KR102307173B1 - 피타아제 - Google Patents

Abstract

피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 피타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 유전자는 적어도 7 g/L 내지 40 g/L의 수준에서 피타아제를 발현한다. 피타아제는 더 높은 비활성을 가지며, 저 pH에서 활성을 유지하고, 고온에서 활성을 유지한다. 상기 피타아제는 식품, 사료, 약제 및 세정을 비롯한 다양한 조성물에 사용될 수 있다.

Description

피타아제{PHYTASE}

서열 목록

본 출원은 MPEP § 502.05 하에 승인 및 지정된 USPTO EFS-WEB 서버를 통해 전자적으로 출원된 것이며 이 전자 출원은 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고; 이 서열 목록의 전체 내용은 본 출원의 명세서에 참고적으로 도입된다. 서열 목록은 하기와 같이 전자적으로 제출된 ASCII (.txt) 텍스트 파일 상에서 확인된다:

기술 분야

피타아제 활성을 가진 폴리펩티드 및 피타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 특히, 서열은 높은 비활성(specific activity), 높은 열안정성, 높은 열내성, 및 피타아제의 다양한 산업적 용도를 갖는 피타아제의 증가된 발현 수준을 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1: 비활성(U/mg)은 정제된 단백질을 갖는 피트산(pH 5.5)에서 결정되었다. 피키아(Pichia) 발현된 피타아제: 서열 번호 8 (서열 번호 7에 의해 코딩됨), 서열 번호 3 (서열 번호 2에 의해 코딩됨), 및 서열 번호 6 (서열 번호 5에 의해 코딩됨) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 발현된 피타아제: 서열 번호 3 (서열 번호 1에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6 (서열 번호 4에 의해 코딩됨).

도 2: 100 mM 시트레이트 pH 5.5 + 10% 소르비톨-10% NaCl에서 피타아제 서열 번호 3 (서열 번호 1에 의해 코딩됨)에 대한 DSC 크로마토그램.

도 3: 10% 소르비톨-10% NaCl의 존재 및 부재 하에 100 mM 시트레이트 pH 5.5에서 피타아제에 대한 DSC T_m 값 (℃). 서열 번호 3 (서열 번호 1에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6 (서열 번호 4에 의해 코딩됨)은 슈도모나스 발현된다. 서열 번호 3 (서열 번호 2에 의해 코딩됨), 서열 번호 6 (서열 번호 5에 의해 코딩됨), 및 서열 번호 8 (서열 번호 7에 의해 코딩됨)은 피키아 발현된다.

도 4: 4 mM 피테이트 상에서 브리톤-로빈슨(Britton-Robinson) "유니버셜" 버퍼를 이용한 피타아제의 pH 프로파일. 서열 번호 3 (서열 번호 1에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6 (서열 번호 4에 의해 코딩됨)은 슈도모나스 발현된다. 서열 번호 3 (서열 번호 2에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6 (서열 번호 5에 의해 코딩됨)은 피키아 발현된다.

도 5: SGF + 펩신에 처리된 피타아제의 SDS-PAGE. 서열 번호 3 (서열 번호 1에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6 (서열 번호 4에 의해 코딩됨)은 슈도모나스 발현된다. 서열 번호 3 (서열 번호 2에 의해 코딩됨), 서열 번호 6 (서열 번호 5에 의해 코딩됨), 및 서열 번호 8 (서열 번호 7에 의해 코딩됨)은 피키아 발현된다.

도 6: SGF 처리 후 열안정성 피타아제의 활성. 열안정성 피타아제에 대해 활성에 있어 최소 또는 무 손실이 관찰된다. T0 샘플을 피타아제 효소의 첨가 이전에 pH 11 버퍼로 미리-켄칭했다.

도 7: 피타아제 발효(30L)의 슈도모나스 (P.f.) 발현 수준.

피타아제는 피트산(마이오-이노시톨-헥사키스포스페이트)의 인 및 이노시톨로의 가수분해를 촉진하는 인산 모노에스테르 히드롤라제 효소이다. 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합(IUBMB)의 명명 위원회의 권고 및 문헌[Bairoch A., "The ENZYME database in 2000," Nucleic Acids Res 28:304-305(2000)]에 따르면, 피타아제는 효소 커미션 (EC) 넘버 EC 3.1.3.8로서 분류되고, 또한 1-피타아제; 마이오-이노시톨-헥사키스포스페이트 3-포스포히드롤라제; 피테이트 1-포스파타제; 피테이트 3-포스파타제; 또는 피테이트 6-포스파타제로서 지칭되어진다. 피타아제는 EC 3.1.3.26으로서도 분류되며, 이는 또한 4-피타아제; 6-피타아제 (1L-넘버링 시스템에 기초하며 1D-넘버링에 기초하지 않은 명칭); 또는 피테이트 6-포스파타제로서 지칭되어진다. 피타아제는 EC 3.1.3.72로서도 분류되며, 이는 또한 5-피타아제로서 지칭되어진다. 피타아제는 히스티딘산 포스파타제(HAP); β-프로펠러 피타아제; 퍼플산 포스파타제(PAP); 및 단백질 티로신 포스파타제(PTPs)로서도 지칭되어진다. 피타아제에 대한 다른 명칭은 업계에 숙련인에게 알려져 있을 것이다.

피타아제는 동물 사료 펠릿에서 보충제로서 효과를 가질 수 있는 효소의 일례이다. 피타아제는 피트산을 마이오-이노시톨 코어 및 하나 이상의 유리 포스페이트 분자로 분해한다. 피트산은 6개의 포스페이트 기들이 공유적으로 부착된 마이오-이노시톨 코어로 이루어진다. 피트산은 식물 재료, 예컨대 대두씨의 구성분이며, 이는 동물 예컨대 비반추 동물, 예를 들면, 가금, 구이용 닭, 새, 닭, 알 낳는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 및 암탉; 반추 동물 예를 들면 암소, 축우, 말 및 양; 돼지, 멧돼지, 새끼 돼지, 성장 돼지, 및 암퇘지; 고양이, 개, 설치류, 및 토끼(이에 한정되지 않음)를 포함한 반려 동물; 연어, 송어, 틸라피아, 캣피쉬 및 잉어(이에 한정되지 않음)를 포함한 어류; 및 작은 새우 및 참새우(이에 한정되지 않음)를 포함한 갑각류를 위한 사료 펠릿을 제조하는데 사용된다. 이들 동물은 피트산을 소화할 수 없기 때문에, 피트산은 다수의 유해 작용을 가진다. 이는 2가 양이온 예컨대 칼슘 및 마그네슘을 킬레이팅하고, 이의 포스페이트는 동물에 대해 생물학적으로 입수불가능한 형태이며, 그 결과 사료 중에 이들이 풍부함에도 불구하고 동물 식이에 이러한 영양분을 보충할 필요가 있다. 나아가, 이들 영양분은 소화됨이 없이 동물을 통과하기 때문에, 이들은 피트산을 분해할 수 있는 더 하부 먹이 사슬의 분해자에게 입수가능하며, 그 결과, 예를 들어, 동물 배설물과 접촉하는 표면 수에서 녹조가 발생한다.

비반추 동물 예컨대 닭, 돼지, 및 어류는 먹이에서 발견되는 피트산으로부터 인을 방출하는데 필요한 피타아제 효소를 천연적으로 생성하지 못하기 때문에 빠른 성장에 필요한 먹이로부터 충분한 인을 이용할 수 없다. 단지 소량의 인이 식물계 먹이로부터 이용되는데, 그 이유는 인의 대부분이 피트산의 포스페이트 기의 형태(피테이트)로 존재하기 때문이다. 따라서, 동물의 성장을 증가시키기 위해 동물에 인을 제공할 필요성이 존재한다.

하나의 해결책은 동물 사료에 무기 인 보충제를 첨가하는 것이지만; 무기 인 보충제의 사용은 동물로부터 그리고 환경으로 배출되는 포스페이트의 양을 증가시키며, 이는 물 공급의 오염을 야기한다.

또다른 해결책은 동물에 피타아제 보충제를 제공하거나 동물 사료에 피타아제를 첨가하는 것이다. 상업적으로 입수가능한 피타아제 제품의 예는 PHYZYME(Dupont, Danisco, Genencor); QUANTUM 및 FINASE (AB Vista, AB Enzymes); NATUPHOS(BASF); RONOZYME(DSM); Biofeed 피타아제(Novo Nordisk); Allzyme 피타아제(Alltech); OPTIPHOS(Enzyvia, Phytex, Cornell); Rovabio(Adisseo); PHYTOUT(US Waters)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이들 피타아제 제품 각각은 적어도 제조 수준, 제조 시간, 고온에서의 안정성, 낮은 pH에서의 안정성, 비활성, 및 투여 요건에 있어 한계를 가진다. 따라서, 피타아제, 예를 들면, 보다 적은 시간으로 보다 높은 수율로 생성될 수 있는 피타아제, 고온에서 보다 높은 활성을 보유하는 피타아제, 낮은 pH에서 보다 높은 활성을 보유하는 피타아제, 또는 사용자가 투여 수준을 감소시키고 동물 사료용 피타아제를 생성하고 제공하기 위한 비용을 감소시킬 수 있도록 하는 보다 높은 비활성을 갖는 피타아제에 대한 필요성이 존재한다.

