CN1197963C - 固态肌醇六磷酸酶组合物 - Google Patents

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Abstract

用乳酸源例如玉米浆(CSL)稳定的固态酶(尤其是肌醇六磷酸酶)组合物，及其制备方法。优选的组合物另外包含淀粉和二糖(比如乳糖或海藻糖)。

Description

固态肌醇六磷酸酶组合物
发明领域
向动物饲料中添加肌醇六磷酸酶来消除肌醇六磷酸对营养成分的破坏作用已有详细描述，可参见例如WO98/28408和WO98/28409。
本发明涉及用乳酸源例如玉米浆(CSL)稳定的固态肌醇六磷酸酶组合物，及其制备方法。
发明背景
WO9316175中公开了用尿素、甘油或山梨醇来稳定液态肌醇六磷酸酶制品。
EP0758018 A1中公开了盐稳定的固态肌醇六磷酸酶组合物。
植物种子、谷物和豆类是动物饲料的常规组分。这些种子有一些含有肌醇六磷酸，经常也含有内源的肌醇六磷酸酶。
根据申请人的研究，动物饲料中的内源肌醇六磷酸酶活性非常低，大约0.5单位/g。
根据例如上面引用的两篇WO文献，向饲料中补加肌醇六磷酸酶时，饲料中的肌醇六磷酸酶活性在0.01-20单位/g的范围内。
发明概述
本发明涉及固态肌醇六磷酸酶组合物，其包含(a)一种具有肌醇六磷酸酶活性的酶；和(b)一种乳酸源，其中该组合物的肌醇六磷酸酶活性在20单位/g以上。
发明详述
在本文中，术语“具有肌醇六磷酸酶活性的酶(或多肽)”或者“肌醇六磷酸酶”包括任何能影响无机磷酸根从肌醇六磷酸或其某种盐中释放出来的酶。
肌醇六磷酸是肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸二氢盐(或者简称为肌醇六磷酸二氢盐)。在下文中，除非另外说明，术语“肌醇六磷酸”和“肌醇六磷酸盐”同义或者随机使用。
在本文中，术语“单位”表示酶，尤其是肌醇六磷酸酶的活性单位。可以使用任何测定肌醇六磷酸活性的方法。
在一个优选实施方案中，一个肌醇六磷酸酶活性单位定义为在下列条件下，每分钟能释放1微摩尔无机正磷酸的酶量：pH在实际酶的最适pH的+/-1 pH单位范围内；温度在实际酶的最适温度+/-20℃范围内；以适当浓度的肌醇六磷酸或其盐为底物。
优选地，所述底物是浓度为0.005摩尔/l的肌醇六磷酸十二钠。
优选地，所述pH在最适pH的+/-0.5 pH单位范围内；更优选pH是最适pH。
优选地，所述温度在最适温度+/-10℃范围内；更优选温度是最适温度。
优选地，最适pH和温度是指以肌醇六磷酸钠作为底物。
在另一个优选实施方案中，肌醇六磷酸酶活性测定为FYT单位，一个FYT是在下列条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸的酶量：pH5.5；温度37℃；底物：0.005摩尔/l的肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)。
在另一个优选实施方案中，采用FTU检测法测定肌醇六磷酸酶活性。
FYT-和FTU法在实验部分有更详细的描述。
在优选实施方案中，发明所述固态组合物的肌醇六磷酸酶活性在25、50、100、250、500、750或甚至1000单位/g以上。
任选地，固态组合物的肌醇六磷酸酶活性低于100000单位/g，更优选低于75000单位/g，还要优选的是低于50000单位/g，或者低于40000单位/g，或者低于25000单位/g，或甚至低于10000单位/g，最优选低于5000单位/g。
优选的肌醇六磷酸酶活性范围是25-100000、25-75000、35-50000或者50-40000单位/g；更优选100-25000单位/g；更优选500-10000单位/g；最优选1000-5000单位/g。
在本文中，可以使用任何具有肌醇六磷酸酶活性的酶。
已经从植物和微生物中获得了肌醇六磷酸酶。在微生物中，产肌醇六磷酸酶的细菌和真菌是已知的。在植物界，已经知道有一种小麦麸肌醇六磷酸酶(Thomlinson等，生物化学1(1962)：166-171)。Barrientos等(植物生理学106(1994)：1489-1495)描述过一种来自百合花粉的碱性肌醇六磷酸酶。
在细菌中，对来源于枯草芽孢杆菌(Paver和Jagannathan，1982，细菌学杂志151：1102-1108)和假单胞菌(Cosgrove，1970，澳大利亚生物科学杂志23：1207-1220)的肌醇六磷酸酶已有描述。再次，Greiner等提纯和鉴定过来源于大肠杆菌的肌醇六磷酸酶(古生物化学和生物物理学303：107-113，1993)。
还有人描述过产肌醇六磷酸酶的酵母，比如酿酒酵母(Nayini等，1984，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17：24-26)。但是，该酶可能是肌醇单磷酸酶(Wodzinski等，现代应用微生物学42：263-303)。AU-A-24840/95描述了克隆和表达西方许旺氏酵母的肌醇六磷酸酶。
