CN1293542A - 饲料制剂中的热稳定性植酸酶及植物表达 - Google Patents

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Abstract

热稳定性植酸酶在动物饲料制剂中的应用和该植酸酶在植物中的表达。为了制备动物饲料,在团聚步骤之前或期间加入热稳定性植酸酶。优选的方法是造粒、挤出和膨胀。表达热稳定性植酸酶的转基因植物可以直接用于动物饲料制剂中。

Description

饲料制剂中的热稳定性植酸酶及植物表达
技术领域
本申请涉及热稳定性植酸酶，也就是说，热稳定性植酸酶在制备动物饲料过程中的应用及其在植物中的表达。
背景技术
WO91／14782描述表达衍生自曲霉属ficuum NRRL3135的植酸酶的转基因烟草和菜籽植物。该转基因烟草种子用于喂食笋鸡。
US 5824779描述如何以标准方式制备表达同样的曲霉属ficuum植酸酶的转基因苜蓿，和本身可作为动物饲料添加剂使用的含有植酸酶浓缩物的制备。
EP 0556883 B1描述基于挤压技术制备饲料球粒的方法。在饲料粒挤出之后进行温度敏感试剂(其中一个实例是植酸酶)的添加，且在减压下将温度敏感试剂装载到球粒上。
EP 0556883 B1中指出，饲料调制过程中热敏感物质活性的损失是众所周知的问题。上述EP专利提出，在挤出过程之后，在减压下加入这些物质来解决这一问题。然而，这种解决方法需要液态形式的温度敏感物质，以及需要配备额外的昂贵的工艺设备。
本发明提供制备动物饲料的改进的方法以及改进的表达植酸酶的转基因植物。
发明概述
本发明提供制备动物饲料的方法，该方法包括饲料成分的团聚，在团聚之前或期间加入热稳定性植酸酶。
本发明也提供含有编码热稳定性植酸酶的DNA-构建体的转基因植物或植物的一部分。
转基因植物或其部分(如种子或叶子)可以用于本发明的饲料配制过程，从而在一优选的实施方案中同时提供养分(饲料成分)和饲料添加剂植酸酶。
附图简述
结合下面的附图，详细描述本发明，其中
图1是共有植酸酶-1和共有植酸酶-10的差示扫描量热图(DSC)；
图2是共有植酸酶-10-热-Q50T和共有植酸酶-10-热-Q50T-K91A的DSC；
图3是共有植酸酶-1-热[8]-Q50T和共有植酸酶-10-热[8]-Q50T-K91A的DSC；
图4是来自烟曲霉ATCC 13073和其α-变株的植酸酶的DSC；和
图5显示共有-植酸酶-1氨基酸序列的设计；
图6是五种担子菌植酸酶的对比和担子菌共有序列；
图7是共有-植酸酶-10氨基酸序列的设计；
图8是为共有-植酸酶-11设计的对比(对于每一个担子菌序列，赋予0．2的权重，所有担子菌植酸酶作为独立序列而被使用；进一步使用黑曲霉T213的氨基酸序列)；
图9是共有植酸酶-1-热(8)-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列；
图10是共有植酸酶-10-热(3)-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列；
图11是烟曲霉ATCC 13073α-变株的DNA和氨基酸序列；和
图12是共有-植酸酶-7的DNA和氨基酸序列，共有植酸酶-7与共有-植酸酶-1相比，包括下列突变：S89D，S92G，A94K，D164S，P201S，G203A，G205S，H212P，G224A，D226T，E255T，D256E，V258T，P265S，Q292H，G300K，Y305H，A314T，S364G，M365I，A397S，S398A，G404A和A405S。
发明详述
本文中，“食物”或“动物饲料”指打算或适宜于由动物吃入、摄入、消化的任何天然或人工饮食、乳品或类似物。人类的食物包括在上述食物的定义中。
“动物”包括所有动物，无论它是多胃动物(反刍动物)还是单胃动物如人类、家禽、猪和鱼类。优选的动物是单胃的动物，特别是猪和笋鸡。
“饲料成分”的概念包括将被或被加工成饲料的原料。非人动物的饲料成分通常是并且优选地选自下列非穷举的物质：
取自植物的产品
如种子、谷粒、叶子、根、块茎、花、豆、皮-它们可以是鳞片状、饼状、渣状、粉状等；
取自动物的产品
如鱼肉、奶粉、骨提取物(extract)、肉类提取物、血液提取物等；
添加剂
如矿物质、维生素、芳香族化合物和饲料增强酶。
植酸或肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸二氢酯(或简称为肌醇六磷酸酯)是肌醇的主要来源并且是植物种子和谷粒中磷酸的主要储存形式。在豆类种子中，其含量占磷酸酯含量的约70％。种子、谷粒和豆是重要的饲料成分。
除非另外声明，植酸或其盐即植酸盐是抗营养剂，所述术语在本文中是同义使用或者随意使用，是抗营养因子。部分由于它结合营养必需离子如钙离子、微量矿物质如锰，还结合蛋白质(通过静电相互作用)。部分由于它们的亚磷不能被营养地利用的事实，因为植酸和其盐，即植酸常常不被代谢。
这导致需要用诸如无机磷酸盐补充食品和饲料制剂。