피타아제는 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질이다. 핵산 또는 DNA는 피타아제를 발현하거나 생성할 수 있는 숙주 유기체 내로 클로닝된다. 단백질 생성에 사용될 수 있는 업계에 공지된 다양한 발현계가 존재한다. 단백질 발현계의 예는 유기체 예컨대: 박테리아, 효모, 곰팡이, 포유동물, 식물, 또는 곤충을 포함한다. 다양한 인자가 발현계의 선택, 예컨대 발현될 단백질의 종류 및 생성되는 단백질 생성물의 양에 영향을 미친다. 문헌[Demain, (2009) "Production of Recombinant Proteins by Microbes and higher Organisms," Biotechnology Advances, volume 27, pp 297-306]은 다양한 단백질 발현계의 다양한 이점 및 단점을 개시하고 있다.

피타아제는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 페니실리움 퍼니쿨로섬(Penicillium funiculosum), 피타아제 카놀라(Phytase canola (Brassica napus)), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 및 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(이에 한정되지 않음)를 포함한 다양한 숙주 유기체로부터 세포외적으로 상업적으로 생성되어진다. 문헌[Pariza, "Determining the safety of enzymes used in animal feed," Regulatory Toxicology and Pharmacology 56 (2010) 332-342]을 참조하기 바란다.

피타아제의 산업적 규모의 생성은 낮은 가격으로 단시간내에 높은 수준의 효소를 생성하는 발현계를 요구한다. 따라서, 피타아제의 산업적 규모의 제조를 위한 제조 요건을 충족하거나 능가하는 유전자를 제공할 필요성이 존재한다.

본 발명의 일 실시양태는 그램 음성 박테리아 발현계에서 높은 수준으로 생성되는 피타아제를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다. 또 다른 실시양태는 세포내 발현을 통해 높은 수준으로 생성되는 피타아제를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다. 또 다른 실시양태는 그램 음성 박테리아 발현계에서 세포내 발현을 통해 피타아제를 생성하는데 있으며, 여기서 숙주 유기체는 슈도모나스이다. 또 다른 실시양태는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 피타아제를 생성하는데 있다. 발현계는 업계에 공지된 임의의 슈도모나스 플루오레센스 발현계, 예를 들면, Dow Global Technologies 사에서 상업적으로 입수가능한 슈도모나스 플루오레센스 발현계, 균주 DC454 (미국 특허 출원 공보 제20050130160호 및 미국 특허 출원 공보 제20050186666호)일 수 있다. 피타아제 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 pMYC 벡터(Dow Global Technologies Inc., 미국 특허 출원 공보 제20050130160호) 또는 pDOW1169 벡터(Dow Global Technologies Inc., 미국 특허 출원 공보 제20080058262호)에 삽입된 다음 전기천공에 의해 슈도모나스 플루오레센스 숙주에 도입된다. 업계의 숙련인은 본 발명의 실시양태들로서 사용될 수 있는 대체 벡터에 대해 숙지하고 있을 것이다.

또 다른 실시양태에서, 피타아제를 코딩하는 DNA는 플라스미드 상에 도입될 수 있거나 또는 예를 들면, 다수의 그램 음성 박테리아 시스템 예컨대 이 콜라이(E. coli), 슈도모나스 종 예컨대 플루오레센스(fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 랄스토니아(Ralstonia) 종, 또는 카울로박터(Caulobacter) 종의 게놈에 안정적으로 형질전환될 수 있다. 마찬가지로, 피타아제는 다수의 그램 양성 박테리아 발현계 예컨대 바실러스(Bacillus) 종 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 또는 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 락토코커스(Lactococcus) 종 예컨대 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 예컨대 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)에 도입될 수 있다. 다른 그램 음성, 그램 양성 또는 관련되지 않은 진정세균 또는 고세균 발현계가 피타아제를 발현시키는데 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 피타아제를 코딩하는 DNA는 이의 발현을 지시하기 위해 플라스미드에 도입될 수 있다. 피타아제를 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드는 예를 들면, 패밀리 pQE, pET, 및 pASK의 이 콜라이 발현 벡터; 패밀리 pCN51 LT8, RSF1010, pWZ112T, 및 pMYC의 슈도모나스 발현 벡터; 패밀리 pBAX, pHT01, 및 pHIS1525의 바실러스 발현 벡터; 패밀리 pIJ6021 및 pIJ2460의 스트렙토마이세스 발현 벡터; 및 패밀리 pNZ9530 및 pNZ8148의 락토코커스 발현 벡터를 포함할 수 있다. 이들 예는 설명을 목적으로 한 것이며 서열 번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열이 발현될 수 있는 완전한 벡터 세트를 대표하는 것은 아니다.

또 다른 실시양태에서, 피타아제를 코팅하는 단리된, 재조합, 또는 합성 핵산 서열은 적어도 7.0 g/L, 8.0 g/L, 9.0 g/L, 10.0 g/L, 11.0 g/L, 12.0 g/L, 13.0 g/L, 14.0 g/L, 15.0 g/L, 16.0 g/L, 17.0 g/L, 18.0 g/L, 19.0 g/L, 20.0 g/L, 21.0 g/L, 22.0 g/L, 23.0 g/L, 24.0 g/L, 25.0 g/L, 26.0 g/L, 27.0 g/L, 28.0 g/L, 29.0 g/L, 30.0 g/L, 31.0 g/L, 32.0 g/L, 33.0 g/L, 34.0 g/L, 35.0 g/L, 36.0 g/L, 37.0 g/L, 38.0 g/L, 39.0 g/L, 또는 적어도 40.0 g/L 또는 40.0g/L 초과의 수준에서 세포내 발현을 통해 생성된다.

또 다른 실시양태에서, 피타아제의 발효 생성 시간은 150 시간 미만, 145 시간, 140 시간, 135 시간, 130 시간, 125 시간, 120 시간, 115 시간, 110 시간, 105 시간, 100 시간, 95 시간, 90 시간, 85 시간, 80 시간, 75 시간, 70 시간, 65 시간, 60 시간, 55 시간, 50 시간, 49 시간, 48 시간, 47 시간, 46 시간, 45 시간, 44 시간, 43 시간, 42 시간, 41 시간, 40 시간, 39 시간, 38 시간, 37 시간, 36 시간, 35 시간, 34 시간, 33 시간, 32 시간, 31 시간, 30 시간, 29 시간, 28 시간, 27 시간, 26 시간, 25 시간, 24 시간, 23 시간, 22 시간, 21 시간, 20 시간이거나 또는 20 시간 미만이다.

또 다른 실시양태에서, 발효는 10 L, 100 L, 200 L, 500 L, 1000 L, 2000 L, 5000 L, 10,000 L, 25,000 L, 50,000 L, 55,000 L, 60,000 L, 65,000 L, 70,000 L, 75,000 L, 80,000 L, 85,000 L, 90,000 L, 95,000 L, 100,000 L, 110,000 L, 120,000 L, 130,000 L, 140,000 L, 150,000 L, 160,000 L, 170,000 L, 180,000 L, 190,000 L, 200,000 g/L 이상의 부피로, 또는 200,000 L보다 큰 부피로 수행된다.

일 실시양태에서, 세포내 발현계는 그램 음성 박테리아이다. 또 다른 실시양태에서, 그램 음성 박테리아는 슈도모나스(Pseudomonas)이다. 또 다른 실시양태에서, 슈도모나스는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)이다.

일 실시양태에서, 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 약 35.0 g/L로 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 7.0 g/L 초과로 생성된다. 또 다른 실시양태에서, 피타아제는 144 시간 미만 내에 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 피타아제는 84 시간, 74 시간, 64 시간, 54 시간, 44 시간, 34 시간, 또는 24 시간 미만 내에 생성된다.

일 실시양태에서, 세포내 발현에 의해 생성되는 피타아제를 코딩하는 핵산은 이 콜라이(E. coli), 바실러스 종(Bacillus sp.), 하프니아 종(Hafnia sp.), 페르니 오포라 라이시(Perni ophora lycii), 부티옥셀라 종(Buttiauxella sp.), 시트로박터 종(Citrobacter sp.), 또는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로부터 유래되거나 이로부터 유래되는 핵산의 변형된 형태이다. 또 다른 실시양태에서, 피타아제는 PCT 공개공보 번호 WO 1999/008539, WO 2000/071728, WO 2001/090333, WO 2002/095003, WO 2006/028684, WO 2008/036916, 또는 WO 2010/135588에 개시된 임의의 피타아제가다.

