартных способов скрещивания, в зависимости от вида, подвергаемого скрещиванию. Смотри, например, ХУе1кН ί. Р., РшНатеШаР οΓ Р1аШ Оег1еПск апй Вгеейтд, ίοΐιη ХУПеу & δοη^ ΝΥ (1981); Сгор Вгеейтд, XУοοй Ό. Р. (Ей.) Атепсам 3ο^1ν οΓ Ад^οηοту Μай^кοη. ХУЬ. (1983); Μауο О., Ню Τ^οιγ οΓ Р1аШ Вгеейтд, Зе^ий ΕΦΐίοη, ίΗΐΌΐΗοη Ргекк, Охйгй (1987); ЗтдН, Ό. Р., Вгеейтд Γογ Рек^кΐаηсе ΐο ЭЬеакек ипй йкес! РеЧк, Зргшдег-Уейад, ΝΥ (1986); апй ХУпске ипй ХУеЬег, ^иаηΐ^ΐаΐ^νе ОегюЬск ипй ЗеΕΗίοη Р1аШ Вгеейтд, УаЬег йе Огиу1ег апй Сс., Вег1ш (1986).
В одном из аспектов после того как трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот по изобретению приводит к фенотипическим изменениям, растения, содержащие рекомбинантные нуклеиновые кислоты, по изобретению могут быть подвергнуты половому скрещиванию со вторым растением, чтобы получить конечный продукт. Таким образом, семя по изобретению может быть получено в результате скрещива- 44 021178 ния между двумя трансгенными растениями по изобретению или в результате скрещивания между растением по изобретению и другим растением. Требуемые эффекты (например, экспрессия полипептидов по изобретению для получения растения, в котором изменены характеристики цветения) могут быть усилены, когда оба родительских растения экспрессируют полипептиды (например, фитазу) по изобретению. Требуемые эффекты могут быть переданы будущим поколениям растений стандартными способами размножения.
В случае двудольных растений можно использовать бинарную векторную систему (Ноекета е! а1., 1983; ЕР 0120516, 8сНйрегоог! е! а1.). Например, могут быть использованы штаммы АдгоЪас!егшт, которые содержат νίτ-плазмиду с генами вирулентности и совместимую плазмиду, содержащую генную конструкцию, которую необходимо перенести. Такой вектор может реплицироваться как в Е. сой, так и в ЛдгоЬас1епит, и является производным от бинарного вектора Вш19 (Веνаη, 1984), который изменяют в отношении деталей, которые не являются важными для настоящего изобретения. Бинарные векторы, которые используют в данном примере, содержат между последовательностями левой и правой границ ТΌΝΑ идентичный ген МРТП, кодирующий резистентность к канамицину (Веνаη, 1984), и сайт множественного клонирования, чтобы клонировать требуемые генные конструкции.
Трансформация и регенерация однодольных сельскохозяйственных культур может быть осуществлена на практике с использованием любого способа или стандартной методики; однодольные растения поддаются трансформации, и способные к размножению трансгенные растения могут быть регенерированы из трансформированных клеток. В альтернативном аспекте однодольные растения трансформируют, используя трансформацию АдгоЪас!егшт.
В одном из аспектов трансгенные растения риса могут быть получены с использованием бактериального гена ИрН, кодирующего резистентность к гигромицину, в качестве селектируемого маркера; ген может быть введен с помощью электропорации. В одном из аспектов трансгенные растения кукурузы могут быть получены введением гена Ъаг 81гер!отусек Нудгоксоркик, который кодирует фосфинотрицинацетилтрансферазу (фермент, который инактивирует гербицид фосфинотрицин), в эмбриогенные клетки суспензионной культуры кукурузы посредством бомбардировки микрочастицами. В одном из аспектов генетический материал может быть введен в протопласты, полученные из клеток алейронового слоя однодольных сельскохозяйственных культур, таких как пшеница и ячмень. В одном из аспектов растения пшеницы регенерируют из эмбриогенной суспензионной культуры, отбирая только ткани зрелого компактного и узелкового эмбриогенного каллуса для создания эмбриогенных суспензионных культур. В одном из аспектов сочетание с системами трансформации для таких сельскохозяйственных культур делает возможным применение настоящего изобретения в случае однодольных растений. Описанные способы и другие способы также могут быть применимы для трансформации и регенерации двудольных растений.
При практическом осуществлении настоящего изобретения экспрессия фитазной конструкции включает такие элементы, как транскрипция гена полимеразами растения, трансляция мРНК и т.д., которые известны специалистам в области технологии рекомбинантной ДНК. Некоторые подробности, имеющие отношение к практическому осуществлению некоторых вариантов настоящего изобретения, обсуждаются в настоящем описании. Регуляторные последовательности, которые, как известно или обнаружено, вызывают экспрессию фитазы, могут быть использованы в настоящем изобретении. Выбор используемых регуляторных последовательностей может зависеть от представляющей интерес сельскохозяйственной культуры-мишени и/или органа-мишени. Такие регуляторные последовательности могут быть получены из растений или вирусов растений или могут быть химически синтезированы. Такими регуляторными последовательностями являются промоторы, активные в управлении транскрипцией в растениях, либо конститутивно, либо специфично для стадии и/или ткани, в зависимости от применения растения или их частей. Такие промоторы включают без ограничения промоторы, осуществляющие конститутивную экспрессию, такие как промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) ^ийку е! а1., 1982), промоторы для специфичной для листьев экспрессии, такие как промотор гена малой субъединицы рибулозабисфосфаткарбоксилазы (Соги/ζί е! а1., 1984), промоторы для специфичной для корня экспрессия, такие как промотор гена глутаминсинтазы (Тшдеу е! а1., 1987), промоторы для специфичной для семян экспрессии, такие как промотор круциферина А Вгаккка парик (Куап е! а1., 1989), промоторы для специфичной для клубней экспрессии, такие как промотор пататина класса-1 картофеля (Кок!ег-ТорГег е! а1., 1989; ХУегШег е! а1., 1989) или промоторы для специфичной для плодов экспрессии, такие как промотор полигалактуроназы ^Ο) томата (В1гй е! а1., 1988).
Другие регуляторные последовательности, такие как последовательности терминаторов и сигналы полиаденилирования, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, и такие регуляторные последовательности могут включать любую такую последовательность, функционирующую в растениях, выбрать которые может специалист в данной области. Примером таких последовательностей является 3'-флакирующая область гена нопалинсинтазы (пок) АдгоЪаскгшт ШтеГаскпк (Веνап, выше). Регуляторные последовательности также могут включать энхансерные последовательности, такие как последовательности, найденные в промоторе 358 СаМУ, и стабилизирующие мРНК последовательности, такие как лидерная последовательность РНК4 вируса мозаики люцерны (А1МУ) (Вгейегойе е!
- 45 021178 а1., 1980) или любые другие последовательности, функционирующие подобным образом.
В некоторых вариантах фитаза по изобретению экспрессируется в среде, которая обеспечивает стабильность экспрессированного белка. Выбор клеточных компартментов, таких как цитозоль, эндоплазматическая сеть, вакуоль, белковое тельце или периплазматическое пространство, можно использовать в настоящем изобретении для создания такой стабильной среды, в зависимости от биофизических параметров фитазы. Такие параметры включают без ограничения оптимум рН, чувствительность к протеазам или чувствительность к молярности предпочтительного компартмента.
В некоторых вариантах фитаза по изобретению экспрессируется в цитоплазме; в некоторых аспектах, чтобы получить экспрессию в цитоплазме клетки, экспрессированный фермент не должен содержать сигнального пептида секреции или любой другой последовательности-мишени. В случае экспрессии в хлоропластах и митохондриях экспрессированный фермент должен содержать специфичный так называемый транзитный пептид для импорта в такие органеллы. Известны направляющие к мишени последовательности, которые могут быть связаны с представляющим интерес ферментом для достижения такой экспрессии (Зтеекепк еГ а1., 1990; уап йеп Вгоеск еГ а1., 1985; Ао1Гег еГ а1., 1988). Если требуется активность фермента в вакуолях, необходимо присутствие сигнального пептида секреции, а также специфичной направляющей к мишени последовательности, которая направляет фермент в такие вакуоли (Тадие еГ а1., 1990). Вышесказанное относится и к белковым тельцам в семенах. Последовательность ДНК, кодирующая представляющий интерес фермент, должна быть модифицирована таким образом, чтобы фермент мог проявлять свое действие в требуемом месте в клетке.
В некоторых вариантах, чтобы добиться внеклеточной экспрессии фитазы, в экспрессирующей конструкции по настоящему изобретению используют сигнальную последовательность секреции. Хотя сигнальные последовательности, которые являются гомологичными (нативными) для вида растенияхозяина, могут быть предпочтительными, также можно использовать гетерологичные сигнальные последовательности, т.е., последовательности, происходящие из другого вида растения или имеющие микробное происхождение. Такие сигнальные последовательности известны специалистам в данной области. Подходящие сигнальные последовательности, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, описаны В1оЬе1 еГ а1., 1979; Уоп Нерпе, 1986; Оагаа еГ а1., 1987; §утопк еГ а1., 1990; Ыд еГ а1., 1994; и Роетегк еГ а1., 1996).
В некоторых вариантах все части рассматриваемых конструкций ДНК (промоторы, регуляторные, секреторные, стабилизирующие, направляющие к мишени последовательности или последовательности терминации) по настоящему изобретению при необходимости модифицируют, чтобы повлиять на их регуляторные свойства, используя способы, известные специалистам в данной области. Растения, содержащие фитазу, полученную по настоящему изобретению, можно использовать для получения растений или органов растений с еще более высокими уровнями фитазы. Например, можно получать такие растения или органы растений, используя методику сомаклональной изменчивости или методику кроссбридинга. Такие методики хорошо известны специалистам в данной области.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) получения высокоэффективной системы сверхэкспрессии фитазы и других молекул. В одном из аспектов изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) получения высокоэффективной системы сверхэкспрессии фитазы и кислой фосфатаза (рН 2,5) ТпсНойегта. Такая система приводит к получению ферментативных композиций, которые особенно применимы в производстве кормов для животных. Дополнительные подробности такого способа указаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области. В конкретном не ограничивающем примере такая общедоступная литература включает ЕР 0659215 (АО 9403612 А1) (№уа1ашеп еГ а1.), хотя в таких публикациях не раскрыты предложенные в настоящем изобретении молекулы.
В некоторых вариантах в изобретении используют пересортировку ίίί У1уо, которая может быть сфокусирована на межмолекулярных процессах, вместе называемых рекомбинацией, которая у бактерий может представлять собой КесА-зависимое явление. Изобретение может быть основано на процессах рекомбинации клетки-хозяина, чтобы рекомбинировать последовательности или подвергнуть их пересортировке, или на способности клеток опосредовать редукционные процессы, чтобы уменьшить сложность квазиповторяющихся последовательностей в клетке путем делеции. Такой процесс редукционной пересортировки происходит в результате внутримолекулярного КесА-независимого процесса.
Следовательно, в другом аспекте изобретения могут быть созданы варианты полинуклеотидов способом редукционной пересортировки. Способ заключается в создании конструкций, содержащих следующие друг за другом последовательности (исходные кодирующие последовательности), их встраивание в подходящий вектор и последующее введение в подходящую клетку-хозяина. Пересортировка отдельных молекулярных элементов происходит благодаря процессам комбинирования между следующими друг за другом последовательностями в конструкции, имеющими области гомологии, или между квазиповторяющимися единицами. В процессе пересортировки происходит рекомбинация и/или понижается сложность и степень повторения последовательностей, что приводит к получению новых видов молекул. Могут быть применены различные способы обработки для повышения скорости пересортировки. К таким обработкам относится обработка ультрафиолетовым светом или повреждающими ДНК химическими
- 46 021178 веществами и/или использованием линий клеток-хозяев, имеющих повышенные уровни генетической нестабильности. Таким образом, процесс пересортировки может включать гомологичную рекомбинацию или природное свойство квазиповторяющихся последовательностей управлять своей собственной эволюцией.
В изобретении можно использовать повторяющиеся или квазиповторяющиеся последовательности; такие последовательности могут играть роль в генетической нестабильности. В настоящем изобретении квазиповторы представляют собой повторы, которые не ограничены исходной структурой своих единиц. Квазиповторяющиеся единицы могут присутствовать в виде ряда последовательностей в конструкции; следующих друг за другом единиц со сходными последовательностями. После лигирования места соединения между следующими друг за другом последовательностями становятся, по существу, невидимыми, и квазиповторяющаяся природа полученной конструкции становится непрерывной на молекулярном уровне. Процесс делеции, который клетка осуществляет, чтобы уменьшить сложность полученной конструкции, происходит между квазиповторяющимися последовательностями. Квазиповторяющиеся единицы обеспечивают практически безграничный репертуар матриц, на базе которого могут происходить события проскальзывания. Таким образом, конструкции, содержащие квазиповторы, эффективно обеспечивают достаточную молекулярную эластичность, чтобы события делеции (и потенциально инсерции) могли происходить фактически повсюду в квазиповторяющихся единицах.
В некоторых аспектах, когда все квазиповторяющиеся последовательности лигированы в одной и той же ориентации, например, головой к хвосту и наоборот, клетка не может различать отдельные единицы. Следовательно, редукционные процессы могут происходить на всем протяжении последовательностей. Напротив, когда, например, единицы присутствуют в ориентации голова к голове, а не голова к хвосту, инверсия определяет конечные точки близлежащей единицы, так что образование делеции будет способствовать утрате дискретных единиц. Таким образом, в одном из аспектов изобретения последовательности находятся в одной и той же ориентации. Случайная ориентация квазиповторяющихся последовательностей будет приводить к потере эффективности пересортировки, тогда как единообразная ориентация последовательностей будет обеспечивать наиболее высокую эффективность. Однако, хотя наличие меньшего количества непрерывных последовательностей в одной и той же ориентации снижает эффективность, все еще может обеспечиваться достаточная эластичность для эффективного выделения новых молекул. Могут быть получены конструкции с квазиповторяющимися последовательностями в одной и той же ориентации для обеспечения более высокой эффективности.
Последовательности могут быть собраны в ориентации голова к хвосту с использованием любого из множества способов, включая следующие способы.
(a) Могут быть использованы праймеры, которые имеют поли-А-голову и поли-Т-хвост, которые в случае их получения в однонитевой форме определяют ориентацию. Это осуществляют благодаря наличию нескольких первых оснований праймеров, полученных из РНК и, следовательно, легко удаляемых РНК-азой Н.
(b) Могут быть использованы праймеры, которые содержат уникальные сайты расщепления ферментами рестрикции. Могут быть необходимыми множественные сайты, группа уникальных последовательностей и многократные стадии синтеза и лигирования.
(c) Несколько внутренних оснований праймера могут быть тиолированы, и используют экзонуклеазу, чтобы получить молекулы с правильными концами.
В некоторых аспектах выделение пересортированных последовательностей основано на идентификации клонирующих векторов с пониженным ΚΙ. Пересортированные кодирующие последовательности затем могут быть выделены с использованием амплификации. Продукты повторно клонируют и экспрессируют. Извлечение клонирующих векторов с пониженным ΚΙ можно осуществить, используя следующие подходы.
1) Использование только стабильно поддерживаемых векторов при понижении сложности конструкции.
2) Физическое извлечение укороченных векторов физическими способами. В данном случае клонирующий вектор извлекают, используя стандартный способ выделения плазмид, и фракционируют по размеру либо в агарозном геле, либо на колонке с определенным пределом отсечения низкой молекулярной массы, используя стандартные способы.
3) Извлечение векторов, содержащих прерывистые гены, которые могут быть отобраны в том случае, когда уменьшается размер вставки.
4) Использование способов прямой селекции в случае вектора экспрессии и подходящей селекции.
Кодирующие последовательности (например, гены) из родственных организмов могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения, и они могут иметь высокую степень гомологии и кодировать довольно разнообразные белковые продукты. Такие типы последовательностей особенно применимы в настоящем изобретении в качестве квазиповторов. Однако, хотя примерные протоколы, обсуждаемые ниже, демонстрируют пересортировку почти идентичных исходных кодирующих последовательностей (квазиповторов), такой способ не ограничен такими почти идентичными повторами.
- 47 021178
После образования конструкции могут быть либо подвергнуты, либо не подвергнуты фракционированию по размеру в агарозном геле согласно опубликованным протоколам, встроены в клонирующий вектор и трансфицированы в подходящую клетку-хозяина. Затем клетки размножают и осуществляют редукционную пересортировку. Скорость процесса редукционной пересортировки при необходимости можно стимулировать введением повреждения ДНК. Опосредовано ли уменьшение К! образованием делеции между повторяющимися последовательностями внутримолекулярным механизмом или опосредовано подобными рекомбинации событиями посредством межмолекулярного механизма, не имеет значения. Конечным результатом является пересортировка молекул на все возможные комбинации.
В одном из аспектов способы по настоящему изобретению включают дополнительную стадию скрининга представителей библиотеки перетасованного пула, чтобы идентифицировать отдельных представителей перетасованной библиотеки, обладающих способностью связываться или иным образом взаимодействовать или катализировать конкретную реакцию (например, такую как катализ гидролиза фитата).
В одном из аспектов полипептиды, которые идентифицированы в таких библиотеках, могут быть использованы для терапевтических, диагностических, исследовательских и родственных целей (например, катализаторы, растворимые вещества для повышения осмолярности водного раствора и тому подобные), и/или могут быть подвергнуты одному или нескольким дополнительным циклам перетасовки и/или селекции.
В другом аспекте перед или во время рекомбинации или пересортировки полинуклеотиды по изобретению или полинуклеотиды, созданные способом, описанным в настоящей публикации, могут быть подвергнуты воздействию средств или процессам, которые стимулируют введение мутаций в исходные полинуклеотиды. Введение таких мутаций может увеличивать разнообразие полученных в результате гибридных полинуклеотидов и кодируемых ими полипептидов. Средства или процессы, которые стимулируют мутагенез, могут включать без ограничения: (+)-СС-1065 или синтетический аналог, такой (+)СС-1065-Щ3-аденин, смотри 8ип и Ниг1еу, 1992); Ν-ацетилированный или деацетилированный 4'-фторо4-аминобифениловый аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (смотри, например, νаη бе Ро11 е! а1., 1992); или Ν-ацетилированный или деацетилированный 4-аминобифениловый аддукт, способный ингибировать синтез ДНК (смотри также νаη бе Ро11 е! а1., 1992, стр. 751-758); трехвалентный хром, соль трехвалентного хрома, аддукт полициклического ароматического углеводорода (РАН) с ДНК, способный ингибировать репликацию ДНК, такой как 7-бромметилбенз[а]антрацен (ВМА), трис(2,3дибромпропил)фосфат (трис-ВР), 1,2-дибром-3-хлорпропан (ОВСР). 2-бромакролеин (2ВА), бензо [а]пирен-7,8-дигидродиол-9-10-эпоксид (ВРОЕ), галогеновая соль платины (II), ^гидрокси-2-амино-3метилимидазо[4,5-Г]хинолин (Ν-гидрокси-Ю) и ^гидрокси-2-амино-1-метил-6-фенилимидазо [4, 5-ί] пиридин (Ν-гидрокси-РЫР). Примерами средств для замедления или остановки ПЦР-амплификации являются УФ-свет (+)-СС-1065 и (+)-СС-1065-Щ3-аденина). В частности, предлагаемыми средствами являются ДНК-аддукты или полинуклеотиды, содержащие ДНК-аддукты, из полинуклеотидов или пула полинуклеотидов, которые могут высвобождаться или могут быть удалены способом, включающим нагревание раствора, содержащего полинуклеотиды, перед дальнейшей обработкой.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения рекомбинантных белков, обладающих биологической активностью, в результате обработки образца, содержащего двунитевые матричные полинуклеотиды, кодирующие белок дикого типа, в условиях по изобретению, которые обеспечивают получения гибридных или подвергнутых пересортировке полинуклеотидов.
Изобретение также относится к применению собственных кодонных праймеров (содержащих вырожденную последовательность Ν,Ν,Ο/Т), чтобы ввести точечные мутации в полинуклеотид, так чтобы создать группу дочерних полипептидов, в которых представлен полный диапазон одиночных аминокислотных замен в каждом аминокислотном положении (насыщающий мутагенез генных сайтов (О88М)). Используемые олигонуклеотиды состоят из следующих друг за другом первой гомологичной последовательности, вырожденной последовательности Ν,Ν,Ο/Т и, необязательно, второй гомологичной последовательности. Дочерние закодированные ниже продукты трансляции, полученные в результате использования таких олигонуклеотидов, включают все возможные аминокислотные изменения в каждом аминокислотном сайте вдоль полипептида, поскольку вырожденность последовательности Ν,Ν,Ο/Т включает кодоны для всех 20 аминокислот.
В одном из аспектов один такой вырожденный олигонуклеотид (содержащий одну вырожденную кассету Ν,Ν,Ο/Т) используют для того, чтобы подвергнуть каждый оригинальный кодон в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. В другом аспекте используют по меньшей мере две вырожденных кассеты Ν,Ν,Ο/Т - либо в одном и том же олигонуклеотиде, либо в разных, для того, чтобы подвергнуть по меньшей мере два оригинальных кодона в исходной полинуклеотидной матрице полному диапазону замен кодонов. Таким образом, в одном олигонуклеотиде может находиться более одной последовательности Ν,Ν,Ο/Т, чтобы ввести аминокислотные мутации в более чем одном участке. Несколько таких последовательностей Ν,Ν,Ο/Т могут непосредственно соседствовать или могут быть разделены одной или несколькими дополнительными нуклеотидными последовательностями. В другом аспекте олигонуклеотиды, пригодные для введения добавлений и делеций, могут быть использо- 48 021178 ваны либо отдельно, либо в сочетании с кодонами, содержащими последовательность ККС/Т, чтобы ввести любое сочетание или перетасовку аминокислотных добавлений, делеций и/или замен.
В одном из аспектов возможен одновременный мутагенез в двух или более следующих друг за другом положениях аминокислот с использованием олигонуклеотида, который содержит следующие друг за другом триплеты ККС/Т, т.е. вырожденную последовательность (ККС/Т)и.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению вырожденных кассет, имеющих меньшую вырожденность, чем последовательность ККС/Т. Например, в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета, содержащей только один N при этом указанный N может быть в первом, втором или третьем положении триплета. Любые другие основания, включая любые их сочетания и перестановки, можно использовать в остальных двух положениях триплета. Альтернативно в некоторых случаях может требоваться использование (например, в олигонуклеотиде) вырожденной последовательности триплета N,N,N или последовательности триплета N,N,0/0.
Однако понятно, что использование вырожденного триплета (такого как последовательность триплета ККС/Т или N,N,0/6), которое раскрыто в настоящем изобретении, имеет преимущества по нескольким причинам. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам систематичного и довольно простого получения замены полного диапазона возможных аминокислот (всего 20 аминокислот) во всех без исключения аминокислотных положениях в полипептиде. Таким образом, в случае полипептида длиной 100 аминокислот изобретение обеспечивает путь систематического и довольного простого создания 2000 разных видов (т.е. 20 возможных аминокислот на одно положение X 100 положений аминокислот). Понятно, что благодаря использованию олигонуклеотида, содержащего вырожденную последовательность триплета ККС/Т или ККС/С, получают 32 индивидуальных последовательности, которые кодируют 20 возможных природных аминокислот. Таким образом, в реакционном сосуде, в котором исходную полинуклеотидную последовательность подвергают насыщающему мутагенезу с использованием одного такого олигонуклеотида, создают 32 отдельных дочерних полинуклеотида, кодирующих 20 отдельных полипептидов. Напротив, использование невырожденного олигонуклеотида в сайт-специфичном мутагенезе приводит к образованию только одного дочернего полипептидного продукта в реакционном сосуде.
Настоящее изобретение также относится к применению невырожденных олигонуклеотидов, которые, необязательно, могут быть использованы в сочетании с описанными вырожденными праймерами. Понятно, что в некоторых ситуациях, предпочтительно, использование невырожденных олигонуклеотидов, чтобы создать специфичные точечные мутации в рабочем полинуклеотиде. Такой подход обеспечивает средство создания специфичных молчащих точечных мутаций, точечных мутаций, приводящих к соответствующим аминокислотным изменениям, и точечных мутаций, которые вызывают образование стоп-кодонов и соответствующую экспрессию фрагментов полипептида.
Таким образом, в одном из аспектов каждый реакционный сосуд для насыщающего мутагенеза содержит полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере 20 дочерних полипептидных молекул, таких что все 20 аминокислот представлены в одном конкретном положении аминокислоты, соответствующем положению кодона, подвергнутого мутагенезу в исходном полинуклеотиде. 32-кратные вырожденные дочерние полипептиды, созданные в каждом реакционном сосуде для насыщающего мутагенеза, могут быть подвергнуты клональной амплификации (например, клонированы в подходящем хозяине Е. соН, с использованием вектора экспрессии) и подвергнуты скринингу экспрессии. Когда при скрининге обнаруживают, что индивидуальный дочерний полипептид проявляет подходящее изменение свойства (по сравнению с исходным полипептидом), полипептид может быть секвенирован, чтобы идентифицировать имеющуюся в нем соответствующую благоприятную аминокислотную замену.
Понятно, что после мутагенеза всех без исключения положений аминокислот в исходном полипептиде с использованием насыщающего мутагенеза генных сайтов (С88М), который описан в настоящей публикации, благоприятные аминокислотные изменения могут быть идентифицированы в более чем одном аминокислотном положении. Могут быть созданы одна или несколько новых дочерних молекул, которые содержат сочетание всех или части таких благоприятных аминокислотных замен. Например, если идентифицированы 2 конкретных благоприятных аминокислотных изменения в каждом из 3 положений аминокислот в полипептиде, то перестановки включают 3 возможности в каждом положении (без изменения по сравнению с исходной аминокислотой и каждое из двух благоприятных изменений) и 3 положения. Таким образом, всего существует 3x3x3 или 27 возможностей, включая 7, которые были исследованы ранее - 6 одиночных точечных мутаций (т.е. 2 в каждом из трех положений) и без изменения в любом положении.
В еще одном аспекте насыщающий мутагенез генных сайтов можно применять в сочетании с перетасовкой, химеризацией, рекомбинацией и другими способами мутагенеза, вместе с использованием скрининга. Настоящее изобретение относится к применению любого способа(ов) мутагенеза, включая насыщающий мутагенез, многократно. В одном примере многократное применение любого способа(ов) мутагенеза используют в сочетании со скринингом.
Таким образом, в не ограничивающем примере полинуклеотиды и полипептиды по изобретению
- 49 021178 могут быть получены с применением насыщающего мутагенеза генных сайтов (ОЗЗМ) в сочетании с дополнительными способами мутагенеза, такими как способ, при котором два или более родственных полинуклеотида вводят в подходящую клетку-хозяина, так что образуется гибридный полинуклеотид в результате рекомбинации и редукционной пересортировки.
Кроме осуществления мутагенеза вдоль полной последовательности гена может быть использован мутагенез для замены каждого из любого количества оснований в полинуклеотидной последовательности, при этом количество оснований, подвергаемых мутагенезу, может быть любым целым числом от 15 до 100000. Таким образом, вместо мутагенеза каждого положения вдоль молекулы можно подвергать мутагенезу любое или определенное количество оснований (может быть группа, насчитывающая от 15 до 100000). Отдельный нуклеотид может быть использован для мутагенеза каждого положения или группы положений вдоль полинуклеотидной последовательности. Группой из 3 положений, подвергаемых мутагенезу, может быть кодон. Мутации могут быть введены с использованием мутагенного праймера, содержащего гетерологичную кассету, также называемую мутагенной кассетой. Примерные кассеты могут иметь от 1 до 500 оснований. В каждом положении нуклеотида в таких гетерологичных кассетах может быть Ν, А, С, О, Т, А/С, А/С, А/Т, С/С, С/Т, С/Т, С/С/Т, А/С/Т, А/С/Т, А/С/С или Е, где Е означает любое основание, которое не является А, С, С или Т (Е может быть назван конструирующим олигонуклеотидом).
В общем смысле насыщающий мутагенез заключается в мутагенезе полного набора мутагенных кассет (при этом каждая кассета может иметь длину примерно 1-500 оснований) в определенной подвергаемой мутагенезу полинуклеотидной последовательности (при этом последовательность, подвергаемая мутагенезу, может иметь длину примерно от 15 до 100000 оснований). Таким образом, группу мутаций (в диапазоне от 1 до 100 мутаций) вводят в каждую кассету, подвергаемую мутагенезу. Группа мутаций, вводимых в одну кассету, может отличаться или может быть такой же, как и вторая группа мутаций, вводимых во вторую кассету, во время использования одного раунда насыщающего мутагенеза. Примерами таких групп являются делеции, добавления, группировки конкретных кодонов и группировки конкретных нуклеотидных кассет.
Определенные последовательности, подвергаемые мутагенезу, включают целый ген, каскад генов, кДНК, полную открытую рамку считывания (ОРС) и полный промотор, энхансер, репрессор/трансактиватор, точку начала репликации, интрон, оператор или любую функциональную группу полинуклеотидов. В общем, определенные последовательности для такой цели могут представлять собой любой полинуклеотид, который является состоящей из 15 оснований полинуклеотидной последовательностью и полинуклеотидными последовательностями длиной от 15 оснований до 15000 оснований (в настоящем изобретении специально включено каждое целое число в указанном диапазоне). При выборе групп кодонов в рассмотрение включены типы аминокислот, кодируемых вырожденной мутагенной кассетой.
В одном из аспектов, имеющем отношение к группе мутаций, которые могут быть введены в мутагенную кассету, настоящее изобретение, в частности, относится к вырожденным заменам кодонов (с использованием вырожденных олигонуклеотидов), которые кодируют 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 аминокислот в каждом положении, и библиотеке полипептидов, кодируемых таким образом.
В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты по изобретению содержат ДНК, включая кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двунитевой или однонитевой, и в том случае, если они являются однонитевыми, они могут представлять собой кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую) нить. Альтернативно нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержать РНК.
Как обсуждается более подробно ниже, выделенные последовательности нуклеиновых кислот по изобретению можно применять для получения полипептидов по изобретению.
Соответственно, другой аспект изобретения относится к выделенной последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по изобретению. Последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать дополнительные кодирующие последовательности, такие как лидерные последовательности или последовательности пробелка, и некодирующие последовательности, такие как интроны или некодирующие последовательности, расположенные с 5'- и/или 3'-стороны от кодирующей последовательности. Таким образом, в используемом в настоящем описании смысле термин полинуклеотид, кодирующий полипептид охватывает полинуклеотид, который включает только кодирующую последовательность для полипептида, а также полинуклеотид, который содержит дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.
Альтернативно последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть подвергнуты мутагенезу с использованием обычных способов, таких как сайт-специфичный мутагенез, или других способов, известных специалистам в данной области, чтобы ввести молчащие изменения в полинуклеотид по изобретению. В используемом в настоящем описании смысле молчащие изменения включают, например, изменения, которые не меняют аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом. Такие изменения могут быть желательными для того, что повысить уровень полипептида, продуцируемого клетками-хозяевами, содержащими вектор, кодирующий полипептид, посредством введения кодонов или пар кодонов, которые часто встречаются в организме-хозяине.
- 50 021178
Изобретение также относится к полинуклеотидам, которые имеют нуклеотидные изменения, которые приводят к аминокислотным заменам, добавлениям, делециям, слияниям и укорочениям в полипептидах по изобретению. Такие нуклеотидные изменения могут быть введены с использованием таких способов, как сайт-специфичный мутагенез, случайный химический мутагенез, делецию экзонуклеазой III и другие способы рекомбинации ДНК.
При необходимости условия, которые позволяют зонду специфично гибридизоваться с комплементарными последовательностями, могут быть определены с помощью приведения зонда в контакт с комплементарными последовательностями из образца, который, как известно, содержит комплементарную последовательность, а также регуляторные последовательности, которые не содержат комплементарную последовательность. Условия гибридизации, такие как концентрация соли в буфере для гибридизации, концентрация формамида в буфере для гибридизации или температура гибридизации, можно варьировать, чтобы идентифицировать условия, которые позволяют зонду специфично гибридизоваться с комплементарными нуклеиновыми кислотами.
Если образец содержит организм, из которого выделена нуклеиновая кислота, то затем выявляют специфичную гибридизацию зонда. Гибридизация может быть выявлена благодаря мечению зонда детектируемым средством, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцирующий краситель или фермент, способный катализировать образование детектируемого продукта.
Множество способов использования меченых зондов для выявления присутствия комплементарных нуклеиновых кислот в образце известно специалистам в данной области. Такие способы включают Саузерн-блоты, Нозерн-блоты, способы гибридизации с колониями и дот-блоты. Протоколы каждого из указанных способов приведены в публикациях ΑикиЬе1 е1 а1., Сиггеи1 Рго1осо1к ш Мо1еси1аг В1о1оду, 1оЬи \УПеу 503 8оик, Шс. 1997 и 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1отид: Α ЬаЬога1огу Маииа1. 2б Еб., Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, 1989.
Альтернативно более одного зонда (по меньшей мере один из которых способен специфично гибридизоваться с любыми комплементарными последовательностями, которые присутствуют в образце нуклеиновой кислоты), можно использовать в реакции амплификации, чтобы определить, содержит ли образец организм, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению (например, организм, из которого нуклеиновая кислота была выделена). Обычно зонды содержат олигонуклеотиды. В одном из аспектов реакция амплификации может включать реакцию ПЦР. Протоколы ПЦР описаны Απ8υΒο1 и 8атЬгоок (смотри выше). Альтернативно амплификация может включать лигазную цепную реакцию, 38Р или реакцию с замещением цепи. (Смотри Вагаиу, Р., Лю Ыдаке Сбаш Реасбои т а РСР Vо^1б, РСР Мебюбк аиб Αррбсабоик 1:5-16, 1991; Е. Рабу е1 а1., 8е1Г-кик1а1иеб 8ециеисе Рербсабои (38Р): Αи бобюткб ^а^сирИои-Ьа^ Αтр1^йсабои 8ук1ет Μ^τ^ΐΝ 1о РСР, РСР Ме1бобк аиб Αрр1^сабоик 1:25-33, 1991; аиб \Уа1кег 6.Τ. е1 а1., 81гаиб О1кр1асетеи1 Αтр1^йсабои-аи бобюткб ш ν^1^о ΌΝΑ Αтр1^йсабои Τесби^^ие, №.1с1ею Αο6 Рекеагсб 20:1691-1696, 1992). В таких способах нуклеиновые кислоты в образце подвергают контакту с зондами, осуществляют реакцию амплификацию и выявляют какой-либо полученный в результате продукт амплификации. Продукт амплификации может быть выявлен благодаря осуществлению гель-элетрофореза продуктов реакции и окрашивания геля интеркалятором, таким как бромид этидия. Альтернативно, один или несколько зондов можно метить радиоактивным изотопом, и присутствие радиоактивного продукта амплификации можно выявить с помощью авторадиографии после гель-электрофореза.
Зонды, полученные из последовательностей, расположенных вблизи концов последовательности по изобретению, также можно использовать в способах прогулки по хромосомам, чтобы идентифицировать клоны, содержащие геномные последовательности, расположенные вблизи последовательностей нуклеиновой кислоты, которые указаны выше. Такие способы позволяют выделять гены, которые кодируют дополнительные белки, из организма-хозяина.
Последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению может быть использована в качестве зона для идентификации и выделения родственных нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах родственные нуклеиновые кислоты могут представлять собой кДНК или геномные ДНК из других организмов, отличных от организма, из которого выделена нуклеиновая кислота. Например, другие организмы могут быть родственными организмами. В таких способах образец нуклеиновой кислоты подвергают контакту с зондом в условиях, которые позволяют зонду специфично гибридизоваться с родственными последовательностями. Затем выявляют гибридизацию зонда с нуклеиновыми кислотами из родственного организма с использованием любых способов, описанных выше.
В реакциях гибридизации нуклеиновых кислот условия, используемые для достижения конкретного уровня жесткости, будут варьировать, в зависимости от природы нуклеиновых кислот, подвергаемых гибридизации. Например, при выборе условий гибридизации могут быть учтены длина, степень комплементарности, состав нуклеотидной последовательности (например, содержание СС и ΑΤ) и тип нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК) гибридизующихся областей нуклеиновых кислот. Дополнительно учитывают, иммобилизована ли одна из нуклеиновых кислот, например, на фильтре.
Гибридизация может быть осуществлена в условиях низкой жесткости, умеренной жесткости или высокой жесткости. В качестве примера гибридизации нуклеиновых кислот полимерную мембрану, со- 51 021178 держащую иммобилизованные денатурированные нуклеиновые кислоты, сначала предварительно гибридизуют в течение 30 мин при 45°С в растворе, содержащем 0,9 М №С1, 50 мМ ΝπΗ2Ρ04, рН 7,0, 5,0 мМ №ьЕОТА, 0,5% δΌδ, 10-кратный раствор Денхардта и 0,5 мг/мл полирибоадениловой кислоты. Затем к раствору добавляют меченый на конце 32Р олигонуклеотидный зонд, примерно 2х107 имп./мин (удельная активность 4-9х108 имп./мин/мкг). После 12-16-часовой инкубации мембрану промывают в течение 30 мин при комнатной температуре в 1Х δΕТ (150 мМ №С1, 20 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,8, 1 мМ №ьЕОТА), содержащем 0,5% δΌδ, с последующей 30-минутной промывкой в свежем 1Х δΕТ при Тт10°С для олигонуклеотидного зонда. Затем мембрану экспонируют с пленкой для авторадиографии для выявления сигналов гибридизации.
В результате варьирования жесткости условий гибридизации, используемых для идентификации нуклеиновых кислот, таких как кДНК или геномная ДНК, которые гибридизуются с детектируемым зондом, могут быть идентифицированы и выделены нуклеиновые кислоты, имеющие разные уровни гомологии с зондом. Жесткость можно варьировать, проводя гибридизацию при разных температурах ниже температур плавления зондов. Температура плавления, Тт, представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с полностью комплементарным зондом. Очень жесткие условия выбирают такими, чтобы температура была равна или была примерно на 5°С ниже, чем Тт для конкретного зонда. Температуру плавления зонда можно вычислить, используя следующие формулы: Для зондов длиной от 14 до 70 нуклеотидов температуру плавления (Тт) вычисляют, используя формулу: Тт = 81,5 + 16,6 (1од |Νη+]) + 0,41 (доля О+С) - (600/Ν), где N означает длину зонда. Если гибридизацию осуществляют в растворе, содержащем формамид, то температура плавления может быть вычислена с использованием уравнения: Тт = 81,5 + 16,6 (1од [№+]) + 0,41 (доля О+С) (0,63% формамида) - (600/Н), где N означает длину зонда. Предварительная гибридизация может быть осуществлена в 6-кратном 88С, 5-кратном реагенте Денхардта, 0,5% δΌδ, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося или в 6-кратном 88С, 5-кратном реагенте Денхардта, 0,5% δΌδ, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, 50% формамиде. Формулы для раствора δδС и раствора Денхардта модно найти, например, в публикации δатЬ^οοк е1 а1., (смотри выше).
Гибридизацию проводят, добавляя детектируемый зонд к растворам для предварительной гибридизации, указанным выше. Когда зонд содержит двунитевую ДНК, его денатурируют перед добавлением к раствору для гибридизации. Фильтр подвергают контакту с раствором для гибридизации в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить возможность для гибридизации зонда с кДНК или геномными ДНК, содержащими комплементарные ему последовательности или гомологичные последовательности. В случае зондов длиной более 200 нуклеотидов гибридизация может быть осуществлена при температуре на 15-25°С ниже чем Тт. В случае более коротких зондов, таких как олигонуклеотидные зонды, гибридизация может быть проведена при температуре на 5-10°С ниже чем Тт. Обычно в случае гибридизаций в 6-кратном δδС гибридизацию проводят примерно при 68°С. Обычно в случае гибридизаций в растворах, содержащих 50% формамида, гибридизацию проводят примерно при 42°С. Все описанные выше условия гибридизации считают условиями высокой жесткости.
После гибридизации фильтр промывают, чтобы удалить неспецифично связанный детектируемый зонд. Жесткость, используемая при промывке фильтров, также может варьировать в зависимости от природы нуклеиновых кислот, подвергаемых гибридизации, длины нуклеиновых кислот, подвергаемых гибридизации, степени комплементарности, состава нуклеотидной последовательности (например, содержание ОС по сравнению с АТ) и типа нуклеиновых кислот (например, РНК или ДНК) . Примерами промывок в условиях постепенно все более высокой жесткости являются следующие условия: 2Х 88С, 0,1% δΌδ при комнатной температуре в течение 15 мин (низкая жесткость); 0,1Х 88С, 0,5% δΌδ при комнатной температуре в течение от 30 мин до 1 ч (умеренная жесткость); 0,1Х 88С, 0,5% δΌδ в течение от 15 до 30 мин при температуре от температуры гибридизации до 68°С (высокая жесткость); и 0,15 М №С1 в течение 15 мин при 72°С (очень высокая жесткость). Конечная промывка в условиях низкой жесткости может быть проведена в 0,1Х δδС при комнатной температуре. Приведенные выше примеры являются только иллюстрациями одной группы условий, которые можно использовать для промывки фильтров. Специалисту в данной области может быть известно, что существуют многочисленные составы для промывок в условиях разной жесткости. Некоторые другие примеры приведены ниже.
Нуклеиновые кислоты, которые гибридизовались с зондом, можно идентифицировать с использованием авторадиографии или других обычных способов.
Описанный выше способ может быть модифицирован для идентификации нуклеиновых кислот, имеющих понижающиеся уровни гомологии с последовательностью зонда. Например, чтобы получить нуклеиновые кислоты с понижающейся гомологией с детектируемым зондом, можно использовать менее жесткие условия. Например, температуру гибридизации можно снижать шагами по 5°С от 68 до 42°С в буфере для гибридизации, имеющем концентрацию №+ примерно 1 М. После гибридизации фильтр можно промыть 2Х 88С, 0,5% δΌδ при температуре гибридизации. Такие условия считаются умеренными условиями, если температура выше 50°С, и условиями низкой жесткости, если температура ни- 52 021178 же 50°С. Конкретным примером умеренных условий гибридизации являются условия, когда указанную выше гибридизацию проводят при 55°С. Конкретным примером условий гибридизации низкой жесткости являются условия, когда указанную выше гибридизацию проводят при 45°С.
Альтернативно гибридизация может быть проведена в таких буферах, как 6Х §§С, содержащий формамид, при температуре 42°С. В данном случае концентрация формамида в буфере для гибридизации можно снижать с шагом в 5% от 50 до 0%, чтобы идентифицировать клоны, имеющие снижающиеся уровни гомологии с зондом. После гибридизации фильтр можно промыть в 6Х §§С, 0,5% δΌδ при 50°С. Такие условия считают умеренными условиями в случае концентрации формамида выше 25% и условиями низкой жесткости в случае концентрации формамида ниже 25%. Конкретным примером умеренных условий гибридизации являются условия, когда указанную выше гибридизацию проводят в присутствии 30% формамида. Конкретным примером условий гибридизации низкой жесткости являются условия, когда указанную выше гибридизацию проводят в присутствии 10% формамида.
Например, указанные выше способы можно использовать для выделения нуклеиновых кислот, имеющих последовательность по меньшей мере примерно на 99%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 80% гомологичную последовательности нуклеиновой кислоты §ЕЦ ГО N0:1, последовательностям, по существу ей идентичным, или фрагментам, содержащим по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 следующих друг за другом оснований такой последовательности, и последовательностям, комплементарным любой из указанных выше последовательностей. Гомология может быть измерена с использованием алгоритма выравнивания. Например, гомологичные полинуклеотиды могут иметь кодирующую последовательность, которая является природным аллельным вариантом одной из кодирующих последовательностей, описанных в настоящей публикации. Такие аллельные варианты могут иметь замену, делецию или добавление одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая указана в 8Е0 ГО N0:1, или с комплементарными ей последовательностями.
Дополнительно указанные выше способы можно использовать для выделения нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере примерно 99%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 70% гомологии с полипептидом, имеющим последовательность 8Е0 ГО N0:2, последовательности, по существу, ей идентичные, или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 следующих друг за другом аминокислот такой последовательности, которую определяют с использованием алгоритма выравнивания последовательностей (например, такие как алгоритм РА8ТА, версия 3.0ί78, с параметрами по умолчанию).
Другой аспект изобретения относится к выделенному или очищенному полипептиду, содержащему последовательность 8Е0 ГО N0:1, последовательности, по существу, идентичные указанной последовательности, или фрагменты, содержащие по меньшей мере примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 следующих друг за другом аминокислот такой последовательности. Как обсуждалось выше, такие полипептиды могут быть получены путем встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в вектор, так чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с последовательностью, способной управлять экспрессией кодируемого полипептида в подходящей клетке-хозяине. Например, вектор экспрессии может содержать промотор, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор также может включать подходящие последовательности для усиления экспрессии.
Промоторы, подходящие для экспрессии полипептида или его фрагмента в бактериях, включают промоторы 1ас и 1гр Е. той, промотор 1ас1, промотор 1ас2, промотор Т3, промотор Т7, промотор дрр промотор РК лямбда, промотор Ръ лямбда, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (РСК), и промотор кислой фосфатазы. Промоторы грибов включают промотор фактора V. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор СМV, промотор тимидинкиназы Ηδν, промоторы теплового шока, ранний и поздний промоторы δν40, ЬТК ретровирусов и промотор металлотионеина-Ι мыши. Также можно использовать другие промоторы, которые, как известно, контролируют экспрессии генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах.
Векторы экспрессии млекопитающих также могут содержать точку начала репликации, любые необходимый сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсинга и полиаденилирования δν40, можно использовать для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
Векторы для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках также могут содержать энхансеры, чтобы повысить уровни экспрессии. Энхансеры представляют собой цисдействующие элементы ДНК, обычно длиной примерно от 10 до примерно 300 п.н., которые действуют на промотор, увеличивая его транскрипцию. Примеры включают энхансер δν40, находящийся со сторо- 53 021178 ны поздних генов от начала репликации от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы, находящийся со стороны поздних генов от начала репликации, и энхансеры аденовирусов.
Кроме того, векторы экспрессии обычно содержат один или несколько селектируемых маркерных генов, чтобы обеспечить возможность селекции клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолатредуктазу, или гены, придающие резистентность к неомицину в случае культуры эукариотических клеток, гены, придающие резистентность к тетрациклину или ампициллину клеткам Е. сой, и ген ТКР1 8. сегеуыае.
Зонд ДНК, используемый для избирательного выделения представляющей интерес ДНК-мишени из ДНК, полученной по меньшей мере из одного микроорганизма, может представлять собой полноразмерную последовательность кодирующей области или частичную последовательность кодирующей области ДНК для фермента с известной активностью. Исходная библиотека ДНК может быть исследована с использованием смесей зондов, содержащих по меньшей мере часть последовательности ДНК, кодирующей фермент, обладающий конкретной ферментативной активностью. Такие зонды или библиотеки зондов могут быть однонитевыми, и ДНК микроорганизма, которую исследуют, может быть превращена в однонитевую форму. Подходящими зондами являются зонды, полученные из ДНК, кодирующей ферменты, обладающие активностью, сходной или идентичной с активностью конкретного фермента, который подвергают скринингу.
Зонд ДНК может иметь длину по меньшей мере примерно 10 оснований или по меньшей мере 15 оснований. В одном из аспектов полная кодирующая область может быть использована в качестве зонда. Условия для гибридизации, при которой ДНК-мишень избирательно выделяют с использованием по меньшей мере одного зонда ДНК, будут рассчитаны так, чтобы обеспечить жесткость гибридизации по меньшей мере примерно для 50% идентичности последовательностей, более предпочтительно, обеспечить жесткость для идентичности последовательностей по меньшей мере примерно 70%.