已有人对产肌醇六磷酸酶的丝状真菌(主要属于子囊菌门(ascomycetes))作过描述。特别是有几篇文献涉及曲霉属的产肌醇六磷酸酶子囊菌，比如土曲霉(Yamada等，1986，农业生物化学322：1275-1282)。还描述过来自黑曲霉泡盛变种的肌醇六磷酸酶基因的克隆和表达(Piddington等，1993，基因133：55-62)。EP0420358描述了无花果曲霉(黑曲霉)的肌醇六磷酸酶的克隆和表达。EP0684313描述了子囊菌嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和土曲霉的肌醇六磷酸酶的克隆和表达。
WO98/28409和WO98/28408描述了来源于担子菌门的真菌的肌醇六磷酸酶。
通过本领域已知的方法，尤其是EP0897010、EP0897985、PCT/DK99/00153和PCT/DK99/00154中公开的方法可以获得修饰过的肌醇六磷酸酶或肌醇六磷酸酶变体。在这四篇专利申请中公开的肌醇六磷酸酶也可以用于本发明所述的组合物。
所述固态或干组合物是一种微粒状材料，包含，优选基本上或者就是由大小在0.01或1.0(μm)以上，或者优选在1左右到1000，或者到1200，或到1500，甚至到2000(μm)的自由漂浮颗粒组成。
优选地，所述固态或干肌醇六磷酸酶组合物是这样一种组合物，该组合物可以由液态肌醇六磷酸酶浓缩物通过例如喷雾干燥、喷雾冷却(成粒)或者任何形式的造粒来制备。
对于喷雾干燥，不需要向液态肌醇六磷酸酶浓缩物中加入其他成分。
对于喷雾冷却，以一种可熔化性成分—比如棕榈油(和/或另一种可熔化性植物油或脂肪)、氢化棕榈油(和/或另一种氢化植物油)、动物脂、氢化动物脂或蜡作为基质。将肌醇六磷酸酶和其他成分(如果有的话)引入熔化好的可熔化成分，然后让熔化的材料在能形成颗粒的条件下，通常是在喷雾干燥塔中进行固化。
但是对于许多用途，包括用在动物饲料中，一般优选形成粒状有几个原因。一个原因是它们易于与饲料成分混合，或者更优选，构成预混合料(它含有其他所需饲料添加剂比如维生素和矿物质)的一种成分。
酶颗粒的微粒大小优选与混合物中其他成分相当。这就提供了一种将酶掺入例如动物饲料中的安全和方便的手段。
微粒大小可以看做是微粒的最大长径；因此，对于例如基本上是圆形的微粒(比如基本上圆形颗粒)，所指微粒大小是微粒的直径。
利用凝聚技术在一个高剪切搅拌器(例如Lodige)中可以制备凝聚颗粒和凝聚粉末，在该过程中一或多种填料物质与酶共凝聚形成颗粒。
吸附颗粒的制备是使一或多种载体物质吸附上酶或者用酶包被。
典型的填料物质是盐，比如硫酸二钠和木素磺酸钙。其他填料包括硅、石膏、高岭土、云母、硅酸镁铝和纤维素纤维。任选，凝聚颗粒中还包括粘合剂比如糊精。
典型的载体材料可以包括合适微粒大小的微粒核。所述载体可以是水溶性或水不溶性的，例如，木薯或小麦形式的淀粉；或者是糖，比如蔗糖或乳糖，或者是一种盐，比如氯化钠或硫酸钠。
任选地，所述颗粒外裹包被混合物。这类混合物含有包被剂，优选疏水性包被剂，比如氢化棕榈油和牛脂，如果需要，还有其他添加剂，比如碳酸钙或高岭土。
WO97/39116公开了制备含酶细粒或含酶颗粒形式的本发明所述固态组合物的优选方法，具体参见发明详述部分，其中头状核心、粘合剂、填料、增塑剂、纤维材料、超吸附剂、包被层、酶、其他添加成分(这些部分此处引入作为参考文献)。但是，WO97/39116没有公开固态组合物中包含乳酸源。
制备肌醇六磷酸酶颗粒的优选方法参见实施例3。
优选的发明所述固态组合物是酶组合物。优选的组合物是浓缩的，即活性在20单位/g以上。因此，固态酶组合物的概念具体包括，但不限于，喷雾干燥的酶制品、酶颗粒，例如包被和未包被的凝聚颗粒和吸附颗粒，以及动物饲料的含酶预混合料。肌醇六磷酸酶是优选的酶。
可以例如如下制备液态酶(肌醇六磷酸酶)浓缩物：酶源(通常是含有肌醇六磷酸酶的发酵液)进行初级分离步骤(例如利用倾析器、离心机或加压滤器)，然后进行次级磨光过滤和/或微生物过滤。最后将液体浓缩，例如利用超滤，然后微生物过滤。典型的干物质含量是10-30％、优选15-25％，更优选17-22％。
在本文中，“一个”通常表示“一或多个”或者“至少一个”。这适用于发明所述组合物的如下必需或任选的成分：肌醇六磷酸酶、乳酸源、CSL、淀粉、二糖、填料、载体。
除非另外说明，所有百分数表示为重量/重量的干物质含量。优选，“单位/g”也表示干物质含量。通过本领域已知的任何方法，比如用折射计或者在烤箱中干燥以释放出水分，可以确定干物质含量。
除非另外说明，术语“以上”一般表示“≥”，而术语“达到”或“低于”表示“≤”。
在本文中，“乳酸源”或“乳酸制品”是任何含有乳酸化合物或任意乳酸盐，即乳酸形成的任意盐(乳酸是2-羟基丙酮酸)的组合物。同样，此处使用的“乳酸”包括任何乳酸盐。这些术语可以互换使用表示乳酸源，代表乳酸，及其干物质部分。