또 다른 실시양태에서, 핵산은 단리된, 합성, 또는 재조합 핵산이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된, 재조합, 또는 합성 핵산 서열은 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7의 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시양태에서, 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 7의 변이체, 또는 이들의 단편으로서, 상기 변이체는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및/또는 서열 번호 7과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 완전히(100%) 동일하며, 상기 변이체는 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.

또 다른 실시양태에서, 단리된, 합성, 또는 재조합 핵산 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 번호 1의 핵산, 또는 서열 번호 1의 변이체는 서열 번호 3의 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 번호 2의 핵산, 또는 서열 번호 2의 변이체는 서열 번호 3의 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 번호 4의 핵산, 또는 서열 번호 4의 변이체는 서열 번호 6의 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 번호 5의 핵산, 또는 서열 번호 5의 변이체는 서열 번호 6의 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 번호 7의 핵산, 또는 서열 번호 7의 변이체는 서열 번호 8의 폴리펩티드를 코딩한다.

일 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 또는 이의 변이체의 전장 서열에 상보적이다.

일 실시양태에서, 피타아제는 피타아제 활성을 갖는 단리된, 재조합, 또는 합성 폴리펩티드이며, 이 폴리펩티드는 서열 번호 3, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 피타아제는 서열 번호 3, 서열 번호 6, 또는 서열 번호 8의 변이체, 또는 이의 효소적 활성 단편으로서, 상기 변이체는 서열 번호 3, 서열 번호 6, 또는 서열 번호 8에 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 완전히(100%) 동일하며, 상기 변이체는 피타아제 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 피타아제는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 및/또는 서열 번호 7을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이다.

일 실시양태에서, 피타아제는 신호 서열, 전구단백질(proprotein) 서열, 프로모터 서열, 또는 이들의 임의의 조합이 결여된 아미노산 서열이다.

일 실시양태에서, 피타아제는 신호 서열, 태그, 에피토프, 접합 인자(mating facor), 조절 서열, 프로모터 서열, N-말단 연장체, C-말단 연장체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종 서열을 추가로 포함하는 아미노산 서열이다.

일 실시양태에서, 피타아제는 약 1000 U/mg 내지 약 1,600 U/mg 범위의 임의의 값의 비활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 피타아제는 1000 U/mg, 1100 U/mg, 1200 U/mg, 1300 U/mg, 1400 U/mg, 1500 U/mg, 또는 1600 U/mg의 비활성을 갖는다.

일 실시양태에서, 피타아제는 약 pH 1.0 내지 약 pH 9.0 범위의 임의의 pH에서 활성을 갖는다. 일 실시양태에서, 피타아제는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5의 pH, 또는 보다 알칼리 조건에서 활성을 갖는다.

일 실시양태에서, 피타아제는 약 50℃ 내지 약 100℃ 범위의 임의의 온도에서 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 피타아제는 37℃ 초과 내지 약 95℃, 또는 약 55℃ 내지 약 85℃, 또는 약 70℃ 내지 약 75℃, 또는 약 70℃ 내지 약 95℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 105℃, 또는 약 95℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도에서 활성을 갖는다.

일 실시양태에서, 본 발명의 피타아제는 조성물 중에 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 피타아제를 포함하는 식품, 사료, 보충제, 동물 사료 첨가제, 또는 식이 보조제이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 피타아제를 포함하는 약제이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "클로닝"은 DNA 단편, 세포, 또는 유기체의 카피를 생성하기 위한 과정이며, 여기서 DNA는 재조합 DNA 카피를 생산하는 숙주 유기체 내로 도입된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "클로닝 벡터"는 데옥시리보핵산(DNA) 단편 또는 완전한 유전자와 같은 유전자 서열을 숙주 세포 내로 삽입하여 외부 유전 물질이 복제될 수 있도록 하는 데 사용되는 박테리아 플라스미드 또는 박테리오파지와 같은 캐리어이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "칵테일(cocktail)"은 1종 이상의 추가 효소와 조합하여 본 발명의 피타아제를 포함하는 조성물이다. 상기 1종 이상의 추가 효소는 임의의 효소, 예를 들어, 락타제, 리파제, 프로테아제, 카탈라제, 크실라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 만난아제, 아밀라제, 아미다제, 에폭시드 하이드롤라제, 에스테라제, 포스포리파제, 트랜스아미나제, 아민 옥시다제, 셀로바이오하이드롤라제, 암모니아 리아제, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

"코돈"은 단백질에 부가되는 아미노산의 실체를 특정하는 3개 폴리뉴클레오티드 서열이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "상보적 DNA 또는 cDNA"는 효소 리버스 트랜스크립타제 및 효소 DNA 폴리머라제에 의해 촉진되는 반응에서 메신저 RNA(mRNA) 주형으로부터 합성되는 DNA이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "배양"은, 피타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에서, 프로모터를 활성화하거나, 형질전환체를 선별하거나, 유전자를 증폭시키는 데 적절하도록 개질된 통상적인 영양 배지의 사용을 포함한다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 사용되는 조건이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "숙주 세포"는 피타아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 본 발명의 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비이클, 발현 벡터, 또는 클로닝 벡터를 포함하는 형질전환된 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포, 예컨대 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포를 비롯하여 당업자에게 잘 알려진 임의의 숙주 세포일 수 있다. 적절한 숙주의 선택은 당업자의 능력 범위 내에 있다.

숙주 세포는 재조합 서열에 의해 코딩되는 유전자 생성물을 생성하기 위한 통상적인 방식으로 사용될 수 있다. 재조합 생산 절차에 이용되는 숙주에 따라, 숙주 세포에 의해 생성된 폴리펩티드는 글리코실화될 수도 있고 비글리코실화될 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 처음의 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "동일한"은 서열 동일성(상동성)의 정도이며, 이것은 당업계에 공지된 임의의 컴퓨터 프로그램 및 관련 파라미터, 예컨대 디폴트 파라미터와 함께 BLAST 2.2.2. 또는 FASTA 버젼 3.0t78을 이용하여 결정할 수 있다.

단백질 및/또는 핵산 서열 동일성(상동성)은 당업계에 공지된 다양한 서열 비교 알고리즘 및 프로그램 중 임의의 것을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 알고리즘 및 프로그램으로는 BLAST 프로그램[국립 생물학 정보 센터(National Center for Biological Information)의 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴, 예컨대 BLAST, BLAST2, BLASTN 및 BLASTX], TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, 및 CLUSTALW[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8): 2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Necleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993]을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. BLAST, BLAST 2.0 및 BLAST 2.2.2 알고리즘도 본 발명을 실시하는 데 사용된다. 이들은, 예를 들어 문헌[Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]; 문헌[Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수할 수 있다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 사용되는 용어 "상동성"과 "동일성"은, 임의의 수의 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 수작업 정렬 및 시각적 조사에 의해 측정되는 바와 같이, 비교 윈도 또는 지정된 영역에 대해 최대 상응성으로 비교 및 정렬할 때, 동일하거나, 특정 비율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분 서열을 말한다. 서열 비교를 위해, 하나의 서열은 테스트 서열의 비교 대상이 되는 참조 서열(본 발명의 예시적 서열)로서 작용할 수 있다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 테스트 서열과 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라, 부분 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 이용할 수 있거나 대안적 파라미터를 지정할 수 있다. 그 후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 테스트 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "핵산"은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 핵산 단편을 의미한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥일 수 있는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 게놈 또는 합성 유래의 RNA(예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 예를 들어 iRNA, 리보핵단백질(예를 들어, iRNP)를 비롯한 천연 또는 합성 유래의 임의의 DNA 유사 또는 RNA 유사 물질일 수 있다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이 용어는 또한 합성 골격을 갖는 핵산 유사 구조를 포함하며, 이에 대해서는, 예를 들어 문헌[Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197]; 문헌[Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698]; 문헌[Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156]을 참조할 수 있다.

본 발명을 실시하는 데 사용되는 핵산은, 이것이 RNA, iRNA, 안티센스 핵산, cDNA, 게놈 DNA, 벡터, 바이러스 또는 이들의 하이브리드 중 무엇이든지 간에, 다양한 공급원으로부터 단리하고/하거나, 유전적으로 조작하고/하거나, 증폭시키고/시키거나, 발현/재조합 생성할 수 있다. 이들 핵산으로부터 생성된 재조합 폴리펩티드는 개별적으로 단리 또는 클로닝하여 원하는 활성에 대해 테스트할 수 있다. 일 실시양태에서, 핵산은 박테리아, 포유동물, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현계를 비롯한 재조합 발현계 내에 존재할 수 있다.