不能被代谢的含亚磷的植酸通过动物的胃肠道并随粪尿排泄，导致不期望的磷酸盐环境污染，引发例如水环境的富营养和藻类过渡生长。
植酸被植酸酶降解。本文中“植酸酶”是具有植酸酶活性的多肽或酶，即，催化植酸酯(肌醇六磷酸)转化为(1)肌醇和／或(2)其单-、二-、三-、四-、和／或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐。
由植物及微生物产生的植酸酶已有报道。在微生物中，产生植酸酶的细菌以及产生植酸酶的真菌是已知的。
对产生植酸酶的属于子囊(Ascomycota)(子囊菌(ascomycete))真菌门的丝状真菌有数种描述。更具体而言，有数篇有关产生植酸酶的曲霉属子囊菌如土曲霉的文献(Yamada等，1986，农用生物化学(Agric．Bio1．Chem．)322：1275-1282)。也已描述了由黑曲霉变株Awamori的植酸酶基因的克隆和表达(Piddington等，1993，基因(Gene)133：55-62)。EP 0420358描述了曲霉ficuum(黑曲霉)的植酸酶的克隆和表达。EP 0684313描述了子囊菌黑曲霉、嗜热毁丝霉、土曲霉的植酸酶的克隆和表达。另外，给出了构巢曲霉、嗜热踝节菌、烟曲霉和另一土曲霉菌株的植酸酶的部分序列。
WO97／35017描述了Thermomyces lanuginosus的植酸酶的克隆和表达。
WO98／28409描述了数种担子菌植酸酶的克隆和表达，如由隔孢伏革菌lycii(Peniophora lycii)、平田头菇(Agrocybe pediades)、卷蠋毛头棘菌(Paxillus involutus)和绒毛栓菌(Trametes pubescens)产生的植酸酶。
根据酶命名数据库ExPASy(主要根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会推荐与酶命名有关的描述每种类型被鉴定的酶的信息的贮存库，所述酶已被EC(酶委员会)提供一个号码)，目前已知有两种不同类型的植酸酶：一种是所谓的3-植酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC3．1．3．8)和所谓的6-植酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC 3．1．3．26)。3-植酸酶首先水解3-位的酯键，而6-植酸酶首先水解植酸中6-位的酯键。这两种类型的植酸酶包括在上述定义的植酸酶中。
已知许多测定植酸酶活性的方法，任何一个均可用于本发明的目的。优选的植酸酶测定包括在实施例中。
“团聚”的概念定义为在热的影响下各种成分混合的过程。产生的产品优选是“团聚物”或“成簇物”，其中成分相互粘附而形成具有满意物理稳定性的产品。由这类团聚物形成的粉尘是其物理稳定性的指征--形成的粉尘越少，稳定性越好。对于由团聚物形成的粉尘的适宜的分析方法是ASAE标准S 269-1。满意的团聚物具有少于20％、优选少于15％、更优选少于10％、更加优选少于6％的粉尘。
“在热的影响下”指于团聚单元出口处在产品上测得的温度至少为65℃。更优选的温度至少为70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、或者甚至至少为130℃。
优选的团聚过程是在加压下进行。通常，压力使成分紧密结合，任选地与横截面或通过面积的降低相结合。优选地，适度调整加工参数如温度和压力，产生的剪切力和剪切速度具有如此的大小以致于含有淀粉和蛋白质的饲料成分变成流体。
“加压”指相对于正常大气压压力的增加，在团聚单元内部测到最大压力。
在团聚中通常包括添加水蒸汽(vapour)或蒸汽(steam)，但并不作为绝对必要条件。
团聚包括但不限于众所周知的称为挤出、膨胀(或压力调节)和造粒(或压粒)的过程。
挤出尤其在通过索取即可得到的来自Danish Company Sprout-Matador，Glentevej 5-7，DK-6705 Esbjergφ或Niels Finsensvej 4，DK-7100 Vejle的手册(“Handbog i Pilleteringsteknik 1996”)第149-153页中描述。然而，在本发明的团聚过程中，在上述手册中提到的下列加工步骤完全是任选的：
(ⅰ)在级联混合器中预加热饲料成分；
(ⅱ)将离开喷口-截面的产品切割成小片；
(ⅲ)具有所需的尺寸；
(ⅳ)驯化或调整；
(ⅴ)包衣；
(ⅵ)干燥；
(ⅶ)冷却。
膨胀过程(压力调节)尤其在上述相同手册的第61-66页中描述。同时对于膨胀来说，上述加工步骤(ⅰ)-(ⅵ)，特别是步骤(ⅰ)和(ⅵ)是完全任选的步骤。
对于下列加工步骤也是同样的：
(ⅱ’)粉碎产品(使用例如在第65页所示的叶片制粒机)；
(ⅶ)将产品造粒(使用例如在第62页所示的造粒压榨机)；
造粒过程尤其描述在上述相同手册的第71-107页。这里，上述步骤(ⅰ)-(ⅶ)也是完全任选的步骤。这些步骤详细描述在上述手册的第29-70页。