乳酸源的非限制性列表是：比较纯的化学化合物形式的乳酸和乳酸盐(纯度在70％、80％、90％以上)；较不纯物质形式的乳酸和乳酸盐(纯度在5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％以上)；任何天然或合成组合物，其所含乳酸量在5％，优选在10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、70％、80％、90％以上。
优选本发明的固态酶组合物中包含的乳酸达到20、优选15、更优选10，还要优选的是9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75或0.5％。乳酸含量优选在0.001以上，优选在0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28或者0.3％以上。乳酸含量的优选范围是0.01-10％、0.02-9％、0.03-8％、0.04-7％、0.05-6％、0.06-7％、0.07-6％、0.08-5％、0.09-4％或者0.1-3％。
可以使用任何乳酸检测法。优选的乳酸检测法来自SIGMA：(1)检测试剂盒货号735-10(酶法检测，在有氧化酶的情况下，乳酸盐降解为丙酮酸盐和过氧化氢)；或者(2)检测试剂盒货号826-A和826-B(在有乳酸盐脱氢酶和NAD的情况下，紫外线、终点、乳酸盐转化为丙酮酸)。
优选的乳酸盐是玉米浆或者CSL。CSL是一种商品，参见例如MerckIndeks，1996，第4版，索引号2598。它是一种通过将玉米浸液浓缩得到的粘性黄色或深褐色液体。干物质含量通常是45-55％、优选48-52％。pH在3-5，优选3.5-4.5。蛋白质含量(干物质)通常是30-50％、优选35-45％。酸度(乳酸)通常是10-30％(干物质)，优选12-25％。
此处所用“CSL”是指该产品本身，或者其干物质部分。
在一个优选实施方案中，本发明的固态组合物含有0.01-15％、优选0.1-10％，更优选1-5％的CSL。
可以使用任何方法来分析CSL含量。实施例8中描述了一种优选的鉴定和定量CSL的HPLC方法。另外一种优选方法是顶空气相色谱(HS-GC)，优选与质谱(MS)联合使用。
在一个优选实施方案中，本发明的固态组合物另外含有淀粉源，通常含量在0.1-20％、更优选在0.2-10％、还要优选的是1-5％。
淀粉源的概念包括任何含有以α-1，4-或α-1，6-键连接起来的葡萄糖单元的天然或合成多糖。纯度优选在10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。优选的淀粉源是小麦淀粉，它是一种商品。术语“淀粉源”包括淀粉和上文WO9739116中头状“核心”部分所描述的修饰过的淀粉。
在另一个优选实施方案中，本发明的固态组合物还包含一种二糖，优选含量在0.01-15％，更优选0.1-10％，还要优选的是1-5％。
二糖的概念包括任何天然或合成二糖，无论是什么单体和连接类型。这类二糖的例子是麦芽糖、乳糖、纤维二糖、蔗糖、海藻糖(非限制性举例)。优选地，所述二糖纯度在10、20、30、40、50、60、70、80或甚至90％以上。优选的二糖是乳糖和海藻糖(α-D-葡萄糖α-D-吡喃葡萄糖苷，α-1，1连接)。
在本发明的方法中，所有步骤，例如权利要求14中阐述的步骤，可以同时进行或顺序进行。例如步骤(i)和(ii)顺序地或者优选同时进行(将乳酸源和肌醇六磷酸酶混匀然后喷洒到载体上)；步骤(iii)和(iv)同时或者顺序地，优选同时地在相同容器中进行；这也适用于权利要求12中的“与…一起”。
本发明的其他优选实施方案是下列：
一种固态组合物，其包含至少一种具有肌醇六磷酸酶活性的酶，以及玉米浆(CSL)，其中该组合物的肌醇六磷酸酶活性在20-50000单位/g。优选的CSL含量是0.01-15％(干物质含量，w/w)。优选地，所述组合物另外含有小麦淀粉(WS)，优选含量在0.01-20％(干物质含量，w/w)。
一种制备颗粒组合物的方法，所述组合物具有的肌醇六磷酸酶活性在20-50000单位/g，该方法包括步骤(i)将液态肌醇六磷酸酶浓缩物喷洒到载体上；(ii)将CSL喷洒到载体上；(iii)混合；以及(iv)干燥。
一种制备喷雾干燥的固态组合物的方法，所述组合物具有的肌醇六磷酸酶活性在20-50000单位/g，该方法包括将在喷雾干燥之前，将CSL加入液态肌醇六磷酸酶浓缩物的步骤。
在本实施例中制备的固态肌醇六磷酸酶组合物在储存前，活性在1000-3000FTU/g的范围内。
实施例1
FYT检测
将10μl稀释过的酶样品(在0.1M醋酸钠、0.01％吐温20，pH5.5中稀释)加入250μl溶于0.1M醋酸钠、0.01％吐温20(pH5.5)的5mM肌醇六磷酸钠(Sigma)(溶解肌醇六磷酸钠后调节pH，底物预热)中，于37℃保温30分钟。加入250μl 10％TCA终止反应，加入500μl溶在100ml钼酸盐试剂(2.5g(NH4)6Mo7O24.4H2O溶于8ml H2SO4，稀释至250ml)中的7.3g FeSO4来测定游离磷酸的量。在96孔微量板中测定200μl样品的750nm吸光度。包括底物和酶空白。还包括一个磷酸盐标准曲线(0-2mM磷酸盐)。1个FYT等于在给定条件下释放1μmol磷酸盐/min的酶量。