핵산의 조작 기법, 예를 들어, 서브클로닝, 프로브 표지(예를 들어, 클레나우(Klenow) 폴리머라제를 이용하는 랜덤 프라이머 표지, 닉 번역(nick translation), 증폭), 시퀀싱, 하이브리드화 등은 과학 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook, ed., Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)]; 문헌[Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)]를 참조할 수 있다.

본 발명은, RNA 합성/발현을 지시하거나 조절하기 위해, 발현(예를 들어, 전사 또는 번역) 조절 서열(들), 예를 들어 프로모터 또는 인핸서에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 핵산(예를 들어, DNA) 서열을 제공한다. 발현 조절 서열은 발현 벡터 내에 존재할 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 과다발현을 위한, 본 발명의 핵산, 예를 들면 본 발명의 피타아제를 코딩하는 서열을 포함하는 발현계, 예를 들면 발현 카세트, 벡터, 클로닝 비히클 등을 제공한다.

본 발명의 핵산 서열의 최적화된 발현은 또한 코딩된 단백질의 증가된 발현을 수행하는 핵산의 유도 또는 무작위 돌연변이 생성을 의미한다. 본 발명의 핵산의 돌연변이 생성은 발현된 단백질의 증가된 수율을 직접적으로 또는 간접적으로 가능하게 할 수 있다. 비제한적인 예에 의해, 본 명세서에 기술된 돌연변이 생성 기법들이 5' 비번역된 영역, 3' 비번역된 영역, 또는 핵산의 코딩 영역의 돌연변이를 수행하는 데 이용될 수 있으며, 그 돌연변이는 결과적으로 RNA 또는 단백질 수준에서 증가된 안정성을 형성함으로써 결과적으로 단백질의 증가된 수율을 형성한다.

일부 실시양태에서, 관심 있는 단백질에서 이루어지는 돌연변이는, 관심 있는 단백질의 발현을 강화할 수 있는 돌연변이를 선택하기 위해서, 관심 있는 오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 유전자 뿐만 아니라 뿐만 아니라 호스트의 바람직한 코돈의 예측된 mRNA 구조의 5 프라임 말단의 2차원 및 3차원 구조의 분석을 비롯한 다양한 인자에 의해 결정된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 돌연변이는 호스트의 바람직한 코돈, 즉 코돈 최적화를 토대로 하여 전적으로 선택되지 않으며, 또한 코돈 최적화 프로그램을 토대로 하여 전적으로 선택되지 않는다.

"돌연변이"는 기준과 비교하여 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산에서의 차이이가 있는 것을 의미한다.

"침묵(silent) 돌연변이"는 상이한 아미노산의 규격을 결과로 형성하지 않는 코돈에서의 돌연변이를 의미한다.

"뉴클레오티드"는 DNA 서열을 포함하는 4가지 염기 - 아데닌(A), 티미딘(T), 구아니딘(G) 및 시토신(C) 중 하나를 의미한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 호스트에서 구조 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 본 발명의 서열 및 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 단백질 코딩 서열, 예컨대 본 발명의 피타아제)을 포함하고, 여기서 호스트는 그러한 서열과 호환성을 갖는다. 발현 카세트는 폴리펩티드 코딩 서열에 의해, 그리고 임의로 다른 서열, 예를 들면 전사 종결 신호에 의해 작동가능하게 연쇄된 프로모터를 적어도 포함한다. 발현을 수행하는데 필요하거나 도움을 주는 추가적인 인자, 예를 들면 인핸서가 사용될 수도 있다.

적합한 인자의 대다수는 당업자에게 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다. 예시적인 벡터로는 박테리아: pQE 벡터(Qiagen), pBluescript 플라스미드, pNH 벡터, 람다-ZAP 벡터(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T(Pharmacia); 진핵성물: pXT1, pSG5(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40(Pharmacia)가 포함된다. 그러나, 임의의 다른 플라스미드 또는 다른 벡터가 호스트에서 복사가능하여 생존 가능하는 한 사용될 수 있다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 벡터"를 호스팅하는 것으로서 기술되는 경우, 이는 염색체외의 원형 및 선형 DNA 및 호스트 염색체(들) 내로 혼입되는 DNA를 둘 다 포함한다. 벡터가 호스트 세포에 의해 유지되는 경우, 벡터는 자가 구조로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정하게 복제될 수 있거나, 또는 호스트 게놈 내에 혼입된다.

발현 벡터는 프로모터, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 전사 종결자를 포함할 수 있다. 그 벡터는 또한 발현을 증폭하기 위한 적당한 서열도 포함할 수 있다.

본 발명은 피타아제 활성을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 증폭하기 위한 증폭 프라이머 서열 쌍 또는 이의 서브서열을 제공한다. 당업자라면, 그러한 서열의 임의의 부분 또는 전장을 위한 증폭 프라이머 서열 쌍을 설계할 수 있다. 증폭 방법들은 또한 해당 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 폴리머라제 사슬 반응, PCR; 전사 증폭; 자가-유지된 서열 복제; Q 베타 레플리카제 증폭; 및 다른 RNA 폴리머아제 매개된 기법을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "폴리펩티드"는 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 펩티드 서열이거나, 또는 대안으로 이들 중 임의 것의 단편, 부분 또는 서브유닛이며, 천연 발생 분자 또는 합성 분자인 "아미노산" 또는 "아미노산 서열"을 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 피타아제 활성을 갖는다. 대안적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 예를 들면 표지화 프로브, 항원, 내성원(toleragen), 모티프, 피타아제 활성 부위로서 유용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 단리, 합성 또는 재합될 수 있다. 펩티드 및 단백질은 시험관내 또는 생체내 재조합 발현될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 해당 기술에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조 및 단리될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 해당 기술 분야에서 잘 알려진 화학 방법을 이용하여 전부 또는 일부 합성될 수도 있다. 예를 들면, 피타아제 폴리펩티드는 (본 명세서에서 기술된 바와 같은) 표준 재조합 발현계로 생성될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있거나, 그것이 자연적으로 발현되는 유기체로부터 정제될 수 있다.

대안적인 양태에서, 본 발명의 "재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기법에 의해 생성된 폴리펩티드 또는 단백질; 예를 들면 원하는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 외인성 DNA 구성체(constrcut)에 의해 형질변환된 세포로부터 생성된 것들을 포함한다(의미한다).

대안적인 양태에서, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 글리코실화된다. 이 글리코실화는 화학적으로 또는 세포 생합성 메카니즘으로 번역후 추가될 수 있으며, 여기서 후자는 공지된 글리코실화 모티프의 사용을 포함하고, 그 모티프는 서열에 네이티브할 수 있거나, 펩티드로서 첨가될 수 있거나 핵산 코딩 서열 내로 첨가될 수 있다. 그 글리코실화는 0-결합될 수 있거나, N-결합될 수 있거나, 이들의 조합으로 결합될 수 있다.

대안적인 양태에서, 상기 정의된 바와 같이, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 "미메틱(mimetic)" 형태 및 "펩티도미메틱(peptidomimetic)" 형태를 일부 또는 전부로서 포함한다. 하나의 양태에서, 용어 "미메틱" 및 "펩티도미메틱"는 본 발명의 폴리펩티드의 실질적으로 동일한 구조적 및/또는 기능적 특성을 갖는 합성 화학 화합물을 의미한다. 그 미메틱은 아미노산의 합성 비천연 유사체으로만 전적으로 구성될 수 있거나, 일부 천연 펩티드 아미노산과 일부 아미노산의 비천연 유사체로 구성된 키메릭(chimeric) 분자이다. 그 미메틱은 또한 임의의 양의 천연 아미노산 보존적 대체물을 혼입할 수 있는데, 단 그러한 대체물이 그 미메틱 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경하지 않는다는 전제로 한다. 보존적 변형인 본 발명의 폴리펩티드를 사용한다면, 일상적인 실험으로, 임의의 미메틱이 본 발명의 영역 내에 속하는지, 즉 그 구조 및/또는 기능이 실질적으로 변경되지 않은지의 여부가 결정될 것이다. 따라서, 하나의 양태에서, 미메틱 조성물이 피타아제 활성을 갖고 있다면, 그 미메틱 조성물은 본 발명의 영역 내에 속한다.

