CN1606627A - 谷物加工方法和其中有用的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了加工谷物(例如玉米和大豆)的新方法，通过使用硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶来提高淀粉和蛋白质的可提取性和回收量。本发明进一步提供了表达热稳定硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的新的转基因植物。

Description

谷物加工方法和其中有用的转基因植物
本发明涉及尤其是在玉米湿磨法和大豆加工过程中提高蛋白质和淀粉回收量的谷物加工的改进方法，以及在此类过程中有用的新转基因植物。
硫氧还蛋白(TRX)和硫氧还蛋白还原酶(TR)是通过NADPH来还原蛋白质中二硫键的酶。蛋白质二硫键在谷物加工效率和谷物加工之后回收产物的质量上起了很重要的作用。消除或者减少谷物中蛋白质二硫键程度的有效方法的开发能够提高加工效率。此外，分子间或分子内的二硫键也可影响谷物或源于谷物的产物在牲畜饲料中的表现。通过减少二硫键的程度可增加谷物的可消化性、营养物的可利用性和抗营养因子(例如蛋白酶和淀粉酶抑制剂等)的中和(见WO 00/36126，1999年12月15日申请)。
在玉米和大豆中表达转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶以及在谷物加工中(例如湿磨法)使用硫氧还蛋白是一种在工业加工过程中或之前减少种子蛋白质中二硫键的新的替代方法。因此本发明提供了经过改良的储存蛋白质质量的谷物，以及在工业加工或动物消化过程(两者随后均称为“加工”)中与正常谷物在质量上表现不同的谷物。
本方法通过传送硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶消除了开发在加工过程中额外加入外源硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的来源的必要。通过谷物供应硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的第二个好处在于：对种子完整性的物理破坏不必再让酶在加工之前与种子中的储藏蛋白或基质蛋白接触，或作为额外加工步骤。
三种在谷物加工过程中使用硫氧还蛋白的方法如下：
1.在种子发育时通过表达该蛋白质，并使其发生作用，来改变收获谷物的组成和质量；
2.在种子发育时通过表达该蛋白质(但无活性)来改变产物在加工时的质量；
3.在谷物中生产硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶，通过在加工过程中添加该谷物来改变其他谷物产物的质量。
在此描述的本发明对于任何谷物都适用，尤其是玉米、大豆、小麦和大麦，特别是玉米和大豆，最特别是玉米。在谷物中表达转基因的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶是一种具有以下作用的方法：改变需要经过谷物加工的材料(种子)质量、改变从谷物加工而来的材料质量、在加工过程中使特别的种子成分的产率最大化(提高效率)、改变加工方法和为从研磨物流而来的种子组分或成分创造新用途。
因此本发明提供了一种表达硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶(如在植物体内非天然表达的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶)的植物，例如，含有编码硫氧还蛋白的异源DNA序列的植物，该异源DNA序列稳定地整合入植物的核DNA或质体DNA，优选在一个可诱导的启动子控制下(如化学试剂诱导的启动子)，例如有效连接在可诱导的启动子上或受反式激活蛋白调控的启动子控制，其中相应的反式激活蛋白受可诱导的启动子的控制或在另一种植物体内表达，以致通过与另一种植物杂交可激活该启动子；其中硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶优选地为热稳定的或真核还原酶；因此该植物也可包括经任选地处理(例如接触过抗原的(primed)或包被的)和/或包装的种子(例如连同使用说明书一起包装在一个袋内)，以及从那里收获的种子，例如用于以上曾提过的研磨加工过程。
本发明的转基因植物可选择地进一步包含提高硫氧还蛋白还原酶和/或NADPH产量的基因。
更进一步地本发明提供了一种生产硫氧还蛋白的方法，包括培育如上所述的表达硫氧还蛋白的植物；提供了一种生产淀粉和/或蛋白质的方法，包括从如上所述的植物收获的种子中提取淀粉或蛋白质；还提供了一种湿磨法，包括浸泡来自如上所述的表达硫氧还蛋白的植物体的种子以及从其中提取淀粉和/或蛋白质。
更进一步地本发明提供了一种在植物中可表达的表达盒，包括硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的编码区，优选地为来自一个嗜热生物的硫氧还蛋白，例如来自古细菌，如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)或闪烁古生球菌(Archaeglobus fulgidus)，如下所述，其中编码区优选地优化为含有植物的偏爱密码子，并且将在植物中起作用的启动子和终止子序列有效地与所述编码区连接，其中启动子优选地为种子特异启动子或可诱导的启动子，如一个化学试剂诱导的启动子或反式激活蛋白调控的启动子；例如，一个在质体或核中可表达的表达盒，包括一个启动子，如受核反式激活蛋白调节的反式激活蛋白介导的启动子(例如当反式激活蛋白为T7RNA聚合酶时，该启动子可以是T7启动子，并且T7RNA聚合酶的表达可以选择性地受可诱导的启动子的控制)。
更进一步地，本发明提供了包含此类在植物中可表达的表达盒的载体。
更进一步地，本发明提供了用此类载体转化的植物或在其基因组中(如核或质体基因组)含有此类在植物中可表达的表达盒的转基因植物。
本发明也包括了一种生产含有高含量的硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的谷物的方法，该方法包括用含有异源表达盒的第二种植物的花粉给含有异源表达盒的第一种植物授粉，并从如此授粉的植物中回收谷物，其中第一种植物的异源表达盒含有受反式激活蛋白介导的启动子调控的，并且与之有效地连接的编码硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的DNA序列，而且第一种植物优选是去雄的或雄性不育的，第二种植物的异源表达盒含有有效连接在DNA序列上的启动子，其中上述DNA序列编码能调控上述反式激活蛋白介导的启动子的反式激活蛋白。
本发明也提供了一个核酸分子，包含编码真核拟南芥(Arabidopsis)NADPH+依赖性的硫氧还蛋白还原酶(NTR)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列优化为在单子叶植物中表达，优选地优化为在玉米中表达。该核苷酸序列优选为SEQ ID NO：24的核苷酸序列，优选编码SEQ ID NO：25的氨基酸序列。
本发明也提供了分离的核酸分子，包含编码真核水稻NADPH+依赖性的硫氧还蛋白还原酶(NTR)的核苷酸序列。该核苷酸序列优选地编码SEQ ID NO：27的氨基酸序列。该核苷酸序列优选地为SEQ ID NO：25的核苷酸序列。
序列表的简要描述
SEQ ID NO：1-来自詹氏甲烷球菌的硫氧还蛋白的蛋白质序列(gil 1591029)。
SEQ ID NO：2-来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白的蛋白质序列(gil 2649903)(trx-1)。
SEQ ID NO：3-来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白的蛋白质序列(gil 2649838)(trx-2)。
SEQ ID NO：4-来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白的蛋白质序列(gil 2649295)(trx-3)。
SEQ ID NO：5-来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白的蛋白质序列(gil 2648389)(trx-4)。
SEQ ID NO：6-来自詹氏甲烷球菌的硫氧还蛋白还原酶(trxB)的蛋白质序列(gil 1592167)。
SEQ ID NO：7-来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白还原酶的蛋白质序列(gil 2649006)(trxB)。
SEQ ID NO：8-引物NMD 109。
SEQ ID NO：9-引物NMD 110。
SEQ ID NO：10-引物NMD 102。
SEQ ID NO：11-引物NMD 103。
SEQ ID NO：12-引物NMD 124A。
SEQ ID NO：13-引物NMD 125A。
SEQ ID NO：14-引物NMD 126。
SEQ ID NO：15-引物NMD 127。
SEQ ID NO：16-引物NMD 128。
SEQ ID NO：17-引物NMD 129。
SEQ ID NO：18-引物STRF 1A。
SEQ ID NO：19-引物STRF 1B。
SEQ ID NO：20-引物STRF 2A。
SEQ ID NO：21-引物STRF 2B。
SEQ ID NO：22-引物STR 3A。
SEQ ID NO：23-引物STR 3B。
SEQ ID NO：24-玉米中优化的编码拟南芥NADPH依赖性的硫氧还蛋白还原酶的序列。
SEQ ID NO：25-由SEQ ID NO：24编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26-编码水稻NADPH依赖性的硫氧还蛋白还原酶(NTR)的序列。
SEQ ID NO：27-由SEQ ID NO：26编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28-引物P9。
SEQ ID NO：29-引物P10。
SEQ ID NO：30-引物P4。
SEQ ID NO：31-引物P1。
SEQ ID NO：32-引物P2。
SEQ ID NO：33-引物P5。
SEQ ID NO：34-引物P12。
SEQ ID NO：35-引物P11。
SEQ ID NO：36-引物P27。
SEQ ID NO：37-引物P28。
SEQ ID NO：38-引物P29。
SEQ ID NO：39-引物P26。
SEQ ID NO：40-引物P31。
SEQ ID NO：41-引物Thiorodoxubi 1603
SEQ ID NO：42-引物Thiorodox 2364
“联结/有效连接”指两段物理或功能相关的核酸序列。例如，如果有效连接或定位以致于调节DNA序列能够影响编码或结构DNA序列表达的水平，启动子或调节DNA序列被认为与编码RNA或蛋白质的DNA序列是“联结”的。
“嵌合基因”为重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列与编码mRNA或表达为蛋白质的核酸序列有效连接或联结，以至于该调节核酸序列能够调节所联结核酸序列的转录或表达。在自然界中，嵌合基因的调节核酸序列通常不是与它所联结的核酸序列有效连接的。
“编码序列”是可转录为RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地该RNA在生物体内可随后被翻译为蛋白质。
互补：“互补”指两条核苷酸序列(包含两条反向平行的核苷酸序列)可在反向平行的核苷酸序列的互补碱基对之间通过形成氢键来进行配对。
DNA改组：DNA改组是一种快速、简单且有效的方法，以向DNA分子优选随机地引入突变或重排，或在两个或更多DNA分子之间优选随机地产生DNA序列交换。DNA改组所产生的DNA分子为改组DNA分子，它是非自然出现的DNA分子，并且从至少一个模板DNA分子衍生而来。与模板DNA编码的酶相比，该改组DNA编码经修饰了的酶，优选地为具有改变了的生物学活性的酶。
酶/蛋白质活性：在此指酶(或蛋白质)将底物催化转化为产物的能力。酶的底物包括天然酶底物，也包括天然底物的类似物，酶可将该类似物转化为产物或产物的类似物。酶活性可用诸如一定时间之后在反应中检测产物的量，或一定时间之后检测剩余底物的量的方法来测得。酶活性也可通过一定时间之后测定反应混合物中剩余未消耗的辅助因子的量或一定时间之后测定反应混合物中消耗的辅助因子的量来测得。酶活性还可以通过一定时间之后测定反应混合物中自由能供体或高能分子(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的剩余量或一定时间之后测定反应混合物中消耗的自由能供体或高能分子(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量来测得。
表达盒：在此使用的“表达盒”表示可在适当的宿主细胞中指导一段特定核苷酸序列表达的DNA序列，包含与目标核苷酸序列有效连接的启动子，该目标核苷酸序列又和终止信号有效连接。通常它也包含该核苷酸序列适当翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白质，但也可编码一段功能RNA，例如有义或反义方向上的反义RNA或非翻译的RNA。包括目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，即它组分中的至少一个相对于其它组分中的至少一个是异源的。表达盒也可以是天然出现的，但是以用于异源表达的重组形式获得。然而，与宿主相比，表达盒一般为异源的，即该表达盒的特定DNA序列并非宿主细胞自然产生的，而是需要通过转化导入宿主细胞或宿主细胞的祖先。表达盒中核苷酸序列的表达可受组成型启动子或可诱导的启动子的控制，对于可诱导的启动子而言，只有当宿主细胞暴露于特定的外界刺激时，该启动子才开始转录。在诸如昆虫之类的多细胞生物中，启动子可以是特定组织、器官或发育阶段特异的。
基因：术语 “基因”广泛使用以指与生物学功能相关的任何DNA片段。因此，基因包括编码序列和/或它们表达所需的调控序列。基因也可包括不表达的DNA片段，例如其他蛋白质的识别序列。可从多种来源得到基因，包括从目标来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，也可以包括为得到所需参数而设计的序列。
异源DNA序列：在此使用的“异源DNA序列”、“外源DNA片段”或“异源核酸”均指由外源(相对于特定宿主细胞)产生的序列，或者如果是从相同来源产生的，那就是对它产生时的形式进行了修饰。因此，在宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞中的内源但已被修饰过的基因，例如用DNA改组。该术语还包括自然出现的DNA片段的非自然出现的多拷贝。因此，该术语指对于细胞来说是外源或异源的DNA片段，或者该片段虽然与细胞同源，但却在宿主细胞的核酸中处于特殊的位置，通常情况下，在该位置是不会发现该片段的。表达外源DNA片段以产生外源多肽。
同源DNA序列：与宿主细胞天然相关的DNA序列。
“同质体的”指在植物、植物组织或者植物细胞中所有的质体在遗传上是相同的。这是植物体的正常状态，当质体还未被转化、突变或遗传上被改变的时候。在不同组织或不同的发育阶段，质体可以有不同的形式，如叶绿体、前质体、白色体、造粉体、有色体等等。
分离的：在本发明的上下文中，分离的DNA分子或分离的酶指通过人工方法从原天然环境中分离出来的DNA分子或蛋白质，因而不是天然产物。分离的DNA分子或蛋白质可以纯化的形式存在，或者存在于非天然环境中，例如在转基因宿主细胞中。
成熟蛋白质：正常定向于细胞器并且已被切除转运肽的蛋白质。
最小启动子：不具有活性或启动子活性大大降低的启动子元件(尤其为TATA元件)，并且没有上游激活序列。当存在合适的转录因子时，最小启动子可行使功能以允许转录。
修饰的酶活性：与在昆虫体内自然出现的酶活性(即，在对此类活性缺乏人工直接或间接操纵的情况下，自然出现的酶活性)不同的酶活性，它对能抑制自然出现的酶活性的抑制剂具有耐受性。
天然的：指在未经转化的昆虫细胞基因组中存在的基因。
自然出现的：“自然出现的”用来描述与人工生产不同的并且能在自然界找到的物体。例如，在生物体中(包括病毒)存在的、可从自然来源分离出来并且还未在实验室经过人为修饰的蛋白质或核苷酸序列，是自然出现的。
核酸：“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的多聚体。除非特别限定，该术语包括含有已知天然核苷酸类似物的核酸，它们与上面所述的核酸具有相似的结合性质，并且与自然出现的核苷酸以相似的方式代谢。除非特别说明，特定的核酸序列也包含其保守性修饰的变体(例如简并密码子的取代)、互补序列以及清楚说明的序列。特别的，简并密码子的取代可通过将一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位用混和碱基或脱氧次黄苷残基取代而完成(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。术语“核酸”或“核酸序列”也可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
“植物”指在任何发育阶段的任何植物，尤其为种子植物。
“植物细胞”为植物的结构和生理单元，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可为分离的单细胞或培养细胞的形式，也可为更高级组织单位的一部分，例如植物组织、植物器官或整个植物体。
“植物细胞培养”指植物单元的培养，例如原生质体、细胞培养的细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、受精卵以及处于各个发育阶段的胚。
“植物材料”指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、受精卵、种子、插条、细胞或组织培养或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”指植物体明显的、具有可见结构和分化的部分，例如根、茎、叶、花蕾或胚。
“植物组织”在此指组织成一个结构和功能单元的一群植物细胞。包括植物活体或培养体系中的任何组织。该术语包括，但并不限于整个植物体、植物器官、植物种子、组织培养体系和任何组织成结构或功能单元的植物细胞群。该术语连同或不连同如上所列出或被该定义所涵盖的任何特定植物组织类型的使用，并不旨在排除其他任何类型的植物组织。
“启动子”为编码区上游的非翻译DNA序列，含有RNA聚合酶II的结合位点，并可启动DNA转录。启动子区域也可包含对基因表达起调控作用的其他元件。
“原生质体”为没有细胞壁或仅有部分细胞壁的经分离的植物细胞。
“纯化的”.当用来指核酸或蛋白质时，“纯化的”意味着核酸或蛋白质基本上不含天然状态下与其相连的其他细胞成分。尽管它可以是干燥或水溶液的状态，但它优选地以同质状态存在。可通过分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱，来确定纯度和同质性。在制备物中以主要成分存在的蛋白质可以认为是基本上纯化的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳胶中基本上呈现一条条带。特别的，它意味着核酸或蛋白质纯度为至少50％，更优选的为至少85％，最优选的为至少99％。
“调控元件”指涉及控制核苷酸序列表达的序列。调控元件包括与目标核苷酸序列有效相连的启动子和终止信号。它们一般也包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。
“显著增加”.酶活性的增加大于测量技术的固有误差极限，优选地在抑制剂存在时比野生型酶活性增加约2倍或更多，更优选地增加大约5倍或更多，最优选地增加大约10倍或更多。
当用于两条或更多的核酸或蛋白质序列时，“相同”或百分比“一致性”指当在最大对应时互相比较和比对，两条或更多的序列或子序列为相同的或含有特定百分比相同的氨基酸残基或核苷酸，可通过以下的比较算法或目视检查得出。
基本上相同：两条核酸或蛋白质序列“基本上相同”，指在最大对应时互相比较和比对，两条或更多的序列或子序列具有至少60％，优选的80％，更优选的90-95％，最优选的99％的核苷酸或氨基酸残基的一致性，可通过以下的比较算法中的一种或目视检查得出。优选地，基本上一致性存在于长度至少为50个残基的序列区域，更优选地为至少100个残基的区域，最优选地为在150个残基的区域内都存在基本上一致性。在最优选的实施方案中，在编码区的全长内都存在基本上一致性。此外，基本上一致的核酸或蛋白质序列行使基本上一致的功能。
在序列比较中，通常将一条序列作为参照序列，待测序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将待测和参照序列输入电脑(必要时标明子序列座标)，指定序列算法程序的参数。然后基于指定的程序参数，序列比较算法计算出待测序列相对于参照序列的序列一致性百分比。
可通过以下方法来进行序列比较的最佳比对：Smith & Waterman在Adv.Appl.Math 2：482(1981)中提出的局部同源性算法，Needleman和Wunsch在J.Mol.Biol.48：443(1970)中提出的同源比对算法，Pearson和Lipman在Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)中提出的相似性寻找方法，这些算法的计算机化执行[Wisconsin遗传软件包(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA]，或目视检查(可一般性参阅Ausubel等，见下文)。