在本发明一优选的团聚加工中，包括一个或多个上述提到的其它加工步骤(ⅰ)-(ⅶ)。
特别优选的进一步的步骤是步骤(ⅰ)。
在一最优选的实施方案中，在第一个步骤(a)中将饲料-成分被预热到至少45℃，优选至少50、55、60、65、70、75、80℃的温度；然后在第二个步骤(b)中加热到至少65℃，优选70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或甚至至少130℃的温度。
在步骤(a)之前或期间和／或步骤(b)之前或之间加入热稳定性植酸酶。
优选在步骤(a)加入水。更优选，在各成分混合(步骤(a)和／或(b))期间加入热蒸汽。
加工步骤(a)优选在级联混合器(见上述引证的手册第44页)中进行。
“热稳定性”植酸酶是具有至少65℃ Tm(解链温度)的植酸酶，使用差示扫描量热法(DSC)在纯化的植酸酶蛋白测得，优选对于DSC来说使用恒定加热速度，更优选为10℃／分。在优选的实施方案中，Tm是至少66、67、68、69、70、71、72、73、74或75℃。优选地，Tm等于或低于150℃，更优选等于或低于145、140、135、130、125、120、115或110℃。相应地，优选的Tm间隔是65-150℃、66-150℃……(等)到75-150℃；65-145℃、66-145℃……(等)到75-145℃；65-140℃……(等)到75-110℃……(等)到65-110℃、66-110℃……(等)到75-110℃。
特别优选的Tm范围是下列：65～110℃；70～110℃；70～100℃；75～95℃或80～90℃。
在下述实施例3中，描述了由DSC测定的Tm，给出了多种植酸酶的Tm。
也指出了最适温度，因此--可供选择地-热稳定性植酸酶可被定义为具有至少60℃最适温度的植酸酶。优选地，最适温度是在pH5．5的底物植酸盐或者在pH5．0的底物植酸上测定的。优选的设备是FYT、FTU或实施例3的设备。实施例3的植酸酶测定是最优选的。
在优选的实施方案中，最适温度为至少61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃。优选地，最适温度等于或低于140℃，更优选等于或低于135、130、125、120、115、110、105或100℃。相应地，优选的最适温度间隔是：60-140℃、61-140℃、……(等)至70-140℃；60-135℃、61-135℃、……(等)至70-135℃；60-130℃、……(等)至70-130℃；……(等)至60-100℃、61-100℃、……(等)至70-100℃；
本发明优选的植酸酶显示出一定程度的与下面(iii)中所提到的任一植酸酶的全部氨基酸序列相似或同源，优选地相同，-优选地与共有-植酸酶-10-热-Q50T-K91A的全部氨基酸序列至少48％，优选至少50、52、55、60、62、65、67、70、73、75、77、80、82、85、88、90、92、95、98或99％同源。
使用本领域已知的任何对比程序可以测定相似或同源或者相同的程度。优选的序列对比程序是在GCG第8版程序包中提供的GAP(Wisconsin程序包的程序手册，第8版，1994年8月，遗传计算机组，575科学大道(Science Drive)，Madison，Wisconsin，USA 53711)(也参见Needleman，S．B．和Wunsch，C．D(1970)，分子生物学杂志(Joumal of Molecular Biology)48，443-453)。多肽序列比较使用具有如下设置的GAP：GAP权重(weight)为3．000和GAP纵向权重(lengthweight)为0．100。
多序列对比可以使用程序堆(program pileUp)(Wisconsin程序包的程序手册，第8版，1994年8月，遗传计算机组，575科学大道，Madison，Wisconsin，USA 53711)GAP权重为3．000和GAP纵向权重为0．100。
使用GAP程序，一些选择的植酸酶显示出与共有-植酸酶-10-热(3)-Q50T-K91A氨基酸序列具有下列百分比的相似性(括号中的值是同一性)：
烟曲霉ATCC-13073α-变株          86．7％(81．8％)
担子菌共有                       61．4％(49．0％)
共有-植酸酶-1                    98．7％(97．9％)
共有-植酸酶-10                   96．6％(94．4％)
共有-植酸酶-1-热(8)-Q50T-K91A    97．4％(95．5％)
共有-植酸酶-11                   96．5％(94．2％)
共有-植酸酶-12                   92．5％(89．9％)
共有-植酸酶-7                    95．5％(93．4％)