FTU检测
一个FTU定义为在标准条件(37℃，pH5.5；反应时间60分钟，肌醇六磷酸起始浓度为5mM)下，每分钟释放相当于1μmol磷酸盐的磷酸根的酶量。
1FTU＝1FYT
优选用FTU检测法来测定动物饲料预混合料以及类似复杂组合物的肌醇六磷酸酶活性
试剂/底物
用于饲料等的提取缓冲液
这种缓冲液也用于制备PO4标准液以及预混合料样品的进一步稀释。
含有吐温20的0.22M醋酸盐缓冲液，pH5.5
每升称30g三水合醋酸钠(MW＝136.08g/mol)(例如Merck Art 46267)和0.1g吐温20(例如Merck Art22184)。
将醋酸钠溶于去矿质水中。
加入吐温20，用醋酸将pH调到5.50±0.05。
加入去矿质水至终体积。
用于预混合料的提取缓冲液
含有吐温20、EDTA、PO4 3-og BSA的0.22M醋酸盐缓冲液
每升30g三水合醋酸钠(例如Merck Art 6267)，
每升0.1g吐温20(例如Merck Art22184)，
每升30g EDTA(例如Merck Art 8418)，
每升20g Na2HPO4.2H2O(例如Merck Art 6580)，
每升0.5g BSA(牛血清清蛋白，例如Sigma Art A-9647)
将各成分溶于去矿质水中，用醋酸将pH调节至5.50±0.05。
加入去矿质水至终体积。
BSA不稳定，因此必须在缓冲液使用当天加入。
50mMPO4 3- 储液
称量0.681g KH2PO4(MW＝136.09g/mol)，例如Merck Art 4873，溶解在100ml含有吐温的0.22M醋酸钠(pH5.5)中。
储存稳定性：冰箱中1周。
不含吐温的0.22M醋酸盐缓冲液(pH5.5)
这种缓冲液用于制备肌醇六磷酸底物。
称量150g三水合醋酸钠(MW＝136.08)例如，Merck Art 6267，溶于去矿质水中，用醋酸将pH调节至5.50±0.05。
加入去矿质水至5000ml。
储存稳定性：室温1周。
肌醇六磷酸底物：5mM肌醇六磷酸
肌醇六磷酸的体积计为所用容量扣除含水量。
如果含水量是例如8.4％，得到下式：
0.005mol/l×923.8g/mol＝5.04g/l
(1÷0.084)
称量肌醇六磷酸(Na-盐)(MW＝923.8g/mol)(例如Sigma P-8810)，溶解在0.22M醋酸盐缓冲液(没有吐温)中。添加(稀释的)醋酸能提高溶解速度。
用醋酸将pH调节到5.50±0.05。
加入0.22M醋酸盐缓冲液至终体积。
21.7％硝酸溶液
作为反应终止液。
将1份浓(65％)硝酸与2份去矿质水混合。
钼酸盐试剂
作为反应终止液。
100g四水合庚钼酸铵(NH4)6Mo7O24，4H2O(例如Merck Art 1182)溶解在去矿质水中。加入10ml 25％NH3。
加入去矿质水至1升。
0.24％钒酸铵
购自Bie & Berntsen。
钼酸盐/钒酸盐反应终止液
1份钒酸盐溶液(0.24％钒酸铵)与1份钼酸盐溶液混合。加入2份21.7％硝酸溶液。
该溶液在用前两小时内配制，瓶子包在锡箔内。
样品
冷冻样品在冰箱中过夜解冻。
饲料样品的样品体积：至少70g，优选100g。
饲料样品
选择溶液体积以便能加入样品重量10倍的缓冲液，例如100g溶解在1000ml含有吐温的0.22M醋酸盐缓冲液中。参见附录1，四舍五入(round up to)到最接近的溶液体积。
如果样品大小是大约100g，将所有样品在咖啡磨内磨碎，随后放在配衡烧杯中。记录样品重量。没有成粒的样品不必研磨。如果样品大得难以处理，就将样品分散成大约100g的份额。
在烧杯中放入磁铁，加入含有吐温的0.22M醋酸盐缓冲液。
将样品提取90分钟。
提取后，样品放置30分钟以便饲料沉积。用吸液管取5ml样品。样品取自溶液液面下2-5cm，将其放入玻璃离心管中，盖上盖子。
样品于4000rpm离心10分钟。
预混合料样品
选择溶液体积以便能加入样品重量10倍的缓冲液，四舍五入(round up to)到最接近的溶液体积。
如果样品称重在50-100g，将所有样品放在配衡烧杯中。记录样品重量。如果样品大得难以处理，将其分散成大约100g的份额。
在烧杯中放入磁铁，加入含有吐温、EDTA和PO4 3-的0.22M醋酸盐缓冲液。
将样品提取60分钟。
提取后，样品放置30分钟以便预混合料沉积。用吸液管取5ml样品。样品取自溶液液面下2-5cm，将其放入玻璃离心管中，盖上盖子。
样品于4000rpm离心10分钟。
分析
直接分析饲料样品的提取物。
预混合料的提取物稀释到大约1.5FTU/g(A415(主要样品)＜1.0)。
稀释使用含有吐温20的0.22M醋酸盐缓冲液。
主要样品
将2×100ml来自经过提取并离心的样品的上清液移入标记好的玻璃试管中，并在每个管中放入磁铁。
所有样品准备好后，将它们搅拌放在水浴上。温度：37℃。
加入3.0ml底物。
加入底物后，保温整整60分钟。
从水浴上取下样品，加入2.0ml反应终止液(加入底物后刚好60分钟)。
将样品搅拌1分钟或更长时间。