适用于序列一致性百分比和序列相似性测定的工具的例子为BLAST算法，在Altschul等的J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中有描述。在国家生物信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可得到公开的BLAST分析软件。该算法首先通过确定在查询序列中长度为W的短字串来确定高分值序列对(HSPs)，当与序列数据库中具有相同长度的字串进行比对时，该高分值序列满足某个正的阈值T或者与T匹配。T指相邻字串阈值(Altschul等，1990)。这些起始的相邻字串作为种子开始寻找含有这些字串的更长的HSPs。接着，这些字串沿着每条链向两个方向延伸直至累积比对分值增加。对于核苷酸序列，累积分值是通过参数M(给一对配对残基的奖励分值，总为＞0)和N(对错配残基的惩罚分值，总为＜0)来计算的。对于氨基酸序列，使用分值矩阵来计算累积分值。当累积比对分值从它的最大值下降X时，或者当累积分值降至0或更低(由于一个或更多的负分值残基比对)时，或者当任何一条序列到达了尽头时，字串在每个方向的延伸就停止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认值：字串长(W)为11，期望值(E)为10，截止为100，M＝5，N＝-4，两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认值：字串长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62分值矩阵(见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
除了计算序列一致性百分比，BLAST算法也可用于两条序列之间相似性的统计分析(如见Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性测量为最小概率之和(P(N))，它提供了在两条核苷酸或氨基酸序列之间随机匹配的概率。例如，如果待测核酸序列与参照核酸序列对比的最小概率之和小于0.1，优选地为小于0.01，最优选地为小于0.001，则待测核酸序列可认为类似于参照序列。
两条核酸序列为基本上一致的另一个标志是在严格条件下两个分子可互相杂交。“特异性地杂交”指在严格条件下一个分子只和存在于DNA或RNA的复杂混合物中(例如总细胞)的特定的核酸序列结合、配对或杂交，。“基本上结合”指探针核酸和目标核酸的互补杂交，包括较小的错配，该错配可以通过降低杂交介质的严紧性来弥补，以达到对目标核酸序列的检测。
“严格杂交条件”和“严格杂交洗脱条件”在核酸杂交实验例如Southern和Northern杂交中的上下文均为序列依赖性的，且在不同环境参数下而不同。长序列特异杂交需要在较高的温度下进行。在Tijssen(1993)的《生物化学和分子生物学实验技术-核酸探针杂交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第I部分第2章“杂交原理概述和核酸探针试验策略”(Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assay)(Elsevier，纽约)中有关于核酸杂交的大量指导。总的来说，对于特定序列，在一定的离子强度和pH值下，高度严格的杂交和洗脱条件为低于热解链温度(Tm)约5℃。通常，在“严格的条件”下，一个探针会同其目标序列杂交，而不同其它序列杂交。
Tm为50％的目标序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在一定的离子强度和pH值下)。对于一个特定的探针，选择非常严格的条件以与Tm相当。在Southern和Northern印迹中，两条具有100个以上互补残基的互补核酸在膜上杂交的严格条件的一个例子是50％甲酰胺和1mg的肝素，于42℃杂交反应过夜。高度严格的洗脱条件的一例为在0.15M的NaCl中于72℃洗脱15分钟。严格的洗脱条件的一例为在0.2×SSC中于65℃洗脱15分钟(见Sambrook，见下文中关于SSC缓冲液的描述)。通常地，在高度严格的洗脱前使用低严格性的洗脱去除背景的探针信号。中度严格的洗脱的一例为将具有例如100个以上碱基的双螺旋链在1×SSC中于45℃洗脱15分钟。低严格性的洗脱的一例为将具有例如100个以上碱基的双螺旋链在4-6×SSC中于40℃洗脱15分钟。对于短的探针(例如约10-50个核苷酸)，严格的洗脱条件通常涉及低于1.0M的Na离子浓度，通常约为0.01-1.0M的Na离子浓度(或者其他的盐)，pH为7.0至8.3，温度通常为至少约30℃。严格条件也可通过添加诸如甲酰胺之类的去稳定剂而达到。总之，特定杂交试验中的信噪比比所观察到的无关探针的信噪比高2倍(或更高)，即表明检测到了杂交。在严格条件下互不杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么这两条核酸仍是基本上相同的。例如在遗传密码允许的前提下，使用最大密码子简并性来产生核酸的拷贝时，这种情况会发生。
如下为杂交/洗脱条件组合的例子，可用于克隆与本发明中的参照序列基本上相同的同源核苷酸序列：优选地，参照核苷酸序列与参照核苷酸序列的杂交条件为7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mMEDTA，反应温度50℃，洗脱条件为于50℃在2×SSC和0.1％SDS中；更理想的为7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反应温度50℃，洗脱条件为于50℃在1×SSC和0.1％SDS中；更理想的杂交条件仍为7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反应温度50℃，洗脱条件为于50℃在0.5×SSC和0.1％SDS中；优选的杂交条件为7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反应温度50℃，洗脱条件为于50℃在0.1×SSC和0.1％SDS中；更优选的杂交条件为7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，反应温度50℃，洗脱条件为于65℃在0.1×SSC和0.1％SDS中。
两条核苷酸序列或蛋白质为基本上相同的另一个标志是由第一个核酸编码的蛋白质能够与第二个核酸编码的蛋白质发生免疫交叉反应或者特异性结合。因此，一个蛋白质通常与另一个蛋白质是基本上相同的，(例如)如果它们仅仅由于保守取代而不同。
当指蛋白质或者肽时，短语“与抗体特异性(或选择性)结合”或“与……发生特异性(或选择性)的免疫反应”，指一个结合反应，它能够确定当异源蛋白质或其他生物制剂存在时蛋白质的存在与否。因此，在指定的免疫测定条件下，特定的抗体只和特定的蛋白质结合，而不与样品中存在的其他蛋白质发生显著量的结合。在这样的条件下，与一个抗体发生特异性结合可能需要选择一个对特定蛋白质具有特异性的抗体。例如，针对具有本发明中任何核酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质制备的抗体可以被选择，从而得到与该蛋白质而不与其它蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(多态变体除外)。
一系列的免疫测定方式可用于选择对一个特定蛋白质具有特异免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定、Western印迹或免疫组织化学都是常规用于选择对一个特定蛋白质具有特异免疫反应的单克隆抗体的方法。见Harlow和Lane(1988)《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，纽约“Harlow和Lane”)，其中有关于测定特定免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述。通常，一个特异性或选择性的反应会比背景信号或噪声高出至少两倍，更通常地比背景高出10至100倍。
特定核酸序列的“保守性修饰变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸序列，或者当核酸序列不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸都可编码任何一个给定的多肽。例如，密码子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码精氨酸。因此，在每个编码精氨酸的密码子位置，可按照如上描述的相应的密码子将其替换而不会改变所编码的蛋白质。这一类的核酸突变称为“沉默突变”，为一种“保守性修饰变异”。除非特别标明，在此描述的每一种编码蛋白质的核酸序列都可能为沉默突变。技术人员知道核酸中的每个密码子(除了ATG，它是甲硫氨酸的唯一密码子)都可通过标准技术经修饰后产生另一个功能相同的分子。因此，在每个描述的序列中都隐含有编码蛋白质的核酸序列的“沉默突变”。
此外，技术人员也知道在编码序列中，导致单个氨基酸或很小百分比(通常为小于5％，更通常地为小于1％)的氨基酸改变、增加或缺失的个别的取代、缺失或增加都可被称为“保守性修饰变异”，其中这些改变导致一个氨基酸被其在化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本领域中是熟知的。如下五组中每组都包括可互相保守性取代的氨基酸：脂肪族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳香族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性氨基酸：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性氨基酸：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。也可见Creighton(1984)的《蛋白质》(Proteins)，W.H.Freeman and Company。此外，可导致编码序列中一个氨基酸或很小百分比的氨基酸的改变、增加或缺失的单个的取代、缺失或增加也称为“保守性修饰变异”。
“子序列”指分别含有较大核酸序列或氨基酸序列(如蛋白质)的一部分的核酸序列或氨基酸序列。
当另外的核苷酸(或者其他类似分子)整合入核酸时，核酸“延伸”。最普遍的是通过聚合酶(如DNA聚合酶)来实现的，例如在核酸3’末端添加序列的聚合酶。
当分别来自两条核酸的序列组合为子核酸时，这两条核酸为“重组的”。当两条核酸都为重组底物时，这两条序列是“直接”重组的。当两条核酸通过中间物例如交换寡核苷酸来进行重组时，这两条序列称为“间接”重组的。在间接重组时，至多一条序列为重组的实际底物，在一些情况下，两条序列都不是重组的底物。
“合成的”指具有在天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。例如，一段与双子叶和/或单子叶基因的G+C含量非常接近，并且具有其正常的密码子分布的人工合成的序列称为“合成的”。
“反式激活蛋白”是能使编码区转录的蛋白质(独自或结合一个或多个其它蛋白质)，其中该编码区受相应的反式激活蛋白介导的启动子的控制。反式激活蛋白系统的例子包括“噬菌体T7基因10启动子，其转录激活依赖于特定的RNA聚合酶，例如噬菌体T7 RNA聚合酶。反式激活蛋白通常为能与特定启动子相互作用以启动转录的RNA聚合酶或DNA结合蛋白，它以直接激活启动子或使抑制基因失活的方式(例如抑制阻遏蛋白的表达或积累)行使上述功能。DNA结合蛋白可以是一个含有与合适的转录激活因子区域相连的结合区(如GAL4结合区)的嵌合蛋白。一些反式激活蛋白系统可有多个反式激活蛋白，例如一些不仅需要聚合酶，也需要一个特定亚基(σ因子)来识别启动子、结合DNA或激活转录的启动子。反式激活蛋白相对于植物体优选是异源的。
转化：将异源DNA引入细胞、组织或昆虫的方法。转化的细胞、组织和昆虫应该理解成不仅包含转化方法的终产物，也包含其转基因后代。
“转化的”、“转基因的”和“重组”指引入异源核酸分子的宿主生物，例如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合入宿主基因组，或者该核酸分子也可以染色体外分子的形式存在。这样一个染色体外分子可以是自主复制性的。转化的细胞、组织和昆虫应该理解成不仅包含转化方法的终产物，也包含其转基因后代。“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物，例如细菌和植物。
按照如下标准缩写用碱基来表示核苷酸：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)。按照如下标准缩写来表示氨基酸：、丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。此外，(Xaa，X)代表任何氨基酸。
湿磨法
湿磨法是一种分离谷物中，尤其为谷类(如玉米)中淀粉、蛋白质和脂肪组分的方法。在此它和干磨法是有区别的，干磨法只是简单地粉碎谷物。玉米湿磨法包括浸泡、磨碎谷粒和分离谷粒组分几个步骤。湿磨法的第一个步骤通常为浸泡，其中将谷物在小心控制的条件下浸泡于水中，来达到软化谷粒利于分离各组分的目的。通常将谷粒浸泡于盛有120°F回流水的浸泡缸中，其中含有约0.2％(重量)的二氧化硫。谷粒在浸泡缸中浸泡24至48个小时。而后将其去水，放入几组磨碎机。第一组磨碎机将谷粒破裂并从谷粒的剩余部分释放出胚芽和玉米油。通过离心将胚芽从剩余的谷物中分离出来。带油的胚漂浮在水溶液的表面并被除去。其次，经过水化和去水、研磨、筛选、离心和洗涤，可从蛋白质中分离出淀粉并纯化。去除胚后，剩余的谷物组分(包括淀粉、谷壳、纤维和谷蛋白)均被放入另一组磨碎机，经过一系列的洗涤筛，将纤维和淀粉、谷蛋白分离开来。淀粉和谷蛋白均能通过筛，而纤维不能。用离心或第三次研磨之后离心的方法将淀粉和蛋白质分开。离心产生含有淀粉颗粒的浆液，它经过去水、用新鲜水洗涤并干燥至约12％湿度。用这种方法就可从玉米谷粒中回收得到基本上纯的淀粉组分。
关键的难点在于从复杂的蛋白质基质和组成谷物胚乳的细胞壁物质中释放出淀粉颗粒。造成困难的一个原因是分子间或分子内二硫键的存在，使得蛋白质基质不易溶且对蛋白水解酶不敏感，并抑制了从谷物蛋白质基质中释放出淀粉粒。现在减少这些二硫键的主要方法是在二氧化硫存在的情况下浸泡谷物，然而这样操作是很昂贵、不环保的，并且效率也不是最优的。因为浸泡水中含有二氧化硫，因此该水被认为是有毒废弃物，所以将产生的水量降到最低程度是有利的。选择性地，可以不需要二氧化硫。降低胚乳基质中二硫键含量的另一个优点是在研磨之前减少谷物处理所需的浸泡时间。一些突变对玉米谷粒胚乳(粉状的和不透明的)中的蛋白质基质有较有利的影响，但是破坏了谷物的完整性。转基因硫氧还蛋白的表达提供了上述的几个有利条件而并不产生一些与突变相关的谷粒完整性问题。
收割后或加工依赖性的硫氧还蛋白的活性有相同的有利影响。例如，在一个实施例中，硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶被定位和累积于细胞小室中。在种子物理破坏之后蛋白质还原。在另一个实施例中，通过浸泡，处于休眠中的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶被激活。在一个优选的实施例中，本发明提供了一种能够表达热稳定硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶(例如来自一个嗜热生物的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶)的转基因植物，从而使得硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶除了在高温下均没有显著活性(例如高于50℃)。在一个实施例中，热稳定的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶通过胚乳中其他热稳定酶的表达可增强糖化作用。
饲料上的应用
在谷物中表达转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶也可用于改良与可消化性相关的谷物特征，尤其在动物饲料中。饲料蛋白质对蛋白酶的敏感性是时间和蛋白质构象的函数。在饲料配方中经常使用谷物破裂和蒸汽剥落(Steam flaking)。这两种方法都用来增加谷粒的可消化性。在动物的胃中其完整性更易被破坏的较软的颗粒是优选的。对蛋白酶敏感性的主要决定因素为构象限制和蛋白质之间的交联。通过增加硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的表达而修饰这些键，从而有助于消化。
玉米干磨法/湿润粉糊
蛋白质含量和质量是磨粉生产和湿润粉糊生产的重要决定因素。二硫键的减少改变了玉米粉的性质，从而使得它适用作小麦的替代物，尤其是来自高蛋白质含量的白玉米变种的粉末。
大豆压榨
美国的大豆作物中有一半为压榨或研磨处理的，产生的低脂肪豆粉或脱脂豆粉(或大豆粉)中的蛋白质质量对于以后的加工是很重要的。由大豆加工物流得到的蛋白质产量和质量在经济上是重要的，并且在很大程度上依赖于蛋白质构象。通过表达转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶来提高硫氧还蛋白的活性可提高蛋白质的可溶性，进而提高水溶性蛋白质组分的产率。在碱性条件下通过在水溶液中提取脱脂大豆粉可提高回收量。通过表达转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶提高了硫氧还蛋白的活性，同时也降低了有效提取所需的pH值，因此减少了加入的氢氧化钙或氢氧化钠的量，同时减少了随后酸沉降所需加入酸的量，使不经过碱的破坏就可有效回收蛋白质，进而减少水的消耗和加工植物产生的废水(其包含大量生化耗氧负荷)。蛋白质氧化还原状态影响了大豆蛋白质的重要功能特性，例如可溶性、吸水性、粘性、内聚力/粘附力、凝胶化和弹性。通过在此描述的提高硫氧还蛋白活性还可促进大豆蛋白质浓缩生产期间和蛋白酶对大豆蛋白质分离物的水解过程期间的纤维的去除。类似的，如同上述对玉米描述的一样，通过表达转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶提高硫氧还蛋白的活性也增加了具有酶活性的豆粉的功能，以及在动物饲料中大豆粉组分和蒸汽剥落组分的可消化性。提供了在种子发育过程中或加工过程中对蛋白质质量的修饰，尽管优选的为如上所述的转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶定向至细胞小室且为热稳定的，以避免种子发育过程中由于硫氧还蛋白的活性所导致的对储存蛋白质累积的可能遇到的显著负面效应。可选择地，硫氧还蛋白可作为加工酶添加，因为直到谷物的完整性被破坏(压碎和油提取)后才有必要破坏二硫键(与玉米湿磨法相反)。
用于异源表达的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的选择
硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因存在于真核生物，包括植物、真细菌以及古细菌，其中包括如詹氏甲烷球菌和闪烁古生球菌等嗜高温生物。对一个特定基因的选择部分依赖于所需的应用。对于本发明的方法，优选的硫氧还蛋白具有如下的特征：
1.热稳定性-来自嗜高温细菌的硫氧还蛋白和相关蛋白在高温下(＞50℃)均具有增加的热稳定性，而在环境温度下具有相对低的活性。在种子发育过程中优选表达来自嗜高温细菌的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶，例如来自詹氏甲烷球菌和闪烁古生球菌或其他嗜高温细菌，这样除非谷物浸泡或在高温下加工，硫氧还蛋白的活性不会有显著增加。大部分谷物加工过程包括或者可兼容高温的步骤。因此热稳定的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶为优选的。热稳定是指酶在高温时具有较高的活性，例如在高于40℃的温度下，最优选的温度为高于50℃，如湿磨法为45-60℃，甚至更高，45-95℃。
2.底物特异性-通过选择某一硫氧还蛋白，有可能降低对种子发育的不需要的作用，其中该硫氧还蛋白优先作用于某一蛋白质(如基质中的结构蛋白)，但对基本代谢酶具有低的活性。多种硫氧还蛋白显示了与在氧化还原条件控制下的酶作用的不同活性。因此选择能主要作用于目标的硫氧还蛋白是可能的，这样可使过量表达产生的不需要的负面效应降至最低。
适当的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶包括如下几种：
●来自詹氏甲烷球菌的硫氧还蛋白氨基酸序列(gil 1591029)
MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL(SEQ ID NO：1)；
●来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白氨基酸序列(gil 2649903)(trx-1)
MPMVRKAAFYAIAVISGVLAAVVGNALYHNFNSDLGAQAKIYFFYSDSCPHCREVKPYVEEFAKTHNLTWCNVAEMDANCSKIAQEFGIKYVPTLVIMDEEAHVFVGSDEVRTAIEGMK(SEQ ID NO：2)；
●来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白氨基酸序列(gil 2649838)(trx-2)
MVFTSKYCPYCRAFEKVVERLMGELNGTVEFEVVDVDEKRELAEKYEVLMLPTLVLADGDEVLGGFMGFADYKTAREAILEQISAFLKPDYKN(SEQ ID NO：3)；
●来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白氨基酸序列(gil 2649295)(trx-3)
MDELELIRQKKLKEMMQKMSGEEKARKVLDSPVKLNSSNFDETLKNNENVVVDFWAEWCMPCKMIAPVIEELAKEYAGKVVFGKLNTDENPTIAARYGISAIPTLIFFKKGKPVDQLVGAMPKSELKRWVQRNL(SEQ ID NO：4)；
●来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白氨基酸序列(gil 2648389)(trx-4)