“纯化的”植酸酶是指基本上不含有其它非植酸酶多肽，例如用SDS-PAGE测定纯度至少约20％，优选至少约40％，更优选约60％，甚至更优选约80％，更加优选约90％，甚至最优选约95％。
优选的热稳定性植酸酶是EP 98113176．6(EP 0897985)中所谓的共有植酸酶，即
(ⅰ)由其中描述的方法获得的任何热稳定性植酸酶；
(ⅱ)含有其中的图2所示的氨基酸序列的植酸酶或其任何变体或突变蛋白，优选的突变蛋白是那些含有取代Q50L；Q50T；Q50G；Q50T-Y51N或Q50L-Y51N的突变蛋白。
其它优选的热稳定性植酸酶是
(ⅲ)含有至少一种下列氨基酸序列(其中一些在本文图5-12中显示)的热稳定性植酸酶，优选是下列植酸酶：共有-植酸酶-1(或只是共有植酸酶)；共有-植酸酶-1-热(3)；共有-植酸酶-1-热-Q50T；担子菌-共有(或只是担子的)；共有-植酸酶-10(或Fcp 10)；共有-植酸酶-11(或共有序列11)；共有-植酸酶-1-热(8)-Q50T-K91A；共有-植酸酶-1-热(8)-Q50T；共有-植酸酶-1-热(8)；共有-植酸酶-10-热(3)-Q50T-K91A；共有-植酸酶-10-热(3)-Q50T(有时，在该表达式中省略“(3)”)；烟曲霉ATCC 13073植酸酶α-变体、烟曲霉ATCC 13073植酸酶α-变体加上突变E59A、S126N、R329H、S364T、G404A；烟曲霉ATCC 13073植酸酶α-变体加上突变E59A、K68A、S126N、R329H、S364T、G404A；共有-植酸酶-7；共有-植酸酶-12。
(ⅳ)以及植酸酶(iv)和(v)的热稳定变体和突变蛋白，特别是那些含有一种或多种下列取代的那些变体和突变蛋白：Q50L，T，G；Q50L-Y51N；Q50T-Y51N。
术语“植物”是指包括不仅完整植物而且也包括植物部分或器官如叶子、种子或谷粒、茎、根、块茎、花、胼胝(callus)、果实等；组织、细胞、原生质体等；以及它们的任何结合或部分结合。植物组织培养物和植物细胞系以及植物原生质体也特别包括在本文中。
术语“转基因植物”是指上面定义的植物，所述植物已被基因修饰，以及保留基因修饰的其子代和其繁殖物质。优选地，转基因植物包括用重组基因技术引入祖代植物的至少一种特异基因。该术语不限定于单个植物品种。
本发明涉及含有编码热稳定性植酸酶的DNA-构建体的转基因植物。
在优选的实施方案中，转基因植物是以含有编码热稳定性植酸酶的DNA-构建体为特征的植物群。该植物群的成员可以具有很强的个性，但是它们共有的热稳定植酸酶DNA-构建体的特性使它们明显区别于其它品种的植物群。
相应地，本技术可用于一种以上的植物品种。本发明植物中不包括自然产生的植物品种。
本发明另一优选的实施方案涉及转基因植物变种或它们的变种；转基因植物种，转基因植物属，转基因植物科和／或转基因植物目。更优选，将这样的植物品种排除在外。
本发明可以使用任何热稳定性植酸酶，例如任何野生型植酸酶、基因工程植酸酶、共有植酸酶、植酸酶突变蛋白、和／或植酸酶变体。基因工程植酸酶包括但不限于由定点诱变、基因改组(gene shuffling)、随机诱变等制备的植酸酶。
编码野生型热稳定植酸酶的核苷酸序列可以是任何起源的，包括哺乳动物、植物和微生物起源，使用惯常方法可以从这些来源中分离出来。优选地，核苷酸序列取自微生物，如真菌例如酵母或丝状真菌，或细菌。使用本领域熟知的各种方法(参见例如WO98／28409和EP 0897985)可以将编码热稳定植酸酶的DNA序列从产生植酸酶的细胞中分离出来。
编码热稳定性基因工程的或共有植酸酶(包括突变蛋白或其变体)的核苷酸序列，可以按照任何方法制备，例如按照本文中实施例3和在EP0897985中所描述的方法。
为了完成热稳定性植酸酶在本发明植物中的表达，将编码植酸酶的核苷酸序列插入含有调节元件或能够引导核苷酸序列表达的序列的表达构建体中，以及，如果需要或期望，引导基因产物分泌或将基因产物靶向植物种子。
为了使转录发生，将编码热稳定性植酸酶的核苷酸序列可操作地连接到能够介导所研究的植物转录的适宜启动子上。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。典型地，诱导型启动子介导以组织-特异性或生长-阶段特异性方式的转录，而组成型启动子在所有细胞组织中提供持续转录。适于本发明的适宜组成型启动子的一个实例是花椰菜花叶病毒35S启动子。优选的组成型启动子的进一步的实例是来自土壤杆菌属的肿瘤-诱导质粒(Ti)的转录启动序列如章鱼氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶或甘露氨酸合成酶。