ДНК зонда может меченой одним партнером специфично связывающейся пары (т.е., лигандом), и другой партнер пары связывают с твердым матриксом для обеспечения простого отделения мишени от ее источника. Лиганд и партнер в специфичном связывании могут быть выбраны в любой ориентации из следующих пар: (1) антиген или гаптен и антитело или его специфично связывающий фрагмент; (2) биотин или иминобиотин и авидин или стрептавидин; (3) сахар и специфичный для сахара лектин; (4) фермент и его ингибитор; (5) апофермент и кофактор; (6) комплементарные гомополимерные олигонуклеотиды; и (7) гормон и его рецептор. Твердая фаза может быть выбрана из: (1) стеклянная или полимерная поверхность; (2) колонка, упакованная полимерными шариками; и (3) магнитные или парамагнитные частицы.
Подходящая последовательность ДНК может быть встроена в вектор различными способами. В общем, последовательность ДНК лигируют в требуемом положении в вектор после расщепления вставки и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Альтернативно могут быть лигированы тупые концы вставки и вектора. Различные способы клонирования описаны в публикациях АикиЬе1 е) а1., Сиггеп) Рго)осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬп ^йеу 503 8опк, 1пс. 1997 и 8атЬгоок е) а1., Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬога)огу Мапиа1. 2й Ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога)огу Ргекк, 1989. Описанные и другие способы входят в сферу деятельности специалистов в данной области.
Вектор может быть, например, в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, производные 8У40; бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, полученные в результате сочетаний плазмид и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как вирус осповакцины, аденовирус, поксвирус птиц и вирус псевдобешенства. Множество клонирующих векторов и векторов экспрессии, используемых в прокариотических и эукариотические хозяевах, описаны в публикации 8атЬгоок е) а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога)огу Мапиа1 8есопй Ейтоп, Со1й 8рппд НагЬог, ΝΥ., (1989).
Конкретные бактериальные векторы, которые можно использовать, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы, хорошо известного клонирующего вектора рВК322 (АТСС 37017), рКК223-3 (РЬагтата Рте СЬетка1к, Иррка1а, 8^ейеп), ОЕМ1 (Рготеда Вю)ес, Майкоп, ^1, И8А) рОЕ70, рЦЕ60, рЦЕ-9 (^адеп), рЭ10, рйХ174 рВ1иексйр) II К8, рМН8А, рМН16а, рМН18А, р\Н46А (8)га)адепе), рйс99а, рКК223-3, рКК233-3, рПК540, рК1Т5 (РЬагтата), рКК232-8 и рСМ7. Конкретные эукариотические векторы включают р8У2САТ, р0О44, рХТ1, р8О (8йа1адепе) р8УК3, рВРУ, рМ8О и р8УЪ (РЬагтата). Однако можно использовать любой другой вектор, при условии, что он реплицируется и является жизнеспособным в клетке-хозяине.
Клеткой-хозяином могут быть любые клетки-хозяева, известные специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. В качестве характерных примеров подходящих хозяев можно указать бактериальные клетки, такие как Е. сой, 8)гер)отусек, ВасЫик киЬййк, ВасЫик сегеик, 8а1топе11а 1ур1йтипит и различные виды родов Ркеийотопак, 8йер)отусек и 8)арЬу1ососсик, клетки грибов, такие как АкрегдЫик, дрожжи, такие как любой вид РюЫа, 8ассЬаготусек, 8сЫ/окассЬаготусек, 8сЬ\уапшотусек, включая РюЫа рак)опк, 8ассЬаготусек сегеуЫае или 8сЫ/окассЬаготусек ротЬе, клетки насекомых, такие как
- 54 021178
ОгокорНПа 82 и 8ройор!ега 8Г9, клетки животных, такие как СНО, СО8 или меланомы Боуэса, и аденовирусы. Выбор подходящего хозяина способны осуществить специалисты в данной области.
Вектор может быть введен в клетки-хозяева с использованием любого из множества способов, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, генную пушку или Т1опосредованный перенос генов. Конкретные способы включают трансфекцию с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную ОЕАЕ-декстраном, липофекцию или электропорацию ^пак, Ь., О|Ъпег, М., Вайеу, Ь, Вакк Ме!йойк ш Мо1еси1аг Вк1о§у, (1986)).
В соответствующем случае сконструированные клетки-хозяева можно культивировать в обычной питательной среде, модифицированной соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов по изобретению. После трансформации подходящей линии хозяина и выращивания линии хозяина до соответствующей плотности клеток выбранный промотор можно индуцировать подходящими способами (например, сдвигом температуры или посредством химической индукции), и клетки можно культивировать в течение дополнительного периода времени, чтобы обеспечить для них возможность продуцирования требуемого полипептида или его фрагмента.
Клетки обычно собирают центрифугированием, разрушают физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Клетки микроорганизмов, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены любым обычным способом, включая циклы замораживания-размораживания, обработку ультразвуком, механическое разрушение или использование средств для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент могут быть извлечены и очищены из культур рекомбинантных клеток разными способами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. При необходимости можно использовать стадии рефолдинга белка для получения полной конфигурации полипептида. При необходимости можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) на конечных стадиях очистки.
Для экспрессии рекомбинантного белка также можно использовать различные системы культивирования клеток млекопитающих. Примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии СО8-7 фибробластов почки обезьяны (описанные в Ο1иζтаη, Се11, 23: 175, 1981) и другие линии клеток, способные экспрессировать белки с совместимого вектора, такие как линии клеток С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК.
Конструкции в клетках-хозяевах можно использовать обычным способом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от используемого хозяина в способе получения рекомбинантов полипептиды, продуцируемые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или не гликозилированными. Полипептиды по изобретению также могут включать или не включать начальный остаток аминокислоты метионина. Дополнительные подробности, имеющие отношение к рекомбинантной экспрессии белков доступны специалистам в данной области. Например, в публикации Ргокш Ехргекыои: А Ргасйса1 Арргоасй (Ргасйса1 Арргоасй 8епек Ъу 8. I. Н1дд1пк (Еййог), В. Ό. Натек (Еййог) (Ли1у 1999) ОхГогй ипкегкйу Ргекк; 18В№ 0199636249 предложено подробное руководство для специалистов в данной области относительно экспрессии белков в широком множестве организмов.
Альтернативно полипептиды по изобретению могут быть получены синтетически с использованием обычных синтезаторов пептидов. В других аспектах фрагменты или части полипептидов могут быть использованы для получения соответствующего полноразмерного полипептида при синтезе пептида; следовательно, фрагменты могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов для получения полноразмерных полипептидов.
Как известно специалистам в данной области последовательности нуклеиновых кислот по изобретению могут быть оптимизированы для экспрессии в различных организмах. В одном из аспектов последовательности по изобретению оптимизируют в отношении использования кодонов в представляющем интерес организме, например грибах, таких как 8. сеге\ак1ае, или в бактерии, такой как Е. сой. Оптимизация последовательностей нуклеиновой кислоты в целях использования кодонов хорошо известна в данной области и относится к отбору конкретного кодона, который организм предпочитает для кодирования конкретной аминокислоты. Таблицы оптимизированного использования кодонов известны для многих организмов. Например, смотри ТгапкГег КЯА ш Ргокш 8уп!йек1к Ъу Эо1рй Ь. На!Пе1й, Вуеопд ί. Ьее, КоЪег! М. РиИе (Еййог) (1и1у 1992) СКС Ргекк; 18В№ 0849356989. Таким образом, изобретение также относится к нуклеиновым кислотам по изобретению, адаптированным в отношении использования кодонов организмом.
Оптимизированная экспрессия последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению также относится к направленному или случайному мутагенезу нуклеиновой кислоты для осуществления повышенной экспрессии кодируемого белка. Мутагенез нуклеиновых кислот по изобретению непосредственно или опосредованно обеспечивать повышенный выход экспрессированного белка. В качестве не ограничивающего примера способы мутагенеза, описанные в настоящей публикации, можно использовать
- 55 021178 для получения мутации 5'-нетранслируемой области, 3'-нетранслируемой области или кодирующей области нуклеиновой кислоты, мутации, результатом которой может быть повышенная стабильность на уровне РНК или белка, которая приводит к повышенному выходу белка.
Также могут быть использованы бесклеточные системы трансляции для получения полипептидов по изобретению с использованием мРНК, транскрибируемых с конструкции ДНК, содержащей промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкция ДНК может быть линеаризована перед проведением реакции трансляции ш у1Гго. Затем транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, чтобы получить требуемый полипептид или его фрагмент.
Изобретение также относится к вариантам полипептидов по изобретению. Термин вариант включает производные или аналоги таких полипептидов. В частности, варианты могут отличаться по аминокислотной последовательности от полипептидов по изобретению и последовательностей, по существу, им идентичным одной или несколькими заменами, добавлениями, делециями, слияниями и укорочениями, которые могут присутствовать в любом сочетании.
Варианты могут быть природными или созданными ш νίΙΐΌ. В частности, такие варианты могут быть созданы с использованием способов генетической инженерии, таких как сайт-специфичный мутагенез, случайный химический мутагенез, способы на основе создания делеций экзонуклеазой ΙΙΙ и стандартные способы клонирования. Альтернативно такие варианты, фрагменты, аналоги или производные могут быть созданы с использованием химического синтеза или способов модификации.
Другие способы получения вариантов также известны специалистам в данной области. К ним относятся способы, в которых последовательности нуклеиновых кислот, полученные из природных изолятов, модифицируют, чтобы создать нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды, обладающие свойствами, которые повышают их ценность при промышленном и лабораторном применении. В таких способах создают и характеризуют большое количество вариантов последовательности, имеющих одно или несколько отличий нуклеотидов от последовательности, полученной из природного изолята. Обычно такие различия в нуклеотидах приводят к аминокислотным изменениям по сравнению с полипептидами, кодируемыми нуклеиновыми кислотами из природных изолятов.
Например, варианты могут быть созданы с использованием склонной к ошибкам ПЦР. В случае склонной к ошибкам ПЦР реакцию ПЦР осуществляют в условиях, при которых точность копирования ДНК-полимеразой является низкой, так что получают высокий процент точечных мутаций вдоль всей длины продукта ПЦР. Склонная к ошибкам ПЦР описана в Реипд, О.А., еГ а1., ТесЬшдие, 1: 11-15, 1989) и Са1йете11, К. С. апй 1оусе О.Р., РСК МеГЬойк АррЬс, 2: 28-33, 1992. Коротко, в таких способах нуклеиновые кислоты, подвергаемые мутагенезу, смешивают с ПЦР-праймерами, буфером для реакции, МдС12, МпС12, Тад-полимеразой и йЫТР в соответствующей концентрации, чтобы добиться высокой доли точечных мутаций вдоль всей длины продукта ПЦР. Например, реакция может быть осуществлена с использованием 20 фмоль нуклеиновой кислоты, подвергаемой мутагенезу, 30 пмоль каждого ПЦРпраймера, буфера для реакции, содержащего 50 мМ КС1, 10 мМ трис-НС1 (рН 8,3) и 0,01% желатина, 7 мМ МдС12, 0,5 мМ МпС12, 5 единиц Тад-полимеразы, 0,2 мМ йОТР, 0,2 мМ йАТР, 1 мМ йСТР и 1 мМ йТТР. ПЦР может быть осуществлена с использованием 30 циклов: при 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин. Однако будет понятно, что такие параметры могут соответствующим образом варьировать. Подвергнутые мутагенезу нуклеиновые кислоты клонируют в подходящем векторе и оценивают активности полипептидов, кодируемых подвергнутыми мутагенезу нуклеиновыми кислотами.
Варианты также могут быть созданы с применением мутагенеза с использованием специфичных олигонуклеотидов, чтобы создать сайт-специфичные мутации в любой представляющей интерес клонированной ДНК. Мутагенез с использованием олигонуклеотидов описан в Ке1йЬааг-О1коп, 1Р. апй Заиег, К.Т.,еГ а1., Заепсе, 241: 53-57, 1988. Коротко, в таких способах синтезируют множество двунитевых олигонуклеотидов, несущих одну или несколько мутаций для введения в клонированную ДНК, и встраивают в клонированную ДНК, подвергаемую мутагенезу. Клоны, содержащие подвергнутую мутагенезу ДНК, извлекают и оценивают активности кодируемых ею полипептидов.
Другим способом создания вариантов является ПЦР-сборка. ПЦР-сборка заключается в сборке продукта ПЦР из смеси небольших фрагментов ДНК. Большое количество разных реакций ПЦР происходит параллельно в одном и том же флаконе, при этом продукты одной реакции праймируют продукты другой реакции. ПЦР-сборка описана в находящейся на рассмотрении заявке на выдачу патента США с регистрационным номером 08/677112, поданной 9 июля 1996, озаглавленной МеГЬойк ЭЫА ЗЬиГЯшд \νί11ι Ро1ушс1еоЬйек Ргойисей Ьу В1оскшд ог шГеггирГшд а ЗупГЬекк ог АтрЬйсаЬоп Ргосекк.
Еще одним способом создания вариантов является мутагенез на основе ПЦР, имитирующий половой процесс. В мутагенезе на основе ПЦР, имитирующем половой процесс, принудительная гомологичная рекомбинация происходит между молекулами ДНК с разными, но близкородственными последовательностями ДНК ш уйго в результате случайной фрагментации молекулы ДНК на основе гомологии последовательностей с последующей фиксацией кроссинговера посредством удлинения праймера в ре- 56 021178 акции ПЦР. Мутагенез на основе ПЦР, имитирующий половой процесс, описан в 81еттег, ^.Р., ΡNΑ8, и8А, 91: 10747-10751, 1994. Коротко, в таких способах множество нуклеиновых кислот, которые необходимо рекомбинировать, расщепляют ДНК-азой, чтобы создать фрагменты, имеющие средний размер 50-200 нуклеотидов. Фрагменты требуемого среднего размера очищают и ресуспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в условиях, которые облегчают рекомбинацию между фрагментами нуклеиновой кислоты. Например, ПЦР можно осуществлять посредством ресуспендирования очищенных фрагментов в концентрации 10-30 нг/л в растворе, содержащем 0,2 мМ каждого кNΤΡ, 2,2 мМ МдС12, 50 мМ КС1, 10 мМ трис-НС1, рН 9,0 и 0,1% тритон Х-100. Добавляют 2,5 единицы Тад-полимеразы на 100:1 реакционной смеси и ПЦР осуществляют, используя следующий режим: 94°С в течение 60 с, 94°С в течение 30 с, 50-55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с (30-45 раз) и 72°С в течение 5 мин. Однако будет понятно, что такие параметры можно соответствующим образом варьировать. В некоторых аспектах олигонуклеотиды могут быть включены в ПЦР-реакции. В других аспектах можно использовать фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I в первой группе ПЦР-реакций, и Тад-полимеразу можно использовать в последующей группе ПЦР-реакций. Рекомбинантные последовательности выделяют и оценивают активности полипептидов, которые они кодируют.
Варианты также можно создать посредством мутагенеза ш νί\Ό. В некоторых аспектах случайные мутации в представляющей интерес последовательности создают размножением представляющей интерес последовательности в бактериальном штамме, таком как штамм Е. сой, который несет мутации в одном или нескольких путях репарации ДНК. Такие мутаторные штаммы имеют более высокую частоту случайных мутаций, чем исходный штамм дикого типа. Размножение ДНК в одном из таких штаммов в конечном итоге будет генерировать случайные мутации в ДНК. Мутаторные штаммы, подходящие для использования для мутагенеза ш νί\Ό, описаны в публикации РСТ № \УО 91/16427, опубликованной 31 октября 1991, озаглавленной Ме!Ьокк £ог РЬепо!уре Сгеайоп £гот МиЙгр1е Сепе Рори1айопк.
Варианты также могут быть созданы с использованием кассетного мутагенеза. При кассетном мутагенезе небольшую область двунитевой молекулы ДНК реплицируют с синтетическим олигонуклеотидом кассетой, который отличается от нативной последовательность. Олигонуклеотид часто содержит полностью и/или частично рандомизированную нативную последовательность.
Рекурсивный множественный мутагенез также можно использовать для создания вариантов. Рекурсивный множественный мутагенез представляет собой алгоритм конструирования белка (мутагенез белков), разработанный для получения разнообразных популяций фенотипически родственных мутантов, представители которых отличаются по аминокислотной последовательности. В таком способе используют механизм обратной связи для регулирования последовательных раундов комбинаторного кассетного мутагенеза. Рекурсивный множественный мутагенез описан в Агкн1, А. Р. апк Уотли Ь.С., ΡNΑ8, и8А, 89: 7811-7815, 1992.
В некоторых аспектах варианты создают, используя экспоненциальный множественный мутагенез. Экспоненциальный множественный мутагенез представляет собой процесс для создания комбинаторных библиотек с высоким процентным содержанием уникальных и функциональных мутантов, при этом небольшие группы остатков параллельно рандомизируют, чтобы идентифицировать в каждом измененном положении аминокислоты, которые приводят к функциональным белкам. Экспоненциальный множественный мутагенез описан в Эекди-ке, 8. апк Уоиуап, Ό. С, Вю£есйпо1. Кек., 11: 1548-1552, 1993. Случайный и сайт-специфичный мутагенез описаны в Агпо1к, Р. Н., Сиггеп! Оршюп ш Вю!есйпо1оду, 4: 450-455, 1993.
В некоторых аспектах варианты создают, используя способы перетасовки, в которых части множества нуклеиновых кислот, которые кодируют отдельные полипептиды, сливают вместе, создавая химерные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют химерные полипептиды, как описано в находящейся на рассмотрении заявки на выдачу патента США с регистрационным номером 08/677112, поданной 9 июля 1996, озаглавленной Ме!Ьок о£ ЭХА 8Ьнй1тд №ЙЬ Ро1упис1еойкек Ргокисек Ьу В1оск1пд ог иНеггирйпд а 8уп!Ьек1К ог АтрНПсаПоп Ргосекк, и в находящейся на рассмотрении заявке на выдачу патента США с регистрационным номером 08/651568, поданной 22 мая 1996, озаглавленной СотЬтаЮпа1 Еп/уте □езШортет.
Варианты полипептидов по изобретению могут представлять собой варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептидов по изобретению заменяют консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (например, консервативным аминокислотным остатком), и такой используемый для замены аминокислотный остаток может быть остатком, кодируемым генетическим кодом, или может быть остатком, не кодируемым генетическим кодом.
Консервативными заменами являются замены, которые заменяют данную аминокислоту в полипептиде другой аминокислотой со сходными свойствами. Обычно консервативными считают следующее замены: замены алифатической аминокислотой, такой как А1а, Уа1, Ьеи и 11е, другой алифатической аминокислотой; замену 8ег аминокислотой ТЬг или наоборот; замену кислого остатка, такого как Акр и С1и, другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, такого как Акп и С1п, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка, такого как Ьук и Агд, другим основным остатком; и замену ароматического остатка, такого как РЬе, Туг, другим ароматическим остатком.
- 57 021178
Другими вариантами являются варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептидов по изобретению включают группу заместителя.
Другими вариантами являются варианты, в которых полипептид связан с другим соединением, таким как соединение для увеличения времени полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль).
Дополнительными вариантами являются варианты, в которых дополнительные аминокислоты сливают с полипептидом, таким как лидерная последовательность, секреторная последовательность, последовательность пробелка или последовательность, которая облегчает очистку, обогащение или стабилизацию полипептида. В некоторых аспектах производные и аналоги сохраняют такую же биологическую функцию или активность, как и полипептиды по изобретению, и могут включать пробелок, так что фрагмент, производное или аналог может быть активирован отщеплением части пробелка с получением активного полипептида.
Оптимизация кодонов для достижения высоких уровней экспрессии белка в клетках-хозяевах
Изобретение относится к способам модификации кодирующих фитазы нуклеиновых кислот с целью модификации использования кодонов. В одном из аспектов изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фитазу, чтобы повысить или понизить ее экспрессию в клетке-хозяине. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фитазу, модифицированным для увеличения их экспрессии в клетке-хозяине, модифицированным таким образом фитазным ферментам и к способам получения модифицированных фитазных ферментов. Способ включает идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в кодирующей фитазу нуклеиновой кислоте и замену одного или нескольких из таких непредпочтительных или менее предпочтительных кодонов предпочтительным кодоном, кодирующим такую же аминокислоту, что и замененный кодон, и по меньшей мере один непредпочтительный или менее предпочтительный кодон в нуклеиновой кислоте заменен предпочтительным кодоном, кодирующим такую же аминокислоту. Предпочтительным кодоном является кодон, присутствующий в избыточных количествах в кодирующих последовательностях в генах в клетке-хозяине, и непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном является кодон, который присутствует в недостаточном количестве в кодирующих последовательностях в генах в клетке-хозяине.
Клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновых кислот, кассет экспрессии и векторов по изобретению включают бактерии, дрожжи, грибы, клетки растений, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Таким образом, изобретение относится к способам оптимизации использования кодонов во всех указанных клетках, к нуклеиновым кислотам с измененными кодонами и полипептидам, полученным с использованием нуклеиновых кислот с измененными кодонами. Примеры клеток-хозяев включают грамотрицательные бактерии, такие как ЕксйейсЫа сой и Ркеиботопак Лиогексепк; грамположительные бактерии, такие как ЬасйоЬасШик даккеп, йасЮсосспк 1асйк, йасЮсосспк сгетойк, ВасШик киЬййк. Примеры клеток-хозяев также включают эукариотические организмы, например, различные дрожжи, такие как виды 8ассйаготусек, включая 8ассйаготусек сегеу1к1ае, 8с1и/окассНаготусек ротЬе, РюЫа ракЮпк и К1иууеготусек 1асйк, Напкепи1а ро1утогрйа, АкрегдШик тдег и клетки и линии клеток млекопитающих и клетки и линии клеток насекомых. Таким образом, изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и полипептидам, оптимизированным для экспрессии в таких организмах и видах.
Например, кодоны нуклеиновой кислоты, кодирующей фитазу, выделенной из бактериальной клетки, модифицируют таким образом, что нуклеиновая кислота оптимально экспрессируется в другой бактериальной клетке, отличной от бактерий, из которых получена фитаза, в дрожжах, грибах, растительной клетке, клетке насекомого или клетке млекопитающего. Способы оптимизации кодонов известны в данной области, смотри, например, патент США № 5795737; Васа (2000) Шй ί. Рагакйой 30: 113-118; На1е (1998) Ргойеш Ехрг. РштГ. 12: 185-188; Ыагит (2001) ШГесй 1ттит 69: 7250-7253. Смотри также публикацию Ыагит (2001) ШГесй 1ттип. 69: 7250-7253, в которой описана оптимизация кодонов в мышиных системах; публикацию ОйсНкоигоу (2002), Ргойеш Ехрг. РипГ. 24: 18-24, в которой описана оптимизация кодонов у дрожжей; публикацию Еепд (2000) Вюсйешшйу 39: 15399-15409, в которой описана оптимизация кодонов у Е. сой; публикацию Нитрйгеук (2000) Ргойеш Ехрг. РипГ. 20: 252-264, в которой описана оптимизация использования кодонов, которая влияет на секрецию у Е. сой.
Трансгенные животные, отличные от человека
Изобретение относится к трансгенным животным, отличным от человека, содержащим нуклеиновую кислоту, полипептид, кассету экспрессии или вектор или трансфицированную или трансформированную клетку по изобретению. Трансгенными животными, отличными от человека, могут быть, например, козы, кролики, овцы, свиньи, коровы, кролики и мыши, содержащие нуклеиновые кислоты по изобретению. Таких животных можно использовать, например, в качестве моделей Ш У1уо для исследования фитазной активности или в качестве моделей для скрининга модуляторов фитазной активности ηι У1уо. Кодирующие последовательности для полипептидов, которые необходимо экспрессировать в трансгенных животных, отличных от человека, могут быть сконструированы как конститутивные или под контролем тканеспецифичных, специфичных для стадии развития или индуцируемых факторов регуляции транскрипции. Трансгенные животные, отличные от человека, могут быть сконструированы и созданы с использованием любого способа, известного в данной области; смотри, например, патенты США №
- 58 021178
6211428, 6187992, 6156952, 6118044, 6111166, 6107541, 5959171, 5922854, 5892070, 5880327, 5891698, 5639940, 5573933, 5387742, 5087571, описывающие получение и применение трансформированных клеток и яйцеклеток и трансгенных мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и коров. Смотри также, например, публикацию Ро11оск (1999) 1. 1ттиио1. Мебюбк 231: 147-157, в которой описано получение рекомбинантных белков в молоке трансгенных молочных животных; публикацию Вадшк1 (1999) №1. Вю!есНио1. 17: 456-461, в которой описано получение трансгенных коз. В патенте США № 6211428 описано получение и применение трансгенных млекопитающих, отличных от человека, которые экспресоируют в своем головном мозге конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность ДНК. В патенте США № 5387742 описана инъекция клонированных рекомбинантных или синтетических последовательностей ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мышей, имплантация яйцеклеток, в которые осуществлена инъекция, псевдобеременным самкам, и выращивание с целью рождения трансгенных мышей, клетки которых экспрессируют белки, связанные с патологией болезни Альцгеймера. В патенте США № 6187992 описано получение и применение трансгенной мыши, геном которой содержит нарушение гена, кодирующего предшественник амилоидного белка (АРР).
Нокаутированных животных также можно использовать при практическом осуществлении способов по изобретению. Например, в одном из аспектов трансгенные или модифицированные животные по изобретению включают нокаутированного животного, например нокаутированную мышь, сконструированную так, чтобы она не экспрессировала или была неспособна экспрессировать фитазу.
В другом аспекте предлагаются трансгенные организмы, отличные от человека, которые содержат гетерологичную последовательность, кодирующую фитазу по изобретению (например, конкретно указанные модификации последовательности 8ЕО ГО N0:2). Можно использовать различные способы получения трансгенных животных по настоящему изобретению. В общем, можно использовать три таких способа. В одном таком способе эмбрион на стадии пронуклеуса (одноклеточный эмбрион) извлекают из организма самки и трансген микроинъецируют в эмбрион, и в таком случае трансген будет интегрирован в хромосому как в половых клетках, так и в соматических клетках полученного в результате взрослого животного. В другом таком способе выделяют эмбриональные стволовые клетки и вводят в них трансген с использованием электропорации, трансфекции плазмиды или микроинъекции, с последующим повторным введением стволовых клеток в эмбрион, где они осуществляют колонизацию и участвуют в образовании зародышевой линии. Способы микроинъекции для видов млекопитающих описаны в патенте США № 4873191.
В еще одном приведенном в качестве примера способе эмбриональные клетки инфицируют ретровирусом, содержащим трансген, при этом зародышевые клетки эмбриона содержат трансген, интегрированный в их хромосому. В том случае, когда животными, которых необходимо сделать трансгенными, являются птицы, из-за того, что оплодотворенные яйцеклетки птиц обычно проходят клеточное деление в течение первых двадцати часов в яйцеводе, микроинъекция в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки проблематична вследствие недоступности пронуклеуса. Таким образом, из всех способов получения трансгенных животных, в общем описанных выше, ретровирусная инфекция является предпочтительной для видов птиц, например, как описано в патенте США № 5162215. Однако если необходимо осуществить микроинъекцию видам птиц, можно использовать способ, опубликованный Ьоуе е! а1., (В1о1есНио1., 12, 1аи 1994), при этом эмбрион получают из умерщвленной курицы примерно через два с половиной часа после откладки предыдущего снесенного яйца, трансген микроинъецируют в цитоплазму зародышевого диска и эмбрион культивируют в оболочке хозяина вплоть до созревания. Когда животными, которых необходимо сделать трансгенными, являются коровы или свиньи, микроинъекциям может мешать непрозрачность яйцеклетки, которая затрудняет идентификацию ядра с помощью традиционной дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии. Чтобы преодолеть указанную проблему, яйцеклетки сначала можно центрифугировать, чтобы произошла сегрегация пронуклеусов для лучшей визуализации.
В одном из аспектов животные, отличные от человека по изобретению включают крупный рогатый скот, свиней, овец и птиц (например, корову, свинью, овцу, курицу). Трансгенных животных, отличных от человека по изобретению получают введением трансгенов в зародышевую линию животного, отличного от человека. Для введения трансгенов можно использовать эмбриональные клетки-мишени на разных стадиях развития. Используют разные способы, в зависимости от стадии развития эмбриональной клетки-мишени. Наилучшей мишенью для микроинъекции является зигота. Использование зигот в качестве мишени для переноса генов имеет основное преимущество, состоящее в том, что в большинстве случаев инъецированная ДНК будет включаться в геном хозяина перед первым делением (Вгшк!ег е! а1., Ргос. №б. Асаб. 8ск И8А 82: 4438-4442, 1985). Как следствие, все клетки трансгенного животного, отличного от человека, будут нести включенный трансген. В общем, это также будет отражаться на эффективном переносе трансгена потомкам исходного организма, так как 50% зародышевых клеток будут нести трансген.
В одном из аспектов термин трансгенное используют для описания животного, которое содержит экзогенный генетический материал во все своих клетках. Трансгенное животное может быть получено скрещиванием двух химерных животных, которые содержат экзогенный генетический материал в клет- 59 021178 ках, используемых для репродукции. Двадцать пять процентов полученного потомства будут трансгенными т.е., животными, которые содержат экзогенный генетический материал во всех своих клетках в обоих аллелях, 50% полученных животных будут содержать экзогенный генетический материал в одном аллеле, и 25% не будут содержать экзогенного генетического материала.
В одном из аспектов способ микроинъекции применяют при практическом осуществлении изобретения. Трансген отщепляют и очищают от векторной ДНК, например, с использованием гельэлектрофореза. В одном из аспектов трансген включает функционально связанный промотор, который взаимодействует с клеточными белками, вовлеченными в транскрипцию, в конечном счете приводя к конститутивной экспрессии. Применимые для этого промоторы включают промоторы цитомегаловируса (СМУ), вируса лейкоза Молони (МЬУ) и вируса герпеса, а также промоторы генов, кодирующих металлотионеин, актин скелетных мышц, Р-енолпируваткарбоксилазу (РЕРСК), фосфоглицерат (РΟΚ), ЭНРК и тимидинкиназу. Также можно использовать промоторы длинных концевых повторов (ЬТК) вирусов, таких как вирус саркомы Рауса. Когда необходимо получить трансгенных животных, которые являются птицами, предпочтительные промоторы могут включать промоторы гена β-глобина кур, гена лизосом кур и вируса лейкоза птиц. В конструкциях, применимых для трансфекции плазмидами эмбриональных стволовых клеток, могут быть использованы дополнительные регуляторные элементы, хорошо известные в данной области, такие как энхансерные элементы для стимуляции транскрипции, акцепторы сплайсинга, сигналы терминации и полиаденилирования и сайты связывания рибосом для осуществления трансляции.
Также можно использовать ретровирусную инфекцию, чтобы ввести трансген животному, отличному от человека, как описано выше. Развивающийся эмбрион животного, отличного от человека можно культивировать ш уйго до стадии бластоциста. В течение этого времени бластомеры могут быть мишенями для ретровирусной инфекции (1аешсй, К., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. 8б. И8А 73: 1260-1264, 1976) . Эффективную инфекцию бластомеров получают посредством ферментативной обработки для удаления /опа ре11ис1ба (Нодап, е! а1. (1986), Машри1а!шд !1е Мойке ЕтЪгуо. Со1б 8ргтд НагЪог ЬаЪога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЪог, Ν.Υ.). Вирусная векторная система для введения трансгена обычно представляет собой дефектный по репликации ретровирус, несущий трансген Оайпег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А 82: 6927-6931, 1985; Уап бег Рийеп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с! И8А 82: 6148-6152, 1985). Трансфекцию легко и эффективно осуществляют, используя культивирование бластомеров на монослое продуцирующих вирус клеток (Уап бег Ри!!еп, выше; 81е\уаП е! а1., ЕМВО 1. 6: 383-388, 1987). Альтернативно инфекция может быть осуществлена на более поздней стадии. Вирус или продуцирующие вирус клетки могут быть инъецированы в бластоцель (Ό. 1а1тег е! а1., №!иге 298: 623-628, 1982). Большинство организмовоснователей будут мозаичными в отношении трансгена, так как включение происходит только в подгруппу клеток, из которых состоит организм трансгенного животного, отличного от человека. Кроме того, организм-основатель может содержать различные ретровирусные инсерции трансгена в разных положениях в геноме, которые, как правило, будут сегрегировать в потомстве. Кроме того, также можно ввести трансгены в зародышевую линию, хотя и с меньшей эффективностью, посредством внутриматочной ретровирусной инфекции эмбриона в середине периода беременности (Ό. 1а1тег е! а1., выше).
Третьим типом клетки-мишени для введения трансгена является эмбриональная стволовая клетка (Е8). Е8-клетки получают из предимплантационных эмбрионов, культивируемых ίΐ'ΐ уйго и слитых с эмбрионами (М. 1. Еνаи5 е! а1., №!иге 292:154-156, 1981; М. О. Вгаб1еу е! а1., №!иге 309:255-258, 1984; Οο551ег, е! а1., Ргос. №й1. Асаб. 8ск И8А 83:9065-9069, 1986; апб КоЪегйоп е! а1., №!иге 322:445-448, 1986). Трансгены могут быть эффективно введены в Е8-клетки в результате ДНК-трансфекции или в результате опосредованной ретровирусами трансдукции. Такие трансформированные Е8-клетки затем можно объединять с бластоцистами животного, отличного от человека. Затем Е8-клетки колонизируют эмбрион и участвуют в образовании зародышевой линии полученного в результате химерного животного (обзор смотри в 1аешксЬ, К., 8с1епсе 240: 1468-1474, 1988).
В одном из аспектов трансформированная означает клетку, в которую (или в предшественник которой) с помощью методики рекомбинантных нуклеиновых кислот введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Гетерологичная относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая либо получена из другого вида, либо модифицирована, исходя из любой ее исходной формы или формы, главным образом, экспрессируемой в клетке.
В одном из аспектов трансген означает любой участок ДНК, который искусственно встраивают в клетку и который становится частью генома организма (т.е., либо в виде стабильно интегрированного, либо в виде стабильного внехромосомного элемента), который развивается из такой клетки. Таким трансгеном может быть ген, который частично или полностью гетерологичен (т.е. является чужеродным) для трансгенного организма, или может представлять собой ген, гомологичный эндогенному гену организма. Такое определение включает трансген, созданный благодаря получению последовательности РНК, которую транскрибируют в ДНК и затем включают в геном. Трансгены по изобретению включают последовательности ДНК, которые кодируют фитазы или полипептиды, обладающие фитазной активностью, и включают полинуклеотиды, которые могут быть экспрессированы в организме трансгенного животного, отличного от человека. Термин трансгенный в используемом в настоящем описании смысле,
- 60 021178 кроме того, подразумевает любой организм, геном которого был изменен в результате в результате обработки ίίί ν^ι^о эмбриона на ранней стадии или оплодотворенной яйцеклетки или с использованием любой методики получения трансгенных организмов, позволяющей вводить нокаут конкретного гена. Термин нокаут гена в используемом в настоящем описании смысле относится к целенаправленному нарушению гена ίΐ'ΐ νί\Ό с полной утратой функции, которое осуществляют любым способом трансгенеза, известным специалистам в данной области. В одном из аспектов трансгенными животными, имеющими нокауты генов, являются животные, у которых ген-мишень был приведен в нефункциональное состояние в результате инсерции, направленной на ген, который необходимо сделать нефункциональным посредством гомологичной рекомбинации.
В одном из аспектов термин трансгенный подразумевает использование любой методики трансгенеза, известной специалистам в данной области, с помощью которой можно получить организм, несущий введенный трансген, или организм, в котором эндогенный ген был сделан нефункциональным или нокаутированным.
Трансген, используемый при практическом осуществлении настоящего изобретения, представляет собой последовательность ДНК, содержащую последовательность, кодирующую фитазу или полипептид, обладающий фитазной активностью. В одном из аспектов полинуклеотид, имеющий последовательность ЗЕО ГО N0:1, или последовательность, кодирующую полипептид, имеющий последовательность ЗЕО ГО N0:2, является трансгеном в соответствии с термином, определенным в настоящем описании. В соответствующих случаях последовательности ДНК, которые кодируют белки, обладающие фитазной активностью, но отличающиеся по последовательности нуклеиновой кислоты вследствие вырожденности генетического кода, также могут быть использованы в настоящем изобретении и могут представлять собой укороченные формы, аллельные варианты и межвидовые гомологи.
В одном из аспектов после микроинъекции эмбриона, колонизации трансфицированными эмбриональными стволовыми клетками или инфекции ретровирусом, содержащим трансген (за исключением использования настоящего изобретения на практике по отношению к видам птиц, о чем упоминается в настоящем описании), эмбрион имплантируют в яйцевод псевдобеременной самки. Полученное потомство исследуют в отношении включения трансгена в Саузерн-блот-анализе образцов крови или ткани, используя специфичные для трансгена зонды. В этом отношении особенно применима ПЦР. Позитивное потомство (С0) скрещивают, получая потомство (С1), которое анализируют в отношении экспрессии трансгена, используя Нозерн-блот-анализ образцов ткани.
В одном из аспектов способы включают увеличение поглощения фосфора у трансгенного животного и/или уменьшение количества загрязнителя в помете трансгенного организма примерно на 15%, примерно на 20% или примерно от 20% до примерно 50% или больше.
В одном из аспектов животными, которые предполагают использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, являются животные, обычно считаемые домашними животными, включая комнатных животных (например, собак, кошек, виды птиц и т.д.), и животные, применяемые для получения пищевых продуктов, т.е., птицы, такие как разводимые для получения мяса и яйценосные куры и индейки, овцы, такие как ягнята, коровы, такие как коровы мясных пород и молочных пород, рыбы и свиньи. В одном из аспектов таких животных называют трансгенными, когда такое животное имеет гетерологичную последовательность ДНК или одну или несколько дополнительных последовательностей ДНК, обычно эндогенных для животного (вместе называемых трансгенами), интегрированные в хромосомы в зародышевых клетках животного. Трансгенное животное (включая его потомство) также будет иметь трансген, случайно интегрированный с хромосомы соматических клеток.
Способы скрининга и устройства мониторинга в режиме онлайн
При практическом осуществлении способов по изобретению можно использовать множество устройств и способов, наряду с полипептидами и нуклеиновыми кислотами по изобретению, например, для скрининга полипептидов в отношении фитазной активности, для скрининга соединений в качестве потенциальных модуляторов активности (например, усиление или ингибирование ферментативной активности), в отношении антител, которые связываются с полипептидом по изобретению, в отношении нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой по изобретению, и тому подобное.
Твердые подложки для иммобилизации ферментов
Фитазные ферменты, их фрагменты и нуклеиновые кислоты, которые кодируют ферменты и фрагменты, могут быть фиксированы на твердой подложке. Такой способ часто является экономичным и эффективным при применении фитазы в процессах производства. Например, объединение или смесь фитазных ферментов (или их активных фрагментов), которые используют в конкретной химической реакции, можно прикрепить к твердой подложке и опустить в технологическую емкость. Может происходить ферментативная реакция. Затем твердую подложку можно вынуть из емкости вместе с фиксированными на ней ферментами для повторного использования. В одном варианте осуществления изобретения выделенную нуклеиновую кислоту по изобретению фиксируют на твердой подложке. В другом варианте по изобретению твердую подложку выбирают из группы, состоящей из геля, смолы, полимера, керамики, стекла, микроэлектрода и любого их сочетания.
Например, твердые подложки, применимые в настоящем изобретении, включают гели. Некоторые
- 61 021178 примеры гелей включают сефарозу, желатин, глутаральдегид, обработанный хитозаном глутаральдегид, альбумин-глутаральдегид, хитозан-ксантан, гель Тоуореаг1 (полимерный гель), альгинат, альгинатполилизин, каррагенан, агарозу, глиоксилагарозу, магнитную агарозу, декстран-агарозу, поли(карбамоилсульфонатный) гидрогель, БСА-ПЭГ-гидрогель, фосфорилированный поливиниловый спирт (РУА), моноаминоэтил-Ы-аминоэтил (МАКА), амино- или любое их сочетание.
Другими твердыми подложками, используемыми в настоящем изобретении, являются смолы или полимеры. Некоторые примеры смол или полимеров включают целлюлозу, акриламид, нейлон, вискозу, сложный полиэфир, анионообменную смолу, АМВЕКЫТЕ™ ХАЭ-7, АМВЕКЫТЕ™ ХАЭ-8, АМВЕКЫТЕ™ 1КА-94, АМВЕКЫТЕ™ 1КС-50, поливинил, полиакрилат, полиметакрилат или любое их сочетание. Другим типом твердой подложки, используемой в настоящем изобретении, является керамика. Некоторые примеры включают непористую керамику, пористую керамику, δΏ^ А12О3. Другим типом твердой подложки, используемой в настоящем изобретении, является стекло. Некоторые примеры включают непористое стекло, пористое стекло, аминопропил-стекло или любое их сочетание. Другим типом твердой подложки, которую можно использовать, является микроэлектрод. Примером является покрытый полиэтиленимином магнетит. В качестве твердой подложки можно использовать графитовые частицы. Другим примером твердой подложки является клетка, такая как эритроцит.
Способы иммобилизации
Существует много способов, которые могут быть известны специалисту в данной области, для иммобилизации ферментов или их фрагментов или нуклеиновых кислот на твердой подложке. Некоторые примеры таких способов включают, например, электростатическую генерацию капель, электрохимические средства, адсорбцию, ковалентное связывание, поперечные сшивки, химическую реакцию или процесс, инкапсулирование, улавливание, использование альгината кальция или использование поли(2гидроксиэтилметакрилата). Подобные способы описаны в Ме!Ьобк ш Еи/утоШду, ПптоЫП/еб Еи/утек аиб Се11к, Рай С. 1987. Асабетю Ргекк. Ебйеб Ьу δ. Р. Со1о\\юк аиб Ν. О. Кар1аи. Уо1ите 136; аиб ЕптоЫП/аПои оГ Еи/утек аиб Се11к. 1997. Нитаиа Ргекк. Ебйеб Ьу Ο. Р. Вюкегк!а£Г. δе^^ек: Ме!Ьобк ш Вю!есЬио1оду, Ебйеб Ьу I. М. \Уа1кег.
Капиллярные матрицы
Капиллярные матрицы, такие как ΟIΟΑМΑТКIX™, ОРегка Согрогабои, δаη О|едо, СА, можно использовать в способах по изобретению. Нуклеиновые кислоты или полипептиды по изобретению могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу, включая капиллярные матрицы. Матрицы можно использовать для скрининга или проверки библиотек композиций (например, малых молекул, антитела, нуклеиновых кислот и т.д.) в отношении их способности связывать или модулировать активность нуклеиновой кислоты или полипептида по изобретению. Капиллярные матрицы обеспечивают другую систему удерживания и скрининга образцов. Например, устройство для скрининга образцов может включать множество капилляров, сформированных в виде матрицы из расположенных рядом капилляров, при этом каждый капилляр имеет по меньшей мере одну стенку, определяющую границы просвета для удерживаемого образца. Устройство может дополнительно содержать промежуточный материал, расположенный между соседними капиллярами в матрице, и один или несколько справочных указателей, находящихся в промежуточном материале. Капилляр для скрининга образца, в том случае, когда капилляр приспособлен для того, чтобы он был связан в матрице из капилляров, может иметь первую стенку, определяющую границы просвета для удерживания образца, и вторую стенку, образованную из фильтрующего материала, для фильтрации энергии возбуждения, подаваемой в просвет для возбуждения образца.
Полипептид или нуклеиновую кислоту, например лиганд, можно ввести в первый компонент по меньшей мере в часть капилляра капиллярной матрицы. Каждый капилляр капиллярной матрицы может иметь по меньшей мере одну стенку, определяющую границы просвета для удерживания первого компонента. После первого компонента в капилляр может быть введен пузырь воздуха. Второй компонент может быть введен в капилляр, при этом второй компонент отделен от первого компонента пузырьком воздуха. Представляющий интерес образец может быть введен в виде первой жидкости, меченой детектируемой частицей, в капилляр капиллярной матрицы, при этом каждый капилляр капиллярной матрицы имеет по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для удерживания первой жидкости и детектируемой частицы, и при этом по меньшей мере одна стенка покрыта связывающим материалом для связывания детектируемой частицы по меньшей мере с одной стенкой. Способ дополнительно может включать удаление первой жидкости из капиллярной трубки, при этом связанная детектируемая частица удерживается в капилляре, и введение второй жидкости в капиллярную трубку.
Капиллярная матрица может содержать множество отдельных капилляров, имеющих по меньшей мере одну внешнюю стенку, определяющую границы просвета. Внешняя стенка капилляра может представлять собой одну или несколько стенок, слитых вместе. Подобным образом, стенка может определять границы просвета, который имеет цилиндрическую, квадратную, гексагональную или любую другую геометрическую форму, при условии, что стенки формируют просвет для удерживания жидкости или образца. Капилляры капиллярной матрицы могут удерживаться вместе в непосредственной близости с образованием плоскостной структуры. Капилляры могут быть связаны вместе, будучи слиты (например,
- 62 021178 когда капилляры сделаны из стекла), склеены, связаны или скреплены бок о бок. Капиллярная матрица может быть образована из любого количества отдельных капилляров, например, в диапазоне от 100 до 4000000 капилляров. Капиллярная матрица может образовывать планшет для микротитрования, имеющий примерно 100000 или больше отдельных капилляров, соединенных вместе.
Матрицы или биочипы
Нуклеиновые кислоты или полипептиды по изобретению могут быть иммобилизованы или нанесены на матрицу. Матрицы могут быть использованы для скрининга или проверки библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.д.) в отношении их способности связывать или модулировать активность нуклеиновой кислоты или полипептида по изобретению. Например, в одном из аспектов по изобретению контролируемым параметром является экспрессия транскрипта гена фитазы. Один или несколько или все транскрипты клетки можно измерить посредством гибридизации образца, содержащего транскрипты клетки или нуклеиновые кислоты, представляющие или комплементарные транскриптам клетки, посредством гибридизации с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице или биочипе. С использованием матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе одновременно можно количественно оценить некоторые или все транскрипты клетки. Альтернативно, матрицы, содержащие геномную нуклеиновую кислоту, также можно использовать для определения генотипа вновь сконструированного штамма, полученного способами по изобретению. Полипептидные матрицы также можно использовать для одновременной количественной оценки множества белков.
В альтернативных аспектах матрицы или микроматрицы или биочипы или чипы по изобретению содержат множество элементов-мишеней в дополнение к нуклеиновой кислоте и/или полипептиду или пептиду по изобретению; каждый элемент-мишень может содержать определенно количество одного или нескольких полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной области поверхности подложки, как обсуждается более подробно ниже.
Настоящее изобретение может быть осуществлено на практике с использованием любой известной матрицы, также называемой микроматрицей или матрицей нуклеиновых кислот или матрицей полипептидов или матрицей антител или биочипом, или их варианта. Матрицы, в общем, представляют собой множество пятен или элементов-мишеней, при этом каждый элемент-мишень содержит определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например, олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности подложки для специфичного связывания с молекулой образца, например, транскриптами мРНК.