MERLNSERFREVIQSDKLVVVDFYADWCMPCRYISPILEKLSKEYNGEVEFYKLNVDENQDVAFEYGIASIPTVLFFRNGKVVGGFIGAMPESAVRAEIEKALGA(SEQ IDNO：5)；
●来自詹氏甲烷球菌的硫氧还蛋白还原酶(trx B)氨基酸序列(gil 1592167)
MIHDTIIIGAGPGGLTAGIYAMRGKLNALCIEKENAGGRIAEAGIVENYPGFEEIRGYELAEKFKNHAEKFKLPIIYDEVIKIETKERPFKVITKNSEYLTKTIVIATGTKPKKLGLNEDKFIGRGISYCTMCDAFFYLNKEVIVIGRDTPAIMSAINLKDIAKKVIVITDKSELKAAESIMLDKLKEANNVEIIYNAKPLEIVGEERAEGVKISVNGKEEIIKADGIFISLGHVPNTEFLKDSGIELDKKGFIKTDENCRTNIDGIYAVGDVRGGVMQVAKAVGDGCVAMANIIKYLQKL(SEQ ID NO：6)；以及
●来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列(gil2649006)(trxB)
MYDVAIIGGGPAGLTAALYSARYGLKTVFFETVDPVSQLSLAAKIENYPGFEGSGMELLEKMKEQAVKAGAEWKLEKVERVERNGETFTVIAEGGEYEAKAIIVATGGKHKEAGIEGESAFIGRGVSYCATCDGNFFRGKKVIVYGSGKEAIEDAIYLHDIGCEVTIVSRTPSFRAEKALVEEVEKRGIPVHYSTTIRKIIGSGKVEKVVAYNREKKEEFEIEADGIFVAIGMRPATDVVAELGVERDSMGYIKVDKEQRTNVEGVFAAGDCCDNPLKQVVTACGDGAVAAYSAYKYLTS(SEQ ID NO：7)。
使用植物偏爱密码子通过反向翻译(back-translation)来设计编码用于本发明的这些蛋白质的基因，提高G-C的含量并去除有害序列，更详细的见如下的叙述。可通过DNA改组或其他方法来提高蛋白质的活性，如下所述。因此本发明包括从这些蛋白质衍生而来的蛋白质，尤其为具有硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶活性并且基本相似的蛋白质。
为了在谷物发育过程中在种子中表达具活性的硫氧还蛋白，优选的是能指导硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶种子特异性表达的启动子，由于目标是储藏，从而使得酶对储藏蛋白具有需要的作用，这在一些应用中是可取的。然而在本发明中，更普遍可取的为在种子中表达硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶，它们在谷物发育过程中累积并且无活性。很多策略可用于生产表达转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的种子，并且对正常种子发育过程不会产生很大的影响，例如：
(i)将具有活性的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶隔离，使其不能与目标蛋白质发生显著相互作用，例如通过定位于或表达于造粉体中。质体定向序列可用于引导在造粉体中的累积。可选择地，通过分泌信号可将硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶定位于细胞壁的细胞外空间。或者在单子叶植物中，在种子发育过程中在糊粉细胞等细胞类型中的表达，可将硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶与胚乳中其他储存成分分离开来。
(ii)通过遗传工程改造来自嗜热生物的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的表达。在环境温度中(在本领域中高至38-39℃)几乎没有活性的酶在发育过程中不太可能产生问题。因此优选地，酶主要在高温下具有活性，例如高于40℃的温度，对于湿磨法最优选的为45-60℃，甚至更高，如45-95℃。
(iii)将硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶置于一个可诱导的启动子控制下，例如化学试剂诱导的启动子，创伤诱导的启动子或者反式激活蛋白介导的启动子(它通过被表达该反式激活蛋白的植物花粉传粉而激活)。
(iv)使用对特定硫氧还蛋白还原酶具有特定要求的硫氧还蛋白，从而使得硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的活性可分别通过合适的硫氧还蛋白还原酶或硫氧还蛋白的获得来调节。例如在不同植物中表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶，从而只有通过表达互补酶的植物传粉，种子中才可发生有活性的结合。可选择地，硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶在细胞中被隔离于如上所述的质体、液泡或质外体中，从而直到谷物加工时它才能相遇而具有活性。
谷物加工的方法
因此本发明提供了一种通过硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶促进淀粉从蛋白质基质中分离的新方法。在第一个实施例中，在多个种子加工应用中，硫氧还蛋白的活性均有用途，包括湿磨法、干磨法、油料种子加工、大豆加工、小麦加工和面粉/面团品质，尤其是谷物(特别是玉米)的湿磨法。因此本发明提供了一种提高研磨效率或提高研磨产量，提高分离淀粉和蛋白质的效率，增大了谷物淀粉和可溶性蛋白质的产量，或者提高蛋白质在水溶液或其它溶剂中的溶解度的方法，包括在补充的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶存在时浸泡谷物，以及分离谷物中的淀粉和蛋白质组分。通常，在研磨之前浸泡，但也可在研磨之后浸泡，在加工提取过程中可有多次的研磨或浸泡步骤，在浸泡时或浸泡后种子的蛋白质产量会增加。优选地，补充的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶可通过收获谷物的植物中转基因的表达来提供。
本发明进一步提供了：在某一方法中硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶提高研磨的效率或增大淀粉和蛋白质的研磨产量的用途，例如在如上所述的任何一种方法中，含有一定量的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的浸泡水，这一数量可促进谷物中淀粉和蛋白质的分离；用能促进淀粉从蛋白质中分离的有效量硫氧还蛋白处理的谷物；用如上所述的方法生产的淀粉或者蛋白质。在如上方法中的硫氧还蛋白的活性可通过补充含有硫氧还蛋白还原酶和/或NADPH的浸泡水来提高。湿磨法的浸泡水中正常存在的其它组分也可存在，例如生产乳酸的细菌。优选地，浸泡温度为52℃左右，时间为22-50小时，因此就需要硫氧还蛋白在这些条件下是稳定的。
谷物可为双子叶植物的种子，例如油料种子，如大豆、向日葵或油菜籽，优选的为大豆；或者也可为单子叶植物的种子，例如谷类的种子，如玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦或水稻，优选的为玉米。
硫氧还蛋白可为任何含硫醇基的蛋白质，它可被可逆氧化形成二硫键，并且在硫氧还蛋白还原酶的存在下，可被NADPH还原。优选的硫氧还蛋白来自如上所述的嗜热生物。在本发明中使用的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶是通过基因工程微生物适当生产的，例如酵母或者曲霉，或者如受控于在发芽期间活化的启动子，如高pI的α-淀粉酶启动子或其它依赖于赤霉素的启动子，在具有高表达能力的基因工程植物(例如在大麦中)中产生。将硫氧还蛋白(以分泌或提取的形式或者与制造者生物或其部分相结合的形式)加入浸泡水中。
作为一种将硫氧还蛋白加入浸泡水中的可供选择的办法或补充方法，可在用于研磨的种子中直接表达该酶。优选地，在谷物成熟过程或条件加工过程中表达该酶。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了在转基因生物中以工业规模生产硫氧还蛋白的方法，例如在植物或微生物中，植物的例子是诸如大麦或玉米的谷类，微生物的例子是酵母或曲霉，例如，包含培养具有表达硫氧还蛋白的嵌合基因之转基因生物，并且可选择性地分离或提取硫氧还蛋白的步骤的方法。
使用转基因植物的方法，该植物在种子成熟或发芽时能够产生增加量的硫氧还蛋白，从而使得种子中蛋白质的质量在种子发育过程中或者浸泡过程中受内源合成的硫氧还蛋白的影响，从而消除或减少了在研磨之前用外源化合物或酶处理的必要；
生产转基因植物的方法，该植物在种子成熟或发芽时能够产生增加量的硫氧还蛋白，从而使得种子中蛋白质的质量在种子发育过程中或者浸泡过程中受硫氧还蛋白的影响，从而消除或减少了在研磨之前用外源化合物或酶处理的必要；
使用含有硫氧还蛋白的转基因种子研磨谷物的方法，可导致更高的淀粉和可溶性蛋白质的产量。
本发明进一步包括一个在其基因组中含有嵌合表达盒的转基因生物，其中该嵌合表达盒包含编码热稳定或真核硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的编码区，该编码区受启动子的有效控制。
优选地，转基因生物为以该种植物中天然不出现的形式表达硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的植物，或者是其中硫氧还蛋白的表达量要高于该种植物自然表达量的植物。优选地，硫氧还蛋白表达于处于发育过程的种子中，因此优选地受控于种子特异性的启动子。可选择地，硫氧还蛋白的表达受控于可诱导或反式激活蛋白调控的启动子，从而使得在需要时可通过化学诱导或与反式激活蛋白杂交激活表达。通过与液泡定位序列发生融合，将硫氧还蛋白适当定位于植物液泡中。在本发明中，编码硫氧还蛋白的序列是与植物中具有活性的启动子相连的，它们转化入核基因组或质体基因组。启动子优选地为诸如γ-玉米醇溶蛋白启动子之类的种子特异性的启动子。该启动子也可为化学试剂诱导的启动子，例如烟草PR-1a启动子；或者为化学试剂诱导的反式激活蛋白调控的启动子，其中反式激活蛋白受控于一个化学试剂诱导的启动子；然而在一定条件下，可使用组成型启动子，例如CaMV35S或Gelvin启动子。在化学试剂诱导的启动子控制下，转化入植物的硫氧还蛋白基因的表达可通过叶子上化学诱导剂的应用在适当时机激活。
可选择地，硫氧还蛋白的编码序列可以受控于反式激活蛋白调控的启动子，通过将转化了该序列的植物和另一种表达反式激活蛋白的植物杂交可激活表达。在这种方法的优选形式中，含有硫氧还蛋白编码序列的第一种植物为种子亲本，且为雄性不育，而表达反式激活蛋白的第二种植物为传粉者。在种子中表达硫氧还蛋白是通过间作第一种和第二种植物实现的，例如第一种植物被第二种植物授粉，通过第二种植物反式激活蛋白基因表达的反式激活蛋白激活第一种植物中反式激活蛋白调控的启动子，可使硫氧还蛋白在第一种植物种子中表达。
在本申请中所描述的核酸序列可通过传统DNA重组技术整合入植物细胞。通常，该过程包括将本发明的编码序列插入对该编码序列来说是异源(即在正常情况下不存在的)的表达系统，使用的为本领域熟知的标准克隆方法。载体含有插入的编码蛋白质序列转录和翻译必需的元件。可使用多种本领域熟知的载体系统，例如质粒、噬菌体病毒或其它修饰了的病毒。适当的载体包括，但并不限于，病毒载体，例如λ载体系统λgt11、λgt10和Charon4；质粒载体，如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；以及其它类似的系统。表达系统的组分也可经修饰来增加表达。例如，可使用截短的序列、核苷酸取代或其它的修饰。在此所描述的表达系统可在适当条件下转化任何作物植物细胞。转化的细胞可再生为完整的植株，从而使得本发明的核苷酸序列可在转基因植物中表达。
编码序列和相邻序列的修饰
来自微生物源的基因在植物中的转基因表达可能需要对这些基因进行修饰来达到和优化它们在植物中的表达。特别地，编码分离酶但在天然微生物中被相同的转录本所编码的细菌ORF在植物中分离的转录本上可被最佳表达。要达到此目的，每个细菌的ORF都被单独分离出来并克隆入盒中，该组件提供了ORF5’端的植物启动子序列和ORF3’端的植物转录终止子。分离出的ORF序列优选地包括起始的ATG密码子和终端STOP密码子，但还可在起始ATG和STOP密码子外含有其它序列。此外，ORF可被截短，但仍具有其所需活性；对于特别长的ORF，具有活性的截短ORFs对于在转基因生物中的表达是优选的。“植物启动子”和“植物转录终止子”指在植物细胞中操作的启动子和转录终止子。这包括来自非植物源例如来自病毒(如花椰菜花叶病毒)的启动子和转录终止子。
在一些情况下，不需要对ORF编码区及其相邻序列进行修饰。分离出含有目的ORF的片段并将其插入植物启动子下游就足够了。例如，Gaffney等(Science  261：754-756(1993))已经在CaMV 35S启动子和CaMV tml终止子控制下在转基因植物中成功地表达了Pseudomonas nahG基因，其编码区未经修饰，并且Pseudomonas基因ATG上游x bp和STOP密码子下游y bp仍连接于nahG ORF上。ATG上游和STOP密码子下游相连的微生物序列最好不要留下。实际上，此类构建依赖于限制性酶切位点的可获得性。
在其它情况下，表达来自微生物源的基因可能导致表达中的问题。这些问题在本领域已经得到了很好的表征，尤其常见的为表达来自诸如芽孢杆菌属(Bacillus)之类的基因。这些问题可在本发明中的核苷酸序列中出现，可通过现在本领域熟知的技术来对这些基因进行修饰。可遇到如下的问题：
1.密码子利用
植物中的偏爱密码子利用与一些微生物的偏爱密码子利用不同。对比目标克隆的微生物ORF中密码子的利用和植物基因中密码子的利用(尤其为来自目标植物的基因)能够辨别ORF中应该改变的密码子。通常对于单子叶植物来说，植物进化趋向于在第三个碱基位置对核苷酸C和G的强烈偏好，而在双子叶植物中，在这个位置经常使用核苷酸A或T。通过修饰基因，使其整合特定目标转基因物种的偏爱密码子，很多如下描述的GC/AT含量和错误剪接之类的问题都可克服。
2.GC/AT含量
植物基因通常具有35％以上的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列在植物中会产生一些问题。第一，ATTTA基序会产生信息的不稳定，并且经常在许多短命mRNA的3’末端发现。第二，信息中在正确位置出现诸如AATAAA之类的聚腺苷酸化信号被认为会导致转录的早熟性截短。此外，单子叶植物可将富含AT的序列识别为剪接位点(如下)。
3.与起始甲硫氨酸相邻的序列
植物区别于微生物的一点在于它们的信息不具有一个固定的核糖体结合位点。据信，核糖体与信息的5’末端结合，搜寻第一个可用的ATG来起始翻译。然而，据信对于与ATG相邻的某些核苷酸具有偏爱性，并且微生物基因可通过在ATG包含真核的共同翻译起始子来增强表达。Clontech(1993/1994目录，第210页)已经建议将一段序列作为大肠杆菌(E.coli)uidA基因在植物中翻译的共有翻译起始子。此外，Joshi(NAR  15：6643-6653(1987))比较了许多与ATG相邻的植物序列，并提出了另一个共同序列。当微生物ORF在植物中表达遇到困难时，在起始ATG处加入一个这样的共同序列可能会改善翻译。在这些情况下，共同序列的最后三个核苷酸可能不适合包括于该修饰的序列，因为它们对第二个氨基酸残基的修饰。与起始甲硫氨酸相邻的优选序列在不同植物种类中各不相同。对GenBank数据库中14个玉米基因的分析提供了如下的结果：
在14个玉米基因中位于起始ATG之前位置：
     -10  -9   -8   -7   -6   -5   -4   -3   -2   -1
C    3    8    4    6    2    5    6    0    10   7
T    3    0    3    4    3    2    1    1    1    0
A    2    3    1    4    3    2    3    7    2    3
G    6    3    6    0    6    5    4    6    1    5
该分析可适用于要整合核苷酸序列的合意的植物种类，也适用于与ATG相邻的并经过修饰以整合优选核苷酸的序列。
4.错误剪接位点的去除
由非植物源克隆并且在植物中没有经过表达优化的基因可能含有被植物识别为5’或3’剪接位点的基序，从而被剪切产生截短或删除的信息。可通过本领域熟知的技术将这些位点去除。
修饰编码区及其相邻序列的技术为本领域熟知的。当微生物ORF的起始表达很低并且认为对上述的序列作修改是合适的，那么可通过本领域熟知的方法构建合成基因。例如，在已发表的专利公开内容EP0 385 962(授于Monsanto)、EP 0 359 472(授于Lubrizol)和WO93/07278(授于Ciba-Geigy)中所述的。在大部分情况下，优选的是在转移到转基因植物之前，通过瞬时分析方法(本领域熟知的)分析基因构建体的表达。
植物表达盒的构建
用于在转基因植物中表达的编码序列首先组装入表达盒，并且位于可在植物中表达的合适的启动子下。该表达盒可更进一步包括转基因表达所需或所造的任何序列。这样的序列包括，但并不限于转录终止子、增强表达的外源序列如内含子、vital序列以及用来将基因产物定位于特定细胞器和细胞小室的序列。这些表达盒能很容易地转入下面描述的植物转化载体。以下为典型表达盒各种组分的描述。
1.启动子
对在表达盒中使用的启动子的选择将决定转基因在转基因植物中的时间和空间表达模式。选择的启动子能够在特定的细胞类型中(例如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)，或在特定的组织或器官中(例如根、叶或花)表达转基因，且该选择反映了基因产物的合意的累积位置。可选择的，选择的启动子可在不同的诱导条件下启动基因的表达。启动子在强度上，即驱动转录的能力上有区别。依赖于所使用的宿主细胞系统，任何适合的启动子都可使用，包括该基因的天然启动子。以下为可在表达盒中使用的启动子的非限制性例子。
a.组成型表达，泛素启动子
泛素是一个在许多细胞类型中都累积的基因产物，它的启动子已从许多种类中克隆出来用于转基因植物(例如向日葵-Binet等，Plant Science  79：87-94(1991)；玉米-Christensen等，Plant Mol.Biol. 12：619-632(1989)；拟南芥-Norrij等，Plant Mol.Biol.21：895-906(1993))。玉米的泛素启动子已可用于转基因单子叶系统中，为单子叶转化所构建的序列和载体公开于公布的专利EP 0 342 926(授于Lubrizol)。Taylor等(Plant Cell Rep. 12：491-495(1993))描述了载体(pAHC25)，其包含玉米泛素启动子和第一个内含子，也描述了通过微粒轰击引入各种单子叶植物时该载体在细胞悬浮液中具有高活性。
拟南芥泛素启动子与本发明中核苷酸序列一同使用是理想的。该泛素启动子适合用于转基因植物中的基因表达，包括单子叶植物和双子叶植物。适当的载体为pAHC25的衍生物或任何在本申请中提及的转化载体，并通过引入适当泛素启动子和/或内含子序列进行修饰。
b.组成型表达，CaMV 35S启动子
质粒pCGN1761的构建在公布的专利申请EP 0 392 225(实施例23)有描述。pCGN1761含有“双”CaMV 35S启动子和tml转录终止子，在启动子和终止子之间有一个EcoRI的单一酶切位点，pCGN1761具有pUC型的主链。构建了一个pCGN1761的衍生物，其含有包含NotI和XhoI位点以及已存在的EcoRI位点的多位点接头。该衍生物记为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX对于在它的多位点接头内克隆cDNA序列或编码序列(包括微生物ORF序列)是很有用的，这样作是为了在转基因植物中让这些序列的表达受控于35S启动子。这样一个构建体中完整的35S启动子-编码区-tml终止子序列组件，可在启动子的5’端被HindIII、SphI、SalI和XbaI切割，在终止子的3’端被XbaI、BamHI和BglI切割，以便于转移到如下所述的转化载体中去。此外，双35S启动子片段可在5’末端用HindIII、SphI、SalI、XbaI或Pstl切割，在3’末端可对任何一个多位点接头的限制性位点(EcoRI、NotI或XhoI)切割，而后用另一个启动子代替。需要的话，在克隆位点周围的修饰可通过引入能够提高翻译的序列来实现。当需要过量表达时，这种方法尤其有用。例如，pCGN1761ENX可通过优化翻译起始位点来修饰，如美国专利号5,639,949中实施例37所描述的。
c.组成型表达，肌动蛋白启动子
多种同种型肌动蛋白在大部分细胞类型中均有表达，因此肌动蛋白启动子是组成型启动子的一个好的选择。特别地，来自水稻ActI基因的启动子已被克隆并表征(McElroy等，Plant Cell  2：163-171(1990))。该启动子中一个1.3kb片段含有在水稻原生质体表达所需的所有调节元件。此外，基于ActI启动子构建了许多表达载体以特别用于单子叶植物(McElroy等，Mol.Gen.Genet. 231：150-160(1991))。它们整合了ActI-内含子1、AdhI侧翼序列和AdhI-内含子1(来自玉米醇脱氢酶基因)以及CaMV35S启动子。高表达的载体为35S和ActI内含子或ActI5’侧翼序列和ActI内含子的融合。将起始ATG附近序列(在GUS报告基因中)优化后也可提高表达。McElroy等(Mol.Gen.Genet.， 231：150-160(1991))描述的启动子表达盒能很容易地修饰以用于基因表达，并且尤其适用于单子叶宿主。例如含有启动子的片段被从McElroy构建体中删除，用于代替pCGN1761ENX中的双35S启动子，而后可将特定基因序列插入该pCGN1761ENX。如此构建的融合基因可以转移至适当的转化载体中。在另一篇独立的报道中，水稻ActI启动子连同它的第一个内含子也可以在培养的大麦细胞中指导表达(Chibbar等，Plant Cell Rep. 12：506-509(1993))。
d.可诱导的表达，PR-1启动子
pCGN1761ENX中的双35S启动子可用任何能够导致适当高表达水平的启动子来代替。例如，一个在美国专利号5,614,395中所描述的化学试剂调控的启动子可代替双35S启动子。优选地，该启动子可通过限制性内切酶从其原先位置上切除，但也可通过具有适当末端限制性酶切位点的引物经PCR扩增而得。如果用PCR扩增，在目标载体上克隆该扩增的启动子之后，该启动子应重新测序来检查扩增错误。将化学试剂/病原体调节的烟草PR-1a启动子从质粒pCIB1004上切除(用于构建，见EP 0 332 104中的实施例21)，并转移至质粒pCGN1761ENX中(Uknes等，1992)。用NcoI切割pCIB1004后，用T4DNA聚合酶处理产生的线性片段的3’突出端为平末端。用HindIII切割该片段，用胶纯化产物中含有PR-1a启动子的片段，并将其克隆至pCGN1761ENX(其中双35S启动子已被切除)。这通过以下步骤来完成：用XholI切割再用T4聚合酶补平，之后再用HindIII切割，将较大的含有载体-终止子的片段分离出来，其中在该片段中克隆了pCIB1004启动子片段。这样产生了一个pCGN1761ENX衍生物，含有PR-1a启动子和tml终止子，以及具有单一EcoRI和NotI位点的间插多位点接头。选择的编码区可插入该载体，融合产物(即启动子-基因-终止子)随后可转移至任何选定的转化载体，包括如下所述的载体。各种化学调控剂可用来诱导本发明中的转化植物中选定的编码序列，包括公开于美国专利号5,523,311和5,614,395中的苯并噻唑、异烟酸和水杨酸化合物。
e.可诱导的表达，乙醇诱导的启动子
可被诸如乙醇之类的醇或酮诱导的启动子也可用于提供本发明中编码序列的可诱导表达。这样的启动子的一个例子是来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的alcA基因启动子(Caddick等(1998)Nat.Biotechnol.16：177-180)。在构巢曲霉中，alcA基因编码醇脱氢酶I，它的表达在化学诱导剂存在时受AlcR转录因子的调控。为达到本发明的目的，包含与最小35S启动子融合的alcA基因启动子序列的质粒palcA：CAT的CAT编码序列(Caddick等(1998)Nat.Biotechnol.16：177-180)被本发明中的编码序列取代，形成一个具有受控于alcA基因启动子的编码序列的表达盒。这通过本领域熟知的方法来实现。
f.可诱导的表达，糖皮质激素诱导的启动子
也提供了用基于类固醇激素的系统来诱导本发明中核酸的表达。例如使用了糖皮质激素介导的诱导系统(Aoyama和Chua(1997)ThePlant Journal 11：605-612)，通过使用糖皮质激素诱导了基因表达，例如合成的糖皮质激素，优选地为地塞米松，优选的浓度为0.1mM至1mM，更优选的为10mM至100mM。为达到本发明的目的，可用本发明中的核酸序列代替荧光素酶基因，形成一个表达盒，该表达盒具有本发明的核酸序列，该核酸序列受控于与35S启动子相连的六拷贝的GAL4上游激活序列。这通过本领域熟知的方法来实现。反式作用因子包括GAL4 DNA结合区(Keegan等(1986)Science，231：699-704)，该GAL4 DNA结合区与疱疹病毒蛋白VP16的反式激活区融合(Triezenberg等(1988)Genes Devel.2：718-729)，后者又与大鼠糖皮质激素受体的激素结合区融合(Picard等(1988)，Cell 54：1073-1080)。融合蛋白的表达受控于任何在本领域熟知或在此描述的适于植物表达的启动子。含有与6×GAL4/最小启动子融合的本发明的一段核酸序列的表达盒也可包含于植物中。因而得到了融合蛋白的组织或器官特异性，进而导致杀虫毒素诱导的组织或器官特异性。
g.根特异表达：
另一种基因表达的模式为根的表达。de Framond(FEBS 290：103-106(1991))和已公布的专利申请EP 0 452 269中描述了一个合适的根启动子。该启动子转移至一个适当的载体例如pCGN1761ENX，将一个选定的基因插入，随后将完整的启动子-基因-终止子序列组件转移至目标转化载体中。
h.创伤诱导的启动子
创伤诱导的启动子也可适用于基因表达。有大量这样启动子的描述(例如，Xu等，Plant Molec.Biol. 22：573-588(1993)，Logemann等，Plant Cell  1：151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，PlantMolec.Biol. 22：783-792(1993)，Firek等，Plant Molec.Biol. 22：129-142(1993)，Warner等，Plant J. 3：191-201(1993))，它们均适用于本发明。Logemann等描述了双子叶植物马铃薯wunI基因的5’上游序列。Xu等提出来自双子叶植物马铃薯的创伤诱导的启动子(pin2)在单子叶植物水稻中也具有活性。此外，Rohrmeier和Lehle描述了玉米WipI cDNA的克隆，该cDNA为创伤诱导的，并可通过标准技术用来分离关连启动子。类似地，Firek等和Warner等描述了从单子叶植物可刁柏(Asparagus officinalis)中而来的创伤诱导的基因，它在创伤和病原体侵入的位置表达。使用本领域熟知的克隆技术可将这些启动子转移至适当的载体上，与属于本发明的基因融合，并用来在植物的创伤部位表达这些基因。
i.髓优选的表达
专利申请WO 93/07278中描述了玉米trpA基因的分离，它优选在髓细胞中表达。提供基因序列和转录起始位点之前-1726bp的启动子。通过标准分子生物学技术可将该启动子或其部分转移至例如pCGN1761的载体，它代替了其中的35S启动子，并用于驱动外源基因以髓优选的方式表达。实际上，含有髓优选的启动子或其部分片段可转移入任何载体并被修饰以用于转基因植物。
j.叶特异性表达
Hudspeth和Grula提供了一个编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因(Plant Molec.Biol. 12：579-589(1989))。通过标准分子生物学技术可将该基因的启动子用于驱动转基因植物中的任何基因以叶特异性方式表达。
k.花粉特异性表达
WO 93/07278描述了在花粉细胞中表达的玉米钙依赖性蛋白激酶(CDPK)基因的分离。该基因序列和启动子从转录起始位点延伸至1400bp。通过标准分子生物学技术，该启动子或其部分可转移至例如pCGN1761的载体上，其中它可代替35S启动子并用于驱动本发明的核酸序列以花粉特异性的方式表达。
2.转录终止子
有多种转录终止子可用于表达盒。它们负责超出转基因的转录终止以及转基因的正确聚腺苷酸化。适当的转录终止子是那些在植物中起作用的，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。这些均可用于单子叶植物和双子叶植物。此外，可使用基因的天然转录终止子。
3.提高或调节表达的序列
已发现在转录单元中有大量的序列能够增强基因表达，并且这些序列能与本发明中的基因相连来促进它们在转基因植物中的表达。
许多内含子序列能够增强表达，尤其在单子叶植物细胞中。例如，已发现玉米AdhI基因的内含子能显著增强位于其关连启动子下的野生型基因的表达，当该野生型基因导入玉米细胞时。在氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中内含子I特别有效并且促进了表达(Callis等，Gene Develop. 1：1183-1200(1987))。在相同的实验系统中来自玉米bronzeI基因的内含子在增强表达上具有类似的效果。内含子序列常常整合于植物转化载体，通常位于非翻译的前导区。
已知大量来自病毒的非翻译的前导区序列能增强表达，在双子叶植物细胞中尤其有效。特别地，来自烟草花叶病毒(TMV，“W序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达上均很有效(例如，Gallie等，Nucl.Acids Res. 15：8693-8711(1987)；Skuzeski等，Plant Molec.Biol. 15：65-79(1990))。
4.基因产物在细胞中的定位
已知各种定位基因产物的机制存在于植物中，控制这些机制行使功能的序列已经在某种程度上表征。例如，将基因产物定位于叶绿体是受控于各种蛋白质氨基端的信号序列，进入叶绿体时该信号序列被切除，产生成熟的蛋白质(例如Comai等，J.Biol.Chem. 263：15104-15109(1988))。这些信号序列可融合于异源基因产物来影响异源产物运输进入叶绿体(van den Broeck等，Nature  313：358-363(1985))。编码适当信号序列的DNA可由编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶、GS2蛋白以及其他定位于叶绿体的蛋白质的cDNA的5’端分离而得。也可见美国专利号5,639,949实施例37中题为“叶绿体定向表达”的部分。
其他基因产物定位于其他细胞器例如线粒体和过氧化物酶体(例如Unger等，Plant Molec.Biol. 13：411-418(1989))。也可操纵编码这些产物的cDNA来影响异源基因产物定向于这些细胞器。此类序列的例子为：核基因编码的ATPase和线粒体中特定天冬氨酸转氨酶同工酶。Rogers等提供了定向细胞蛋白质体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6512-6516(1985))。
此外，导致基因产物定位于其它细胞器的序列已被表征。氨基端序列负责定位于ER、质外体和从糊粉细胞的胞外分泌(Koehler和Ho，Plant Cell  2：769-783(1990))。此外，与羧基端序列相连的氨基端序列负责基因产物的液泡定位(Shinshi等，Plant Molec.Biol.14：357-368(1990))。
通过将目的转基因序列与如上所述的适当定位序列融合，有可能将转基因产物引导进入任何细胞器或细胞小室。例如，对于叶绿体定位而言，来自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的叶绿体信号序列与转基因氨基端的ATG发生融合。选择的信号序列应包括已知的切割位点，并且构建的融合体应考虑切割所需的切割位点以后的任何氨基酸。在一些情况下，这个要求可通过在切割位点和转基因ATG之间添加少量氨基酸，或者将转基因序列中一些氨基酸替换掉来满足。
为叶绿体输入而构建的融合体可以检测叶绿体吸收效率，方法是使体外构建的转录体在体外翻译，而后在体外测定叶绿体吸收，该方法由Bartlett在《叶绿体分子生物学方法》(Eldelmann等(Eds))，Elsevier出版社1081-1091(1981)和Wasmann在Mol.Gen.Genet.205：446-453(1986)中描述。这些构建技术是本领域熟知的，并且对于线粒体和过氧化物酶体同样适用。
以上描述的细胞定位机制不仅适用于与关联启动子相连，也适用于与异源启动子相连，从而在一个启动子的转录控制下影响特定细胞定位目标，而该启动子与定位信号序列的来源启动子具有不同的表达模式。
植物转化载体的构建
大量可用于植物转化的转化载体对植物转化领域的普通技术人员来说是熟知的，并且与本发明相关的基因可以与任何这样的载体相连使用。载体的选择依赖于优选的转化技术和转化的目标物种。对于一些目标物种而言，不同的抗生素或除草剂选择标记是优选的。常用的转化选择标记包括：nptII基因，它具有对卡那霉素及其相关抗生素的抗性(Messing和Vierra，Gene  19：259-268(1982)；Bevan等，Nature  304：184-187(1983))；bar基因，它具有对除草剂膦丝菌素的抗性(White等，Nucl.Acids Res. 18：1062(1990)，Spencer等，Theor.Appl.Genet. 79：625-631(1990))；hph基因，它具有对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和Diggelmann，Mol Cell Biol  4：2929-2931)；dhfr基因，它具有对methatrexate的抗性(Bourouis等，EMBO J. 2(7)：1099-1104(1983))；EPSPS基因，它具有对草甘磷的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；甘露糖-6-磷酸异构酶基因，它提供了代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,944,629)。
1.适用于农杆菌(Agrobacterium)转化的载体
很多载体均可适用于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化。它们通常都带有至少一个T-DNA边缘序列，并包括例如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))和pXYZ之类的载体。如下描述了两种适用于农杆菌转化的典型载体。
a.pCIB200和pCIB2001：
二元载体pCIB200和pCIB2001用于农杆菌重组载体的构建，并按照如下顺序构建。pTJS75kan用以下方法产生：用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，J.Bacteriol. 164：446-455(1985))，以切除四环素抗性基因，而后插入具有NPTII的来自pUC4K的AccI片段(Messing和Vierra，Gene  19：259-268(1982)；Bevan等，Nature  304：184-187(1983)；NcBride等，Plant Molecular Biology14：266-276(1990))。XhoI接头与PCIB7的EcoRV片段相连，该片段含有T-DNA的左右边缘序列、一个植物可选择的nos/nptII嵌合基因以及pUC多位点接头(Rothstein等，Gene 53：153-161(1987))，并且将该Xhol消化片段克隆至SalI消化的pTJS75kan中去，形成pCIB200(也可见EP 0 332 104，实施例19)。pCIB200含有如下单一的多位点接头限制性位点：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbalI和SalI。pCIB2001为pCIB200的衍生物，通过在多位点接头中插入附加的限制性位点而形成。pCIB2001含有如下单一的多位点接头限制性位点：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrlI、ApaI、HpaI和StuI。pCIB2001除了含有这些单一的限制性酶切位点以外，还具有植物和细菌卡那霉素选择、农杆菌介导的转化所需的T-DNA的左右边缘序列、由RK2衍生的trfA功能(用于大肠杆菌和其他宿主之间的转移)以及来自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多位点接头适用于具有自身调控信号的植物表达盒的克隆。
b.pCIB10及其潮霉素选择性衍生物
二元载体pCIB10含有用于在植物中选择的编码卡那霉素抗性的基因、T-DNA的左右边缘序列以及来自广宿主范围的质粒pRK252的序列，使其在大肠杆菌和农杆菌中都能够复制。它的构建可见Rothstein等的描述(Gene  53：153-161(1987))。构建了各种pCIB10的衍生物，其整合了编码潮霉素B磷酸转移酶的基因，见Gritz等的描述(Gene25：179-188(1983))。这些衍生物可使转基因植物只用潮霉素筛选(pCIB741)或者用潮霉素与四环素筛选(pCIB715和pCIB717)。
2.适用于非农杆菌转化的载体
不使用根癌农杆菌的转化不要求在选定的转化载体中有T-DNA序列，因而除了以上所述的含有T-DNA序列的载体，不存在这些序列的载体也可使用。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过微粒轰击、原生质体吸收(例如PEG和电穿孔)和微量注射的转化。载体的选择大部分依赖于转化物种的优选选择。如下描述了适用于非农杆菌转化的典型载体的构建。
a.pCIB3064：
pCIB3064为一个pUC衍生的载体，它适用于直接基因转移技术，并结合除草剂basta(或膦丝菌素)的选择。质粒pCIB246包括与大肠杆菌GUS基因和CaMV 35S转录终止子有效融合的CaMV 35S启动子，在PCT公布的申请WO 93/07278中有描述。该载体的35S启动子在起始位点的5’端含有两个ATG序列。这些位点通过标准PCR技术来产生突变，去除了ATG序列并产生了SspI和PvuI的限制性酶切位点。这些新的限制性位点分别为距单SalI位点96和37bp，距实际起始位点101和42bp。pCIB246的衍生产物记为pCIB3025。通过SalI和SacI的消化将GUS基因从pCIB3025上切除，将末端补平并连接产生新质粒pCIB3060。由John Innes Centre，Norwich得到质粒pJIT82，切除含有来自产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)bar基因的400bp SmaI片段，并插入pCIB3060的HpaI位点(Thompson等，EMBO J.6：2519-2523(1987))。这样产生了pCIB3064，它包含CaMV35S启动子和终止子控制下的用于除草剂选择的bar基因、氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌中选择用)和具有SphI、PstI、HindIII和BamHI单一位点的多位点接头。该载体适用于含有自身调控信号的植物表达盒的克隆。
b. pSOG19和pSOG35
pSOG35是使用大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DFR)基因的转化载体，二氢叶酸还原酶是一个对氨甲蝶呤具有抗性的选择性标记。用PCR扩增35S启动子(-800bp)、来自玉米Adh1基因的内含子6(-550bp)和来自pSOG10的GUS非翻译前导序列的18bp。一个编码大肠杆菌二氢叶酸脱氢酶II的基因的250bp片段也通过PCR扩增，这两段PCR片段和来自pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段相连，该SacI-PstI片段包含pUC载体主干和胭脂碱合酶终止子。这些片段的组装产生pSOG19，它含有与内含子6序列融合的35S启动子、GUS前导区、DHFR基因和胭脂碱合酶终止子。用来自玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)的前导序列代替pSOG19中GUS前导区产生载体pSOG35。pSOG19和pSOG35具有氨苄青霉素抗性的pUC基因与HindIII、SphI、PstI和EcoRI位点(其用于外源物质的克隆)。
3.适用于叶绿体转化的载体
为将本发明中的核苷酸序列表达于植物质体，使用了质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。将核苷酸序列插入pPH143，从而取代了PROTOX编码序列。然后将该载体用于质体转化和壮观霉素抗性转化体的选择。可选择地，核苷酸序列插入pPH143使得它取代了aadH基因。在这种情况下，通过PROTOX抑制剂抗性来筛选转化体。
转化
一旦本发明的核酸序列克隆至一个表达系统，它就转化入植物细胞了。植物转化和再生方法为本领域所熟知。例如，使用Ti质粒载体、DNA直接摄取、脂质体、电穿孔、微量注射和微粒轰击来传送外源DNA。此外，来自农杆菌属的细菌可用于转化植物细胞。如下为转化单子叶植物和双子叶植物的具代表性的技术以及具代表性的质体转化技术的描述。
1.双子叶植物的转化
转化双子叶植物的技术为本领域熟知的，包括基于农杆菌的技术以及不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、微粒轰击介导的传送或微量注射来实现。这些技术的描述可见Paszkowski等，EMBOJ. 3：2717-2722(1984)，Potrykus等，Mol.Gen.Genet. 199：169-177(1985)，Reich等，Biotechnology  4：1001-1004(1986)和Klein等，Nature 327：70-73(1987)。在每种情况下，通过本领域熟知的标准技术将转化的细胞再生为完整的植株。
农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术，因为它的高转化效率和对许多种类的广泛适用性。典型的农杆菌转化包括将带有目标外源DNA的双重载体(例如pCIB200或pCIB2001)转移至适当的农杆菌株系，这一转移可能依赖于vir基因的补充，其中vir基因是由宿主农杆菌株系携带的，它或者与Ti质粒共存或者存在于染色体上(例如，pCIB200和pCIB2001的CIB542株系)(Uknes等，Plant Cell5：159-169(1993))。将重组的双重载体转移入农杆菌，可通过使用带有重组双重载体的大肠杆菌、带有例如pPK2013质粒并能够将重组双重载体转移入目标农杆菌株系的辅助大肠杆菌株系的三亲杂交过程来实现。可选择地，可通过DNA转化将重组的双重载体转移入农杆菌(Hofgen和Willmitzer，Nucl.Acids Res  16：9877(1988))。
用重组农杆菌对目标植物转化通常包括将农杆菌和来自该植物的外植体共培养，依照本领域熟知的方法。双重质粒T-DNA边缘序列之间带有抗生素或除草剂抗性标记的转化组织在选择性培养基上再生。