适宜的诱导型启动子的实例包括，种子-特异性启动子如小麦种子中表达α-淀粉酶的启动子(见Stefanov等，Acta Biologica Hungarica第42卷，第4期第323-330(1991))，编码水稻种子储藏蛋白如谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白的基因的启动子(Wu等，植物和细胞生理学(Plant and CellPhysiology)第39卷第8期第885-889页(1998))，来自豆球蛋白B4和来自Conrad U等在植物生理学杂志(Journal of Plant Physiology)第152卷第6期第708-711页(1998)描述的蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆(vicia faba)启动子，来自Brassica napus的储藏蛋白napA启动子，或者本领域已知的任何其它种子特异性启动子，如在WO91／14772中描述的。
为了增加热稳定性植酸酶的表达，希望使用启动子增强子元件。例如，启动子增强子可以是置于启动子和淀粉酶基因之间的内含子。内含子可以是来自水稻Waxy(Wx)基因的第一个内含子(Li等，植物科学(Plant Science)第108卷第2期第181-190页(1995))，来自玉米Ubil(遍在蛋白)基因的第一个内含子(Vain等，植物细胞报告(Plant Cell Reports)第15卷第7期第489-494页(1996))或者来自Actl(肌动蛋白)基因的第一个内含子。作为双叶内含子的实例，提到了chsA内含子(Vain等，出处同上)。而且，种子特异增强子可用于增加种子中热稳定性植酸酶的表达。种子特异性增强子的一个实例是由Vandergeest和Hall在植物分子生物学(Plant Molecular Biology)第32卷第4期第579-588页(1996)所公开的一个衍生自编码豆(菜豆)主要种子储存蛋白的β-菜豆球蛋白基因。
此外，表达构建体优选含有使热稳定性植酸酶基因信号转录终止的终止子序列如rbcS2’和nos3’终止子。
为了便于筛选成功转化的植物，表达构建体还应当优选包括一种或多种标志，如抗生素抗性选择性标志或提供除草剂抗性的选择性标志。一种广泛应用的选择性标志是提供卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)。其它适宜标志的实例包括提供可测得酶活性的标志如二氢叶酸还原酶、萤光素酶和b-葡糖醛酸酶(glucoronidase)(GUS)。膦丝菌素乙基转移酶可与除草剂basta或bialaphos联合用作选择性标志。
本发明转基因植物可以按照本领域已知的方法来制备。所用的转化方法将取决于要被转化的植物种属并可选自本领域已知的任何转化方法如土壤杆菌属介导的转化(Zambryski等，EMBO Journal 2，第2143-2150页，1993)、粒子轰击、电穿孔(Fromm等，1986年，自然(Nature)319，第791-793页)，和病毒介导的转化。对于单叶的转化，优选胚胎细胞系或培养胚胎的粒子轰击(即biolistic转化)。下面，列出参考文献，其中公开了转化各种植物的各种方法：水稻(Cristou等，1991，生物技术(Bio／Technology)9，第957-962页)、玉米(Gordon-Kamm等，1990，植物细胞(Plant Cell)2，第603-618页)、燕麦(Somers等，1992，生物技术(Bio／Technology)10，第1589-1594页)、小麦(Vasil等，1991，生物技术(Bio／Technology)10，第667-674页，Weeks等，1993，植物生理学(Plant Physiology)102，第1077-1084)和大麦(Wan和Lemaux 1994，植物生理学(Plant Physiology)102，第37-48页，review Vasil1994，植物分子生物学(Plant Mol．Biol．)25，第925-937)。
更具体而言，土壤杆菌属介导的转化可以按照下列方法很方便地完成：
构建携带热稳定性植酸酶的载体系统。载体系统可以包括一个载体，但是也可以包括两个载体。如果是两个载体的话，载体系统被看作是双载体系统(Gynheung An等(1980)，双载体，植物分子生物学手册(PlantMolecular Biology Manual)A3，第1-19页)。
基于土壤杆菌属的植物转化载体由大肠杆菌和土壤杆菌的复制起始点以及细菌选择标志构成。对于植物的转化，来自根癌土壤杆菌的Ti质粒或者来自发根土壤杆菌的Ri质粒的右侧并且优选还有左侧边缘是必要的。在两侧边缘之间放置含有热稳定性植酸酶基因和适宜的调节序列如启动子和终止子序列的表达构建体。另外，将来自转座子Tn5的选择基因如新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因和报告基因如GUS(β-葡糖醛酸酶)基因克隆在边缘之间。用上述载体转化装载含有病毒基因的辅助质粒的disarmed土壤杆菌株。然后将转化后的土壤杆菌株用于植物转化。
本发明也涉及制备能够表达热稳定性植酸酶的转基因植物的方法，所述方法包括下列步骤：(ⅰ)分离编码热稳定性植酸酶的核苷酸序列；(ⅱ)将(ⅰ)的核苷酸序列插入能够介导该核苷酸序列在选定的宿主植物进行表达的表达构建体中；和(ⅲ)用表达构建体转化选定的宿主植物。
当相对于热稳定性植酸酶使用时，用“至少一种”代替“一种”的上述方法也在本发明的范围之内。
该方法基本上是非-生物学方法。
任何植物可以被选作宿主植物。更具体而言，植物可以是双叶或单叶植物，简称双叶或单叶。主要感兴趣的是可能成为食物或饲料成分的那些植物。这些植物可以含有植酸。单叶植物的实例是草类如牧草(兰草，Poa)，饲草如羊茅属、毒麦属，温草如翦股颍属，谷类如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉米。
双叶植物的实例是豆类如羽扇豆、豌豆、黄豆和大豆，十字花科类(芸苔科)如花椰菜、油菜和非常相关的典型生物(model organism)拟南芥。
特别感兴趣的是单叶植物，尤其是农作物或谷类植物如小麦(小麦属，如夏令小麦)大麦(Hardeum，如普通小麦)、燕麦、黑麦、稻米、高粱和玉米(玉米属，玉米)。
另外特别感兴趣的是双叶植物，如上面提到的那些植物。
在一优选的实施方案中，祖代植物或宿主植物本身是期望的饲料成分。
实施例
实施例1
FYT-分析-分析植酸酶制剂
使用下列分析能够测定植酸酶的活性：10μl稀释的酶样品(稀释在0．1M醋酸钠、0．01％吐温20，pH5．5中)加入到250μl 5mM植酸钠在0．1M醋酸钠、0．01％吐温20、pH5．5的溶液中(溶解植酸钠后调节pH，将底物预热)，于37℃孵育30分钟。加入250μl 10％TCA终止反应，加入500μl7．3g FeSO4在100ml钼酸盐试剂(2．5g (NH4)6Mo7O24·4H2O在8mlH2SO4的溶液稀释到250ml)中的溶液中来测定游离的磷酸盐。在96孔微量滴定板上测定200μl样品在750nm处的吸光度。包括底物和酶的空白样。也包括磷酸盐的标准曲线(0-2mM磷酸盐)。在给定条件下，1FYT等于释放1μmol磷酸盐／分钟的酶的量。该分析法优选用于植酸酶制剂(在没有与其它饲料成分混合时)。
实施例2
FTU分析-分析与饲料成分混合的植酸酶
1FTU定义为在标准条件下(37℃，pH5．5；反应时间为60分钟，植酸起始浓度为5mM)释放相当于每分钟1μmol磷酸盐的酶的量。
1FTU=1FYT
FTU分析优选用于动物饲料预混物和类似的复合组合物的植酸酶活性的测定。
试剂／底物
饲料等的提取缓冲液
该缓冲液也用于制备PO4-标准物和预混合样品的进一步稀释。
pH5．5的含有吐温20的0．22M醋酸盐缓冲液
称量出每升30g三水醋酸钠(MW=136．08g／mol)例如Merck Art 46267和每升0．1g吐温20例如Merck Art 22184。
将醋酸钠溶于去离子水中。
加入吐温20，用醋酸调节pH为5．50±0．05。
加入去离子水补足总容积。
预混物的提取缓冲液
含有吐温20、EDTA、PO4 3-和BSA的0．22M醋酸盐缓冲液。
每升30g三水醋酸钠如Merck Art 6267。
每升0．1g吐温20如Merck Art 22184。
每升30g EDTA如Merck Art 8418。
每升20gNa2HPO4·2H2O如Merck Art 6580。
每升0．5g BSA(牛血清白蛋白，如Sigma Art A-9647)。
这些成分溶于去离子水中，用醋酸调节pH至5．50±0．05。
加入去离子水补足总容积。
BSA不稳定，因而必须在缓冲液使用当天加入。
50mM PO4 3-储备溶液
称量0．681g KH2PO4(MW=136．09g／mol)如Merck Art 4873，溶于100ml pH5．5的含有吐温的0．22M醋酸钠溶液中。
储存稳定性：在冰箱中1周。
不含吐温的pH5．5的0．22M醋酸盐缓冲液
该缓冲液用于配制植酸底物。
称量出150g三水醋酸钠(MW=136．08)如Merck Art 6267并溶于去离子水中，用醋酸调节pH至5．50±0．05。
加入去离子水至5000ml。
储存稳定性：室温下1周。
植酸底物；5mM植酸
根据所用的批中水的含量可以计算出植酸的体积。
例如，如果水的含量为8．4％，则按下面的计算得到：
0．005mol／l×932．8g／mol=5．04g／l
(1÷0．084)
称量植酸(Na-盐)(MW=923．8g／mol)如Sigma P-8810并溶于0．22M醋酸盐缓冲液(不含吐温)中。稀释醋酸的加入增加了溶解速度。
用醋酸调节pH至5．50±0．05。
加入0．22M醋酸盐缓冲液至总容积。
21．7％硝酸溶液
用于终止溶液。
1份浓缩的(65％)硝酸与2份去离子水混合。
钼酸盐试剂
用于终止溶液。
100g四水六钼酸氨(NH4)6Mo7O24·4H2O如Merck Art 1182溶于去离子水中。加入10ml 25％的NH3。
加入去离子水至1升。
0．24％钒酸铵
购自fra Bie & Berntsen。
钼酸盐／钒酸盐终止溶液
1份钒酸盐溶液(0．24％钒酸铵)+1份钼酸盐溶液混合。加入2份21．7％的硝酸溶液。
使用前不超过2小时时制备该溶液并用锡箔包裹瓶子。
样品