При практическом осуществлении способов по изобретению можно применять любую известную матрицу и/или способ получения и применения матриц целиком или частично, или их варианты, которые описаны, например, в патентах США № 6277628, 6277489, 6261776, 6258606, 6054270, 6048695, 6045996, 6022963, 6013440, 5965452, 5959098, 5856174, 5830645, 5770456, 5632957, 5556752, 5143854, 5807522, 5800992, 5744305, 5700637, 5556752, 5434049, смотри также, например, ν0 99/51773, ν0 99/09217, ν0 97/46313, ν0 96/17958, смотри также, например, 1оби81ои (1998) Сигг. Вю1. 8:Р171-Р174; 8сЬиттег (1997) ВЮесЬшсщек 23:1087-1092; Кет (1997) ВюЮсЬшсщек 23:120-124; 8о1^ηак-Τо1бо (1997) Сеиек, Сбготокотек & Саисег 20:399-407; Во\\1е11 (1999) №Лиге Сеиебск 8ирр. 21:25-32. Смотри также опубликованные заявки на выдачу патента США № 20010018642, 20010019827, 20010016322, 20010014449, 20010014448,20010012537,20010008765.
Полипептиды и пептиды
Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным полипептидам, имеющим аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности 8ЕЦ ГО Ν0:2, и содержащую по меньшей мере одну из мутаций, указанных в таблице 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание. Изобретение, кроме того, относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности 8ЕЦ ГО Ν0:2, и содержащую по меньшей мере одну из мутаций, указанных в таблице 4, 5, 6, 7, 9, или любое их сочетание. Для справки, синтетически созданная исходная последовательность 8ЕЦ ГО Ν0:2 представляет собой последовательность:
- 63 021178
Ме! Ьуз А1а Пе Ьеи Пе Рго РЬе Ьеи 8ег Ьеи Ьеи Не Рго Ьеи ТЬг 15 10 15
Рго О1п Зег А1а РЬе А1а С1п 8ег О1и Рго С1и Ьеи Ьуз Ьеи О1и Зег
25 30
Уа1 Уа1 Пе Уа1 Зег Агд Шз С1у Уа1 Агд А1а Рго ТЬг Ьуз А1а ТЬг
40 45
О1п Ьеи Ме! С1п Азр Уа1 ТЬг Рго Азр А1а Тгр Рго ТЬг Тгр Рго Уа1
55 60
Ьуз Ьеи С1у О1и Ьеи ТЬг Рго Агд С1у С1у С1и Ьеи Не А1а Туг Ьеи 65 70 75 80
С1у Шз Туг Тгр Агд О1п Агд Ьеи Уа1 А1а Азр О1у Ьеи Ьеи Рго Ьуз
90 95
Суз О1у Суз Рго С1п Зег С1у С1п Уа1 А1а Не Не А1а Азр Уа1 Азр
100 105 110
О1и Агд ТЬг Агд Ьуз ТЬг С1у О1и А1а РЬе А1а А1а С1у Ьеи А1а Рго
115 120 125
Азр Суз А1а Не ТЬг Уа1 Шз ТЬг О1п А1а Азр ТЬг Зег Зег Рго Азр
130 135 140
Рго Ьеи РЬе Азп Рго Ьеи Ьуз ТЬг О1у Уа1 Суз О1п Ьеи Азр Азп А1а 145 150 155 160
Азп Уа1 ТЬг Азр А1а Пе Ьеи О1и Агд А1а О1у С1у Зег Не А1а Азр
165 170 175
РЬе ТЬг О1у Шз Туг О1п ТЬг А1а РЬе Агд О1и Ьеи О1и Агд Уа1 Ьеи
180 185 190
Азп РЬе Рго С1п Зег Азп Ьеи Суз Ьеи Ьуз Агд С1и Ьуз С1п Азр О1и 195 200 205
Зег Суз Зег Ьеи ТЬг О1п А1а Ьеи Рго Зег С1и Ьеи Ьуз Уа1 Зег А1а 210 215 220
Азр Суз Уа1 Зег Ьеи ТЬг О1у А1а Уа1 Зег Ьеи А1а Зег Ме! Ьеи ТЬг 225 230 235 240
О1и Пе РЬе Ьеи Ьеи С1п С1п А1а О1п О1у Ме! Рго О1и Рго С1у Тгр
245 250 255
С1у Агд Пе ТЬг Азр Зег ΗΪ5 О1п Тгр Азп ТЬг Ьеи Ьеи Зег Ьеи Шз
260 265 270
Азп А1а С1п РЬе Азр Ьеи Ьеи О1п Агд ТЬг Рго С1и Уа1 А1а Агд Зет
275 280 285
Агд А1а ТЬг Рго Ьеи Ьеи Азр Ьеи Пе Ьуз ТЬг А1а Ьеи ТЬг Рго Шз
290 295 300
Рго Рго С1п Ьуз О1п А1а Туг С1у Уа1 ТЬг Ьеи Рго ТЬг Зег Уа1 Ьеи 305 310 315 320
РЬе Пе А1а С1у Шз Азр ТЬг Азп Ьеи А1а Азп Ьеи С1у С1у А1а Ьеи
325 330 335
О1и Ьеи Азп Тгр ТЬг Ьеи Рго С1у (31п Рго Азр Азп ТЬг Рго Рго С1у
340 345 350
С1у О1и Ьеи Уа1 РЬе С1и Агд Тгр Агд Агд Ьеи Зег Азр Азп Зег С1п
355 360 365
Тгр Пе О1п Уа1 Зег Ьеи Уа1 РЬе О1п ТЬг Ьеи О1п С1п Ме! Агд Азр
370 375 380
Ьуз ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Азп ТЬг Рго Рго С1у С1и Уа1 Ьуз Ьеи ТЬг 385 390 395 400
Ьеи А1а О1у Суз С1и С1и Агд Азп А1а О1п О1у Ме! Суз Зег Ьеи А1а
405 410 415
О1у РЬе ТЬг С1п Пе Уа1 Азп С1и А1а Агд Не Рго А1а Суз Зег Ьеи
420 425 430
Последовательность исходной фитазы ЗЕС) ΙΌ N0:2, кодируемой, например, последовательностью ЗЕС) ΙΌ N0:1, в которой указаны созданные с использованием насыщающего мутагенеза генных сайтов (СЗЗМ) модификации последовательности, выбранные из конструкции библиотеки СепеКеаккетЫу™, как описано в примере 1, показана на фиг. 4. Исходную последовательность фитазы ЗЕС) ΙΌ N0:2, кодируемую, например, последовательностью ЗЕС) ΙΌ N0:1, подвергали дополнительным модификациям последовательностей с использованием насыщающего мутагенеза генных сайтов (СЗЗМ), сайтспецифичного мутагенеза (ЗГ)М) и конструирования библиотеки ТМСА, как описано в примере 2.
В одном из аспектов полипептид и пептиды по изобретению обладают фитазной активностью. В альтернативных аспектах они также могут быть применимы, например, в качестве зондов для мечения, антигенов, толерагенов, мотивов, активных участков фитазы.
В альтернативных аспектах полипептиды и пептиды по изобретению являются синтетическими или
- 64 021178 созданными на основе рекомбинации полипептидами. Пептиды и белки можно рекомбинантно экспрессировать ш уйго или ш У1уо. Пептиды и полипептиды по изобретению могут быть получены и выделены с использованием любого способа, известного в данной области. Полипептид и пептиды по изобретению также могут быть синтезированы, целиком или частично, с использованием химических способов, хорошо известных в данной области. Смотри, например, СагиШегз (1980) №с1ею Аибз Яез. δутр. δе^. 215223; Нот (1980) ШсШс Аабз Яез. δутр. δе^. 225-232; Вапда, А.К., ТЬегареийс Рерйбез апб РгоЮтз, Рогти1аЬоп, Ргосеззшд апб ОеПуегу δу8ΐет8 (1995) ТесНпотю РиЬБзЬтд Со., Б-апсазЮг, РА. Например, синтез пептидов можно осуществить, используя различные твердофазные способы (смотри, например, ЯоЬегде (1995) δ^ι^ 269: 202; Метйе1б (1997) МеШобз Еп/уто1. 289: 313), и может быть осуществлен автоматизированный синтез, например, с использованием синтезатора пептидов АВ1 431А (Регкш Е1тег) согласно инструкциям, предлагаемым производителем.
Ферменты и полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть получены в выделенной форме или очищены до гомогенности. Фитазный полипептид по изобретению может быть получен с использованием любого из нескольких стандартных способов. Например, фитазные полипептиды могут быть получены в стандартной рекомбинантной системе экспрессии (которая описана в настоящей публикации), химически синтезированы (хотя в некоторой степени ограничено небольшими фрагментами фитазных пептидов) или очищены из организмов, в которых они экспрессируются в природе. Применимые способы рекомбинантной экспрессии включают способы экспрессии в хозяевах млекопитающих, хозяевах микроорганизмах и хозяевах растениях.
В альтернативных аспектах полипептиды и пептиды по изобретению содержат аминокислоты или аминокислотные последовательности, которые представляют собой олигопептиды, пептиды, полипептиды или последовательности белка, или альтернативно, являются фрагментами, частями или субъединицами любой из указанных последовательностей, и природными или синтетическими молекулами.
В альтернативных аспектах рекомбинантные полипептиды или белки по изобретению включают (относятся к) полипептиды или белки, полученные с использованием методики рекомбинантной ДНК; например, полученные из клеток, трансформированных конструкцией экзогенной ДНК, кодирующей требуемый полипептид или белок. Синтетические нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды), полипептиды или белки по изобретению включают указанные молекулы, полученные в результате химического синтеза, как подробно описано в настоящем описании. В альтернативных аспектах полипептиды или белки по изобретению содержат аминокислоты, связанные друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидные изостеры, и могут содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Полипептиды могут быть модифицированы в любых природных процессах, таких как посттрансляционный процессинг, или способами химических модификаций, которые хорошо известны в данной области. Модификации могут быть осуществлены в любом месте полипептида, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино-конец или карбоксильный конец. Будет понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или в разной степени в нескольких сайтах в данном полипептиде. Также данный полипептид может иметь множество типов модификаций, например ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное связывание флавина, ковалентное связывание остатка тема, ковалентное связывание нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное связывание липида или производного липида, ковалентное связывание фосфатидилинозита, циклизация при поперечном сшивании, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гаммакарбоксилирование, гликозилирование, образование якоря ОР1, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование и опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белку, такое как аргинилирование.
В альтернативных аспектах синтетические полипептиды или белок получены химическим синтезом. Способы твердофазного химического синтеза пептидов также можно использовать для синтеза полипептида или фрагментов по изобретению. Такой способ был известен в данной области с начала 1960х годов (Метйе1б, Κ. В., ί. Ат. СЬет. δοс., 85: 2149-2154, 1963) (смотри также δ^ΉΓΐ, ί. М. апб Уоипд, ί. Ό., δο1^б РЬазе Рерйбе δуиιΗе8^8. 2 еб., Р1егсе СЬетюа1 Со., НоскГогб, 111., рр. 11-12)) и недавно был использован в коммерчески доступных лабораторных наборах для конструирования и синтеза пептидов (СатЬпбде ЯезеагсН ВюсЬетюа1з). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах использованы инструкции, приведенные в публикации Н. М. Оеузеп е1 а1., (Ргос. №·ιΐ1. Асаб. δοΐ., ^А, 81: 3998 (1984)), и они обеспечивают синтез пептидов на кончиках множества стержней или игл, которые все соединены с одним планшетом. В случае использования такой системы планшет со стержнями или иглами переворачивают и вставляют во второй планшет, имеющий соответствующие лунки или емкости, которые содержат растворы, для прикрепления или заякоривания соответствующей аминокислоты на кончике иглы или стержня. В результате повторения такой стадии процесса, т.е. переворачивания и вставления кончиков стержней или игл в соответствующие растворы, аминокислоты выстраивают в требуемые пептиды. Кроме того, имеется несколько доступных систем РМ0С-синтеза пептидов. Например, сборка
- 65 021178 полипептида или фрагмента может быть осуществлена на твердой подложке с использованием автоматизированного синтезатора пептидов АррПей ВюкуЧетк, 1пс., модели 431А. Такое оборудование обеспечивает простое получение пептидов по изобретению, либо в результате прямого синтеза или в результате синтеза серии фрагментов, которые могут быть связаны с использованием других известных способов.
В альтернативных аспектах пептиды и полипептиды по изобретению гликозилированы. Г ликозилирование может быть добавлено посттрансляционно либо химически, либо посредством клеточных механизмов биосинтеза, при этом последние включают использованием известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности или могут быть добавлены в виде пептида или добавлены в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может быть О-связанным или Ν-связанным или их сочетанием.
В альтернативных аспектах пептиды и полипептиды по изобретению, которые определены выше, содержат формы миметиков и пептидомиметиков, либо частично, либо полностью. В одном из аспектов термины миметик и пептидомиметик относятся к синтетическому химическому соединению, которое имеет, по существу, такие же структурные и/или функциональные характеристики, как и полипептиды по изобретению. Миметик может либо полностью состоять из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо представляет собой химерную молекулу, состоящую частично из природных аминокислот пептида и частично из неприродных аналогов аминокислот. Миметик также может включать любое количество консервативных замен природных аминокислот при условии, что такие замены также существенно не изменяют структуру и/или активность миметика. Как и в случае полипептидов по изобретению, которые являются консервативными вариантами, обычное экспериментирование позволит определить, входит ли миметик в объем изобретения, т.е., что его структура и/или функция существенно не изменены. Таким образом, в одном из аспектов состав миметика входит в объем изобретения, если он обладает фитазной активностью.
В альтернативных аспектах пептиды и полипептиды по изобретению имеют последовательности, содержащие специфичные модификации последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ν0:2, которые определены выше, и также консервативные замены, которые могут модифицировать или не могут модифицировать активность, например, ферментативную активность. В альтернативных аспектах консервативными заменами являются замены, которые заменяют данную аминокислоту в полипептиде другой аминокислотой со сходными свойствами. В альтернативных аспектах консервативными являются следующие замены: замены алифатической аминокислоты, такой как А1а, Уа1, Ьеи и 11е, другой алифатической аминокислотой; замену Зег аминокислотой ΤΠγ или наоборот; замену кислого остатка, такого как Акр и О1и другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, такого как Акп и О1п, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка, такого как Ьук и Агд, другим основным остатком; и замену ароматического остатка, такого как РЬе, Τυγ, другим ароматическим остатком.
В состав миметика полипептида по изобретению может входить любое сочетание неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте в состав миметика по изобретению входят одна или все из следующих трех структурных групп: а) другие группы, связывающие остатки, отличные от природной амидной связи (пептидной связи); Ь) неприродные остатки вместо природных аминокислотных остатков; или с) остатки, которые индуцируют мимикрию вторичной структуры, т.е. индуцируют или стабилизируют вторичную структуру, например, бета-поворот, гамма-поворот, бета-слой, альфаспиральную конформацию и тому подобное. Например, полипептид по изобретению может быть охарактеризован как миметик, когда все или некоторые из его остатков связаны другим химическим способом, отличным от природных пептидных связей. Отдельные остатки пептидомиметика могут быть связаны пептидными связями, другими химическими связями или способами связывания, такими как, например, глутаральдегид, сложные Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, бифункциональные малеимиды, Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид ГОСС) или Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (Ю1С). Связывающие группы, которые могут быть альтернативой для традиционной амидной связи (пептидной связи), включают, например, кетометилен (например, -С(=0)-СН2- для -ί.’(=0)-ΝΗ-), аминометилен (ΟΗ2-ΝΗ), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-0), простой тиоэфир (СН2-З), тетразол (ΟΝ4-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (смотри, например, ЗраЮ1а (1983) ίη СНениЧгу апй ВюсНеникЦу οΓ Атию Аайк, РерПйек апй Ргсйетк, νο1. 7, рр. 267-357, Рер11йе ΒаскЬοηе Μοй^Πсаι^οηк. Μа^се11 Эеккег, ΝΥ).
Полипептид по изобретению также можно охарактеризовать как миметик в случае присутствия всех или некоторых неприродных остатков вместо остатков природных аминокислот. Не встречающиеся в природе остатки хорошо описаны в научной и патентной литературе; некоторые примеры не встречающихся в природе композиций, используемых в качестве миметиков остатков природных аминокислот, и рекомендации описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот могут быть созданы заменой, например, Ό- или Ь-нафилаланином; Ό- или Ь-фенилглицином; Ό- или Ь-2-тиенилаланином; Ό- или Ь-1,-2, 3- или 4-пиренеилаланином; Ό-или Ь-3-тиенеилаланином; Ό- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Ό- или Ь(3-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(2-пиразинил)аланином; Ό- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; Ό(трифторметил)фенилглицином; О-(трифторметил)фенилаланином; Ό-п-фторфенилаланином; Ό- или Ьп-бифенилфенилаланином; К- или Ь-п-метоксибифенилфенилаланином; Ό- или Ь-2индол(алкил)аланинами; и Ό- или Ь-алкилаланинами, где алкилом может быть замещенный или незаме- 66 021178 щенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, петил, изопропил, изобутил, втор-изобутилтил, изопентил или некислые аминокислоты. Ароматические циклы не встречающихся в природе аминокислот включают, например, ароматические циклы тиазолила, тиофенила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.
Миметики кислых аминокислот могут быть созданы заменой, например не содержащими карбоксилата аминокислотами с сохранением отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартил или глутамил) также могут быть избирательно модифицированы в результате взаимодействия с карбодиимидами (К'Ж-СЖ-К') такими как, например, 1-циклогексил-3(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азония-4,4-диметолпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил также могут быть превращены в остатки аспарагинила и глутаминила в результате реакции с ионами аммония. Миметики основных аминокислот могут быть созданы заменой, например (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислотами орнитином, цитруллином или (гуанидино)уксусной кислотой или (гуанидино)алкилуксусной кислотой, где алкил имеет значение, определенное выше. Производным нитрила (например, содержащее СЖ-остаток вместо СООН) можно заменять аспарагин или глутамин. Остатки аспарагинила и глутаминила могут быть дезаминированы до соответствующих остатков аспартила или глутамила. Миметики остатков аргинина могут быть созданы посредством взаимодействия аргинила, например, с одним или несколькими обычными реагентами, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, при этом в случае таких реагентов может быть, предпочтительно, использование щелочных условий. Миметики остатка тирозина могут быть созданы в результате взаимодействия тирозила, например, с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. ^ацетилимидазол и тетранитрометан можно использовать для образования видов О-ацетилтирозила и 3-нитропроизводных, соответственно. Миметики остатков цистеина могут быть созданы в результате взаимодействия остатков цистеинила, например, с альфа-галогенацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид и соответствующие амины, с получением карбоксиметил- или карбоксиамидометил-производных. Миметики остатков цистеина также могут быть созданы в результате взаимодействия остатков цистеинила, например, с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидазолил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлормеркурибензоатом, 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина могут быть созданы (и амино-концевые остатки могут быть изменены) в результате взаимодействия лизинила, например, с янтарным ангидридом или другими ангидридами карбоновых кислот. Миметики лизина и других содержащих альфа-амин остатков также могут быть созданы в результате взаимодействия со сложными имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиродоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборогидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, 0-метилизомочевина, 2,4-пентандион и в результате катализируемых трансамидазой реакций с глиоксилатом. Миметики метионина могут быть созданы в результате взаимодействия, например, с метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин, или 3,3-диметилпролин. Миметики остатков гистидина могут быть созданы в результате взаимодействия гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или парабромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, миметики, образованные в результате гидроксилирования пролина и лизина; фосфорилирования гидроксильных групп остатков серила или треонила; метилирования альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилирования ^концевого амина; метилирования остатков амида основной цепи или замены ^метиламинокислотами; или амидирования С-концевых карбоксильных групп.
Остаток, например аминокислота полипептида по изобретению, также может быть заменена аминокислотой (или остатком пептидомиметика) противоположной хиральности. Таким образом, любая аминокислота, встречающаяся в природе в Ь-конфигурации (которая также может быть названа Κ или З, в зависимости от структуры химического компонента), может быть заменена аминокислотой с таким же типом химической структуры или пептидомиметиком, но с противоположной хиральностью, называемой Ό-аминокислотой, но которая также может быть названа Κ- или З-формой.
Изобретение также относится к способам модификации полипептидов по изобретению либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), или способами химической модификации, и к полученным в результате модифицированных полипептидов. Модификации могут возникать в любом месте в полипептиде, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и амино-конец или карбоксильный конец. Будет понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или в разной степени в нескольких участках данного полипептида. Также данный полипептид может иметь множество типов модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное связывание флавина, ковалентное связывание остатка тема, ковалентное связывание нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное связывание липида или производного липида, ковалентное связывание фосфатидилинозита, циклизация при поперечном сшивании, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных сшивок, образование цистеина, образова- 67 021178 ние пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование якоря СР1, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование и опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белку, такое как аргинилирование. Смотри, например, Сге1дН!ои, Т. Е., Рго!етк - 8!гис!иге аиб Мо1еси1аг РгорегНек 2иб Еб., \У.Н. Ргеетаи аиб Сотраиу, №ν Уогк (1993); Рокйгаик1а!юиа1 Соуа1еи! Мобйюайои оГ Рго!ешк, В.С. 1оНикои, Еб., Асабетю Ргекк, №ν Уогк, рр. 1-12 (1983).
Способы твердофазного химического синтеза пептидов также можно использовать для синтеза полипептида или фрагментов по изобретению. Такой способ был известен в данной области с начала 1960х годов (Метйе1б, К. В., 1. Ат. СНет. 8ос, 85: 2149-2154, 1963) (смотри также 81е\уаг1, 1. М. аиб Уоиид, 1. Ό., 8оНб РНаке РерНбе 8уи1Нек1к, 2 еб., Р1егсе СНетюа1 Со., Коск&гб, 111., рр. 11-12)) и недавно был использован в коммерчески доступных лабораторных наборах для конструирования и синтеза пептидов (СатЬпбде КекеагсН ВюсНетюа1к). В таких коммерчески доступных лабораторных наборах в общем использованы инструкции, приведенные в публикации Н. М. Сеукеи е! а1., (Ргос. №·ιΐ1. Асаб. 8сЕ, И8А, 81: 3998 (1984)), и они обеспечивают синтез пептидов на кончиках множества стержней или игл, которые все соединены с одним планшетом. В случае использования такой системы планшет со стержнями или иглами переворачивают и вставляют во второй планшет, имеющий соответствующие лунки или емкости, которые содержат растворы, для прикрепления или заякоривания соответствующей аминокислоты на кончиках игл или стержней. В результате повторения такой стадии процесса, т.е. переворачивания и вставления кончиков стержней или игл в соответствующие растворы, аминокислоты выстраивают в требуемые пептиды. Кроме того, имеется несколько доступных систем РМ0С-синтеза пептидов. Например, сборка полипептида или фрагмента может быть осуществлена на твердой подложке с использованием автоматизированного синтезатора пептидов АррНеб Вюкук!етк, 1ис., модели 431А. Такое оборудование обеспечивает простое получение пептидов по изобретению, либо в результате прямого синтеза или в результате синтеза серии фрагментов, которые могут быть связаны с использованием других известных способов.
В одном из аспектов пептиды и полипептиды по изобретению имеют последовательности, содержащие специфичную модификацию последовательности 8ЕО ГО N0:2, которая определена выше, а также по существу идентичные аминокислотные последовательности, т.е. последовательности, которые отличаются одной или несколькими консервативными или неконсервативными аминокислотными заменами, делециями или инсерциями, особенно когда такая замена происходит на участке, который не является активным участком молекулы, и при условии, что такой полипептид по существу сохраняет свои функциональные свойства. В одном из аспектов пептиды и полипептиды по изобретению имеют последовательности, содержащие специфичную модификацию последовательности 8Е0 ГО N0:2, которая определена выше, и консервативные аминокислотные замены, которые заменяют одну аминокислоту другой такого же класса, например замену одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой, или замену одной полярной аминокислоты другой, такие как замена лизина на аргинин, аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту или аспарагина на глутамин. В одном из аспектов одна или несколько аминокислот могут быть делетированы, например, из полипептида фитазы по изобретению, чтобы получить модификацию структуры полипептида без значимого изменения его биологической активности, или альтернативно, чтобы намеренно значимо изменить его биологическую активность. Например, аминоконцевые или расположенные на карбоксильном конце аминокислоты, которые необходимы или альтернативно не являются необходимыми для биологической активности фитазы, могут быть удалены и/или добавлены. Модифицированные полипептидные последовательности по изобретению можно анализировать в отношении биологической активности фитазы любым из способов, включая осуществление контакта модифицированной полипептидной последовательности с субстратом фитазы и определение того, уменьшает ли модифицированный полипептид количество специфичного субстрата в анализе или увеличивает биологические продукты ферментативной реакции функционального полипептиды фитазы с субстратом.
Другой аспект изобретения содержит полипептиды, имеющие примерно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более высокую идентичность последовательности 8Е0 ГО N0:2 и имеющие одну из специфичных указанных модификаций последовательности, которые обсуждаются (указаны) выше.
Такие варианты аминокислотной последовательности по изобретению можно характеризовать на основании предварительно определяемой природы изменения, признака, который отличает их от природной формы, например, аллельного или межвидового изменения последовательности фитазы. В одном из аспектов варианты по изобретению проявляют такую же качественную биологическую активность, как и встречающийся в природе аналог. Альтернативно, варианты могут быть отобраны по наличию модифицированных свойств. В одном из аспектов хотя участок или область для введения изменения аминокислотной последовательности предварительно определяют, мутация саму по себе не должна быть предварительно определена. Например, чтобы оптимизировать осуществление мутации на данном участке, может быть проведен случайный мутагенез в кодоне-мишени или области-мишени, и экспрессиро- 68 021178 ванные варианты фитазы подвергнуты скринингу в отношении оптимального сочетания требуемой активности. Способы получения основанных на заменах мутаций в предварительно определяемых участках в ДНК, имеющей известную последовательность, хорошо известны и обсуждаются в настоящем описании, например, мутагенез с праймерами М13 и ПЦР-мутагенез. Скрининг мутантов можно осуществлять, используя, например, анализы катализа превращения фитата (миоинозитгексафосфата) в инозит и неорганический фосфат; или гидролиза фитата (миоинозитгексафосфата). В альтернативных аспектах аминокислотные замены могут быть в единичных остатках; инсерции могут составлять примерно от 1 до 20 аминокислот, хотя могут быть осуществлены значительно более крупные инсерции. Делеции могут иметь размер в диапазоне примерно от 1 до примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70 остатков или больше. Чтобы получить конечное производное с оптимальными свойствами, можно использовать замены, делеции, инсерции или любое их сочетание. Обычно такие изменения осуществляют в небольшом количестве аминокислот, чтобы минимизировать изменение молекулы. Однако в некоторых случаях можно допускать более крупные изменения.
Полипептиды по изобретению могут быть получены способами биохимического обогащения или очистки. Последовательность потенциально гомологичных полипептидов или фрагментов может быть определена с использованием протеолитического расщепления, гель-электрофореза и/или микросеквенирования.
Другой аспект изобретения заключается в анализе для идентификации фрагментов или вариантов полипептидов по изобретению. Полипептиды по изобретению можно применять для катализа биохимических реакций, чтобы показать, что указанный фрагмент или вариант сохраняет ферментативную активность полипептидов по изобретению.
Характерный анализ для определения того, сохраняют ли фрагменты или варианты ферментативную активность полипептидов по изобретению, включает: осуществление контакта фрагмента или варианта полипептида с молекулой субстрата в условиях, которые обеспечивают возможность для функционирования фрагмента или варианта полипептида, и выявление либо снижения уровня субстрата, либо повышения уровня специфичных продуктов реакции, полученных при взаимодействии полипептида и субстрата.
Полипептиды по изобретению можно применят для катализа биохимических реакций. Согласно одному аспекту изобретения предлагается способ применения полипептида по изобретению в качестве фитазы.
Изобретение относится к фитазам, не имеющим или имеющим модифицированные сигнальные последовательности (также называемые сигнальными пептидами (8Р) или лидерными пептидами) или гетерологичные сигнальные последовательности. Полипептиды по изобретению также могут не иметь или иметь модифицированные или гетерологичные препродомены и/или каталитические домены (СО). Модифицированные или гетерологичные 8Р, препродомены и/или СО, включенные в полипептид по изобретению, могут быть частью слитого белка, например, в виде гетерологичного домена в химерном белке, или могут быть добавлены с использованием агента для химического связывания. Например, фермент по изобретению может содержать гетерологичный 8Р и/или препродомен в векторе, например, векторе серии рР1С (Iиν^!^одеи. Саг1кЪай, С А).
Кроме того, полипептиды по изобретению могут дополнительно содержать гетерологичные последовательности, либо последовательности из других фитаз, либо последовательности из отличных от фитаз источников, либо полностью синтетические последовательности. Таким образом, в одном из аспектов нуклеиновая кислота по изобретению содержит кодирующую последовательность для эндогенной, модифицированной или гетерологичной сигнальной последовательности (8Р), препродомена и/или каталитического домена (СО) и гетерологичной последовательности (т.е., последовательности, не связанной в природе с сигнальной последовательностью (8Р), препродоменом и/или каталитическим доменом (СО) по изобретению).
Гетерологичная последовательность может быть на 3'-конце, 5'-конце и/или на обоих концах кодирующей последовательности 8Р, препродомена и/или СО.
Способы идентификации последовательностей препродоменов и сигнальных последовательностей хорошо известны в данной области, смотри, например, Уап йе Уеп (1993) Сгй. Ке\\ Опсод. 4(2): 115136. Например, чтобы идентифицировать препропоследовательность, белок очищают из внеклеточного пространства и определяют Ν-концевую последовательность белка и сравнивают с непроцессированной формой. Различные способы распознавания сигнальных последовательностей известны специалистам в данной области. Например, в одном из аспектов сигнальные пептиды, используемые в полипептидах по изобретению, идентифицируют способом, называемым 81дпа1Р. В способе 81дпа1Р используют объединенную нейронную сеть, которая распознает как сигнальные пептиды, так и участки их расщепления; смотри, например, №е1кеп (1997) 1йеппПса!юп оГ ргокагуойс апй еикагуойс к1дпа1 рерййек апй ргейюйоп оГ !йей с1еаνаде кйек Рго!ет Епдтееппд 10: 1-6.
Изобретение относится к фитазным ферментам, в которых структура остова полипептида, вторичная или третичная структура, например альфа-спиральная или бета-слоистая структура, были модифицированы. В одном из аспектов заряд или гидрофобность были модифицированы. В одном из аспектов объ- 69 021178 ем боковой цепи был модифицирован. Существенные изменения функции или иммунологической природы получают, отбирая замены, которые являются менее консервативными. Например, могут быть осуществлены замены, которые оказывают более значимое влияние на: структуру остова полипептида в области изменения, например альфа-спиральную или бета-слоистую структуру; заряд или гидрофобный участок молекулы, который может быть в активном участке; или на боковую цепь. Изобретение относится к заменам в полипептиде по изобретению, при этом (а) гидрофильными остатками, например, серилом или треонилом, заменяют гидрофобный остаток, например лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил (или наоборот); (Ь) цистеином или пролином заменяют любой другой остаток (или наоборот); (с) остатком, имеющим электроположительную боковую цепь, например лизилом, аргинилом или гистидилом, заменяют электроотрицательный остаток, например глутамил или аспартил (или наоборот); или (к) остатком, имеющим объемную боковую цепь, например фенилаланином, заменяют остаток, не имеющий боковой цепи, например глицин (или наоборот). Варианты могут проявлять такую же качественную биологическую активность (т.е., активность фермента фитазы), хотя при необходимости могут быть отобраны варианты для модификации свойств фитазы.
В одном из аспектов фитазы по изобретению содержат эпитопы или метки для очистки, сигнальные последовательности или другие слитые последовательности и т.д. В одном из аспектов фитазы по изобретению могут быть слиты со случайным пептидом с образованием слитого полипептида. Термин слитый или функционально связанный в настоящем описании означает, что случайный пептид и фитаза связаны вместе таким образом, чтобы минимизировать нарушение стабильности фитазной активности. Слитый полипептид (или слитый полинуклеотид, кодирующий слитый полипептид) также может содержать дополнительные компоненты, включая множественные пептиды, во многих петлях.
В одном из аспектов фитазы по изобретению являются химерными полипептидами, например, содержащими гетерологичные 8Р, модули связывания углеводов, каталитические домены фермента фитазы, линкеры и/или нефитазные каталитические домены. Изобретение относится к способам создания химерных полипептидов, которые могут кодировать биологически активные гибридные полипептиды (например, гибридные фитазные ферменты). В одном из аспектов исходные полинуклеотиды кодируют биологически активные полипептиды. Способ по изобретению дает новые гибридные полипептиды благодаря использованию клеточных процессов, которые интегрируют последовательности исходных полинуклеотидов, так что полученный в результате гибридный полинуклеотид кодирует полипептид, проявляющий активности, полученные из исходных биологически активных полипептидов. Например, исходные полинуклеотиды могут кодировать конкретный фермент их разных микроорганизмов. Фермент, кодируемый первым полинуклеотидом из одного организма, или вариант может, например, эффективно функционировать в конкретных условиях окружающей среды, например в условиях высокой солености. Фермент, кодируемый вторым полинуклеотидом из второго организма, или вариант может эффективно функционировать в других условиях окружающей среды, таких как экстремально высокие температуры. Гибридный полинуклеотид, содержащий последовательности из первого и второго исходных полинуклеотидов, может кодировать фермент, который проявляет свойства обоих ферментов, кодируемых исходными полинуклеотидами. Таким образом, фермент, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может эффективно функционировать в условиях окружающей среды, в которых функционируют каждый из ферментов, кодируемых первым и вторым полинуклеотидами, например, в условиях высокой солености и экстремальных температур.
Таким образом, гибридный полипептид, полученный в результате применения такого способа по изобретению, может проявлять специализированную ферментативную активность, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редукционной пересортировки полинуклеотидов, кодирующих ферменты фитазы, полученный гибридный полипептид, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может быть подвергнут скринингу в отношении специализированных ферментативных активностей, например гидролазы, пептидазы, фосфорилазы и т.д., активностей, полученных от каждого из исходных ферментов. Таким образом, например, гибридный полипептид может быть подвергнут скринингу, чтобы определить такие химические функциональности, которые отличают гибридный полипептид от исходных родительских полипептидов, такие как температура, рН или концентрация соли, при которых гибридный полипептид функционирует.
Гибридный полипептид, полученный способ по изобретению, может проявлять специализированную ферментативную активность, не проявляемую исходными ферментами. Например, после рекомбинации и/или редукционной пересортировки полинуклеотидов, кодирующих гидролазные активности, полученный в результате гибридный полипептид, кодируемый гибридным полинуклеотидом, может быть подвергнут скринингу в отношении специализированных гидролазных активностей, полученных от каждого из исходных ферментов, т.е., в отношении типа связи, на которую гидролаза действует, и температуры, при которой гидролаза функционирует. Таким образом, например, фитаза может быть подвергнута скринингу, чтобы выявить такие химические функциональности, которые отличают гибридную фитазу от исходных фитаз, такие как: (а) амидные (пептидные связи), т.е. протеазы; (Ь) сложноэфирные связи, т.е. эстеразы и липазы; (с) ацетали, т.е. гликозидазы, и, например, температура, рН или концентрация соли, при которой гибридный полипептид функционирует.
- 70 021178
В одном из аспектов изобретение относится к способу получения биологически активного гибридного полипептида и к скринингу такого полипептида в отношении повышенной активности с использованием:
(1) введения, по меньшей мере, первого полинуклеотида в функциональной связи и второго полинуклеотида в функциональной связи в подходящую клетку-хозяина, при этом указанный, по меньшей мере, первый полинуклеотид и второй полинуклеотид имеют по меньшей мере одну общую область частичной гомологии последовательностей;
(2) выращивания клетки-хозяина в условиях, которые стимулируют реорганизацию последовательностей, приводящую к получению гибридного полинуклеотида в функциональной связи;
(3) экспрессии гибридного полипептида, кодируемого гибридным полинуклеотидом;
(4) скрининга гибридного полипептида в условиях, которые способствуют идентификации повышенной биологической активности; и (5) выделения полинуклеотида, кодирующего гибридный полипептид.
Способы скрининга различных ферментативных активностей известны специалистам в данной области и обсуждаются на протяжении настоящего описания. Такие способы можно применять при выделении полипептидов и полинуклеотидов по изобретению.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) получения стабилизированных водных жидких препаратов, обладающих фитазной активностью, которые проявляют повышенную резистентность к тепловой инактивации ферментативной активности и которые сохраняют свою фитазную активность в течение длительных периодов хранения. Жидкие препараты стабилизируют с помощью добавления мочевины и/или полиола, такого как сорбит и глицерин, в качестве стабилизирующего средства. Также предлагаются кормовые препараты для животных с однокамерным желудком и способы их получения, которые являются результатом использования таких стабилизированных водных жидких препаратов. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области. В конкретном не ограничивающем примере такая общедоступная литература включает публикацию ЕР 0626010 (АО 9316175 А1) (Вагепйке еГ а1.), хотя в таких публикациях в общедоступной литературе не раскрыты предложенные в настоящем изобретении молекулы.
Антитела и основанные на антителах способы скрининга
Изобретение относится к выделенным, синтетическим или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с фитазой по изобретению. Такие антитела можно использовать для выделения, идентификации или определения количества фитазы по изобретению или родственных полипептидов. Такие антитела могут быть использованы для ингибирования активности фермента по изобретению. Такие антитела могут быть использованы для выделения полипептидов, родственных полипептидам по изобретению, например родственных фитазных ферментов.
Антитела по изобретению могут содержать пептид или полипептид, полученный, смоделированный или, по существу, кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов или их фрагментами, способный специфично связывать антиген или эпитоп, смотри, например, Риийатеиίа1 1ттипо1оду, ТЫгй ЕйПюп, А.Е. Раи1, ей., Вауеп Ргекк, Ν.Υ. (1993); АЬкоп (1994) 1. 1ттипо1. МеГЬойк 175: 267-273; Υа^тикЬ (1992) 1. ВюсЬет. ВюрЬук. МеГЬойк 25: 85-97. Термин антитело включает антигенсвязывающие части, т.е. антигенсвязывающие участки (например, фрагменты, подпоследовательности, определяющие комплементарность области (СОК)), которые сохраняют способность связывать антиген, включая (ί) РаЬ-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЬ')2_ фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в области шарнира; (ίίί) Рй-фрагмент, содержащий домены УН и СН1; (ίν) Ρν-фрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН одного плеча антитела, (ν) йАЬ-фрагмент (Аагй еГ а1., (1989) ЫаГиге 341: 544-546), который состоит из УН-домена; и (νί) выделенную определяющую комплементарность область (СОК). Одноцепочечные антитела также включены в термин антитело.
Антитела могут быть использованы для иммунопреципитации, окрашивании (например, РАС8), в иммуноаффинных колонках и тому подобном. При необходимости последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие конкретные антигены, могут быть созданы посредством иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификации или клонирования и иммобилизации полипептида на матрице по изобретению. Альтернативно способы по изобретению могут быть применены для модификации структуры антитела, продуцируемого клеткой, которое необходимо модифицировать, например аффинность антитела может быть повышена или понижена. Кроме того, возможность получать или модифицировать антитела может быть обеспечена фенотипом клетки, сконструированным способами по изобретению.
Способы иммунизации, продуцирования и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области и описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, СоЬдап, СИРРЕЫТ РКОТОСОЬЗ ΙΝ ШМЕХОРОСЛ/ АЬеу/Огеепе, ΝΥ (1991); Зшек (ейк.) ВА81С αΝο СЫМСАЬ ШМРХОРОСА (7Ηι ей.) Ьапде Мейюа1 РиЬЬсаЬопк, Ьок А1Гок, СА (§ЬГек); Сойшд, МОРОСТ-ОХАР АХПВООПА: РМХЫРВЕЗ ΑΝΟ РКАСПСЕ (2й ей.) Асайешю Ргекк, Хем ΥογΕ ΝΥ
- 71 021178 (1986); КоЫег (1975) ХаПие 256:495; Нагкш (1988) АЭТ1В0П1Е8, А 1.АВ0КАТ0КУ МА^АЬ, Со1й 8ргш§ НагЬог РнЬНсаиопк, №ν Уогк. Антителам также могут быть созданы ш уЬго, например, с использованием рекомбинантных библиотек, экспрессирующих связывающие участки антител, в фаговом дисплее, в дополнение к традиционным способам ш У1уо с использованием животных. Смотри, например, НоодепЬоот (1997) Тгепйк В1о)есЬпо1. 15: 62-70; Ка)/ (1997) Аппи. Кеу. ВюрЬук. Вюто1. 81гис). 26: 27-45.
Полипептиды могут быть использованы для создания антител, которые специфично связываются с полипептидами по изобретению. Полученные антитела могут быть использованы в способах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида или для определения того, присутствует ли полипептид в биологическом образце. В таких способах препарат белка, такой как экстракт или биологическая образец, подвергают контакту с антителом, способным специфично связываться с одним из полипептидов по изобретению.
В иммуноаффинных способах антитело связывают с твердой подложкой, такой как шарик или другой матрикс в колонке. Препарат белка приводят в контакт с антителом в условиях, в которых антитело специфично связывается с одним из полипептидов по изобретению. После промывки для удаления неспецифично связанных белков элюируют специфично связанные полипептиды.
Способность белков в биологическом образце связываться с антителом можно определить, используя любой из множества способов, известных специалистам в данной области. Например, связывание можно определить путем мечения антитела детектируемой меткой, такой как флуоресцирующее средство, ферментативная метка или радиоизотоп. Альтернативно, связывание антитела с образцом может быть определено с использованием второго антитела, имеющего такую детектируемую метку. Конкретные анализы включают анализы ЕЫ8А, анализы типа сэндвич, радиоиммуноанализы и Вестерн-блоты.
Поликлональные антитела, созданные против полипептидов по изобретению, могут быть получены в результате прямой инъекции полипептидов животному или введением полипептидов животному, например, животному, отличному от человека. Полученное таким образом антитело затем будет связывать сам полипептид. Таким образом, даже последовательность, кодирующая только фрагмент полипептида, может быть использована для создания антител, которые могут связываться с целым нативным полипептидом. Затем такие антитела могут быть использованы для выделения полипептида из клеток, экспрессирующих такой полипептид.
Для получения моноклональных антител можно использовать любой способ, который относится к антителам, продуцируемым непрерывными культурами линий клеток. Примеры включают основанный на гибридомах способ, методику триом, методику на основе В-клеточных гибридом человека и способ на основе ЕВУ-гибридом (смотри, например, Со1е (1985), Мопос1опа1 АпйЬоФек апй Сапсег ТЬегару, А1ап К. Пкк, 1пс., рр. 77-96).
Способы, описанные для получения одноцепочечных антител (смотри, например, патент США № 4946778), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к полипептидам по изобретению. Альтернативно, можно использовать трансгенных мышей для экспрессии антител к таким полипептидам или их фрагментам.
Антитела, созданные против полипептидов по изобретению, можно использовать в скрининге в отношении сходных полипептидов из других организмов и образцов. В таких способах полипептиды из организма подвергают контакту с антителом, и выявляют те полипептиды, которые специфично связывают антитело. Любой из описанных выше способов можно использовать для выявления связывания антител.
Наборы
Изобретение относится к наборам, содержащим композиции, например, нуклеиновых кислот, кассет экспрессии, векторов, клеток, полипептидов (например, фитаз) и/или антител по изобретению. Наборы также могут содержать инструктивный материал, в котором содержится руководство относительно методики и промышленных применений изобретения, которое описано в настоящей публикации.
Полипептиды по изобретению также можно использовать для создания антител, которые специфично связываются с ферментативными полипептидами или фрагментами. Полученные в результате антитела можно использовать в способах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки полипептида или для определения того, присутствует ли полипептид в биологическом образце. В таких способах препарат белка, такой как экстракт или биологическая образец, подвергают контакту с антителом, способным специфично связывать один из полипептидов, содержащий последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, последовательности, по существу ей идентичные, или фрагменты указанных выше последовательностей.
В иммуноаффинных способах антитело связывают с твердой подложкой, такой как шарик или другой матрикс в колонке. Препарат белка приводят в контакт с антителом в условиях, в которых антитело специфично связывается с одним из полипептидов, содержащих последовательность 8ЕЦ ГО N0:2, последовательности, по существу ей идентичные, или их фрагменты. После промывки для удаления неспецифично связанных белков элюируют специфично связанные полипептиды.
Выделенные полинуклеотидные последовательности, полипептидную последовательность, их варианты и мутанты можно измерить в отношении сохранения биологической активности, характерной для
- 72 021178 фермента по настоящему изобретению, например, в анализе для выявления ферментативной фитазной активности (Рооб СЬетсак Собех, 4* Еб.). Такие ферменты включают укороченные формы фитазы и варианты, такие как делеционные и инсерционные варианты полипептидной последовательности 8Еф ГО ЫО:2. Такие фитазы обладают термоустойчивостью. То есть, фитаза имеет остаточную удельную активность на уровне примерно 90% после обработки при 70°С в течение 30 мин и примерно 50% после обработки при 75°С в течение 30 мин. Термоустойчивость фитаз по изобретению является преимуществом при использовании фермента в качестве добавки в корм, так как корм может быть подвергнут прессованию, гранулированию или таблетированию при высокой температуре.
Например, в одном из аспектов изобретение относится к съедобному гранулированному матриксу для доставки фермента и способу применения для доставки фитазы животному, например, в виде добавки питательного вещества. Матрикс для доставки фермента легко высвобождает фермент фитазу, такую как фитаза, имеющая аминокислотную последовательность 8Еф ГО ЫО:2 или по меньшей мере 30 следующих друг за другом аминокислот такой последовательности, в водной среде, такой как, например, пищеварительные соки животного. Матрикс для доставки фермента по изобретению получают из гранулированного съедобного носителя, выбранного из таких компонентов, как зародыш зерна, который обеднен в отношении масла, сено, люцерна, тимофеевка, соевая шелуха, мука из семян подсолнечника, пшеничная мука, и тому подобное, которые легко распределяют находящийся в них рекомбинантный фермент в водной среде. В случае применения съедобный гранулированный матрикс для доставки фермента вводят животному, чтобы доставить в организм животного фитазу. Подходящие основанные на зерне субстраты могут содержать или могут быть получены из любого подходящего съедобного зерна, например, пшеницы, кукурузы, сои, сорго, люцерны, ячменя и тому подобного. Примером основанного на зерне субстрата является основанный на кукурузе субстрат. Субстрат может быть получен из любой подходящей части зерна, например, зародыша зерна, разрешенного для применения на корм животным, такого как зародыш кукурузы, который получают в результате влажного или сухого помола. Зародыш зерна может содержать обедненный зародыш, который представляет собой зародыш зерна, из которого удалено масло, например, в результате отжима или экстракции гексаном или другим растворителем. Альтернативно зародыш зерна подвергают экстракции на шнековом прессе, то есть, масло удаляют отжимом.
Матрикс для доставки фермента по изобретению имеет форму множества дискретных частиц, таблеток или гранул. Под гранулами подразумевают частицы, которые спрессованы или сжаты, таким образом как таблетирование, экструзия или подобное сжатие, чтобы удалить воду из матрикса. Такое прессование или сжатие частиц также стимулирует когезию между частицами. Например, гранулы могут быть получены таблетированием основанного на зерне субстрата в грануляторе. Полученные при этом таблетки измельчают или растирают до размера гранул, подходящих для использования в качестве добавки в корм для животных. Так как матрикс сам по себе разрешен для применения в кормах для животных, его можно использовать в качестве разбавителя для доставки ферментов в кормах для животных.