饲料样品于4000rpm离心10分钟(预混合料样品不需离心)。
盲试样品
将100ml来自经过提取并离心的样品的上清液移入标记好的玻璃试管中，并在每个管中放入磁铁。
向样品中加入2.0ml的反应终止液。
样品中加入3.0ml底物。
样品于室温保温60分钟。
饲料样品于4000rpm离心10分钟(预混合料样品不需离心)。
标准液
从8份标准液中各取2×100ml，另还取4×100ml 0.22M醋酸盐缓冲液(盲试试剂)。
测定所有样品的A415。
计算
FTU/g＝μmol PO4 3-/(min*g(样品))
称出Cg样品(研磨后)。
从经过提取和离心的样品中取出100μl。
使PO4 3-标准曲线线性化。
从PO4 3-标准液的回归曲线找出样品的实际浓度(mM)：
[PO4 3-]＝(x-b)/a     x＝A415        a＝斜率        b＝y轴截距
μmol PO4 3-/min＝{[PO4 3-](mM)×Vol(升)×1000μmol/mmol}/t
t＝保温时间(分钟)
Vol＝样品体积(升)＝0.0001升
1000＝从mmol到μmol的换算因子
FTU/gprove＝{(x-b)×Vol×1000×Fp}/{a×t×C}
C＝样品克数
Fp＝取出的样品与总样品(提取后)的系数。
例子：从1000ml中取出0.100ml→Fp＝1000/0.100＝10000。
缩写词的数值如下：
t＝60
Vol＝0.0001l
Fp＝10000
FTU/gprove＝{(x-b)×0.0001×1000×10000}/{a×60×C}
实施例2
制备浓缩的液态肌醇六磷酸酶制品
基本上按照WO98/28408中描述的在米曲霉中表达来自隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的肌醇六磷酸酶，发酵并纯化。得到的液态肌醇六磷酸酶浓缩物是一种UF(超滤)浓缩液，干物质含量18％。将pH调至5。
实施例3
制备肌醇六磷酸酶颗粒
如下制备带有涂层的含1.5％CSL的肌醇六磷酸酶颗粒：
14.68kg粉末组合物，配方：
0.75kg高岭土、Speswhite、英国高岭土
1.80kg纤维性纤维素(Arbocel BC 200)
11.23kg仔细研磨的硫酸钠
0.90kg Roquette的糖类粘合剂Tackidex G155
在Lodige搅拌器FM50中混合，与3.15kg喷雾液一起喷雾，所述喷雾液中含有1.68kg水，0.625kg玉米浆(Amylum N.V.提供的浓缩玉米浆(CCSL)，干物质含量48％)和0.84kg肌醇六磷酸酶浓缩液(18％干物质含量)，按照实施例2描述制备。喷雾过程中和喷雾后，如美国专利4106991实施例1的描述，用多套刀具给湿混合物施加压紧和成粒影响。
如下计算这里以及未包被的生颗粒中的CSL百分比：0.625×0.48/(14.68+0.625×0.48+0.84×0.18)＝0.300/(14.68+0.30+0.672)＝0.300/15.652＝1.917％～2％。
所述颗粒在流体床中干燥至水分含量低于3％，得到浅色的颗粒，其微粒分配如下：
10.5％＞1100μm(微米)
92.0％＞300μm
8.0％＜300μm
最后将颗粒过筛得到颗粒大小在300μm到1100μm的产品，6kg颗粒于80℃包被9％完全氢化的棕榈油，然后涂22.5％高岭土、Speswhite(100g涂料中的干物质含量：22.5g+9g＝31.5g)，按照美国专利4,106,991实施例22中描述的方式。
所得终产物即包被的颗粒中的CSL含量，比上述生颗粒中的CSL含量减少如下：1.917％/1.315＝1.458％～1.5％。
将颗粒过筛得到颗粒大小在300μm到1200μm的产品。
按照以上描述制备下面使用的对照颗粒，但不加CSL。
用相应方式制备另含有小麦淀粉和乳糖或海藻糖的颗粒。
实施例4
预混合料中的肌醇六磷酸酶颗粒的储存稳定性
根据实施例3制备表1中指出的肌醇六磷酸酶颗粒。“对照”是指按照实施例3中的方法但不加CSL制备的肌醇六磷酸颗粒。
将所述颗粒直接称到每个小瓶中。记录颗粒的准确重量。瓶子用干净毛巾盖上，在室温放置过夜。
预混合料ENGA 1-02/Nordkorn，产品编号：015384 Artikel Nr.8259.(25kg转筒)在Ldige搅拌器中混合以便保证预混合料成分平均分布，并在每个塑料袋中装入约3kg。
预混合料中的组分如下(每千克)：
5000000IE     维生素A
1000000IE     维生素D3
13333   mg    维生素E
1000    mg    维生素K3
750     mg    维生素B1
2500    mg    维生素B2
1500    mg    维生素B6
7666    mcg   维生素B12
12333   mg    烟酸
33333   mcg   生物素
300     mg    叶酸
3000    mg    Ca-D-Panthothenate
1666    mg    Cu