冷冻样品在冰箱中解冻过夜。
饲料样品的大小：至少70g，优选100g。
饲料样品
选择溶液的体积以使得加入10倍于样品重量的缓冲液，例如将100g溶于1000ml 0．22M含有吐温的醋酸缓盐冲溶液中，见刻度圈(erclosure)1。四舍五入至最接近的溶液容积。
如果样品大小接近100g，将所有样品在咖啡研磨机中进行研磨，接下来放入配衡烧杯中。记录样品重量。不必要研磨不-成粒的样品。如果样品太大而难以操作，则将样品分裂为大约100g的各份。
将磁铁放入烧杯中，加入0．22M含有吐温的醋酸盐缓冲液。
提取样品90分钟。
提取后，静置样品30分钟以使饲料沉淀。用移液管取出5ml样品。样品是在溶液表面下2-5cm处取出的，将样品放入离心玻璃管中，加盖。
以4000rpm的转速离心10分钟。
预混合样品
选择溶液的体积以使得加入10倍于样品重量的缓冲液。四舍五入至最接近的溶液容积。
样品称量好后(50-100g)，将所有样品放入配衡烧杯中。记录样品重量。如果样品太大而难以操作，则将样品分裂为大约100g的各份。
将磁铁放入烧杯中，加入0．22M含吐温、EDTA和PO4 3-的醋酸盐缓冲液。
提取样品60分钟。
提取后，静置样品30分钟以使预混合物沉淀。用移液管取出5ml样品。样品是在溶液表面下2-5cm处取出的，将样品放入离心玻璃管中，加盖。
样品于4000rpm下离心10分钟。
分析
直接分析饲料样品提取物。
将预混合物的提取物稀释至约1．5FTU／g(A415(主样品)＜1．0)。
将0．22M含有吐温20的醋酸缓冲液用于稀释。
主样品
从提取和离心的样品中取出2×100ml的上清液置于标记的玻璃试管中，每个管中放入一根磁铁。
所有样品准备好后，将样品置于伴有搅拌的水浴中。温度：37℃。
加入3．0ml底物。
加入底物后孵育正好60分钟。
将样品从水浴中取出，加入2．0ml终止溶液(加入底物后精确地为60分钟)。
搅拌样品1分钟或更长时间。
在4000rpm下将饲料样品离心10分钟(不必要离心预混合物样品)。
盲样品
从提取和离心的样品中取出100ml上清液置于标记的玻璃试管中，每个管中放入一根磁铁。
向样品中加入2．0ml终止溶液。
向样品中加3．0ml底物。
室温下孵育样品60分钟。
搅拌样品1分钟或更长些。
在4000rpm下离心饲料样品10分钟(不必要离心预混合物样品)。
标准品
从8个标准品的每一个中取出2×100ml，以及4×100ml 0．22M醋酸缓冲液(盲试剂)。
测定所有样品的A415。
计算
FTU／g=μmol PO4 3-(分钟*g(样品))
称量出Cg样品(研磨后)。
从提取和离心的样品中取出100μl。
PO4 3-标准曲线是线性的。
从PO4 3-标准物的回归曲线可以找到样品的实际浓度(浓度单位是mM)：
[PO4 3-]=(x-b)／a  x=A415  a=斜率  b=与y轴的截距
μmol PO4 3-／分={[PO4 3-](mM)×体积(升)×1000μmol／mmol}／t
t=以分钟为单位的孵育时间。
体积=以升为单位的样品体积=0．0001升。
1000=由mmol到μmol的转化系数。
FTU／G检验={(x-b)×体积×1000×Fp}／{a×t×C}
C=称量出来的样品克数
Fp=取出的样品与总样品(提取后)之间的关系。实例：从1000ml中取出0．100ml→Fp=1000／0．100=10000。
将下列值代入的简化表达式为：
t=60
体积=0．00011
Fp=10000
FTU／g样品={(x-b)×0．0001×1000×10000}／{a×60×C}
实施例3
测定各种植酸酶的最适温度和熔点Tm
已经测定了各种植酸酶的热稳定性，即熔化温度，Tm，和／或最适温度。
按照EP 0420358和van Hartingsveldt等(基因(Gene)，127，87-94，1993)所述制备黑曲霉NRRL 3135的植酸酶。
按照EP-0897985和其中的文献描述的方法制备烟曲霉ATCC 13073、土曲霉9A-1、土曲霉CBS 116．46、构巢曲霉、嗜热毁丝霉和嗜热踝节菌的植酸酶。
EP 0897985中显示共有-植酸酶-1(图5)和共有-植酸酶-1-Q50T并描述了其制备。
根据EP-0897985(分别为实施例1-2和3-7)中描述的技术衍生和制备共有-植酸酶-10，然而向图1序列中加入Thermomyces lanuginosa(Berka等，Appl．Environ．Microbio1．64，4423-4427，1998)，担子菌共有序列(按照下面描述衍生)-省略黑曲霉T213的序列，赋予余留的黑曲霉植酸酶序列权重0．5。图7显示共有-植酸酶-10序列的衍生。
担子菌共有序列也根据EP-0897985的原则诱导，即由WO98／28409的5个担子菌植酸酶，以成熟植酸酶(排除信号肽)的第一个氨基酸残基开始。赋予两个Paxillus植酸酶权重0．5，赋予所有其它基因权重1．0，见图6。
类似于EP-0897985中实施例5-8的方法，通过引入三个回复-突变K94A、V158I和A396S(“热(3)”或“热”)，以及也可使用突变Q50T或Q50T-K91A，而由共有-植酸酶-10制备突变蛋白共有-植酸酶-10-热、共有-植酸酶-10-热-Q50T-K91A(图10)和共有-植酸酶-10-热-Q50T。
类似于EP-0897985中实施例8的方法，通过引入八个突变E58A、D197N、E267D、R291I、R329H、S364T、A379K和G404A(“热(8)”)，以及，也可使用突变Q50T或Q50T-K91A，而由共有-植酸酶-1制备突变蛋白共有-植酸酶-1-热(8)、共有-植酸酶-1-热(8)-Q50T-K91A(图9)和共有-植酸酶-1-热(8)-Q50T。
通过引入三个突变K94A、V158I和A396S而由共有-植酸酶-1制备共有-植酸酶-1-热(3)。
按照上述总体描述，制备表1中所示的烟曲霉所谓的α-变株(突变为Q51(27)T、F55Y、V100I、F114Y、A243L、S265P、N294D突变)和它们的其它突变蛋白。位置编号指本文的图11，括号中的数字指在EP0897010中使用的编号。
根据例如EP 0897985的描述可以制备编码上述热稳定性植酸酶的DNA构建体。为使它们在植物表达，参考本发明的描述。
为了测定植酸酶的解叠温度或熔化温度，Tm，使用以前由Brugger等(1977)公布的差示扫描量热法：“用差示扫描量热法研究植酸酶和pH2．5酸性磷酸酶的热变性”，植酸盐和植酸酶的生物化学(Rasmussen编著，S．K；Raboy，V．；Dalbφge，H．和Loewus，F．；Kluwer学术出版社出版)。
配制50-60mg／ml蛋白质的均相的或纯化的植酸酶溶液，用pH5．0 10mM醋酸钠进行广泛透析。以10℃／分的恒定加热速度加热至90-95℃。
对上述植酸酶测得的Tm的结果见下面表1；对选择的植酸酶的测定结果也由图1-4所示。
在下表1中，也给出了各种植酸酶的最适温度。对于此测定，植酸酶的活性基本上是根据Mitchell等(微生物学(Microbiology)143；245-252，1997)的描述进行测定的：在含有0．5％植酸(～5mM)的pH5．0的200mM醋酸钠的分析混合物中测定酶的活性。于37℃孵育15分钟后，加入等体积的15％三氯乙酸终止反应。通过100μl分析混合物与900μl H2O和1ml的0．6MH2SO4、2％抗坏血酸及0．5％钼酸铵进行混合来测量释出的磷酸盐。将磷酸钾的标准溶液用作参照。一个单位酶活性定义为37℃下每分钟释放1μmol磷酸盐的酶的量。根据Pace等(蛋白质科学(Prot．Sci．)4；2411-2423，1995)等的描述，利用在280nm下的酶消光系数测定蛋白浓度：共有植酸酶，1．101；共有植酸酶7，1．068；共有植酸酶10，1．039。
为测定最适温度，酶(100μl)和底物溶液(100μl)在指定温度下预热5分钟。向酶中加入底物溶液启动反应。孵育15分钟后，用三氯醋酸终止反应，测定释出的磷酸盐的量。植酸酶活性对温度作图，植酸酶活性达到最大值时的温度即是最适温度。
表1各种植酸酶的最适温度和Tm
Figure 9980400900201

Claims (14)

1．制备动物饲料的方法，所述方法包括饲料成分的团聚，其中在团聚前或团聚期间加入热稳定性植酸酶。
2．权利要求1所述方法，其中饲料成分被加热到至少65℃的温度。
3．权利要求1或2的方法，其中热稳定性植酸酶是具有用DSC测得的Tm为至少65℃的植酸酶，DSC使用的是10℃／分钟的恒定加热速度。
4．权利要求1-3中任一项所述的方法，在饲料膨胀机中进行。
5．权利要求1-3中任一项所述方法，在挤出机中进行。
6．权利要求1-3中任一项所述方法，在造粒压榨机中进行。
7．权利要求1-6中任一项所述方法，其中热稳定性植酸酶存在于转基因植物中。
8．权利要求1-7中任一项所述方法，其中团聚包括下列步骤：
(a)将饲料成分预热到至少45℃的温度；和
(b)加热步骤(a)的产物到至少65℃的温度；
其中热稳定性植酸酶是在步骤(a)和／或(b)之前或期间加入的。
9．一种转基因植物，其含有编码热稳定性植酸酶的DNA-构建体。
10．权利要求9所述的转基因植物，其中编码热稳定性植酸酶的DNA-构建体可操作地与能够介导所述植酸酶编码序列在至少植物的一部分中表达的调节序列连接。
11．含有编码热稳定性植酸酶的DNA构建体的表达构建体，可操作地与能够介导所述植酸酶编码序列在植物的至少一部分中表达的调节序列连接。
12．一种载体，其含有权利要求11所述的表达构建体。
13．制备能够表达热稳定性植酸酶的转基因植物的方法，所述方法包括下列步骤：
(ⅰ)离编码热稳定性植酸酶的核苷酸序列；
(ⅱ)将(ⅰ)的核苷酸插入到能够介导该核苷酸序列在选定的宿主植物中表达的表达构建体中；和
(ⅲ)用表达构建体转化选定的宿主植物。
14．权利要求13所述的方法，进一步包括从植物中提取植酸酶的步骤。
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