대안적인 양태에서, 보존적 대체물은 폴리펩티드 내의 주어진 아미노산을 유사 특성의 또다른 아미노산으로 대체한 것들이다. 대안적인 양태에서, 보존적 대체물로는 다음과 같은 대체물: 지방족 아미노산, 예컨대 Ala, Val, Leu 및 Ile를 또다른 지방족 아미노산으로 대체한 대체물; Ser를 Thr로 대체하거나 Thr를 Ser로 대체한 대체물; 산성 잔기, 예컨대 Asp 및 Glu를 또다른 산성 잔기로 대체한 대체물; 아미드 기를 보유하는 잔기, 예컨대 Asp 및 Glu를 아미드 기를 보유하는 또다른 잔기로 대체한 대체물; 염기성 잔기, 예컨대 Lys 및 Arg를 따른 염기성 잔기로 교환한 대체물; 및 방향족 잔기, 예컨대 Phe, Tyr를 또다른 방향족 잔기로 대체한 대체물이 있다. 하나의 양태에서, 하나의 소수성 아미노산, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌을 또 다른 것으로 대체한 대체물, 또는 하나의 극성 아미노산을 또다른 것으로 대체한 대체물, 예컨대 아르기닌을 리신으로 대체한 대체물, 글루탐산을 아스파르트산으로 대체한 대체물 또는 글루타민을 아스파라긴으로 대체한 대체물이 있다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 아미노산이, 예를 들면 본 발명의 피타아제 폴리펩티드로부터 결실되어, 결과적으로 그의 생물학적 활성을 유의적으로 변경하는 일 없이 폴리펩티드의 구조의 변형을 형성할 수 있거나, 대안으로 목적상 그의 생물학적 활성을 유의적으로 변경할 수 있다. 예를 들면, 피타아제 생물학적 활성에 요구되거나, 또는 대안적으로 요구되지 않은 아미노- 또는 카르복실-말단 아미노산이 제거 및/또는 첨가될 수 있다. 본 발명의 변형된 폴리펩티드 서열은 변형된 폴리펩티드 서열을 피타아제 기질과 접촉시키는 단계, 및 변형된 폴리펩티드가 측정검사에서 특정 기질의 양을 감소시키는지 또는 기능성 피타아제 폴리펩티드와 기질과의 효소 반응의 바이오생성물을 증가시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 임의의 다수 방법에 의해 피타아제 생물학적 활성에 대하여 측정검사할 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열과 "실질적으로 동일한" 서열, 즉 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 상이한 서열을 가지며, 이는 특히 그러한 치환이 분자의 활성 부위가 아닌 부위에서 일어나는 경우에 해당하고, 단 폴리펩티드는 기본적으로 그의 기능적 특성을 유지해야 한다.

하나의 실시양태에서, 피타아제는 서열 번호 3(서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; (서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및 (서열 번호 7의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된다.

또다른 실시양태에서, 피타아제는 서열 번호 3, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 폴피펩티드 변형이고, 여기서 폴리펩티드 변형은 서열 번호 3, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 폴리펩티드 또는 이의 효소적 활성 단편에 대하여 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98.0%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%(완전) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 여기서 폴리펩티드 변형은 피타아제 활성을 갖는다.

본 발명은 변형된 신호 서열(또한 신호 펩티드(SP) 또는 리더 펩티드라고 칭하기도 함) 또는 이종 신호 서열을 갖지 않거나 갖는 피타아제를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 변형 또는 이종 프리포(prepo) 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)을 갖지 않거나 가질 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 내에 혼입된 변형 또는 이종 SP, 프리포 도메인 및/또는 CD는 융합 단백질의 부분, 예를 들면 키메릭 단백질 내의 이종 도메인일 수 있거나, 또는 화학 링커제에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 효소는 벡터, 예를 들면 pPIC 시리즈 벡터(캘리포니아주 칼스배드 소재, Life Technologies) 내에 이종 SP 및/또는 프리포 도메인을 포함할 수 있다.

추가로, 본 발명의 폴리펩티드는 이종 서열, 다른 피타아제로부터의 서열 또는 비-피타아제 공급원으로부터의 서열, 또는 완전 합성 서열을 더 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 핵산은 내인성 변형 또는 이종 신호 서열(SP), 프리포 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)에 대한 코딩 서열 및 이종 서열(즉, 본 발명의 신호 서열(SP), 프리포 도메인 및/또는 촉매 도메인(CD)과 자연적으로 회합되지 않은 서열)을 포함한다. 그 이종 서열은 SP, 프리포 도메인 및/또는 CD 코팅 서열의 3' 말단부, 5' 말단부 및/또는 양쪽 말단부 상에 존재할 수 있다.

본 발명의 부동화 효소 및 고체 지지체는 피타아제 효소 또는 이의 단편이고, 그 효소 및 단편을 코딩하는 핵산은 고체 지지체에 고정될 수 있다. 이는 종종 공업 공정에서 피타아제의 사용에 있어서 경제적이고 효율적이다. 예를 들면, 특정 화학 반응에서 사용되는, 피타아제 효소(또는 이의 활성 단편)의 컨소시엄 또는 칵테일이 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 공정 배트(process vat) 내에 잠겨 있을 수 있다. 효소 반응이 일어날 수 있다. 이어서, 고체 지지체는, 반복 사용을 위해, 그 지지체에 고정된 효소와 함께 그 배트에서 꺼낼 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산이 고체 지지체에 고정될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 그 고체 지지체는 겔, 수지, 폴리머, 세라믹, 유리, 마이크로전극, 및/또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

지지체 상에서 효소 또는 이의 단편 또는 핵산을 부동화시키기 위한 많은 방법들이 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 방법 중 일부는, 예를 들면 흡착을 통한, 공유 결합을 통한, 가교결합을 통한, 화학 반응 또는 공정을 통한, 캡슐화를 통한, 인트랩먼트(entrapment)을 통한, 알긴산나트륨을 통한 또는 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)를 통한, 정전기적 액적 발생, 전기화학적 수단을 포함한다. 유사 방법들이 문헌[Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Editied by S.P. Colowick and N.O. Kaplan. Volume 136]; 및 문헌[Immobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Edited by G.F. Bickerstaff. Series: Methods in Biotechnology, Edited by J.M. Walker]에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "변이체"는 그러한 폴리펩티드의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 특히, 변이체는 본 발명의 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열 및 이 서열에 실질적으로 동일한 서열이 하나 이상의 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단(이들은 임의의 조합으로 존재할 수 있음)에 의해 차이가 날 수 있다.

본 발명의 핵산의 변이체, 예를 들면 피타아제 효소를 코딩하는 것을 발생시키는 방법들이 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 이들 방법은 주형 핵산에 의해 코딩된 피타아제의 것으로부터 변경되거나 상이한 활성, 또는 변경되거나 상이한 안정성을 갖는 피타아제 효소를 발생시키기 위해서 다양한 조합으로 반복 또는 이용될 수 있다. 이들 방법은 또한, 예를 들면 유전자/메시지 발현, 메시지 번역 또는 메시지 안정성에서의 변형을 발생시키기 위해서, 다양한 조합으로 반복 또는 이용될 수 있다. 또다른 양태에서, 세포의 유전자적 조성은, 예를 들면 생체외에서 유사성 유전자의 변형에 의해, 이어서 세포 내로의 재삽입에 의해 변경된다.

본 발명은 또한 돌연변이 유발 및 예컨대 Verenium Corporation(미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 전 Diversa Corporation)에서 개발한 자체 방법, 예컨대, 유전자 리어셈블리(예컨대 미국 특허 6,537,776호 참조; 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM)(예컨대 미국 특허 6,171,820호 및 6,764,835호 참조), 방향 진화 엑소누클레아제 매개 유전자 어셈블리(예컨대 미국 특허 6,361,974호 및 6,352,842호 참조), 방향 진화 최종 선택(예컨대 미국 특허 6,358,709호 및 6,238,884호 참조), 재조합 베이스 합성 셔플링(예컨대 미국 특허 5,965,408호 및 6,440,668호, 및 오스트레일리아 특허 AU724521호 참조), 호열성 효소의 방향 진화(예컨대 미국 특허 5,830,696호 및 6,335,179호 참조), 및 맞춤형 다부위 결합 어셈블리(예컨대 WO 2009/018449호 참조)를 포함하는 다른 방법에 의하여 본 발명의 피타아제의 특성을 변화시키는 방법을 제공한다.

예컨대 랜덤 PCR 돌연변이 유발[예컨대, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471 참조] 또는 결합적 다중 카세트 돌연변이 유발[예컨대, Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196 참조]과 같은 분자 생물학에 공지된 여러가지 기술을 사용할 수 있다. 별법으로, 핵산, 예컨대 유전자를 랜덤 또는 "추계적" 단편화 후 재조합할 수 있다. 예컨대 미국 특허 6,291,242호; 6,287,862호; 6,287,861호; 5,955,358호; 5,830,721호; 5,824,514호; 5,811,238호; 5,605,793호 참조. 다른 양태에서는, 변형, 부가 또는 결실을, 에러 유발 PCR, 셔플링, 올리고누클레오티드 지향 돌연변이 유발, 어셈블리 PCR, 성적 PCR 돌연변이 유발, 생체내 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 반복적 조화(ensemble) 돌연변이 유발, 지수적 조화 돌연변이 유발, 부위 특이적 돌연변이 유발, 유전자 리어셈블리, 유전자 부위 포화 돌연변이 유발(GSSM), 합성 리게이션 리어셈블리(SLR), 재조합, 반복적 시퀀스 재조합, 포스포티오에이트 변성 DNA 돌연변이 유발, 우라실 함유 주형 돌연변이 유발, 갭 듀플렉스(gapped duplex) 돌연변이 유발, 포인트 미스매치 리페어 돌연변이 유발, 복구 결함 숙주 균주 돌연변이 유발, 화학적 돌연변이 유발, 방사능에 의한 돌연변이 유발, 결실 돌연변이 유발, 제한 선택 돌연변이 유발, 제한 정제 돌연변이 유발, 인공 유전자 합성, 조화 돌연변이 유발, 키메라 핵산 멀티머 생성, 및/또는 이들 방법 및 다른 방법의 조합에 의하여 도입할 수 있다.

본원에서 사용될 때 "유전자 이식 식물 및 종자"는 본 발명의 핵산, 폴리펩티드, 발현 카세트, 클로닝 메카니즘 또는 벡터, 또는 본 발명의 형질감염되거나 형질전환된 세포를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 예컨대 오일, 종자, 잎, 추출물 등과 같은 식물 생성물을 제공한다. 유전자 이식 식물은 쌍자엽(디코트) 또는 단자엽(모노코트)일 수 있다. 본 발명은 또한 이들 유전자 이식 식물 및 종자의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 유전자 이식 식물 또는 식물 세포는 업계에 공지된 임의의 방법에 따라 작제될 수 있다. 예컨대 미국 특허 6,309,872호 참조.

일부 실시양태에서, 피타아제의 세포외 발현을 달성하기 위하여, 본 발명의 발현 작제물은 분비 신호 서열을 이용한다. 식물 숙주종과 상동인(자생) 신호 서열, 이종 신호 서열, 즉 다른 식물 종에서 유래하거나 미생물 기원인 신호 서열도 이용될 수 있으나, 이러한 신호 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 적절한 신호 서열은 문헌[Blobel et al., 1979; Von Heijne, 1986; Garcia et al., 1987; Sijmons et al., 1990; Ng et al., 1994; and Powers et al., 1996)]에 개시되어 있다.

본원에서 사용될 때 "유전자 이식 비인간 동물"은 본 발명의 핵산, 폴리펩티드, 발현 카세트 또는 벡터 또는 형질감염되거나 형질전환된 세포이다. 유전자 이식 비인간 동물은 본 발명의 핵산을 포함하는 예컨대 염소, 토끼, 양, 돼지, 소, 래트 및 마우스일 수 있다. 이들 동물은 예컨대 피타아제 활성을 연구하기 위한 생체내 모델로서 또는 생체내 피타아제 활성 조절인자를 스크리닝하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 유전자 이식 비인간 동물에서 폴리펩티드를 발현시키는 코딩 서열은 구성적이도록 또는 조직 특이적, 발생 특이성 또는 유도가능한 전사 조절 인자하에 설계될 수 있다. 유전자 이식 비인간 동물은 업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 설계 및 발생될 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명의 피타아제는 동물 사료의 첨가제로서 사용된다. 피타아제를 첨가하는 이점 중 일부는 사료에 함유되는 총 인을 증가시키는 것, 분비를 통해 환경으로 방출되는 인을 감소시키는 것 및 다른 무기산 및 아미노산의 소화능을 증가시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 피타아제를 포함하는 동물 사료 또는 보충제가 임의의 동물에 제공될 수 있다. 피타아제는 통상 닭, 육계 또는 알 낳는 암탉; 칠면조; 오리; 돼지, 새끼 돼지 또는 암퇘지와 같은 돼지류; 소와 같은 소류와 같은 가금류용 동물 사료 및 송어, 연어, 틸라피아, 메기 및 농어와 같은 어류용 양식 사료에 포함된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 피타아제를 포함하는 동물 사료는 당업자에게 공지된 임의의 배합으로 동물에게 제공될 수 있다. 동물 사료 제제의 예는 전달 매트릭스, 펠릿, 정제, 젤, 액체, 스프레이, 분쇄 그레인 또는 분말을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 피타아제는 골다공증과 같은 골손실, 악액질 및 영양소의 적절한 흡수 또는 이용을 해칠 수 있는 화학요법과 같은 의약적 치료를 겪는 개체의 치료에 이용된다. 본 발명의 한 양태는 피타아제를 포함하는 약제 또는 식이요법제를 제공하는 것이다. 또한 운동 훈련, 집중적인 신체 훈련, 병원 식이요법, 미량 영양소 부족 시리얼 및 콩류 다이어트, 학교 급식 프로그램 또는 임의의 다른 영양 프로그램을 거치는 개체를 위해 본 발명의 피타아제를 사용하는 것이 업계에서 통상적이다.

일 실시양태에서, 본 발명의 피타아제는 바이오연료 및 바이오매스의 공업적 전환 생성물에 사용된다. 예컨대, 피타아제는 발효 또는 알콜 제조 공정에서 사용된다. 일 실시양태에서, 알콜은 에탄올인데, 이것은 연료용일 수 있거나 마실 수 있는 에탄올이다. 일 실시양태에서, 발효 공정은 전분 또는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및/또는 리그닌과 같은 리그노셀룰로오스 물질과 같은 비전분 식물 재료를 이용할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 피타아제는 증류 건조 가용물(DDS); 증류 건조 그레인(DDG); 응축 건조 가용물(CDS); 증류 습윤 그레인(DWG); 및 가용물을 포함하는 증류 건조 그레인(DDGS)의 처리에 사용된다. 알콜 발효 공정의 이들 부산물은 동물 사료용 성분으로서 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 피타아제는 스케일링을 감소시키고 에탄올 수율을 증가시키기 위해 사용된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 피타아제는 조류, 버진 식물 오일, 폐 식물 오일, 오물을 연료로 전환시키는 데 사용된다.

실시예

실시예 1: 피타아제 비활성

슈도모나스(Pseudomonas) 및 피키아(Pichia)에서 발현되는 피타아제에 대하여 (이하 개시되는 바와 같이) 비활성을 측정하였다. 피타아제 분자의 비활성은 분석된 두 발현계에서의 발현에 의하여 영향을 받지 않았다(도 1 참조). 피키아 세포를 원심분리에 의하여 발효 브로스로부터 제거하고 상청액을 DNAse 처리하고 100 mM TRIS, pH 8.0으로 완충액 교환하였다. 피타아제를 발현시키는 슈도모나스 세포를 미세유동화기를 이용하여 용해하고 원심분리하였다. 상청액을 DNAse 처리하고 100 mM Tris pH 8.0으로 완충액 교환하였다. 이어서 시료를 교환 칼럼(FPLC)에 로딩하고 분획을 수거하였다. 용출된 분획을 활성에 대하여 시험하고 SDS-PAGE에서 실행시키고 순수한 분획을 풀링하였다.

분광광도법(280 nm에서 흡수)에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 펩티드계 소프트웨어 계산기 VECTOR NTI(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재 Life Technologies사)를 이용하여 특정 단백질 흡수 계수(280 nm)를 측정하였다. 펩티드 서열에 기초한 피타아제 분자의 280 nm 계수는 OD₂₈₀ 1.0 = 0.875 mg/mL [서열번호:6(서열번호:4로 코딩됨), 서열번호:6(서열번호:5로 코딩됨), 서열번호:3(서열번호:1로 코딩됨) 및 서열번호:3(서열번호:2로 코딩됨)] 및 0.897 mg/mL(서열번호:8, 서열번호:7로 코딩됨)인 것으로 측정되었다. DNA는 흡수비(260/280 nm)에 기초하여 이하의 측정가능한 값으로 결정되었다.

피타아제 비활성은 피틴산의 탈인산화로부터 유리 인산염을 검출하는 비색분석법을 이용하여 측정하였다. 50 μL의 정제된 피타아제의 알리코트를 예열된(37℃) 950 μL의 기질 혼합물(4 mM 도데카소듐 피테이트 100 mM Na-아세테이트 pH 5.5)에 첨가하였다. 50 uL의 알리코트를 1분마다 빼내어 50 μL 컬러/스톱 용액(몰리브데이트-바나데이트)에서 켄칭하였다. 10분 후, 황색이 완전히 나타났을 때, SpectraMax Plus 흡수율 리더를 이용하여 OD₄₁₅를 측정하였다. 이하 나타내어지는 계산에 의하여 활성을 측정하였다.

1 단위는 효소에 의하여 분당 방출되는 인산염의 μ몰수로서 정의된다.

실시예 2 : 고온에서의 피타아제 활성(DSC Tm)

피타아제의 열안정성을 측정하기 위하여 Perkin-Elmer Pyris 1 시차 주사 열량계(DSC)를 이용하여 피타아제 변종의 융점(Tm)을 측정하였다. Tm 분석은 완충제로서 100 mM 시트레이트를 사용하여 pH 5.5(수성 공급물 추출물과 유사)에서 수행되었다. DSC 런은 10% 소르비톨-10% NaCl 유/무에서 실행되었다. DSC 분석은 10% 소르비톨-10% NaCl이 피타아제의 열안정성을 개선하였음을 나타낸다. 액체 형태에서, 98℃를 초과하는 Tm이 달성되었다(도 2). 슈도모나스 발현 피타아제는 완충액 단독에서는 피키아 발현 피타아제보다 약 1∼2℃ 더 낮은 Tm을 나타내었으나, 이 온도 감소는 10% 소르비톨-10% NaCl이 첨가된 경우에는 관찰되지 않았다(도 3).

실시예 3: pH 프로파일

피키아 또는 슈도모나스에서 발현시의 피타아제의 최적 pH(도 4)는 pH 3.5 내지 pH 4.5로 측정되었다. pH 1.0 내지 pH 5.5의 시험 범위를 커버하기 위한 스위칭 버퍼로부터 나오는 중첩 변수를 제거하기 위해, 상이한 pH 점에서의 피트산 기질에 대한 피타아제의 활성을 브리톤-로빈슨 버퍼를 사용하여 측정하였다. 상이한 pH에서의 활성을 4의 최적 pH로 정규화하였다.

실시예 4: 저 pH(모의 위액(SGF)) 조건에서의 피타아제 활성 및 pH 프로파일

60 분의 시간 경과에 걸쳐 pH 1.2의 모의 위액(SGF) 중에서 피타아제 분자를 처리하여 위 안정성을 평가하였다. 피타아제 1 ㎍당 10 펩신 단위로 펩신을 SGF에 첨가하였다. 10, 30 및 60 분에서, 분취량의 SGF-피타아제 혼합물을 제거하고, 200 mM Na-탄산염 버퍼 pH 11.0 중에 켄칭하였다. 그 다음, SDS-PAGE에 의해 샘플을 분석하여 단백질 소화 정도를 측정하였다. SDS-PAGE(도 5) 결과는, 서열 번호 8(서열 번호 7에 의해 코딩됨) 분자에 대한 피타아제 띠가 SGF+ 펩신 처리 10 분 이내에 분해됨을 증명하였다. 피키아(서열 번호 3(서열 번호 2에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6(서열 번호 5에 의해 코딩됨)) 및 슈도모나스(서열 번호 3(서열 번호 1에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6(서열 번호 4에 의해 코딩됨))에서 발현된 다른 피타아제 분자는 60 분 후 최소 분해를 나타냈다.

이전 보고에 기초하여, 이 콜라이 wt appA 피타아제는 2.4 분의 SGF 반감기를 나타냈다(Garrett et al, 2004). 서열 번호 8(서열 번호 7에 의해 코딩됨)의 피타아제는 10 분 후 실질적으로 활성을 갖지 않았고, 다른 피타아제(서열 번호 3(서열 번호 2에 의해 코딩됨), 서열 번호 6(서열 번호 5에 의해 코딩됨), (서열 번호 3(서열 번호 1에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6(서열 번호 4에 의해 코딩됨))는 60 분 후 무손상 단백질(도 5) 및 활성(도 6)을 유지하였다.

실시예 5: 피타아제 발현

피키아 발현계는 RCT가 라이센스를 갖는 피키아 파스토리스 GS115 균주 및 메탄올 유도성 프로모터(AOX)를 이용한다. 피타아제를 발효 배지에 분비시켰다. 피키아에서 발현되는 서열 번호 3(서열 번호 2에 의해 코딩됨)의 피타아제를 30 L 발효통에서 시험하여, 120 시간 후 7.0 g/L를 달성하였다. 피타아제 서열 번호 6(서열 번호 5에 의해 코딩됨)의 발효 결과는 7.0 g/L 미만이었다.

DOW로부터의 슈도모나스 발현계는 pDOW1169(IPTG에 의해 유도 가능)에 삽입된 피타아제 서열을 갖는 균주(DC454)를 이용한다. 피타아제를 세포내 발현시켰고, 이에 따라 피타아제 회수를 위한 세포 용해가 필요하였다(도 7 참조). 슈도모나스에서의 세포내 피타아제(서열 번호 3(서열 번호 1에 의해 코딩됨) 및 서열 번호 6(서열 번호 4에 의해 코딩됨)) 발현에 대한 3 회 결과는 약 5 g/L 내지 35.0 g/L 범위였다.

SEQUENCE LISTING <110> VERENIUM CORPORATION <120> Phytase <130> VEREN.067WO/D2500-1WO <140> Filed herewith <141> Filed herewith <150> US 61/777,139 <151> 2013-03-12 <150> GB 1308828.1 <151> 2013-05-16 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polynucleotide <400> 1 atgcagagcg agccggagct gaagctggaa agcgtggtga ttgtcagccg tcatggtgtg 60 cgtgctccaa ccaaggctac gcaactgatg caggatgtca ccccagacgc atggccaacc 120 tggccggtaa aactgggtga gctgacaccg cgcggtggtg agctaatcgc ctatctcgga 180 cattactggc gtcagcgtct ggtagccgac ggattgctgc ctaaagaagg ctgcccgcag 240 tctggtcagg tcgcgattat tgctgatgtc gacgagcgta cccgtaaaac aggcgaagcc 300 ttcgccgccg ggctggcacc tgactgtgca ataaccgtac atcatcaggc agatacgtcc 360 agtcccgatc cgttatttaa tcctctaaaa actggcgttt gccaactgga tgtcgcgaac 420 gtgagacggg cgatcctcag aagggcagga gggtcaattg ctgactttac ccggcattat 480 caaacggcgt ttcgcgaact ggaacgggtg cttaattttc cgcaatcaaa cttgtgcctt 540 aaacgtgaga aacaggacga 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Val His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 115 120 125 Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala 130 135 140 Ile Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Arg His Tyr 145 150 155 160 Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 165 170 175 Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 180 185 190 Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asp Val Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu 210 215 220 Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp 225 230 235 240 Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp 245 250 255 Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln 275 280 285 Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His 290 295 300 Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe 325 330 335 Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser 340 345 350 Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu 370 375 380 Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile 385 390 395 400 Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 405 410 <210> 4 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polynucleotide <400> 4 atgcagagcg agccggagct gaagctggaa agcgtggtga ttgtcagtcg tcatggtgtg 60 cgtgctccaa ccaaggctac gcaactgatg caggatgtca ccccagacgc atggccaacc 120 tggccggtaa aactgggtga gctgacaccg cgcggtggtg agctaatcgc ctatctcgga 180 cattactggc gtcagcgtct ggtagccgac ggattgctgc ctaaagaagg ctgcccgcag 240 tctggtcagg tcgcgattat tgctgatgtc gacgagcgta cccgtaaaac aggcgaagcc 300 ttcgccgccg ggctggcacc tgactgtgca ataaccgtac atcatcaggc agatacgtcc 360 agtcccgatc cgttatttaa tcctctaaaa actggcgttt gccaactgga tgtcgcgaac 420 gtgactcggg cgatcctcag aagggcagga gggtcaattg ctgactttac ccggcattat 480 caaacggcgt ttcgcgaact ggaacgggtg cttaattttc cgcaatcaaa cttgtgcctt 540 aaacgtgaga aacaggacga aagctgttca ttaacgcagg cattaccatc ggaactcaag 600 gtgagcgccg acgatgtctc attaaccggt gcggttagcc tcgcatcaat gctgacggag 660 atatttctcc tgcaacaagc acagggaatg ccggagccgg ggtggggaag gatcaccgat 720 tcacaccagt ggaacacctt gctaagtttg cataacgcgg tgtttgattt gctacaacgc 780 acgccagagg ttgcccgcag ccgcgccacc ccgttattag atttgatcaa gacagcgttg 840 acgccccatc caccgcaaaa acaggcgtat ggtgtgacat tacccacttc agtgctgttt 900 atcgccggac acgatactaa tctggcaaat ctcggcggcg cactggagct caactggacg 960 cttcccggtc agccggataa ctatccgcca ggtggtgaac tggtgtttga acgctggcgt 1020 cggctaagcg ataacagcca gtggattcag gtttcgctgg tcttccagac tttacagcag 1080 atgcgtgata aaacgccgct gtcattaaat acgccgcccg gagaggtgaa actgaccctg 1140 gcaggatgtg aagagcgaaa tgcgcagggc atgtgttcgt tggcaggttt tacgcaaatc 1200 gtgaatgaag cacgcatacc ggcgtgcagt ttgtgatgac tcgagcccaa aacgaaaggc 1260 tcagtc 1266 <210> 5 <211> 1230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polynucleotide <400> 5 cagagtgagc cggagctgaa gctggaaagt gtggtgattg tcagtcgtca tggtgtgcgt 60 gctccaacca aggctacgca actgatgcag gatgtcaccc cagacgcatg gccaacctgg 120 ccggtaaaac tgggtgagct gacaccgcgc ggtggtgagc taatcgccta tctcggacat 180 tactggcgtc agcgtctggt agccgacgga ttgctgccta aagaaggctg cccgcagtct 240 ggtcaggtcg cgattattgc tgatgtcgac gagcgtaccc gtaaaacagg cgaagccttc 300 gccgccgggc tggcacctga ctgtgcaata accgtacatc atcaggcaga tacgtccagt 360 cccgatccgt tatttaatcc tctaaaaact ggcgtttgcc aactggatgt cgcgaacgtg 420 actcgggcga tcctcagaag ggcaggaggg tcaattgctg actttacccg gcattatcaa 480 acggcgtttc gcgaactgga acgggtgctt aattttccgc aatcaaactt gtgccttaaa 540 cgtgagaaac aggacgaaag ctgttcatta acgcaggcat taccatcgga actcaaggtg 600 agcgccgacg atgtctcatt aaccggtgcg gttagcctcg catcaatgct gacggagata 660 tttctcctgc aacaagcaca gggaatgccg gagccggggt ggggaaggat caccgattca 720 caccagtgga acaccttgct aagtttgcat aacgcggtgt ttgatttgct acaacgcacg 780 ccagaggttg cccgcagccg cgccaccccg ttattagatt tgatcaagac agcgttgacg 840 ccccatccac cgcaaaaaca ggcgtatggt gtgacattac ccacttcagt gctgtttatc 900 gccggacacg atactaatct ggcaaatctc ggcggcgcac tggagctcaa ctggacgctt 960 cccggtcagc cggataacta tccgccaggt ggtgaactgg tgtttgaacg ctggcgtcgg 1020 ctaagcgata acagccagtg gattcaggtt tcgctggtct tccagacttt acagcagatg 1080 cgtgataaaa cgccgctgtc attaaatacg ccgcccggag aggtgaaact gaccctggca 1140 ggatgtgaag agcgaaatgc gcagggcatg tgttcgttgg caggttttac gcaaatcgtg 1200 aatgaagcac gcataccggc gtgcagtttg 1230 <210> 6 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polypolypeptide <400> 6 Met Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp 20 25 30 Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu 35 40 45 Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg 50 55 60 Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Glu Gly Cys Pro Gln 65 70 75 80 Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys 85 90 95 Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr 100 105 110 Val His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 115 120 125 Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala 130 135 140 Ile Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Arg His Tyr 145 150 155 160 Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 165 170 175 Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 180 185 190 Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asp Val Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu 210 215 220 Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp 225 230 235 240 Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp 245 250 255 Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln 275 280 285 Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His 290 295 300 Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe 325 330 335 Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser 340 345 350 Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu 370 375 380 Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile 385 390 395 400 Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 405 410 <210> 7 <211> 1230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polynucleotide <400> 7 cagagtgagc cggagctgaa gctggaaagt gtggtgattg tcagtcgtca tggtgtgcgt 60 gctccaacca aggccatgca actgatgcag gatgtcaccc cagacgcatg gccaacctgg 120 ccggtaaaac tgggtgagct gacaccgcgc ggtggtgagc taatcgccca tctcggacat 180 tactggcgtc agcgtctggt agccgacgga ttgctgccta aatgtggctg cccgcagtct 240 ggtcaggtcg cgattattgc tgatgtcgac gagcgtaccc gtaaaacagg cgaagccttc 300 gccgccgggc tggcacctga ctgtgcaata accgtacata cccaggcaga tacgtccagt 360 cccgatccgt tatttaatcc tctaaaaact ggcgtttgcc aactggatgt ggcgaacgtg 420 agacgtgcga tcctcgagag ggcaggaggg tcaattgctg actttaccgg gcattatcaa 480 acggcgtttc gcgaactgga acgggtgctt aattttccgc aatcaaactt gtgccttaaa 540 cgtgagaaac aggacgaaag ctgttcatta acgcaggcat taccatcgga actcaaggtg 600 agcgccgact gtgtctcatt aaccggtgcg gtaagcctcg catcaatgct gacggagata 660 tttctcctgc aacatgcaca gggaatgccg gagccggggt ggggaaggat caccgattca 720 caccagtgga acaccttgct aagtttgcat aacgcggtgt ttgatttgct acaacgcacg 780 ccagaggttg cccgcagccg cgccaccccg ttattagatt tgatcaagac agcgttgacg 840 ccccatccac cgcaaaaaca ggcgtatggt gtgacattac ccacttcagt gctgtttatc 900 gccggacacg atactaatct ggcaaatctc ggcggcgcac tggagctcga atggacgctt 960 cccggtcagc cggataacta tccgccaggt ggtgaactgg tgtttgaacg ctggcgtcgg 1020 ctaagcgata acagccagtg gattcaggtt tcgctggtct tccagacttt acagcagatg 1080 cgtgataaaa cgccgctgtc attaaatacg ccgcccggag aggtgaaact gaccctggca 1140 ggatgtgaag agcgaaatgc gcagggcatg tgttcgttgg caggttttac gcaaatcgtg 1200 aatgaagcac gcataccggc gtgcagtttg 1230 <210> 8 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated polypeptide <400> 8 Met Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser 1 5 10 15 Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Met Gln Leu Met Gln Asp 20 25 30 Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu 35 40 45 Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala His Leu Gly His Tyr Trp Arg 50 55 60 Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln 65 70 75 80 Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys 85 90 95 Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr 100 105 110 Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 115 120 125 Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala 130 135 140 Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr 145 150 155 160 Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 165 170 175 Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 180 185 190 Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser Leu 195 200 205 Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu 210 215 220 Gln His Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp 225 230 235 240 Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp 245 250 255 Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu 260 265 270 Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln 275 280 285 Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His 290 295 300 Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Glu Trp Thr 305 310 315 320 Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe 325 330 335 Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser 340 345 350 Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser 355 360 365 Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu 370 375 380 Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile 385 390 395 400 Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 405 410

Claims (27)

1. 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 단리된, 재조합 또는 합성 핵산으로서,
   (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 5의 서열을 포함하는 핵산;
   (b) 서열 번호 3 또는 서열 번호 6의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;
   (c) (a) 또는 (b)의 핵산 단편으로서, 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 단편; 및
   (d) (a), (b) 또는 (c)의 전장 서열에 상보적인 핵산
   으로 이루어진 군에서 선택되는, 단리된, 재조합 또는 합성 핵산.
2. 피타아제 활성을 갖는, 단리된, 재조합 또는 합성 폴리펩티드로서,
   (a) 서열 번호 3 또는 서열 번호 6의 서열을 포함하는 아미노산 서열;
   (b) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 5를 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 및
   (c) 서열 번호 3 또는 서열 번호 6의 단편을 포함하는 아미노산 서열로서, 상기 단편은 피타아제 활성을 갖는 아미노산 서열
   로 이루어진 군에서 선택되는, 단리된, 재조합 또는 합성 폴리펩티드.
3. 제2항에 있어서, 폴리펩티드는
   (a) 신호 서열, 전구 단백질(proprotein) 서열, 프로모터 서열 또는 이의 임의의 조합을 포함하지 않거나, 또는
   (b) 신호 서열, 태그, 에피토프, 프로모터 서열, N-말단 연장체, C-말단 연장체 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 이종 서열을 더 포함하는 것인 단리된, 재조합 또는 합성 폴리펩티드.
4. 제2항에 있어서, 폴리펩티드는
   (a) 적어도 제2 효소를 더 포함하거나, 또는
   (b) (a)의 폴리펩티드에서, 제2 효소는 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 크실라나아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭시드 히드롤라아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로비오히드롤라아제, 암모니아 리아제 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 단리된, 재조합 또는 합성 폴리펩티드.
5. 제2항에 있어서, 피타아제는
   (a) 1000 U/mg 내지 1,600 U/mg의 비활성을 갖거나,
   (b) 적어도 pH 1.0 내지 pH 9.0의 pH에서 활성이거나, 또는
   (c) 50℃ 내지 100℃의 온도에서 활성인 것인 단리된, 재조합 또는 합성 폴리펩티드.
6. 서열 번호 3 및 서열 번호 6으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된, 재조합 또는 합성 폴리펩티드.
7. (a) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 피티아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 또는
   (b) 서열 번호 1을 포함하는 핵산 서열로서, 상기 핵산 서열은 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 핵산 서열
   을 포함하는, 단리된, 재조합 또는 합성 핵산.
8. 제2항의 단리된, 재조합 또는 합성 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서,
   (a) 식품 또는 사료, 또는
   (b) 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 식이 보조제
   에 사용하기 위한 것인 조성물.
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