另一种用基因转化植物细胞的方法涉及向植物组织或细胞推进惰性或具有生物学活性的微粒。该技术公开于美国专利号4,945,050、5,036,006和5,100,792(都是授于Sanford等人)。总的来说，该技术包括在有效穿透细胞外表面并且能够与其内部结合的条件下，向细胞推进惰性或具有生物学活性的微粒。当使用惰性微粒时，该载体可通过用含有目标基因的载体包被微粒引入细胞。可选择地，目标细胞可用载体包围，当微粒进入的时候载体也被带入细胞。具有生物学活性的微粒(例如干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，每个都含有需要引入的DNA)也可被推进植物细胞组织。
2.单子叶植物的转化
大部分单子叶植物的转化都已成为常规方法。优选的技术包括通过PEG或电穿孔技术将基因直接转入原生质体，以及通过微粒轰击进入愈伤组织。转化可使用单种DNA或多种DNA(即共转化)，这两种方法都适用于本发明。共转化的优点是可避免完整的载体构建，以及产生将目的基因与选择标记分离的转基因植物，从而如果需要的话，在后代中可去除该选择标记。然而，使用共转化的一个不利因素为不同种DNA整合入基因组的频率低于100％(Schocher等，Biotechnology4：1093-1096(1986))。专利申请EP 0 292 435、EP 0 392 225和WO 93/07278中描述了由玉米原种自交系制备愈伤组织和原生质体的技术，使用PEG或电穿孔转化原生质体的技术，以及由转化的原生质体再生为玉米植株的技术。Gordon-Kamm等(Plant Cell  2：603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology  8：833-839(1990))发表了通过微粒轰击转化A188衍生的玉米系的技术。此外，WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology 11：194-200(1993))描述了通过微粒轰击转化玉米原种自交系的技术。该技术中使用1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚，它来自授粉后14-15天的玉米穗，使用PDS-1000HeBiolistics设备用于轰击。
也可通过原生质体或微粒轰击的直接基因转移来实现水稻的转化。对于Japonia型和Indica型的原生质体介导的转化均已有描述(Zhang等，Plan Cell Res. 7：379-384(1988))；Shimamoto等，Nature 338：274-277(1989)；Datta等，Biotechnology  8：736-740(1990))。两种类型均可用微粒轰击进行常规转化(Christou等，Biotechnology 9：957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了通过电穿孔转化水稻的技术。
专利申请EP 0 332 581中描述了Pooideae原生质体增殖、转化和再生的技术。这些技术允许转化鸭茅属(Dactylis)和小麦。此外，小麦转化已由Vasil等描述过(Biotechnology  10：667-674(1992))，他使用的是微粒轰击进入C型可长期再生的愈伤组织细胞的方法，在Vasil等(Biotechnology  11：1553-1558(1993)和Weeks等(PlantPhysiol.102：1077-1084(1993))的描述中使用微粒轰击进入未成熟的胚和未成熟胚衍生的愈伤组织的方法。然而，小麦转化的优选技术涉及用未成熟胚的微粒轰击来转化小麦和在基因传送前的高蔗糖或高麦芽糖水平的步骤。在轰击之前，任何数量的胚(长0.75-1mm)放置于含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培养基中(Murashiga和Skoog等，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))，用于诱导体细胞胚，该步骤可在暗处进行。在轰击的当天，将胚从诱导培养基中取出，并放于渗透剂中(即含有理想浓度的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基，典型的为15％，)。将胚进行质壁分离处理2-3个小时而后进行轰击。常规的为二十个胚每个目标平板，但这并不是十分重要的。通过标准方法将适当的携带基因的质粒(例如pCIB3064或pSG35)沉淀于微米级的金颗粒上。每个胚的平板用Dupont Biolistics氦设备轰击，暴发压力为～1000psi，使用标准的80目筛。轰击后，将胚放回暗处恢复24小时左右(仍处于渗透剂中)。24小时之后，将胚从渗透剂中取出，放回诱导介质，在再生之前继续放置一个月。大约一个月以后，将带有正在发育的胚愈伤组织的胚外植体转移至再生培养基(MS+1 mg/l NAA，5mg/l GA)，进一步含有适当的选择剂(pCIB3064质粒为10mg/l basta，pSOG35质粒为2mg/l氨甲蝶呤)。大约一个月以后将发育出的根转移至更大的名为“GA7s”的无菌容器中，其中含有一半离子强度的MS、2％蔗糖和相同浓度的选择剂。
使用农杆菌转化单子叶植物也已有描述。见WO 94/00977和美国专利号5,591,616。
3.质体的转化
在另一个优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列直接转化入质体基因组。质体转化的主要优势在于质体可在不经大量修饰的前提下表达细菌基因，并且在一个启动子的控制下，质体可表达多个开放读码框。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，PCT申请号WO 95/16783和McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305中均有关于质体转化技术的大量叙述。叶绿体转化的基本技术包括将侧翼带有选择性标记的克隆的质体DNA区域和目的基因引入适当的目标组织，例如，通过biolistics或原生质体转化(例如氯化钙或PEG介导的转化)。1至1.5kb的侧翼序列称为定位序列，促进了质体基因组的同源重组，因此允许质体基因组特定区域的替换或修饰。首先，对叶绿体16SrRNA和rps12基因进行点突变，使其对壮观霉素和/或链霉素具有抗性，可用于作为转化的选择标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：8526-8530；Straub，J.M.和Maliga，P.(1992)Plant Cell 4：39-45)。这导致了稳定的大约每100次轰击目标叶子产生一个同质转化体的速率。在这些标记之间的克隆位点允许构建质粒定位的载体以导入外源基因(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBO J.12：601-606)。通过将隐性rRNA或r蛋白抗生素抗性基因替换为一个显性选择性标记，细菌编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷转移酶的aadA基因，可大大提高转化频率(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：913-917)。之前，该标记已成功用于绿藻莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)Nucl.Acids Res.19：4083-4089)。其他适用于质体转化的选择性标记为本领域熟知的，并包含于本发明的范围之内。通常，转化后需要大约15-20个细胞分裂周期达到同质体的状态。质体表达(其中基因通过同源重组插入每个植物细胞中都存在的环状质体基因组的数千个拷贝中)的巨大的拷贝数量大大超过了核表达的基因数量，允许超过植物总可溶蛋白质量的10％的表达水平。在一个优选的实施方案中，将本发明的核苷酸序列插入一个质体定位载体，并转化至目标植物宿主的质体基因组中。可获得质体基因组同型的植物，其中含有本发明的核苷酸序列，并且该植物具有高的核苷酸表达能力。
实施例
依照如下详细的实施例来进一步描述本发明。这些实施例仅用于举例说明而已，除非指明，并非旨在限制本发明的应用。在此使用的标准DNA重组和分子克隆技术为本领域熟知的，并描述于Ausubel(ed.)《分子生物学现有技术》(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley和Sons.，Inc(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)；以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，《基因融合实验》(Experiments with Gene Fusion)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)。
实施例1：使用热稳定硫氧还蛋白转化玉米
表达来自詹氏甲烷球菌的热稳定硫氧还蛋白的基因(具有SEQ IDNO：1的序列)是通过使用如美国专利5,625,136中所述的玉米偏爱密码子来制备的，该基因在种子特异的γ-玉米醇溶蛋白启动子控制下，在pGIGUP质粒T-DNA边缘之间整合入表达盒。
在这些实验中使用根癌农杆菌株系LBA4404(pAL4404，pSB1)。pAL4404是一个卸甲辅助质粒。pSB1是一个具有广宿主范围的质粒，它含有pGIGUP的同源区和来自pTiBo542毒性区的一个15.2kb的KpnI片段(Ishida等，1996；根癌农杆菌介导的玉米(Zea mays L.)高效转化，Nature Biotechnology 14：745-750)。通过电穿孔将质粒pGIGUP引入LBA4404(pAL4404，pSB1)导致pGIGUP和pSB1共合体的产生。该质粒的T-DNA包括受泛素启动子驱动的甘露糖-6-磷酸异构酶基因，提供了代谢甘露糖的能力，以及如上所述的硫氧还蛋白基因。
在YP培养基上(5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l NaCl、15g/l琼脂、pH6.8)培养农杆菌3天，培养基上还有50mg/l壮观霉素和10mg/l四环素。用接种环收集细菌，并悬浮于N6液体培养基中，密度可为109至5109细胞/毫升。也可从YP培养基的过夜培养物中收集农杆菌细胞并在N6液体培养基中重新悬浮。
在大约自花授粉10至14天以后可获得玉米的未成熟胚。在具有诱导和支持胚愈伤组织形成的平板培养基上分割未成熟的合子胚，密度为大约25个未成熟胚每平板。
将未成熟胚与含有Ti质粒(含有选择性标记基因)的农杆菌在平板或液体中共同孵育。在与农杆菌孵育之前或之后，将未成熟胚置于含有硝酸银(10mg/l)的愈伤组织诱导培养基上培养。大约每个平板上放置25个未成熟胚。在孵育16至72个小时之后，将未成熟胚转移至含有硝酸银和头孢噻肟的愈伤组织诱导培养基上。按照如下步骤筛选转化的细胞：在体外使用甘露糖来选择转化的细胞。在侵染2至20天以后该选择剂的浓度可低至1g/L并维持一共2-12周。由此获得的胚胎愈伤组织在标准再生培养基上再生，存在或不存在甘露糖均可。所有植物都通过氯酚红(CR)测验来检测对甘露糖的耐受性。该分析采用pH敏感的显色剂来显示哪些细胞在存在甘露糖时生长。活的细胞会在培养基中产生pH变化，从而使指示剂氯酚红由黄色变为红色。在这个测试中能很容易地鉴定对甘露糖有耐受性的植物。CR测验为阳性的植物经PCR分析是否存在甘露糖基因。PCR测试为阳性的植物再经Southern印迹分析。
对再生的植物分析硫氧还蛋白的表达。植物为发育上正常的植物。来自具高表达能力的子代植物玉米经过小规模湿磨法加工分析，与不含有硫氧还蛋白转基因的同一基因型对比确定淀粉的可提取性。在湿磨法加工过程中，表达硫氧还蛋白基因的玉米与同一基因型非转化玉米相比，显示了更高的淀粉可提取性。
实施例2：使用热稳定硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶转化玉米
通过实施例1中描述的方法，玉米用来自詹氏甲烷球菌编码硫氧还蛋白(SEQ ID NO：1)和硫氧还蛋白还原酶(SEQ ID NO：6)的基因共转化。两个基因都处于种子特异的γ-玉米醇溶蛋白启动子控制下。这两个基因连接于pGIGUP质粒的左右边缘序列之间，可提高两个基因作为一个单一插件整合入植物染色体的可能性。
再生的植物经过表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的分析。植物为发育上正常的植物。来自具高表达能力的子代植物玉米经过小规模湿磨法加工分析，与不含有硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶转基因的同一基因型对比确定淀粉的可提取性。在湿磨法加工过程中，表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶基因的玉米与同一基因型非转化玉米相比，显示了更高的淀粉可提取性。
实施例3：克隆硫氧还蛋白基因并构建植物转化载体
分别从水稻和小麦发芽的种子提取总RNA，通过RT-PCR克隆水稻和小麦硫氧还蛋白-h cDNA(trx-h)。通过引物NMD109-(5’-GGA TCCACC ATG GCC GCC GAG GAG-3’)(SEQ ID NO：8)和NMD110(5’-GAGCTC TTA GGC AGA AGC AGA TG-3’)(SEQ ID NO：9)扩增水稻的trxcDNA，引物NMD102-(5’-GGA TCC ACC ATG GCG GCG TCG G-3’)(SEQ ID NO：10)和NMD103(5’-GAG CTC TTA CTG GGC CGC GTG T-3’)(SEQ ID NO：11)扩增小麦的trx cDNA。为将该基因克隆至植物表达载体需要插入适当的限制性酶切位点，即在5’端插入BamHI，在3’端插入SacI，这些通过上面的反应也完成了。适当大小的PCR产物通过胶纯化并用Topo PCR 2.1克隆载体(Invitrogen)克隆。含有正确插入的菌落在限制性分析后测序。水稻trx序列与已发表于GenBankAccession no.U92541的序列匹配。小麦trx序列与来自T.aestivium(GenBank Accession no.X69915)的trx-h序列匹配。克隆γ-玉米醇溶蛋白启动子：由Dr.Brian Larkins提供的质粒pGZ27.3中扩增出673 bp的γ-玉米醇溶蛋白启动子。该序列与不透明2号修饰基因5’区(GenBank Accession no.S78780)和(Marzabal等，1998，PlantJ.，16：41-52)完全匹配。γ-玉米醇溶蛋白启动子具有胚乳特异性(Torrent等(1997)Plant Mol.Biol.，34：139-149)。
pNOV 3401：玉米泛素启动子加上内含子-水稻trx-h -35S终止子，位于PMI选择的农杆菌转化载体中：
将水稻trx基因克隆至含有泛素启动子加上内含子和35S终止子的植物表达载体。将产生的构建体pNOV 3400用限制性内切酶HindIII和KpnI消化并亚克隆至农杆菌转化二元载体盒pNOV 2117，得到pNOV3401。
pNOV 3405：位于PMI选择的农杆菌转化载体中的γ-玉米醇溶蛋白启动子-水稻trx-h -35S终止子：
pNOV 3406：位于PMI选择的农杆菌转化载体中的γ-玉米醇溶蛋白启动子-小麦trx-h -35S终止子：
将水稻和小麦trx-h基因克隆至含有如上所述的γ-玉米醇溶蛋白启动子和35S终止子的植物表达载体。用HindIII和KpnI消化得到的构建体得到启动子、基因和终止子单元，并亚克隆至农杆菌二元载体pNOV 2117，分别得到pNOV 3405和pNOV 3406。pNOV 2117为具有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因以及内含子和NOS终止子的二元载体，磷酸甘露糖异构酶基因的表达受玉米泛素启动子的驱动。
pNOV 3408：位于PMI选择的农杆菌转化载体中的γ-玉米醇溶蛋白启动子-γ-玉米醇溶蛋白信号序列-水稻trx-h -γ-玉米醇溶蛋白3’端-35S终止子：
为了将水稻硫氧还蛋白定位于细胞内膜系统，使用了γ-玉米醇溶蛋白基因的N末端和C末端的信号序列(Torrent等(1994)Planta，192：515-518)。插入Eco47AIII限制性酶切位点于水稻硫氧还蛋白基因第一个ATG之后的5’端，通过诱变引物NMD124A(5’-GAGCTCTTAGGCGCTAGCAG ATG-3’)(SEQ ID NO：12)和NMD125A(5’-GGATCCACCAGCGCTGCCGA-3’)(SEQ ID NO：13)经PCR诱变将NheI限制性酶切位点插入其3’端。所有突变均为沉默突变。将基因克隆至topo PCR2.1载体并测序。通过限制性内切酶Eco47AIII和NheI消化得到trx片段。四段寡核苷酸用来编码γ-玉米醇溶蛋白信号序列和C端序列：NMD126(5’-GATCCACCAT GAGGGTGTTG CTCGTTGCCC TCGCTCTCCT GGCTCTCGCTGCGAGCGCCA CCAGC-3’)(SEQ ID NO：14)；NMD127(5’-GCTGGTGGCGCTCGCAGCGA GAGCCAGGAG AGCGAGGGCA ACGAGCAACA CCCTCATGGT G-3’)(SEQ ID NO：15)；NMD128(5’CTAGCGCTCT GCAGCAGCCG ACTCCATGCCCCTACGCTGC TGCCGGCGGT GTCCCCCACT GAGAGCT-3’)(SEQ ID NO：16)；和NMD 129(5’-CTCAGTGGGG GACACCGCCG GCAGCAGCGT AGGGGCATGGAGTCGGCTGC TGCAGAGCG-3’)(SEQ ID NO：17)。使用标准方法用T4多核苷酸激酶将寡核苷酸对NMD126和127以及NMD128和129杂交并磷酸化。这两对杂交并磷酸化的寡核苷酸对与如上所述的用Eco47AIII和NheI消化的trx片段和一个含有γ-玉米醇溶蛋白启动子和35S终止子的植物表达载体盒以四向方式连接。用HindIII和KpnI消化产生的构建体得到启动子、基因和终止子单元，并亚克隆至农杆菌二元载体pNOV 2117，得到pNOV 3408，其中pNOV 2117含有受玉米泛素启动子驱动的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为选择标记。
将pNOV 3401、pNOV 3405、pNOV 3406和pNOV 3408转化入农杆菌株系LBA4404(pSB1)并用于稳定的玉米转化。
在体外还原水稻硫氧还蛋白时拟南芥的硫氧还蛋白还原酶具有活性。因此构建一个玉米优化的NTR基因。
实施例4：构建玉米优化的拟南芥依赖于NADPH的硫氧还蛋白还原酶基因
拟南芥NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶基因(NTR)是一个35kD的蛋白质。设计该合成基因需要将该从NTR基因(GenBank Accession#Z23109)推理所得的多肽序列进行反向翻译，通过Wisconsin大学GCG课题组建立的“反向翻译”程序，使用玉米偏爱密码子表(Murray等(1989)Nucl.Acids Res.，17：477-498)。“玉米最优化”序列进一步经修饰插入单一位点来促进克隆。将该基因分为三部分克隆。每个片段都通过8-10对长为60-75个核苷酸的寡聚物(其代表基因的双链)的杂交来构建。在顺序寡核苷酸对之间设计一个15个核苷酸的重叠，用于正确的定向和组装。寡核苷酸是通过Genosys Inc.(Texas)来合成的。基因的片段1(对应于核苷酸1-305)是通过扩增305bp片段来构建的，利用PCR技术通过Taq聚合酶以及由提供者推荐的标准条件，以8寡聚物的等摩尔混合物为模板，STRF1A(5’-ggATCCACCATgAACggCCT ggAg-3’)(SEQ ID NO：18)和STRF1B(5’-CTCgAgAAgTCCACCTTggT CAC-3’)(SEQ ID NO：19)为引物。基因的片段2是通过扩增346bp片段来构建的(对应于核苷酸299-645)，利用PCR技术，以10寡聚物的等摩尔混合物为模板，STRF2A(5’-CTCgAgCAAGCCgTTCAA-3’)(SEQ ID NO：20)和STRF2B(5’-gACgTCgATCTTCgggTTgg A-3’)(SEQ ID NO：21)为引物。基因的片段3是通过扩增382bp片段来构建的(对应于核苷酸639-1021)，利用PCR技术，以10寡聚物的等摩尔混合物为模板，STRF3A(5’-CgACgTCATCTggAACTCCT-3’)(SEQ ID NO：22)和STRF3B(5’-gAgCTCAgATCTAgTCggAC TTg-3’)(SEQ ID NO：23)为引物。将每个片段的扩增DNA克隆至topo PCR2.1 T-载体(Invitrogen)。具有正确序列的基因片段通过重叠限制性内切酶位点XhoI和AatII连接。玉米优化的拟南芥NADPH依赖性的硫氧还蛋白还原酶编码序列为SEQ ID NO：24，它编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：25。构建完整的基因并测序，再亚克隆至含有γ-玉米醇溶蛋白启动子和35S终止子的植物表达载体盒。启动子、基因、终止子单元再单独亚克隆至一个农杆菌玉米转化载体，并与水稻和小麦的硫氧还蛋白基因相连。
实施例5：水稻NADPH依赖性的硫氧还蛋白还原酶(NTR)基因
水稻NADPH依赖性的硫氧还蛋白还原酶(NTR)编码序列为SEQ IDNO：26，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：27。
实施例6：拟南芥NTR和如上所述的水稻序列的比对
比对的序列
参照分子：arab trPG(SEQ ID NO：25)，1-1002(334个氨基酸)
序列2：TRCONAA.TXT(SEQ ID NO：27)，1-310(310个氨基酸)
同源性70％
排列类型：球状蛋白质
参数：错配2；开放缺口4；延伸缺口1；保守N
arab trPG    (1)  mnglethn--trlcivgsgpaahtaaiyaaraelkpllfegwmandiapg
TRCONAA.TXT  (1)  .e.sagaplr....i....s...............v.....l.....a.
arab trPG    (145) gqlttttdvenfpgfpegilgveltdkfrkqserfgttiftetvtkvdfs
TRCONAA.TXT  (51)  .....................g..m.rc.a..l....s.is....a....
arab trPG    (295) skpfklftdskailadavilaigavakwlsfvgsgevlgglwnrgisaca
TRCONAA.TXT  (101) ar..rvas..ttv.....vv.t....rr.h.a..----day.........
arab trPG    (445) vcdgaapifrnkplavigggdsameeanfltkygskvyiidrrdafrask
TRCONAA.TXT  (147) .............i............s........h....h..nt.....
arab trpG    (595) imqqralsnpkidviwnssvveaygdgerdvlgglkvknvvtgdvsdlkv
TRCONAA.TXT  (197) ...a........q.f.d.e......gegggp.a.v....l...ki...q.
arab trPG    (745) sglffaighepatkfldggveldsdgyvvtkpgttqtsvpgvfaagdvqd
TRCONAA.TXT  (247) ................g.ql...a....a....s.h...k..........
arab trpG    (895) kkyrqaitaagtgcmaaldaehylqeigsqqgksd*
TRCONAA.TXT  (297) ...........----------------------.gl
实施例7：植物转化载体
PNOV4100-PTX5’-At PPO-35ST’和Ubq3(At)-内含子-NOS载体：用EcoRI消化PBH28(拟南芥Ubq3int-NOS)，分离出4756bp的条带，用Klenow补平，连接至pCTK2(PTX5’-At PPO-35ST)，用HindIII消化，分离出2386bp的条带，用Klenow补平。pNOV4100含有PTX5’、At PPO、35ST’、amp、Ubq3(At)内含子NOS。将连接产物测序。
PNOV4101-在PPO载体pNOV4100中的β总大豆球蛋白(conglycinin)α’亚基启动子-大豆硫氧还蛋白-NOS
用HindIII消化pNOV4100。通过PCR克隆β总大豆球蛋白α’亚基启动子(GenBank accession #M13759)，使用大豆叶基因组DNA和寡核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO：28))和P10(5’-gct ttt ccc aat acg caa tgc-3’(SEQ ID NO：29))(Sylvain等(1992)Plant Mol.Biol.19：937-949)。将该PCR产物克隆至PCR2.1 TOPO载体并测序。该构建体在PCR中用作模板，引物为寡核苷酸P4(5’-gac tag cgc tga cag aaa ctg atgcta gga a-3’(SEQ ID NO：30))和P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO：28))。用HindIII和Eco47AIII消化。从大豆发芽的种子提取总RNA，通过RT-PCR克隆大豆硫氧还蛋白，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggttgt c-3’(SEQ ID NO：31))和P2(5’-cgt aga gct ctc aag aagaag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO：32))。将该PCR产物克隆至PCR2.1 TOPO载体并测序。该构建体在PCR中用作模板，引物为寡核苷酸P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO：32))和P5(5’-gac tag cgc tga aga ggg tca ggt tgtcg-3’(SEQ ID NO：33))。用Eco47III和SacI消化。将以上三个片段进行三向连接，序列经鉴定。
PNOV4102-在PPO载体pNOV4100中的β总大豆球蛋白α’亚基启动子-大豆硫氧还蛋白-烟草壳多糖酶液泡信号序列-NOS。用HindIII和SacI消化pNOV4100。通过PCR克隆β总大豆球蛋白α’亚基启动子，使用大豆叶基因组DNA和寡聚核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO：28))和P10(5’-gct tttccc aat acg caa tgc-3’(SEQ ID NO：29))。将该PCR产物克隆至PCR2.1 TOPO载体并测序。该构建体在PCR中用作模板，引物为寡核苷酸P4(5’-gac tag cgc tga cag aaa ctg atg cta gga a-3’(SEQID NO：30))和P9(5’-gac taa gct tac aat tat tat atc aaa atggc-3’(SEQ ID NO：28))。用HindIII和Eco47AIII消化。从大豆发芽的种子提取总RNA，通过RT-PCR克隆大豆硫氧还蛋白(GenBankaccession#AI441505)，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tgaaga aga ggg tca ggt tgt c-3’(SEQ ID NO：31))和P2(5’-cgtaga gct ctc aag aag aag cag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO：32))。将该PCR产物克隆至PCR2.1 TOPO载体并测序。该构建体在PCR中用作模板，引物为寡核苷酸P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aagcag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO：32))和P5(5’-gac tag cgctga aga ggg tca ggt tgt cg-3’(SEQ ID NO：33))。用Eco47III和SacI消化。将以上三个片段进行三向连接，序列经鉴定。
PNOV4103-在PPO载体pNOV4100中的β总大豆球蛋白α’亚基启动子加上β总大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧还蛋白-NOS。通过PCR克隆β总大豆球蛋白α’亚基启动子加上β总大豆球蛋白的前肽部分，使用大豆叶基因组DNA和寡核苷酸P9(5’-gac taa gct tac aattat tat atc aaa atg gc-3’(SEQ ID NO：28))和P12(5’-cag taggct taa gga aat tgc aac gag-3’(SEQ ID NO：34))。将该片段克隆至pCR 2.1 TOPO。用StuI和SacI消化该构建体，并将大豆硫氧还蛋白克隆至该载体。经PCR修饰大豆硫氧还蛋白的限制性酶切位点。寡核苷酸P2(SacI)(5’-cgt aga gct ctc aag aag aag cag cag cagcag at-3’(SEQ ID NO：32))和P11(PvuII)(5’-cag tca gct gaagag ggt cag gtt gtc-3’(SEQ ID NO：35))。在pCR 2.1 TOPO中产生β总大豆球蛋白启动子加上前肽部分+硫氧还蛋白，其称为A-6。用HindIII和SacI消化A-6和pNOV4100。来自A-6的1459bp的片段与pNOV4100连接。
PNOV4104-在PPO载体pNOV4100中的β总大豆球蛋白α’亚基启动子加上β总大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧还蛋白-烟草壳多糖酶液泡信号序列-NOS。用StuI和SacI消化pCR 2.1 TOPO中的β总大豆球蛋白α’亚基启动子加上β总大豆球蛋白的前肽部分。用P11(5’-cag tca gct gaa gag ggt cag gtt gtc-3’(SEQ ID NO：35))和P27(5’-cta gga gct cta cat ggt gtc cac cag cag-3’(SEQ IDNO：36))为引物，以BTC4为模板(含有大豆硫氧还蛋白和烟草壳多糖酶液泡信号序列的pBluescript)得到PCR片段。用PVuII和SacI消化该片段，与StuI-SacI片段连接。产生A3-10(即带有β总大豆球蛋白启动子的pCR 2.1 TOPO+前肽-大豆硫氧还蛋白-烟草壳多糖酶液泡信号序列)。用HindIII和SacI消化A3-10和pNOV4100并连接。
PNOV4105-Ubq3(At)-内含子-烟草壳多糖酶ER信号序列-NOS和PTX5’-At PPO-35ST’。用BamHI和PstI消化PNOV4100，并连接至pCIB8418的烟草壳多糖酶ER信号序列再用BamHI和PstI消化得到PNOV4105。该载体含有Ubq3启动子和内含子与烟草壳多糖酶ER信号序列。
PNOV4106-在PPO载体pNOV4105中的Ubq3(At)-内含子-烟草壳多糖酶ER信号序列-大豆硫氧还蛋白-烟草壳多糖酶液泡信号序列-NOS。用Eco47III和SacI消化pNOV4105和pNOV4102。来自pNOV4102的387bp的条带连接至消化过的pNOV4105。
PNOV4107-在PPO载体pNOV4105中的Ubq3(At)-内含子-烟草壳多糖酶ER信号序列-大豆硫氧还蛋白-NOS。用Eco47III和SacI消化pNOV4105和pNOV4101。来自pNOV4101的360bp的条带连接至消化过的pNOV4105。
PNOV4108-在二元载体pCIB200中的β总大豆球蛋白α’亚基启动子-大豆硫氧还蛋白-烟草壳多糖酶液泡信号序列-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow补平。用HindIII和SacI消化pNOV4101，用T4 DNA聚合酶将末端补平，并将1626bp条带与消化过的pCIB200连接。
PNOV4109-在二元载体pCIB200中的β总大豆球蛋白α’亚基启动子加上β总大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧还蛋白-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow补平。用HindIII和KpnI消化pNOV4103，用T4 DNA聚合酶将末端补平，并将1748bp条带与消化过的pCIB200连接。
PNOV4110-β总大豆球蛋白α’亚基启动子-大豆硫氧还蛋白-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow补平。用PvuII和KpnI消化pNOV4102，用T4 DNA聚合酶将末端补平，并将1843bp条带与消化过的pCIB200连接。
PNOV4111-在二元载体pCIB200中的β总大豆球蛋白α’亚基启动子加上β总大豆球蛋白的前肽部分-大豆硫氧还蛋白-烟草壳多糖酶液泡信号序列-NOS。用XbaI消化pCIB200，并用Klenow补平。用PvuII和KpnI消化pNOV4104，用T4 DNA聚合酶将末端补平，并将1969bp的条带与消化过的pCIB200连接。
PNOV4112-大肠杆菌蛋白质表达载体pET29a中的大豆硫氧还蛋白。从大豆发芽的种子提取总RNA，通过RT-PCR克隆大豆硫氧还蛋白，使用P1(5’-cgt agg atc cac cat ggc tga aga aga ggg tca ggt tgtc-3’(SEQ ID NO：31))和P2(5’-cgt aga gct ctc aag aag aagcag cag cag cag at-3’(SEQ ID NO：32))。用BamHI和SacI消化该PCR产物，并克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。该序列已经鉴定。
PNOV4113-大肠杆菌蛋白质表达载体pET29a中的水稻硫氧还蛋白。用BamHI和SacI消化pNOV3400，将水稻硫氧还蛋白(378bp)克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。该序列已经鉴定。
PNOV4114-大肠杆菌蛋白质表达载体pET29a中的小麦硫氧还蛋白。用BamHI和SacI消化pNOV3406，将小麦硫氧还蛋白(387bp)克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。该序列已经鉴定。
PNOV4115-大肠杆菌蛋白质表达载体pET29a中的拟南芥NADPH硫氧还蛋白还原酶.通过RT-PCR克隆拟南芥NADPH硫氧还蛋白还原酶(GenBank Accession # Z23109)。用Trizol(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)依照生产者提供的实验方法，从拟南芥的叶子中提取出总RNA。在Superscript One Step RT-PCR系统(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中使用一微克总RNA，来一步产生cDNA和PCR产物。在该反应中使用引物P28(5’-gca cgg ctt ggt ggt gaa tcc-3’(SEQ ID NO：37))和P29(5’-ctc att ctg gtc cat caa tgt c-3’(SEQ ID NO：38))。依照生产者提供的实验方法。将PCR产物以1∶10稀释，嵌套式PCR反应中使用1微升该产物，与引物P26(5’-gactgt cga ctc aat cac tct tac ctt gct gag-3’(SEQ ID NO：39))和P31(5’-gac tgg atc caa tgg tct cga aac tca caa c-3’(SEQID NO：40))进行反应。该嵌套式PCR反应产物(998bp)经胶纯化，用BamHI和SacI消化后克隆至用BamHI和SacI消化的pET29a中去。该序列已经鉴定。PNOV4109-用XbaI消化pCIB200，并用Klenow补平。用HindIII和KpnI消化pNOV4103，用T4 DNA聚合酶将末端补平，并将1748bp条带与消化过的pCIB200连接。该构建可用于大豆中的瞬时表达分析，也可与硫氧还蛋白连接用于拟南芥和其它双子叶植物的稳定转化。
PNOV4101、PNOV4102、PNOV4103、PNOV4104、PNOV4106、PNOV4107用于大豆子叶中的瞬时表达实验。
通过Western印迹分析了硫氧还蛋白的表达
PNOV4108、PNOV4109、PNOV4110、PNOV4111用于拟南芥的稳定转化实验。通过Western印迹分析了硫氧还蛋白的表达。检测了硫氧还蛋白对表达的作用和种子特异性蛋白质的活性。
PNOV4112、PNOV4113、PNOV4114分别为大肠杆菌蛋白质表达载体pET29a(Novagen)中的含有大豆、水稻和小麦trx-h基因的构建体。这些构建体是用于制备适用于抗体生产和纯化的硫氧还蛋白，该硫氧还蛋白也可在硫氧还蛋白的酶试验中充当标准蛋白。
实施例8：蛋白质表达和纯化
如下构建体用于大肠杆菌中的蛋白质表达：PNOV4112(pET29a中的大豆硫氧还蛋白)、PNOV4113(pET29a中的水稻硫氧还蛋白)、PNOV4114(pET29a中的小麦硫氧还蛋白)和PNOV4115(pET29a中的拟南芥硫氧还蛋白还原酶)。将大肠杆菌株系BL21(DE3)pLysS用每个构建体转化。在含有来自甘油原液的等分试样、50mg/ml的卡那霉素、34mg/ml的氯霉素的LB培养基中于37℃培养直至在600nm的光密度达到0.6。培养体系在4℃中保存至第二天。将培养体系离心后在新鲜LB中重悬细胞。用每25ml大规模培养液使用1ml小规模培养液的方式来进行大批培养。细胞在含有50mg/ml的卡那霉素、34mg/ml的氯霉素的LB培养基中于37℃培养直至在600nm的光密度达到0.6。加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)使其终浓度为0.4mM，用于诱导蛋白质表达。继续在37℃培养3个小时。取出培养液1/25体积的量，在3000g离心10分钟，并将细胞在BugBuster中重新悬浮(Novagen，Madison，WI)。在每毫升BugBuster中加入5单位DNase。细胞在-20℃放置过夜。细胞融化后在室温旋转孵育30分钟。通过在4℃以14,000g离心20min去除细胞碎片。
表达的蛋白为具有S-标记(15个氨基酸)和5’端凝血酶切割位点(6个氨基酸)的融合蛋白。通过cDNA的5’端克隆位点的BamHI位点，将另外的31个氨基酸加入目标蛋白的5’端。
用亲和色谱纯化该融合蛋白。将蛋白质提取物加入S-蛋白琼脂糖浆液(Novagen，Madison，WI)。由于融合蛋白的表达量不同，每个实验的S-蛋白琼脂糖所需量也不同。产率为0.5mg纯化的蛋白质/ml树脂。依照生产者提供的实验方法。要去除S-标记，依照生产者提供的实验方法使用S-标记凝血酶纯化试剂盒(Novagen，Madison，WI)。
实施例9：抗体的生产
大豆硫氧还蛋白抗体的生产：经过亲和色谱纯化大豆硫氧还蛋白，使用S-蛋白琼脂糖和如上所述的方法去除S-标记。在这种制备物中存在污染蛋白，因此将该蛋白在4-20％的Tris-甘氨酸胶(Novex，SanDiego)上电泳，并将大豆硫氧还蛋白的条带从电泳胶上切除。将切下的胶条提供给Duncroft Inc.(Lovettsville，VA)，用于在山羊中生产抗体，使用如下标准操作过程CG1“兔、绵羊和山羊的多克隆抗体制备”。
水稻硫氧还蛋白特异性抗体的纯化：依照生产者提供的实验方法用S-蛋白琼脂糖亲和色谱纯化水稻硫氧还蛋白(Novagen，Madison，WI)。不去除S-标记。
Affi-Gel-10柱的制备：在与Bio-rad Affi-Gel-10柱偶联之前，将纯化的水稻硫氧还蛋白置于2L含0.1M NaHCO3、pH为8.3的溶液中透析5小时，依照生产者提供的实验方法操作。简要地说，将大约2ml的Affi-Gel-10浆液转移至与真空相连的玻璃过滤器，去除溶剂，并用冰预冷的dH2O(至少3倍体积)将胶洗涤两次。然后将潮湿的胶转移至含有透析过的水稻硫氧还蛋白的试管中，在4℃摇床上过夜。为了确保封闭所有未被占用的活性位点，向胶中加入0.1ml的1M乙醇胺HCl(pH7.0)，在4℃摇一个小时。再将胶转移至柱中，经PBS洗涤，用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5，0.4ml)预洗脱，再用PBS平衡。最终的柱体积为0.8ml。不使用时，将柱在含有0.2％叠氮化钠的PBS中保存于4℃。
水稻硫氧还蛋白特异性抗体的纯化：通过水稻硫氧还蛋白Affi-Gel-10柱将大豆硫氧还蛋白山羊抗血清进行免疫亲和纯化。对于每轮反应，借助重力将2ml血清加入柱中，用PBS洗涤柱直至A280值＜0.015，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.5)洗脱。收集组分(1ml)并用50μl 0.5M的Tris(pH8.5)中和。将A280为0.05或更大值的组分收集。
实施例10：硫氧还蛋白分析
胰岛素还原分析：(Arne Holmgren(1979)J.Biol.Chem.254：9627-9632)。在该分析中，DTT(二硫苏糖醇)还原硫氧还蛋白。还原了的硫氧还蛋白进而将胰岛素中的二硫键还原，产生白色沉淀物。在650nm波长下记录沉降速率。新鲜制备的胰岛素溶液(1mg/ml，在0.1M的磷酸钾溶液中，pH6.5)、2mM EDTA(乙二胺四乙酸)和100mM DTT在冰上预冷。在比色杯中制备分析混合物。每个比色杯中含有750微升1mg/ml胰岛素、3.3微升DTT并用水加至终体积为1ml。空白对照不含有硫氧还蛋白，样品中含有不同含量的硫氧还蛋白(适用于分析的最低量为10微摩尔)。在650nm读出光密度之前，样品必须在室温制备和培养至少20分钟。
DTNB[5，5’-二硫-双-(2-硝基苯甲酸)]分析-(Oblong等(1993)Biochemistry 32：7271-7277)。在本分析中硫氧还蛋白还原酶和NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)用于还原硫氧还蛋白，而还原的硫氧还蛋白进一步还原DTNB。在412nm处监控光密度变化4分钟。需要新鲜制备的DTNB溶液(100mM，于DMSO二甲基亚砜中)、NADPH(20mM于H2O中)和含有100mM Tris(pH8.0)的缓冲液、0.1mg/mlBSA。在比色杯中制备分析混合物。每个比色杯中含有10微升DTNB、10微升NADPH、5微克硫氧还蛋白、2微克拟南芥或大肠杆菌硫氧还蛋白还原酶并用缓冲液加至终体积为1ml。一旦加入硫氧还蛋白，立即颠倒混匀，并立即开始测定412nm处的光密度。这是一个慢反应。Y轴设置为0至0.5A。空白对照不含硫氧还蛋白。
实施例11：农杆菌介导的玉米转化
转化质粒和选择标记：将用于转化的基因克隆至适于玉米转化的载体上。使用了含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因的载体，以允许用甘露糖来筛选转基因细胞。
根癌农杆菌的制备：含有植物转化质粒的农杆菌株系LBA4404(pSB1)在YEPC固体培养基上生长(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、CaCl2·2H2O(1.029g/L))，其中含有适当的抗生素(壮观霉素(100mg/L)、四环素(10mg/L))，在28℃培养2-4天。将大约0.75×108的农杆菌悬浮于LS修饰的液体感染培养基，其中含有100μM乙酰丁香酮(acetosyringone)(Negrotto等(2000)Plant Cell Rep.，印刷中：用0.1×磷酸修改)。在使用前在该培养基中将细菌预诱导0.5-2个小时。于660nm检测细菌浓度，并将其光密度调整至大约0.75。
孵育：将来自A188、Hi-II或A188×Hi-II的8-9天的未成熟胚切割，直接放入含有LS修饰的液体感染培养基的1.5ml离心管中，其中含有100μM乙酰丁香酮。总切割时间为30分钟。将胚旋涡振荡5秒，使其沉降下来，并去除感染培养基。加入新鲜的感染培养基。将离心管置于45℃水浴中5分钟，使胚热休克。去除感染培养基，代替为农杆菌溶液。将胚旋涡振荡30秒，使其与细菌结合5分钟。将细菌/胚溶液倒入固化的LS修饰的感染培养基，其中含有500μM乙酰丁香酮(Negrotto等，ibid：用0.1×磷酸修改)。小心地将菌液吸走，并将胚转移至平板的干净部位。将胚盾片朝上放置，于22℃共培养2-3天。
转化细胞的选择和转化植物的再生：在共培养之后，将胚置于JMS培养基之上[Suttie等(1991)第三次国际植物生长和发育的分子生物学大会海报#905(3rD International Congress Molecular Biologyof Plant Growth and Development Poster#905)]，其中含有AgNO3和200mg/l替卡西林用于诱导愈伤组织。在所有随后的培养基中均含有替卡西林。于28℃在暗处培养10天之后，已诱导出胚发生的愈伤组织。将愈伤组织转移至不含有银却含有用于选择的10g/L甘露糖和5g/L蔗糖的JMS培养基。在2-3周以后，将仍存活的愈伤组织转移至新鲜的选择培养基。再过2-3周，将仍存活的愈伤组织转移至MSAK+PO4培养基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473-439：附加有20g/L蔗糖、5g/L/甘露糖、ancimidol(0.25mg/L)、细胞分裂素(0.5mg/L)和KH2PO4(170mg/L))用于再生(28℃，暗处，10-14天)。将愈伤组织转移至新鲜的MSAK+PO4培养基，并转移至光下培养(16小时光/8小时黑暗)。在1周以后，将再生的苗转移至不含激素的MS培养基，其中附加有20g/L蔗糖和5g/L/甘露糖。将长出根的苗转移至MagentaTMGA-7试剂盒中，其中含有0.75离子强度的MS培养基，并添加有10ml/L的Plant Preservative MixtureTM和10g/L蔗糖用于进一步的生长。可对直接来自GA-7试剂盒的植物或转移至土壤中的植物进行分析。
实施例12：大豆子叶瞬时表达系统
S3911 Novartis育种系中灭菌的种子在MS固体培养基上萌发6天，5个/平板，条件为16/8光周期、25℃。将子叶外植并切成1-2mm的小条。将来自一对子叶的小条放置成直径为1-2cm的圆圈，其处于含MS培养基的培养皿的中央，该MS培养基中含有1mg/l BAP和0.5mg/l NAA。用PDS-100 Helium枪轰击该组织，依照DuPont手册。每个平板均通过1550psi裂口盘轰击两次。依据手册制备带有DNA的金微载体。每个大载体上带有0.6μg选定的质粒DNA。将一个不锈钢屏幕作为轰击波的挡板。在轰击后，将平板置回16/8光周期，25℃的条件下。第一次取材为48小时。
实施例13：用pNOV 3401转化的转基因植物分析
A.PCR：
从GA-7盒中的转基因植物中选取材料。在96孔板用Gentra DNA提取试剂盒，依照厂家的说明书来提取DNA。使用Jumpstart RedtaqReadymix(Sigma)和引物Thiorodoxubi 1603(5’-GCGGTCGTTCATTCGTTCTA-3’(SEQ ID NO：41))和引物Thiorodox 2364(5’-ACGTGCTTCA CGATGGTGTT-3’(SEQ ID NO：42))，其终浓度均为2.5μM，来进行PCR反应。经PCR鉴定含有硫氧还蛋白基因的转基因植物转移至温室中。
B.通过Northern印迹分析来自转基因植物的硫氧还蛋白RNA：
通过Lagrimini等((1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7542-7546)描述的方法，从转基因植物的叶和种子组织中提取总RNA。探针是由完整的水稻trx-h基因制备而来的。用BamHI-SacI消化质粒pNOV 3401得到一个327bp的片段，再经胶纯化并通过LifeTechnologies Inc.的随机引物标记试剂盒用32P α-CTP标记。
来自代表性转基因植物的叶和种子RNA的Northern印迹结果显示硫氧还蛋白mRNA在叶和种子组织中的表达。
C.来自转基因植物的硫氧还蛋白蛋白质的分析：
玉米叶的蛋白质提取和western分析：从每片叶子材料上打孔取下一个eppendorf盖大的小圆。将该组织放入eppendorf管中并用干冰冷冻。用一个小杵在eppendorf管中研磨组织。向研碎的组织加入400微升100mM Tris(pH8.0)，样品在室温下离心30分钟，取上清。所有样品均使用3000MW截止的Centriconsi浓缩。每个样品上样12.5微升于16％Tris-甘氨酸(Novex，San Diego CA)微型胶，以Tris-甘氨酸-SDS(24mM Tris、52mM甘氨酸、1％十二烷基硫酸钠)为电泳缓冲液，而后将蛋白质转移至PVDF上。杂交膜用TBS-2％Tween(TBS-150mM NaCl、30mM Tris、pH10.2)在室温封闭15分钟后，与水稻硫氧还蛋白抗体(从山羊抗大豆硫氧还蛋白血清中经亲和纯化)温育，浓度为1微克抗体/1微升TBS-0.5％Tween，在4℃反应过夜。将杂交膜用TBS-0.05％Tween洗三次，每次5分钟，而后与HRP(辣根过氧化物酶)兔抗羊IgG(50纳克抗体每微升TBS-0.05％Tween)，在室温反应1小时，再用TBS-0.05％Tween洗，最后与supersignalwest femto化学发光底物(Pierce，Rockford，IL)在室温反应5分钟。再将杂交膜与底片放置，一起曝光30秒。
玉米种子的蛋白质提取和western分析：将来自每个样品的每个种子切成两半，取一半在干冰中冷冻，并用研钵和杵将其研磨，加入1.5微升Tris(pH8.0)，在室温旋转孵育30分钟。将样品离心，并用10,000MW截止的Centricons将蛋白质提取物浓缩。每个样品上样12.5微升于16％Tris-甘氨酸(与叶子样品的条件相同)。胶转移至硝化纤维素上，TBS-2％Tween封闭15分钟，与水稻硫氧还蛋白抗体(1微克抗体每微升TBS-0.5％Tween)在室温孵育1.5小时，洗净后与HRP兔抗羊IgG孵育，步骤如上所述。最后将杂交膜与supersignal westpico化学发光底物(Pierce，Rockford，IL)在室温反应5分钟。再将杂交膜与底片放置，一起曝光5分钟。Western杂交结果显示水稻硫氧还蛋白在叶和种子组织中的表达。Western印迹结果也显示，与同上样于胶上的对照水稻硫氧还蛋白相比，在转基因植物中表达的水稻硫氧还蛋白具有预期的大小。
实施例14：大肠杆菌中表达的重组硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的酶活性
大肠杆菌中表达的重组大豆硫氧还蛋白通过使用S-蛋白琼脂糖的亲和色谱来纯化，并用凝血酶切割S-标记。在上述的胰岛素还原分析中检测该蛋白质。检测4、20、40和80微克的亲和纯化的硫氧还蛋白(存在一种污染蛋白)。在31分钟之后，在650nm下测量到了光密度的变化。
硫氧还蛋白(μg)    650nm的OD值(31     沉降速率(Δ
                      分钟之后)         A 650 /min)
      0                .0000            .000000
      1                .0010            .000032
      2                .0077            .00025
      3                .0084            .00027
      4                .0117            .00038
在NADPH硫氧还蛋白还原酶DTNB分析中测定了以下重组蛋白质：具有S-标记的大豆硫氧还蛋白、不具有S-标记的大豆硫氧还蛋白、具有S-标记的水稻硫氧还蛋白、具有S-标记的小麦硫氧还蛋白和不具有S-标记的拟南芥硫氧还蛋白还原酶。在此分析中也使用大肠杆菌硫氧还蛋白还原酶(T-7915，Sigma，St.Louis，MO)。在4分钟之内监控412nm处的光密度变化。
硫氧还蛋白           硫氧还蛋白还原酶   ΔA 412
   0μl               1.5μl(≈0.5μg)    0.06
                        拟南芥
30μl(≈12μg)大豆    2.3μg大肠杆菌      0.333
30μl(≈12μg)大豆    1.5μl(≈0.5μg)    0.42
                        拟南芥
30μl(≈6μg)大豆     2.3μg大肠杆菌      0.20
30μl(≈15μg)水稻    1.5μl(≈0.5μg)    0.66
                        拟南芥
30μl(≈15μg)水稻    2.3μg大肠杆菌      0.30
30μl(≈0.6μg)小麦   2.3μg大肠杆菌      0.30
30μl(≈0.6μg)小麦   1.5μl(≈0.5μg)    0.08
                        拟南芥
30μl(≈1.2μg)小麦   1.5μl(≈0.5μg)    0.08
                        拟南芥
拟南芥的硫氧还蛋白还原酶和大肠杆菌的硫氧还蛋白还原酶可还原具有或不具有S-标记的大豆硫氧还蛋白。拟南芥和大肠杆菌的硫氧还蛋白还原酶也可还原水稻硫氧还蛋白。小麦硫氧还蛋白可被大肠杆菌的硫氧还蛋白还原酶还原，而不能被拟南芥的硫氧还蛋白还原酶还原。
                             序列表
序列表
<110>Syngenta Participations AG
<120>谷物加工方法和其中有用的转基因植物
<130>A-31383A
<140>
<141>
<150>US 09/598747
<151>2000-06-21
<160>42
<170>PatentIn Ver.2.2
<210>1
<211>85
<212>PRT
<213>詹氏甲烷球菌
<400>1
Met Ser Lys Val Lys Ile Glu Leu Phe Thr Ser Pro Met Cys Pro His
  1               5                  10                  15
Cys Pro Ala Ala Lys Arg Val Val Glu Glu Val Ala Asn Glu Met Pro
             20                  25                  30
Asp Ala Val Glu Val Glu Tyr Ile Asn Val Met Glu Asn Pro Gln Lys
         35                  40                  45
Ala Met Glu Tyr Gly Ile Met Ala Val Pro Thr Ile Val Ile Asn Gly
     50                  55                  60
Asp Val Glu Phe Ile Gly Ala Pro Thr Lys Glu Ala Leu Val Glu Ala
 65                  70                  75                  80
Ile Lys Lys Arg Leu
                 85
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌
<400>2
Met Pro Met Val Arg Lys Ala Ala Phe Tyr Ala Ile Ala Val Ile Ser
  1               5                  10                  15
Gly Val Leu Ala Ala Val Val Gly Asn Ala Leu Tyr His Asn Phe Asn
             20                  25                  30
Ser Asp Leu Gly Ala Gln Ala Lys Ile Tyr Phe Phe Tyr Ser Asp Ser
         35                  40                  45
Cys Pro His Cys Arg Glu Val Lys Pro Tyr Val Glu Glu Phe Ala Lys
     50                  55                  60
Thr His Asn Leu Thr Trp Cys Asn Val Ala Glu Met Asp Ala Asn Cys
 65                  70                  75                  80
Ser Lys Ile Ala Gln Glu Phe Gly Ile Lys Tyr Val Pro Thr Leu Val
                 85                  90                  95
Ile Met Asp Glu Glu Ala His Val Phe Val Gly Ser Asp Glu Val Arg
            100                 105                 110
Thr Ala Ile Glu Gly Met Lys
        115
<210>3
<211>93
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌
<400>3
Met Val Phe Thr Ser Lys Tyr Cys Pro Tyr Cys Arg Ala Phe Glu Lys
  1               5                  10                  15
Val Val Glu Arg Leu Met Gly Glu Leu Asn Gly Thr Val Glu Phe Glu
             20                  25                  30
Val Val Asp Val Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Val
         35                  40                  45
Leu Met Leu Pro Thr Leu Val Leu Ala Asp Gly Asp Glu Val Leu Gly
     50                  55                  60
Gly Phe Met Gly Phe Ala Asp Tyr Lys Thr Ala Arg Glu Ala Ile Leu
 65                  70                  75                  80
Glu Gln Ile Ser Ala Phe Leu Lys Pro Asp Tyr Lys Asn
                 85                  90
<210>4
<211>134
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌
<400>4
Met Asp Glu Leu Glu Leu Ile Arg Gln Lys Lys Leu Lys Glu Met Met
  1               5                  10                  15
Gln Lys Met Ser Gly Glu Glu Lys Ala Arg Lys Val Leu Asp Ser Pro
             20                  25                  30
Val Lys Leu Asn Ser Ser Asn Phe Asp Glu Thr Leu Lys Asn Asn Glu
         35                  40                  45
Asn Val Val Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Met Pro Cys Lys Met
     50                  55                  60
Ile Ala Pro Val Ile Glu Glu Leu Ala Lys Glu Tyr Ala Gly Lys Val
 65                  70                  75                  80
Val Phe Gly Lys Leu Asn Thr Asp Glu Asn Pro Thr Ile Ala Ala Arg
                 85                  90                  95
Tyr Gly Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu Ile Phe Phe Lys Lys Gly Lys
            100                 105                 110
Pro Val Asp Gln Leu Val Gly Ala Met Pro Lys Ser Glu Leu Lys Arg
        115                 120                 125
Trp Val Gln Arg Asn Leu
    130
<210>5
<211>105
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌
<400>5
Met Glu Arg Leu Asn Ser Glu Arg Phe Arg Glu Val Ile Gln Ser Asp
  1               5                  10                  15
Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Asp Trp Cys Met Pro Cys Arg
             20                  25                  30
Tyr Ile Ser Pro Ile Leu Glu Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Gly Glu
         35                  40                  45
Val Glu Phe Tyr Lys Leu Asn Val Asp Glu Asn Gln Asp Val Ala Phe
     50                  55                  60
Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Pro Thr Val Leu Phe Phe Arg Asn Gly
 65                  70                  75                  80
Lys Val Val Gly Gly Phe Ile Gly Ala Met Pro Glu Ser Ala Val Arg
                 85                  90                  95
Ala Glu Ile Glu Lys Ala Leu Gly Ala
            100                 105
<210>6
<211>301
<212>PRT
<213>詹氏甲烷球菌
<400>6
Met Ile His Asp Thr Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Gly Gly Leu Thr
  1               5                  10                  15
Ala Gly Ile Tyr Ala Met Arg Gly Lys Leu Asn Ala Leu Cys Ile Glu
             20                  25                  30
Lys Glu Asn Ala Gly Gly Arg Ile Ala Glu Ala Gly Ile Val Glu Asn
         35                  40                  45
Tyr Pro Gly Phe Glu Glu Ile Arg Gly Tyr Glu Leu Ala Glu Lys Phe
     50                  55                  60
Lys Asn His Ala Glu Lys Phe Lys Leu Pro Ile Ile Tyr Asp Glu Val
 65                  70                  75                  80
Ile Lys Ile Glu Thr Lys Glu Arg Pro Phe Lys Val Ile Thr Lys Asn
                 85                  90                  95
Ser Glu Tyr Leu Thr Lys Thr Ile Val Ile Ala Thr Gly Thr Lys Pro
            100                 105                 110
Lys Lys Leu Gly Leu Asn Glu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Gly Ile Ser
        115                 120                 125
Tyr Cys Thr Met Cys Asp Ala Phe Phe Tyr Leu Asn Lys Glu Val Ile
    130                 135                 140
Val Ile Gly Arg Asp Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ile Asn Leu Lys
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Lys Lys Val Ile Val Ile Thr Asp Lys Ser Glu Leu Lys
                165                 170                 175
Ala Ala Glu Ser Ile Met Leu Asp Lys Leu Lys Glu Ala Asn Asn Val
            180                 185                 190
Glu Ile Ile Tyr Asn Ala Lys Pro Leu Glu Ile Val Gly Glu Glu Arg
        195                 200                 205
Ala Glu Gly Val Lys Ile Ser Val Asn Gly Lys Glu Glu Ile Ile Lys
    210                 215                 220
Ala Asp Gly Ile Phe Ile Ser Leu Gly His Val Pro Asn Thr Glu Phe
225                 230                 235                 240
Leu Lys Asp Ser Gly Ile Glu Leu Asp Lys Lys Gly Phe Ile Lys Thr
                245                 250                 255
Asp Glu Asn Cys Arg Thr Asn Ile Asp Gly Ile Tyr Ala Val Gly Asp
            260                 265                 270
Val Arg Gly Gly Val Met Gln Val Ala Lys Ala Val Gly Asp Gly Cys
        275                 280                 285
Val Ala Met Ala Asn Ile Ile Lys Tyr Leu Gln Lys Leu
    290                 295                 300
<210>7
<211>300
<212>PRT
<213>闪烁古生球菌
<400>7
Met Tyr Asp Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ala
  1               5                  10                  15
Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Tyr Gly Leu Lys Thr Val Phe Phe Glu Thr
             20                  25                  30
Val Asp Pro Val Ser Gln Leu Ser Leu Ala Ala Lys Ile Glu Asn Tyr
         35                  40                  45
Pro Gly Phe Glu Gly Ser Gly Met Glu Leu Leu Glu Lys Met Lys Glu
     50                  55                  60
Gln Ala Val Lys Ala Gly Ala Glu Trp Lys Leu Glu Lys Val Glu Arg
 65                  70                  75                  80
Val Glu Arg Asn Gly Glu Thr Phe Thr Val Ile Ala Glu Gly Gly Glu
                 85                  90                  95
Tyr Glu Ala Lys Ala Ile Ile Val Ala Thr Gly Gly Lys His Lys Glu
            100                 105                 110
Ala Gly Ile Glu Gly Glu Ser Ala Phe Ile Gly Arg Gly Val Ser Tyr
        115                 120                 125
Cys Ala Thr Cys Asp Gly Asn Phe Phe Arg Gly Lys Lys Val Ile Val
    130                 135                 140
Tyr Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ile Glu Asp Ala Ile Tyr Leu His Asp
145                 150                 155                 160
Ile Gly Cys Glu Val Thr Ile Val Ser Arg Thr Pro Ser Phe Arg Ala
                165                 170                 175
Glu Lys Ala Leu Val Glu Glu Val Glu Lys Arg Gly Ile Pro Val His
            180                 185                 190
Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Lys Ile Ile Gly Ser Gly Lys Val Glu Lys
        195                 200                 205
Val Val Ala Tyr Asn Arg Glu Lys Lys Glu Glu Phe Glu Ile Glu Ala
    210                 215                 220
Asp Gly Ile Phe Val Ala Ile Gly Met Arg Pro Ala Thr Asp Val Val
225                 230                 235                 240
Ala Glu Leu Gly Val Glu Arg Asp Ser Met Gly Tyr Ile Lys Val Asp
                245                 250                 255
Lys Glu Gln Arg Thr Asn Val Glu Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Cys
            260                 265                 270
Cys Asp Asn Pro Leu Lys Gln Val Val Thr Ala Cys Gly Asp Gly Ala
        275                 280                 285
Val Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Lys Tyr Leu Thr Ser
    290                 295                 300
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD109)
<400>8
ggatccacca tggccgccga ggag                                        24
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD110)
<400>9
gagctcttag gcagaagcag atg                                         23
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD102)
<400>10
ggatccacca tggcggcgtc gg                                          22
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD103)
<400>11
gagctcttac tgggccgcgt gt                                          22
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD124A)
<400>12
gagctcttag gcgctagcag atg                                         23
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD125A)
<400>13
ggatccacca gcgctgccga                                             20
<210>14
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD126)
<400>14
gatccaccat gagggtgttg ctcgttgccc tcgctctcct ggctctcgct gcgagcgcca 60
ccagc                                                             65
<210>15
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD127)
<400>15
gctggtggcg ctcgcagcga gagccaggag agcgagggca acgagcaaca ccctcatggt 60
g                                                                 61
<210>16
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD128)
<400>16
ctagcgctct gcagcagccg actccatgcc cctacgctgc tgccggcggt gtcccccact 60
gagagct                                                           67
<210>17
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物NMD129)
<400>17
ctcagtgggg gacaccgccg gcagcagcgt aggggcatgg agtcggctgc tgcagagcg 59
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物STRF1A)
<400>18
ggatccacca tgaacggcct ggag                                       24
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物STRF1B)
<400>19
ctcgagaagt ccaccttggt cac                                         23
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物STRF2A)
<400>20
ctcgagcaag ccgttcaa                                               18
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物STRF2B)
<400>21
gacgtcgatc ttcgggttgg a                                           21
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物STR3A)
<400>22
cgacgtcatc tggaactcct                                             20
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物STR3B)
<400>23
gagctcagat ctagtcggac ttg                                         23
<210>24
<211>1021
<212>DNA
<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)
<400>24
ggatccacca tgaacggcct ggagactcac aacacccgcc tctgcatcgt tggctccggc 60
ccggctgccc acaccgccgc catctacgcc gcccgcgccg agctgaagcc gctcctcttc 120
gagggctgga tggccaacga catcgccccg ggcggccagc tcaccaccac caccgacgtg 180
gagaacttcc ccggcttccc ggagggcatc ctcggcgtgg agctgaccga caagttccgc 240
aagcagagcg agcgcttcgg caccaccatc ttcaccgaga ccgtgaccaa ggtggacttc 300
tcgagcaagc cgttcaagct cttcaccgac tccaaggcca tcctcgccga cgccgtgatc 360
ctcgccatcg gcgccgtggc caagtggctc tccttcgtgg gctccggcga ggtgctcggc 420
ggcctctgga accgcggcat ctccgcctgc gctgtgtgcg acggcgccgc cccgatcttc 480
cgcaacaagc cgctcgctgt gatcggtggc ggagacagcg cgatggagga ggccaacttc 540
ctcaccaagt acggctccaa ggtgtacatc atcgaccgcc gcgacgcctt ccgcgcctcc 600
aagatcatgc agcagcgcgc cctctccaac ccgaagatcg acgtcatctg gaactcctcc 660
gtggtggagg cctacggcga cggcgagcgc gacgtgctcg gcggcctcaa ggtgaagaac 720
gtggtgaccg gcgacgtgtc cgacctcaag gtgtccggcc tcttcttcgc catcggccac 780
gagccggcca ccaagttcct cgacggcggc gtggagctgg actccgacgg ctacgtggtg 840
accaagccgg gcaccaccca gacctccgtg cctggcgtgt tcgccgccgg cgacgtgcag 900
gacaagaagt accgccaggc catcaccgcc gccggcaccg gctgcatggc cgccctcgac 960
gccgagcact acctccagga gatcggctcc cagcagggca agtccgacta gatctgagct 1020
c                                                                 1021
<210>25
<211>333
<212>PRT
<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)
<400>25
Met Asn Gly Leu Glu Thr His Asn Thr Arg Leu Cys Ile Val Gly Ser
  1               5                  10                  15
Gly Pro Ala Ala His Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala Glu Leu
         20                      25                  30
Lys Pro Leu Leu Phe Glu Gly Trp Met Ala Asn Asp Ile Ala Pro Gly
         35                  40                  45
Gly Gln Leu Thr Thr Thr Thr Asp Val Glu Asn Phe Pro Gly Phe Pro
     50                  55                  60
Glu Gly Ile Leu Gly Val Glu Leu Thr Asp Lys Phe Arg Lys Gln Ser
 65                  70                  75                  80
Glu Arg Phe Gly Thr Thr Ile Phe Thr Glu Thr Val Thr Lys Val Asp
                 85                  90                  95
Phe Ser Ser Lys Pro Phe Lys Leu Phe Thr Asp Ser Lys Ala Ile Leu
            100                 105                 110
Ala Asp Ala Val Ile Leu Ala Ile Gly Ala Val Ala Lys Trp Leu Ser
        115                 120                 125
Phe Val Gly Ser Gly Glu Val Leu Gly Gly Leu Trp Asn Arg Gly Ile
    130                 135                 140
Ser Ala Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Ala Pro Ile Phe Arg Asn Lys
145                 150                 155                 160
Pro Leu Ala Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ala Asn
                165                 170                 175
Phe Leu Thr Lys Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Ile Ile Asp Arg Arg Asp
            180                 185                 190
Ala Phe Arg Ala Ser Lys Ile Met Gln Gln Arg Ala Leu Ser Asn Pro
        195                 200                 205
Lys Ile Asp Val Ile Trp Asn Ser Ser Val Val Glu Ala Tyr Gly Asp
    210                 215                 220
Gly Glu Arg Asp Val Leu Gly Gly Leu Lys Val Lys Asn Val Val Thr
225                 230                 235                 240
Gly Asp Val Ser Asp Leu Lys Val Ser Gly Leu Phe Phe Ala Ile Gly
                245                 250                 255
His Glu Pro Ala Thr Lys Phe Leu Asp Gly Gly Val Glu Leu Asp Ser
            260                 265                 270
Asp Gly Tyr Val Val Thr Lys Pro Gly Thr Thr Gln Thr Ser Val Pro
        275                 280                 285
Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Val Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Gln Ala
    290                 295                 300
Ile Thr Ala Ala Gly Thr Gly Cys Met Ala Ala Leu Asp Ala Glu His
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Gln Glu Ile Gly Ser Gln Gln Gly Lys Ser Asp
                325                 330
<210>26
<211>1560
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>26
aytcagatat gttatccaga ttctaaatgt gctatagggg wtaaatgtgt gttcatatgg 60
gagatatatc agtttcagtt tttttggaag gtgtttatag gagttmggcg cgttttaaar 120
ktgtggtatg catcgtgttg tgarttgttk gtgtgttycy ttaaaaaaaa awttgccatt 180
tgtcaattat tgtggaattt ctgcaacttg ttgtccmaag kaaaaggaaa atagtttcgg 240
tcaacaactc aacatccatc tgggggtatg accgaccgag cgcggtggcc gttgattggc 300
tcgtcgcctc ctcccttctc ggtctgacgg tctgaccagt gccgggtagg aagcgtaatt 360
ttgaggagag actccgaccc gcgccgccgc cgccgcagcc aagccatgga gggatccgcc 420
ggggcgccgc tccgcacgcg cctgtgcatc atcgggagcg ggccgtcggc gcacacggcg 480
gcgatctacg ccgcccgcgc ggagctcaag cccgtgctct tcgagggctg gctcgccaac 540
gacatcgcgg cggggggcca gctcaccacc accaccgacg tcgagaactt cccggggttc 600
cccgagggga tcctcggcgg cgagctcatg gatcggtgcc gcgcccagtc cctccggttc 660
ggcaccagca tcatctccga gaccgtcacc gcggtcgact tctccgcccg ccccttccgc 720
gtcgcctccg actccaccac cgtgctcgcc gacgccgtcg tcgtcgccac cggcgccgtc 780
gcccggcgac tccacttcgc cggctccgac gcctactgga accgcggcat ctcagcctgc 840
gccgtctgcg acggggccgc cccaatcttc aggaacaaac ccatcgccgt catcggcggc 900
ggcgactccg ccatggagga gtccaacttc ctcaccaagt acggctccca tgtgtacatc 960
atccaccgcc gcaacacctt ccgcgcctcc aagatcatgc aggccagggc gttgtcaaac 1020
cccaagatcc aggttttctg ggactctgag gtcgtcgagg cctacggcgg cgagggtgga 1080
ggtccattgg ctggtgtcaa ggtgaagaac ttggttactg ggaagatctc cgaccttcag 1140
gtgtccggtc tcttcttcgc catcggacat gaaccggcga cgaagtttct cggcgggcag 1200
cttgagctcg atgctgatgg gtatgtggcc accaagccag gctccacgca caccagtgtg 1260
aagggggtct ttgctgctgg ggatgtgcag gacaagaagt atcgccaggc tattactgcc 1320
gctggatcag gtttgtgaat tgatgatttt tcaggttacc tgtgattaat ttttttctgc 1380
actttcttag agatcagtcg cttcatgggt tgctatttgc tagtgcgaat tgcaatagaa 1440
attgttcagg gcttgagtat gtagtgagcg aatgatgatg gtcaaaatta gaaccttttt 1500
aagctatcat agagttaacg tgtttgagtt tctgaaataa gtgctttcat tatgtatcta 1560
<210>27
<211>310
<212>PRT
<213>稻(Oryza satiya)
<400>27
Met Glu Gly Ser Ala Gly Ala Pro Leu Arg Thr Arg Leu Cys Ile Ile
  1               5                  10                  15
Gly Ser Gly Pro Ser Ala His Thr Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Ala
             20                  25                  30
Glu Leu Lys Pro Val Leu Phe Glu Gly Trp Leu Ala Asn Asp Ile Ala
         35                  40                  45
Ala Gly Gly Gln Leu Thr Thr Thr Thr Asp Val Glu Asn Phe Pro Gly
     50                  55                  60
Phe Pro Glu Gly Ile Leu Gly Gly Glu Leu Met Asp Arg Cys Arg Ala
 65                  70                  75                  80
Gln Ser Leu Arg Phe Gly Thr Ser Ile Ile Ser Glu Thr Val Thr Ala
                 85                  90                  95
Val Asp Phe Ser Ala Arg Pro Phe Arg Val Ala Ser Asp Ser Thr Thr
            100                 105                 110
Val Leu Ala Asp Ala Val Val Val Ala Thr Gly Ala Val Ala Arg Arg
        115                 120                 125
Leu His Phe Ala Gly Ser Asp Ala Tyr Trp Asn Arg Gly Ile Ser Ala
    130                 135                 140
Cys Ala Val Cys Asp Gly Ala Ala Pro Ile Phe Arg Asn Lys Pro Ile
145                 150                 155                 160
Ala Val Ile Gly Gly Gly Asp Ser Ala Met Glu Glu Ser Asn Phe Leu
                165                 170                 175
Thr Lys Tyr Gly Ser His Val Tyr Ile Ile His Arg Arg Asn Thr Phe
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Lys Ile Met Gln Ala Arg Ala Leu Ser Asn Pro Lys Ile
        195                 200                 205
Gln Val Phe Trp Asp Ser Glu Val Val Glu Ala Tyr Gly Gly Glu Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Pro Leu Ala Gly Val Lys Val Lys Asn Leu Val Thr Gly Lys
225                 230                 235                 240
Ile Ser Asp Leu Gln Val Ser Gly Leu Phe Phe Ala Ile Gly His Glu
                245                 250                 255
Pro Ala Thr Lys Phe Leu Gly Gly Gln Leu Glu Leu Asp Ala Asp Gly
            260                 265                 270
Tyr Val Ala Thr Lys Pro Gly Ser Thr His Thr Ser Val Lys Gly Val
        275                 280                 285
Phe Ala Ala Gly Asp Val Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Gln Ala Ile Thr
    290                 295                 300
Ala Ala Gly Ser Gly Leu
305                 310
<210>28
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P9)
<400>28
gactaagctt acaattatta tatcaaaatg gc                                 32
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P10)
<400>29
gcttttccca atacgcaatg c                                             21
<210>30
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P4)
<400>30
gactagcgct gacagaaact gatgctagga a                                  31
<210>31
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P1)
<400>31
cgtaggatcc accatggctg aagaagaggg tcaggttgtc                         40
<210>32
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P2)
<400>32
cgtagagctc tcaagaagaa gcagcagcag cagat                              35
<210>33
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P5)
<400>33
gactagcgct gaagagggtc aggttgtcg                                     29
<210>34
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P12)
<400>34
cagtaggctt aaggaggttg caacgag                                       27
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P11)
<400>35
cagtcagctg aagagggtca ggttgtc                                       27
<210>36
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(oligo P27)
<400>36
ctaggagctc tacatggtgt ccaccagcag                                    30
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物P28)
<400>37
gcacggcttg gtggtgaatc c                                             21
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物P29)
<400>38
ctcattctgg tccatcaatg tc                                            22
<210>39
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物P26)
<400>39
gactgtcgac tcaatcactc ttaccttgct gag                                33
<210>40
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物P31)
<400>40
 gactggatcc aatggtctcg aaactcacaa c                                 31
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物thiorodoxubi 1603)
<400>41
gcggtcgttc attcgttcta                                               20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸(引物thiorodox 2364)
<400>42
acgtgcttca cgatggtgtt                                               20

Claims (19)

1.在研磨加工法中分离谷物淀粉和蛋白质组分的方法，包括：
(a)在高温下，在添加的硫氧还蛋白还原酶存在的情况下，浸泡谷物；和
(b)分离谷物中的淀粉和蛋白质组分，其中硫氧还蛋白还原酶为真核硫氧还蛋白还原酶。
2.权利要求1的方法，其中谷物包括从表达硫氧还蛋白还原酶的转基因植物而来的谷物。
3.权利要求2的方法，其中植物是玉米。
4.含有编码真核硫氧还蛋白还原酶的异源DNA的转基因植物，其中该异源DNA稳定地整合入上述转基因植物的核或质体基因组。
5.权利要求4的植物，其中该植物是玉米或大豆。
6.权利要求4的植物，其中硫氧还蛋白还原酶包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27。
7.含有真核硫氧还蛋白还原酶的编码区的嵌合表达盒，其中上述编码区与能在植物中行使功能的启动子和终止序列有效连接。
8.权利要求7的嵌合表达盒，其中硫氧还蛋白还原酶包含SEQID NO：25或SEQ ID NO：27。
9.一种生产能表达增加的真核硫氧还蛋白还原酶表达量的谷物的方法，包括用权利要求7的表达盒转化植物。
10.一种生产能表达增加的真核硫氧还蛋白还原酶表达量的谷物的方法，包括用权利要求8的表达盒转化植物。
11.一种生产能表达增加的硫氧还蛋白还原酶表达量的谷物的方法，包括：用含有异源表达盒的第二种植物的花粉给含有异源表达盒的第一种植物授粉，并从如此授粉的植物中回收谷物，其中第一种植物含有的异源表达盒包含有效连接于编码真核硫氧还蛋白还原酶的DNA序列上的反式激活蛋白介导的启动子，第二种植物含有的异源表达盒包含有效连接于编码反式激活蛋白的DNA序列上的启动子，该反式激活蛋白能调控上述反式激活蛋白介导的启动子。
12.一种包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26的分离的核酸分子。
13.一种包含在植物中具有活性的启动子的嵌合基因，并且该启动子有效连接于权利要求12的核酸分子上。
14.含有权利要求13的嵌合基因的重组载体。
15.含有权利要求13的嵌合基因的转基因宿主细胞。
16.根据权利要求15的转基因宿主细胞，其为转基因植物细胞。
17.含有权利要求16的转基因植物细胞的转基因植物。
18.权利要求17的转基因植物，其为玉米或大豆。
19.根据权利要求17的转基因植物的种子，含有权利要求13中的嵌合基因。
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