Матрикс для доставки фермента может быть в форме гранул, имеющих размер в диапазоне примерно от 4 до примерно 400 меш (И88); или примерно от 8 до примерно 80 меш; или примерно от 14 до примерно 20 меш. Если зародыш зерна обеднен в результате экстракции растворителем, то в грануляторе может быть необходимо использование смазочного вещества, такого как кукурузное масло, но такое смазочное средство обычно не нужно, если зародыш подвергали экстракции в шнековом прессе. В других аспектах изобретения матрикс получают другими способами сжатия или прессования, такими как, например, экструзия основанного на зерне субстрата посредством штампования и выдавливания экструдата с подходящим размером гранул.
Матрикс для доставки фермента может дополнительно содержать полисахаридный компонент в качестве связывающего средства, чтобы усилить связующую способность гранул матрикса. Связывающее средство, как полагают, обеспечивает дополнительные гидроксильные группы, которые усиливают связывание между белками зерна в грануле матрикса. Кроме того, полагают, что дополнительные гидроксильные группы функционируют таким образом, что усиливают водородные связи белков с крахмалом и другими белками. Связывающее средство может присутствовать в любом количестве, подходящем для усиления связующей способности гранул матрикса для доставки фермента. Подходящие связывающие средства включают один или несколько из следующих средств: декстрины, мальтодекстрины, крахмалы, такие как кукурузный крахмал, муку, целлюлозные полимеры, гемицеллюлозные полимеры и тому подобное. Например, процентное содержание зародыша зерна и связывающего средства в матриксе (не включая фермента) составляет 78% муки зародышей зерна и 20 мас.% кукурузного крахмала.
Поскольку высвобождающий фермент матрикс по изобретению изготавливают из биологически разрушаемых материалов, то матрикс может подвергаться порче, например гниению. Чтобы предотвратить или ингибировать такое гниение, матрикс может содержать ингибитор гнили, такой как пропионатная соль, которая может присутствовать в любом количестве, достаточном для ингибирования гниения высвобождающего фермент матрикса, таким образом, обеспечивая стабильную форму матрикса для доставки, которая не требует хранения в холодильнике.
Фермент фитаза, находящийся в матриксе для доставки фермента по изобретению, и используемый в способах по изобретению, в одном из аспектов является термоустойчивой фитазой, которая описана в
- 73 021178 настоящей публикации, для того, чтобы противостоять инактивации фитазы во время производства, в котором могут быть использованы повышенные температуры и/или пар для получения гранулированного матрикса для доставки фермента. При переваривании корма, содержащего матрикс для доставки фермента, по изобретению, водные пищеварительные соки будут вызывать высвобождение активного фермента. Другие типы термоустойчивых ферментов и добавок питательных веществ, которые являются термоустойчивыми, также могут быть введены в матрикс для доставки с целью высвобождения в водных условиях любого типа.
Можно использовать покрытие для частиц матрикса, несущего фермент, по изобретению для многих разных целей, например, чтобы добавить корригент или питательную добавку к корму для животных, чтобы замедлить высвобождение кормовых добавок и ферментов для животных в условиях желудка, и тому подобное. Или покрытие можно использовать для достижения функциональной цели, например, в тех случаях, когда требуется замедлить высвобождение фермента из частиц матрикса или контролировать условия, при которых фермент будет высвобождаться. Состав материала покрытия может быть таким, чтобы он избирательно разрушался агентом, к которому он чувствителен (таким как нагревание, кислота или щелочь, ферменты или другие химические вещества). Альтернативно два или более покрытий, чувствительных к разным таким разрушающим агентам, могут быть последовательно нанесены на частицы матрикса.
Изобретение также относится к способу получения высвобождающего фермент матрикса. По изобретению способ включает получения множества дискретных частиц основанного на зерне субстрата с размером частиц, подходящим для применения в качестве высвобождающего фермент матрикса, при этом частицы содержат фермент фитазу по изобретению. Способ может включать сжатие или прессование части высвобождающего фермент матрикса в гранулы, которое можно осуществлять в процессе гранулирования. Ингибитор гниения и связывающее средство, в случае их использования, могут быть добавлены в любое подходящее время и могут быть смешаны с основанным на зерне субстратом в требуемых соотношениях перед гранулированием основанного на зерне субстрата. Влагосодержание корма в грануляторе может быть в диапазоне, указанном выше по отношению к влагосодержанию конечного продукта, или примерно от 14 до 15%, или примерно от 10 до 20%. Влага может быть добавлена в исходное сырье в форме водного препарата фермента, чтобы довести исходное сырье до указанного содержания влаги. Температура в грануляторе может быть доведена примерно до 82°С с использованием пара. Гранулятор может работать в любых условиях, которые обеспечивают достаточную обработку исходного сырья для получения гранул. Процесс гранулирования сам по себе является высокорентабельным с точки зрения удаления воды из содержащей фермент композиции.
В одном из аспектов при работе гранулятора используют матрицу размером 1/8 на 2 дюйма (0,3 см на 5 см) и давление 100 фунтов/кв. дюйм/минуту (0,7 МПа/мин) при 82°С, чтобы получить пеллеты, которые затем дробят в дробилке гранулятора, получая множество дискретных частиц, имеющих размер частиц, позволяющий им проходить через сито 8 меш, но задерживаться на сите 20 меш.
Термоустойчивые фитазы, описанные в настоящей публикации, могут иметь высокие оптимальные температуры и могут иметь высокую резистентность к нагреванию или устойчивость к нагреванию. Таким образом, фитазы по изобретению могут осуществлять ферментативные реакции при температурах, которые обычно считают превышающими оптимум. Фитазы по изобретению также могут осуществлять ферментативные реакции после воздействия на них высоких температур (при этом термоустойчивость представляет собой способность сохранять ферментативную активность при таких температурах, при которых фитаза дикого типа активна после предварительного воздействия высоких температур, даже если высокая температура может инактивировать или снижать активность фермента, смотри также определение термоустойчивости выше). Ген, кодирующий фитазу по настоящему изобретению, можно использовать для получения фитазы (например, с использованием методики О88М и/или ТМСА, которые описаны в настоящей публикации), обладающей свойствами, отличными от свойств фитазы с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:2 (в отношении оптимума рН, оптимума температуры, резистентности к нагреванию, стабильности в растворителях, удельной активности, аффинности к субстрату, способности к секреции, скорости трансляции, регуляции транскрипции и тому подобного). Кроме того, полинуклеотиды по изобретению можно применять для скрининга вариантов фитазы, полученного способами, описанными в настоящей публикации, чтобы определить варианты, обладающие требуемой активностью, такой как повышенная или модифицированная термостабильность или термоустойчивость. Например, в патенте США № 5830732 описан скрининговый анализ для определения термоустойчивости фитазы.
Примером такого скринингового анализа ίη уйго является следующий анализ для определения фитазной активности: фитазную активность можно измерить, инкубируя 150 мкл препарата фермента с 600 мкл 2 мМ фитата натрия в 100 мМ трис-НС1-буфере, рН 7,5, с добавлением 1 мМ СаС12 в течение 30 мин при 37°С. После инкубации реакцию останавливают добавлением 750 мкл 5% трихлоруксусной кислоты. Высвобождаемый фосфат измеряли спектрофотометрически против стандарта фосфата при 700 нм после добавления 1500 мкл цветного реагента (4 объема 1,5% молибдата аммония в 5,5% серной кислоте и 1 объем 2,7% сульфата железа; 8Ыш1/и, 1992). Одну единицу ферментативной активности определяют как количество фермента, необходимое для высвобождения одного мкмоля Р| в минуту в условиях анализа.
- 74 021178
Удельную активность можно выразить в единицах ферментативной активности на миллиграмм белка. Фермент по настоящему изобретению обладает ферментативной активностью в отношении гидролиза фитата до инозита и свободного фосфата.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу гидролиза фитата, включающему осуществление контакта фитата с одной или несколькими новыми молекулами фитазы, описанными в настоящей публикации (например, белки, имеющие специфичные модификации в последовательности δερ ΙΌ NО:2). Соответственно, изобретение относится к способу катализа гидролиза фитата до инозита и свободного фосфата с высвобождением минеральных вещества из комплекса фитиновой кислоты. Способ включает осуществление контакта субстрата фитата с эффективным в расщеплении количеством фермента по изобретению. Термин расщепляющее эффективное количество относится к количеству фермента, которое требуется для расщепления по меньшей мере 50% фитата по сравнению с фитатом, не подвергнутым контакту с ферментом. Может быть расщеплено 80% фитата.
В другом аспекте изобретение относится к способу гидролиза сложных фосфомоноэфирных связей в фитате. Способ включает введение эффективного количества молекул фитазы по изобретению, чтобы получить инозит и свободный фосфат. В одном из аспектов эффективное количество относится к количеству фермента, которое необходимо для гидролиза по меньшей мере 50% сложных фосфомоноэфирных связей по сравнению с фитатом, который не контактировал с ферментом. В одном из аспектов гидролизуют по меньшей мере 80% связей.
В конкретном аспекте при необходимости молекулы фитазы можно использовать в сочетании с другими реагентами, такими как другие катализаторы; чтобы вызвать химические изменения (например, гидролиз) молекул фитата и/или других молекул в источнике(ах) субстрата. Согласно настоящему аспекту молекулы фитазы и дополнительный реагент(ты) не будут ингибировать друг друга. Молекулы фитазы и дополнительный реагент(ты) могут оказывать общее аддитивное влияние или альтернативно молекулы фитазы и дополнительный реагент(ты) могут оказывать общее синергетическое влияние.
Соответствующие источники молекул субстрата фитата включают пищевые продукты, возможные пищевые продукты, промежуточные продукты пищевых продуктов (как промежуточные продукты ш уПго, так и промежуточные продукты ш У1уо, например, продукты реакции ех У1уо и продукты экскрементов животных), предшественники пищевых продуктов и любой другой материальный источник фитата.
В не ограничивающем аспекте рекомбинантную фитазу могут потреблять организмы, и она сохраняет активность при потреблении. В другом примере можно использовать способы трансгенеза для достижения экспрессии рекомбинантной фитазы, например, контролируемым образом (имеются способы для регуляции экспрессии трансгенных молекул специфичным для периода времени и специфичным для ткани образом).
В одном из аспектов фитазная активность в материале источника (например, источник в виде трансгенного растения или рекомбинантный прокариотический хозяин) может увеличиваться при потреблении; такое увеличение активности может происходить, например, после превращения предшественника молекулы фитазы в проформе в значительно более активный фермент в более зрелой форме, при этом указанное превращение может быть, например, результатом проглатывания и переваривания источника фитазы. Гидролиз фитатного субстрата может происходить в любой период времени после осуществления контакта фитазы с фитатом; например, гидролиз может происходить перед проглатыванием или после проглатывания или как до, так и после проглатывания любого субстрата, либо фермента, либо их обоих. Кроме того, следует понимать, что субстрат фитата может быть подвергнут контакту - кроме контакта с фитазой - с одним или несколькими дополнительными реагентами, такими как другой фермент, который также может быть применен либо непосредственно, либо после очистки из материала его источника.
Следует понимать, что материал(лы) источника фитазы могут быть подвергнуты контакту непосредственно с материалом(ами) источника фитата; например, после измельчения или пережевывания ш уПго или ш У1уо любого одного или обоих источников фитазы и фитата. Альтернативно фитазный фермент может быть очищен из материала(ов) источника, или фитатный субстрат может быть очищен из материала(ов) источника, или и фитазный фермент, и фитатный субстрат могут быть очищены из материала(ов) источника перед осуществлением контакта фермента фитазы с субстратом фитатом. Понятно, что можно использовать сочетание очищенных и неочищенных реагентов, включая фермент(ты) или субстрат(ты) или и то и другое.
Понятно, что в качестве источника фитазной активности можно использовать более одного материала источника. В качестве одного из путей достижения распределенного по времени высвобождения реагента(ов) из материала(ов) источника полезно, когда высвобождение разных реагентов из материалов их источников происходит дифференцированно, например, по мере того, как проглоченные материалы источника перевариваются ш У1уо, или по мере того, как материалы источников обрабатываются в применениях 1и У1!го. Использование более одного материала источника фитазной активности также применимо для получения фитазных активностей в определенном диапазоне условий и их флуктуации, которые могут встречаться, таких как диапазон значений рН, температуры, соленость и интервалы времени,
- 75 021178 например, во время разных стадий обработки при применении. Использование разных материалов источников также полезно для того, чтобы получить разные реагенты, примерами которых являются одна или несколько форм или изомеров фитазы и/или фитаты и/или других материалов.
Следует понимать, что один источник материала, такой как вид трансгенного растения (или части растения), может быть источником материала и для фитазы и для фитаты; и что ферменты и субстраты могут быть по-разному распределены в разные компартменты в указанном одном источнике - например, секретироваться или не секретироваться, дифференцированно экспрессироваться и/или иметь разные относительные количества в разных частях или органах, или тканях растения, или в разных субклеточных компартментах в одной и той же части или органе или ткани растения. Очистка молекул фитазы, находящейся в источнике, может включать выделение и/или дополнительную обработку одной или нескольких требуемых частей или органов или тканей или субклеточных компартментов растения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу катализа реакций ш νί\Ό и/или ίπ νίίΐΌ с использованием семян, содержащих повышенные количества ферментов. Способ включает добавление трансгенных семян не дикого типа, например, в измельченной форме, к реакционной смеси и обеспечение возможности для того, чтобы ферменты в семенах увеличивали скорость реакции. В результате непосредственного добавления семян в реакционную смесь способ позволяет получать раствор для более дорогостоящего и трудоемкого процесса экстракции и очистки фермента. Также предлагаются способы обработки, при которых в организм, в котором нет достаточного поступления фермента, вводят фермент в форме семян от одного или нескольких видов растений, например видов трансгенных растений, содержащих повышенные количества фермента. Дополнительные подробности, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области. В конкретном не ограничивающем примере такая общедоступная литература включает патент США № 5543576 (Уап Ооцеп е! а1.) и патент США № 56714474 (Уап Ооцеп е! а1.), хотя в указанных публикациях нет информации о молекулах, предлагаемых в настоящем изобретении, а вместо этого имеются инструкции по применению фитаз грибов.
В одном из аспектов молекулы фитазы по изобретению используются для создания рекомбинантных жизненных форм пищеварительной системы (либо микробов, либо флоры) и для введения указанных рекомбинантных жизненных форм пищеварительной системы животным. Введение, необязательно, можно осуществлять отдельно или в сочетании с другими ферментами и/или с другими жизненными формами, которые могут обеспечивать ферментативную активность в пищеварительной системе, при этом указанные другие ферменты и указанные жизненные формы могут быть рекомбинантными или иными. Например, введение может быть осуществлено в сочетании с ксиланолитическими бактериями.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу вымачивания зерен кукурузы или сорго в теплой воде, содержащей диоксид серы, в присутствии препарата ферментов, содержащего один или несколько разрушающих фитин ферментов, например, в таком количестве, что фитин, присутствующий в кукурузе или сорго в значительной степени разрушается. Препарат ферментов может содержать фитазу и/или кислую фосфатазу и, необязательно, другие разрушающие растительный материал ферменты. Время вымачивания может составлять от 12 до 18 ч. Вымачивание может быть прервано промежуточной стадией размалывания, уменьшающей время вымачивания. В одном из аспектов зерна кукурузы или сорго вымачивают в теплой воде, содержащей диоксид серы, в присутствии препарата фермента, включающего один или несколько разрушающих фитин ферментов, таких как фитаза и кислые фосфатазы, чтобы удалить или сильно уменьшить содержание фитиновой кислоты и солей фитиновой кислоты. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в патенте США № 4914029, (Сагапка е! а1.) и ЕР 0321004 (Уаага е! а1.).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения теста, обладающего требуемыми физическим свойствами, такими как нелипкость и эластичность, и хлебного продукта высшего качества, например, наилучшего удельного объема, включающему добавление молекул фитазы в тесто. В одном из аспектов молекулы фитазы по настоящему изобретению добавляют в подвергающийся брожению тесто, которое затем формуют и выпекают. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в публикации 1Р 03076529 (Нага е! а1.).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения улучшенных соевых пищевых продуктов. Соевые бобы объединяют с молекулами фитазы по настоящему изобретению, чтобы удалить фитиновую кислоту из соевых бобов, таким образом получая соевые пищевые продукты, которые улучшены в отношении поступления из них микроэлементов, необходимых для потребляющих продукты организмов, и в отношении усвояемости белков. В одном из аспектов при получении соевого молока молекулы, фитазы по настоящему изобретению добавляют или приводят в контакт с соевыми бобами, чтобы уменьшить содержание фитиновой кислоты. В не ограничивающем примере способ применения может быть ускорен встряхиванием соевого молока вместе с ферментом при нагревании или посредством проведения реакции типа смешивания при встряхивании емкости с использованием иммобилизованного фермента. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в
- 76 021178 общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в публикации 1Р 59166049 (КаткиЬо е! а1.).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения продукта в виде смеси для питьевой воды или корма для животных в жидкой форме, который включает использование смесей минеральных вещества и смесей витаминов, а также новых молекул фитазы по настоящему изобретению. В одном из аспектов достигается получение правильно дозированной и составленной смеси питательных веществ, необходимых для потребляющего организма, без какого-либо риска преципитации и разрушения важных минеральных веществ/витаминов, при этом одновременно достигается оптимальное использование связанного с фитином фосфата в корме. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например в публикации ЕР 0772978 (ВепЛхеп е! а1.).
Следует понимать, что молекулы фитазы по настоящему изобретению также могут быть использованы для получения других алкогольных и неалкогольных питьевых пищевых продуктов (или напитков), основанных на использовании плесневых грибков и/или зерновых и/или других растений. Такие питьевые пищевые продукты включают ликеры, вина, смешанные алкогольные напитки (например, напитки из разбавленного вина и соков, другие алкогольные напитки с кофе, такие как ирландский кофе и т.д.), пиво, безалкогольное пиво, соки, экстракты, гомогенаты и пюре. В одном из аспектов предлагаемые в настоящем изобретении молекулы фитазы используют для создания трансгенных вариантов плесневых грибков и/или зерновых культур и/или других растений, используемых для получения таких питьевых пищевых продуктов. В другом аспекте предлагаемые в настоящем изобретении молекулы фитазы используют в качестве дополнительных ингредиентов в процессе производства и/или в конечном содержимом таких питьевых пищевых продуктов. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам получения очищенной рисовой водки сакэ, имеющей пониженное количество фитина и повышенное содержание инозита. Такая водка сакэ может обладать - благодаря непосредственному и/или психогенному эффектам - профилактическим действием при заболеваниях печени, артериосклерозе и других заболеваниях. В одном из аспектов сакэ получают из риса Кодзи в качестве сырья, благодаря размножению плесневого гриба риса Кодзи, обладающего высокой фитазной активностью. Понятно, что молекулы фитазы по настоящему изобретению можно использовать для получения полезной плесени с повышенной активностью (например, трансгенной плесени) и/или их можно добавлять экзогенно для усиления эффектов плесени Кодзи. Штамм добавляют к вареному рису и получают Кодзи обычным способом. В одном из примеров используют полученную плесень Кодзи, целый рис готовят в две стадии и получают сакэ при постоянной температуре для сакэ 15°С, чтобы получить целевую очищенную водку сакэ, имеющую пониженное количество фитина и повышенное количество инозита. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в публикации 1Р 06153896 (8ода е! а1.) и 1Р 06070749 (8ода е! а1.).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вещества, вызывающего всасывание, способного стимулировать всасывание минеральных веществ, включая принимаемый вовнутрь кальций, без расщепления желудочным соком или кишечным соком, при низких затратах. В одном из аспектов вещество, вызывающее всасывание минеральных веществ, содержит частичный гидролизат фитиновой кислоты в качестве активного ингредиента. Частичный гидролизат фитиновой кислоты может быть получен в результате гидролиза фитиновой кислоты или ее солей с использованием новых молекул фитазы по настоящему изобретению. Обработка молекулами фитазы может быть осуществлена либо отдельно и/либо в виде комбинированной обработки (чтобы ингибировать или усилить конечный эффект), с последующим ингибированием гидролиза в определенном диапазоне, чтобы не высвободить все радикалы фосфата. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в публикации ΙΡ 04270296 (Но8Ыпо).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) получения композиции ферментов, обладающей аддитивной или синергетической активностью в гидролизе фитата; указанная композиция содержит новые молекулы фитазы по настоящему изобретению и один или несколько дополнительных реагентов, чтобы получить композицию, которая применима для комбинированной обработки. В одном из аспектов комбинированную обработку по настоящему изобретению осуществляют с использованием по меньшей мере двух фитаз со специфичностью к разным положениям, т.е. любого сочетания 1-, 2-, 3-, 4-, 5- и 6-фитаз. При объединении фитаз со специфичностью к разным положениям получают аддитивный или синергетический эффект. Композиции, такие как пищевой продукт и корм или пищевые и кормовые добавки, содержащие такие фитазы в сочетании, также включены в настоящее изобретение, также как и способы их получения. Дополнительные подробности, имеющие отношение к указанному способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в публикации АО 30681 (ОЬтаии е! а1.).
В другом аспекте комбинированную обработку по настоящему изобретению осуществляют с ис- 77 021178 пользованием кислой фосфатазы, обладающей гидролизующей фитат активностью при рН 2,5, при низком соотношении, соответствующем профилю активности при рН, примерно от 0,1:1,0 до 10:1, или примерно от 0,5:1,0 до 5:1, или примерно от 0,8:1,0 до 3:1, или примерно от 0,8:1,0 до 2:1. Композиция ферментов может обладать более высокой синергетической эффективностью при гидролизе фитата при термической обработке. Композиция ферментов применима для обработки пищевых продуктов (питьевых и твердых пищевых продуктов, корма и кормовых продуктов) с целью улучшения гидролиза фитата. Дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в патенте США № 5554399 ^аибегЬеке е1 а1. ) и патенте США № 5443979 ЩаибегЬеке е1 а1.), в которых содержатся инструкции по применению фитаз грибов (в частности, Αкре^§^11ик).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) получения композиции, содержащей новый действующий на фитат фермент по изобретению в сочетании с одним или несколькими дополнительными ферментами, которые действуют на полисахариды. Такие полисахариды могут быть выбраны из группы, состоящей из арабинанов, фруктанов, фуканов, галактанов, галактуронанов, глюканов, маннанов, ксиланов, левана, фукоидана, каррагинана, галактокаролозы, пектина, пектиновой кислоты, амилозы, пуллулана, гликогена, амилопектина, целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, декстрана, пустулана, хитина, агарозы, кератана, хондроитина, дерматана, гиалуроновой кислоты, альгиновой кислоты и полисахаридов, содержащих по меньшей мере одну альдозу, кетозу, кислоту или амин, выбранный из группы, состоящей из эритрозы, треозы, рибозы, арабинозы, ксилозы, ликсозы, аллозы, альтрозы, глюкозы, маннозы, гулозы, идозы, галактозы, талозы, эритрулозы, рибулозы, ксилулозы, псикозы, фруктозы, сорбозы, тагатозы, глюкуроновой кислоты, глюконовой кислоты, глукаровой кислоты, галактуроновой кислоты, маннуроновой кислоты, глюкозамина, галактозамина и нейраминовой кислоты.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) получения композиции, обладающей синергетической гидролизующей фитат активностью, содержащей одну или несколько новых молекул фитазы по настоящему изобретению, целлюлазу (также может быть включена ксиланаза), необязательно, протеазу и, необязательно, один или несколько дополнительных реагентов. В альтернативных аспектах такие комбинированные обработки применимы при обработке пищевых продуктов, лесоматериалов, таких как бумажные продукты, и в качестве растворов моющих средств и очищающих твердых веществ.
В одном из аспектов фитазы по изобретению используют в сочетании с целлюлозными компонентами. Известно, что целлюлазы многих целлюлолитических бактерий организованы в виде дискретных многоферментных комплексов, называемых целлюлосомами. Множественные субъединицы целлюлосом состоят из многочисленных функциональных доменов, которые взаимодействуют друг с другом и с целлюлозным субстратом. Одна из таких субъединиц содержит отличающийся новый класс некаталитического опорного полипептида, который избирательно интегрирует различные субъединицы целлюлазы и ксиланазы в сцепленный комплекс. Рациональное применение гибридов целлюлосом и химерных конструкций целлюлосомных доменов позволит лучше использовать целлюлозную биомассу и может обеспечить широкий диапазон новых применений в исследованиях, медицине и промышленности.
В одном из аспектов фитазы по изобретению используют либо отдельно, либо в комбинированных обработках, в области биологического размягчения древесины и биологического отбеливания, при этом желательно уменьшение использования опасных для окружающей среды химических веществ, традиционно используемых в целлюлозной и бумажной промышленности. Обработка сточных вод представляет другую огромную область применения, в которой, как было показано, биологические ферменты являются эффективными не только для обесцвечивания, но также в биологическом превращении потенциально вредных вещества в полезные биопродукты.
В одном из аспектов фитазы по изобретению используют для создания жизненных форм, которые могут обеспечивать по меньшей мере одну ферментативную активность либо отдельно, либо при комбинированных обработках, при обработке пищеварительных систем организмов. Особенно подходящими организмами, которые могут быть обработаны, являются нежвачные организмы, хотя жвачные организмы также могут получить пользу от такой обработки. В частности, понятно, что такой способ можно осуществлять отдельно или в сочетании с другими биологическими молекулами (например, ксиланазами) для создания рекомбинантного хозяина, который экспрессирует множество биологических молекул. Также понятно, что введение молекул фитазы по изобретению и/или рекомбинантных хозяев, экспрессирующих молекулы фитазы по изобретению, можно осуществлять отдельно или в сочетании с другими биологическими молекулами и/или жизненными формами, которые могут обеспечивать ферментативные активности в пищеварительной системе, при этом указанные другие ферменты и указанные жизненные формы могут быть рекомбинантными или иными. Например, введение можно осуществлять в сочетании с ксиланолитическими бактериями.
Например, кроме фитата многие организмы также неспособны в достаточной мере расщеплять гемицеллюлозы. Гемицеллюлозы или ксиланы являются основными компонентами (35%) растительных материалов. В случае жвачных животных примерно 50% пищевых ксиланов расщепляется, но только
- 78 021178 небольшие количества ксиланов расщепляются в нижних отделах кишечника нежвачных животных и человека. В рубце основными ксиланолитическими видами являются ВЩугкФпо ПЬпкокепк и Вас!его1кек тт1тсо1а. В ободочной кишке человека основными ксиланолитическими бактериями являются ВасЮгспкек ονа!ик и Вас!его1кек ГгадШк подвида а. Ксиланы являются химически сложными, и для их разрушения требуется множество ферментов. Экспрессия таких ферментов кишечными бактериями сильно варьирует у разных видов. ВЩугкгЬпо ПЬпкокепк образует внеклеточные ксиланазы, а Вас!его1кек креаек обладает связанной с клетками ксиланазной активностью. Биохимическая характеристика ксиланазных ферментов кишечных бактерий еще осуществлена не полностью. Ген ксилозидазы был клонирован из В. ПЬгококепк. Данные о гибридизации ДНК, полученные с использованием гена ксиланазы, клонированного из В. ПЬпкокепк, свидетельствуют, что данный ген может присутствовать в других штаммах В. ПЬпкокепк. Клонированную ксиланазу Вас!. Киш1тсо1а переносили и экспрессировали на высоком уровне в клетках Вас!. ГгадШк и Вас!. ишГогпнк. Гены арабинозидазы и ксилозидазы из Вас!. ονа!ик были клонированы, и обе каталитические активности, по-видимому, осуществляются одним новым бифункциональным ферментом.
В одном из аспектов фитазы по изобретению применимы для 1) переноса в подходящего хозяина (такого как Вас!. ГгадШк или Вас!. шпГопшк); 2) осуществления адекватной экспрессии в полученном рекомбинантном хозяине; и 3) введения указанного рекомбинантного хозяина в организмы, чтобы повысить способность обрабатываемых организмов разрушать фитат. Продолжающиеся исследования в области генетики и биохимии позволят получить сведения и информацию, необходимую для манипулирования расщеплением на уровне кишечника, и лучше понять процесс переваривания волокон в толстом кишечнике.
Дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, изобретение может включать способы, которые описаны в патенте США № 5624678 (ВекГогк е! а1.), патенте США № 5683911 (Вок1е е! а1.), патенте США № 5720971 (ВеаисЬетш е! а1.), патенте США № 5759840 (8ипд е! а1.), патенте США № 5770012 (Соорег), патенте США № 5786316 (Ваеск е! а1.), патенте США № 5817500 (Напкеп е! а1.).
Настоящему изобретение свидетельствует, что молекулы фитазы по настоящему изобретению могут быть добавлены к указанному реагенту(ам), чтобы получить препараты, обладающие дополнительной фитазной активностью. В одном из аспектов реагент(ты) и дополнительные молекулы фитазы не будут ингибировать друг друга. В одном из аспектов реагент(ты) и дополнительные молекулы фитазы могут оказывать общее аддитивное влияние. В одном из аспектов реагент(ты) и дополнительные молекулы фитазы могут оказывать общее синергетическое влияние.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) усиления утилизации фитатного фосфора и лечения и профилактики дисхондроплазии большеберцовой кости у животных, особенно у птиц, посредством введения животным кормовой композиции, содержащей гидроксилированное производное витамина Ό3. Производное витамина Ό3 можно вводить животным в корме, содержащем пониженные уровни кальция и фосфора, для усиления утилизации фитатного фосфора. Соответственно, производное витамина Ό3 можно вводить в сочетании с новыми молекулами фитазы по настоящему изобретению для дополнительного усиления утилизации фитатного фосфора. Дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в патенте США № 5516525 (Ек\\агкк е! а1.) и патенте США № 5366736 (Ек\\агкк е! а1.), патенте США № 5316770 (Ек\\агкк е! а1.).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) получения пищевого продукта, который 1) содержит фитин, который легко всасывается и утилизируется в форме инозита в организме; 2) который способен уменьшать количество фосфора в экскрементах; и 3) который соответствующим образом применим для уменьшения загрязнения окружающей среды. Указанный пищевой продукт состоит из смеси содержащего фитин зерна, микроорганизма, продуцирующего молочную кислоту, и новой молекулы фитазы по настоящему изобретению. В одном из аспектов указанный пищевой продукт получают, объединяя содержащее фитин зерно (например, рисовые отруби) с эффективной группой микроорганизмов, обладающих ацидофильным свойством, продуцирующих молочную кислоту без продуцирования масляной кислоты, не обладающих патогенностью, и фитазой. Примеры эффективной группы микроорганизмов включают, например, виды 8!гер!отусек (Американская коллекция типов культур № АТСС 3004), относящиеся к группе актиномицетов, и виды Ьас!оЬасШик (1РО 3070), относящиеся к группе лактобактерий.
Примерное количество добавляемой эффективной группы микроорганизмов составляет 0,2 мас.% на основе пересчета бактериальной массы относительно массы зерна. В одном из аспектов количество добавляемой фитазы составляет примерно 1-2 мас.% на основе пересчета массы фитина относительно массы зерна. Дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в 1Р 08205785 (АкаПоп е! а1.).
- 79 021178
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу повышения растворимости растительных белков. Более конкретно изобретение относится к способам солюбилизации белков в источниках растительных белков, и такие способы включают обработку источника растительных белков эффективным количеством одного или нескольких фитазных ферментов по изобретению и обработку источника растительных белков эффективным количеством одного или нескольких протеолитических ферментов. В другом аспекте изобретение относится к добавкам в корма для животных, содержащим фитазу по изобретению и один или несколько протеолитических ферментов. Дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в ЕР 0756457 (\УО 9528850 А1) (№е1кеп и Кпар).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения препарата растительного белка, включающему диспергирование материалов источника растительного белка в воде при рН в диапазоне от 2 до 6 и добавлением в смесь молекул фитазы по настоящему изобретению. Кислотный экстракт, содержащий растворимый белок, отделяют и сушат с получением твердого белка с требуемым свойством. Одну или несколько протеаз также можно использовать для улучшения характеристик белка. Дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в патенте США № 3966971.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу (и полученным таким способам продуктам) активации инертного фосфора в почве и/или компосте, повышения коэффициента использования соединения азота и для подавления размножения патогенных плесневых грибов в результате добавления трех реагентов: фитазы, сапонина и хитозана, к компосту.
В одном из аспектов способ может включать обработку компоста 1) добавлением содержащих фитазу микроорганизмов в среде, например, рекомбинантных хозяев, которые сверхэкспрессируют новые молекулы фитазы по настоящему изобретению, например, 100 мл среды/100 кг влажного компоста; 2) альтернативно также добавлением содержащего фитазу растительного источника, такого как пшеничные отруби, например, от 0,2 до 1 кг/100 кг влажного компоста; 3) добавлением содержащего сапонин источника, такого как торф, растения полыни и юкки, например, от 0,5 до 3,0 г/кг; 4) добавлением содержащих хитозан материалов, таких как измельченные в порошок панцири креветок, крабов и т.д., например, от 100 до 300 г/кг влажного компоста.
В одном из аспектов используют рекомбинантные источники трех реагентов, фитазы, сапонина и хитозана. Дополнительные подробности или альтернативные протоколы, имеющие отношение к такому способу, описаны в общедоступной литературе и/или известны специалисту в данной области, например, в ,1Р 07277865 (Тоуа Такике).
В некоторых случаях может быть преимущественной доставка и экспрессия последовательности фитазы по изобретению локально (например, в конкретной ткани или типе клеток). Например, локальная экспрессия фитазы или пищеварительного фермента в кишечнике животного будет способствовать перевариванию и усвоению, например, фитата и фосфора соответственно. Нуклеиновая последовательность может быть непосредственно доставлена в слюнные железы, ткань и клетки и/или в эпителиальные клетки, выстилающие, например, кишечник. Такие способы доставки известны в данной области и включают электропорацию, использование вирусных векторов и прямое поглощение ДНК. Любой полипептид, обладающий фитазной активностью, может быть использован в способах по изобретению (например, пептиды, специально описанные в разделе 6.3.18, а также пептиды, описанные в других разделах описания изобретения).
Например, конструкции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению будут содержать молекулы нуклеиновой кислоты в форме, подходящей для поглощения клетками-мишенями в ткани хозяина. Нуклеиновые кислоты могут быть в форме голых молекул ДНК или РНК, при этом молекулы могут содержать один или несколько структурных генов, один или несколько регуляторных генов, антисмысловые нити, нити, способные образовывать триплекс, или тому подобное. Обычно конструкция нуклеиновой кислоты будет содержать по меньшей мере один структурный ген под транскрипционным и трансляционным контролем подходящей регуляторной области. Более обычно, конструкции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению будут содержать нуклеиновые кислоты, включенные в носитель для доставки, чтобы повысить эффективность трансфекции, при этом носитель для доставки будет диспергирован в более крупных частицах, содержащих высушенное гидрофильное веществе эксципиента.
Одни из таких носителей для доставки содержат вирусные векторы, такие как ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы, которые были инактивированы для предотвращения саморепликации, но которые сохраняют природную вирусную способность связывать клетку-мишень хозяина, доставлять генетический материал в цитоплазму клетки-мишени хозяина и стимулировать экспрессию структурных или других генов, которые были включены в частицу. Подходящие ретровирусные векторы для опосредованного переноса генов описаны КаНп е( а1., (1992) (С'агс. Рек. 71: 1508-1517). Подходящая доставка генов аденовирусами описана РокепГе1б е( а1., (1991) (8аепсе 252: 431-434). И ретровирусные и аденовирусные системы доставки описаны Рпебтап (1989) (8аепсе 244: 1275-1281).
- 80 021178
Второй тип носителя для доставки нуклеиновой кислоты содержит липосомные носители для трансфекции, включая как анионные, так и катионные липосомные конструкции. Использование анионных липосом требует захватывания нуклеиновых кислот в липосому. Катионные липосомы не требуют захватывания нуклеиновых кислот, и вместо этого могут быть образованы при простом смешивании нуклеиновых кислот и липосом. Катионные липосомы прочно связываются с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновой кислоты, включая как ДНК, так и РНК, с образованием комплексов, которые обеспечивают достаточную эффективность трансфекции для многих типов клеток. Смотри публикацию РагНооб с! а1. (1992) ВюсНст. ВюрНук. Ас!а. 1111: 239-246. Примером вещества для образования липосомных носителей является липофектин, который состоит из эквимолярной смеси диолеилфосфатидилэтаноламина (Э0РЕ) и диолеилоксипропилтриэтиламмония (Э0ТМА), как описано в Радпег апб Кшдо1б (1989) Хаите 337: 387-388.
Также возможно сочетание двух таких типов систем доставки. Например, Ка1п с! а1., (1992) (смотри выше) указывают, что ретровирусный вектор можно сочетать с катионным носителем на основе ЭЕАЕдекстрана, чтобы дополнительно повысить эффективность трансформации. Также можно включать ядерные белки в вирусные и/или липосомные носители для доставки, чтобы еще больше повысить эффективность трансфекции. Смотри, Капеба с! а1. (1989) 8с1епсс 243: 375-378.
В другом аспекте предлагается способствующее пищеварению средство, содержащее фермент, либо в виде единственного активного ингредиента, либо в сочетании с одним или несколькими другими средствами и/или ферментами. Использованием ферментов и других агентов в способствующих пищеварению средствах для сельскохозяйственных или домашних животных не только улучшает состояние и продолжительность жизни животных, но также способствует улучшению здоровья сельскохозяйственных животных и повышению выхода пищевых продуктов, получаемых от таких животных.
В изобретении также можно использовать корма для сельскохозяйственных животных (например, корм для некоторых домашних птиц), которые содержат высокие уровни многочисленных добавок минеральных веществ (например, неорганического фосфора), ферментов, факторов роста, лекарственных средств и других средств, которые необходимо доставлять сельскохозяйственным животным. Такие добавки возмещают калорийность и заменяют природные питательные вещества, присутствующие, например, в зерне. При уменьшении или исключении из корма добавки неорганического фосфора и других добавок (например, солей микроэлементов, факторов роста, ферментов, антибиотиков) корм еще способен нести питательные вещества и энергию. Соответственно, оставшаяся пища может содержать немало пригодной энергии. Например, рацион на основе муки из зернового жмыха обычно содержит примерно 3200 ккал преобразуемой при метаболизме энергии на килограмм корма, а минеральные соли дают не преобразуемую в ходе метаболизма энергию. Следовательно, удаление ненужных минералов и замена зерном увеличивает используемую энергию в рационе. Таким образом, изобретение отличается от обычно используемого содержащего фитазу корма. Например, в одном из аспектов используют биосовместимый материал, который является резистентным к расщеплению в желудочно-кишечном тракте организма.
Во многих организмах, включая, например, домашних и других птиц, таких как, например, куры, индейки, гуси, утки, попугаи, павлины, страусы, фазаны, перепела, голуби, эму, киви, гагары, кореллы, какаду, канарейки, пингвины, фламинго и голуби, пищеварительный тракт имеет мускульный желудок, в котором откладываются и используются твердые биосовместимые предметы (например, камни и раковины моллюсков), помогающие в расщеплении семян или другого корма, потребляемого птицей. Типичный пищеварительный тракт такого общего семейства организмов включает пищевод, который содержит карман, называемый зобом, где пищевой продукт хранится в течение короткого периода времени. Из зоба пищевой продукт движется вниз в настоящий желудок или железистый желудок, где соляная кислота и пепсин начинают процесс пищеварения. Затем пищевой продукт движется в мускульный желудок, который имеет овальную форму и толстые стенки с мощными мышцами. Основной функцией мускульного желудка является перемалывание или размельчение частиц пищи, процесс, которому способствует проглатывание птицей небольших количеств мелкого гравия или песка. Из мускульного желудка пища передвигается в двенадцатиперстную кишку. Тонкий кишечник птиц сходен с кишечником млекопитающих. Имеется два слепых мешочка или слепых отростка, примерно 4-6 дюймов (10-15 см) длиной в месте соединения тонкой и толстой кишки. Толстый кишечник короткий, главным образом состоящий из прямой кишки длиной примерно 3-4 дюйма (7,5-10 см). Прямая кишка опорожняется в клоаку и экскременты выводятся через отверстие.
Твердые биосовместимые предметы, проглатываемые (или иным образом вводимые) и присутствующие в мускульном желудке, обеспечивают применимый вектор для доставки различных ферментативных, химических, терапевтических средств и антибиотиков. Такие твердые вещества имеют продолжительность жизни от нескольких часов до нескольких суток и проходят после определенного периода времени. Соответственно, изобретение относится к покрытым оболочками, пропитанным (например, пропитанный матрикс и мембраны) модифицированным вспомогательным пищевым добавкам для доставки полезных стимулирующих пищеварение или терапевтических средств в организм. Такие вспомогательные пищевые добавки включают предметы, которые обычно проглатываются организмом, чтобы
- 81 021178 облегчить пищеварение в мускульном желудке (например, камни или песок). Изобретение относится к биосовместимым предметам, которые были покрыты или пропитаны средствами, применимыми в качестве средств, способствующих пищеварению в организме, или применимыми для доставки терапевтического или лекарственного средства или химического вещества.
В одном из аспектов изобретение относится к вспомогательным пищевым добавкам, содержащим биосовместимую композицию, предназначенную для высвобождения средства, которое способствует пищеварению, при этом биосовместимая композиция предназначена для перорального потребления и высвобождения в пищеварительном тракте (например, в мускульном желудке) организма. Биосовместимое означает, что вещество при контакте с организмом хозяина (например, птицы), не вызывает неблагоприятной реакции, достаточной для того, чтобы привести к отторжению вещества или сделать вещество нефункциональным. Такая утрата функциональности может возникать, например, в результате образования фиброзной структуры вокруг вещества, ограничивающей диффузию средств, которыми была произведена пропитка, в организм хозяина, или образования вещества, которое приводит к увеличению смертности или заболеванию организмов вследствие токсичности или инфекции. Биосовместимое вещество может быть биологически неразрушаемым или биологически разрушаемым. В одном из аспектов биосовместимая композиция устойчива к разрушению или перевариванию в желудочно-кишечном тракте. В другом аспекте биосовместимая композиция имеет консистенцию камня или косточки.
Биологически неразрушаемым материалом, применимым в изобретении является материал, который позволяет связывать или пропитывать его пищевым средством. Неограничивающие примеры таких биологически не разрушаемых материалов включают, например, термопластики, такие как акриловые, модакриловые, полиамидные, поликарбонатные, полиэфирные, полиэтиленовые, полипропиленовые, полистиреновые, полисульфоновые, полиэфирсульфоновые и поливинилиденфторидные. Эластомеры также являются используемыми материалами и включают, например, полиамид, сложный полиэфир, полиэтилен, полипропилен, полистирол, полиуретан, поливиниловый спирт и силикон (например, основанные на силиконе или содержащие диоксид кремния). Изобретение относится, что биосовместимая композиция может содержать множество таких материалов, которые можно, например, смешивать или наслаивать с образованием смесей, сополимеров или их сочетаний.
В одном из аспектов биологически разрушаемое вещество означает, что композиция будет разъедаться или разрушаться ш νί\Ό с образованием более мелких химических частиц. Разрушение может происходить, например, в ходе ферментативных, химических или физических процессов. Подходящие биологически разрушаемые вещества, предполагаемые для применения в изобретении, включают без ограничения, поли(лактиды), поли(гликолиды), поли(молочные кислоты), поли(гликолевые кислоты), полиангидриды, сложные полиортоэфиры, полимеры простых и сложных эфиров, поликапролактон, полиамидоэфиры, поликарбонат, полицианоакрилат, полиуретаны, полиакрилат и тому подобные. Такие вещества можно смешивать или наслаивать с образованием смесей, сополимеров или их сочетаний.
В одном из аспектов несколько разных биосовместимых вещества по изобретению могут быть даны животному и последовательно им проглочены, или иным образом доставлены в один и тот же организм одновременно или в различных сочетаниях (например, одно вещества перед другим). Кроме того, биосовместимые вещества по изобретению могут быть предназначены для медленного прохождения по пищеварительному тракту. Например, крупные или жирные вещества имеют тенденцию продвигаться более медленно по пищеварительному тракту, соответственно, можно использовать биосовместимый материал, имеющий крупный размер, чтобы предотвратить быстрое прохождение пищеварительного тракта. Такие крупные вещества могут представлять собой сочетание биологически не разрушаемых и биологически разрушаемых веществ. Например, небольшое биологически не разрушаемое вещество может быть заключено в биологически разрушаемое вещество по изобретению, так что в течение определенного периода времени биологически разрушаемая часть будет разрушаться, позволяя биологически неразрушаемой части проходить по пищеварительному тракту. Кроме того, понятно, что любое количество корригентов вкуса и запаха могут быть добавлены к биосовместимому веществу по изобретению, чтобы помочь в его употреблении.
Любое количество средств отдельно или в сочетании с другими средствами могут быть нанесены в виде покрытия на биосовместимые вещества по изобретению, включая, например, полипептиды (например, ферменты, антитела, цитокины или терапевтические малые молекулы) и антибиотики. Примеры конкретных применимых средств указаны в таблице 1 и 2 ниже. Также предполагается, что могут быть клетки инкапсулированы в биосовместимый материал по изобретению и использованы для доставки ферментов или терапевтических средств. Например, могут быть сконструированы пористые вещества, которые имеют поры, достаточно крупные для роста в них клеток и сквозь них, и такие пористые материалы затем могут поступать в пищеварительный тракт. Например, биосовместимое вещество по изобретению может содержать множество сред для микрофлоры (например, различную пористость, рН и т.д.), что обеспечивает поддержание множества типов клеток. Клетки могут быть генетически сконструированы для доставки конкретного лекарственного средства, фермента или химического вещества в организм. Клетки могут быть эукариотическими или прокаритическими.
Таблица 1
- 82 021178
Класс средства для лечения Химическое вещество Описание
Антибиотики Амоксициллин и его Лечение, направленное против
сочетание бактериальных болезней,
инъекция мастокса вызванных грамположительными и
(амоксициллин и клоксациллин) грамотрицательными бактериями
Ампициллин и его Лечение, направленное против
сочетание бактериальных болезней,
инъекция биолокса вызванных грамположительными и
(ампициллин и клоксациллин) грамотрицательными бактериями
Нитрофуразон + мочевина болюс Ые£геа Лечение генитальных инфекций
Триметоприм + Лечение инфекций дыхательных
сульфаметоксазол путей, инфекций желудочно-
болюс тризола кишечного тракта, мочеполовых инфекций
Метронидазол и Лечение бактериальных и
фуразолидон болюс метофура протозойных болезней
Фталилсульфатиазол, Лечение бактериальной и
пектин и каолин неспецифичной диареи,
пектолин бактериальной дизентерии и
болюс суспензия поноса у телят
Антигель- Эктопаразитицид Эктопаразитицид и антисептик
минтные мазь гермекс (гамма-
средства бензолгексахлорид, полусульфат профлавина и цетримид)
Эндопаразитициды > Профилактика и лечение
албендазол и его заражения круглыми червями,
сочетание албен ленточными червями и
(албендазол) суспензия (албендазол 2,5%) суспензия плюс (албендазол 5%) болюс форте (албендазол 1,5 г) таблетка (альбендазол 600 мг) порошок (албендазол 5%, 15%) трематодами ·
- 83 021178
Алпраз (альбендазол и празиквантел), таблетка Профилактика и лечение заражения круглыми червями и ленточными червями у собак и кошек
Оксиклозанид и его Профилактика и лечение
сочетание заражения трематодами
клозан (оксиклозанид)
болюс, суспензия
Тетзан (оксиклозанид и Профилактика и лечение
гидрохлорид заражения круглыми червями и
тетрамизола), болюс, трематодами
суспензия
Флузан (оксиклозанид и Профилактика и лечение
гидрохлорид заражения круглыми червями и
левамизола), болюс, усиление иммунитета
суспензия
Левамизол Профилактика и лечение
инъекция немазола заражения круглыми червями и
порошок вормила усиление иммунитета
Фенбендазол Профилактика и лечение
Фензол таблетка заражения круглыми червями и
(фенбендазол 150 мг) ленточными червями
болюс (фенбендазол 1,5
г) порошок
(фенбендазол 2,5%
масс./масс)
Укрепляющие Комплекс витамина В, Лечение анорексии, гепатита,
средства аминокислоты и астении, невралгических
экстракт печени судорог, истощения и задержки
инъекция гептогена роста
Левулинат кальция с Профилактика и лечение
витамином В12 и гипокальцемии, поддерживающая
витамином ϋ3 терапия болезненных состояний
инъекция гилактина (особенно гипотермии) и
лечение ранних стадий рахита
Кормовые Необходимые минералы, Лечение анэструса, вызывающего
добавки для селен и витамин Е бесплодие и повторное
животных болюс гинолактина осеменение у молочных животных
и лошадей
Необходимые минералы, Бесплодие, ложная лактация,
витамин Е и йод, пониженный иммунитет, задержка
порошок гилактина роста и слабость
Необходимые Диарея, обезвоживание, до и
электролиты с после перевозки, при
витамином С, порошок экстремальных температурах
электра-С (высоких или низких) и в
других условиях стресса
Пиренокс плюс Лечение мастита, лихорадки,
(диклофенак натрия + послеоперационной боли и
парацетамол) болюс, воспаления, опущения матки.