16666   mg    Fe
16666   mg    Zn
23333   mg    Mn
133     mg    Co
66      mg    I
66      mg    Se
5.8     ％    钙
25      ％    钠
向每瓶中加入50g±1g预混合料，拧上螺旋盖。预混合料是用一个体积调节到相当于50g的可调式勺子加入的。用手将瓶子摇匀直到颗粒在预混合料中分布均匀。
0周的样品(密封瓶)(定义为颗粒活性100％)在完成样品制备后立即冷冻。将要保存在30℃的样品重新打开。将打开的瓶子放在塑料盒中，此盒含有1升甘油，其用水调到43％rH(用折射计测量干物质得到62％的糖度)以便对应于所述样品中约10％的水份。塑料盒的盖子用强力胶带封口。这意味着在整个实验过程的13周内水活度是0.43。
储存期结束后，从甘油盒中取出样品，拧上螺旋盖并冷冻。
分析前将样品在冰箱(5℃)中解冻。
同一天对-18℃保存的0周样品和30℃保存的相应样品进行分析以便消除时间和人的差异。
结果如下面表1所示；CSL＝玉米浆，WS＝小麦淀粉。
含有2％CSL、3％CSL和2％CSL加上5％WS的肌醇六磷酸酶颗粒显示类似的结果。
                                表1
    颗粒代号     颗粒     30℃保存13周后的残余活性百分比
    1     对照颗粒     61％
    2     对照颗粒     64％
    3     1.5％CSL     81％
    4     1.5％CSL     86％
    5     1.5％CSL     84％
    6     1.5％CSL     85％
    7     1.5％CSL+3.8％WS     84％
    8     1.5％CSL+3.8％WS     90％
    9     1.5％CSL+3.8％WS     84％
实施例5
饲料中的肌醇六磷酸酶颗粒的储存稳定性
按照实施例3制备下面表2指出的肌醇六磷酸酶颗粒。“对照”是指根据实施例3中的常规方法，但不加WS和CSL以及二糖制备的肌醇六磷酸酶颗粒。
饲料中的颗粒样品在Bioteknologisk Institut，Kolding，Denmark制备。
饲料成分如下：
74.0％小麦
20.7％烤豆饼
5.0％豆油
0.3％预混合料Enga 1-02/Nordkorn
加入肌醇六磷酸酶颗粒前将饲料干燥至水分≤10％。
将各批颗粒混入饲料，使混合物于65℃成团。
饲料团分散取样，填入100ml样品瓶中。
用螺旋盖将0周的样品(定义为颗粒活性100％)封口，保存在-18℃。
要保存在30℃的样品不密封。将打开的瓶子放在塑料盒中，此盒含有1升甘油，其用水调到43％rH(用折射计测量干物质得到62％的糖度)以便对应于所述样品中约10％的水份。塑料盒的盖子用强力胶带封口。这意味着在整个实验过程的13周内水活度是0.43。
储存期结束后，从甘油盒中取出样品，拧上螺旋盖并冷冻。分析前将样品在冰箱(5℃)中解冻。
用于均匀性实验的样品在5℃冷藏保存直至分析。
正如希望的，捣碎的饲料、加热到65℃的饲料以及未加酶的饲料团都含有约0.5FTU/g饲料。
分析5份加酶并加热到65℃的捣碎饲料样品的均匀性。相对标准差为2％到11％。总之，均匀性是可以接受的。
分析5份饲料团样品的均匀性。相对标准差为2％到10％。总之，均匀性是可以接受的。
13周后测定储存稳定性。同一天对-18℃保存的0周样品和30℃保存的相应样品进行分析以便消除时间和人的差异。
肌醇六磷酸酶残余活性测定结果如下表2所示(计算残余活性前从总活性中减去内源活性)；CSL＝玉米浆，WS＝小麦淀粉。
含有2％CSL、3％CSL以及2％CSL加上5％WS的肌醇六磷酸酶颗粒显示出类似的能力。
                              表2
  颗粒代号     颗粒   30℃储存13周后的残余活性百分数
  1     对照颗粒   53％
  2     对照颗粒   55％
  3     1.5％CSL   74％
  4     1.5％CSL   89％
  5     1.5％CSL   82％
  6     1.5％CSL   73％
  7     1.5％CSL+3.8％WS   82％
  8     1.5％CSL+3.8％WS   91％
  9     1.5％CSL+3.8％WS   89％
实施例6
肌醇六磷酸酶颗粒本身；成粒产率和储存稳定性
根据实施例3的方法，用实施例2所述浓缩液制备实验性固态肌醇六磷酸酶组合物。
在第一个成粒实验中，加入2％的乳糖和3％的玉米浆(CSL)。
在第二个成粒实验中，除了第一个实验加入的两种成分，再加上3％小麦淀粉(WS)。
在第三个成粒实验中，加入2％的海藻糖，以及3％WS和3％的CSL。
检验所得颗粒本身对成粒产率及其储存稳定性的影响。
成粒产率计算为离开成粒设备的产品中剩余肌醇六磷酸酶单位与进入设备的浓缩液中肌醇六磷酸酶单位的比值。
使用下面较严格的条件来检测所得肌醇六磷酸颗粒组合物的储存活性：4周、40℃和60％的相对湿度。