инъекция хромоты и артрита
- 84 021178
Таблица 2 Терапевтические препараты
Продукт Описание
Асибгтт® Подавитель аппетита в таблетках для приема
(фенилпропаноламин) один раз в сутки.
Насос ВахРег® Для контролируемой внутривенной доставки антикоагулянтов, антибиотиков, химиотерапевтических средств и других широко используемых лекарственных средств.
СаРаргез-ТТЗ® Трансдермальная система для лечения
(трансдермальная гипертензии, применяемая один раз в неделю.
терапевтическая
система доставки
клонидина)
Сомега НЗЗ Таблетки длительного высвобождения с
(гидрохлорид контролируемым началом (СОЕЕ-24) для
верапамила) лечения гипертензии и стенокардии, принимаемые один раз в сутки.
ОупаСхгс СЕ® Таблетки длительного высвобождения для
(исрадипин) лечения гипертензии, принимаемые один раз в сутки.
Е£1с1ас 24® (малеат Таблетки длительного высвобождения для
хлорфенирамина) облегчения симптомов аллергии, принимаемые один раз в сутки.
ЕзРгайегт® Трансдермальная система для лечения
(трансдермальная некоторых симптомов менопаузы и
система доставки профилактики остеопороза, применяемая два
эстрадиола) раза в неделю.
(31исоРго1 ХЬ® Таблетки длительного высвобождения,
(глипизид) используемые в качестве добавки к пище для контроля гипергликемии у пациентов с инсулиннезависимым сахарным диабетом, принимаемые один раз в сутки.
1УОМЕС ЗЕ® болюс Система руминаторной доставки для сезонного
(ивермектин) контроля основных внутренних и внешних паразитов крупного рогатого скота.
МФпФргезз ХЬ® Таблетки длительного высвобождения для
(празозин) лечения гипертензии, принимаемые один раз в
Νϊσοϋθπη® СО™ сутки. Трансдермальная система, используемая в
(трансдермальная качестве вспомогательного средства в случае
система доставки прекращения курения для ослабления
никотина) симптомов отмены никотина, применяемая один раз в сути.
РгосагсЦа ХЬ® Таблетки длительного высвобождения для
(нифедипин) лечения стенокардии или гипертензии, применяемые один раз в сутки.
3и<3а£еб® 24 часа Назальное противоотечное средство для
(псевдоэфедрин) облегчения простуд, синуситов, поллиноза и других респираторных аллергий, принимаемой один раз в сутки.
Тг апз <3е гт - Νί Р го® Трансдермальная система для профилактики
(трансдермальная стенокардии при болезни коронарных артерий.
система доставки применяемая один раз в сутки.
нитроглицирина)
Тгапзбегт Зсор® Трансдермальная система для профилактики
(трансдермальная тошноты и рвоты, связанных с укачиванием.
система доставки
скополамина)
- 85 021178
Уо1тах (албутерол) Таблетки длительного высвобождения для облегчения бронхоспазмов у пациентов с реверсивной обструкцией дыхательных путей.
АсбФзтбе® Периодонтальная нить, используемая в
(гидрохлорид качестве вспомогательного средства для
тетрациклина) удаления зубного камня и сглаживания поверхности корней для уменьшения глубины кармана и кровотечения при зондировании у пациентов с периодонтитом взрослых.
ΑΣΖΕΤ® Осмотические насосы для лабораторных исследований.
АтрЬобес® (комплекс АМРНОТЕС® является противогрибковым
амфотерицина В- средством для лечения инвазивного
холестеринсульфата аспергиллеза у тех пациентов, у которых
для инъекции) почечная недостаточность или неприемлемая токсичность не позволяют использовать амфотерицин В в эффективных дозах, и у пациентов с инвазивным аспергиллезом, у которых предварительное лечение амфотерицином В было неудачным.
ВФСФбга® (цитрат Подщелачивающее средство, используемое при
натрия и лимонная состояниях, когда желательно долговременное
кислота) сохранение щелочной реакции мочи.
ПФбгорап® (хлорид Для облегчения симптомов нестабильности
оксибутинина) мочевого пузыря, связанной с неконтролируемым нейрогенным или рефлекторным нейрогенным мочевым пузырем (например, неотложный позыв к мочеиспусканию, частое мочеиспускание, утечка мочи, неотложное недержание расстройство мочеиспускания).
ПФбгорап® ХЬ (хлорид Таблетка контролируемого высвобождения,
оксибутинина) показанная для лечения гиперактивного мочевого пузыря с симптомами неотложного недержания мочи, неотложных позывов к мочеиспусканию и частого мочеиспускания, принимаемая один раз в сутки.
ООХ1Ь® (липосомная
инъекция
доксорубицина-НС1)
ОигадезФс® 72-часовая трансдермальная система для
(трансдермальная управления хронической болью у пациентов,
система доставки которым необходима непрерывная анальгезия
фентанила) СИ опиоидами боли, с которой невозможно справиться более слабыми средствами, такими как сочетания ацетаминофена-опиоида, нестероидная анальгезия или дозы ΡΕΝ с опиоидами короткого действия.
ΕΙπιΪΓοη® Показан для ослабления боли или дискомфорта
(пентозанполисульфат мочевого пузыря, связанных с
натрия) интерстициальным циститом.
ЕЫАСТ АФгИабсЬ™ Система мониторинга и лечения астмы.
ЕДНуо1® (амифостин) Показан для уменьшения кумулятивной почечной токсичности, связанной с многократными введениями цисплатина, у пациентов с поздней стадией рака яичника или немелкоклеточным раком легкого. Показан для уменьшения частоты возникновения ксеростомии, от умеренной до тяжелой формы, у пациентов, подвергаемых послеоперационной лучевой терапии по поводу рака головы и шеи, когда место облучения включает значительную часть паращитовидных желез.
Мусе1ех®, пастилки Для местного лечения орофарингеального
(клотримазол) кондидоза. Также показан профилактически для снижения частоты появления орофарингеального кандидоза у пациентов с иммунной недостаточностью в условиях, которые включают химиотерапию, лучевую терапию или стероидную терапию, используемую при лечения лейкоза, солидных опухолей или при трансплантации почек.
Ыеибга-РПоз® (фосфат Пищевая добавка/добавка питательного
калия и натрия) вещества
- 86 021178
Ро1уСхбга®-К, ' Подщелачивающее средство, используемое при
пероральный раствор, таких состояниях, когда желательно
и Ро1уСд.бга®-К, долговременное сохранение щелочной реакции
кристаллы (цитрат мочи, например, у пациентов с мочевой
калия и лимонная кислотой и цистиновыми камнями в
кислота) мочевыводящих путях, особенно когда введение солей натрия нежелательно или противопоказано.
Ро1уС1бга®-К, сироп, Подщелачивающее средство, используемое при
и ЬС (трицитраты) таких состояниях, когда желательно долговременное сохранение щелочной реакции мочи, например, у пациентов с мочевой кислотой и цистиновыми камнями в мочевыводящих путях.
РгодезбазегС® Внутриматочная прогестероновая система
(прогестерон) контрацепции
ТезЬоДегт® с клейким Трансдермальная система доставки
веществом, и тестостерона
ТезСобегт® ТТ5 СШ Продукты Тезбобегт® показаны для заместительной терапии у мужчин в случае состояний, связанных с недостаточностью или отсутствием эндогенного тестостерона: (1) первичный гипогонадизм (врожденный или приобретенный) или (2) гипогонадотропный гипогонадизм (врожденный или приобретенный).
Утайиг™ (имплантат Имплантат для паллиативного лечения рака
ацетата лейпролида) простаты, применяемый один раз в год.
Некоторые средства могут быть предназначены для того, чтобы они становились активными или инактивированными в некоторых условиях (например, при некоторых значениях рН, в присутствии активирующего агента и т.д.). Кроме того, может быть полезным использование проферментов в композициях по изобретению. Например, проферменты могут быть активированы протеазой (например, протеазой слюны, которая присутствует в пищеварительном тракте или искусственно введена в пищеварительный тракт организма). Предполагается, что средства, доставляемые биосовместимыми композициями по изобретению, активируются или инактивируются при добавлении активирующего средства, которое может быть проглочено или иным образом доставлено в организм. Другой механизм для контролирования средства в пищеварительном тракте заключается в использовании чувствительного к окружающей среде средства, которое активируется в нужном отделе пищеварительного тракта. Например, средство может быть неактивным при низком рН, но активным при нейтральном рН. Соответственно, средство может быть неактивным в желудке, но активным в кишечнике. Альтернативно, средство может становиться активным в ответ на присутствие фактора, специфичного для микроорганизма (например, микроорганизмов, присутствующих в кишечнике).
В одном из аспектов возможные преимущество настоящего изобретения включают, например, (1) уменьшение или возможное исключение необходимости в добавках минеральных веществ (например, добавок неорганического фосфора), ферментов или терапевтических средств для животного (включая рыб) к ежедневному корму или зерну, что увеличивает калорийность и количество питательных веществ, присутствующих в корме, и (2) улучшение здоровья и роста домашних и не домашних животных, включая, например, птиц, свиней, коров, лошадей, собак и кошек.
Большое количество ферментов можно использовать в способах и композициях по настоящему изобретению кроме фитазы по изобретению. Такие ферменты включают ферменты, необходимые для правильного переваривания потребляемых пищевых продуктов или правильного метаболизма, активации или дериватизации химических веществ, пролекарств или других средств или соединений, доставляемых в организм животного через пищеварительный тракт. Примеры ферментов, которые могут быть доставлены или введены в композиции по изобретению, включают, например, усиливающие питание ферменты, выбранные из группы, состоящей из α-галактозидаз, β-галактозидаз, в частности лактаз, фитаз, βглюканаз, в частности, эндо-β-1,4-глюканаз и эндо-в-1,3(4)-глюканаз, целлюлаз, ксилозидаз, галактаназ, в частности, арабиногалактанэндо-1,4-в-галактозидаз и арабиногалактанэндо-1,3-в-галактозидаз, эндоглюканаз, в частности, эндо-1,2-в-глюканазы, эндо-1,3-а-глюканазы и эндо-1,3-в-глюканазы, разрушающих пектин ферментов, в частности пектиназ, пектинэстераз, лиаз пектина, полигалактуроназ, арабинаназ, рамногалактуроназ, рамногалактуронанацетилэстераз, рамногалактуронан-а-рамнозидазы, пектатлиаз и α-галактуронизидаз, маннаназ, β-маннозидаз, маннанацетилэстераз, ксиланацетилэстераз, протеаз, ксиланаз, арабиноксиланаз, и липолитических ферментов, таких как липазы, фитазы и кутиназы. Другие фитазы в дополнение к фитазам, имеющим аминокислотную последовательность δЕ^ ΙΌ NО:2, можно
- 87 021178 использовать в способах и композициях по изобретению.
В одном из аспектов фермент, используемый в композициях (например, вспомогательная пищевая добавка) по настоящему изобретению, представляет собой фермент фитазу, который является стабильным при нагревании и резистентным к нагреванию и катализирует ферментативный гидролиз фитата, т.е,, фермент способен ренатурировать и восстанавливает активность после кратковременного воздействия (т.е., от 5 до 30 с) или воздействия в течение более длительного периода, например, в течение минут или часов, температур выше 50°С.
Корм и пищевой продукт, соответственно, означают любую природную или искусственную еду, пищу или тому подобное или компоненты такой пищи, предназначенные или подходящие для поедания, поглощения, переваривания животным и человеком соответственно. Вспомогательная пищевая добавка в используемом в настоящем описании смысле означает, например, композицию, содержащую средства, которые обеспечивают терапевтическое или способствующее пищеварению средство животному или организму. Вспомогательная пищевая добавка обычно не является источником калорийности, потребляемой организмом, другими словами, вспомогательная пищевая добавка обычно не является источником энергии для организма, а является композицией, которую потребляют в дополнение к обычному корму или пищевому продукту.
В различных аспектах изобретения предлагается композиция корма, который содержит рекомбинантный фитазный белок, имеющий по меньшей мере тридцать непрерывно следующих друг за другом аминокислот белка, имеющего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Ν0:2; и содержащий фитат пищевой продукт. Как известно специалистам в данной области, такие композиции могут быть получены несколькими способами, включая без ограничения, получение в пеллетированной форме с покрытыми полимерами добавками или без таких добавок, в гранулированной форме и получение с использованием распылительной сушки. В качестве не ограничивающего примера публикации в данной области, содержащие инструкции по получению препарата корма, включают международные публикации № А0 0070034 А1, А0 0100042 А1, А0 0104279 А1, А0 0125411 А1, А0 0125412 А1 и ЕР 1073342А.
Средство или фермент (например, фитаза) может проявлять свое влияние ш уйго или ίΐ'ΐ νί\Ό, т.е. до поглощения или в желудке или мускульном желудке организма, соответственно. Также возможно комбинированное действие.
Хотя любой фермент можно включать в состав вспомогательной пищевой добавки, в настоящем описании указана фитаза в качестве примера способов и композиций по изобретению. Вспомогательная пищевая добавка по изобретению включает фермент (например, фитазу). Обычно вспомогательная пищевая добавка, содержащая фитазную композицию, является жидкой или сухой.
В случае жидких композиций не нужно ничего больше, кроме фермента (например, фитазы), предпочтительно, в высоко очищенной форме. Однако обычно также добавляют стабилизатор, такой как глицерин, сорбит или монопропиленгликоль. Жидкая композиция также может содержать другие добавки, такие как соли, сахара, консерванты, средства, корректирующие рН, белки, фитат (субстрат фитазы). Обычные жидкие композиции являются водными или полученными на основе масса взвесями. Жидкие композиции могут быть добавлены к биосовместимой композиции для медленного высвобождения. Предпочтительно, фермент добавляют к композиции вспомогательной пищевой добавки, которая является биосовместимым материалом (например, биологически разрушаемым или биологически не разрушаемым), и включает добавление рекомбинантных клеток, например, к пористым микрошарикам.
Сухие композиции могут представлять собой композиции, полученные распылительной сушкой, и в таком случае в композиции не нужно ничего больше, кроме фермента в сухой форме. Однако обычно сухие композиции представляют собой так называемые грануляты, которые можно легко смешивать с компонентами пищи или корма, или, более предпочтительно, образуют компонент премикса. Размер частиц гранулята фермента, предпочтительно, совместим с размером частиц других компонентов смеси. Это обеспечивает безопасные и удобные способы введения ферментов в корм для животных. Грануляты по изобретению могут быть биосовместимыми, или они могут быть биосовместимыми гранулятами, которые биологически не разрушаются.
Агломерационные грануляты по изобретению, покрытые ферментом, могут быть получены с использованием способа агломерации в мешалке с большими сдвиговыми усилиями. Абсорбционные грануляты получают, имея сердцевины из материала носителя, чтобы абсорбировать/покрыть их ферментом. В одном из аспектов материал носителя является биосовместимым биологически не разрушаемым материалом, который имитирует роль камней или песка в мускульном желудке животного. Обычные вещества-наполнители, используемые в способе агломерации, включают соли, такие как сульфат динатрия. Другими наполнителями являются каолин, тальк, алюмосиликат магния и волокна целлюлозы. Необязательно, в агломерационные грануляты также включают связывающие средства, такие как декстрины. Материалы-носители могут представлять собой любой биосовместимый материал, включая биологически разрушаемые и биологически не разрушаемые материалы (например, камни, косточки, керамику, различные полимеры). В одном из аспектов грануляты покрыты смесью для покрытия. Такая смесь содержит покрывающие средства, например, гидрофобные средства для покрытия, такие как гидрогенизированное пальмовое масло и говяжий жир, и при необходимости другие добавки, такие как карбонат
- 88 021178 кальция или каолин.
В одном из аспектов композиции вспомогательных пищевых добавок (например, композиции вспомогательной пищевой добавки фитазы) могут содержать другие заменители, такие как красители, ароматизаторы, стабилизаторы, витамины, минералы, другие усиливающие питание и кормление ферменты и т.д. В одном из аспектов добавка, используемая в композиции по изобретению, содержит одно или несколько соединений, таких как витамины, минералы или усиливающие питание ферменты, и подходящие носители и/или эксципиенты.
В одном из аспектов композиции вспомогательных пищевых добавок по изобретению дополнительно содержат эффективное количество одного или нескольких усиливающих питание ферментов, в частности, усиливающих питание ферментов, выбранных из группы, состоящей из α-галактозидаз, βгалактозидаз, в частности, лактаз, других фитаз, β-глюканаз, в частности, эндо-в-1,4-глюканаз и эндо-β1,3(4)-глюканаз, целлюлаз, ксилозидаз, галактаназ, в частности, арабиногалактанэндо-1,4-в-галактозидаз и арабиногалактанэндо-1,3-в-галактозидаз, эндоглюканаз, в частности, эндо-1,2-в-глюканазы, эндо-1,3α-глюканазы и эндо-1,3-в-глюканазы, разрушающих пектин ферментов, в частности, пектиназ, пектинэстераз, пектинлиаз, полигалактуроназ, арабинаназ, рамногалактуроназ, рамногалактуронанацетилэстераз, рамногалактуронан-а-рамнозидазы, пектатлиаз и α-галактуронизидаз, маннаназ, β-маннозидаз, маннанацетилэстераз, ксиланацетилэстераз, протеаз, ксиланаз, арабиноксиланаз, и липолитических ферментов, таких как липазы, фитазы и кутиназы.
Вспомогательную пищевую добавку для животных по изобретению в случае животного с однокамерным желудком добавляют до или одновременно с пищей. В одном из аспектов вспомогательную пищевую добавку по изобретению добавляют в случае животного с однокамерным желудком одновременно с пищей. В другом аспекте вспомогательную пищевую добавку добавляют к пище в форме гранулята или стабилизированной жидкости.
Эффективное количество фермента во вспомогательной пищевой добавке по изобретению составляет примерно 10-20000, примерно от 10 до 15000, примерно от 10 до 10000, примерно от 100 до 5000, или примерно от 100 до примерно 2000 РУТ/на кг вспомогательной пищевой добавки.
Не ограничивающими примерами других конкретных применений фитазы по изобретению являются обработка сои и производство инозита или его производных.
Изобретение также относится к способу уменьшения уровней фитата в помете животного, при этом животное кормят вспомогательной пищевой добавкой, содержащей эффективное количество фитазы по изобретению. Как указано в начале настоящей заявки, один из его важных эффектов является уменьшение загрязнения окружающей среды фосфатом.
В другом аспекте вспомогательной пищевой добавкой является магнитный носитель. Например, магнитный носитель, содержащий фермент (например, фитазу), распределенную в магнитном носителе, на магнитном носителе или сквозь магнитный носитель (например, пористый магнитный шарик), можно распределить поверх площади с высоким содержанием фитата и собрать магнитами через определенный период времени. Такое распределение и повторный сбор шариков уменьшает дополнительное загрязнение и позволяет повторно использовать шарики. Кроме того, использованием таких магнитных шариков 1и У1уо позволяет локализовать вспомогательную пищевую добавку в том месте пищеварительного тракта, в котором может быть осуществлена, например, фитазная активность. Например, вспомогательная пищевая добавка по изобретению, содержащая пищеварительные ферменты (например, фитазы) может быть локализована в мускульном желудке животного посредством прикладывания магнита напротив мускульного желудка животного после того, как животное проглотило вспомогательную пищевую добавку в виде магнитных носителей. Магнит может быть удален после определенного периода времени, чтобы позволить вспомогательной пищевой добавке пройти через пищеварительный тракт. Кроме того, магнитные носители подходят для извлечения из организма после умерщвления или способствуют сбору.
Когда вспомогательная пищевая добавка представляет собой пористую частицу, такие частицы обычно пропитаны веществом, в случае которого желательно медленное высвобождение, с образованием частицы для медленного высвобождения. Такие частицы медленного высвобождения могут быть получены не только в результате пропитывания пористых частиц веществом, высвобождение которого требуется, но также сначала растворением требуемого вещества в первой дисперсионной фазе. В таком случае, частицы медленного высвобождения, полученные способом, при котором вещество, которое необходимо высвобождать, сначала растворяют в первой дисперсионной фазе, также входят в объем и составляют сущность изобретения. Пористые полые частицы, например, могут быть пропитаны веществом для медленного высвобождения, таким как лекарственное средство, агрохимикатом или ферментом. В частности, когда пористые полые частицы, пропитанные ферментом, изготовлены из биологически разрушаемых полимеров, такие частицы сами по себе могут быть использованы в качестве агрохимиката или удобрения, и они не оказывают неблагоприятного влияния на окружающую среду. В одном из аспектов пористые частицы являются магнитными по природе.
Пористые полые частицы могут быть использованы в качестве основы биореактора, в частности, ферментативной основы. Следовательно, предпочтительно, получение вспомогательной пищевой добав- 89 021178 ки с использованием способа медленного высвобождения, например, в результате инкапсулирования ферментативного средства в микроносителе, таком как липосома, из которого высвобождается определенная доза в течение нескольких суток, предпочтительно, примерно от 3 до 20 суток. Альтернативно, средство (например, фермент) может быть приготовлено в виде препарата для медленного высвобождения, например, включением в полимер для медленного высвобождения, из которого доза средства (например, фермента) медленно высвобождается в течение нескольких суток, например, от 2 до 30 суток и такой период может достигать продолжительности, равной продолжительности жизни животного.
В одном из аспектов липосомы по изобретению получают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомы образуются одно- или многослойными гидратированными жидкими кристаллами, которые диспергированы в водной среде. Можно использовать любой нетоксичный физиологически приемлемый и метаболизируемый липид, способный образовывать липосомы. Композиции по изобретению в форме липосом могут содержать стабилизаторы, консерванты, эксципиенты и тому подобное в дополнение к средству. Некоторые иллюстративные липиды являются фосфолипидами и фосфатидилхолинами (лецитинами), как природными, так и синтетическими. Способы образования липосом известны в данной области. См., например, Рюк^й, Ей., ΜеίЬοйк ίη Се11 Вюйду. νο1ιιιικ XIV, Асайетю Ргекк, №ν ΥοιΈ Ν.Υ. (1976), р. 33 и далее.
Также в объем изобретения включено применение фитазы по изобретению при получении пищевых или кормовых препаратов или добавок, т.е. фитаза проявляет свою фитазную активность только во время производства и является неактивной в конечном пищевом или кормовом продукте. Такой аспект важен, например, при приготовлении теста и выпекании. Соответственно, фитазу или рекомбинантные дрожжи, экспрессирующие фитазу, можно вводить в магнитные носители, наносить на поверхность или вносить в полости, распределять их в тесте или пищевой среде и снова собирать магнитами.
Вспомогательная пищевая добавка по изобретению может быть введена отдельно животному в биосовместимом (например, биологически разрушаемом или биологически не разрушаемом) носителе или в сочетании с другими дополнительными средствами для пищеварения. Вспомогательная пищевая добавка по изобретению может быть легко введена в виде подкормки или может быть непосредственно смешана с кормом для животных или ее можно давать отдельно от корма в виде отдельной пероральной дозы, путем инъекции или трансдермальными способами или в сочетании с другими связанными с ростом съедобными соединениями, при этом относительное содержание каждого из соединений в сочетании зависит от конкретного организма или решаемой проблемы и степени требуемого ответа. Следует понимать, что конкретная доза питательных веществ, вводимых в любом данном случае, будет скорректирована в соответствии с конкретными вводимыми соединениями, решаемой проблемой, состоянием субъекта и другими важными фактами, которые могут модифицировать активность эффективного ингредиента, или ответом субъекта, как хорошо известно специалистам в данной области. В общем, можно использовать либо однократную суточную дозу или дробные суточные дозы, как хорошо известно в данной области.
В случае введения отдельно от корма для животных формы вспомогательной пищевой добавки могут быть получены ее объединением с нетоксичными фармацевтически приемлемыми съедобными носителями, чтобы получить препараты либо немедленного высвобождения, либо медленного высвобождения, как хорошо известно в данной области. Такие съедобные носители могут быть либо твердыми, либо жидкими, такими как, например, кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, соевые хлопья, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло и пропиленгликоль. Если используют твердый носитель, то дозированные формы соединений могут представлять собой таблетки, капсулы, порошки, пастилки или лепешки или подкормка в виде микродиспергируемые формы. Если используют жидкий носитель, то дозированными формами могут быть мягкие желатиновые капсулы или сироп или жидкие суспензии, эмульсии или растворы. Дозированные формы также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажнители или эмульгаторы, стимуляторы растворения и т.д. Дозированные формы также могут содержать другие терапевтически ценные вещества. Способ получения гранулята съедобного носителя при высокой температуре для высвобождения фермента при проглатывании описан в находящейся одновременно на рассмотрении заявке на выдачу патента США с регистрационным № 09/910579, поданной 20 июля 2001.
В альтернативных вариантах значительные преимущества изобретения могут включать 1) простоту производства биосовместимых композиций, содержащих активный ингредиент; 2) универсальность, так как оно относится к классу полимеров и/или активных ингредиентов, которые могут быть использованы; 3) более высокие выходы и эффективности нагрузки; и 4) получение препаратов длительного высвобождения, которые высвобождают активные, интактные активные средства ίη νίνο, таким образом обеспечивая контролируемое высвобождение активного средства в течение длительного периода времени. В одном варианте преимущество может быть следствием локальной доставки средства в пищеварительный тракт (например, мускульный желудок) организма. В одном из аспектов фраза находящийся внутри означает способ приготовления средства в композиции, применимой для контролируемого высвобождения средства в течение длительного периода времени.
В альтернативных вариантах в композициях длительного высвобождения или медленного высвобождения по изобретению используют эффективное количество средства (например, фермента или анти- 90 021178 биотика). В одном из аспектов длительное высвобождение или медленное высвобождение относится к постепенному высвобождению средства из биосовместимого материала в течение длительного периода времени. Длительное высвобождение может быть непрерывным или прерывистым, линейным или нелинейным и может быть осуществлено с использованием одной или нескольких биологически разрушаемых или биологически не разрушаемых композиций, нагрузки лекарственного средства, выбора эксципиентов или других модификаций. Однако следует понимать, что может быть желательным получение композиции быстрого высвобождения, которое относится к быстрому высвобождению после употребления организмом. Также следует понимать, что высвобождение не обязательно означает, что средство высвобождается из биосовместимого носителя. В одном из аспектов медленное высвобождение охватывает медленную активацию или непрерывную активацию средства, присутствующего в биосовместимой композиции. Например, фитаза не обязательно должна высвобождаться из биосовместимой композиции, чтобы быть эффективной. В данном аспекте фитазу иммобилизуют на биосовместимой композиции.
Корм для животных может представлять собой любой содержащий белок органический пищевой продукт, обычно используемый для удовлетворения пищевых потребностей животных. Многие из таких содержащих белок пищевых продуктов обычно состоят главным образом из кукурузы, соевого продукта или смеси кукурузного/соевого пищевого продукта. Например, характерные коммерчески доступные продукты, используемые для кормления птиц, включают полноценный корм для яйценосных пород (Едд Макег Сотр1е1е), птичий кормовой продукт Ьаиб 0'Ьакек ΑС 8егу1сек, а также корм для молодняка диких птиц и индеек (Соии1гу Сате аиб Τи^кеу Сго^ег), продукт Α^^, Ею. (смотри также руководство для фермеров, разводящих эму, РЫШр Мйтааг и Мапа Мптааг). Оба указанных коммерчески доступных продукта являются характерными примерами кормов для животных, в случае которых настоящая вспомогательная пищевая добавка и/или фермент фитаза могут быть включены для уменьшения количества или исключения введения дополнительного фосфора, цинка, марганца и железа, необходимых в таких композициях.
Изобретение относится к новым препаратам и диетическим и пищевым добавкам, и к способам дополнения рациона в случае некоторых диет, например диеты Аткинса, вегетарианской диеты, макробиотической диеты, строгой растительной диеты или региональных диет, например, диет в развивающихся странах. В случае пищевых продуктов, связанных с некоторыми элективными диетами, такими как диеты Аткинса, вегетарианская, макробиотическая, строгая растительная или региональные диеты (например, диеты в развивающихся странах) особое значение придается некоторым категориям пищевых продуктов, таких как белки и жиры, соя и т.д., или диеты основаны на местных культурных растениях, например хлебных злаках, рисе, бобах и тому подобном в качестве основных или единственных источников индивидуального питания. Многие из таких зерновых культур имеют повышенный (от 3 до 10 раз) уровни фитиновой кислоты. Обработанные продукты питания, такие как гидролизат соевого белка и другие, по-видимому, сохраняют повышенные уровни фитиновой кислоты и их включение в качестве источника белка в питательные батончики, порошки и другие пищевые продукты или пищевые добавки и ингредиенты увеличивает нагрузку фитиновой кислоты, которой подвергаются люди, которые практикуют такие диеты.
Профилактика потери костной массы и восстановление
Изобретение также относится к новым фармацевтическим и пищевым препаратам, используемым в качестве дополняющих компонентов и добавок, и к способам пополнения рациона, включая добавки фитазы, например, любой фитазы, включая фитазу по изобретению, для индивидов, предрасположенных к потере костной массы, для индивидов с потерей костной массы и индивидов с некоторыми состояниями здоровья, например, с остеопорозом, кахексией, и при медицинских обработках, таких как химиотерапия, которые могут нарушать правильное усвоение или утилизацию необходимых питательных веществ. Способы и композиции по изобретению можно применять отдельно или в сочетании с другими добавками или схемами лечения, включая сочетание с лекарственными средствами и тому подобным. Например, препараты, пищевые добавки и способы пополнения рациона могут быть осуществлены с использованием других пищевых добавок или лекарственных средств для лечения или профилактики остеопороза, например, с использованием витамина Ό3 и/или кальция (которые апробированы для профилактики потери костной массы). В одном из аспектов изобретение относится к препарату, содержащему фитазу, например любую фитазу или фитазу по изобретению, и витамин Ό3 и/или кальций. В одном из аспектов изобретение относится к препарату, содержащему фитазу, например любую фитазу или фитазу по изобретению, для профилактики потери костной массы. В одном из аспектов изобретение относится к препарату, содержащему фитазу, например любую фитазу или фитазу по изобретению, для восстановления костной массы после потери.
Препарат может быть в форме фармацевтической композиции, может представлять собой добавку к фармацевтическому препарату, любая из которых может быть в жидкой, твердой, порошкообразной форме, в форме лосьона, спрея или аэрозоля. Фармацевтические композиции и препараты по изобретению для перорального введения могут быть приготовлены с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области, в соответствующих и подходящих дозах. Такие носители делают возможными приготовление фармацевтических препаратов в стандартной лекарствен- 91 021178 ной форме в виде таблеток, пилюль, порошка, драже, капсул, жидкостей, пастилок, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.д., подходящих для проглатывания пациентом. Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть приготовлены с использованием твердого эксципиента, необязательно, с измельчением полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления подходящих дополнительных соединений, если они необходимы, чтобы получить таблетки или сердцевины драже. Подходящими твердыми эксципиентами являются углеводные или белковые наполнители, включая, например, сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натрий-карбоксиметилцеллюлоза; и камеди, включая аравийскую и трагакантовую камедь; и белки, например желатин и коллаген. Могут быть добавлены дезинтегрирующие или солюбилизирующие средства, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.
Изобретение относится к водным суспензиям, содержащим фитазу, например фитазу по изобретению, в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензий. Такие эксципиенты включают суспендирующее средство, такое как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь, и диспергирующие средства или увлажнители, такие как встречающийся в природе фосфатид (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида с жирной кислотой (например, стеарат полиоксиэтилена), продукт конденсации этиленоксида с длинноцепочечным алифатическим спиртом (например, гептадекаэтиленоксицетанол), продукт конденсации этиленоксида с неполным сложным эфиром, полученным из жирной кислоты и гексита (например, моноолеат полиоксиэтиленсорбита), или продукт конденсации этиленоксида с неполным сложным эфиром, полученным из жирной кислоты и ангидрида гексита (например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана). Водная суспензия также может содержать один или несколько консервантов, таких как этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, один или несколько корригентов и один или несколько подсластителей, таких как сахароза, аспартам или сахарин. Препараты могут быть скорректированы в отношении осмолярности.
При определении схемы дозирования также учитывают фармакокинетические параметры, хорошо известные в данной области, т.е., скорость всасывания активных средств, биодоступность, метаболизм, клиренс и тому подобное (смотри, например, Н1йа1до-Агадопек (1996) ί. 8!егснй Вюсйет. Мо1. Вю1. 58:611-617; Οιώ^^ (1996) РЬа^таζ^е 51:337-341; РоШегЬу (1996) Соп!гасер!юп 54:59-69; ГоИпкоп (1995) I. РНагт. 8с1. 84:1144-1146; КоНа!ад| (1995) РНатиШе 50:610-613; Вгорйу (1983) Еиг. I. С1ш. Рйагтасок 24:103-108; последнюю редакцию КеттдФп, ТНе 8с1епсе апй Ргасйсе оГ Рйагтасу 2011' Ей. Ырртсо!! \УПНатк апй ХУПктк). Современное состояние в данной области позволяет клиницисту определять схему дозирования для каждого отдельного пациента, активного средства и заболевания или состояния, подвергаемого лечению. Инструкции, предлагаемые для сходных композиций, применяемых в качестве фармацевтических средств, можно использовать в качестве руководства для определения схемы дозирования, т.е. схемы доз и уровней доз, вводимых при практическом осуществлении способов по изобретению (например, для восстановления утраченной костной массы или для профилактики потери костной массы), которые являются подходящими и правильными.
Добавки при физических тренировках
Изобретение также относится к новым дополняющим пищевые продукты компонентам и пищевым добавкам, и к способам применения таких добавок, содержащих фитазы, например любую фитазу или фитазу по изобретению, для индивидов, подвергаемых спортивной или другой интенсивной физической подготовке, например подготовке солдат. Спортивная подготовка и гипернагрузки могут истощать необходимые питательные вещества и требовать добавки в рацион. В таких диетах и при таких состояниях, в общем, имеется недостаток важных питательных микроэлементов, таких как металлы (К, Са, Ре, Ζπ, Мп, 8е) и ионы (РО4), необходимые для оптимального питания. Пища, богатая фитиновой кислотой, обостряет такую проблему и также может приводить как к хроническим, так и острым состояниям, которые возникают в результате либо добровольной, либо экономически вынужденной зависимости от диеты, богатой пищевыми продуктами с высоким содержанием фитиновой кислоты.
Например, людей после различных диет с низким содержанием углеводов (низкоуглеводных) часто беспокоят судороги мышц, например мышц ног. Обычным советом в таком случае является добавление дополнительного калия, кальция и других питательных веществ к рациону. Настоящее изобретение относится к композициям для восполнения рациона, вспомогательным пищевым добавкам и дополняющим рацион компонентам и к способам восполнения рациона с целью повышения иным образом нарушенного питания в результате мобилизации макро- и микроэлементов с использованием добавления фитазы в пищу (включая использование любой фитазы или фитазы по изобретению).
В одном из аспектов по изобретению применение фитазы (например, применение любой фитазы или фитазы по изобретению) оптимизируют, чтобы выявить профили термолабильности или рНстабильности, которые сделают ее подходящей для добавления непосредственно в пищевой продукт и использования в дополнительном способе, и/или выявить повышенную стабильность и активность в желудочно-кишечном тракте человека или животного.
- 92 021178
Изобретение также относится к новым добавкам в рацион и пищевым добавкам, и к способам их применения, при этом добавки содержат фитазы, например любую фитазу или фитазу по изобретению, для индивидов, использующих добавки минеральных веществ. Минеральные добавки в пищевые продукты для людей с высоким содержанием фитиновой кислоты действительно могут усиливать проблемы с доступностью питательных веществ. Публикации в литературе свидетельствуют, что комплексы фитиновой кислоты, кальция и цинка намного менее растворимы, чем комплексы фитиновой кислоты и кальция. Люди часто принимают полиминеральные добавки. Добавление фитазы к схеме, предназначенной для комбинирования минеральных добавок в присутствии пищевых продуктов с высоким содержанием фитиновой кислоты, может сделать такие добавки намного более эффективными.
В альтернативных аспектах композиции и способы по изобретению (содержащие любую фитазу или фитазу по изобретению) применимы в качестве дополняющих компонентов или добавок к программам снижения массы, в которых ограничено потребление конкретных групп пищевых продуктов, к вегетарианским, макробиотическим или строгим растительным диетам, которые ограничивают или исключают употребление мяса, пасленовых растений, хлебных изделий и т.д., и другим диетам, которые сфокусированы на употреблении орехов;
специфичная добавка для индивидов на низкоуглеводных диетах, богатых пищевыми продуктами с высоким содержанием фитиновой кислоты, для облегчения физиологических симптомов, основанных на пониженном употреблении минеральных веществ, к режимам спортивных тренировок, в которых стремятся повысить результативность за счет пищевого рациона, включая режимы военной подготовки, к больничным диетам, разработанным для специальных нужд пациентов с нарушениями в употреблении пищи или ограничениями в отношении групп пищевых продуктов;
к диетам, основанным на злаковых или бобовых культурах, бедным в отношении микроэлементов, в развивающихся странах, к программам школьных обедов.
Изобретение также относится к наборам, содержащим композиции по изобретению (содержащим любую фитазу или фитазу по изобретению) и инструкции по включению композиции или способа по изобретению в такие диеты. Наборы могут содержать любую упаковку, ярлыки, вкладыши к продуктам и тому подобное.
В одном из аспектов изобретение относится к природной фитазе или оптимизированной фитазе по изобретению, приготовленной или оптимизированной (например, оптимизированной по последовательности) для получения, обработки или прохождения через систему человека или животного, например, через пищеварительный тракт. Фермент фитаза может быть оптимизирована с использованием альтернативных препаратов.
Альтернативно фермент фитаза по изобретению или любая фитаза может быть оптимизирована конструированием ее последовательности, например, и использованием направленной эволюции, склонной к ошибкам ПЦР, перетасовки, сайт-специфичного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, ПЦР-сборки, ПЦР-мутагенеза, имитирующего половой процесс, мутагенез ш угуо, кассетного мутагенеза, рекурсивного множественного мутагенез, экспоненциального множественного мутагенеза, сайтспецифичного мутагенеза, вторичной сборки лигированием, О88М™ и любого их сочетания, чтобы сохранить активность во время обработки, поедания и в кишечнике человека.
Композиции (например, пищевые препараты, содержащие любой фитазный фермент или фитазный фермент по изобретению) могут быть доставлены несколькими путями, чтобы обеспечить пищевую эффективность. Например, изобретение относится к композициям (например, пищевым препаратам или добавкам, содержащим любой фитазный фермент или фитазный фермент по изобретению) и способам, включающим применение:
в расфасованных пищевых добавках, таких как жевательные таблетки или питательные батончики, в виде лиофилизированного продукта, который можно гидратировать перед проглатыванием, совместно расфасованным с пищевыми продуктами, например, переработанным соевым продуктом, или продаваемым в виде препарата с гидролизатом соевого белка и другими фракциями переработки цельных пищевых продуктов, которые продаются в виде ингредиентов для пищевой промышленности, в коммерчески выпекаемых товарах, нанесенными распылением на зерновые завтраки, вводимых в виде спрея (например, назального спрея) препаратах, в виде трансгенного продукта, экспрессированного в местных культурах, например, злаковых и бобовых (например, в виде трансгенного продукта микроорганизма, такого как бактерия), в виде трансгенного организма, например микроорганизма; например, человек или животное потребляет в пищу бактерии или другой микроорганизм, способный производить (и, в альтернативном варианте, секретировать) рекомбинантную фитазу, такую как фитазу по изобретению, после проглатывания или имплантации, например, в кишечник человека или животного.
Содержащие фитазу продукты и способы по изобретению могут быть маркированы как усиливающие питательную ценность, совместимые с питательными веществами, или иным образом может быть
- 93 021178 отмечена их способность усиливать эффективность питательных веществ и облегчать различные симптомы, связанные с недостаточностью питательных веществ.
Содержащие фитазу продукты и способы по изобретению применяют для ослабления антипитательных эффектов фитата, который хелатирует важные для питания минералы, такие как цинк, медь, железо, магний, олово и кальций. Соответственно, содержащие фитазу продукты и способы по изобретению применяют в качестве добавок к рациону, чтобы предотвратить преципитацию содержащих металлы ферментов и белков в поедаемых пищевых продуктах. В одном из аспектов содержащие фитазу продукты и способы по изобретению применяют для ослабления антипитательных эффектов фитата в пище человека, в частности, в пище, богатой бобовыми и злаковыми, чтобы повысить биодоступность минералов. В одном из аспектов фитаза в добавке к рациону по изобретению катализирует частичное или полное гидролитическое удаление ортофосфата из фитата, при этом полный гидролиз фитата приводит к образованию 1 молекулы инозита и 6 молекул неорганического фосфата.
Содержащие фитазу продукты и способы по изобретению применимы по отношению к рациону людей и многочисленных животных, включая птиц и рыб. Например, содержащие фитазу продукты пищевых добавок и способы пополнения рациона по изобретению могут быть осуществлены на практике с использованием коммерчески значимых видов, например свиней, крупного рогатого скота, овец, коз, лабораторных грызунов (крыс, мышей, хомячков и песчанок), пушных животных, такие как норка и лиса, и животных в зоопарках, таких как обезьяны и человекообразные обезьяны, а также домашних млекопитающих, таких как кошки и собаки. Характерными коммерчески значимыми видами птиц являются куры, индейки, утки, гуси, фазаны, эму, страусы, гагары, киви, голуби, попугаи, кореллы, какаду, канарейки, пингвины, фламинго и перепела. Коммерчески разводимым рыбам, таким как, форель, также могут быть полезны вспомогательные пищевые добавки, раскрытые в настоящем описании. Другие рыбы, которым могут получать пользу, включают, например, рыб (особенно аквариумных или выращиваемых в аквакультуре, например, тропических рыб), серебряного карася и других декоративных карповых, сома, форель, лосося, акулу, ската, камбалу, морского языка, тилапию, оризию, гуппи, моллинезию, меченосца, парусника, полосатого данио и гольца.
Содержащие фитазу продукты и способы по изобретению также применимы в различных агарах, гелях, средах и растворах, используемых для культивирования тканей и/или клеток. Нестабильные соевые гидролизаты могут создавать проблему, с которой сталкиваются при использовании культивирования тканей и/или клеток. В одном из аспектов содержащие фитазу продукты и способы по изобретению применимы в качестве добавок к среде для культуры клеток или для обработки среды, например, чтобы повысить выход культуры клеток и стабильное качество. В одном из аспектов изобретение относится к гидролизату для культивирования клеток, содержащему фитазы, например фитазы по изобретению.
В одном из аспектов для получения единообразного продукта в изобретении предлагаются способы получения гидролизатов, дополняющих компонентов или других добавок для культивирования клеток, содержащих фитазы, с использованием биомаркеров фитазы. Например, способ может включать мечение или маркировку нескольких молекул фитазы в партиях гидролизата, дополняющего компонента или другой добавки, и затем перемешивание партии гидролизата, дополняющего компонента или другой добавки, чтобы получить соответствующую картину биомаркера. В одном из аспектов эффективность культивирования с использованием каждой партии в минибиореакторе(ах) измеряют и соотносят эффективность при использовании каждого биомаркера и партию. В одном из аспектов получают смесь, чтобы создать продукт с более высокой эффективностью, который соответствует или лучше среднего. В одном из аспектов добавляют тиоредоксин (ТКХ), чтобы увеличить биодоступность многих белков за счет устранения вторичной структуры, образованной дисульфидными связями. В одном из аспектов также добавляют протеазы к гидролизатам, дополняющим компонентам или добавкам по изобретению. Протеазы могут быть мечеными или их качество можно контролировать с использованием других биомаркеров (как в случае с фитазой, обсуждаемой выше), чтобы контролировать процесс смешивания.
В одном из аспектов изобретение относится к способам добавления фитазы к зерну, чтобы получать единообразный продукт, с использованием мечения биомаркером или способа контроля качества, аналогичного способу, описанному выше для гидролизатов, дополняющих компонентов или добавок по изобретению.
Усиленные ферментом пищевые рационы для повышения боеспособности и боевого духа войск
В одном из аспектов изобретение относится к новым дополняющим рацион компонентам и пищевым добавкам и способам дополнения рациона, содержащим фитазы, например любую фитазу или фитазу по изобретению, с целью получения усиленных ферментом пищевых рационов для повышенной боеспособности и боевого духа войск. В одном из аспектов такие композиции для добавки в рацион по изобретению работают ίΐ'ΐ кПи, повышая энергию, выносливость и боевой дух в целенаправленной, легко применимой и приятной форме с ограничением при этом пищевых отходов.
В одном из аспектов такие композиции добавок в рацион и способы по изобретению направлены на решение проблемы готовности войск, включающее эффективную доставку питательных вещества и связанные с этим состояние здоровья, боевой дух и боеспособность солдат. Изобретение относится к ферментам, оптимизированным для эффективного функционирования в кишечнике человека. Такие фермен- 94 021178 ты могут усиливать экстракцию питательных веществ и генерирование энергии, а также более длительно поддерживать удовлетворение пищей и чувство сытости у человека.
Кроме фитазы используют другие ферменты, например амилазы, ксиланазы, протеазы, липазы, для получения на практике композиций пищевых добавок и осуществления способов по изобретению. В одном из аспектов изобретение относится к препаратам, пищевым добавкам, пищевым продуктам, индивидуальным пайкам в виде набора готовых к употреблению продуктов для одноразового приема пищи (МРЕ), напиткам, гидратирующим средствам и тому подобному, содержащим фитазу, например, фитазу по изобретению, и другой фермент, например, амилазы, ксиланазы, протеазы, липазы или их сочетание. В случае проглатывания с пищей такие ферменты, как было показано, усиливают высвобождение особенно важных питательных веществ, например, фосфора, необходимых минералов и ионов, аминокислот и сахаров. Кроме того, совместное проглатывание таких ферментов усиливает механическую работу желудочно-кишечного тракта и всасывание в результате деполимеризации полученной из растений целлюлозы, гемицеллюлозы и крахмала. Настоящий технический документ предлагает разработку таких ферментов в качестве дополнения к рациону для военнослужащих, чтобы обеспечить повышенную утилизацию питательных веществ для участников боевых действий.
В одном из аспектов пищевая добавка по изобретению вызывает высвобождение необходимого фосфата из непитательного в обычных условиях полученного из растений фитата, повышая выход энергии из пищевых продуктов и отложение СаРО4 в костях. В одном из аспектов фитазы и другие возможные ферменты, добавляемые к пище, могут выдерживать рН в кишечнике и противостоять активностям эндогенных протеаз.
В одном из аспектов изобретение относится к ферментативным добавкам к рационам, питьевым напиткам, пищевым продуктам, МРЕ, гидратирующим средствам и тому подобному для значимого повышения питательной ценности, перевариваемости и энергосодержания в пище для военнослужащих (или любой пище, включая пищу обычных потребителей и диетические добавляемые продукты), помогающим участникам боевых действий в подготовке, в сражении или любой стрессовой ситуации. Добавка может быть приготовлена для простоты применения и личной транспортировки (в или вместе с МРЕ, гидратирующими средствами и т.д.). В одном из аспектов добавка фермента не будет нарушать вид, вкус и/или консистенцию пищевого продукта. В одном из аспектов продукт улучшает состояние здоровья и повышает выносливость участников боевых действий.
В альтернативных аспектах добавка фермента доставляется несколькими путями, чтобы обеспечить пищевую эффективность; например, изобретение относится к фитазам, включая фитазы по изобретению, и в некоторых аспектах, дополнительные ферменты:
в расфасованных пищевых или питьевых добавках, таких как МРЕ, пайки, неприкосновенные аварийный запас, гидратирующие средства, жевательные таблетки или питательные батончики;
в виде лиофилизированного продукта (т.е., порошка), который можно гидратировать перед проглатыванием;
совместно расфасованными с пищевыми продуктами, продовольственными продуктами, напитками, например, переработанным соевым продуктом, или в виде препарата с гидролизатом соевого белка и другими фракциями переработки цельных пищевых продуктов, которые продаются в виде ингредиентов для пищевой промышленности;
в выпекаемых товарах;
нанесенными распылением на зерновые продукты;
в виде препаратов, таких как таблетки, гелеобразные таблетки, капсулы, спреи и тому подобное.
В одном из аспектов композиции и способы по изобретению обеспечивают пищевую добавку, которая быстро высвобождает калории и макро- и микроэлементы из съеденной пищи. В одном из аспектов композиции и способы по изобретению обеспечивают энергию и физическую силу людям в стрессовых ситуациях, например, включающим чрезмерные перегрузки и периодические периоды голодания. В одном из аспектов композиции и способы по изобретению обеспечивают ферментами, оптимизированными и приготовленными для эффективной работы в кишечнике человека при сохранении стабильности, срока годности и транспортабельности в требуемой окружающей среде, например, в военных условиях.
В одном из аспектов композиции и способы по изобретению обеспечивают получение препаратов для улучшения вкусовых характеристик, растворимости, возможности разжевать и эффективности индивидуальной перевозки продукта. В одном из аспектов композиции и способы по изобретению дополнительно включают другие компоненты, такие как калий, глюкоза, СаС12. СаС12 в препарате может комбинироваться с высвобождаемым фосфатом и, в свою очередь, усиливать отложение в костях и прибавку массы. В одном из аспектов композиции и способы по изобретению дополнительно включают препараты других ферментов, таких как протеазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, для расщепления белков, целлюлозы и гемицеллюлозы соответственно. Такие ферменты могут улучшать доступность белков и крахмала и дополнительно увеличивать поглощение железа из многих богатых железом пищевых продуктов.
В одном из аспектов композиции и способы по изобретению дополнительно включают ферменты для гидролиза пищевых продуктов, полученных из растительного материала, который богат основанны- 95 021178 ми на глюкозе и ксилозе полимерами, целлюлозой, гемицеллюлозой и крахмалом, а также состоящего из аминокислот полимера, белка. В одном из аспектов композиции и способы по изобретению облегчают гидролиз полимерных материалов в пищевых продуктах; т.е. способствуют полному расщеплению полимеров на мономеры, например, полисахаридов до мономерных сахаров или белков до аминокислотных остатков. Таким образом, в данном аспекте композиции и способы по изобретению позволяют реализовать полную калорийную и питательную ценность пищевого продукта, напитка или пайка. В одном из аспектов добавка фермента включает использование стабильных ферментов, например, гидролаз различных видов, целлюлаз, гемицеллюлаз, амилаз, липаз, амида, протеаз и других ферментов. В одном из аспектов ферменты, используемые в композициях и способах по изобретению, могут выдерживать условия среды в пищеварительном тракте, т.е. стабильны при низком рН и в присутствии протеаз желудка.
Промышленные применения фитаз
Кроме применений, описанных выше, изобретение относится к новым промышленным применениям фитаз, включая применение новых фитаз по изобретению.
Уменьшения загрязнения фосфатом окружающей среды
В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим фитазы (включая фитазы по изобретению) для добавления в отвалы отходов и навоза, чтобы подвергнуть превращению фитиновой кислоты в окружающей среде. В одном из аспектов такое применение служит целям уменьшения загрязнения и увеличения доступности питательных веществ. Изобретение также относится к композициям и способам добавления фитазы в почву, природные или искусственные водоемы (например, озера, пруды, колодцы, навозные пруды и тому подобное), коммунально-бытовые сточные воды, любой канализационный сток и тому подобное. Как описано выше, изобретение относится к композициям и способам снижения уровней фитата в отходах или сточных водах, например, в навозе животных, при этом животное кормят вспомогательной пищевой добавкой, содержащей эффективное количество фитазы, например, фитазы по изобретению. Примером применения композиций и способов по изобретению является уменьшение загрязнения фосфатом окружающей среды. Таким образом, композиции и способы по изобретению можно использовать в любом применении, при котором снижают загрязнение в результате разложения фитиновых кислот.
Применения в фермерском хозяйстве и выращивании растений
В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим фитазы (включая фитазы по изобретению), и к способам применений в фермерском хозяйстве или других применений для выращивания растений, например добавления фитазы к удобрениям или добавкам для питания растений (например, МIКΑС^Е0К0\™) в случае растений, например домашних растений. При использовании композиций и способов по изобретению для применений в фермерском хозяйстве потребители включают фермеров, ведущих хозяйство с применением органических удобрений. Композиции и способы по изобретению можно использовать для добавления фитазы в любую почву с недостатком фосфора или нуждающуюся в добавлении фосфора для конкретной культуры или применения. Поскольку высвобождение фосфора помогает растениям расти, композиции и способы по изобретению можно применять для добавления фитазы ко всему, что содержит материал водорослей или растений.
Продукты производства
Изобретение относится к различным продуктам производства, содержащим одну или несколько фитаз по изобретению. Например, в одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим фитазы (включая фитазы по изобретению), и к способам применений в косметике, например, в шампунях, лосьонах или мыле, содержащих растительные продукты.
В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим фитазы (включая фитазы по изобретению), и к способам иммобилизации фитазы. В одном из аспектов иммобилизованная фитаза действует в качестве механизма контролируемого высвобождения. Например, в одном из аспектов изобретение относится к препаратам контролируемого высвобождения (высвобождения по времени) фитазы для применения в почве, например глиноземе, для домашних растений и т.д. В одном из аспектов фитазы иммобилизуют на шариках, например шариках из полисорбата. Такие шарики могут быть доставлены в почву, например, для сельскохозяйственных или домашних растений. В другом аспекте препараты контролируемого высвобождения (высвобождения по времени) фитазы по изобретению применяют в качестве дополнения к рациону и пищевых добавок.
Биотопливо и превращение биомассы
Изобретение относится к способам получения топлива, например биотоплива, включающим применение одной или нескольких фитаз по настоящему изобретению; включая получение топлива, например биотоплива, содержащего одну или несколько фитаз по настоящему изобретению. Изобретение относится к способам превращения биомассы, включающим применения одной или нескольких фитаз по настоящему изобретению.
В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим фитазы (включая фитазы по изобретению), и к способам применения фитазы при ферментации или в способе получения спирта, например получения этанола. Например, композиции и способы по изобретению можно применять для получения эффективных и надежных альтернатив или дополнений к использованию продуктов на основе
- 96 021178 нефти, например в виде смеси биоэтанола и бензина.
Изобретение относится к организмам, экспрессирующим ферменты по изобретению, для участия в химических циклах, заключающихся в превращении природных биомасс. Кроме того, сочетание фитазы (например, фермента по настоящему изобретению) с одним или несколькими ферментами, расщепляющими крахмал, такими как амилаза или глюкоамилаза, улучшает получение этанола из крахмала. Изобретение относится к способам обнаружения и внедрения наиболее эффективных ферментов, чтобы обеспечить возможность такого важного нового превращения биомассы и альтернативных процессов промышленного получения энергии.
Превращение биомассы и получение чистого биотоплива
Изобретение относится к полипептидам, включая ферменты (фитазы по изобретению) и антитела, и к способам переработки биомассы или любого лигноцеллюлозного материала (например, любой композиции, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин) в топливо (например, биоэтанол, биопропанол, биобутанол, биопропанол, биометанол, биодизельное топливо), в дополнение к кормам, пищевым продуктам и химикатам. Например, в одном из аспектов фермент по изобретению разрушает неперевариваемую фитиновую кислоту (фитат) в биомассе (например, лигноцеллюлозном материале, зерне или семенах масличных растений), высвобождая перевариваемый фосфор; таким образом, в одном из вариантов, фитазы по настоящему изобретению применяют для обработки или предварительной обработки биомассы.
Таким образом, композиции и способы по изобретению можно использовать для получения и/или обработки биотоплива, например, для получения эффективных или устойчивых альтернатив и/или дополнений к использованию продуктов на основе нефти; например, композиции и способы по изобретению можно применять с использованием смеси ферментов для получения биотоплива, такого как биометанол, биоэтанол, биопропанол, биобутанол, биодизельное топливо и тому подобное; которое можно добавлять к дизельному топливу, бензину, керосину и тому подобному. Изобретение относится к организмам, экспрессирующим ферменты по изобретению для участия в химических циклах, заключающихся в превращении природной биомассы. В одном из аспектов ферменты и способы превращения применяют, используя наборы ферментов для эффективной обработки биомассы наряду с деполимеризацией полисахаридов, целлюлозных и/или гемицеллюлозных полимеров до метаболизируемых (например, ферментируемых) углеродных компонентов. Изобретение относится к способам обнаружения и внедрения наиболее эффективных ферментов, чтобы обеспечить возможность такого важного нового превращения биомассы и альтернативных процессов промышленного получения энергии.
Композиции и способы по изобретению можно применять для получения эффективных и надежных альтернатив или дополнений к применению продуктов на основе нефти, например, в виде смеси биоэтанола, биопропанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизельного топлива и бензина. Изобретение относится к организмам, экспрессирующим ферменты по изобретению для участия в химических циклах, заключающихся в превращении природной биомассы. Изобретение относится к способам обнаружения и внедрения наиболее эффективных ферментов, чтобы обеспечить возможность такого важного нового превращения биомассы и альтернативных процессов промышленного получения энергии.
Изобретение относится к способам, ферментам и смесям ферментов или коктейлям по изобретению, для переработки материала, например материала биомассы, например к композициям, содержащим целлоолигосахарид, олигомер арабиноксилана, лигнин, лигноцеллюлозу, ксилан, глюкан, целлюлозу и/или ферментируемый сахар; например, включая способы осуществления контакта композиции с полипептидом по изобретению или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по изобретению, при этом, необязательно, материал получен из сельскохозяйственной культуры (например, пшеницы, ячменя, картофеля, проса, древесины тополя), является побочным продуктом при получении пищевых продуктов или кормов, является лигноцеллюлозными отходами производства или является растительным остатком или бумажными отходами или продуктом бумажных отходов, и, необязательно, остаток растения содержит стебли, листья, кожуру, шелуху, кукурузу или стержни кукурузных початков, кукурузную солому, кукурузные волокна, сено, солому (например, рисовую солому или пшеничную солому), жмых сахарного тростника, жом сахарной свеклы, цитрусовый жом и кожуру цитрусовых плодов, древесину, древесные щепки, древесные стружки, древесную волокнистую массу, отходы древесных волокон, древесные отходы, древесные стружки и опилки, отходы и обломки от строительства и демонтажа (например, древесина, древесные стружки и опилки), и, необязательно, бумажные отходы содержат бракованную или использованную бумагу для фотокопий, бумагу для компьютерного принтера, бумагу для тетрадей, бумагу для блокнотов, бумагу для пишущей машинки, газеты, журналы, картон и упаковочные материалы на бумажной основе и материалы вторичной переработки бумаги. Кроме того, можно использовать городские отходы, например бумажную фракцию твердых коммунально-бытовых отходов, древесные коммунально-бытовые отходы и коммунально-бытовые отходы от вырубки деревьев, наряду с другими материалами, содержащими сахар, крахмал и/или целлюлоза. В альтернативных вариантах при обработке материала, например материала биомассы, образуется биоспирт, например биодизельное топливо, биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол.
- 97 021178
Альтернативно полипептид по изобретению может быть экспрессирован в растительном материале биомассы или самом исходном сырье.
Способы по изобретению также включают получение подвергнутого превращению лигноцеллюлозного материала (обработанного ферментами по изобретению) и изготовление из него топлива (например, биоспирта, например, биоэтанола, биометанола, биобутанола или биопропанола, или биодизельного топлива) посредством ферментации и/или химического синтеза. В одном из аспектов полученные сахара подвергают ферментации и/или неферментируемые продукты превращают в газ.
Способы по изобретению также включают превращение водорослей, растительных масел прямой гонки, использованных растительных масел, животных жиров и технических жиров (например, таллового жира, лярда и желтого жира), или стоков с использованием ферментов по изобретению и получение топлива (например, биоспирта, например, биоэтанола, биометанола, биобутанола или биопропанола, или биодизельного топлива) посредство ферментации и/или химического синтеза или превращения.
Ферменты по изобретению (включая, например, организмы, такие как микроорганизмы, например, грибы, дрожжи или бактерии, производящие и в некоторых аспектах секретирующие рекомбинантные ферменты по изобретению) можно использовать или включать/вводить на любой стадии любого способа превращения биомассы, например, на любой одной стадии, нескольких стадиях или включать на всех стадиях или во все следующие способы осуществления процессов превращения биомассы или получения всех видов альтернативного биотоплива.
Прямое горение: сжигание материала прямым нагреванием, что является наиболее простым способом переработки биомассы; может быть очень экономичным, если источник биомассы расположен близко.
Пиролиз: представляет собой термическое разрушение биомассы нагреванием в отсутствие кислорода. В одном из аспектов биомассу нагревают до температуры примерно от 800 до 1400 градусов по Фаренгейту, но кислород не вводят для поддержания горения, что приводит к образованию газа, топливного масла и древесного угля.
Газификация: биомасса может быть использована для получения метана в результате нагревания или анаэробного разложения. Из биомассы может быть получен синтетический газ, смесь окиси углерода и водорода.
Газ органических отходов: образуется при распаде (анаэробном разложении) захороненных отходов на полигонах. Когда органические отходы разлагаются, они образуют газ, состоящий примерно на 50% из метана, основного компонента природного газа.
Анаэробное разложение: превращает органическое вещество в смесь метана, основного компонента природного газа, и диоксида углерода. В одном из аспектов биомассу, такую как сточные воды (стоки), навоз или отходы переработки пищевых продуктов, смешивают с водой и загружают в биореактор без доступа воздуха.
Ферментация.
Спиртовое брожение: топливный спирт получают, превращая целлюлозную массу и/или крахмал в сахар, ферментируя сахар до получения спирта, затем разделяя смесь спирта и воды дистилляцией. Исходное сырье, такое как специализированные культуры (например, кукуруза, пшеница, ячмень, картофель, просо, мискант, древесина тополя), остатки и отходы сельского хозяйства (например, рисовая солома, кукурузная солома, пшеничная солома, жмых сахарного тростника, рисовые отруби, кукурузные волокна, жом сахарной свеклы, жом цитрусовых и кожура цитрусовых), древесные отходы (например, твердые древесные и мягкие древесные щепки, твердые древесные и мягкие древесные остатки от лесозаготовки, древесные стружки и опилки), городские отходы (например, бумажная фракция твердых коммунально-бытовых отходов, древесные коммунально-бытовые отходы и коммунально-бытовые отходы от вырубки деревьев), древесные отходы (например, отходы лесопилки, отходы целлюлозного завода, отходы строительства, строительный лом, древесные стружки и опилки) и бумажная макулатура или другие материалы, содержащие сахар, крахмал и/или целлюлозу, могут быть превращены в сахара и затем в спирт в результате ферментации дрожжами. Альтернативно материалы, содержащие сахара, могут быть превращены непосредственно в спирт в ходе ферментации.
Переэтерификация: иллюстративную реакцию превращения масла в биодизельное топливо называют переэтерификацией. В способе переэтерификации спирт (подобный метанолу) взаимодействует с триглицеридными маслами, присутствующими в растительных маслах, животных жирах или вторично перерабатываемых горюче-смазочных материалах, с образованием сложных алкиловых эфиров жирных кислот (биодизельного топлива) и глицерина. Реакция требует нагревания и сильного щелочного катализатора, такого как гидроксид натрия или гидроксид калия.
Биодизельное топливо: биодизельное топливо представляет собой смесь сложных алкиловых эфиров жирных кислот, полученных из растительных масел, животных жиров или вторично перерабатываемых горюче-смазочных материалов. Биодизельное топливо можно использовать в качестве топлива для транспортных средств в его чистой форме, но обычно его используют в качестве добавки к полученному из нефти дизельному топливу, чтобы уменьшить уровни твердых частиц, оксида углерода, углеводородов и загрязняющих воздух токсичных вещества от транспортных средств с дизельным двигателем.
- 98 021178
Гидролиз: включает гидролиз соединения, например, биомассы, такой как лигноцеллюлозный материал, катализируемый с использованием фермента по настоящему изобретению.
Когенерация: представляет собой одновременное получение более одной формы энергии с использованием одного топлива и установки. В одном из аспектов когенерация биомассы имеет большую вероятность развития, чем отдельная генерация из биомассы, поскольку когенерация дает как тепло, так и электричество.
В одном из аспектов полипептиды по изобретению можно применять вместе с другими ферментами, например, гидролазами или ферментами, обладающими целлюлолитической активностью, например, глюканазой, эндоглюканазой, манназой и/или другим ферментом, для создания топлива, такого как биоспирт, например, биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо, из любого органического материала, например, биомассы, такой как композиции, полученные из растений и животных, включая любую сельскохозяйственную культуру, или другое возобновляемое исходное сырье, остатки сельского хозяйства или отходы животных, органические компоненты коммунальнобытовых и промышленных отходов, или отходов и обломков строительства или демонтажа, или микроорганизмы, такие как водоросли или дрожжи.
В одном из аспектов полипептиды по изобретению применяют в способах превращения лигноцеллюлозной биомассы в топливо (например, биоспирт, например, а биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо), или иным образом применяют в способах гидролиза или расщепления биоматериалов, так что их можно использовать в качестве топлива (например, биоспирт, например, биозтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо), или применяют для облегчения переработки биомассы в топливо.
В альтернативном аспекте полипептиды по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, применяют в способах на основе процесса переэтерификации, в котором спирт (подобный этанолу, пропанолу, бутанолу, пропанолу, метанолу) взаимодействует с триглицеридным маслом, присутствующим в растительном масле, животном жире или вторично перерабатываемых горючесмазочных материалах, с образованием сложных алкиловых эфиров жирных кислот (биодизельного топлива) и глицерина. В одном из аспектов биодизельное топливо получают из соевого масла или вторично используемых кулинарных жиров. Жиры животных, другие растительные масла и другие вторично используемые масла также можно использовать для получения биодизельного топлива, в зависимости от их стоимости и доступности. В другом аспекте смеси всех видов жиров и масел применяют для получения биодизельного топлива по изобретению.
Ферменты по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, также можно применять для очистки глицерина. Побочный продукт глицерина содержит не вступивший в реакцию катализатор и мыла, которые нейтрализуют кислотой. Воду и спирт удаляют, получая от 50 до 80% неочищенного глицерина. Остальные загрязняющие примеси включают непрореагировавшие жиры и масла, которые могут быть обработаны с использованием полипептидов по изобретению. На крупных заводах по производству биодизельного топлива по изобретению глицерин может быть дополнительно очищен, например, до 99% или более высокой чистоты, для фармацевтической и косметической промышленности.
Топливо (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо), полученное с использованием полипептидов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, можно использовать с оксигенатами топлива, чтобы улучшить характеристики горения. Добавление кислорода приводит к более полному сгоранию, что уменьшает выбросы монооксида углерода. Это является другим полезным для окружающей среды следствием замены бензинового топлива биотопливом (например, топливом по изобретению). Биотопливо, полученное с использованием композиций и/или способов по настоящему изобретению, можно смешивать с бензином с образованием смеси Е10 (примерно от 5 до 10% этанола и примерно от 90 до 95% бензина), но его можно использовать в более высоких концентрациях, таких как Е85, или в чистой форме. Биотопливо, полученное с использованием композиций и/или способов по настоящему изобретению, можно смешивать с дизельным топливом на основе нефти с образованием смеси В20 (20% биодизельного топлива и 80% нефтяного дизельного топлива), хотя можно использовать другие уровни смешивания вплоть до В100 (чистое биодизельное топливо).
Изобретение также относится к способам применения ферментов по настоящему изобретению для получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) из композиций, содержащих биомассу, например, полученный из растений источник, такой как лигноцеллюлозная биомасса. Материал биомассы может быть получен из сельскохозяйственных культур, в виде побочного продукта при получении пищевых продуктов или кормов, или в виде отходов, включая лигноцеллюлозные отходы, такие как растительные остатки растений, макулатура или отходы или обломки, полученные при строительстве и/или демонтаже. Примеры подходящих растительных источников или растительных остатков для обработки полипептидами по изобретению включают бурые водоросли, другие водоросли, зерно, семена, побеги, листья, кожуру, шелуху, сердцевины кукурузных початков, кукурузную солому, солому, сахарный тростник, жмых сахарного
- 99 021178 тростника, травы (например, соргаструм, такой как 3ο^дЬакίтт пШапк; или просо, например, виды Ратсит, такие как Ратсит ν^^даίит), и тому подобные, а также древесину, древесные стружки, древесную массу и опилки. Примеры бумажных отходов, подходящих для обработки полипептидами по изобретению, включают бракованную бумагу для фотокопий, бумагу для компьютерного принтера, бумагу для тетрадей, бумагу для блокнотов, бумагу для пишущей машинки и тому подобную, а также газеты, журналы, картон и упаковочные материалы на бумажной основе. Примеры отходов и обломков, полученных при строительстве и демонтаже, включают древесину, древесные отходы, древесные стружки и опилки.
В одном из вариантов ферменты, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, и способы по изобретению можно применять вместе с более традиционными способами получения этанола, метанола, пропанола, бутанола, пропанола и/или дизельного топлива из биомассы, например, такими как способы, включающие гидролиз лигноцеллюлозного материала, который осуществляют, подвергая высушенный лигноцеллюлозный материал в биореакторе воздействию катализатора, состоящего из разбавленного раствора сильной кислоты и соли металла; это может снижать энергию активации или температуру гидролиза целлюлозы, чтобы получить более высокие выходы сахара; смотри, например, патенты США № 6660506 и 6423145.
Другой иллюстративный способ, который включает применение ферментов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, заключается в гидролизе биомассы, включая любой лигноцеллюлозный материал, например, содержащий гемицеллюлозу, целлюлозу и лигнин, или любой другой полисахарид, который может быть гидролизован, благодаря тому, что материал подвергают первой стадии этапа гидролиза в водной среде при температуре и давлении, выбранным для осуществления, главным образом, деполимеризации гемицеллюлозы без существенной деполимеризации целлюлозы до глюкозы. Такая стадия приводит к получению взвеси, в которой жидкая водная фаза содержит растворенные моносахариды, полученные в результате деполимеризации гемицеллюлозы, а твердая фаза содержит целлюлозу и лигнин. Вторая стадия этапа гидролиза может включать использование таких условий, в которых по меньшей мере основная часть целлюлозы деполимеризуется, такая стадия приводит к тому, что жидкая водная фаза содержит растворенные продукты деполимеризации целлюлозы. Смотри, например, патент США № 5536325. Ферменты по изобретению (включая смеси или коктейли ферментов по изобретению) могут быть добавлены на любой стадии данного иллюстративного способа.
Другой иллюстративный способ, который включает применение ферментов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, заключается в обработке содержащей лигноцеллюлозу материала биомассы в ходе одной или нескольких стадий гидролиза разбавленной кислотой с использованием примерно от 0,4 до 2% сильной кислоты; и обработке не вступившего в реакцию твердого лигноцеллюлозного компонента материала биомассы, гидролизованного кислотой, с использованием щелочной делигнификации с получением предшественников биологически разрушаемых термопластиков и производных. Смотри, например, патент США № 6409841. Ферменты по изобретению могут быть добавлены на любой стадии данного иллюстративного способа.
Другой иллюстративный способ, который включает применение ферментов по изобретению, включая смесь ферментов или коктейли по изобретению, включает предварительный гидролиз лигноцеллюлозного материала в реакторе для предварительного гидролиза; добавление кислой жидкости к твердому лигноцеллюлозному материалу с получением смеси; нагревание смеси до температуры реакции; поддержание температуры реакции в течение времени, достаточного для фракционирования лигноцеллюлозного материала на солюбилизированную часть, содержащую по меньшей мере примерно 20% лигнина из лигноцеллюлозного материала и твердую фракцию, содержащую целлюлозу; удаление солюбилизированной части из твердой фракции при температуре реакции или близкой к ней температуре, при этом целлюлоза в твердой фракции становится лучше поддающейся ферментативному расщеплению; и извлечение солюбилизированной части. Смотри, например, патент США № 5705369. Ферменты по изобретению могут быть добавлены на любой стадии данного иллюстративного способа.
Изобретение относится к способам получения композиций моторного топлива (например, для двигателей с электрозажиганием) на основе жидких углеводородов, смешанных с топливным спиртом, полученным с использованием фермента или способа по изобретению. В одном из аспектов топливо, полученное с использованием фермента по изобретению, содержит, например, смеси жидкий угольный газили жидкий природный газ-этанол. В одном из аспектов сорастворителем является полученный из биомассы 2-метилтетрагидрофуран (МТНР). Смотри, например, патент США № 6712866.
В одном из аспектов способы по изобретению для ферментативного расщепления лигноцеллюлозы, например, для получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) из лигноцеллюлозного материала, также могут включать использование ультразвуковой обработки материала биомассы; смотри, например, патент США № 6333181.
В другом аспекте способы по изобретению для получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) из целлюлозного субстрата, включают получение реакционной смеси в форме взвеси, содержащей целлюлозный субстрат, фермент по настоящему изобретению и агент для ферментации (например, в реакционном сосуде, таком
- 100 021178 как биореактор с загрузкой твердых веществ полунепрерывного действия), и реакционной смеси дают возможность взаимодействовать в условиях, достаточных для инициации и поддержания реакции ферментации (как описано, например, в заявке на выдачу патента США № 20060014260). В одном из аспектов благодаря эксперименту или теоретическим расчетам можно определить оптимальную частоту загрузки. В одном из аспектов дополнительные количества целлюлозного субстрата и фермента подают в реакционный сосуд с интервалом(ами) в соответствии с оптимальной частотой загрузки.
Один иллюстративный способ получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) по изобретению описан в публикациях заявок на выдачу патента США № 20050069998; 20020164730; и в одном из аспектов включает стадии измельчения лигноцеллюлозной биомассы (например, до размера 15-30 мм), предварительной обработки полученного продукта паром (например, при температуре 190-230°С) в течение от 1 до 10 мин в реакторе; сбора предварительного обработанного материала в циклоне или подобном продукте производства; и разделения жидкой и твердой фракций фильтрованием в фильтр-прессе, внесение твердой фракции в слой для ферментации и добавление одного или нескольких ферментов по изобретению, например, фермента целлюлазы и/или бета-глюкозидазы (например, растворенного в цитратном буфере, рН 4,8).
Другой иллюстративный способ получения биотоплива (включая биоспирты, такие как биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, или биодизельное топливо) по изобретению, содержащего биоэтанол, биометанол, биобутанол или биопропанол, с использованием ферментов по изобретению включает предварительную обработку исходного материала, содержащего лигноцеллюлозное сырье, которое содержит, по меньшей мере, гемицеллюлозу и целлюлозу. В одном из аспектов исходный материал содержит картофель, сою (рапс), ячмень, рис, кукурузу, овес, пшеницу, свеклу или сахарный тростник или компонент или отходы, или побочный продукт производства пищевых продуктов или кормов. Исходный материал (сырье) подвергают условиям реакции, в которых разрушается структура растительных волокон, чтобы осуществить по меньшей мере частичный гидролиз гемицеллюлозы и целлюлозы. Разрушающие условия могут включать, например, воздействие на исходный материал температуры в среднем от 180 до 270°С и рН от 0,5 до 2,5 в течение периода времени примерно от 5 с до 60 мин; или температуры от 220 до 270°С и рН от 0,5 до 2,5 в течение периода времени от 5 с до 120 с, или эквивалентных условиях. Такие условия делают сырье более доступным для расщепления ферментом, например, ферментом целлюлазой по изобретению. Патент США № 6090595.
Примеры условий для применения ферментов по изобретению в гидролизе лигноцеллюлозного материала включают реакции при температурах примерно от 30 до 48°С и/или рН примерно от 4,0 до 6,0. Другие примеры условий включают температуру примерно от 30 до 60°С и рН примерно от 4,0 до 8,0.
Глюканазы (или целлюлазы), маннаназы, ксиланазы, амилазы, ксантаназы и/или гликозидазы, например, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы можно использовать для превращения биомассы в топливо и для получения этанола, например, как описано в заявках РСТ № \УО 0043496 и \УО 8100857. Глюканазы (или целлюлазы), маннаназы, ксиланазы, амилазы, ксантаназы и/или гликозидазы, например, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, можно использовать в сочетании с фитазой (например, ферментами по изобретению) для получения сбраживаемых сахаров и содержащей глюкан биомассы, которые могут быть превращены в топливный этанол. Амилазы, глюкоамилазы, пулланазы, глюкоизомераза, альфа-глюкозидаза и тому подобные можно использовать в сочетании с фитазой (например, ферментами по изобретению) для превращения крахмала в сбраживаемые сахара или этанол. Смотри заявку РСТ № \УО 2005/096804.
Обработка сухой гранулированной барды
В другом аспекте ферменты по изобретению можно применять для обработки/переработки сухого экстракта барды (ΌΌ8), сухой гранулированной барды (ΌΌ8), конденсированного экстракта барды (СО8), влажной гранулированной барды (О\УС) и сухой гранулированной барды с растворимыми компонентами (ООС8); сухая гранулированная барда может представлять собой зерновой побочный продукт процесса перегонки и может содержать растворимые вещества. Такие способы могут включать сухое измельчение побочных растительных продуктов, например, для применения в качестве корма, например, для домашней птицы, коров, свиней и других домашних животных. Таким образом, ферменты по изобретению можно использовать для обработки/переработки гранул, например злаковых, которые являются побочными продуктами процесса перегонки, включая способы с использованием любого источника гранул, например, традиционных источников пивоварен или, альтернативно, завода по производству этанола (фабрики, мельницы или тому подобного). Ферменты по изобретению можно применять для обработки/переработки сухого сусла, полученного после перегонки; такое сусло затем может быть использовано для многих целей, например, в качестве корма для скота, особенно для жвачных животных; таким образом, настоящее изобретение относится к способам обработки корма для скота, например, для жвачных животных, и к обработанному ферментом корму, содержащему фитазы по настоящему изобретению.
Фитазы по настоящему изобретению можно использовать отдельно или с другими ферментами для обработки сухого экстракта барды (ΌΌ8), сухой гранулированной барды (ΌΌ8), конденсированного
- 101 021178 экстракта барды (СЭ8), влажной гранулированной барды (ΌΑΟ) и сухой гранулированной барды с растворимыми компонентами (ΌΌΟ8). Например, фитазы по настоящему изобретению можно использовать на любой стадии способа получения спирта, как показано на фигуре 10. Фитазы по настоящему изобретению можно использовать для повышения биодоступности фосфора в любом биотопливе или потенциальном биотопливе, включая фосфор в составе сухого экстракта барды (ΌΌ8), сухой гранулированной барды (ΌΌ8), конденсированного экстракта барды (СЭ8), влажной гранулированной барды (ΌΆΟ) или сухой гранулированной барды с растворимыми компонентами (ΌΌΟ8) (смотри, например, С. МагЕпе/ Ате/сиа, 2004 Рои1!гу 8аепсе 83: 971-976).
Получение спиртных напитков или питьевого спирта
Фитазы по настоящему изобретению по настоящему изобретению также можно использовать для обработки сухой гранулированной барды для получения спирта - спирта в виде спиртных напитков, например, получения пива или виски (в дополнение к применению для обработки биомассы для получения биотоплива). Фитазы по настоящему изобретению можно использовать на заводах по производству этанола, например, для обработки зерна, такого как кукуруза. Сухую гранулированную барду можно получить, сначала размалывая зерно (например, кукурузу) до получения грубого помола и добавляя его к горячей воде. После охлаждения добавляют дрожжи и смесь бродит в течение от нескольких дней до недели. Твердые вещества, оставшиеся после брожения, представляют собой частицы барды. Фитазы по настоящему изобретению можно использовать на любой стадии указанного способа.
Препараты
Изобретение относится к новым препаратам, содержащим фитазы, например фитазы, описанные в настоящей публикации, и препаратам фитаз, включая препараты, которые содержат новые фитазы по изобретению. Фитазы по изобретению можно применять или готовить в виде препарата отдельно или в виде смеси фитаз или фитаз и других ферментов, такие как ксиланазы, целлюлазы, протеазы, липазы, амилазы или оксидоредуктазы, такие как лакказы, пероксидазы, каталазы, оксидазы или редуктазы. Ферменты можно использовать приготовленными в твердой форме, такой как порошок, лиофилизированный препарат, гранула, таблетка, пластинка, кристалл, капсула, пилюля, драже, или в жидкой форме, такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, взвесь, водная/масляная эмульсия, крем, капсула, или в виде везикулярной или мицеллярной суспензии. Препараты по изобретению могут содержать любой из следующих ингредиентов или сочетание следующих ингредиентов: полиолы, такие как полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, глицерин, сахар, такой как сахароза, сорбит, трегалоза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, манноза, гелеобразующее средство, такое как гуаровая камедь, каррагинан, альгинат, декстраны, производное целлюлозы, пектин, соль, такая как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид цинка, сульфат цинка, соль жирной кислоты и производное жирной кислоты, хелатор металла, такой как ЕЭТА, ЕΟТΑ, цитрат натрия, противомикробное средство, такое как жирная кислота или производное жирной кислоты, парабен, сорбат, бензоат, дополнительное модулирующее соединение для блокирования действия фермента, такого как протеаза, объемные белки, такие как БСА, гидролизат пшеницы, боратное соединение, аминокислота или пептид, соединение, модулирующее соответствующий уровень рН или температуру, эмульгатор, такой как неионогенный и/или ионогенный детергент, окислительно-восстановительный агент, такой как цистин/цистеин, глутатион, окисленный глутатион, восстановленное или антиоксидантное соединение, такое как аскорбиновая кислота, воск или масло или диспергирующее вещество. Для повышения стабильности фермента можно использовать поперечное сшивание и модификации белка, такие как пегилирование, модификация жирными кислотами, гликозилирование.
Измерение метаболических параметров
Способы по изобретению включают эволюцию целых клеток или клеточную инженерию клетки для разработки новой линии клеток, имеющей новый фенотип, посредством модификации генетического состава клетки, при этом генетический состав модифицируют добавлением к клетке нуклеиновой кислоты по изобретению. Чтобы выявить новый фенотип, контролируют по меньшей мере один метаболический параметр модифицированной клетки в клетке во временном интервале в реальном времени или онлайн. В одном из аспектов множество клеток, таких как культура клеток, наблюдают в реальном времени или онлайн. В одном из аспектов множество метаболических параметров наблюдает в реальном времени или онлайн.
Анализ метаболических потоков (МРА) основан на известной биохимической концепции. Конструируют линейно независимую метаболическую матрицу на основе закона превращения масс и гипотезы квазистационарного состояния (Р88Н) внутриклеточных метаболитов. При практическом применении способов по изобретению устанавливают метаболические сети, включая:
идентификацию всех субстратов, продуктов и промежуточных метаболитов, идентификацию всех химических реакций взаимопревращения метаболитов пути, стехиометрии реакций пути, идентификацию всех ферментов, катализирующих реакции, кинетики ферментативных реакций, регуляторные взаимодействия между компонентами пути, например, аллостерические взаимодействия, фермент-ферментные взаимодействия и т.д.,
- 102 021178 внутриклеточную компартментализацию ферментов или любую другую надмолекулярную организацию ферментов и наличие любых градиентов концентрации метаболитов, ферментов или эффекторных молекул или диффузионных барьеров для их движения.
После построения метаболической сети для данной линии может быть осуществлено математическое представление в виде матрицы, чтобы оценить внутриклеточные метаболические потоки, если доступны данные метаболома он-лайн.
Метаболический фенотип основан на изменениях метаболической сети в клетке в целом. Метаболический фенотип основан на изменении использования пути в соответствии с условиями окружающей среды, генетической регуляций, стадией развития и генотипом, и т.д. В одном из аспектов способов по изобретению после расчетов МРА он-лайн анализируют динамическое поведение клеток, их фенотип и другие свойства посредством исследования использования пути. Например, если увеличивается поступление глюкозы и снижается уровень кислорода во время дрожжевого брожения, то использование дыхательных путей будет снижаться и/или останавливаться, а использованием путей брожения будет доминировать. Контроль физиологического стояния клеточных культур станет возможным после анализа путей. Способы по изобретению могут помогать в определении того, как воздействовать на ферментацию, благодаря определению того, как изменить поступление субстрата, температуру, использование индукторов и т.д., чтобы регулировать физиологическое состояние клеток в требуемом направлении. При практическом осуществлении способов по изобретению результаты МРА также можно сравнить с данными транскриптома и протеома, чтобы разработать эксперименты и протоколы для метаболического конструирования или перетасовки генов и т.д.
При практическом осуществлении способов по изобретению можно придавать и определять любой модифицированный или новый фенотип, включая новые или улучшенные свойства клетки. Можно контролировать любой аспект метаболизма или роста.
Мониторинг экспрессии транскрипта мРНК
В одном из аспектов изобретения сконструированный фенотип содержит увеличение или уменьшение экспрессии транскрипта мРНК или образование новых транскриптов в клетке. Транскрипт мРНК или мессенджер можно выявлять и количественно оценивать любым способом, известным в данной области, включая, например, Нозерн-блоты, количественные реакции амплификации, гибридизацию с матрицами и тому подобное. Количественные реакции амплификации включают, например, количественную ПЦР, включая, например, количественную полимеразную цепную реакции с обратной транскрипцией или ОТПЦР; количественную ОТ-ПЦР в режиме реального времени или ОТ-ПЦР с определением кинетики в реальном времени (смотри, например, Кгеи/ег (2001) Вг. ί. Наета!о1. 114: 313-318; Х1а (2001) Тгап5р1ап1аИоп 72: 907-914).
В одном из аспектов изобретения сконструированный фенотип создают нокаутированием экспрессии гомологичного гена. Может быть нокаутирована кодирующая последовательность гена или один или несколько элементов регуляции транскрипции, например, промоторы или энхансеры. Таким образом, экспрессия транскрипта может быть полностью исключена или только снижена.
В одном из аспектов изобретения сконструированный фенотип включает увеличение экспрессия гомологичного гена. Это можно осуществить в результате нокаута негативного регуляторного элемента, включая элемент регуляции транскрипции, действующий в цис- или транс-положении, или в результате мутагенеза позитивного регуляторного элемента.
Как подробно обсуждается ниже, один или несколько или все транскрипты клетки могут быть измерены посредством гибридизации образца, содержащего транскрипты клетки или нуклеиновые кислоты, представляющие или комплементарные транскриптам клетки, с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице.
Мониторинг экспрессии полипептидов, пептидов и аминокислот
В одном из аспектов по изобретению сконструированный фенотип включает увеличение или уменьшение экспрессии полипептида или создание новых полипептидов в клетке. Полипептиды, пептиды и аминокислоты можно определять и количественно оценивать любым способом, известным в данной области, включая, например, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), спектрофотометрию, радиографию (радиоактивное мечение белков), электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (ТСХ), сверхдиффузинную хроматографию, различные иммунологические способы, например иммунопреципитацию, иммунодиффузию, иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы (РИА), твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А), иммунофлуоресцентные анализы, гель-электрофорез (например, в δΌδ-ПААГ), окрашивание антителами, активируемую флуоресценцией сортировку клеток (РАС8), пиролиз-масс-спектрометрию, инфракрасную спектрометрию с преобразованием Фурье, спектрометрию комбинационного рассеяния, ГХ-МС и ЖХ-электроспрей и капиллярную ЖХ-тандемную масс-спектрометрию с ионизацией в электроспрее, и тому подобное. Новые биологические активности также могут быть подвергнуты скринингу с использованием способов или их вариантов, описанных в патенте США № 6057103. Кроме того, как подробно обсуждается ниже, один или несколько или все полипептиды клетки могут быть измерены с использова- 103 021178 нием белковой матрицы.
Управляемое в ходе биосинтеза фракционное 13С-мечение протеиногенных аминокислот можно контролировать, подавая смесь однородно 13С-меченых и немеченых соединений, являющихся источником углерода, в сеть биологических реакций. Анализ полученной картины мечения обеспечивает и подробную характеристику топологии сети и определение скоростей метаболических потоков аминокислот; смотри, например, З/урегкй (1999) ΜеίаЬ. Епд. 1: 189-197.
Следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения изобретения. Хотя способы, описанные в примерах, являются типичными способами, которые можно применять для осуществления некоторых аспектов изобретения, также можно использовать другие способы, известные специалистам в данной области.
Примеры
Пример 1. Характеристика активности характерных фитаз по изобретению.
В данном примере описана характеристика фитазной активности полипептидов по изобретению, которые представляют собой модификации последовательности (так называемые подвергнутые эволюции фитазы) исходной фитазы ЗЕЦ ΙΌ Ν0:2, и пример анализа фитазной активности. Такой анализ фитазной активности можно использовать для определения того, обладает ли полипептид достаточной активностью, чтобы войти в объем заявленного изобретения.
После создания полипептидов по изобретению в результате экспрессии ΟЗЗΜ-модифицированных последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению подвергнутые эволюции полипептиды фитазы - в данном исследовании примеры с мутацией только одного остатка - очищали и затем подвергали тепловой обработке (рН 7,0, 0,01% твин) при различных температурах в течение 30 мин. После стадии тепловой обработки образцы (20 мкл) анализировали с использованием флуоресцирующего субстрата (180 мкл) 4 мМ ΌίΡΜϋΡ при рН 5,5. Скорости сравнивали со скоростями для каждого соответствующего необработанного образца. Результаты показаны на фиг. 1.
В другом исследовании подвергнутые эволюции фитазы по изобретению, содержащие смешанные одиночные мутации, т.е., фитазы, содержащие множество мутаций, получали, выращивая культуры в течение ночи в ЬВСАРВ 100™ (ЬВсагЬ100) при 30°С. 100 мкл каждой культуры (смешанного мутанта) подвергали тепловой обработке в термоциклере от 72 до 100°С. 20 мкл подвергнутой тепловой обработке культуры смешивали с 180 мкл 4 мМ ΌίΡΜυΡ при рН 5,5. Скорости сравнивали со скоростями для каждого соответствующего необработанного образца; данные суммированы на фиг. 2. В таблице, показанной на фиг. 3, графически суммированы данные (округленные до ближайших десятых), используемые для построения графика на фиг. 2.
Образцы 1-21 соответствуют смешанным одиночным мутациям исходной последовательности ЗЕЦ ГО Ν0:2, которые показаны в таблице на фиг. 5; обратите внимание что подвергнутая эволюции фитаза номер 10 имеет модификацию остатка в последовательности (по сравнению с ЗЕЦ ГО Ν0:2), которая не была введена в результате ΟЗЗΜ; такая мутация может быть введена случайно и может либо иметь, либо не иметь какого-либо значения для термостабильности данной иллюстративной фитазы по изобретению. Также, обратите внимание, что помеченные знаком ** примеры фитаз 19, 20 и 21 имеют Сконцевые гистидиновые (6хШк) метки (-РЗНННННН). Фиг. 5 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих модификации нескольких остатков по сравнению с исходной последовательностью ЗЕЦ ГО Ν0:2; которые подробно описаны в настоящем описании. Фиг. 6 иллюстрирует примеры фитаз, имеющих модификации одиночных остатков по сравнению с последовательностью ЗЕЦ ГО Ν0:2; которые подробно описаны в настоящем описании.
Фиг. 7 схематично иллюстрирует пример анализа фитаз по изобретению с использованием флуоресцирующего субстрата 4-метилумбеллиферилфосфата (ΜеυΜΒ-фосфат, структура которого также показана): (ί) фитазу провоцируют нагреванием в течение 20 мин при 72°С, рН 4,5; и при 80°С при физиологическом рН (рН 7,4); и (ίί) остаточную активность тестируют при 37°С, рН 4,5:
измеряют остаточную активность при высоком и низком рН, вычисляют остаточную активность по сравнению с диким типом после тепловой обработки.
Фиг. 8 схематично иллюстрирует другой пример анализа фитазы по изобретению, в котором также используют флуоресцирующий субстрат ΜеυΜΒ-фосфат: (ί) фитазу провоцируют нагреванием в течение 30 мин при 86°С, рН 5,5; и (ίί) тестируют остаточную активность при 37°С, рН 4,5:
измеряют остаточную активность по сравнению с 6Х контрольным вариантом, отбирают наилучшие варианты и повторно анализируют при более высокой жесткости, чтобы отобрать лучшие варианты.
Такой анализ использовали для скрининга библиотек ΟЗЗΜ-вариантов (ЗЕЦ ГО Ν0:1), анализируя фитазную активность кодируемых ими полипептидов. Фиг. 9 схематично иллюстрирует протокол скрининга такой библиотеки (как описано на фиг. 8), при этом размер библиотеки, подвергаемой скринингу, составляет 24576 вариантов.
Пример 2. Разработка фитазы с повышенной термоустойчивостью и повышенной лабильностью в желудке.
В данном примере описана разработка и характеристика фитазной активности полипептидов по
- 104 021178 изобретению, которые имеют дополнительные модификации последовательности (подвергнутые эволюции фитазы) по сравнению с исходной фитазой δЕ^ ΙΌ ΝΌ:2. Подвергнутые эволюции фитазы, описанные в настоящей публикации, оптимизировали в отношении экспрессии в растении и в отношении промышленного внедрения на больших площадях. Фитазы обладают улучшенной или эквивалентной термоустойчивостью по сравнению с исходной фитазой ^Ер ΙΌ ΝΌ:2, кодируемой последовательностью δЕ^ ΙΌ ΝΌ:1) и пониженной стабильностью т укго в желудке (повышенная стабильность в желудке).
Отбор матриц.
Выбранный полученный посредством ΟδδМ остов обладает термоустойчивостью, и были получены данные о его разложении в δΟΡ. Оценку начинали с тестирования свойств в δΟΡ тринадцати термоустойчивых молекул фитазы (которые описаны в примере 1 выше и в таблице 3 ниже). Данные, полученные в δΟΡ для очищенных фитаз, показывают, что все термоустойчивые варианты, включая термоустойчивую мутацию исходной фитазы в одном сайте М59У ^Ер ΙΌ NО:2-N159У), были очень стабильными, при этом наблюдали минимальное разложение в течение 2 ч.