结果如下表3所示。
                          表3
实验        成粒产率        储存稳定性
  第22批     第24批     第22批     第24批
 对照   75％     70％     43％     47％
 CSL+乳糖   80％     67％     47％     50％
 CSL+WS+乳糖   81％     79％     56％     54％
 CSL+WS+海藻糖   85％     82％     63％     62％
实施例7
另一种肌醇六磷酸酶的颗粒组合物的储存稳定性
根据实施例2和3的教导，用EP0897010中描述的所谓通用肌醇六磷酸酶制备液态肌醇六磷酸酶浓缩物和固态组合物-即颗粒。
成粒实验基本上按照实施例6中的描述进行。但是，对于储存稳定性，样品还要储存在30℃。结果如下表4所示。
                           表4
实验   成粒产率                 储存稳定性
         30℃     40℃，60％RH
    8周     17周     4周
对照   82％     85％     85％     40％
CSL+WS+乳糖   92％     97％     95％     48％
实施例8
利用高效液相层析(HPLC)鉴定CSL
按照下面的描述测试来自不同供应商(Roquette Freres，4 Rue Patou，F-59022 Lille Cedex，法国；Staral s.a.，Z.I.ET Portuaire，B.P.32，F-67390Marckolsheim，法国；和Cerestar Scandinavia A/S，Skovlytoften 33，DK-2840Holte，丹麦)的各批CSL的15份样品。
Carrez-沉淀
称5.0g CSL加入100ml烧瓶中。加入40ml MQ-水(经Milli-q滤膜过滤的去矿质水)，于70℃保温15分钟，并同时以200rpm振荡。加入12ml Carrez-I-溶液(三水合六氰基高铁酸钾(II))并振荡。加入12ml Carrez-II-溶液(七水合硫酸锌)并振荡。加20ml 0.5N NaOH并振荡。使其冷却并加入MQ-水 ad 100ml，振荡。取10ml该制品转移到一个瓶子中，于4000rpm离心10分钟。上清液在0.5μm滤膜上过滤用于HPLC分析。每份样品分析两次，包括盲试样品(MQ-水和Carrez-溶液)。
层析参数
层析柱：  Supelcosil LC-18-DB，No.088877AE
探测仪：  Shimadzu SPDM6A-diodearray从220nm到350nm。
数据分析：分析数据时，使用260nm处整合得到的峰区。
泵：      HP 1080梯度泵
洗脱液：  A)MQ-水
          B)30％MeOH
          C)60％MeOH
          D)90％MeOH
梯度：    0min   A
          15min  A
          35min  B
          50min  C
          60min  C
          65min  D
          70min  D
          75min  C
          80min  B
          85ruin A
          90min  A
HPLC所分析的15份CSL样品的变量统计结果如下表5所示：
                              表5
峰保持时间  最低  最高  平均  标准差(SD)  ％SD
6791  22154  114227  79192  25978  32.807
7445  1934348  2326644  2135867  110911  5.191
10331  4746  132048  44503  52860  118.78
11844  0  3020  201  780  387.30
12440  124723  183826  155946  17166  11.014
14124  79613  186731  119578  35032  29.306
15322  0  27204  13205  11537  87.38
16187  314623  380627  346898  21271  6.132
18831  18494  148325  130989  10481  8.003
26373  0  8482  2288  3454  150.99
26833  0  59860  25622  19252  75.14
27672  0  46259  24388  13200  54.12
28053  0  11383  3085  3169  102.71
 28762  5643  60078  31762  20966  66.01
 29491  3657  14650  8970  3353  37.388
 29926  40184  89538  52754  14807  28.075
 30607  0  44749  14732  15523  105.37
 30951  0  19732  2423  5786  238.80
 31825  0  16090  2624  4909  187.06
 32454  0  15725  1288  4050  314.36
 32636  0  28268  7516  9534  126.85
 33068  0  36398  4570  9707  212.42
 33394  0  96671  30197  33359  110.47
 33646  0  24856  4042  7600  188.02
 34108  0  11826  2144  3922  182.94
 34464  0  29248  9794  8990  91.79
 35309  0  14392  8793  6491  73.82
 36826  0  29619  9667  10423  107.82
 42457  0  45570  32023  12404  38.739
 42971  29905  102074  45303  18156  40.0810
 43427  0  49318  6293  14306  227.33
 43812  0  13837  5851  4924  84.16
 45519  0  12487  3570  4815  134.87
 46032  0  11850  4728  4756  100.59
 46654  0  36357  23766  11561  48.65
 47034  0  37769  17540  11212  63.92
 47268  0  20271  5414  6969  128.72
 47784  0  5218  1569  2091  133.25
 48494  0  5858  1872  1595  85.20
 48859  0  10935  2923  3748  128.25
 49180  0  24091  11016  8573  77.82
 49467  0  23885  10146  8372  82.52
 49905  0  22011  4205  8506  202.31
在表5的％SD一栏中，以上标(1、2、3、---、9、10)标志特征性的峰。下文中，这些峰分别称为峰-1、峰-2、峰-3、……、峰-9、峰-10。整组10个峰称为峰1-10。用类似方法表示亚组，例如峰1-5代表编号1到5的5个峰，峰1、3、5代表峰1、峰3和峰5等。因此，样品中有1或多个这些峰表示存在CSL。在优选实施方案中，存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或全部10个峰表示有CSL。在更优选的实施方案中，存在5、7、8或10个峰表示有CSL。最优选存在5个峰。
对于CSL含量未知的样品，利用简单的反复试验技术可以找出合适的稀释度。
以上定性方法可以通过与Roquette Freres指定的标准批号进行比较来进行定量。特别优选的Roquette Freres的标准CSL批号是SOLULYSL 48 LCAS No.66071-94-1，EINECS：266-113-4。

Claims (9)

1.一种固态肌醇六磷酸酶组合物，它包含
(a)肌醇六磷酸酶，和
(b)数量为0.01-15％的玉米浆CSL，
其中该组合物的肌醇六磷酸酶活性在20单位/g以上。
2.权利要求1的组合物，其中的肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的修饰过的肌醇六磷酸酶或肌醇六磷酸酶变体。
3.权利要求1的组合物，经HPLC分析时，其层析图显示存在峰1-10中的一个或多个。
4.权利要求1-3任何一项的组合物，它还包含一或多种以下物质：
i)淀粉源；
ii)二糖；
iii)载体物质；
iv)填料；
v)一或多种维生素；和/或
vi)一或多种矿物质。
5.一种制备权利要求1-4任何一项的组合物的方法，包括将玉米浆CSL与具有肌醇六磷酸酶活性的酶一起干燥，其中所述固态组合物的肌醇六磷酸酶活性在20单位/g以上。
6.权利要求5的方法，其中所述固态肌醇六磷酸酶组合物是肌醇六磷酸酶颗粒组合物，并且该方法包括：
(i)将具有肌醇六磷酸酶活性的酶喷洒到载体上；
(ii)将CSL喷洒到该载体上；
(iii)混合；以及
(iv)干燥。
7.权利要求5的方法，其中所述干燥是喷雾干燥。
8.权利要求5的方法，该方法还包括加入一或多种淀粉源和/或一或多种二糖。
9.权利要求6或7的方法，该方法还包括加入一或多种淀粉源和/或一或多种二糖。
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