Предыдущие исследования/публикации свидетельствуют, что ген аррА фитазы Е. соН (штамма К12, (ΟеηВаηк, номер доступа М58708) кодирует более чувствительную к разрушению в δΟΡ фитазу, чем исходная фитаза ^Ер ΙΌ ΝΌ:2). При попытке понять явление стабильности в δΟΡ исследовали пять промежуточных вариантов между аррА и исходной фитазой ^Ер ΙΌ ΝΌ:2) в отношении лабильности в δΟΡ. Данные свидетельствуют о строгой корреляции между термоустойчивостью и лабильностью в δΟΡ (фигуры 11А и 11В). Более важно, что в случае аррА-7Х, которая отличается одной аминокислотой от исходной фитазы ^Ер ΙΌ ΝΌ:2), показано примерно на 10% большая потеря активности в δΟΡ после 10минутной инкубации по сравнению с исходной фитазой ^Ер ΙΌ ΝΌ:2). Полученные новые данные означают, что одно одиночное мутационное изменение в последовательности δЕ^ ΙΌ ΝΌ:2 может вызывать изменения устойчивости в δΟΡ и, что более важно, отличие от исходной фитазы ^Ер ΙΌ ΝΌ:2) в анализе δΟΡ. На основании полученных новых результатов аррА-7Х был отобран в качестве исходного контроля для δΟΡ-эволюции, и последовательность δЕ^ ΙΌ ΝΌ:2 отобрана в качестве ΟδδМ-остова для эволюции.
Так как очистка белка может быть неотъемлемой частью процесса характеристики, то последовательность δЕ^ ΙΌ ΝΌ:2 оценивали как в виде Ык-меченой ^Ер ΙΌ ΝΌ:2-ΗΙδ), так и не меченой Ыкметкой ^Ер ΙΌ ΝΌ:2) молекулы. Анализы δΟΡ осуществляли как на очищенных Ык-меченых, так и не меченых Ык-меткой вариантах исходной фитазы ^Ер ΙΌ ΝΌ:2). Анализы δΟΡ осуществляли с использованием двух разных доз пепсина (0,15 мг/мл и 0,75 мг/мл). Остаточную активность определяли в разных временных точках (7,5, 15, 30, 60, 90 и 120 мин). Не было значимого различия в профилях δΟΡ между двумя вариантами (фиг. 12).
Таблица 3. Варианты фитазы, охарактеризованные в отношении возможного ΟδδМ δΟΡ-остова
Иетэдге» Вариант Д7 Г Ж Е Ж Ж Ж Р Ж Е Ж с Ж н ж Е Ж V Ж к ж к Ж β Ж β Ж Υ ο С 0 № 0275 V Υ277 0 Α 13® Υ
084 А95
аррА аррА2Х № Р
084 А95 Υ277
аррА аррАЗХ № Р 0
084 А95 Υ277
аррА аррА4Х № Р 0
№68 084 А95 К97 Κ181 N226 Υ277
аррА аррА7Х Е № Р С Υ С β
зваго ЗЕОЮ N0:2 №68 084 А95 К97 5168 β181 N226 Υ277
N0:2 без мутаций Е № Р С Е Υ С β
5Ε0Ι0 ЗЕОЮ N0:2- №68 084 А95 К97 3168 N159 β181 N226 Υ277
N0:2 Ν159ν Е № Р С Е V Υ С β
8Е0Ю ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 Т136 3168 Κ181 N226 У233 Υ277
N0:2 ЗХ Р Е № Р С н Е Υ С № β
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- №68 084 А95 К97 Т136 3168 N159 Κ181 0226 Υ233 Υ277 Τ349
N0:2 5Ха Е № Р С н Е V Υ 0 № β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 3168 N159 β181 0226 Υ233 Υ277 Τ349
N0:2 5ХЬ Е Е № Р С Е V Υ 0 № β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 Т136 3168 Κ181 0226 ν233 Υ277 Τ349
N0:2 5Хс Е Е № Р С н Е Υ 0 № β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 Т136 3168 N159 Κ181 N226 У233 Υ277 Τ349
N0:2 5ХЙ Е Е № Р С н Е V Υ С № Β Υ
ТО ЗЕОЮ N0:2- М7 №63 084 Ж Ж ж N159 Βϊ ^77 та
N0:2 5Хе Е Е № Р С н Е V Υ Β Β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 Т136 3168 N159 Κ181 С226 Υ233 Υ277
N0:2 5X1 Е Е № Р С н Е V Υ ϋ № Β
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 Т136 5168 N159 Κ181 С226 ν233 Υ277 Τ349
N0:2 6Х Е Е № Р С н Е V Υ ϋ № Β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 Т136 5168 N159 0164 0179 Κ181 0226 Υ233 0275 Υ277 Τ349
N0:2 9Х Е Е № Р С н Е V β Β Υ 0 № V Β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 097 1136 5168 N159 Т163 6179 β181 0226 Υ233 0275 Υ277 Τ349
N0:2 ЮХа Е Е № Р Е н Е V β β Υ 0 № V Β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 К97 Т136 3168 N159 Т163 В164 0179 Η181 С226 Υ233 0275 Υ277 Τ349
N0:2 ЮХЬ Е Е № Р С н Е V к β β Υ 0 № V Β Υ
ЗЕОЮ ЗЕОЮ N0:2- А47 №68 084 А95 097 К97 Т136 5168 N159 Т163 0164 Ε168 0179 Η181 0226 Υ233 0275 Υ277 Κ289 Τ349
N0:2 13Х Е Е № Р Е С н Е V к β β β Υ 0 № V Β Α Υ
- 105 021178
Очищенные фракции фитазы 8ЕО ΙΌ N0:2 и вариантов 8ЕО ΙΌ NО:2-N159У - 8ЕО ΙΌ NО:2-6x тестировали в отношении стабильности в 8СР при дозах пепсина 0,75 мг/мл и 0,15 мг/мл; данные не показаны. Определяли остаточную активность в различных временных точках (7, 5, 15, 30, 60, 90 и 120 мин). В случаях обеих доз не наблюдали значимого различия в 8СР-стабильности между вариантами фитаз. Последовательность 8ЕР ΙΌ N0:2 была наименее стабильной в 8СР при обеих дозах.
8СР-анализы с использованием анализа в 8Ы8-ПААГ. Все варианты, указанные в таблице 3, тестировали в отношении 8СР-стабильности в 8Ы8-ПААГ (данные не показаны). 8Э8-ПААГ-гелн сушили, используя 81тр1у В1ие™ 8а£е81ат. В 8СР-анализе последовательность 8ЕО ΙΌ N0:2 денатурировала в течение 60-минутного периода, тогда как последовательность 8ЕР ΙΌ NО:2-N15 9У и другие варианты не повергались значимому разрушению в течение двухчасового периода.
Удаление Ы-гликозилирования.
Предыдущие исследования показали, что N-глнкознлнрованне может повышать 8СР-стабильность. Поэтому, чтобы уменьшить 8РС-стабильность, осуществляли насыщающий направленный мутагенез (8ЫМ), чтобы удалить два участка ^гликозилирования в исходной молекуле 8ЕР ΙΌ N0:2. Первый сайт узнавания для ^гликозилирования может быть удален либо заменой аспарагина (Ή) в положении 161, либо треонина (Т) в положении 163 любой другой аминокислотой. Второй сайт узнавания для N гликозилирования может быть исключен заменой N в положении 339 или Т в положении 341 таким же способом.
8ЫМ осуществляли, конструируя праймер с требуемым изменением кодона и затем осуществляя ПЦР с использованием праймера и матрицы (исходной последовательности), чтобы создать новую матрицу с требуемым изменением кодона. В ходе 8ЭМ все другие 19 возможных аминокислот использовали для замены в каждом из четырех остатков, ответственных за узнавание для ^гликозилирования: сайты 161, 163, 339 и 341. Мутации, проявляющие наиболее сходные свойства (удельную активность, термоустойчивость и профиль рН) с последовательностью 8ЕР ΙΌ N0:2 в четырех положениях затем объединяли, чтобы создать вариант, который не будет иметь никаких сайтов узнавания для ^гликозилирования. Четырьмя наилучшими мутациями, которые сохраняли свойства исходной фитазы (8ЕР ΙΌ N0:2), были мутации №61К, Т163К, №39Е, и Т34Ш. Такие мутации объединяли таким образом, который мог удалить оба сайта узнавания для ^гликозилирования в одной и той же молекуле (таблица 4).
Таблица 4. Варианты с удаленным ^гликозилированием
Название Мутация
Вариант (ЗЬУ1 Ν161Κ и Ν339Ε
Вариант 0ЬУ2 Ν161Κ и Τ341Ό
Вариант СЬУЗ Т163Е и Ν339Ε
Вариант 0ЬУ4 Т163Е. и Τ341Ό
Конструировали четыре варианта с удаленным гликозилированием, экспрессировали такие варианты в РщЫа ракЮпк и характеризовали. Т ермоустойчивость (время полужизни) не имеющих гликозилирования вариантов последовательности 8ЕР ΙΌ N0:2 (варианты СЕУ1-СЬУ4) и двух контролей 8ЕР ΙΌ N0:2 определяли, используя тепловую обработку при 80°С в течение десятиминутного временного периода. Экспрессированные в РщЫа последовательность 8ЕО ΙΌ N0:2 и варианты без N гликозилирования (варианты СЕУ1-СЬУ4) имели примерно одинаковую термоустойчивость. Однако последовательность 8ЕО ΙΌ N0:2 (экспрессированная в РщЫа ракЮпк) имела более высокую термоустойчивость, чем в случае такого же гена, экспрессированного в Е. сой (8ЕР ΙΌ NО:2-НI8). Главный вариант без гликозилирования, вариант СЬУ3, имел такую же термоустойчивость, профиль рН и удельную активность, как и 8ЕР ΙΌ N0:2 (фиг. 13). Данные о термоустойчивости были неожиданными, гипотеза, выдвинутая в предыдущей работе, свидетельствовала о том, что гликозилирование повышает термоустойчивость, поэтому было неожиданным, что варианты без гликозилирования могут иметь пониженную термоустойчивость. Как и предполагалось, имело место значимое различие в термоустойчивости между экспрессированными в Е. сой и РщЫа ракЮпк последовательностями 8ЕО ΙΌ N0:2. Однако если гликозилирование не является влияющим фактором, то вероятно, что различие в термоустойчивости может быть объяснено разной средой для фолдинга белка в двух экспрессирующих хозяевах; РщЫа - внутриклеточный фолдинг белка, Е. сой - фолдинг белка в периплазме.
Мутации Т163К и №39Е были включены в наилучшие лабильные в 8СР-варианты, позднее в конструирование (смотри эволюцию ТМСА8М ниже).
Фитазную активность и рН-профили вариантов без гликозилирования (варианты СЕУ1-СЬУ4), а также очищенной экспрессированной в РщЫа последовательности 8ЕР ΙΌ N0:2 определяли по отношению к фитату при рН 2, 2,5, 3, 4, 5 и 6 при 37°С. Данные (не показаны) свидетельствуют, что не имеющие гликозилирования варианты обладают активностью и рН-профилем, сходными с 8ЕР ΙΌ N0:2.
Скрининг 8Е0 II) N0: 2 8СГ С88М8М
- 106 021178
8Еф ΙΌ ЫО:2-Н18 была выбрана в качестве матрицы для О88М. Осуществляли эволюцию с использованием О88М8М (насыщающий мутагенез генных сайтов™) (смотри, например, патент США № 6171820).
Разработка высокопроизводительного анализа
Культуры 8Еф ГО N0:2 и 8Еф ГО ЫО:2-6Х выращивали в 384-луночных планшетах для микротитрования, тестировали в автоматизированном роботизированном формате анализа в отношении стабильности в 8ОР. Планшеты подвергали тепловой обработке при 65°С в течение 30 мин, чтобы лизировать клетки. Затем культуры делили и вносили в необрабатываемый контрольных планшет и обрабатываемый 8ОР планшет. Активности 8ОР-обработанных образцов сравнивали с необработанными контрольными образцами. Выбирали временные точки 10, 20, 30 и 40 мин (фиг. 14). 8ОР-профиль исходной фитазы (лизат целых клеток), полученный в автоматизированном анализе, отражал обычный лабораторный 8ОРанализ.
Результаты высокопроизводительного анализа
Полную исходную последовательность (8Еф ГО ЫО:2, за исключением стартового кодона), 432 кодона, подвергали мутациям, экспрессировали (в Е. сой, как описано ниже) и подвергали скринингу в отношении улучшения разрушения в 8ОР, используя разработанный высокопроизводительный анализ фитазы в 8ОР. Подтверждена лабильность в 8ОР для ста тридцати двух новых мутаций в 69 разных положениях остатков (табл. 5). По меньшей мере восемь мутаций в одиночных сайтах удовлетворяли требованию полного разрушения белка в 8ОР за 10 мин. Однако большинство таких мутантов не достигали свойства термоустойчивости, присущего исходной фитазе, их термоустойчивость была ниже на 4°С или больше. Только один мутант, О247Н, обладал термоустойчивостью, равной или немного более высокой, чем термоустойчивость исходной фитазы, и полностью разрушался в 8ОР в течение 10 мин.
Утрату 8ОР-активности мутантов, выбранных при скрининге О88М, определяли на протяжении двадцатиминутного исследования (фиг. 15), используя дифтор-4-метилумбеллиферилфосфат (О|РМиР), 50 мМ Ыа-ацетат, рН 5,5, 0,75 мг/мл пепсина. Характеристика таких 8ОР-мутаций показала, что скорость полного разрушения делит их на три категории, быстрые (менее чем 2 мин), средние (~10-15 мин) и медленные (>20 мин); медленные 8ОР-мутанты имели только небольшое улучшение по сравнению с исходной фитазой (8Еф ГО ЫО:2). Данные свидетельствуют, что анализ активности является более чувствительным способом определения распада фитазы; при 20% остаточной активности полоса фитазы не выявляется в 808-ПААГ-геле (данные не показаны).
8ОР-мутанты тестировали в отношении термоустойчивости двумя способами; а) тепловая обработка при 65°С в течение тридцати минут и Ь) градиент 50-70°С в течение тридцати минут. Данные о термоустойчивости свидетельствуют, что большинство 8ОР-мутантов теряли >4°С, за исключением варианта 1427Т и варианта О247Н. Чтобы быстро преодолеть недостаточность термоустойчивости, разработали ускоренную методику; несколько очень многообещающих 8ОР-мутаций включали в более термоустойчивые остовы фитазы (из примера 1, выше), чтобы проверить, можно ли восстановить термоустойчивость (более глубоко обсуждается в разделе под заголовком Ускоренная методика).
Все мутации сравнивали и наилучшие 48 мутаций ранжировали (таблица 6) по значению пригодности РТ (% термоустойчивости - % 8ОР = РТ). Наилучшие мутации в одиночных сайтах рассматривали в отношении сочетания в фазе специализированной многосайтовой комбинаторной сборки 8М (ТМСА8М) (см. ниже).
На основании полученных данных имелись некоторые аминокислотные замены и положения остатков, которые в случае изменения в исходной молекуле фитазы (8Еф ГО ЫО:2) были более благоприятными для повышения лабильности в 8ОР, чем другие (фиг. 16). На фиг. 16 число под символом аминокислоты указывает сколько раз молекула присутствует в исходном белке. Например, остаток в положении 48, треонин, может быть изменен на девять других аминокислот (РУ^МНКУТО). Три добавления аминокислот, которые наиболее часто увеличивали лабильность в 8ОР, представляли собой добавления лейцина (14 раз), пролина (12 раз) и гистидина (12 раз). В качестве следующего примера аргинины, которые присутствовали в исходном белке (22 раза в 8Еф ГО ЫО:2), никогда не были заменены другой аминокислотой так, чтобы наблюдалось увеличение лабильности в 8РО. Однако когда аргинином заменяли другую аминокислоту в исходном белке (7 раз), в каждом случае лабильность в 8ОР возрастала. Данные 8ОР О88М свидетельствуют, что в молекуле фитазы встречаются горячие точки для 8ОР-мутаций (фигура 17). Наибольшая серия мутаций, семь подряд, встречалась между остатками 145-151. Также было три группы, в которых могли мутировать по три остатка подряд. Несколько аминокислотных остатков были нерегулярными для аминокислотных замен, способствующих лабильности в 8ОР, при этом наиболее экстремальным был Т48, который заменяли девятью разными аминокислотами (Р, Υ, ^, М, Н, К, У, I и Ь). В случае положений 48 и 79 Н был наилучшей мутацией и был отобран в качестве кандидата для библиотеки ТМСА.
- 107 021178
Таблица 5. Названия вариантов и мутации наилучших вариантов, обнаруженных при ОЗЗМ-скрининге, которые имели улучшения в отношении разрушения в 8ОР
Вариант Мутация Вариант Мутация Вариант Мутация Вариант Мутация
1 Р 100 А 34 О 137 Р 67 Р 194 I. 100 Р 149 N
2 Р 149 Ь 35 Ь 157 С 68 Н 272 νν 101 Υ 79 Н
3 I 427 Т 36 1 150 Υ 69 V 191 А 102 О 86 Н
4 Т 291 νν 37 V 162 Т 70 8 218 Υ 103 Ω 275 Н
5 Т 291 V 38 I 174 Р 71 Р 217 8 104 А 274 I
6 I. 126 И 39 е 353 С 72 Р 217 ϋ 105 А 274 Т
7 Р 254 δ 40 1 150 Т 73 Р 217 Θ 106 Υ 79 5
8 Ι 192 Р 41 8 102 А 74 8 102 Υ 107 Н 263 Р
9 О 377 К 42 I 174 Р 75 8 218 I 108 А 274 V
10 V 422 М 43 6 171 δ 76 А 232 Р 109 А 274 I.
11 ί 157 Р 44 N 148 М 77 νν 265 Ь 110 А 274 Р
12 I 107 Н 45 □ 137 V 78 N 266 Р 111 8 389 V
13 I 108 К 46 Р 145 ί 79 I. 167 δ 112 С 395 Т
14 О 309 Р 47 I 108 Υ 80 I. 216 Т 113 Θ 395 О
15 I 108 А 48 Е 113 Р 81 Р 217 I. 114 С 395 Ь
16 I 108 δ 49 Р 147 Υ 82 Ь 244 3 115 С 395 I
17 I 107 Р 50 δ 173 Н 83 Р 269 Ь 116 С 395 Е
18 С 155 Υ 51 Т 163 Р 84 Т 48 Р 117 δ 389 Н
19 I 108 О 52 N 148 К 85 Т 48 νν 118 I 427 е
20 А 236 Т 53 δ 173 V 86 Т 48 М 119 I 427 8
21 8 208 Р 54 А 248 Ь 87 Т 48 Н 120 А 429 Р
22 А 109 V 55 А 248 Т 88 Т 48 К 121 Р 343 Е
23 С 171 М 56 О 247 Н 89 Т 48 Υ 122 Р 343 V
24 5 173 Θ 57 А 236 Н 90 Т 48 V 123 Р 343 К
25 V 162 I. 58 I. 269 I 91 М 51 А 124 Р 343 I.
26 Ц 139 Υ 59 δ 197 е 92 М 51 ί 125 Р 343 V
27 Ь 146 К 60 Ь 235 I 93 Т 48 I 126 N 348 К
28 О 137 Υ 61 8 211 н 94 М 51 О 127 Р 343 I
29 О 137 Ь 62 Т 282 Н 95 Т 48 Ь 128 N 348 νν
30 Ь 146 Т 63 О 246 96 Ь 50 νν 129 Р 343 N
31 К 151 Р 64 С 257 К 97 б 67 А 130 I. 379 V
32 N 148 К 65 I. 269 Т 98 Υ 79 νν 131 О 381 8
33 К 151 Н 66 Θ 257 А 99 Υ 79 N 132 I. 379 δ
Значительное количество ОЗЗМ-вариантов удовлетворяли требованиям для 8ОР (быстрое разрушение < 10% после 10-минутного действия 8ОР), но имели недостатки в отношении свойства термоустойчивости (< 75% сохранялось после тепловой обработки при 65°С в течение 30 мин). Мутанты со средним и медленным разрушением удовлетворяли требованиям термоустойчивости, но не требованиям 8ОР. В результате ОЗЗМ-скрининга только вариант 56 ^247Н) удовлетворял требованиям в отношении обоих свойств 8ОР и термоустойчивости.
Таблица 6. Ранжирование наилучших ЗОР-мутантов
- 108 021178
Все 132 мутанта сравнивали параллельно, чтобы определить наилучших мутантов в результате скрининга в 8СР. Наилучшие 49 8СР-мутантов ранжировали и сравнивали с шестью отдельными контролями (исходная фитаза - 8ЕО ГО Ν0:2). Варианты ранжировали по их свойствам термоустойчивости (% сохранения при 65°С, НТ%) и 8СР-лабильности (сохранение в 8СР - 8СР%). Определяли произвольное значение пригодности ^ν) = (65°С НТ%) (8СР %) и варианты с наибольшим РV, выделенные оранжевым цветом, рассматривали в качестве кандидатов для дальнейшей эволюции с использованием методики ТМСА.
В случае двух из трех наилучших мутаций (9246ν и 9247Н) наблюдали свойства термоустойчивости, сходные с термоустойчивостью исходной фитазы (8Е9 ГО Ν0:2), и значительно повышение 8СРлабильности. Используя 3-мерное моделирование, обнаружили, что ν246 предположительно будет погружен под поверхность белка, делая необходимым приспособление белка к более крупной боковой цепи триптофана в той области, которая представляла собой плотно упакованное окружение боковой цепи глутамина. Также, белок должен быть адаптирован к утрате водородной связи между эпсилонкислородом боковой цепи 9246 с азотом основной цепи С255, так как в остатках триптофана нет кислорода в боковой цепи. Структурный анализ также показал, что в то время как основанная цепь Н247 может быть погружена, имидазольная боковая цепь может как трубка для подводного плавания идти к поверхности. Хотя замена глутамина на гистидин является относительно консервативной заменой, она создает новую доступную поверхностную группу в такой области, которая доступна для протонирования при более низком рН, что несомненно может изменять локальную сеть водородных связей, потенциально действуя в качестве кислотного переключателя для разрушения локальной структуры белка структура в данной области, делая белок более чувствительным к разрушению кислотой и пепсином.
Ускоренная методика
Чтобы преодолеть проблему, имеющую отношение к свойствам термоустойчивости, которые были утрачены у лидирующих лабильных в 8СР вариантов (за исключением 9247Н), предложили ускоренную методику для конструирования молекул фитазы, которые обладают двумя требуемыми свойствами; 8СР и термоустойчивостью. Термоустойчивые фитазы (8Е9 ГО Ν0:2-Ν159ν, 8ЕО ГО Ν0:2-6Χ и 8ЕО ГО Ν0:2-9Χ) из проведенной ранее эволюционной обработки (смотри пример 1, выше) отбирали в качестве остовов для двух раундов сайт-специфичного мутагенеза (8ЭМ).
В ходе первого 8Г)М включали каждую из одиночных 8СР-мутаций (Τ291ν, А236Т или Ь157Р) в каждый из трех термоустойчивых остовов, как показано в таблице ниже (табл. 7).
Таблица 7. Варианты и раунда I 8РМ
Раунд I 3ΌΜ
Вариант Исходный (остов) ΗΪ3- метка Хозяин - наилучшие 10 Дополнительные мутации
А ЗЕО Ю ΝΟ:2-6Χ X X Τ2 9ΐν
В ЗЕО Ю ΝΟ:2-6Χ X X А236Т
С ЗЕО ΙΌ ΝΟ:2-6Χ X X Ы57Р
ϋ ЗЕО ΙΌ ΝΟ:2-Ν159ν X X Ы57Р
Е ЗЕО Ιϋ ΝΟ:2-Ν159ν X X А236Т
Р ЗЕО Ю ΝΟ:2-Ν159ν X X Τ29ΐν
С ЗЕО ΙΏ Ν0:2-9Χ X X Ы57Р
Н ЗЕО Ю ΝΟ:2-9Χ X X А236Т
I ЗЕО Ю ΝΟ:2-9Χ X X Τ2 9ΐν
Данные, полученные в первом раунде 8ЭМ, свидетельствуют, что улучшения в 8СР-лабильности получали в случае вариантов, полученных из остова 8Е9 ГО Ν0:2-Ν159ν. Однако такие 8СР-мутации также снижали термоустойчивость до уровней ниже технически требуемых. Варианты других двух термоустойчивых остовов (8Е9 ГО Ν0:2-6Χ и 8ЕО ГО Ν0:2-9Χ) имели только минимальное повышение разрушения в 8СР. Также обнаружено, что добавление большего количества 8СР-мутаций к остову 8ЕО ГО Ν0:2-Ν159ν снижало термоустойчивость ниже технически требуемой термоустойчивости.
Второй раунд 8Г)М с добавлением дополнительных 8СР-мутаций к двум другим термоустойчивым вариантам осуществляли, включая до двух 8СР-мутаций (Τ291ν и/или Ь192Р) в 8Е9 ГО Ν0:2-6Χ и 8ЕО ГО Ν0:2-9Χ, как вместе, так и без мутации А236Т (смотри табл. 8 ниже).
- 109 021178
Таблица 8. Варианты раунда ΙΙ 8Г)М
Раунд II 3ΌΜ
Вариант Исходный (остов) ΗΪΘ- метка Хозяин - наилучшие 10 Дополнительные мутации
σ ЗЕО Ю ΝΟ:2-6Χ X X Ы92Р
к ЗЕф Ю ΝΟ:2-6Χ X X Τ29ΐν
ъ ЗЕО Ю ΝΟ:2-6Χ X X Τ29ΐν + Ы92Р
м ЗЕО Ю ΝΟ:2-9Χ X X Ы92Р
N ЗЕО Ю ΝΟ:2-9Χ X X Τ29ΐν
о ЗЕО Ю ΝΟ:2-9Χ X X Т291У + Ы92Р
Р ЗЕО Ю ΝΟ:2-6Χ + (А236Т) X X Ы92Р
0 ЗЕО Ю ΝΟ:2-6Χ + (А236Т) X X Τ29ΐν
к ЗЕО Ю ΝΟ:2-6Χ + (А236Т) X X Τ29ΐν + Ы92Р
3 ЗЕО Ю ΝΟ;2-9Χ + (А236Т) X X Ы92Р
т ЗЕО Ю ΝΟ:2-9Χ + (А236Т) X X Τ29ΐν
и ЗЕО Ю ΝΟ:2-9Χ + (А236Т) X X Τ29ΐν + Ы92Р
В результате из такой 8Г)М получили вариант, вариант О, с немного более высокой термоустойчивостью, чем исходная фитаза (8Е^ ГО N0:2), и полным разрушением менее чем за 10 мин в 8ОР. Например, во временных точках Т-0 и Т-10 (мин) при использовании разных доз пепсина в 8ОР (0,3, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 и 0 мг/мл пепсина), 8О8-ПААГ-гели, высушенные с использованием устройства 81тр1у В1цс™ 8аГс81ат, показали, что вариант О полностью разрушался в течение 10 мин при концентрации пепсина 0,3 и 0,2 мг/мл. После двадцатиминутного периода в 8ОР (при 0,3 мг/мл пепсина) снова осуществляли разгонку в 8О8-ПААГ-гелях, при этом показано, что 81X) ГО N0:2-1 ΙΙ8 не разрушается после 20 мин, тогда как вариант О полностью разрушается примерно за 7,5 мин.
8ОР-стабильность варианта О и 81X) ГО N0:2-1 ΙΙ8 определяли при разных дозах пепсина: 0,3, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 и 0,0 мг/мл пепсина (фиг. 18) . На фиг. 18 доза пепсина 0,3 мг/мл для 8Е^ ГО Ы0:2-И8 графически показана в виде отметки контрольного уровня. Эксперименты исследования зависимости доза-ответ показали, что пепсин требуется для полного разрушения и что разрушение не является функцией только обработки кислотой (фиг. 18).
Время полужизни варианта О и 81X) ГО Ы0:2-И8 определяли при 75°С (фиг. 19). Очищенную исходную фитазу (8Е^ ГО Ы0:2-И8) и вариант фитазы О в двух разных буферах (100 мМ цитрат, рН 5,5, и 100 мМ трис, рН 7,2) подвергали тепловой обработке при 75°С вплоть до 45 мин (Т - 0, 5, 10, 15, 20, 30, 45 мин). Десять микролитров подвергнутых тепловой обработке образцов анализировали в отношении активности в 100 мкл раствора, содержащего 100 мкМ ОхРМИР, 50 мМ цитрата рН 5,5. Активность сравнивали с активность в Т-0. Вариант О удовлетворял требованиям 8ОР и термоустойчивости, однако, удельная активность была ниже, чем необходимо (фиг. 19). Утрата удельной активности была ожидаемой, так как полученные ранее в исследованиях эволюции данные (пример 1) показали, что остов 81X) ГО Ы0:2-6Х имел только 2/3 удельной активности исходной фитазы (8Е^ ГО N0:2).
Чтобы максимизировать методику ТМСА и преодолеть недостатки варианта О, осуществляли смешивание термоустойчивых мутаций, которые поддерживают удельную активность, с 8ОР-мутациями, используя исходную фитазу (8Е^ ГО Ы0:2-И8) в качестве матрицы.
ТМСА8М-эволюция
Высокопроизводительный анализ модифицировали, чтобы включать стадию тепловой обработки для отбора вариантов, которые обладали требуемой термоустойчивостью, а также требуемыми свойствами в 8ОР. Создавали две библиотеки, используя методику специализированной многосайтовой комбинаторной сборки (ТМСА) (см. публикацию РСТ № \0 09/018449). ТМСА-эволюция включает способ получения множества дочерних полинуклеотидов, имеющих разные сочетания различных мутаций в многочисленных сайтах. Способ может быть осуществлен, отчасти, благодаря сочетанию по меньшей мере одной или нескольких из следующих стадий.
- 110 021178
Получение информации о последовательности (первого или матричного) полинуклеотида
Например, первой или матричной последовательностью может быть последовательность дикого типа (например, ЗЕЦ ГО NΟ:2-N159V) или мутантная последовательность (например, матрица И164Р, описанная ниже). Информация о последовательности может быть получена для полного полинуклеотида (например, гена или открытой рамки считывания) или для частичных представляющих интерес областей, таких как последовательность, кодирующая сайт для связывания, специфичности связывания, катализа или субстратной специфичности.
Идентификация трех или более представляющих интерес мутаций в первой или матричной полинуклеотидной последовательности
Например, мутации могут быть в 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20 или большем количестве положений в первой или матричной последовательности. Положения могут быть предварительно определены на основании абсолютного положения или в контексте окружающих остатков или гомологии. Для ТМСА фитазных полипептидов наилучшие в отношении ЗСР и термоустойчивости аминокислотные изменения, которые приводили к повышенно эффективности фермента, включали в качестве представляющих интерес мутаций. Последовательности, фланкирующие положения мутаций с любой стороны, могут быть известны. Каждое положение для мутации может содержать две или больше мутаций, таких как разные аминокислоты. Такие мутации могут быть идентифицированы с использованием методики насыщающего мутагенеза генных сайтовЗМ (СЗЗМзм), как описано в настоящей публикации и в патентах США № 6171820,6562594 и 6764835.
Получение праймеров (например, синтетических олигонуклеотидов), содержащих представляющие интерес мутации
В одном из вариантов получают праймер для каждой представляющей интерес мутации. Таким образом для первого или матричного полинуклеотида, имеющего 3 представляющих интерес мутации, можно использовать 3 праймера в данном положении. Праймер также может быть получен в виде пула праймеров, содержащих вырожденное положение, так что представляющая интерес мутация представлена диапазоном любых нуклеотидов или встречающихся в природе аминокислот или подгруппы в таком диапазоне. Например, может быть получен пул праймеров, которые способствуют мутациям для алифатических аминокислотных остатков.
Праймеры могут быть получены в виде прямых или обратных праймеров, или праймеры могут быть получены в виде по меньшей мере одного прямого праймера и по меньшей мере одного обратного праймера. Когда мутации расположены близко друг к другу, может быть удобным использование праймеров, которые содержат мутации для более чем одного положения или разные сочетания мутации в нескольких положениях.
Получение полинуклеотида, содержащего матричную последовательность
Первый или матричный полинуклеотид может быть кольцевым или может быть суперспирализованным, таким как плазмида или вектор для клонирования, секвенирования или экспрессии. Полинуклеотид может быть однонитевым (онДНК) или может быть двунитевым (днДНК). Например, в способе ТСМА подвергают суперспирализованную (сс) днДНК-матрицу стадии нагревания при 95°С в течение 1 мин (смотри Ьеуу, №с1ею Лаб Рее., 28(12): е57 (ί-νίί) (2000)).
Добавление праймеров к матричному полинуклеотиду в реакционной смеси
Праймеры и матричный полинуклеотид объединяют в условиях, которые позволяют праймерам отжигаться с матричным полинуклеотидом. В одном из вариантов протокола ТМСА праймеры добавляют к полинуклеотиду в одну реакционную смесь, но праймеры могут быть добавлены в нескольких реакциях.
Осуществление реакций полимеразного удлинения
Продукты удлинения (например, в виде дочернего или модифицированного удлиненного полинуклеотида) могут быть амплифицированы обычными способами. Продукты могут быть проанализированы по длине, последовательности, требуемым свойствам нуклеиновой кислоты или экспрессированы в виде полипептидов. Другие способы анализа включают гибридизацию ш-вби, скрининг последовательностей или скрининг экспрессии. Анализ может включать один или несколько раундов скрининга и отбора в отношении требуемого свойства.
Продуктами также может быть трансформированая клетка или другая система экспрессии, такая как бесклеточная система. Бесклеточная система может содержать ферменты, связанные с репликацией, репарацией, рекомбинацией, транскрипцией ДНК, или ферменты для трансляции. Примеры хозяев включают клетки и линии клеток бактерий, дрожжей, растений и животных, и включают Е. сой, Рвеиботопав Пиогевсепв, Рю1йа равЮпв и АврегдШив тдег. Например, в качестве хозяев можно использовать штаммы ХЬ1-В1ие или З(Ь12 Е. сой.
Способ по изобретению можно использовать с одинаковыми или разными праймерами в разных условиях реакции, чтобы способствовать получению продуктов, имеющих разные сочетания или количества мутаций.
При осуществлении примера способа, описанного выше, данный протокол также относится к одному или нескольким полинуклеотидам, полученным таким способом ТМСА-эволюции, которые затем могут быть подвергнуты скринингу или селекции в отношении требуемого свойства. Один или несколь- 111 021178 ко дочерних полинуклеотидов могут быть экспрессированы в виде полипептидов и, необязательно, подвергнуты скринингу или селекции в отношении требуемого свойства. Таким образом, данный вариант протокола ТМСА-эволюции относится к полинуклеотидам и кодируемым полипептидам, а также библиотекам таких полинуклеотидов, кодирующих такие полипептиды. Кроме того, данный вариант протокола ТМСА-эволюции относится к скринингу библиотек посредством скрининга или селекции библиотеки с целью получения одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих один или несколько полипептидов, обладающих требуемой активностью.
Другой вариант протокола ТМСА-эволюции, описанного в публикации РСТ № А0 2009/018449, включает способ получения множества модифицированных полинуклеотидов. Такие способы обычно включают (а) добавление по меньшей мере трех праймеров к двунитевому матричному полинуклеотиду в одну реакционную смесь, при этом по меньшей мере три праймера не являются перекрывающимися, и при этом каждый по меньшей мере из трех праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличную от мутаций других праймеров, при этом по меньшей мере один праймер является прямым праймером, который может отжигаться с минус-нитью матрицы, и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, который может отжигаться с плюс-нитью матрицы, и (Ь) подвергание реакционной смеси реакции полимеразного удлинения с получением множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере с трех праймеров.
Другой вариант протокола ТМСА-эволюции, описанного в публикации РСТ № А0 2009/018449, включает способ, в котором клетку трансформируют множеством продуктов удлинения, которые не были обработаны лигазой. В другом варианте по изобретению множество удлиненных модифицированных полинуклеотидов извлекают из клетки. В другом варианте извлеченное множество удлиненных модифицированных полинуклеотидов анализируют, например, посредством экспрессии по меньшей мере одного из множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов и анализа экспрессированного с него полипептида. В другом варианте множество удлиненных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации, подвергают селекции.
В другом варианте протокола ТМСА-эволюции получают информацию о последовательности, имеющую отношение к матричному полинуклеотиду, и могут быть идентифицированы три или более представляющих интерес мутации вдоль матричного полинуклеотида. В другом варианте продукты, полученные в результате удлинения полимеразой, могут быть проанализированы перед трансформацией клетки множеством удлиненных модифицированных продуктов.
В одном из вариантов протокола ТМСА-эволюции продукты, полученные в результате удлинения полимеразой, обрабатывают ферментом, например ферментом рестрикции, таким как фермент рестрикции Прп1, таким образом разрушая матричную полинуклеотидную последовательность. Обработанными продуктами можно трансформировать клетку, например клетку Е. сой.
В одном варианте протокола ТМСА-эволюции можно использовать по меньшей мере два, или по меньшей мере три, или по меньшей мере четыре, или по меньшей мере пять, или по меньшей мере шесть, или по меньшей мере семь, или по меньшей мере восемь, или по меньшей мере девять, или по меньшей мере десять, или по меньшей мере одиннадцать, или по меньшей мере двенадцать, или большее количество праймеров. В одном варианте каждый праймер содержит одну точечную мутацию. В другом варианте два прямых или два обратных праймера содержат разное изменение в одном и том же положении матричного полинуклеотида. В другом варианте по меньшей мере один праймер содержит по меньшей мере два изменения в разных положениях матричного полинуклеотида. В еще одном варианте по меньшей мере один праймер, содержит по меньшей мере два изменения в разных положениях и по меньшей мере два прямых или два обратных праймера содержат разные изменения в одном и том же положении матричного полинуклеотида.
В одном варианте протокола ТМСА-эволюции прямые праймеры сгруппированы в группу прямых праймеров и обратные праймеры сгруппированы в группу обратных праймеров, и праймеры в группе прямых праймеров и праймеры в группе обратных праймеров независимо друг от друга нормализуют, чтобы они были в равной концентрации в соответствующей группе, независимо от положений в матричном полинуклеотиде, и при этом после нормализации равное количество прямых и обратных праймеров добавляют к реакционной смеси. В данном способе нормализации сочетание некоторых положений может быть смещено. Смещение может быть, например, вследствие относительно низкой концентрации праймера в одном положении, которому соответствует один праймер, по сравнению с положением, которому соответствуют несколько праймеров. Связанное с положением смещение относится к полученным в результате полинуклеотидам, в которых наблюдается значимое предпочтение для включения праймеров в одном положении по сравнению с другими положениями в группе прямых и обратных праймеров. Это приводит к сочетанию модифицированных полинуклеотидов, которые имеют высокий процент мутаций в одном положении праймера, но низкий процент мутаций в других положениях в группе прямых или обратных праймеров. Такое смещение неудобно, когда целью ТМСА является создание дочерних полинуклеотидов, содержащих все возможные сочетания изменений матрицы. Смещение может быть скорректировано, например, нормализацией праймеров, так как пулы в каждых положениях должны быть равными.
- 112 021178
В одном из вариантов протокола ТМСА-эволюции осуществляют нормализацию праймеров посредством организации праймеров в множество групп, в зависимости от их положения в матричном полинуклеотиде, при этом праймеры, охватывающие одну и ту же выбранную область на матрице, находятся в одной группе; нормализацию сгруппированных праймеров в каждой группе до одинаковой концентрации; объединение прямых праймеров в одну группу, группу прямых праймеров, и нормализацию концентрации в каждой группе прямых праймеров для уравнивания; объединения обратных праймеров в одну группу, группу обратных праймеров, и нормализацию концентрации в каждой группе обратных праймеров для уравнивания; и добавление равного количества объединенных прямых и обратных праймеров в реакционную смесь. Не наблюдали смещения для сочетаний положений.
В одном из вариантов протокола ТМСА-эволюции предлагается набор вырожденных праймеров, каждый из которых содержит вырожденное положение, при этом представляющая интерес мутация представлена диапазоном разных нуклеотидов в вырожденном положении. В другом варианте предлагается набор вырожденных праймеров, содержащих по меньшей мере один вырожденный кодон, соответствующий по меньшей мере одному кодону матричного полинуклеотида и по меньшей мере одну близлежащую последовательность, которая гомологична последовательности, лежащей рядом с кодоном матричной полинуклеотидной последовательности. В другом варианте вырожденным кодоном является кодон Ν,Ν,Ν, и он кодирует любую из 20 природных аминокислот. В другом варианте вырожденный кодон кодирует менее чем 20 природных аминокислот.
Другой вариант протокола ТМСА-эволюции, описанный в публикации РСТ № УО 2009/018449, включает способ получения множества модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации. Такие способы обычно включают (а) добавление по меньшей мере двух праймеров к двунитевому матричному полинуклеотиду в одной реакционной смеси, при этом по меньшей мере два праймера не перекрываются, и при этом каждый по меньшей мере из двух праймеров содержит по меньшей мере одну мутацию, отличную от другого праймера(ов), при этом по меньшей мере один праймер является прямым праймером, который может отжигаться с минус-нитью матрицы и по меньшей мере один праймер является обратным праймером, который может отжигаться с плюс-нитью матрицы, (Ъ) подвергание реакционной смеси реакции полимеразного удлинения с получением множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов по меньшей мере с двух праймеров, (с) обработку множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов ферментом, тем самым разрушая матричный полинуклеотид, (й) трансформацию клетки обработанными удлиненными модифицированными полинуклеотидами, которые не были обработаны лигазой, (е) извлечение множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов из клетки, и (Г) селекцию множества удлиненных модифицированных полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес мутации.
Используя методику ТМСА, создавали небольшую библиотеку, библиотеку А, для быстрой оборачиваемости и упрощения способа (96 разных вариантов, содержащих до пяти 8ΟР-мутаций и две мутации термоустойчивости, смотри табл. 9). В библиотеке А использовали одну матрицу, 8ЕО ГО NО:2Ш59У, и олигонуклеотиды, указанную в таблице 10, ниже. Вторую более обширную библиотеку, библиотеку В, также создавали, используя методику ТМСА, чтобы увеличить вероятность создания очень термоустойчивого варианта с требуемыми 8ΟР-свойствами (4096 разных вариантов, содержащих до семи 8ΟР-мутаций и пяти мутаций термоустойчивости, смотри табл. 9). В библиотеке В использовали две матрицы, 8ЕО ГО NО:2-N159У и матрицу Ό164Κ, в двух отдельных реакциях ТМСА, в каждой из которых использовали олигонуклеотиды, указанные в таблице 11, создавая две подбиблиотеки. Матрица Ό164Κ была создана в библиотеке А и состояла из остова 8ЕО ГО NО:2-N159У с включенной мутацией Ό164Κ. Обе библиотеки амплифицировали в векторе рОЕ60 вектор (01адеп, Уакпаа, СА) и затем трансформировали хозяина РНУ635 (описан ниже) для подтверждения первичной и вторичной фитазной активности.
Всего при скрининге библиотек обнаружено восемь многообещающих наилучших термоустойчивых 8ΟР-лабильных варианта. Пять термоустойчивых (Тт примерно на 5°С выше чем у исходной фитазы, 8ЕО ГО NО:2, табл. 13) 8ΟР-лабильных варианта обнаружены в небольшой библиотеке (варианты АА-ЕЕ, табл. 12). Более крупная ТМСА-библиотека дала десять кандидатов, однако только три имели более высокую термоустойчивость, чем варианты АА-ЕЕ (варианты РР-НН, табл. 13, имели Тт примерно на 7,5°С выше, чем исходная фитаза, 8ЕО ГО NО:2). Для характеристики такие варианты наряду с наилучшей 8ΟР-мутацией в одном сайте (вариант 56), все в виде гликозилированных вариантов и вариантов без гликозилирования, экспрессировали в РкЫа рак!опк (варианты без гликозилирования включали две мутации, Т163К и Ν339Ξ, выявленные при поиске в отношении удаления Ν-гликозилирования, смотри выше).
Определяли остаточную активность 8ΟР-лабильных вариантов фитазы в ходе обработки 8ΟΡ (фигура 20). Очищенную исходную фитазу (8ЕО ГО NО:2), вариант 56 и варианты АА-НН обрабатывали 8ΟΡ (рН 1,2) с пепсином (10 единиц/мкг фитазы) в течение 10,0-минутного периода. Стабильность фитазы определяли по активности в отношении ИхРМИР. Удельную активность 8ΟР-лабильных вариантов фитазы сравнивали с фитазой 8ЕО ГО NО:2 (фиг. 21). Очищенную исходную фитазу (8ЕО ГО NО:2) и лучшие варианты фитазы тестировали в отношении активности на фитате. Очищенный белок анализиро- 113 021178 вали в 4 мМ фитате, 100 мМ На-ацетате, рН 4,5, при 37°С. Не было какого-либо значимого изменения 8ОР-свойств и термоустойчивости среди гликозилированных и негликозилированных экспрессированных в Р1сЫа лидирующих вариантов (фиг. 20 и 21). В предыдущих исследованиях предполагали, что гликозилированные варианты могут иметь более высокую термоустойчивость и быть более устойчивыми к 8ОР; полученные авторами изобретения данные свидетельствует об обратном.
Также получали рН-профиль гликозилированных, не имеющих гликозилирования вариантов и исходной фитазы (8ЕР ГО N0:2) для фитазной активности на фитате при рН 2, 2,5, 3, 4, 5 и 6 при 37°С. Все анализируемые фитазы имели очень сходные профили рН (данные не показаны).
Таблица 9. Мутации, отобранные для ТМСА-эволюции
Библиотека А Библиотека В
ЗОР- мутации Мутации термоустойчивости 8<ЗР- мутации Мутации термоустойчивости
0247Н 0275ν 0247Н С179Е
Ι427Τ Ό164Ε Ι427Τ ζ}275ν
Ы57Р Ы57Р Τ349Υ
0275Н 0275Н С226Ц
Т48М Т48М Ό164Ε
0246Ν
0377Е
Υ79Η
Мутации термоустойчивости и 8ОР-мутации смешивали, применяя ТМСА-методику с использованием 8РС) ГО Н0:2-Н159У в качестве остова.
Таблица 10. Олигонуклеотиды, используемые в библиотеке А
Название последовательность олигонуклеотида -
олигонуклеотида 5' - 3'
Т48М_Р ТаСОТССТССААССААССССАТССААСТдАТССАССА
ТСТСАС ЗЕО Ιϋ N0:3
Ь157Р_Р ТАААААСТССССТТТСССААССОСАТСТСОССААССТ
бАСТОАСесеАТССТССАСАеСССАСОА ЗЕО Ш N0:4
Ш64Е_Р ТАААААСТОСССТТТОССААСТСОАТетеаССААССТ ОАСТССТСССАТССТСОАСАССССАССА ЗЕО Ю N0:5
Ы57Р-Ц164_Е ТАААААСТСеССТТТаССААССССАТСТСОСеААССТ САСТСОТОССАТССТСОАОАОСОСАОСА ЗЕО Ю N0:6
0247Н_Е САСАТАТТТСТССТССААСАТССАСАеССААТССССС АСгСС ЗЕО ΙΌ N0:7
0275Н_Е ТССТААСТТТССАТААСССССАТТТТСАТТТССТАСА АСОСАС ЗЕО Ιϋ N0:8
0275ν_Ε ТССТААСТТТССАТААСеСССТСТТТСАТТТССТАСА АСОСАС ЗЕО Ю N0:9
1427Т_Е ААТСОТСААТОААОСАСОСАСАССООСОТОСАОТТТС АОАТ ЗЕО Ю N0:10
- 114 021178
Таблица 11. Олигонуклеотиды, используемые в библиотеке В
Название олигонуклеотида последовательность олигонуклеотида - 5' - 3'
Т4 8М_Р ТСССТССТССААССААСОССАТССААСТСАТССАССА ТСТСАС ЗЕО Ю N0:11
Υ79Η_Ρ ОСОСТССТОАССТААТСОСССАТСТСССАСАТТАСТС ОССТСА 3Εζ) Ю N0:12
Ь157Р_Р ТАААААСТССССТТТСССААССССАТСТССССААССТ (ЗАСТСА 3Εζ) Ιϋ N0:13
С179Е_Р ССТСААТТССТСАСТТТАССССССАТТАТСАААСССС стттсс 3Εζ) Ιϋ N0:14
С226О_Р ААСТСААССТСАССССССАССАТСТСТСАТТААСССС тсссст 3Εζ) Ιϋ N0:15
024бЮ_Е ТОАСССАСАТАТТТСТССТОТСССААОСАСАОСОААТ ссссса 3Ε0 Ιϋ N0:16
0246Ν+0247Η_Ε ТСАСССАСАТАТТТСТССТСТСССАТОСАСАСССААТ сссссассс 3Ε0 Ιϋ N0:17
0247Н_Е СССАСАТАТТТСТССТССААСАТССАСАСССААТССС ССАССС 3Εζ) Ιϋ N0:18
φ275ν_Ε ТССТААСТТТССАТААСССССТСТТТСАТТТССТАСА АСССАС 5Εζ) ΙΌ N0:19
Τ349Υ_Ε ТТСССССТСАСССССАТААСТАТСССССАССТССТСА АСТССТ 3Ε0 Ιϋ N0:20
0377Ε_Ε ТТСАССТТТСССТССТСТТССССАСТТТАСАССАСАТ ссстса 3Εζ) Ιϋ N0:21
Ι427Τ_Ε ААТССТСААТСААССАСССАСАССССССТССАСТТТС АСЗАТ 3Εζ) Ιϋ N0:22
Таблица 12. Последовательность лидирующих ЗСТ-лабильных термоустойчивых вариантов фитазы
Тип мутации 5СР 5СР ЗСР термо устойчи- вость глимо зипиро термо устойчи- вость термо устойчи- вость термо устоти- вость ЗСР ЗСР термо устойм- вость ЗСР гпино эилиро вание термо устойчи- вость ЗСР ЗСР
Вариам Т48М Υ79Η И57Р Ν159Χ/ Τ163Κ β164Κ С179К С226О Ο24βνν О247Н О275У О275Н Ν339Ε Τ349Υ О377К 1427Τ
АА X X X X X X
ВВ X X X X X X
СС X X X X X X X X
ββ X X X X X X
ЕЕ X X X X X X
РР X X X X X X X X X
СС X X X X X X X X X X
НН X X X X X X X X X X
56 X X X
Вариант АА имеет последовательность ЗН) ГО N0:28 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:27), вариант ВВ имеет последовательность ЗН) ГО N0:32 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:31), вариант СС имеет последовательность ЗН) ГО N0:34 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:33), вариант ϋϋ имеет последовательность ЗН) ГО N0:36 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:35), вариант ЕЕ имеет последовательность 3Е^ ГО N0:38 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:37), вариант ЕЕ имеет последовательность ЗН) ГО N0:24 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:23), вариант СС имеет последовательность ЗН) ГО N0:26 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:25), вариант НН имеет последовательность ЗН) ГО N0:40 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:39), и вариант 56 имеет последовательность 3Е^ ГО N0:30 (кодируемую последовательностью ЗН) ГО N0:29). Однако обратите внимание, что последовательности ЗН) ГО N0:23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 39 не содержат нуклеиновых кислот, кодирующих нативную сигнальную последовательность, и что последовательности ЗН) ГО N0:24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40 не содержат аминокислот нативной сигнальной последовательности (аминокислоты 1-22 в ЗН) ГО N0:2). Стартовый метионин (АТС) добавляют к каждой из эталонных последовательностей. Положения точечных мутаций для таких вариантов (перечисленных, например, в табл. 12) рассчитывали так, как будто нативная сигнальная последовательность присутствует.
- 115 021178
Таблица 13. Температура плавления (Тт) последовательности 8ЕР ГО Ν0:2 и лидирующие 8ΟΡ -кандидаты
ЦЗС Тт Библиотека Гликозилированные (Тт в градусах по Цельсию) Удаление гликозилирования (Тт в градусах по Цельсию)
ЗЕО Ю N0:2 79,8 Ν/Α
Вариант АА (ЗЕО Ю N0:28) А 85,2 85,8
Вариант ВВ (ЗЕО Ю N0:32) А 84,2 85,8
Вариант СС (ЗЕО ΙΌ N0:34) А 85,6 85,2
Вариант ϋϋ (ЗЕО Ю N0:36) А 83,8 84,2
Вариант ЕЕ (ЗЕО Ю N0:38) А 85,4 84,6
Вариант РР (ЗЕО ΙΠ N0:24) В 87,5 87,6
Вариант СО (ЗЕО Ю N0:26) В 87,3 87,0
Вариант НН (ЗЕО ΙΠ N0:40) В 87,4 86,2
Вариант 56 (ЗЕО Ю N0:30) 81,0 81,3
Очищенную исходную фитазу (8НС) ГО Ν0:2) и девять лидирующих 8ΟР-кандидатов фитазы экспрессировали в Р1сЫа ра§!оп§, очищали, диализовали в 100 мМ цитрате, рН 5,5, и тестировали в отношении Тт, используя \-[)8СП АррНеб ТЬегтобупат1с§.
Отбор четырех наилучших вариантов для исследований на животных
В 8П8-ПААГ-анализе 8ΟΡ в девяти временных точках (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 и 10 мин) с использованием пепсина в дозе 10 единиц на мкг фитазы отбирали четыре варианта на основе полученных таким образом данных (не показаны) для крупномасштабной ферментации, чтобы использовать в испытаниях на животных. В случае четырех отобранных лидирующих вариантов наблюдали полное разрушение белка в течение пяти минут.
Отобранные лидирующие варианты.
Вариант 56: (8ЕР ГО Ν0:30, кодируемая последовательностью 8НС) ГО Ν0:29) является вариантом, наиболее близким к исходной молекуле фитазы (8ЕР ГО Ν0:2), имеющим одну 8ΟР-мутацию и две мутации удаления гликозилирования.
Вариант АА: (8ЕР ГО Ν0:28, кодируемая последовательностью 8ЕР ГО Ν0:27) имеет две 8ΟΡмутации, две мутации термоустойчивости и две мутации удаления гликозилирования.
Вариант РР: (8ЕР ГО Ν0:24, кодируемая последовательностью 8ЕР ГО Ν0:23) имеет три 8ΟΡмутации, четыре мутации термоустойчивости и две мутации удаления гликозилирования.
Вариант ΟΟ: (8ЕР ГО Ν0:26, кодируемая последовательностью 8ЕР ГО Ν0:25) имеет три 8ΟΡмутации, пять мутаций термоустойчивости, две мутации удаления гликозилирования.
Ферментация лидирующих кандидатов
Лидирующие варианты (вариант 56, вариант АА, вариант РР и вариант ΟΟ) отбирали для испытаний на животных и масштаб увеличивали до ферментации в объеме 30 л, чтобы получить по меньшей мере 5 г каждого белка. На основании определения активности и анализа белка по Бредфорду получали >16 г белка для каждого варианта. Извлеченные образцы подвергали лиофилизации, затем ресуспендировали и обрабатывали нагреванием, чтобы убить возможный рост микроорганизмов, и затем снова подвергали лиофилизации. Такие образцы (табл. 14) использовали для испытаний на животных. Наряду с четырьмя выбранными вариантами небольшой образец (15-50 мг) других 8ΟΙ'-лабильных вариантов (таблица 12) использовали для оценки в лабораторном масштабе.
- 116 021178
Таблица 14. Характеристика образцов, используемых для испытаний на животных и для оценки в лабораторном масштабе
Вариант Твердое вещество (г) Белок (г) Активность в единицах
56 (ЗЕО Ιϋ N0:30) 106,2 8,34 1,37Х107
ΑΑ (ЗЕО Ю N0:28) 98,9 10,9 1,72Х107
ЕР (ЗЕО Ιϋ N0:24) 132,0 14,2 2,16Х107
СО (ЗЕО Ιϋ N0:26) 109,6 17,4 3,09Х107
Вариант Белок (мг)
ВВ (ЗЕО ΙΌ N0:32) 30
ϋϋ (ЗЕО Ю N0:36) 50
СС (ЗЕО Ιϋ N0:34) 20
ЕЕ (ЗЕО Ιϋ N0:38) 40
НН (ЗЕО ΙΌ N0:40) 15
ЗЕО Ιϋ N0:2 30
Лиофилизированный количественно оценивали как по активности, так и в анализе белка по Бредфорду.
Способы
Рост, индукция и очистка.
Экспрессия фитазы в Е. сой (масштаб 2 л).
Все варианты фитазы, за исключением вариантов в исследованиях гликозилирования, экспрессировали в Е. сой; штамм РНУ635 (рЬу-штамм; созданный посредством превращения штамма Е. сой Си1867 (АТСС 47092; дефицитный по аррА) в Кес А - в результате трансдукции фагом Р1). Исходные культуры для вариантов фитазы выращивали в 5 мл ЬВсагЬ100 при 37°С в течение ~18 ч. В 2 л среды ЬВсагЬ100 инокулировали исходные ночные культуры, культуру индуцировали 1 мМ 1РТС, когда культура достигала ~ОЭ600 0,5. После 24-часовой индукции культуры собирали осаждением культуры центрифугированием (центрифуга 8огга11 КС 5С Р1ик; ротор 8ЬС-4000, 7000 об/мин; 9220 КСР) в течение 20 мин. Клетки ресуспендировали в 50 мМ трис, рН 8,0, и лизировали, используя микрофлюидизатор (МикройшФск, модель 11ОЬ). Чтобы удалить клеточные обломки, лизат целых клеток центрифугировали (8ог\'а11 КС 5С Р1ик; ротор Р138-14Х50, 12500 об/мин; 25642 КСР) в течение 30 мин. Прозрачный лизат стерильно фильтровали и фитазный белок очищали на колонке НшТгар РР объемом 5 мл, используя систему ББЖХ АКТА. Фитазу элюировали, создавая градиент с использованием 2 М имидазола, 50 мМ трис, рН 8,0. Фракции тестировали в отношении активности в 100 мкМ Э1рМиР, 100 мМ Nа-ацетате (рН 5,5), и в отношении чистоты белка с использованием анализа в 8Э8-геле.
Экспрессия фитазы в РюЫа рак!опк (масштаб 1 л).
Для характеристики конечных лидирующих вариантов фитазы (варианты с гликозилированием и без гликозилирования на основе вариантов АА-НН и варианта 56) наряду с вариантом последовательности без гликозилированным 8НР ГО NО:2 (варианты СЙУ1-СЙУ4) экспрессировали в РюЫа рак!опк (Х33). Исходные культуры с вариантами фитазы выращивали в 10 мл ВМСУ7ео100 при 30°С в течение ~18 ч (~ОЭ600 15-20), клетки осаждали и ресуспендировали в 10 мл среды МЕ8* с 0,5% МеОН. В 1 л среды МЕ8* с 0,5% МеОН инокулировали исходную культуру и инкубировали в течение трех-четырех дней при 30°С (5 мл МеОН добавляли каждые 24 ч для индукции белка). Секретированный белок отделяли от клеточной массы центрифугированием (центрифуга 8ο^νа11 КС 5С Р1ик; ротор 8ЬС-4000, 7000 об/мин; 9220 КСР), концентрировали и заменяли буфер (100 мМ ^-ацетат, рН 5,5), используя модуль для сепарации с тангенциальным потоком МлшКгок (8рес1гитЬаЬк М215-600-01Р). Чтобы улучшить очистку, образец пропускали через колонку НПгар™ О РР объемом 5 мл, используя систему ББЖХ АКТА. Фитазу элюировали, создавая градиент с использованием 1 М NаС1, 100 мМ Nа-ацетата, рН 5,5. Фракции тестировали в отношении активности в 100 мкМ Э1РМиР, 100 мМ Nа-ацетате (рН 5,5) и в отношении чистоты белка, используя анализ в 8Э8-геле.
Характеристика фитазы
Термоустойчивость белка.
Дифференциальная сканирующая калориметрия (Э8С).
Температуру плавления белка (Тт) экспрессированных в РюЫа вариантов фитазы определяли, ис- 117 021178 пользуя Ν-Όδί'.’ ΙΙ Аррйей ТНегтойупат1с8. Образцы белка (~1,0 мг/мл) диализовали в 100 мМ цитрате, рН 5,5, загружали в камеру для тестирования (600 мкл) и сравнивали с контрольным образцом (600 мкл 100 мМ цитрата, рН 5,5) и сканировали от 60 до 100°С и назад до 60°С (чтобы оценить рефолдинг белка).
Модифицированное определение Тт.
Разработано быстрое средство для определения термоустойчивости, чтобы оценить лизат целых клеток и неочищенные образцы белка во время предварительной характеристики, чтобы сравнить термоустойчивость 8ОР-лабильных фитаз с исходной фитазой (8ЕЦ ГО NО:2). Образец белка распределяли в ряд на 96-луночном планшете для ПЦР (20 мкл на лунку) и подвергали тепловой обработке с использованием градиента температуры (60-80°С) на устройстве для ПЦР в течение 30 мин. Подвергнутые тепловой обработке образцы белка (10 мкл) смешивали с флуоресцирующим субстратом (190 мкл 100 мкМ П1РМиР, 50 мМ №-1-ацетат, рН 5,5), измеряя изменение флуоресценции (возбуждение 360 нм/испускание 465 нм) в течение пятиминутного периода времени. Температуру, при которой сохранялось 50% активности, сравнивали с эффективностью исходной фитазы (8ЕЦ ГО NО:2) (температурой 50% активности).
Анализ 8СГ (модифицированный - в уменьшенном масштабе)
Проводили множество миниреакций, которые гасили в разных временных точках, чтобы определить 8ОР-лабильность молекулы фитазы. В качестве контроля эталон Т-0, предварительно погашенную реакционную смесь 8ОР, также подобным образом анализировали в реальном эксперименте. Десять микролитров образца белка инкубировали в 50 мкл 8ОР, рН 1,2, (2 мг/мл №С1, 7 мкл/мл концентрированной НС1) с пепсином (в дозах 0,15, 0,30 и 0,75 мг/мл) в течение определенного периода времени при 37°С. Реакцию гасили добавлением 10 мкл раствора с рН 10,0, 200 мМ ^-карбонатного буфера (в случае эталона Т-0 указанную стадию осуществляли перед добавлением образца белка).
Анализ 8ОР в 808-геле. Извлекали 20 мкл погашенной реакционной смеси 8ОР и смешивали с 210 мкл буфера для образца с 8Ό8, кипятили в течение 10 мин и наносили по 15 мкл на 808-ПААГ-гель с трис-О1у. Прикладывали 180 В, 250 мА в рабочем буфере для образца с 8Ό8 в течение ~1 ч или вплоть до завершения.
Анализ активности в 8ОР. Извлекали 10 мкл погашенной реакционной смеси 8ОР и смешивали с субстратом (190 мкл 100 мкМ О|РМиР, 50 мМ Ш-ацетате, рН 5,5), измеряя изменение флуоресценции (возбуждение 360 нм/испускание 465 нм) в течение пятиминутного периода времени.
Анализ 8ОР (адаптирован на основании описания из Фармакопеи Соединенных Штатов Америки 24, 2000. 81ти1а1ей да8йтс Яшй, Т8, Т1е №Лопа1 Рогши1агу 19; Воагй оГ Тги8!ее8, Ей8.; Ипкей 8!а!е8 Р1агшасоре1а1 Сопуепйоп, Ыс., КоскуШе, МО, р. 2235).
Инкубируют 50 мкл раствора 5 мг/мл фитазы в 950 мкл предварительно нагретого до 37°С 8ОР (2 мг/мл №С1, титрованный до рН 1,2 с использованием НС1) с 10 единицами пепсина/мкг тестируемого белка (760 мкг/мл 8ОР) в течение 10-минутного периода времени при 37°С. Временные точки получали, извлекая по 50 мкл реакционной смеси и смешивая с 50 мкл раствора для остановки реакции (200 мМ №-карбонат, рН 10,0). Образцы, взятые в разных временных точках (образцы с остановленной реакцией), выдерживали на льду вплоть до завершения исследования, и они были готовы для анализа (в соответствии с протоколами анализа 8ОР в 808-геле и анализа активности в 8ОР, описанных в разделе Анализ 8ОР (модифицированный - в уменьшенном масштабе).
Анализ удельной активности фитазы
Относительную активность образцов фитазы (50 мкл) анализировали в 950 мкл предварительно нагретого до 37°С раствора, содержащего 4,0 мМ фитат, 100 мМ уксусную кислоту, который титровали до рН 4,5, используя №(ОН. Реакцию гасили, извлекая по 50 мкл реакционной смеси и смешивая с 50 мкл раствора для окрашивания/остановки (20 мМ молибдат аммония/5 мМ ванадат аммония/10% раствор азотной кислоты). После 10-минутного периода развития окраски образцы из разных временных точек измеряли при 415 нм и результаты откладывали на графике против времени. Скорость реакции сравнивали со стандартом фосфата, чтобы определить относительную скорость.
Удельную активность определяли в относительных оценках на основе концентрации белка. Концентрацию белка определяли в анализе при 260 нм/280 нм (1А ОО280 коррелирует с 0,93 мг/мл). Второе сравнение осуществляли, загружая равные активности фитазы на 8О8-гель и количественно оценивая интенсивности полос белка с использованием денситометрического анализа гелей Ое1Рго, чтобы сравнить активность лидирующих вариантов фитазы и исходной фитазы (8ЕЦ ГО NО:2).
Анализы рН-профилей фитазы
Также как и описанный выше протокол определения удельной активности, за исключением того, что субстрат модифицировали, используя более широкую буферную емкость (рН 2-6). Субстрат: 4 мМ фитат, 80 мМ яблочная кислота, 80 мМ муравьиная кислота и 80 мМ №-ацетат, титрованный до получения разных значений рН (2, 2,5, 3, 4, 5 и 6 единиц рН). Относительные оценки для каждого варианта сравнивали с оптимум активности, который имел место при рН 4.
Материалы:
Анализ 8ОР:
пепсин из слизистой оболочки желудка свиньи (81дша Р-6887),
НС1 (Р181ег υΝ1789),
- 118 021178 хлорид натрия (РщЬег З-271-1),
6,8-дифтор-4-метилумбеллиферилфосфат (ΌίΡΜυΡ) (Iην^ΐ^οдеη-^22068),
4-20% ЗИЗ-ПААГ-гели с трис-глицином (Iην^ί^οдеη ЕС60255ВОХ),
ЗЭЗ-буфер для образцов с трис-глицином Nονеx (Iην^ΐ^οдеηNονеx БС2676), рабочий ЗЭЗ-буфер Nονеx (Iην^ί^οдеη БС2675), окраска З1тр1у В1ие™ ЗаΓеЗΐа^η (Iην^ί^οдеη БС6065).
Анализ удельной активности фитазы: фитат додеканатрия из риса (З1дта Р-3168), метаванадат аммония (Асгок 0гдашск 194910500), молибдат аммония (З1дта А-7302), фосфат калия, двухосновный (РЦЬег Р288-500),
70% азотная кислота (З1дта 380091),
25% раствор аммония (АНак СЬетюа1 АА-3060).
Очистка белка:
колонка с Νί-сахарозой ШкИар™ РР объемом 5 мл (ОЕ НеаЙЬсаге 17-5255-01), анионообменная колонка НПгар™ О РР объемом 5 мл (ОЕ НеаИЬсаге 17-5156-01),
Имидазол (З1дта 1-0125).
Описаны некоторые варианты, предлагаемые в изобретении. Тем не менее будет понятно, что могут быть осуществлены различные модификации, не отходя от сути и не выходя за рамки объема, предлагаемого в настоящем описании. Соответственно, другие варианты осуществления изобретения входят в объем следующей формулы изобретения.

Claims (5)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:
    (a) (ί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, обладающий фитазной активностью, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентична последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ν0:1, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию Ц247Н, или указанную в табл. 4-7, 9, или любое их сочетание;
    (ίί) полинуклеотид, кодирующий полипептид, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентичен последовательности ЗЕЦ ГО Ν0:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию Ц247Н, или указанную в табл. 4-7, 9, или любое их сочетание;
    (b) нуклеиновую кислоту по (а), в котором по меньшей мере одной мутацией является мутация А109V, А232Р, А236Н, А236Т, А248Б, А248Т, А274Р, А2741, А274Б, А274Т, А274^ А429Р, Ο155Υ, Ό139Υ, Е113Р, Ρ147Υ, Р194Б, О17Ш, О171З, О257А, О257Р, О353С, О395Е, О3951, О395Б, О395Ц, О395Х О67А, Н263Р, Н272У, Ι107Η, Ι107Ρ, 1108А, 1108Ц, Ι108Ρ, 1108З, Ι108Υ, 1174Р, Ι174Ρ, 1427О, 1427З, Ι427Τ, К151Н, К151Р, Б126Р, Б146Р, Ε146Τ, Ε150Τ, Ε150Υ, Б157С, Б157Р, Б167З, Б192Р, Ε216Τ, Ε235Ι, Б244З, Ε269Ι, Ε269Τ, Ε296Τ, Б379З, Ь379^ Ь50У, М51А, Μ5^ Μ510 М48К, Ν148Μ, Ν148Ρ, Ν16ΕΧ, Ν266Ρ, Ш39Е, №48К, Ν348№, Р100А, Р145Б, Р149Б, Ρ149Ν, Р217И, Р217О, Р217Б, Р217З, Р254З, Р269Б, Р343Е, Ρ343Ι, Р343Б, Ρ343Ν, Р343Р, Ρ343ν, Ц137Р, Ц137Ь, Ц137^ 0137Υ, О246У, Ц275Н, Ц309Р, Ц377Р, Ц381З, 08611, З102А, 8102Υ, З173О, З173Н, З173^ З197О, З208Р, З211Н, 8218Ι, 8218Υ, З389Н, З389^ Т163Р, Т282Н, Τ291ν, Τ291Υ, Τ341Ό, Τ48Ρ, Т48Н, Τ48Ι, Т48К, Τ480 Т48М, Τ48ν, Τ48№, Τ48Υ, ν1620 ν162Τ, ν191^ ν422Μ, У265Б, Υ79Η, Υ79Ν, Υ79З или Υ79№;
    (c) нуклеиновую кислоту по (Ь), в котором полипептид дополнительно содержит по меньшей мере одну из мутаций С226И, И164Р, О179Р, Ν159ν, О2%\\ Τ163Ρ или Τ349Υ.
  2. 2. Кассета экспрессии, вектор, носитель для клонирования, вектор экспрессии или клонирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1.
  3. 3. Трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1.
  4. 4. Выделенная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1.
  5. 5. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид фитазы, содержащий:
    (a) (ί) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1;
    (ίί) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности ЗЕО ГО Ν0:2, при этом полипептид содержит по меньшей мере одну мутацию О247Н, или указанную в табл. 4-7, 9, или любое их сочетание;
    (b) полипептид по (а), при этом по меньшей мере одной мутацией является мутация А109^ А232Р, А236Н, А236Т, А248Е, А248Т, А274Р, А274ф А274Б, А274Т, А274У А429Р, Ο155Υ, Ό139Υ, Е113Р,
EA201171450A 2009-05-21 2010-05-20 Фитазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения EA021178B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18028309P 2009-05-21 2009-05-21
PCT/US2010/035667 WO2010135588A2 (en) 2009-05-21 2010-05-20 Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201171450A1 EA201171450A1 (ru) 2012-06-29
EA021178B1 true EA021178B1 (ru) 2015-04-30

Family

ID=43126780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201171450A EA021178B1 (ru) 2009-05-21 2010-05-20 Фитазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения

Country Status (17)

Country Link
US (3) US9695403B2 (ru)
EP (2) EP2432797B1 (ru)
JP (3) JP2012527247A (ru)
KR (1) KR101817253B1 (ru)
CN (2) CN102459303B (ru)
AU (1) AU2010249500B2 (ru)
BR (1) BRPI1011160A8 (ru)
CA (1) CA2763283C (ru)
DK (2) DK2698374T3 (ru)
EA (1) EA021178B1 (ru)
ES (2) ES2607688T3 (ru)
HU (2) HUE031003T2 (ru)
MX (1) MX355638B (ru)
NZ (1) NZ596459A (ru)
VN (1) VN30065A1 (ru)
WO (1) WO2010135588A2 (ru)
ZA (1) ZA201108491B (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2548776T3 (es) * 2006-09-21 2015-10-20 Basf Enzymes Llc Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso
DE102009038784B4 (de) 2009-08-25 2019-03-28 Siemens Healthcare Gmbh Vorbelegbares Sendedatenspeicherelement einer MR-Sendeeinheit in Array-Anwendungen
BR112014032940A2 (pt) * 2012-07-20 2017-06-27 Sophoro Biotechnologies Llc ésteres de carboidratos como indutores de expressão de genes
GB201308828D0 (en) * 2013-03-12 2013-07-03 Verenium Corp Phytase
GB201308843D0 (en) 2013-03-14 2013-07-03 Verenium Corp Phytase formulation
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
KR20160033711A (ko) * 2013-07-25 2016-03-28 바스프 엔자임스 엘엘씨 피타아제
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
EP3018203A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-11 Fertinagro Nutrientes, S.L. Novel phytase, method for obtaining the same and use thereof
US10386315B2 (en) * 2016-04-19 2019-08-20 Malvern Panalytical Inc. Differential scanning calorimetry method and apparatus
US20210230526A1 (en) 2016-06-28 2021-07-29 National Agriculture And Food Research Organization Cell enclosure device and use for same
JP7051504B2 (ja) * 2018-03-14 2022-04-11 昭和産業株式会社 家禽の筋胃増大用飼料、家禽の筋胃増大用混合飼料、及び家禽の筋胃を増大させる方法
CA3098454A1 (en) * 2018-04-26 2019-10-31 Danisco Us Inc Method for increasing stability of phytase in a solid composition and a granule composition comprising phosphate and phytase
US11278670B2 (en) 2018-04-26 2022-03-22 Carefusion 303, Inc. Semi-autonomous hot-swap infusion module
WO2020168943A1 (zh) * 2019-02-18 2020-08-27 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN111363775B (zh) * 2020-03-18 2022-08-05 浙江工业大学 一种生物酶法去消旋化制备l-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用
CN113699134B (zh) * 2020-05-22 2024-04-05 潍坊康地恩生物科技有限公司 植酸酶突变体
CN111653310B (zh) * 2020-06-29 2023-06-20 北京大学深圳研究生院 含二硫键多肽的结构预测方法及装置
EP4119660A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-18 AB Enzymes Oy Phytase variants
EP4119661A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-18 AB Enzymes Oy Phytase variants with improved stability and ip4 activity
CN115154331B (zh) * 2022-06-16 2024-01-16 武汉大学 一种具有介孔核壳结构的牙本质矿化脱敏材料及其制备方法
CN115011739B (zh) * 2022-08-03 2022-11-01 南京邦康生物技术有限公司 一种益生菌的生产控制方法与系统

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020127218A1 (en) * 1998-03-23 2002-09-12 Novozymes A/S Phytase variants
US20040091968A1 (en) * 1997-08-13 2004-05-13 Short Jay M. Recombinant phytases and methods of making and using them
US20060183213A1 (en) * 2001-12-28 2006-08-17 Syngenta Participations Ag Microbially-expressed thermotolerant phytase for animal feed

Family Cites Families (208)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3966971A (en) 1975-01-02 1976-06-29 Grain Processing Corporation Separation of protein from vegetable sources
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
JPS56501231A (ru) 1979-09-28 1981-09-03
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS59166049A (ja) 1983-03-09 1984-09-19 Nippon Shinyaku Co Ltd 豆乳の製法
JPS60140506A (ja) 1983-12-28 1985-07-25 Hitachi Ltd 磁気ヘツド
US5087571A (en) 1984-06-22 1992-02-11 President And Fellows Of Harvard College Method for providing a cell culture from a transgenic non-human mammal
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
CA1313830C (en) 1985-08-07 1993-02-23 Dilip Maganlal Shah Glyphosate-resistant plants
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5780292A (en) 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
DE3623533A1 (de) 1986-07-12 1988-01-21 Beiersdorf Ag Pyrido(1,8)naphthyridinone, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung sowie diese verbindungen enthaltende zubereitungen
NZ221259A (en) 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
CA1340522C (en) 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US5573933A (en) 1987-04-14 1996-11-12 Luminis Pty, Ltd. Transgenic pigs
DE3725946A1 (de) 1987-08-05 1989-02-16 Boehringer Ingelheim Vetmed Stabilisierter futtermittelzusatz und verfahren zu seiner herstellung
NL8702735A (nl) 1987-11-17 1989-06-16 Dorr Oliver Inc Werkwijze voor het weken van granen met een nieuw enzympreparaat.
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
NZ230375A (en) 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
US5162215A (en) 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5316770A (en) 1989-02-16 1994-05-31 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vitamin D derivative feed compositions and methods of use
US5366736A (en) 1989-02-16 1994-11-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vitamin D derivative feed compositions and methods of use
AU638438B2 (en) 1989-02-24 1993-07-01 Monsanto Technology Llc Synthetic plant genes and method for preparation
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
JPH0376529A (ja) 1989-08-17 1991-04-02 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 生地およびそれを用いるパンの製造法
US4940935A (en) 1989-08-28 1990-07-10 Ried Ashman Manufacturing Automatic SMD tester
UA27702C2 (ru) 1989-09-27 2000-10-16 Гіст-Брокейдс Н.В. Фрагмент геномной днк, которая кодирует фитазу aspergillus niger, фрагмент кднк, которая кодирует фитазу aspergillus niger, рекомбинантная плазмидная днк для экспрессии фитазы в aspergillus (варианты), штамм aspergillus продуцент фитазы aspergillus (варианты), способ получения
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
ES2106737T3 (es) 1990-02-07 1997-11-16 Abbott Lab Enzimas de fosfatasa alcalina con actividad especifica mejorada para uso en reactivos indicadores.
US5593963A (en) 1990-09-21 1997-01-14 Mogen International Expression of phytase in plants
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
WO1991016427A1 (en) 1990-04-24 1991-10-31 Stratagene Methods for phenotype creation from multiple gene populations
CA2085127C (en) 1990-06-15 2002-12-10 Barbara Cordell Transgenic non-human mammal displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
US5639949A (en) 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
DK0558676T3 (da) 1990-11-23 2000-09-25 Aventis Cropscience Nv Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter
JP3298879B2 (ja) 1990-12-20 2002-07-08 イグジス，インコーポレイテッド 結合タンパク質の最適化
JP2509824B2 (ja) 1991-02-23 1996-06-26 正美 星野 ミネラル吸収促進剤
US6110700A (en) 1991-03-11 2000-08-29 The General Hospital Corporation PRAD1 cyclin and its cDNA
US5922854A (en) 1991-06-14 1999-07-13 Kumar; Ramesh Purifying Human Hemogloblin from transgenic pig red cells and plasmids containing pig globin nucleic acids
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
UA48104C2 (ru) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, содержащий последовательность, которая кодирует инсектицидный протеин, оптимизированную для кукурузы, фрагмент днк, обеспечивающий направленную желательную для сердцевины стебля экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, фрагмент днк, обеспечивающий специфическую для пыльцы экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, рекомбинантная молекула днк, способ получения оптимизированной для кукурузы кодирующей последовательности инсектицидного протеина, способ защиты растений кукурузы по меньшей мере от одного насекомого-вредителя
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
EP0626010A1 (en) 1992-02-13 1994-11-30 Gist-Brocades N.V. Stabilized aqueous liquid formulations of phytase
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
GB9216151D0 (en) 1992-07-29 1992-09-09 Ici Plc Containment of plant germplasm
JPH0670749A (ja) 1992-08-27 1994-03-15 Nishinomiya Shuzo Kk 麹菌及びその育種方法
JPH06153896A (ja) 1992-08-27 1994-06-03 Nishinomiya Shuzo Kk 清酒の製造方法
DE69424861T2 (de) 1993-02-26 2000-12-28 Calgene Llc., Davis Geminivirus-basiertes-genexpressionsystem
DE69333071T2 (de) 1993-04-05 2004-05-06 Aveve N.V. Phytate-Hydrolyse und enzymatische Zusammensetzung für die Hydrolyse von Phytat
AU7925094A (en) 1993-09-30 1995-04-18 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US5492813A (en) 1993-11-01 1996-02-20 Boehringer Mannheim Corporation Muteins of β-galactosidase fragments having increased activity
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5639940A (en) 1994-03-03 1997-06-17 Pharmaceutical Proteins Ltd. Production of fibrinogen in transgenic animals
MX198456B (es) 1994-03-09 2000-09-05 Abbott Lab Animales trangenicos que producen oligosacaridos y glucoconjugados.
NZ279676A (en) 1994-03-09 1998-04-27 Abbott Lab Humanized milk produced by non-human transgenic mammal transformed with a heterologous gene coding for human enzyme producing human oligosaccharides and glycoconjugates
JPH07277865A (ja) 1994-04-14 1995-10-24 Ebara Res Co Ltd 堆肥およびその製造方法
DE69524951T3 (de) 1994-04-22 2009-07-09 Novozymes A/S Verfahren zum verbessern der löslichkeit von pflanzlichen proteinen
US5437992A (en) 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
GB9409336D0 (en) 1994-05-10 1994-06-29 Finnfeeds Int Ltd Use of an enzyme for manufacturing an agent for the treatment and/or prophylaxis of coccidiosis
US5750870A (en) 1994-06-17 1998-05-12 Agritope, Inc. Plant genetic transformation methods and transgenic plants
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5830732A (en) 1994-07-05 1998-11-03 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Phytase
US5959171A (en) 1994-08-17 1999-09-28 Pharming B.V. Method for the production of biologically active polypeptides in a mammal's
EP0778886A4 (en) 1994-09-01 2001-05-02 TRANSGENIC ANIMAL EXPRESSING A FAMILY FORM OF A HUMAN AMYLOID PRECURSOR PROTEIN
US6111166A (en) 1994-09-19 2000-08-29 Medarex, Incorporated Transgenic mice expressing human Fcα and β receptors
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US5880327A (en) 1994-09-21 1999-03-09 American National Red Cross Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5786316A (en) 1994-10-27 1998-07-28 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising xylanases
US5770012A (en) 1994-11-18 1998-06-23 P. H. Glatfelter Co. Process for treating paper machine stock containing bleached hardwood pulp with an enzyme mixture to reduce vessel element picking
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
WO1996023062A1 (en) 1995-01-26 1996-08-01 Novo Nordisk A/S Animal feed additives comprising xylanase
JPH08205785A (ja) 1995-02-03 1996-08-13 Ii M Kenkyu Kiko:Kk フィチン分解性飼料
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
JPH11500922A (ja) 1995-03-03 1999-01-26 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト 化学リガンドの存在下での受容体媒介トランス活性化による植物における遺伝子発現の制御
AU698739B2 (en) 1995-06-06 1998-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5720971A (en) 1995-07-05 1998-02-24 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Department Of Agriculture And Agri-Food Canada Enzyme additives for ruminant feeds
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5958672A (en) 1995-07-18 1999-09-28 Diversa Corporation Protein activity screening of clones having DNA from uncultivated microorganisms
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
WO1997016533A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
DK172530B1 (da) 1995-11-10 1998-11-23 Leo Pharm Prod Ltd Tilsætningsprodukt til drikkevand og foder til dyr samt fremgangsmåde for tilsætning
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6358709B1 (en) 1995-12-07 2002-03-19 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6764835B2 (en) 1995-12-07 2004-07-20 Diversa Corporation Saturation mutageneis in directed evolution
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6537776B1 (en) 1999-06-14 2003-03-25 Diversa Corporation Synthetic ligation reassembly in directed evolution
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6740506B2 (en) 1995-12-07 2004-05-25 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US5830696A (en) 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes
US6352842B1 (en) 1995-12-07 2002-03-05 Diversa Corporation Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution
US5939250A (en) 1995-12-07 1999-08-17 Diversa Corporation Production of enzymes having desired activities by mutagenesis
US6562594B1 (en) 1999-09-29 2003-05-13 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
KR0169913B1 (ko) 1996-03-14 1999-01-15 김은영 신균주 바실러스속 ds11과 이로부터 생산되는 신규 파이타아제
AU2077197A (en) 1996-03-18 1997-10-10 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having phytase activity and nucleic acids encoding same
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US5697987A (en) 1996-05-10 1997-12-16 The Trustees Of Princeton University Alternative fuel
AU3568897A (en) 1996-06-07 1998-01-05 Eos Biotechnology, Inc. Immobilised linear oligonucleotide arrays
US5939303A (en) 1996-06-14 1999-08-17 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada Phytases of ruminal microorganisms
US5759840A (en) 1996-09-09 1998-06-02 National Research Council Of Canada Modification of xylanase to improve thermophilicity, alkalophilicity and thermostability
ES2242234T3 (es) 1996-09-12 2005-11-01 Syngenta Participations Ag Plantas transgenicas que expresan enzimas celuloliticas.
US6039942A (en) 1996-12-20 2000-03-21 Novo Nordick A/S Phytase polypeptides
AU5477898A (en) 1997-01-09 1998-08-03 Novo Nordisk A/S Phytase combinations
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
DK1717322T3 (da) 1997-01-17 2012-10-22 Codexis Mayflower Holdings Llc Udvikling af hele celler og organismer ved rekursiv sekvensrekombination
JP4263248B2 (ja) 1997-03-18 2009-05-13 ノボザイムス アクティーゼルスカブ Ｄｎａのシャッフリングによるライブラリーの作成方法
WO1998041653A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Novo Nordisk A/S An in vitro method for construction of a dna library
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
KR100206453B1 (ko) 1997-03-27 1999-07-01 박원훈 신규한플라즈미드를이용하여형질전환시킨균주 이.채씨오엘아이.피와이로부터생산된피타제
US6333181B1 (en) 1997-04-07 2001-12-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production from lignocellulose
US5916780A (en) 1997-06-09 1999-06-29 Iogen Corporation Pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
NZ330940A (en) 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
US6720014B1 (en) 1997-08-13 2004-04-13 Diversa Corporation Phytase-containing foodstuffs and methods of making and using them
US6855365B2 (en) 1997-08-13 2005-02-15 Diversa Corporation Recombinant bacterial phytases and uses thereof
US7078035B2 (en) 1997-08-13 2006-07-18 Diversa Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US6183740B1 (en) 1997-08-13 2001-02-06 Diversa Corporation Recombinant bacterial phytases and uses thereof
US5876997A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Diversa Corporation Phytase
EP1012335A4 (en) 1997-08-15 2004-06-09 Hyseq Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OR QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACID SPECIES
ES2190591T3 (es) 1997-09-11 2003-08-01 Bioventures Inc Metodo de producir disposiciones ordenadas de alta densidad.
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
WO1999021979A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
EP1690868A1 (en) 1997-10-31 2006-08-16 Maxygen, Inc. Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
CA2251263A1 (en) 1997-11-14 1999-05-14 Hajime Karasuyama Transgenic animal allergy models and methods for their use
CA2313380C (en) 1997-12-08 2008-12-30 California Institute Of Technology Method for creating polynucleotide and polypeptide sequences
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1054973A1 (en) 1998-02-11 2000-11-29 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
EP1053343A2 (en) 1998-02-11 2000-11-22 Maxygen, Inc. Targeting of genetic vaccine vectors
DE69933369D1 (en) 1998-04-03 2006-11-09 Compound Therapeutics Inc Adressierbare protein arrays
DE69918091D1 (de) 1998-04-08 2004-07-22 Nutreco Aquaculture Res Ct As Verfahren zur modifizierung der proteinstruktur in endgeformten futterpellets, baellen oder aehnlichen, zur erreichung von formstabilitaet
US6156952A (en) 1998-04-09 2000-12-05 Constituent Institution Of The University Of Maryland System HIV transgenic animals and uses therefor
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
ES2381824T3 (es) 1998-06-29 2012-05-31 Bristol-Myers Squibb Company Procedimientos para generar genotecas muy diversas
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
GB2340755B (en) 1998-08-24 2002-09-25 Cannon Rubber Ltd Breast pump insert
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
FR2788782B1 (fr) 1999-01-25 2003-01-31 Gie Agro Ind Produit multienzymatique a activites glucoamylasique, proteolytique et xylanasique et procede pour sa production par fermentation a l'etat solide de son de ble avec aspergillus niger
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
DE60021715T2 (de) 1999-03-31 2006-06-01 Cornell Research Foundation, Inc. Phospahatasen mit verbesserter phytase-aktivität
EP1170994A1 (en) 1999-04-23 2002-01-16 University Of Guelph Transgenic animals expressing salivary proteins
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
DE19922753A1 (de) 1999-05-18 2000-11-23 Basf Ag Enzym-Instantformulierungen für die Tierernährung
DE19929257A1 (de) 1999-06-25 2000-12-28 Basf Ag Polymerbeschichtete, granulierte enzymhaltige Futtermittelzusätze und Verfahren zu deren Herstellung
JP4647868B2 (ja) 1999-07-09 2011-03-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 酵素含有顆粒の調製方法
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
AU7405200A (en) 1999-10-01 2001-05-10 Novozymes A/S Spray dried enzyme product
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
EP1230350B1 (en) 1999-11-18 2014-01-22 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of escherichia coli phytase
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
EP1276869A2 (en) 2000-01-21 2003-01-22 The Scripps Research Institute Methods and compositions to modulate expression in plants
EP1259630A1 (en) 2000-02-23 2002-11-27 Novozymes A/S Fermentation with a phytase
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
EP1332153A4 (en) 2000-10-12 2006-01-11 Exelixis Inc HUMAN ECT2 AND METHOD OF USE THEREOF
AU2002251724B2 (en) 2000-10-24 2007-06-21 Syngenta Participations Ag Control of gene expression in plants
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
AU2002356511A1 (en) 2001-07-30 2003-04-01 Immunex Corporation T. reesei phytase enyzmes, polynucleides encoding the enzymes, vectors and host cells thereof, and methods of using
JP2005503153A (ja) 2001-08-27 2005-02-03 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 自己加工植物及び植物部分
TW200305430A (en) * 2001-12-28 2003-11-01 Syngenta Participations Ag Thermotolerant phytase for animal feed
CN101792749B (zh) 2002-08-12 2012-09-05 金克克国际有限公司 大肠杆菌AppA肌醇六磷酸酶突变体
US7884261B2 (en) 2004-06-30 2011-02-08 CERES,Inc. Nucleotide sequences and corresponding polypeptides conferring modulated plant growth rate and biomass in plants
JP2007527726A (ja) 2004-03-08 2007-10-04 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 自己プロセシング植物および植物部分
JP4587691B2 (ja) 2004-03-30 2010-11-24 アサヒビール株式会社 イノシトール含量の高いビール、発泡酒、麦芽発酵飲料およびその製造方法
US20050227930A1 (en) 2004-04-08 2005-10-13 Kgk Synergize Inc. Cholesterol lowering combination
US20060014260A1 (en) 2004-05-07 2006-01-19 Zhiliang Fan Lower cellulase requirements for biomass cellulose hydrolysis and fermentation
CN1706941A (zh) 2004-06-10 2005-12-14 安徽固源生物工程有限责任公司 高比活植酸酶的热稳定性改良及其高效表达
DE102004050410A1 (de) 2004-10-15 2006-06-08 Ab Enzymes Gmbh Polypeptid mit Phytaseaktivität und dieses codierende Nucleotidsequenz
ES2531434T3 (es) * 2006-04-04 2015-03-16 Novozymes A/S Variantes de fitasa
WO2008017066A2 (en) * 2006-08-03 2008-02-07 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
ES2548776T3 (es) * 2006-09-21 2015-10-20 Basf Enzymes Llc Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso
DE102006053059A1 (de) 2006-11-10 2008-05-15 Ab Enzymes Gmbh Polypeptid mit Phytaseaktivität und erhöhter Temperaturstabilität der Enzymaktivität sowie dieses codierende Nukleotidsequenz
MX353478B (es) 2007-07-31 2018-01-15 Bp Corp North America Inc Star Ensamblaje combinacional de sitios multiples, a la medida.
ES2647767T3 (es) * 2007-12-03 2017-12-26 Syngenta Participations Ag Generación por ingeniería genética de proteínas enzimáticamente susceptibles

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040091968A1 (en) * 1997-08-13 2004-05-13 Short Jay M. Recombinant phytases and methods of making and using them
US20020127218A1 (en) * 1998-03-23 2002-09-12 Novozymes A/S Phytase variants
US20060183213A1 (en) * 2001-12-28 2006-08-17 Syngenta Participations Ag Microbially-expressed thermotolerant phytase for animal feed

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARRETT et al. Enhancing the Thermal Tolerance and Gastric Performance of a Microbial Phytase for Use as a Phosphate-Mobilizing Monogastric-Feed Supplement Appl Environ Microbiol. May 2004 Vol 70 No 5 Pages 3041-3046. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106011159A (zh) 2016-10-12
ES2607688T3 (es) 2017-04-03
JP6226943B2 (ja) 2017-11-08
DK2698374T3 (en) 2017-01-09
CN102459303B (zh) 2016-06-29
JP6227619B2 (ja) 2017-11-08
EP2698374B1 (en) 2016-09-14
MX2011012428A (es) 2012-02-01
US9969992B2 (en) 2018-05-15
AU2010249500B2 (en) 2016-03-24
US20190127712A1 (en) 2019-05-02
BRPI1011160A8 (pt) 2018-01-02
HUE031003T2 (en) 2017-06-28
NZ596459A (en) 2013-11-29
WO2010135588A2 (en) 2010-11-25
HUE030948T2 (en) 2017-06-28
EA201171450A1 (ru) 2012-06-29
KR101817253B1 (ko) 2018-01-10
JP2016039823A (ja) 2016-03-24
AU2010249500A1 (en) 2011-12-08
US20170306304A1 (en) 2017-10-26
JP2012527247A (ja) 2012-11-08
EP2698374A1 (en) 2014-02-19
VN30065A1 (en) 2012-06-25
ZA201108491B (en) 2017-04-26
EP2432797B1 (en) 2016-10-05
BRPI1011160A2 (pt) 2017-09-26
CA2763283C (en) 2021-01-12
MX355638B (es) 2018-03-26
US10428340B2 (en) 2019-10-01
DK2432797T3 (en) 2017-01-16
ES2608690T3 (es) 2017-04-12
KR20120057585A (ko) 2012-06-05
EP2432797A4 (en) 2012-11-14
CN102459303A (zh) 2012-05-16
CA2763283A1 (en) 2010-11-25
US20120066781A1 (en) 2012-03-15
US9695403B2 (en) 2017-07-04
JP2016127823A (ja) 2016-07-14
WO2010135588A3 (en) 2011-01-13
EP2432797A2 (en) 2012-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021178B1 (ru) Фитазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
CN104450754B (zh) 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
CN1561391B (zh) 重组细菌肌醇六磷酸酶及其用途
KR20020018672A (ko) 재조합 박테리아 피타제 및 이것의 용도
BR122014019327B1 (pt) ácido nucleico codificando uma fitase, cassete de expressão, vetor, veículo de clonagem, construção de dna e célula de micro-organismo transformada compreendendo o mesmo
CN102943085A (zh) 纤维素酶、编码它们的核酸及其制备和应用的方法
AU2013204086B2 (en) Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2013204082A1 (en) Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU