CN105339380A - 用以防治昆虫害虫的组合物和方法 - Google Patents

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N.里奇特曼
S.迪伊恩
M.范阿伦
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Abstract

本发明提供了采用沉默元件的方法和组合物，所述沉默元件在被害虫诸如鞘翅目植物害虫或叶甲属(Diabrotica)植物害虫摄取时能降低靶序列在所述害虫中的表达。本发明提供如下任何一者示出的各种靶多核苷酸：本文所公开的SEQ？ID？NO：(但不包括正向和反向引物)或它们的活性变体和片段、或它们的互补序列，其中所述序列中的一者或多者在所述靶害虫中的表达的降低能防治所述害虫(即，具有杀昆虫活性)。本发明还提供了包含本发明的所述沉默元件或它们的活性变体或片段的植物、植物部分、细菌和其他宿主细胞。

Description

用以防治昆虫害虫的组合物和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求提交于2013年3月14日的美国临时申请No.61/785,680和提交于2013年3月14日的美国实用申请No.13/831,230的权益，所述两份专利申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明整体涉及用以防治害虫的分子生物学和基因沉默的方法。
对通过EFS-WEB作为文本文件提交的
序列表的引用
据此依照37C.F.R.§1.52(e)(5)将提交于2014年3月14日的序列表作为创建于2014年3月14日的697,429字节大小的名称为“36446_0007P1_ST25.txt”的文本文件以引用方式并入。
背景技术
昆虫害虫是农业中的严重问题。它们破坏数百万英亩的主要作物，诸如玉米、大豆、豌豆和棉花。单在美国，这些害虫每年造成的作物损害就超过1000亿美元。在与这些害虫进行的季节性斗争中，农场主们必须施用数十亿加仑的合成杀虫剂来抗击这些害虫。过去采用的其他方法通过微生物或在转基因植物中表达来源于微生物的基因来提供杀昆虫活性。例如，已知芽孢杆菌(Bacillus)属微生物的某些物种对于广泛范围的昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫害虫包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等等。事实上，微生物杀虫剂特别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。农业科学家通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀昆虫蛋白，开发出了抗昆虫性增强的作物。例如，经遗传工程改造而产生Cry毒素的玉米和棉花植物(参见例如Aronson(2002)CellMol.LifeSci.59(3)：417-425(Aronson，2002年，《细胞与分子生命科学》，第59卷，第3期，第417-425页)；Schnepfetal.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(3)：775-806(Schnepf等人，1998年，《微生物学与分子生物学综述》，第62卷，第3期，第775-806页))目前在美国农业中广泛应用，给农场主提供了传统昆虫防治方法的替代方案。然而，这些Bt杀昆虫蛋白仅保护植物免受相对较窄范围的害虫的影响。此外，这些杀昆虫活性模式提供了不同的特异性水平，并且在一些情况下，造成了重大环境影响。因此，迫切需要替代方法用以防治害虫。
发明内容
提供了采用沉默元件的方法和组合物，所述沉默元件在被害虫诸如鞘翅目植物害虫(包括叶甲属(Diabrotica)植物害虫)摄取时能够降低靶序列在害虫中的表达。在特定实施例中，靶序列表达的降低能防治害虫，从而所述方法和组合物能够限制对植物的损害。本发明提供如下示出的各种靶多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体或片段、或它们的互补序列，其中所述序列中的一者或多者在靶害虫中的表达的降低能防治害虫(即，具有杀昆虫活性)。还提供了沉默元件，所述沉默元件在被害虫摄取时降低靶多核苷酸中的一者或多者的表达水平。还提供了包含沉默元件或它们的活性变体或片段的植物、植物部分、植物细胞、细菌和其他宿主细胞。还提供了用于局部施用到害虫昆虫或可能存在害虫昆虫的基质上的可喷雾沉默剂的配方。
在另一个实施例中，提供了用于防治害虫诸如鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫的方法。所述方法包括给害虫喂食包含沉默元件的组合物，其中所述沉默元件在被害虫摄取时能降低靶序列在害虫中的水平，从而防治害虫。还提供了用以保护植物免受害虫的影响的方法。此类方法包括将本发明的沉默元件引入到植物或植物部分中。当表达所述沉默元件的植物被害虫摄取时，靶序列的水平降低，使害虫得以防治。
附图说明
图1是表格，即表1A和表1B，其使用由体外转录(IVT)产生的dsRNA在饵料测定法中识别出了RNAi活性靶标。
图2是表格，即表2，其示出了RNAi活性片段的设计和识别。
图3是表格，即表3，其列出了来自靶害虫、蔓延害虫和非靶昆虫的RNAi活性靶标。通过西方玉米根虫(WCRW，Diabroticavirgifera)、北方玉米根虫(NCRW，Diabroticabarberi)、南方玉米根虫(SCRW，Diabroticaundecimpunctata)、墨西哥豆瓢虫(MBB，Epilachnavarivestis)、科罗拉多马铃薯甲虫(CPB，Leptinotarsadecemlineata)、狡诈花蝽(Orius，Oriusinsidiosus)和褐斑瓢虫(CMAC，Coleomegillamaculate)的转录组分析来识别所选RNAi活性片段的同源序列。
图4是图形，示出了WCRWRyanr(SEQIDNO：730)和果蝇属Ssk(SEQIDNO：731)的氨基酸序列的序列比对。
图5是用于基因与构建体优化实验的PAT3片段的示意图。
图6是示意图，示出了具有代表性的所公开的构建体的转基因区PHP58050(SEQIDNO：729)。
图7是表格，即表4，其示出了包含本发明代表性构建体的玉蜀黍植物对于玉米根虫的代表性杀昆虫活性。在研究中用于转化玉蜀黍植物的代表性构建体如表中所示和所述。
图8示出了用于含图7中所述的构建体的玉蜀黍的代表性玉米根虫结节损伤评分(“CRWNIS”)数据。
具体实施方式
下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施例，而非全部实施例。确实，这些发明可以以许多不同的形式来体现，不应被认为局限于本文给出的实施例；而是，提供这些实施例是为了使本公开内容能满足适用的法律要求。同样的编号在全文中是指同样的要素。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本文所述的发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
I.概述
通常，RNAi发现方法依赖于已知类别的敏感基因(转录因子、管家基因等)的评价。相比之下，本文所示的靶多核苷酸的识别仅仅基于从新孵和/或3龄中肠西方玉米根虫的cDNA文库高通量筛选所有单一序列(singleton)和所有基因簇的代表。该筛选允许发现许多新型序列，这些序列中的许多具有与已知序列极低的同源性或无同源性。该方法提供了对分类群中通常高度保守的基因无内在偏倚的优点。因此，识别出了用于RNAi的许多新型靶标以及先前未显示对RNAi敏感的已知基因。
同样，提供了采用一个或多个沉默元件的方法和组合物，所述一个或多个沉默元件在被害虫诸如鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫摄取时能够降低靶序列在害虫中的表达。在特定实施例中，靶序列表达的降低能防治害虫，从而所述方法和组合物能够限制对植物或植物部分的损害。本发明提供如下示出的靶多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。提供了这些靶多核苷酸的包含沉默元件的序列、互补序列、活性片段或变体，它们在被害虫摄取或与害虫接触时能降低所述靶序列中的一者或多者的表达，从而防治害虫(即，具有杀昆虫活性)。
如本文所用，所谓“防治害虫”或“能控制害虫”意指使害虫造成的损害受到限制的对害虫的任何影响。防治害虫包括但不限于以一定方式杀死害虫、抑制害虫发育、改变害虫繁殖力或生长，使得害虫对植物造成的损害减轻，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的害虫，产生易受捕食者攻击的害虫，或阻止害虫啃食植物。
降低害虫中的靶多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平使得入侵害虫被抑制、控制和/或杀死。降低害虫靶序列的表达水平将使害虫损害减少至少约2％至至少约6％、至少约5％至约50％、至少约10％至约60％、至少约30％至约70％、至少约40％至约80％、或至少约50％至约90％或更多。因此，本发明的方法可用于防治害虫，特别是鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫。
测量害虫的防治的测定法通常是本领域已知的，用以记录结节损伤评分的方法也是本领域已知的。参见例如Olesonetal.(2005)J.Econ.Entomol.98：1-8(Oleson等人，2005年，《经济昆虫学杂志》，第98卷，第1-8页)。参见例如以下实例。
本发明涉及用于保护植物免受植物害虫诸如鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫的影响或者在植物中诱导对植物害虫诸如鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫的抗性的组合物和方法。如本文所用，“鞘翅目植物害虫”用来指鞘翅目的任何成员。可通过本发明的方法和组合物靶向的其他植物害虫包括但不限于墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis)和科罗拉多马铃薯甲虫(Leptmotarsadecemlineata)。
如本文所用，术语“叶甲属植物害虫”用来指叶甲属的任何成员。因此，所述组合物和方法也可用于保护植物免受任何叶甲属植物害虫的影响，所述叶甲属植物害虫包括例如，Diabroticaadelpha；阿梅卡梅卡叶甲(Diabroticaamecameca)；黄瓜条叶甲(Diabroticabalteata)；北方玉米根虫(Diabroticabarberi)；双环叶甲(Diabroticabiannularis)；冠突叶甲(Diabroticacristata)；十星叶甲(Diabroticadecempunctata)；异色叶甲(Diabroticadissimilis)；纽带叶甲(Diabroticalemniscata)；小拟叶甲(Diabroticalimitata)(包括例如十五星小拟叶甲(Diabroticalimitataquindecimpuncata))；长角叶甲(Diabroticalongicornis)；钱币状叶甲(Diabroticanummularis)；中空叶甲(Diabroticaporracea)；棘角叶甲(Diabroticascutellata)；六斑叶甲(Diabroticasexmaculata)；南美叶甲(Diabroticaspeciosa)(包括例如Diabroticaspeciosaspeciosa)；胫叶甲(Diabroticatibialis)；十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata)(包括例如南方玉米根虫(Diabroticaundecimpunctata)、Diabroticaundecimpunctataduodecimnotata；Diabroticaundecimpunctatahowardi(黄瓜十一星叶甲)；Diabroticaundecimpunctataundecimpunctata(西方黄瓜十一星叶甲))；玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera)(包括例如Diabroticavirgiferavirgifera(西方玉米根虫)和Diabroticavirgiferazeae(墨西哥玉米根虫))；绿叶甲(Diabroticaviridula)；Diabroticawartensis；叶甲属物种JJG335；叶甲属物种JJG336；叶甲属物种JJG341；叶甲属物种JJG356；叶甲属物种JJG362；以及叶甲属物种JJG365。
在特定实施例中，叶甲属植物害虫包括西方玉米根虫(D.virgiferavirgifera)、北方玉米根虫(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)、南美叶甲(D.speciosa)或黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctatahowardi)。
II.靶序列
如本文所用，“靶序列”或“靶多核苷酸”包括害虫中的希望降低其表达水平的任何序列。在特定实施例中，降低靶序列在害虫中的水平能防治害虫。例如，靶序列可以是生长和发育所必需的。虽然可在害虫的任何组织中表达靶序列，但在特定实施例中，在害虫中靶向抑制的序列在害虫的肠组织细胞、害虫的中肠细胞和被覆于肠腔或中肠的细胞中表达。此类靶序列可参与例如肠细胞代谢、生长或分化。本发明的靶序列的非限制性例子包括如下示出的多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。如本文其他地方所示例，降低这些靶序列中的一者或多者在鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫中的表达水平能防治害虫。
III.沉默元件
所谓“沉默元件”意指在其被害虫接触或摄取时能够降低或消除靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平或表达的多核苷酸。所采用的沉默元件能够通过影响靶RNA转录物的水平或者通过影响翻译并从而影响所编码多肽的水平来降低或消除靶序列的表达水平。测定能够降低或消除所关注序列水平的功能性沉默元件的方法在本文其他地方有所公开。本发明方法中所采用的单个多核苷酸可包含针对相同或不同靶多核苷酸的一个或多个沉默元件。沉默元件可体内(即，宿主细胞诸如植物或微生物中)或体外生成。
在特定实施例中，沉默元件可包含具有本发明的两个或更多个序列的嵌合构建体分子。例如，该嵌合构建体可为如本文所公开的发夹或dsRNA。嵌合体可包含本发明的两个或更多个序列。在一个实施例中，设想出嵌合体具有本文所示的两个互补序列，所述互补序列之间具有一定程度的错配，使得这两个序列彼此并非完全互补。在单个沉默元件中提供至少两个不同序列可允许使用一个沉默元件和/或例如一个表达盒靶向多个基因。靶向多个基因可允许减慢或减少害虫抗性的可能性，并且在一个所表达的分子中提供多重靶向能力可减轻经转化的植物或植物产物的表达负担，或提供能够在一次施用的情况下靶向多个宿主的局部处理。
在特定实施例中，靶序列不是植物内源的。在其他实施例中，虽然沉默元件能防治害虫，但优选地沉默元件对正常植物或植物部分无作用。
如下文更详细讨论，沉默元件可以包括但不限于有义抑制元件、反义抑制元件、双链RNA、siRNA、amiRNA、miRNA或发夹抑制元件。本发明的沉默元件可包含嵌合体，其中本发明的两个或更多个序列或它们的活性片段或变体或互补序列存在于相同RNA分子中。此外，本发明的序列或它们的活性片段或变体或互补序列可作为DNA构建体、沉默元件、DNA分子或RNA分子中的不止一个拷贝存在。在发夹或dsRNA分子中，有义或反义序列在分子中的位置(例如，其中序列首先转录或位于RNA分子的具体末端上)并不对本发明进行限制，并且本发明不受这种序列的具体位置的本文公开内容限制。可用于降低这些靶鞘翅目植物害虫序列或叶甲属植物害虫序列的表达的沉默元件的非限制性例子包括如下示出的序列的有义或反义序列的片段和变体或者由所述有义或反义序列组成：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。沉默元件还可包含有利地影响转录和/或所得转录物的稳定性的另外序列。例如，沉默元件在3′端可包含至少一个胸腺嘧啶残基。这可有助于稳定。因此，沉默元件在3′端可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个胸腺嘧啶残基。如下文更详细讨论的，增强抑制元件也可与本文所公开的沉默元件结合使用。
所谓“减少”或“降低”多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平，意指靶序列的多核苷酸或多肽水平统计上低于不暴露于(即，未摄取或接触)沉默元件的合适对照害虫中的相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在本发明的特定实施例中，根据本发明降低害虫中靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致其与合适对照害虫中相同靶序列的多核苷酸水平或者由其编码的多肽的水平相比，小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。测定RNA转录物的水平、编码的多肽的水平或多核苷酸或多肽的活性的方法在本文的其他地方讨论。
i.有义抑制元件
如本文所用，“有义抑制元件”包含设计用于表达与“有义”取向的靶信使RNA的至少一部分相对应的RNA分子的多核苷酸。包含有义抑制元件的RNA分子的表达降低或消除靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平。包含有义抑制元件的多核苷酸可以对应靶多核苷酸序列的全部或一部分、靶多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的全部或一部分、靶多核苷酸的编码序列的全部或一部分或靶多核苷酸的编码序列和非翻译区二者的全部或一部分。
通常，有义抑制元件具有与靶多核苷酸实质的序列同一性，通常大于约65％的序列同一性，大于约85％的序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。参见美国专利No.5,283,184和No.5,034,323；将这些专利以引用方式并入本文。有义抑制元件可以是任何长度的，只要其允许抑制靶序列就可以。有义抑制元件可以为例如如下任何一者所示出的靶多核苷酸的15、16、17、18、19、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、900、1000、1100、1200、1300个核苷酸或更长：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。在其他实施例中，有义抑制元件可以为例如如下任何一者所示出的靶多核苷酸的约15-25、19-35、19-50、25-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800个核苷酸或更长：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。
ii.反义抑制元件
如本文所用，“反义抑制元件”包含设计用于表达与靶信使RNA的全部或一部分互补的RNA分子的多核苷酸。反义RNA抑制元件的表达降低或消除靶多核苷酸的水平。用于反义抑制的多核苷酸可以对应于编码靶多核苷酸的序列的互补序列的全部或一部分、靶多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或一部分、靶多核苷酸的编码序列的互补序列的全部或一部分或者靶多核苷酸的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或一部分。此外，反义抑制元件可与靶多核苷酸完全互补(即与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列的同一性低于100％)。在特定实施例中，反义抑制元件与靶多核苷酸具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补。反义抑制可用来抑制同一植物中的多种蛋白的表达。参见例如美国专利No.5,942,657。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸的一部分互补。一般来讲，可使用如下任何一者所示出的序列的15、16、17、18、19、20、22、25、50、100、200、300、400、450个核苷酸或更多：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如以下文献和专利中描述：Liuetal(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和5,942,657，将每个文献和专利以引用方式并入本文。
iii.双链RNA抑制元件
“双链RNA沉默元件”或“dsRNA”包含至少一种能够在被害虫摄取之前或之后形成dsRNA的转录物。因此，“dsRNA沉默元件”包括dsRNA、能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸或者不止一种能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸。“双链RNA”或“dsRNA”是指由单个自互补的RNA分子形成的多核糖核苷酸结构或由至少两个不同的RNA链的表达形成的多核糖核苷酸结构。本发明方法和组合物中使用的dsRNA分子(例如)通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来介导靶序列表达的降低。在本发明的上下文中，该dsRNA能够降低或消除害虫中靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平或表达。
该dsRNA可以通过影响靶RNA转录物的水平、通过影响翻译并从而影响编码的多肽的水平或通过影响转录前水平的表达(即，通过染色质结构调节、甲基化模式等改变基因表达)来降低或消除靶序列的表达水平。参见例如Verdeletal.(2004)Science303：672-676(Verdel等人，2004年，《科学》，第303卷，第672-676页)；Pal-Bhadraetal.(2004)Science303：669-672(Pal-Bhadra等人，2004年，《科学》，第303卷，第669-672页)；Allshire(2002)Science297：1818-1819(Allshire，2002年，《科学》，第297卷，第1818-1819页)；Volpeetal.(2002)Science297：1833-1837(Volpe等人，2002年，《科学》，第297卷，第1833-1837页)；Jenuwein(2002)Science297：2215-2218(Jenuwein，2002年，《科学》，第297卷，第2215-2218页)；以及Halletal.(2002)Science297：2232-2237(Hall等人，2002年，《科学》，第297卷，第2232-2237页)测定能够降低或消除所关注序列水平的功能性dsRNA的方法在本文其他地方有所公开。因此，如本文所用，术语“dsRNA”旨在涵盖用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括，例如，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、发夹RNA、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其他。
在具体的实施例中，该dsRNA的双链体或双链区域的至少一个链与靶多核苷酸共享足够的序列同一性或序列互补性，以允许dsRNA降低靶序列的表达水平。如本文所用，与靶多核苷酸互补的链为“反义链”，与靶多核苷酸同源的链为“有义链”。
在另一个实施例中，dsRNA包含发夹RNA。发夹RNA包含能够折回到自身上以形成双链结构的RNA分子。多种结构都可以用作发夹元件。在具体的实施例中，dsRNA抑制元件包含发夹元件，所述发夹元件依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中第一和第三片段共享足够的互补性，以允许转录的RNA形成双链茎环结构。
该发夹的“第二片段”包含“环”或“环区”。这些术语在本文中是同义词，并且广义地被解释为包含赋予足够柔韧性以允许多核苷酸的互补区域之间发生自配对(即，形成发夹茎的片段1和3)的任何核苷酸序列。例如，在一些实施例中，所述环区可以为基本上单链的并充当发夹茎环的自互补区域之间的间隔区。在一些实施例中，所述环区可以包含随机或无义核苷酸序列，因此与靶多核苷酸不共享序列同一性。在其他实施例中，所述环区包含与靶多核苷酸共享同一性的有义或反义RNA序列或其片段。参见，例如，以引用的方式并入本文的国际专利公布No.WO02/00904。在具体的实施例中，可以对所述环区进行优化，使其尽可能短，同时仍提供足够的分子内柔韧性，以允许形成碱基配对的茎区。因此，环序列通常小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、20、19、18、17、16、15、10个核苷酸或更小。
发夹RNA分子的“第一”和“第三”片段包含发夹结构的碱基配对的茎。第一和第三片段为彼此反向重复序列并共享足够的互补性，以允许形成碱基配对的茎区。在具体的实施例中，第一和第三片段彼此完全互补。或者，第一和第三片段可以彼此部分互补，只要它们能够彼此杂交形成碱基配对的茎区就可以。第一和第三片段之间的互补量可以计算为整个片段的百分比。因此，发夹RNA的第一和第三片段通常共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最高至并包括100％的互补性。
第一和第三片段为至少约1000、500、475、450、425、400、375、350、325、300、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、40、30、25、22、20、19、18、17、16、15或10个核苷酸长。在特定实施例中，第一和/或第三片段的长度为约10-100个核苷酸、约10至约75个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、约10至约25个核苷酸、约10至约19个核苷酸、约10至约20个核苷酸、约19至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约150个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、约150个核苷酸至约200个核苷酸、约200个核苷酸至约250个核苷酸、约250个核苷酸至约300个核苷酸、约300个核苷酸至约350个核苷酸、约350个核苷酸至约400个核苷酸、约400个核苷酸至约500个核苷酸、约600nt、约700nt、约800nt、约900nt、约1000nt、约1100nt、约1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、1600nt、1700nt、1800nt、1900nt、2000nt或更长。在其他实施例中，第一和/或第三片段的长度包含至少10-19个核苷酸、10-20个核苷酸；19-35个核苷酸、20-35个核苷酸；30-45个核苷酸；40-50个核苷酸；50-100个核苷酸；100-300个核苷酸；约500-700个核苷酸；约700-900核苷酸；约900-1100个核苷酸；约1300-1500个核苷酸；约1500-1700个核苷酸；约1700-1900个核苷酸；约1900-2100个核苷酸；约2100-2300个核苷酸；或约2300-2500个核苷酸。参见例如国际专利公布No.WO0200904。
本发明的发夹分子或双链RNA分子可具有存在于RNA分子相同部分中的本发明的不止一个序列或它们的活性片段或变体或互补序列。例如，在嵌合发夹结构中，发夹分子的第一片段包含两个多核苷酸部分，它们各自具有本发明的不同序列。例如，从发夹的一个末端开始读，第一片段由来自两个单独基因(A之后是B)的序列构成。该第一片段之后是第二片段，即发夹的环部分。环片段之后是第三片段，其中存在第一片段中的序列的互补链(B*之后是A*)从而形成发夹结构的茎环，茎包含茎远端的SeqA-A*以及邻近环区的SeqB-B*。
在特定实施例中，第一和第三片段包含与第一片段具有至少85％互补性的至少20个核苷酸。在另外其他实施例中，形成发夹的茎环结构的第一和第三片段包含具有未配对核苷酸残基的3′或5′突出区。
在特定实施例中，第一、第二和/或第三片段中使用的序列包含设计为与所关注的靶多核苷酸具有足够的序列同一性从而能够降低靶多核苷酸的表达水平的结构域。因此，抑制性RNA转录物的特异性通常由沉默元件的这些结构域赋予。因此，在本发明的一些实施例中，沉默元件的第一、第二和/或第三片段包含具有至少10、至少15、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000或1000以上的核苷酸的结构域，它与靶多核苷酸共享足够的序列同一性，以允许在合适的细胞中表达时降低靶多核苷酸的表达水平。在其他实施例中，结构域介于约15至50个核苷酸之间、约19-35个核苷酸、约20-35个核苷酸、约25-50个核苷酸、约19至75个核苷酸、约20至75个核苷酸、约40-90个核苷酸、约15-100个核苷酸、10-100个核苷酸、约10至约75个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、约10至约25个核苷酸、约10至约20个核苷酸、约10至约19个核苷酸、约50个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约150个核苷酸、约150个核苷酸至约200个核苷酸、约200个核苷酸至约250个核苷酸、约250个核苷酸至约300个核苷酸、约300个核苷酸至约350个核苷酸、约350个核苷酸至约400个核苷酸、约400个核苷酸至约500个核苷酸或更长。在其他实施例中，第一和/或第三片段的长度包含至少10-20个核苷酸、至少10-19个核苷酸、20-35个核苷酸、30-45个核苷酸、40-50个核苷酸、50-100个核苷酸、或约100-300个核苷酸。
在特定实施例中，第一、第二和/或第三片段的结构域与靶多核苷酸具有100％的序列同一性。在其他实施例中，与靶多肽具有同源性的第一、第二和/或第三片段的结构域与靶多核苷酸的区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。第一、第二和/或第三片段的结构域与靶多核苷酸的序列同一性只需足以降低所关注靶多核苷酸的表达即可。参见例如ChuangandMeyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijketal.(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；WaterhouseandHelliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然评论遗传学》，第4卷，第29-38页)；Pandolfinietal.BMCBiotechnology3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)，以及美国专利公布No.20030175965，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。用于测定hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中描述：Panstrugaetal.(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-140页)，所述文献以引用方式并入本文。
第一、第二和/或第三片段与靶多核苷酸间共享的互补量或第一片段与第三片段(即，发夹结构的茎)间共享的互补量可以根据要控制其中的基因表达的生物体而有所不同。一些生物体或细胞类型可能需要精确配对或100％同一性，而其他生物体或细胞类型可以容忍一些错配。在一些细胞中，例如，靶向序列中的单个核苷酸错配消除了抑制基因表达的能力。在这些细胞中，本发明的抑制盒可用于靶向突变基因的抑制，所述突变基因例如为癌基因，其转录物包含点突变并因此可使用本发明的方法和组合物特异性地靶向所述癌基因而不改变其余野生型等位基因的表达。在其他生物体中，可以容忍整体序列变异性，只要序列的某个22nt区域表现出靶多核苷酸与抑制盒之间的100％同源性即可。
可靶多核苷酸的任何区域均可用于设计共享足够序列同一性的沉默元件的结构域，以允许发夹转录物的表达，从而降低靶多核苷酸的水平。例如，可将该结构域设计为与靶多核苷酸的5′非翻译区、靶多核苷酸的3′非翻译区、靶多核苷酸的外显子区、靶多核苷酸的内含子区以及它们的任何组合共享序列同一性。在特定实施例中，沉默元件的结构域与来自靶序列的约核苷酸1-50、25-75、75-125、50-100、125-175、175-225、100-150、150-200、200-250、225-275、275-325、250-300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、475-525、450-500、525-575、575-625、550-600、625-675、675-725、600-650、625-675、675-725、650-700、725-825、825-875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-1000、1000-1050、1025-1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、1225-1275、1200-1300、1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-1500、1525-1575、1575-1625、1625-1675、1675-1725、1725-1775、1775-1825、1825-1875、1875-1925、1925-1975、1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000的至少约15、16、17、18、19、20、22、25或30个连续核苷酸共享足够的同源性。在某些情况下，为了优化发夹中使用的siRNA序列，可以用合成寡脱氧核糖核苷酸/RNAseH法确定靶mRNA上易经受RNA沉默的构象中的位点。参见例如Vickersetal.(2003)J.Biol.Chem278：7108-7118(Vickers等人，2003年，《生物化学杂志》，第278卷，第7108-7118页)和Yangetal.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：9442-9447(Yang等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第9442-9447页)，所述文献以引用方式并入本文。这些研究表明，RNase-H-敏感位点与促进有效的siRNA导向的mRNA降解的位点之间具有显著的相关性。
还可对发夹沉默元件进行设计，使得有义序列或反义序列不对应于靶多核苷酸。在这个实施例中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶多核苷酸的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO02/00904，以引用的方式将其并入本文。
另外，可以通过使用发夹抑制元件实现转录基因沉默(TGS)，其中发夹的反向重复序列与要沉默的靶多核苷酸的启动子区域共享序列同一性。参见例如Aufsatzetal.(2002)PNAS99(Suppl.4)：16499-16506(Aufsatz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷(增刊4)，第16499-16506页)和Metteetal.(2000)EMBOJ.19(19)：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第19期，第5194-5201页)。
在其他实施例中，沉默元件可包含小RNA(sRNA)。sRNA可包括微RNA(miRNA)和短干扰RNA(siRNA)两者(MeisterandTuschl(2004)Nature431：343-349(Meister和Tuschl，2004年，《自然》，第431卷，第343-349页)和Bonettaetal.(2004)NatureMethods1：79-86(Bonetta等人，2004年，《自然方法》，第1卷，第79-86页))。miRNA是具有约19至约24个核糖核苷酸长的调控因子，其能高效抑制靶多核苷酸的表达。参见例如Javieretal.(2003)Nature425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，所述文献以引用方式并入本文。对于miRNA干扰，可以将沉默元件设计为表达形成发夹结构或部分碱基配对结构的dsRNA分子，其包含与所关注靶多核苷酸互补的19、20、21、22、23、24或25-核苷酸序列。miRNA可以经合成产生或被转录为更长的RNA，所述更长的RNA随后裂解，以产生活性miRNA。具体地讲，miRNA可以包含与靶多核苷酸具有同源性的有义取向的19个核苷酸的序列，以及与有义序列互补的19个核苷酸的对应反义序列。miRNA可为“人工miRNA”或“amiRNA”，其包含用合成方法设计为使靶序列沉默的miRNA序列。
当表达miRNA时，最终(成熟)miRNA以双链体存在于前体骨架结构中，这两条链称为miRNA(将最终与靶标进行碱基配对的链)和miRNA*(星序列)。已证实，miRNA可进行转基因表达并且所关注的靶基因可被有效地沉默(HighlyspecificgenesilencingbyartificialmicroRNAsinArabidopsisSchwabR，OssowskiS，RiesterM，WarthmannN，WeigelD.PlantCell.2006May；18(5)：1121-33.Epub2006Mar10(拟南芥中人工微RNA引起的高特异性基因沉默，SchwabR、OssowskiS、RiesterM、WarthmannN、WeigelD，《植物细胞》，2006年5月，第18卷，第5期，第1121-1133页，电子版2006年3月10日)和ExpressionofartificialmicroRNAsintransgenicArabidopsisthalianaconfersvirusresistance.NiuQW，LinSS，ReyesJL，ChenKC，WuHW，YehSD，ChuaNH.NatBiotechnol.2006Nov；24(11)：1420-8.Epub2006Oct22.Erratumin：NatBiotechnol.2007Feb；25(2)：254(人工微RNA在转基因拟南芥中的表达赋予病毒抗性，NiuQW、LinSS、ReyesJL、ChenKC、WuHW、YehSD、ChuaNH，《自然生物技术》，2006年11月，第24卷，第11期，第1420-1428页，电子版2006年10月22日，勘误：《自然生物技术》，2007年2月，第25卷，第2期，第254页)。)
用于miRNA干扰的沉默元件包含miRNA一级序列。该miRNA一级序列包含DNA序列，所述DNA序列具有被环间隔开的miRNA和星序列，以及位于该区域旁侧的对于加工较重要的另外序列。当表达为RNA时，一级miRNA的结构使得允许形成发夹RNA结构，所述发夹RNA结构可被加工成成熟miRNA。在一些实施例中，miRNA骨架包含基因组或cDNAmiRNA前体序列，其中所述序列包含其中插入有异源(人工)成熟miRNA和星序列的天然一级结构。
如本文所用，“星序列”是miRNA前体骨架内的与miRNA互补并且与miRNA形成双链体进而形成发夹RNA的茎结构的序列。在一些实施例中，星序列可与miRNA序列具有小于100％互补性。或者，星序列可与miRNA序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或更低的序列互补性，只要星序列与miRNA序列具有足以形成双链结构的互补性即可。在另外的实施例中，星序列包含与miRNA序列具有1、2、3、4、5或更多个错配的序列并且仍然具有足够的互补性以与miRNA序列形成双链结构，从而生成miRNA并抑制靶序列。
miRNA前体骨架可来自任何植物。在一些实施例中，miRNA前体骨架来自单子叶植物。在其他实施例中，miRNA前体骨架来自双子叶植物。在另外的实施例中，骨架来自玉蜀黍或大豆。之前已描述了微RNA前体骨架。例如，US20090155910A1(WO2009/079532)公开了下列大豆miRNA前体骨架：156c、159、166b、168c、396b和398b，并且US20090155909A1(WO2009/079548)公开了下列玉蜀黍miRNA前体骨架：159c、164h、168a、169r和396h。这些参考文献每一个均以引用的方式全文并入本文。
因此，可改变一级miRNA以允许异源miRNA和星序列有效插入到miRNA前体骨架内。在此类情况下，使用PCR技术将miRNA前体骨架的miRNA片段和星片段替换为设计成靶向任何所关注序列的异源miRNA和异源星序列，并且克隆到表达构建体中。已经认识到，可以改变人工miRNA和星序列插入骨架中的位置。用于将miRNA和星序列插入miRNA前体骨架中的详细方法描述于例如美国专利申请20090155909A1和US20090155910A1中，所述专利申请全文以引用方式并入本文中。
当设计miRNA序列和星序列时，可作出各种设计选择。参见例如SchwabR，etal.(2005)DevCell8：517-27(SchwabR等人，2005年，《(发育细胞》，第8卷，第517-527页)。在非限制性实施例中，本文所公开的miRNA序列可具有5′端的“U”、第19个核苷酸位置的“C”或“G”以及第10个核苷酸位置的“A”或“U”。在其他实施例中，miRNA设计使得miRNA具有如ZipFold算法计算的高自由Δ-G(Markham，N.R.&Zuker，M.(2005)NucleicAcidsRes.33：W577-W581(Markham，N.R.和Zuker，M.，2005年，《核酸研究》，第33卷，第W577-W581页)。)任选地，在miRNA的5′部分内可加入一个碱基对变化，以使所述序列与靶序列相差一个核苷酸。
本发明的方法和组合物采用转录时“形成”dsRNA分子的沉默元件。因此，正在表达的异源多核苷酸不需要自己形成dsRNA，但可以与植物细胞中或摄取后的害虫肠中的其他序列相互作用，以允许形成dsRNA。例如，可以通过将包含miRNA或siRNA靶序列的嵌合构建体表达到与要沉默的一个或多个基因的全部或一部分相对应的序列中，生成能够选择性沉默靶多核苷酸的嵌合多核苷酸。在该实施例中，当miRNA或siRNA的靶与细胞中存在的miRNA相互作用时，“形成”dsRNA。然后所得的dsRNA可以降低要被沉默的一个或多个基因的表达水平。参见，例如，名称为“MethodsandCompositionsforGeneSilencing”(用于基因沉默的方法和组合物)的美国专利申请公布2007-0130653，该专利以引用的方式并入本文。可以将该构建体设计为具有内源性miRNA的靶，或者，可以在构建体中使用异源和/或合成miRNA的靶。如果使用异源和/或合成miRNA，可以将其引入与嵌合多核苷酸相同的核苷酸构建体上或单独的构建体上的细胞中。如本文别处所述，可以用任何方法引入包含异源miRNA的构建体。
IV.变体和片段
所谓“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可编码保留该天然蛋白的生物活性的蛋白质片段。或者，可用作沉默元件的多核苷酸片段不必编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段的范围可为至少约10、约15、约16、约17、约18、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约22个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸、600个核苷酸、700个核苷酸并最多至本发明中采用的全长多核苷酸。或者，核苷酸序列的片段的范围可为如下任何一者的1-50、25-75、75-125、50-100、125-175、175-225、100-150、100-300、150-200、200-250、225-275、275-325、250-300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、475-525、450-500、525-575、575-625、550-600、625-675、675-725、600-650、625-675、675-725、650-700、725-825、825-875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-1000、1000-1050、1025-1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、1225-1275、1200-1300、1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-1500、1525-1575、1575-1625、1625-1675、1675-1725、1725-1775、1775-1825、1825-1875、1875-1925、1925-1975、1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、70l、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。测定所需沉默元件的活性的方法在本文其他地方描述。
“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸当中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。可用作沉默元件的多核苷酸的变体将保留降低靶多核苷酸的表达并且在一些实施例中从而防治所关注的害虫的能力。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括那些这样的序列，其由于遗传密码的简并性而编码本发明所采用的多肽中的一者的氨基酸序列。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，诸如那些例如通过使用定点诱变产生但仍保留所需活性的多核苷酸。一般来讲，通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数测定，本发明的特定多核苷酸(即，沉默元件)的变体将具有与该特定多核苷酸至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
本发明的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽与该参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评价。任何两种多肽之间的序列同一性百分数可用本文别处描述的序列比对程序和参数来计算。在本发明所采用的任何给定的多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽所共享序列同一性百分数进行评估的情况中，两个被编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。
(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完全的cDNA或基因序列。
(b)如本文所用，“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续核苷酸，任选可为30、40、50、100个或者更长。本领域技术人员应当理解，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna.cmp打分矩阵，获得核苷酸序列的同一性百分数和相似性百分数；使用GAP权重8和长度权重2及BLOSUM62打分矩阵，获得氨基酸序列的同一性百分数和相似性百分数。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两条所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的对应的比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
(c)如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的情形中是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调序列同一性百分数以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城(MountainView，California)的Intelligenetics公司)中所执行那样进行计算。
(d)如本文所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比对两个序列。通过以下方式计算所述百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
还提供了用于从如下所示出的靶多核苷酸识别沉默元件的方法：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。此类方法包括获得如下任何一者的候选片段：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，所述候选片段具有足够长度以充当沉默元件并从而降低靶多核苷酸的表达和/或防治预期的害虫；在适当表达盒中表达所述候选多核苷酸片段以产生候选沉默元件，并且确定所述候选多核苷酸片段是否具有沉默元件的活性并从而降低靶多核苷酸的表达和/或防治预期的害虫。基于抑制所需的通路来识别此类候选片段的方法是已知的。例如，可采用各种生物信息学程序来识别可用来生成沉默元件的靶多核苷酸的区域。参见例如Elbahiretal.(2001)GenesandDevelopment15：188-200(Elbahir等人，2001年，《基因与发育》，第15卷，第188-200页)，Schwartzetal.(2003)Cell115：199-208(Schwartz等人，2003年，《细胞》，第115卷，第199-208页)，Khvorovaetal.(2003)Cell115：209-216(Khvorova等人，2003年，《细胞》，第115卷，第209-216页)。还可参见siRNAatWhitehead(jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)，该工具计算有义和反义siRNA的结合能。还可参见genscript.com/ssl-bin/app/rnai？op＝known；得自英杰公司(Invitrogen)的Block-iTTMRNAi设计软件和GenScriptsiRNA构建体生成器(GenScriptsiRNAConstructBuilder)。
V.DNA构建体
术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。本发明的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
编码沉默元件或在特定实施例中用于本发明方法和组合物中的多核苷酸可在表达盒中提供以便在所关注的植物或生物体中表达。已经认识到，可使用多个沉默元件，包括多个相同沉默元件、多个靶向靶序列不同区域的沉默元件、或多个来自不同靶序列的沉默元件。在该实施例中，已经认识到，每个沉默元件可包含于单个盒或单独盒、DNA构建体或载体中。如所讨论，设想了提供沉默元件的任何方式。可使用包含编码一个或多个沉默元件的DNA的单个盒转化植物或植物细胞，或者可使用包含每个沉默元件的单独盒来转化植物或植物细胞或宿主细胞。同样，经一种组分转化的植物可随后用第二组分进行转化。还可通过有性杂交将一个或多个沉默元件聚在一起。即，使包含一种组分的第一植物与包含第二组分的第二植物杂交。杂交所产生的子代植物将包含这两种组分。
表达盒可包括与本发明的多核苷酸有效连接的5′和3′调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的有效连接是可使本发明的多核苷酸得以表达的功能性连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。表达盒可另外含有至少一个要共转化到生物体中的额外多核苷酸。或者，可在多个表达盒上提供额外的多肽。表达盒可以设有多个限制性位点和/或重组位点，以使多核苷酸的插入处于调控区域的转录调控之下。表达盒可另外含有选择性标记基因。
表达盒在5′-3′转录方向可以包含转录和翻译起始区(即，启动子)、含本发明方法和组合物中使用的沉默元件的多核苷酸，以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。在其他实施例中，由抑制盒表达双链RNA。这种盒可包含驱动有效连接的沉默元件的转录的两个趋同启动子。“趋同启动子”是指在有效连接的沉默元件的任一端上取向，使得每个启动子以相反方向驱动沉默元件的转录，从而获得两个转录物的启动子。在此类实施例中，趋同启动子允许有义和反义链的转录，从而允许形成dsRNA。这种盒还可包含驱动一个或多个有效连接的沉默元件的转录的两个趋异启动子。“趋异启动子”是指彼此以相反方向取向，驱动一个或多个沉默元件以相反方向转录的启动子。在此类实施例中，趋异启动子允许有义和反义链的转录并允许形成dsRNA。在此类实施例中，趋异启动子还允许至少两个单独发夹RNA的转录。在另一个实施例中，构建体中存在一个盒，该盒包含受到两个单独启动子控制的处于相同取向的两个或更多个沉默元件。在另一个实施例中，构建体中存在处于相同取向的两个或更多个单独盒，它们各自包含受到启动子控制的至少一个沉默元件。
本发明中所用的调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是天然的/相似的。或者，本发明中所用的调控区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所用，指涉序列的“异源”，为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预从其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，有效连接到异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/类似的物种的话，一者或两者实质上从它们的原始形式和/或基因座修饰而得，或者该启动子不是该被有效连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用，嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。
终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于编码沉默元件的有效连接的多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自对于启动子、包含沉默元件的多核苷酸、植物宿主或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学)》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因与发育》，第5卷，第141-149页)；Mogenetal.(1990)PlantCell2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroeetal.(1990)Gene91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；以及Joshietal.(1987)NucleicAcidsRes.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。
已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列以及其他此类得到充分表征的可能有害于基因表达的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免可预见的发夹二级mRNA结构。
在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如，转换和颠换)。
多种启动子可用于本发明的实践中。编码沉默元件的多核苷酸可以与组成型、组织偏好的或其他启动子结合，以便在植物中的表达。
此类组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子以及WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心35SCaMV启动子(Odelletal.(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroyetal.(1990)PlantCell2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)，等等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149；No.5,608,144；No.5,604,121；No.5,569,597；No.5,466,785；No.5,399,680；No.5,268,463；No.5,608,142；和No.6,177,611。
还可采用诱导型启动子，例如病原体诱导型启动子。这种启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些，所述蛋白在病原体感染后诱导，例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等等。参见例如Redolfietal.(1983)Neth.J.PlantPathol.89：245-254(Redolfi等人，1983年，《荷兰植物病理学杂志》，第89卷，第245-254页)；Uknesetal.(1992)PlantCell4：645-656(Uknes等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第645-656页)以及VanLoon(1985)PlantMol.Virol.4：111-116(VanLoon，1985年，《植物分子病毒学》，第4卷，第111-116页)。还可参见WO99/43819，该专利以引用的方式并入本文。
另外，因为病原体可通过伤口或昆虫损伤进入植物中，可将伤口诱导型启动子用于本发明的构建体中。此类伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449(Ryan，1990年，《植物病理学年评》，第28卷，第425-449页)；Duanetal.(1996)NatureBiotechnology14：494-498(Duan等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第494-498页))；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2(Stanfordetal.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208(Stanford等人，1989年，《分子遗传学与基因组学》，第215卷，第200-208页))；系统素(McGurletal.(1992)Science225：1570-1573(McGurl等人，1992年，《科学》，第225卷，第1570-1573页))；WIP1(Rohmeieretal.(1993)PlantMol.Biol.22：783-792(Rohmeier等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第783-792页)；Eckelkampetal.(1993)FEBSLetters323：73-76(Eckelkamp等人，1993年，《欧洲生化学会联合会快报》，第323卷，第73-76页))；MPI基因(Corderoketal.(1994)PlantJ.6(2)：141-150(Corderok等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第2期，第141-150页))等等，这些文献以引用方式并入本文。
可将化学调控启动子用于通过施用外源化学调控剂来调节基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学阻遏型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作萌前(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他值得关注的化学调控启动子包括类固醇响应型启动子(参见例如，糖皮质类固醇诱导型启动子，载于Schenaetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；以及McNellisetal.(1998)PlantJ.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页))以及四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见例如Gatzetal.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第227卷，第229-237页)以及美国专利No.5,814,618和5,789,156)，这些文献以引用的方式并入本文。
组织偏好的启动子可用来使增强的表达定向于特定植物组织内。组织偏好的启动子包括Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamataetal.(1997)PlantCellPhysiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansenetal.(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学和基因组学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russelletal.(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehartetal.(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；VanCampetal.(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535(VanCamp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascinietal.(1996)PlantPhysiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞分化的结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozcoetal.(1993)PlantMolBiol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuokaetal.(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；以及Guevara-Garciaetal.(1993)PlantJ.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kwonetal.(1994)PlantPhysiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-367页)；Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Gotoretal.(1993)PlantJ.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-518页)；Orozcoetal.(1993)PlantMol.Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；以及Matsuokaetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)。
根偏好的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从多种相容物种从头分离。参见例如Hireetal.(1992)PlantMol.Biol.20(2)：207-218(Hire等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第2期，第207-218页)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；KellerandBaumgartner(1991)PlantCell3(10)：1051-1061(Keller和Baumgartner，1991年，《植物细胞》，第3卷，第10期，第1051-1061页)(法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件)；Sangeretal.(1990)PlantMol.Biol.14(3)：433-443(Sanger等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第3期，第433-443页)(根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miaoetal.(1991)PlantCell3(1)：11-22(Miao等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第1期，第11-22页)(编码胞液型谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该酶在大豆的根和根瘤中表达)。还可参见Boguszetal.(1990)PlantCell2(7)：633-641(Bogusz等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第7期，第633-641页)，其中描述了从来自固氮非豆科榆科山黄麻(Paraspomaandersonii)和相关的非固氮非豆科山黄麻(Trematomentosa)的血红蛋白基因分离的两种根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入进非豆科植物烟草(Nicottanatabacum)和豆科植物百脉根(Lotuscorniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见PlantScience(Limerick)79(1)：69-76(《植物科学》，Limerick，第79卷，第1期，第69-76页))。他们得出结论认为，增强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989年)使用与lacZ的基因融合显示，编码章鱼碱合酶的农杆菌(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，TR2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合(参见EMBOJ.8(2)：343-350(《欧洲分子生物学组织杂志》，第8卷，第2期，第343-350页))。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kusteretal.(1995)PlantMol.Biol.29(4)：759-772(Kuster等人，1995年，《植物分子生物学》，第29卷，第4期，第759-772页))；以及rolB启动子(Capanaetal.(1994)PlantMol.Biol.25(4)：681-691(Capana等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第4期，第681-691页)。还可参见美国专利No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,459,252、No.5,401,836、No.5,110,732和No.5,023,179。
在本发明的一个实施例中，植物表达的启动子是维管特异性启动子，诸如韧皮部特异性启动子。如本文所用，“维管特异性”启动子是至少在维管细胞中表达的启动子或优先在维管细胞中表达的启动子。维管特异性启动子的表达不必仅仅局限在维管细胞中，在其他细胞类型或组织中的表达是可能的。如本文所用，“韧皮部特异性启动子”是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子或优先在韧皮部细胞中表达的启动子。
韧皮部特异性启动子的表达不必仅仅局限在韧皮部细胞中，在其他细胞类型或组织例如木质部组织中的表达是可能的。在本发明的一个实施例中，韧皮部特异性启动子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达的启动子，其中与韧皮部细胞中的表达相比，非韧皮部细胞中的表达更受限制(或不存在)。根据本发明的合适维管特异性或韧皮部特异性启动子的例子包括但不限于选自如下的启动子：SCSV3、SCSV4、SCSV5和SCSV7启动子(Schunmannetal.(2003)PlantFunctionalBiology30：453-60(Schunmann等人，2003年，《植物功能生物学》，第30卷，第453-460页)；毛根农杆菌的rolC基因启动子(Kiyokawaetal.(1994)PlantPhysiology104：801-02(Kiyokawa等人，1994年，《植物生理学》，第104卷，第801-802页)；Pandolfinietal.(2003)BioMedCentral(BMC)Biotechnology3：7(Pandolfini等人，2003年，《生物医学中心(BMC)生物技术》，第3卷，第7页)，(WWW.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；Grahametal.(1997)PlantMol.Biol.33：729-35(Graham等人，1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第729-735页)；Guivarc′h等人(1996)；Almonetal.(1997)PlantPhysiol.115：1599-607(Almon等人，1997年，《植物生理学》，第115卷，第1599-1607页)；毛根农杆菌的rolA基因启动子(Dehioetal.(1993)PlantMol.Biol.23：1199-210(Dehio等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1199-1210页))；根瘤农杆菌T-DNA基因5的启动子(Korberetal.(1991)EMBOJ.10：3983-91(Korber等人，1991年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第10卷，第3983-3991页))；水稻蔗糖合成酶RSs1基因启动子(Shietal.(1994)J.Exp.Bot.45：623-31(Shi等人，1994年，《实验植物学杂志》，第45卷，第623-631页))；CoYMV或鸭跖草黄斑驳病毒启动子(Medberryetal.(1992)PlantCell4：185-92(Medberry等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第185-192页)；Zhouetal.(1998)Chin.J.Biotechnol.14：9-16(Zhou等人，1998年，《生物工程学报》，第14卷，第9-16页))；CFDV或椰子叶衰病毒启动子(Rohdeetal.(1994)PlantMol.Biol.27：623-28(Rohde等人，1994年，《植物分子生物学》，第27卷，第623-628页)；HehnandRhode(1998)J.Gen.Virol.79：1495-99(Hehn和Rhode，1998年，《普通病毒学杂志》，第79卷，第1495-1499页))；RTBV或水稻东格鲁杆状病毒启动子(YinandBeachy(1995)PlantJ.7：969-80(Yin和Beachy，1995年，《植物杂志》，第7卷，第969-980页)；Yinetal.(1997)PlantJ.12：1179-80(Yin等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第1179-1180页))；豌豆谷氨酰胺合成酶GS3A基因(Edwardsetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：3459-63(Edwards等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第3459-3463页)；Brearsetal.(1991)PlantJ.1：235-44(Brears等人，1991年，《植物杂志》，第1卷，第235-244页))；马铃薯转化酶基因的invCD111和invCD141启动子(Hedleyetal.(2000)J.Exp.Botany51：817-21(Hedley等人，2000年，《实验植物学杂志》，第51卷，第817-821页))；从拟南芥中分离的启动子，如下文献显示其在烟草中具有韧皮部特异性表达：Kertbunditetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5212-16(Kertbundit等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5212-5216页))；VAHOX1启动子区(Torneroetal.(1996)PlantJ.9：639-48(Tornero等人，1996年，《植物杂志》，第9卷，第639-648页))；豌豆细胞壁转化酶基因启动子(Zhangetal.(1996)PlantPhysiol.112：1111-17(Zhang等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第1111-1117页))；美国已公布的专利申请20030106097的与几丁质酶有关的内源性棉花蛋白的启动子；来自胡萝卜的酸转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenzetal.(1993)ThePlantJ.4：545-54(Ramloch-Lorenz等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第545-554页))；硫酸根转运蛋白基因Sultr1、3的启动子(Yoshimotoetal.(2003)PlantPhysiol.131：1511-17(Yoshimoto等人，2003年，《植物生理学》，第131卷，第1511-1517页))；蔗糖合成酶基因的启动子(NolteandKoch(1993)PlantPhysiol.101：899-905(Nolte和Koch，1993年，《植物生理学》，第101卷，第899-905页))；以及烟草蔗糖转运蛋白基因的启动子(Kuhnetal.(1997)Science275-1298-1300(Kuhn等人，1997年，《科学》，第275卷，第1298-1300页))。
可用的启动子还包括用于野黑樱苷水解酶的黑樱桃启动子(PHDL1.4PRO)(美国专利No.6,797,859)、来自黄瓜和水稻的硫氧还蛋白H启动子(FukudaAetal.(2005).PlantCellPhysiol.46(11)：1779-86)(FukudaA等人，2005年，《植物细胞生理学》，第46卷，第11期，第1779-1786页))，水稻(RSs1)(Shi，T.Wangetal.(1994).J.Exp.Bot.45(274)：623-631(Shi，T.Wang等人，1994年，《实验植物学杂志》，第45卷，第274期，第623-631页))以及玉蜀黍蔗糖合成酶-1启动子(Yang.，N-S.etal.(1990)PNAS87：4144-4148(Yang.，N-S.等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第4144-4148页))、来自南瓜的PP2启动子(Guo，H.etal.(2004)TransgenicResearch13：559-566(Guo，H.等人，2004年，《转基因研究》，第13卷，第559-566页))、AtSUC2启动子(Truernit，E.etal.(1995)Planta196(3)：564-70(Truernit，E.等人，1995年，《植物》，第196卷，第3期，第564-570页))、AtSAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(MijnsbruggeKV.etal.(1996)Planr.Cell.Physiol.37(8)：1108-1115(MijnsbruggeKV.等人，1996年，《植物细胞生理学》，第37卷，第8期，第1108-1115页))以及水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasietal.(1993)PlantJ.4(1)：71-79(Bhattacharyya-Pakrasi等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第1期，第71-79页))。
表达盒还可包含用于选择转化的细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Suetal.(2004)BiotechnolBioeng85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术与生物工程》，第85卷，第610-9页)和Fetteretal.(2004)PlantCell16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-28页))，青色荧光蛋白(CYP)(Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页))和Katoetal.(2002)PlantPhysiol129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-42页))和黄色荧光蛋白(得自Evrogen公司的PhiYFPTM，参见Bolteetal.(2004)J.CellScience117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-54页))。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton等人，1992年，《生物技术新观点》，第3卷，第506-511页)；Christophersonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yaoetal.(1992)Cell71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkleyetal.(1980)inTheOperon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Huetal.(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brownetal.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figgeetal.(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschleetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerstetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschleetal.(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(Gossen，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Reinesetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labowetal.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子与细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambrettietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baimetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborskjetal.(1991)NucleicAcidsRes.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子结构生物学主题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolbetal.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂与化学疗法》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidtetal.(1988)Biochemistry27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg(Bonin，1993年，德国海德尔堡大学博士论文)；Gossenetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Olivaetal.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂与化学疗法》，第36卷，第913-919页)；Hlavkaetal.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，施普林格出版社，柏林)；Gilletal.(1988)Nature334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容以引用的方式并入本文。以上选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因均可用于本发明。
VI.包含沉默元件的组合物
包含沉默元件的多核苷酸中的一者或多者可作为植物、植物部分、种子、害虫或耕作区的外部组合物诸如喷雾剂或粉末提供。又如，使用DNA构建体或表达盒转化植物以便表达至少一个沉默元件。在任一组合物中，沉默元件在被害虫摄取时可降低靶害虫序列的水平并从而防治害虫(即，鞘翅目植物害虫，包括叶甲属植物害虫，诸如西方玉米根虫(D.virgiferavirgifera)、北方玉米根虫(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)、南美叶甲(D.speciosa)或黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctatahowardi)。。已经认识到，所述组合物可包含细胞(诸如植物细胞或细菌细胞)，其中编码沉默元件的多核苷酸稳定掺入到其基因组中并有效连接到在细胞中有活性的启动子。还涵盖包含细胞混合物(表达至少一个沉默元件的一些细胞)的组合物。在其他实施例中，包含沉默元件的组合物不包含于细胞中。在此类实施例中，可将该组合物施用到害虫所栖息的区域。在一个实施例中，将该组合物外部地施用到植物(即，通过喷洒耕作田间或耕作区)以保护植物免受害虫影响。以这种方式施用核苷酸的方法是本领域技术人员已知的。
还可将本发明的组合物配制成诱饵。在该实施例中，所述组合物包含增强组合物对害虫的吸引力的食物或引诱剂。
包含沉默元件的组合物可在农业上合适的和/或环境可接受的载体中配制。此类载体可为待处理的动物、植物或环境可耐受的任何材料。此外，载体必须使得组合物在防治害虫上保持有效。此类载体的例子包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖或其他糖溶液、汉克氏溶液和其他生理上平衡的水性盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液以及Tris缓冲液。另外，所述组合物可包含延长组合物的半衰期的化合物。各种杀昆虫制剂也可见于例如美国专利公布2008/0275115、2008/0242174、2008/0027143、2005/0042245和2004/0127520，所述专利每一个均以引用的方式并入本文。
已经认识到，可使用包含编码沉默元件的序列的多核苷酸转化生物体，以便宿主生物体产生这些组分，并随后将宿主生物体施用到靶害虫的环境。此类宿主生物体包括杆状病毒、细菌等等。这样，可通过合适的载体将编码沉默元件的多核苷酸的组合引入微生物宿主中，并将所述宿主施用到环境或施用到植物或动物。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉将核酸掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸可稳定掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
可选择已知可占领一种或多种所关注的作物的“植物圈”(叶面、叶围、根围和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供编码沉默元件的序列的稳定维持和表达，并且理想的是，提供对该组分的改善保护使其不受环境降解和失活。
此类微生物包括细菌、藻类和真菌。特别要关注的是微生物例如细菌如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、农杆菌属(Agrobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属(Alcaligenes)，真菌尤其是酵母如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别要关注的是诸如以下的植物圈细菌物种：丁香假单胞菌(Pseudomonassyrmgae)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋杆菌(Acetobacterxylinum)、农杆菌、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummelioti)、富营养产碱菌(Alcaligenesentrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacterxyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobactervinlandir)，以及诸如以下的植物圈酵母物种：深红酵母(Rhodotorularubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomycesrosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(Sporobolomycesrosues)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromycesveronae)和出芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。特别要关注的是有色素微生物。
有多种方式可用来将包含沉默元件的多核苷酸引入处于容许这种核苷酸编码序列的稳定维持和表达的条件下的微生物宿主中。例如，可构建出这样的表达盒，其包括所关注的核苷酸构建体及为了该核苷酸构建体的表达该核苷酸构建体所有效连接的转录和翻译调节信号、与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列(据此将发生整合)和/或在宿主中具有功能的复制系统(据此将发生整合或稳定维持)。
转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见例如美国专利No.5,039,523和4,853,331；EPO0480762A2；Sambrooketal.(2000)；MolecularCloning.ALaboratoryManual(3rded.；ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NY)(Sambrook等人，2000年，《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)；Davisetal.(1980)AdvancedBacterialGenetics(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)(Davis等人，1980年，《高级细菌遗传学》，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)；以及其中引用的参考文献。
合适的宿主细胞包括原核生物和低等真核生物如真菌。示例性原核生物(革兰氏阴性和革兰氏阳性两者)包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形杆菌属(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiceae)，诸如根瘤菌属(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，诸如发光杆菌属(photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum)；乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，诸如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋菌属(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物有真菌，如藻菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括酵母如酵母菌属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，如红酵母属(Rhodotorula)、短梗霉属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。
在为了本发明的目的而选择宿主细胞时特别要关注的特征包括编码序列向宿主中引入的便利性、表达系统的可获得性、表达的效率、在宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。对于作为杀虫剂微胶囊使用要关注的特征包括保护质量，如厚细胞壁、色素沉着以及包涵体的胞内包装或形成；无哺乳动物毒性；吸引害虫摄取；等等。其他考虑因素包括配制和操作容易性、经济性、贮存稳定性等。
特别要关注的宿主微生物包括酵母，例如红酵母(Rhodotorulaspp.)、短梗霉(Aureobasidiumspp.)、酵母(Saccharomycesspp.)和掷孢酵母(Sporobolomycesspp.)，叶面生物体例如假单胞菌(Pseudomonasspp.)、欧文氏菌(Erwiniaspp.)和黄杆菌(Flavobacteriumspp.)和其他此类生物体，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugmosa)、荧光假单胞菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等。
可将本发明所涵盖的编码沉默元件的序列引入在植物上繁殖的微生物(体表寄生菌)中，以将这些组分递送至潜在的靶害虫。体表寄生菌例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
可在细菌宿主中发酵沉默元件，并且将所得的细菌加工并以与苏云金芽孢杆菌菌株用作杀昆虫喷雾剂相同的方式用作微生物喷雾剂。任何合适的微生物都可用于这个目的。以举例的方式，已用假。单胞菌属将苏云金芽孢杆菌内毒素表达为包囊蛋白，并且将所得的细胞进行加工并作为杀昆虫剂喷施(Gaertneretal.(1993)，inAdvancedEngineeredPesticides，ed.L.Kim(MarcelDecker，Inc.)(Gaertner等人，1993年，载于《高级工程化杀虫剂》，L.Kim编辑，马塞尔·德克尔公司))。
或者，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生本发明的组分。异源基因的表达直接或间接导致沉默元件的胞内产生。然后可按照常规技术配制这些组合物以便施用到靶标害虫的寄生环境，例如土壤、水和植物的叶。参见例如EPA0192319，以及其中引用的参考文献。
在本发明中，经转化的微生物可与可接受的载体一起配制成单独或组合的组合物，所述组合物为例如悬浮液、溶液、乳状液、扑粉、可分散颗粒、可湿性粉末和可乳化浓缩物、气雾剂、浸渍颗粒、辅剂、可涂覆型糊剂，且还包封于(例如)聚合物物质中。
以上所公开的这类组合物可通过加入以下物质来获得：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外保护剂、缓冲剂、助流剂或肥料、微量营养物供体或其他能影响植物生长的制品。可将包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料的一种或多种农业化学品与常用于配制领域的载体、表面活性剂或助剂进行组合，以便于产品处理和施用于特定的靶害虫。合适的载体和辅剂可以是固体或液体，并对应于通常用于配制技术的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本发明的活性成分(即，至少一个沉默元件)通常以组合物的形式施用，并且可施用到待处理的作物区、植物或种子。例如，所述组合物可以在粮仓或者青贮塔(silo)等中在准备贮藏时或者在贮藏过程中施用到谷物。所述组合物可以与其他化合物同时或者相继施用。施用含有至少一个沉默元件的活性成分或组合物的方法，包括但不限于叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应害虫侵染的强度。
合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物，诸如，例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸酯；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或者二酯或者这类酯的盐；脂肪醇硫酸盐如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或者十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基苯酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐诸如烷基苯磺酸盐或者低级烷基萘磺酸盐，例如丁基萘磺酸盐；磺化的萘-甲醛缩合物的盐；磺化的苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐诸如酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或者二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯的磺酸钠。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酸酯例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，这种酯类与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或者乙氧基化的炔二醇。阳离子表面活性剂的例子包括例如脂肪族单胺、二胺或聚胺诸如乙酸盐、环烷酸盐或者油酸盐；或者含氧胺诸如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或聚胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或者季铵盐。
惰性材料的例子包括但不限于无机矿物质如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或者植物材料如软木、粉末玉米穗轴、花生壳、稻壳和胡桃壳。
包含沉默元件的组合物可以合适的形式直接施用或作为主要组合物的浓缩物，其在施用前需要用适当量的水或其他稀释剂稀释。
组合物(包括经转化的微生物)可通过例如以下方式施用于昆虫害虫(诸如鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫)的环境：喷雾、雾化、撒粉、散播、涂覆或倾倒、引入土壤中或引到土壤上、引入灌溉水中、在害虫已开始出现时或者在害虫出现前进行种子处理或普通施用或散粉作为保护措施。例如，可将组合物和/或经转化的微生物与谷物混合以在贮藏过程中保护谷物。通常重要的是在植物生长的早期阶段获得对害虫的良好防治，因为这是植物可能受到最严重损害的时期。所述组合物可便利地含有另一种杀昆虫剂，如果认为这有必要的话。在本发明的一个实施例中，在种植时将组合物直接施用于土壤，施用的形式为载体与芽孢杆菌菌株或者本发明的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。另一个实施例是包含农业化学品例如除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体与芽孢杆菌菌株或者本发明的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。
VII.植物、植物部分及将序列引入植物中的方法
在一个实施例中，本发明的方法涉及将多核苷酸引入进植物中。“引入”旨在意指以使得多核苷酸得以进入植物细胞的内部的方式将这些序列呈送给植物。本发明的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”旨在意指被引入进植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中，并能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入植物中但没有整合进植物的基因组中，或者多肽被引入进植物中。
转化规程以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的规程，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔法(Riggsetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页)、农杆菌介导的转化(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowskietal.(1984)EMBOJ.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见例如美国专利No.4,945,050；美国专利No.5,879,918；美国专利No.5,886,244；和5,932,782；Tomesetal.(1995)inPlantCell，Tissue，andOrganCulture：FundamentalMethods，ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑(施普林格出版社，柏林))；McCabeetal.(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)；和Lec1转化(WO00/28058)。还可参见Weissingeretal.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年度评论》，第22卷，第421-477页)；Sanfordetal.(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christouetal.(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabeetal.(1988)Bio/Technology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；FinerandMcMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论与应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Dattaetal.(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Kleinetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Kleinetal.(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855；5,322,783；和5,324,646；Kleinetal.(1988)PlantPhysiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Frommetal.(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogterenetal.(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-VanSlogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebieretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；DeWetetal.(1985)inTheExperimentalManipulationofOvuleTissues，ed.Chapmanetal.(Longman，NewYork)，pp.197-209(DeWet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，朗文出版社，纽约，第197-209页)(花粉)；Kaeppleretal.(1990)PlantCellReports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppleretal.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；D′Halluinetal.(1992)PlantCell4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Lietal.(1993)PlantCellReports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)和ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年检》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjodaetal.(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化玉蜀黍)；全部上述文献以引用的方式并入本文。
在特定实施例中，可使用多种瞬时转化方法将本发明的沉默元件序列提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于将蛋白或其变体和片段直接引入到植物中，或者将转录物引入到植物中。这类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如Crosswayetal.(1986)MolGen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学与普通遗传学》，第202卷，第179-185页)；Nomuraetal.(1986)PlantSci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepleretal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hushetal.(1994)TheJournalofCellScience107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，以上所有文献以引用方式并入本文。或者，可使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免DNA随后释放的方式进行沉淀。因此，与粒子结合的DNA可能发生转录，但将它释放出来以整合进基因组中的频率大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEi；Sigma#P3143)的粒子。
在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内部。此外，应认识到，本发明的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931，和Portaetal.(1996)MolecularBiotechnology5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)；以上专利和文献以引用方式并入本文。
用于在植物基因组中特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，将多核苷酸插入在所需的基因组位置是用位点特异性重组系统来实现的。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利以引用方式并入本文。简单而言，可将本发明的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒两侧带有两个非重组工程的(non-recombinogenic)重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点两侧带有两个对应于该转移盒的所述位点的非重组产生的重组位点。提供适当的重组酶，将转移盒整合在该靶标位点处。目的多核苷酸因此被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
可以根据常规方式将已转化的细胞培育成植物。参见例如，McCormicketal.(1986)PlantCellReports5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，所得的子代具有识别出的所需表型特征的组成型表达。可培育两代或更多代以确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特征的表达已得到实现。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本发明的多核苷酸(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。
如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷物旨在意指商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。植物物种的例子包括但不限于玉米(Zeamays)；芸苔属物种(Brassicasp.)(例如，欧洲菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secalecereaie)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghumvulgare)、粟(如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp.)、鳄梨(Perseaamericana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)、杏树(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharumspp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersiconesculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利马豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(Lathyrusspp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员诸如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙(Narcissusspp.)、矮牵牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbiapulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树类包括例如松树类，如厚皮刺果松(Pinustaeda)、沼泽松(Pinuselliotii)、美国黄松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinusradiata)；黄杉(Pseudotsugamenziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Piceaglauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；枞树(truefirs)如银枞(Abiesamabilis)和胶枞(Abiesbalsamea)；和雪松如西部红雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。在特定实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物以及甘蔗植物是优选的，在另外的实施例中玉米植物是优选的。
其他所关注的植物包括提供所关注的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
VIII.转基因植物中性状的堆叠
转基因植物可包含如下所示出的如本文所公开的一个或多个靶多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体或片段、或它们的互补序列与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，所述堆叠导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列的堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含所关注的多核苷酸的单独株系；用后续基因转化包含表达构建体的转基因植物，所述表达构建体包含如下所示出的如本文所公开的各种靶多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体或片段、或它们的互补序列；以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(即，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含分子堆叠，其中序列彼此物理相邻。本文所用的性状是指衍生自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个多核苷酸的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的多核苷酸进行多核苷酸的共转化。如果序列通过遗传转化植株来叠加，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与所关注多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。还认识到，可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO1999/25821、WO1999/25854、WO1999/25840、WO1999/25855和WO1999/25853，这些专利均以引用方式并入本文。
在一些实施例中，单独或与一个或多个另外的抗昆虫性状堆叠的如下所示出的如本文所公开的靶多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体或片段、或它们的互补序列，可与一个或另外的投入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育、茎秆强度等)或产出性状(例如，提高的产量、改性的淀粉、改善的油分布、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维质量、抗旱性等)堆叠。因此，该多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地防治许多农艺学害虫的能力的改善的作物质量的完整农艺学方案。
可用于堆叠的转基因包括但不限于如下文所述的那些：
i.赋予对昆虫或病害的抗性的转基因
(A)植物抗病基因。植物防御往往由该植物中抗病基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用激活。可用克隆的抗性基因转化植物品种，以工程构建出对特定的病原体株系有抗性的植物。参见例如Jones，etal.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)(克隆番茄Cf-9基因用于抵抗黄枝孢菌(Cladosporiumfulvum))；Martin，etal.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)(番茄Pto基因，用于抵抗丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato)，编码蛋白激酶)；Mindrinos，etal.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页)(拟南芥RSP2基因，用于抵抗丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)；McDowellandWoffenden，(2003)TrendsBiotechnol.21(4)：178-83(McDowell和Woffenden，2003年，《生物技术趋势》，第21卷，第4期，第178-183页)以及Toyoda，etal.，(2002)TransgenicRes.11(6)：567-82(Toyoda等人，2002年，《转基因研究》，第11卷，第6期，第567-582页)。抗病植物是与野生型植物相比更能抵抗病原体的植物。
(B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或模拟其的合成多肽的基因。参见例如Geiser，etal.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页)，其公开了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自马里兰州罗克维尔市(Rockville，Md.)的美国模式培养物保藏所，例如ATCC登录号40098、67136、31995和31998。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性例子在以下专利和专利申请中给出，并出于此目的据此以引用方式并入：美国专利No.5,188,960；5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013；6,060,594；6,063,597；6,077,824；6,620,988；6,642,030；6,713,259；6,893,826；7,105,332；7,179,965；7,208,474；7,227,056；7,288,643；7,323,556；7,329,736；7,449,552；7,468,278；7,510,878；7,521,235；7,544,862；7,605,304；7,696,412；7,629,504；7,705,216；7,772,465；7,790,846；7,858,849和WO1991/14778；WO1999/31248；WO2001/12731；WO1999/24581和WO1997/40162。
也可堆叠编码杀虫蛋白的基因，包括但不限于：来自假单胞菌属物种的杀昆虫蛋白，诸如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoSPathogens，7：1-13(Monalysin，2011年，《公共科学图书馆病原学》，第7卷，第1-13页))；来自生防假单胞菌(Pseudomonasprotegens)菌株CHA0和Pf-5(之前的荧光假单胞菌)的杀昆虫蛋白(Pechy-Tarr，(2008)EnvironmentalMicrobiology10：2368-2386(Pechy-Tarr，2008年，《环境微生物学》，第10卷，第2368-2386页)；GenBank登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌的杀昆虫蛋白(Liu，etal.，(2010)J.Agric.FoodChem.58：12343-12349(Liu等人，2010年，《农业与食品化学杂志》，第58卷，第12343-12349页))以及来自类产碱假单胞菌的杀昆虫蛋白(Zhang，etal.，(2009)AnnalsofMicrobiology59：45-50(Zhang等人，2009年，《微生物学年报》，第59卷，第45-50页)和Li，etal.，(2007)PlantCellTiss.OrganCult.89：159-168(Li等人，2007年，《植物细胞、组织与器官培养》，第89卷，第159-168页))；来自发光杆菌属物种(Photorhabdussp.)和致病杆菌属物种(Xenorhabdussp.)的杀昆虫蛋白(Hinchliffe，etal.，(2010)TheOpenToxinologyJournal，3：101-118(Hinchliffe等人，2010年，《开放毒素学杂志》，第3卷，第101-118页)和Morgan，etal.，(2001)AppliedandEnvir.Micro.67：2062-2069(Morgan等人，2001年，《应用与环境微生物学》，第67卷，第2062-2069页))、美国专利No.6,048,838和美国专利No.6,379,946；以及δ-内毒素，包括但不限于δ-内毒素基因的Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51和Cry55类别以及苏云金芽孢杆菌溶细胞cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类别的成员包括但不限于Cry1Aa1(登录号M11250)、Cry1Aa2(登录号M10917)、Cry1Aa3(登录号D00348)、Cry1Aa4(登录号X13535)、Cry1Aa5(登录号D17518)、Cry1Aa6(登录号U43605)、Cry1Aa7(登录号AF081790)、Cry1Aa8(登录号I26149)、Cry1Aa9(登录号AB026261)、Cry1Aa10(登录号AF154676)、Cry1Aa11(登录号Y09663)、Cry1Aa12(登录号AF384211)、Cry1Aa13(登录号AF510713)、Cry1Aa14(登录号AY197341)、Cry1Aa15(登录号DQ062690)、Cry1Ab1(登录号M13898)、Cry1Ab2(登录号M12661)、Cry1Ab3(登录号M15271)、Cry1Ab4(登录号D00117)、Cry1Ab5(登录号X04698)、Cry1Ab6(登录号M37263)、Cry1Ab7(登录号X13233)、Cry1Ab8(登录号M16463)、Cry1Ab9(登录号X54939)、Cry1Ab10(登录号A29125)、Cry1Ab11(登录号I12419)、Cry1Ab12(登录号AF059670)、Cry1Ab13(登录号AF254640)、Cry1Ab14(登录号U94191)、Cry1Ab15(登录号AF358861)、Cry1Ab16(登录号AF375608)、Cry1Ab17(登录号AAT46415)、Cry1Ab18(登录号AAQ88259)、Cry1Ab19(登录号AY847289)、Cry1Ab20(登录号DQ241675)、Cry1Ab21(登录号EF683163)、Cry1Ab22(登录号ABW87320)、Cry1Ab样(登录号AF327924)、Cry1Ab样(登录号AF327925)、Cry1Ab样(登录号AF327926)、Cry1Ab样(登录号DQ781309)、Cry1Ac1(登录号M11068)、Cry1Ac2(登录号M35524)、Cry1Ac3(登录号X54159)、Cry1Ac4(登录号M73249)、Cry1Ac5(登录号M73248)、Cry1Ac6(登录号U43606)、Cry1Ac7(登录号U87793)、Cry1Ac8(登录号U87397)、Cry1Ac9(登录号U89872)、Cry1Ac10(登录号AJ002514)、Cry1Ac11(登录号AJ130970)、Cry1Ac12(登录号I12418)、Cry1Ac13(登录号AF148644)、Cry1Ac14(登录号AF492767)、Cry1Ac15(登录号AY122057)、Cry1Ac16(登录号AY730621)、Cry1Ac17(登录号AY925090)、Cry1Ac18(登录号DQ023296)、Cry1Ac19(登录号DQ195217)、Cry1Ac20(登录号DQ285666)、Cry1Ac21(登录号DQ062689)、Cry1Ac22(登录号EU282379)、Cry1Ac23(登录号AM949588)、Cry1Ac24(登录号ABL01535)、Cry1Ad1(登录号M73250)、Cry1Ad2(登录号A27531)、Cry1Ae1(登录号M65252)、Cry1Af1(登录号U82003)、Cry1Ag1(登录号AF081248)、Cry1Ah1(登录号AF281866)、Cry1Ah2(登录号DQ269474)、Cry1Ai1(登录号AY174873)、Cry1A样(登录号AF327927)、Cry1Ba1(登录号X06711)、Cry1Ba2(登录号X95704)、Cry1Ba3(登录号AF368257)、Cry1Ba4(登录号AF363025)、Cry1Ba5(登录号AB020894)、Cry1Ba6(登录号ABL60921)、Cry1Bb1(登录号L32020)、Cry1Bc1(登录号Z46442)、Cry1Bd1(登录号U70726)、Cry1Bd2(登录号AY138457)、Cry1Be1(登录号AF077326)、Cry1Be2(登录号AAQ52387)、Cry1Bf1(登录号AX189649)、Cry1Bf2(登录号AAQ52380)、Cry1Bg1(登录号AY176063)、Cry1Ca1(登录号X07518)、Cry1Ca2(登录号X13620)、Cry1Ca3(登录号M73251)、Cry1Ca4(登录号A27642)、Cry1Ca5(登录号X96682)、Cry1Ca6[1](登录号AF215647)、Cry1Ca7(登录号AY015492)、Cry1Ca8(登录号AF362020)、Cry1Ca9(登录号AY078160)、Cry1Ca10(登录号AF540014)、Cry1Ca11(登录号AY955268)、Cry1Cb1(登录号M97880)、Cry1Cb2(登录号AY007686)、Cry1Cb3(登录号EU679502)、Cry1Cb样(登录号AAX63901)、Cry1Da1(登录号X54160)、Cry1Da2(登录号I76415)、Cry1Db1(登录号Z22511)、Cry1Db2(登录号AF358862)、Cry1Dc1(登录号EF059913)、Cry1Ea1(登录号X53985)、Cry1Ea2(登录号X56144)、Cry1Ea3(登录号M73252)、Cry1Ea4(登录号U94323)、Cry1Ea5(登录号A15535)、Cry1Ea6(登录号AF202531)、Cry1Ea7(登录号AAW72936)、Cry1Ea8(登录号ABX11258)、Cry1Eb1(登录号M73253)、Cry1Fa1(登录号M63897)、Cry1Fa2(登录号M73254)、Cry1Fb1(登录号Z22512)、Cry1Fb2(登录号AB012288)、Cry1Fb3(登录号AF062350)、Cry1Fb4(登录号I73895)、Cry1Fb5(登录号AF336114)、Cry1Fb6(登录号EU679500)、Cry1Fb7(登录号EU679501)、Cry1Ga1(登录号Z22510)、Cry1Ga2(登录号Y09326)、Cry1Gb1(登录号U70725)、Cry1Gb2(登录号AF288683)、Cry1Gc(登录号AAQ52381)、Cry1Ha1(登录号Z22513)、Cry1Hb1(登录号U35780)、Cry1H样(登录号AF182196)、Cry1Ia1(登录号X62821)、Cry1Ia2(登录号M98544)、Cry1Ia3(登录号L36338)、Cry1Ia4(登录号L49391)、Cry1Ia5(登录号Y08920)、Cry1Ia6(登录号AF076953)、Cry1Ia7(登录号AF278797)、Cry1Ia8(登录号AF373207)、Cry1Ia9(登录号AF521013)、Cry1Ia10(登录号AY262167)、Cry1Ia11(登录号AJ315121)、Cry1Ia12(登录号AAV53390)、Cry1Ia13(登录号ABF83202)、Cry1Ia14(登录号EU887515)、Cry1Ib1(登录号U07642)、Cry1Ib2(登录号ABW88019)、Cry1Ib3(登录号EU677422)、Cry1Ic1(登录号AF056933)、Cry1Ic2(登录号AAE71691)、Cry1Id1(登录号AF047579)、Cry1Ie1(登录号AF211190)、Cry1If1(登录号AAQ52382)、Cry1I样(登录号190732)、Cry1I样(登录号DQ781310)、Cry1Ja1(登录号L32019)、Cry1Jb1(登录号U31527)、Cry1Jc1(登录号I90730)、Cry1Jc2(登录号AAQ52372)、Cry1Jd1(登录号AX189651)、Cry1Ka1(登录号U28801)、Cry1La1(登录号AAS60191)、Cry1样(登录号I90729)、Cry2Aa1(登录号M31738)、Cry2Aa2(登录号M23723)、Cry2Aa3(登录号D86064)、Cry2Aa4(登录号AF047038)、Cry2Aa5(登录号AJ132464)、Cry2Aa6(登录号AJ132465)、Cry2Aa7(登录号AJ132463)、Cry2Aa8(登录号AF252262)、Cry2Aa9(登录号AF273218)、Cry2Aa10(登录号AF433645)、Cry2Aa11(登录号AAQ52384)、Cry2Aa12(登录号DQ977646)、Cry2Aa13(登录号ABL01536)、Cry2Aa14(登录号ACF04939)、Cry2Ab1(登录号M23724)、Cry2Ab2(登录号X55416)、Cry2Ab3(登录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y51Aa1(登录号DQ836184)、Cry52Aa1(登录号EF613489)、Cry53Aa1(登录号EF633476)、Cry54Aa1(登录号EU339367)、Cry55Aa1(登录号EU121521)、Cry55Aa2(登录号AAE33526)。
δ-内毒素的例子还包括但不限于美国专利No.5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利No.8,304,604和8,304,605的DIG-3或DIG-11毒素(Cry蛋白诸如Cry1A的α-螺旋1和/或α-螺旋2变体的N端缺失)；美国专利申请No.10/525,318的Cry1B；美国专利No.6,033,874的Cry1C；美国专利No.5,188,960、6,218,188的Cry1F；美国专利No.7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；Cry2蛋白，诸如美国专利No.7,064,249的Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区块的独特组合而形成的经工程改造的杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公布No.2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利No.7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，诸如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Naimov，etal.，(2008)AppliedandEnvironmentalMicrobiology74：7145-7151(Naimov等人，2008年，《应用与环境微生物学》，第74卷，第7145-7151页)的Cry15蛋白；美国专利No.6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利No.6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公布No.2006/0191034、2012/0278954和PCT专利公布No.WO2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利No.6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白；Cry51蛋白；Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；US2008/0295207的TIC807；PCTUS2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利No.8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；美国专利No.7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO2006/083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO2005/038032的AXMI-010；WO2005/021585的AXMI-003；US2004/0250311的AXMI-008；US2004/0216186的AXMI-006；US2004/0210965的AXMI-007；US2004/0210964的AXMI-009；US2004/0197917的AXMI-014；US2004/0197916的AXMI-004；WO2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO2004/074462的AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利No.8,084,416的AXMI-150；US20110023184的AXMI-205；US201I/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063和AXMI-064；US2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO11/103,247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利No.8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；US2010/0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045；US20090144852的AXMI-066和AXMI-076；美国专利No.8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US2010/0005543的AXMI079、AXM1080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；Cry蛋白，诸如美国专利No.8,319,019的具有经修饰的蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A；以及美国专利申请公布No.2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/(可使用“www”前缀在万维网上访问)的Crickmore，etal.，“Bacillusthuringiensistoxinnomenclature”(2011)(Crickmore等人，“苏云金芽孢杆菌毒素命名”，2011年))。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(有关综述，参见vanFrannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.101：1-16(vanFrannkenhuyzen，2009年，《无脊椎动物病理学杂志》，第101卷，第1-16页))。Cry蛋白作为转基因植物性状的用途是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt的Cry转基因植物已取得监管批准(参见，Sanahuja，(2011)PlantBiotechJournal9：283-300(Sanahuja，2011年，《植物生物技术杂志》，第9卷，第283-300页)和cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database(可使用“www”前缀在万维网上访问)的CERA(2010)GMCropDatabaseCenterforEnvironmentalRiskAssessment(CERA)、ILSIResearchFoundation，WashingtonD.C.(CERA(2010)转基因作物数据库，环境风险评估中心(CERA)，国际生命科学学院研究基金，华盛顿特区))。杀虫蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，其包括美国专利No.7,491,869的脂质酰基水解酶以及诸如得自链霉菌属的胆固醇氧化酶(Purcelletal.(1993)BiochemBiophysResCommun15：1406-1413(Purcell等人，1993年，《生物化学和生物物理研究通讯》，第15卷，第1406-1413页))。杀虫蛋白还包括美国专利No.5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020的VIP(植物性杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html(可使用“www”前缀在万维网上访问))。杀虫蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，可得自诸如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的生物体(参见，美国专利No.7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性，而其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。“独立”TC蛋白(来自例如发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性可通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强A类蛋白的毒性。A类蛋白的例子是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的例子是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的例子是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀虫蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于lycotoxin-1肽及其突变体(美国专利No.8,334,366)。
(C)编码昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮甾类和保幼激素，其变体、基于其的模拟物或者其拮抗剂或激动剂的多核苷酸。参见例如Hammock，etal.，(1990)Nature344：458(Hammock等人，1990年，《自然》，第344卷，第458页)，其公开了以杆状病毒来表达克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)。
(D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时会扰乱受影响害虫的生理机能。例如参见以下文献的公开内容：Regan，(1994)J.Biol.Chem.269：9(Regan，1994年，《生物化学杂志》，第269卷，第9页)(表达克隆产生出编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt，etal.，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243(Pratt等人，1989年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第163卷，第1243页)(在太平洋折翅蠊(Diplopterapuntata)中-识别出的allostatin)；Chattopadhyay，etal.，(2004)CriticalReviewsinMicrobiology30(1)：33-54(Chattopadhyay等人，2004年，《微生物学评论》，第30卷，第1期，第33-54页)；Zjawiony，(2004)JNatProd67(2)：300-310(Zjawiony，2004年，《天然产物杂志》，第67卷，第2期，第300-310页)；CarliniandGrossi-de-Sa，(2002)Toxicon40(11)：1515-1539(Carlini和Grossi-de-Sa，2002年，《毒素》，第40卷，第11期，第1515-1539页)；Ussuf，etal.，(2001)CurrSci.80(7)：847-853(Ussuf等人，2001年，《当代科学》，第80卷，第7期，第847-853页)，以及VasconcelosandOliveira(2004)Toxicon44(4)：385-403(Vasconcelos和Oliveira，2004年，《毒素》，第44卷，第4期，第385-403页)。还可参见授予Tomalski等人的美国专利No.5,266,317，其公开了编码昆虫特异性毒素的基因。
(E)编码负责单萜烯、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素(phenylpropanoid)衍生物或者别的具有杀昆虫活性的非蛋白分子的超量积累的酶的多核苷酸。
(F)编码如下酶的多核苷酸：参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是合成的。参见以Scott等人的名义的PCT申请WO1993/02197，其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可例如以登录号39637和67152从ATCC获得。还可参见Kramer，etal.，(1993)InsectBiochem.Molec.Biol.23：691(Kramer等人，1993年，《昆虫生物化学分子生物学》，第23卷，第691页)，其教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，以及Kawalleck，etal.，(1993)PlantMolec.Biol.21：673(Kawalleck等人，1993年，《植物分子生物学》，第21卷，第673页)，其提供了欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列，以及美国专利No.6,563,020；7,145,060和7,087,810。
(G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella，etal.，(1994)PlantMolec.Biol.24：757(Botella等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第757页)关于绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列的公开内容，以及Griess，etal.，(1994)PlantPhysiol.104：1467(Griess等人，1994年，《植物生理学》，第104卷，第1467页)，其提供了玉蜀黍钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。
(H)编码疏水力矩肽的多核苷酸。参见PCT申请WO1995/16776和美国专利No.5,580,852关于鲎素(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物的公开内容，以及PCT申请WO1995/18855和美国专利No.5,607,914(教导了赋予抗病性的合成抗微生物肽)。
(I)编码膜透性酶、通道离子载体或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见Jaynes，etal.，(1993)PlantSci.89：43(Jaynes等人，1993年，《植物科学》，第89卷，第43页)，其公开了异源表达天蚕杀菌肽-β裂解肽类似物以使转基因烟草植物能抵抗青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)。
(J)编码病毒侵入性蛋白或从中衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累，可赋予对由该外壳蛋白基因衍生的病毒以及相关病毒所造成的病毒感染和/或病害发展的抗性。参见Beachy，etal.，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28：451(Beachy等人，1990年，《植物病理学年评》，第28卷，第451页)。外壳蛋白介导的抗性已被赋予转化植物以抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条斑病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。
(K)编码昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中的关键代谢功能的抗体将会灭活受影响的酶，从而杀死昆虫。Cf.Taylor，etal.，Abstract#497，SEVENTHINT′LSYMPOSIUMONMOLECULARPLANT-MICROBEINTERACTIONS(Edinburgh，Scotland，1994)(Cf.Taylor等人，第497号摘要，《第七届分子植物微生物国际交流会论文集》(苏格兰爱丁堡，1994年))(通过产生单链抗体片段对转基因烟草进行酶促灭活)。
(L)编码病毒特异性抗体的基因。参见例如，Tavladoraki，etal.，(1993)Nature366：469(Tavladoraki等人，1993年，《自然》，第366卷，第469页)，其显示表达重组抗体基因的转基因植物免于病毒攻击。
(M)编码在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内切α-1，4-D-聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同型-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶而有利于真菌定植和植物营养物释放。参见Lamb，etal.，(1992)Bio/Technology10：1436(Lamb等人，1992年，《生物/技术》，第10卷，第1436页)。Toubart，etal.，(1992)PlantJ.2：367(Toubart等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第367页)描述了编码菜豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。
(N)编码在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白的多核苷酸。例如，Logemann，etal.，(1992)Bio/Technology10：305(Logemann等人，1992年，《生物/技术》，第10卷，第305页)已表明表达大麦核糖体灭活基因的转基因植物对真菌病害的抗性提高。
(O)参与系统获得性抗性(SAR)响应的基因和/或病程相关基因。Briggs，(1995)CurrentBiology5(2)(Briggs，1995年，《当代生物学》，第5卷，第2期)，PieterseandVanLoon，(2004)Curr.Opin.PlantBio.7(4)：456-64(Pieterse和VanLoon，2004年，《植物生物学新见》，第7卷，第4期，第456-464页)以及Somssich，(2003)Cell113(7)：815-6(Somssich，2003年，《细胞》，第113卷，第7期，第815-816页)。
(P)抗真菌基因(CornelissenandMelchers，(1993)Pl.Physiol.101：709-712(Cornelissen和Melchers，1993年，《植物生理学》，第101卷，第709-712页)，Parijs，etal.，(1991)Planta183：258-264(Parijs等人，1991年，《植物》，第183卷，第258-264页)以及Bushnell，etal.，(1998)Can.J.ofPlantPath.20(2)：137-149(Bushnell等人，1998年，《加拿大植物病理学杂志》，第20卷，第2期，第137-149页)。还可参见美国专利申请No.09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774,121以及美国专利No.6,891,085和No.7,306,946。用于作为抵抗真菌病原体的植物防御反应的第一步而感知几丁质片段的LysM受体样激酶(US2012/0110696)。
(Q)解毒基因，诸如串珠镰孢菌毒素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮以及它们的结构相关衍生物的解毒基因。例如，参见美国专利No.5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。
(R)编码胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见美国专利No.7,205,453。
(S)防御素基因。参见WO2003/000863和美国专利No.6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781。
(T)赋予对线虫的抗性的基因。参见例如PCT申请WO1996/30517；PCT申请WO1993/19181、WO2003/033651以及Urwin，etal.，(1998)Planta204：472-479(Urwin等人，1998年，《植物》，第204卷，第472-479页)；Williamson，(1999)CurrOpinPlantBio.2(4)：327-31(Williamson，1999年，《植物生物学新见》，第2卷，第4期，第327-331页)；美国专利No.6,284,948和7,301,069及miR164基因(WO2012/058266)。
(U)赋予对疫霉根腐病的抗性的基因，诸如Rps1、Rps1-a、Rps1-b、Rps1-c、Rps1-d、Rps1-e、Rps1-k、Rps2、Rps3-a、Rps3-b、Rps3-c、Rps4、Rps5、Rps6、Rps7和其他Rps基因。参见例如，Shoemaker，etal.，PhytophthoraRootRotResistanceGeneMappinginSoybean，PlantGenomeIVConference，SanDiego，Calif.(1995)(Shoemaker等人，大豆中的疫霉根腐病抗性基因作图，第四届植物基因组大会，加利福尼亚州圣地亚哥，1995年)。
(V)赋予对褐茎腐病抗性的基因，诸如美国专利No.5,689,035中所述，该专利出于此目的以引用方式并入。
(W)赋予对炭疽菌(Colletotrichum)的抗性的基因，诸如美国专利申请公布US2009/0035765中所述，该专利出于此目的以引用方式并入。这包括可用作单基因座转换的Rcg基因座。
ii.赋予对除草剂的抗性的转基因。
(A)编码对抑制生长点或分生组织的除草剂诸如咪唑啉酮或磺酰脲的抗性的多核苷酸。这个类别的示例性基因编码突变的ALS酶和AHAS酶，例如分别由Lee，etal.，(1988)EMBOJ.7：1241(Lee等人，1988年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第7卷，第1241页)和Miki，etal.，(1990)Theor.Appl.Genet.80：449(Miki等人，1990年，《理论与应用遗传学》，第80卷，第449页)描述。还可参见美国专利No.5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；美国专利申请No.11/683,737以及国际专利公布WO1996/33270。
(B)编码对如下的抗性的蛋白的多核苷酸：草甘膦(抗性分别由突变的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因赋予)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草胺膦乙酰转移酶(PAT)基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)草胺膦乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸(proprionicacid)和环己酮(cyclohexone)(ACC酶抑制剂编码基因)。参见例如授予Shah等人的美国专利No.4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘膦抗性的核苷酸序列。授予Barry等人的美国专利No.5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还可参见美国专利No.6,566,587；6,338,961；6,248,876B1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945；4,940,835；5,866,775；6,225,114B1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE37,287E和5,491,288以及国际专利公布EP1173580；WO2001/66704；EP1173581和EP1173582，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。
还向表达编码草甘膦氧化还原酶的基因的植物赋予草甘膦抗性，如在美国专利No.5,776,760以及5,463,175中更充分描述的，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。另外，可以通过过表达编码草甘膦N-乙酰转移酶的基因向植物赋予草甘膦抗性。参见例如美国专利No.7,462,481；7,405,074和美国专利申请公布No.US2008/0234130。编码突变的aroA基因的DNA分子可以以ATCC登录号39256获得，该突变基因的核苷酸序列在授予Comai的美国专利No.4,769,061中公开。授予Kumada等人的EP申请No.0333033和授予Goodman等人的美国专利No.4,975,374公开了赋予对除草剂(诸如L-草胺膦)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。草胺膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列在授予Leemans等人的EP申请No.0242246和0242236；DeGreef，etal.，(1989)Bio/Technology7：61(DeGreef等人，1989年，《生物/技术》，第7卷，第61页)中提供，其描述了表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。还可参见美国专利No.5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616B1和5,879,903，这些专利出于此目的以引用方式并入本文。赋予对苯氧基丙酸和环己酮(诸如烯禾啶和氟吡甲禾灵)的抗性的示例性基因是Marshall，etal.，(1992)Theor.Appl.Genet.83：435(Marshall等人，1992年，《理论与应用遗传学》，第83卷，第435页)所述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。
(C)编码对抑制光合作用的除草剂具有抗性的蛋白的多核苷酸，所述除草剂为诸如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)。Przibilla，etal.，(1991)PlantCell3：169(Przibilla等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第169页)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在授予Stalker的美国专利No.4,810,648中公开，含有这些基因的DNA分子可以以ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes，etal.，(1992)Biochem.J.285：173(Hayes等人，1992年，《生物化学杂志》，第285卷，第173页)描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
(D)编码对乙酰羟酸合酶的抗性的蛋白的多核苷酸，该乙酰羟酸合酶已被发现能使表达这种酶的植物抵抗多种类型的除草剂，其已被引入到多种植物中(参见例如Hattori，etal.，(1995)MolGenGenet.246：419(Hattori等人，1995年，《分子遗传学与普通遗传学》，第246卷，第419页))。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiotaetal.，(1994)PlantPhysiol106：17(Shiota等人，1994年，《植物生理学》，第106卷，第17页))，编码谷胱甘肽还原酶和过氧化物歧化酶的基因(Aono，etal.，(1995)PlantCellPhysiol36：1687(Aono等人，1995年，《植物细胞生理学》，第36卷，第1687页))，以及编码各种磷酸转移酶的基因(Datta，etal.，(1992)PlantMolBiol20：619(Datta等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第619页))。
(E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，原卟啉原氧化酶是产生叶绿素所需的。所述protox酶充当多种除草化合物的靶标。这些除草剂还抑制所存在的所有不同植物物种的生长，造成它们全部毁灭。能抵抗这些除草剂的含有改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的开发在美国专利No.6,288,306B1；6,282,837B1和5,767,373以及国际专利公布WO2001/12825中有所描述。
(F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobiumherbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。该性状赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂诸如喹禾灵))除草剂的耐受性。在植物中实现除草剂耐受性的aad-1基因自身首次公开于WO2005/107437(还可参见US2009/0093366)。aad-12基因，源自代尔夫特食酸菌(Delftiaacidovorans)，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)蛋白，通过使若干具有芳氧基链烷酸酯部分的除草剂(包括苯氧基生长素(例如，2，4-D、MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如，氟草烟、绿草定))失活而赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。
(G)编码美国专利申请公布2003/0135879中公开的用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸。
(H)编码美国专利No.4,810,648中公开的赋予溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子。
(I)编码Misawa，etal.，(1993)PlantJ.4：833-840(Misawa等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第833-840页)和Misawa，etal.，(1994)PlantJ.6：481-489(Misawa等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第481-489页)中所述的用于实现哒草伏耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子。
iii.赋予或促成谷物特性改变的转基因
(A)例如通过如下方式改变的脂肪酸：(1)下调硬脂酰-ACP以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon，etal.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：2624(Knultzon等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第2624页)和WO1999/64579(玉米中改变脂质分布的基因)；(2)通过FAD-2基因修饰来提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰来降低亚麻酸(参见美国专利No.6,063,947；6,323,392；6,372,965和WO1993/11245)；(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，诸如WO2001/12800中；(4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1ps、多种Ipa基因诸如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt。例如，参见WO2002/42424、WO1998/22604、WO2003/011015、WO2002/057439、WO2003/011015、美国专利No.6,423,886、6,197,561、6,825,397以及美国专利申请公布No.US2003/0079247、US2003/0204870以及Rivera-Madrid，etal.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：5620-5624(《美国国家科学院院刊》，第92卷，第5620-5624页)；(5)编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的Δ8去饱和酶(美国专利No.8,058,571和8,338,152)、用于降低饱和脂肪的Δ9去饱和酶(美国专利No.8,063,269)、用于改善ω-3脂肪酸分布的报春花属(Primula)Δ6-去饱和酶的基因；(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和多肽，具体地讲，在产生转基因植物和调节种子贮藏化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子贮藏蛋白)水平的方法中使用的以及在调节植物种子大小、种子数量、种子重量、根长和叶片大小的方法中使用的脂质代谢蛋白(LMP)(EP2404499)；(7)改变高水平表达的糖诱导2型(HSI2)蛋白质在植物中的表达以增加或减少HSI2在植物中的表达。增加HSI2的表达会提高油含量，而减少HSI2的表达会降低脱落酸敏感性和/或提高耐旱性(美国专利申请公布No.2012/0066794)；(8)细胞色素b5(Cb5)单独表达或与FAD2一起表达以调节植物种子中的油含量，特别是增加ω-3脂肪酸的水平并改善ω-6与ω-3脂肪酸的比率(美国专利申请公布No.2011/0191904)；以及(9)编码用于调节糖代谢的wrinkled1样多肽的核酸分子(美国专利No.8,217,223)。
(B)例如通过如下方式改变的磷含量：(1)引入植酸酶编码基因将增强肌醇六磷酸的分解，从而给转化植物增加更多的游离磷酸盐。例如，参见VanHartingsveldt，etal.，(1993)Gene127：87(VanHartingsveldt等人，1993年，《基因》，第127卷，第87页)，其公开了黑曲霉(Aspergillusniger)植酸酶基因的核苷酸序列；和(2)调节降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉蜀黍中，这例如可通过以下方式来实现：将与一种或多种等位基因如LPA等位基因(在以低水平植酸为特征的玉蜀黍突变株中识别出)相关的DNA进行克隆并再引入，如WO2005/113778中所述，和/或改变肌醇激酶活性，如在WO2002/059324、美国专利申请公布No.2003/0009011、WO2003/027243、美国专利申请公布No.2003/0079247、WO1999/05298、美国专利No.6,197,561、美国专利No.6,291,224、美国专利No.6,391,348、WO2002/059324、美国专利申请公布No.2003/0079247、WO1998/45448、WO1999/55882、WO2001/04147中。
(C)例如通过如下方式影响而改变的碳水化合物：改变影响淀粉分枝模式的酶的基因或使硫氧还蛋白改变的基因诸如NTR和/或TRX(参见美国专利No.6,531,648，该专利出于此目的以引用方式并入本文)和/或γ-玉米醇溶蛋白敲除体或突变体诸如cs27或TUSC27或en27(参见美国专利No.6,858,778和美国专利申请公布No.2005/0160488、美国专利申请公布No.2005/0204418，这些专利出于此目的以引用方式并入本文)。参见Shiroza，etal.，(1988)J.Bacteriol.170：810(Shiroza等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第810页)(变形链球菌(Streptococcusmutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz，etal.，(1985)Mol.Gen.Genet.200：220(Steinmetz等人，1985年，《分子遗传学与普通遗传学》，第200卷，第220页)(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)、Pen，etal.，(1992)Bio/Technology10：292(Pen等人，1992年，《生物/技术》，第10卷，第292页)(表达地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的生产)，Elliot，etal.，(1993)PlantMolec.Biol.21：515(Elliot等人，1993年，《植物分子生物学》，第21卷，第515页)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard，etal.，(1993)J.Biol.Chem.268：22480(Sogaard等人，1993年，《生物化学杂志》，第268卷，第22480页)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher，etal.，(1993)PlantPhysiol.102：1045(Fisher等人，1993年，《植物生理学》，第102卷，第1045页)(玉蜀黍胚乳淀粉分支酶II)、WO1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、Fragile1和2、Ref1、HCHL、C4H来改善消化性和/或淀粉提取)、美国专利No.6,232,529(通过改良淀粉水平(AGP)制备高油种子的方法)。本文提到的脂肪酸修饰基因还可用来通过淀粉途径和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。
(D)改变的抗氧化物含量或组成，如生育酚或生育三烯醇的改变。例如，参见涉及抗氧化物水平操纵的美国专利No.6,787,683、美国专利申请公布No.2004/0034886和WO2000/68393以及通过改变尿黑酸牻牛儿基牻牛儿基转移酶(hggt)的WO2003/082899。
(E)改变的必需种子氨基酸。例如，参见美国专利No.6,127,600(提高种子中必需氨基酸积聚的方法)、美国专利No.6,080,913(提高种子中必需氨基酸积聚的二元方法)、美国专利No.5,990,389(高赖氨酸)、WO1999/40209(种子中氨基酸组成的改变)、WO1999/29882(改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利No.5,850,016(种子中氨基酸组成的改变)、WO1998/20133(具有水平提高的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利No.5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利No.5,885,801(高苏氨酸)、美国专利No.6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利No.6,459,019(提高的赖氨酸和苏氨酸)、美国专利No.6,441,274(植物色氨酸合成酶β亚基)、美国专利No.6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利No.5,939,599(高硫)、美国专利No.5,912,414(提高的甲硫氨酸)、WO1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、WO1998/45458(具有更高百分比的必需氨基酸的工程化种子蛋白质)、WO1998/42831(提高的赖氨酸)、美国专利No.5,633,436(提高硫氨基酸含量)、美国专利No.5,559,223(具有确定结构的合成贮存蛋白质，包含可设计必需氨基酸的水平来改善植物的营养价值)、WO1996/01905(提高的苏氨酸)、WO1995/15392(提高的赖氨酸)、美国专利申请公布No.2003/0163838、美国专利申请公布No.2003/0150014、美国专利申请公布No.2004/0068767、美国专利No.6,803,498、WO2001/79516。
iv.控制雄性不育的基因
有数种赋予遗传雄性不育的方法可用，诸如在基因组内独立位置处的多个突变基因可赋予雄性不育，如授予Brar等人的美国专利No.4,654,465和4,727,219中所公开的，以及Patterson在美国专利No.3,861,709和No.3,710,511中所述的染色体易位。除了这些方法外，Albertsen等人(美国专利No.5,432,068)描述了一种核雄性不育的系统，其包括：识别对雄性能育性关键的基因；使这个对雄性能育性关键的天然基因沉默；从该必需的雄性能育性基因移除天然启动子并用诱导型启动子代替；将该经遗传工程改造过的基因插回至植株中；从而产生了雄性不育的植株，因为该诱导型启动子未“开启”从而导致雄性能育性基因不被转录。通过诱导或“开启”启动子，其继而允许赋予雄性能育性的基因被转录，来恢复能育性。非限制性例子包括：(A)在绒毡层特异性启动子的控制下和在施加化学物质N-Ac-PPT的情况下引入脱乙酰酶基因(WO2001/29237)；(B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO1992/13956、WO1992/13957)；以及(C)引入芽孢杆菌RNA酶(barnase)和芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)基因(Paul，etal.，(1992)PlantMol.Biol.19：611-622(Paul等人，1992年，《植物分子生物学》，第19卷，第611-622页))。核雄性和雌性不育系统以及基因的另外的例子，还可参见美国专利No.5,859,341、No.6,297,426、No.5,478,369、No.5,824,524、No.5,850,014和No.6,265,640；据此将所有这些专利以引用的方式并入。
v.能产生用于位点特异性DNA整合的位点的基因。
这包括引入可用于FLP/FRT系统的FRT位点和/或可用于Cre/Loxp系统的Lox位点。例如，参见Lyznik，etal.，(2003)PlantCellRep21：925-932(Lyznik等人，2003年，《植物细胞报道》，第21卷，第925-932页)和WO1999/25821，所述文献据此以引用方式并入。其他可使用的系统包括噬菌体Mu的Gln重组酶(Maeser等人，1991年；VickiChandler，TheMaizeHandbookch.118(Springer-Verlag1994)(VickiChandler，《玉蜀黍手册》，第118章，(斯普林格出版社，1994年))、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983年)以及pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992年)。
vi.影响非生物胁迫抗性的基因
包括但不限于开花、穗和种子发育、氮利用效率增强、改变的氮响应度、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性和抗盐性或耐盐性、以及胁迫下增加的产量。非限制性例子包括：(A)例如，参见：WO2000/73475，其中通过改变苹果酸盐而改变水利用效率；美国专利No.5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,034、6,801,104、WO2000/060089、WO2001/026459、WO2001/035725、WO2001/034726、WO2001/035727、WO2001/036444、WO2001/036597、WO2001/036598、WO2002/015675、WO2002/017430、WO2002/077185、WO2002/079403、WO2003/013227、WO2003/013228、WO2003/014327、WO2004/031349、WO2004/076638、WO199809521；(B)WO199938977，描述了能有效减轻严寒、高盐和干旱对植物的不利作用以及赋予植物表型以其他有利作用的基因，包括CBF基因和转录因子；(C)美国专利申请公布No.2004/0148654和WO2001/36596，其中脱落酸在植物中被改变，导致改善的植物表型，诸如提高的产量和/或增强的非生物胁迫耐受性；(D)WO2000/006341、WO2004/090143、美国专利No.7,531,723和6,992,237，其中细胞分裂素的表达经修饰，产生具有增强的胁迫耐受性(如耐旱性)和/或提高的产量的植物。还可参见WO2002/02776、WO2003/052063、JP2002/281975、美国专利No.6,084,153、WO2001/64898、美国专利No.6,177,275和美国专利No.6,107,547(增强氮利用和改变氮响应性)；(E)有关乙烯改变，参见美国专利申请公布No.2004/0128719、美国专利申请公布No.2003/0166197和WO2000/32761；(F)有关非生物胁迫的植物转录因子或转录调控因子，参见例如美国专利申请公布No.2004/0098764或美国专利申请公布No.2004/0078852；(G)增加液泡焦磷酸酶诸如AVP1(美国专利No.8,058,515)表达以提高产量的基因；编码如下多肽的核酸：HSFA4或HSFA5(A4或A5类的热休克因子)多肽、低聚肽转运蛋白质(OPT4-样)多肽；plastochron2-样(PLA2-样)多肽或Wuschel相关的同源盒1-样(WOX1-样)多肽(美国专利申请公布No.US2011/0283420)；(H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白质的多核苷酸以调节细胞程序死亡(美国专利No.8,058,510)，从而提高活力；(I)编码赋予耐旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公布No.US2011/0277181)；(J)编码ACC合成酶3(ACS3)蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质用于调节发育、调节对胁迫的响应、以及调节胁迫耐受性(美国专利申请公布No.US2010/0287669)；(K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以赋予耐旱性的蛋白质的多核苷酸(WO2012/058528)；(L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公布No.2012/0272352)；(M)用于实现胁迫耐受性的CAAX氨基末端家族蛋白质(美国专利No.8,338,661)；(N)SAL1编码基因中的突变具有增强的胁迫耐受性，包括增强的抗旱性(美国专利申请公布No.2010/0257633)；(O)编码选自如下的多肽的核酸序列的表达提高了产量相关性状：GRF多肽、RAA1-样多肽、SYR多肽、ARKL多肽和YTP多肽(美国专利申请公布No.2011/0061133)；以及(P)调节编码III类磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)多肽的核酸在植物中的表达，以便增强植物中的产量相关性状，特别是提高种子产量(美国专利申请公布No.2010/0024067)。
影响植物生长与农学性状诸如产量、开花、植物生长和/或植物结构的其他基因和转录因子，均可被引入或渐渗到植物中，参见例如WO1997/49811(LHY)、WO1998/56918(ESD4)、WO1997/10339和美国专利No.6,573,430(TFL)、美国专利No.6,713,663(FT)、WO1996/14414(CON)、WO1996/38560、WO2001/21822(VRN1)、WO2000/44918(VRN2)、WO1999/49064(GI)、WO2000/46358(FR1)、WO1997/29123、美国专利No.6,794,560、美国专利No.6,307,126(GAI)、WO1999/09174(D8和Rht)以及WO2004/076638和WO2004/031349(转录因子)。
vii.赋予提高的产量的基因
赋予提高的产量的基因的非限制性例子是：(A)由1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶样多肽(ACCDP)编码核酸所转化的转基因作物，其中该核酸序列在作物中的表达导致与植物的野生型品种相比，植物根生长增加和/或产量提高，和/或对环境胁迫的耐受性增强(美国专利No.8,097,769)；(B)使用种子偏好启动子的玉蜀黍锌指蛋白质基因(Zm-ZFP1)的过表达已经显示促进植物生长、增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公布No.2012/0079623)；(C)侧生器官边界(LOB)结构域蛋白质(Zm-LOBDP1)的组成型过表达已经显示增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公布No.2012/0079622)；(D)通过调节编码VIM1(甲基化1变体)-样多肽或VTC2-样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6-样(生长素响应因子)多肽的核酸在植物中的表达来增强植物中的产量相关性状(WO2012/038893)；(E)调节编码Ste20-样多肽或其同源物的核酸在植物中的表达来提供具有相对于对照植物产量提高的植物(EP2431472)；以及(F)编码用于修饰植物根构型的核苷二磷酸激酶(NDK)多肽及其同源物的基因(美国专利申请公布No.2009/0064373)。
IX.使用方法
本发明的方法包括用于防治害虫(即，鞘翅目植物害虫，包括叶甲属植物害虫，诸如西方玉米根虫(D.virgiferavirgifera)、北方玉米根虫(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)、南美叶甲(D.speciosa)或黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctatahowardi))的方法。该方法包括给害虫喂食或施用包含本发明的沉默元件的组合物，其中所述沉默元件在被害虫(即，鞘翅目植物害虫，包括叶甲属植物害虫，诸如西方玉米根虫(D.virgiferavirgifera)、北方玉米根虫(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)、南美叶甲(D.speciosa)或黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctatahowardi))摄取或接触时能降低害虫的靶多核苷酸的水平并从而防治害虫。可以多种方式给害虫喂食沉默元件。例如，在一个实施例中，将包含沉默元件的多核苷酸引入植物中。当鞘翅目植物害虫或叶甲属植物害虫对表达这些序列的植物或其部分取食时，沉默元件被递送到害虫中。当沉默元件以这种方式递送到植物中时，已认识到，沉默元件可以组成性表达，或者，它可以通过使用在本文其他地方讨论的各种诱导型、组织偏好或发育调节型启动子以阶段特异性的方式产生。在特定实施例中，沉默元件在根、茎秆或茎、叶(包括小穗柄、木质部和韧皮部)、果实或生殖组织、穗丝、花及其中的所有部分或它们的任何组合中表达。
在另一种方法中，将包含本发明的至少一个沉默元件的组合物施用于植物。在此类实施例中，沉默元件可在农学上合适的和/或环境可接受的载体中配制，所述载体优选地适于散布在田间中。另外，所述载体也可包含延长组合物的半衰期的化合物。在特定实施例中，包含沉默元件的组合物以一定方式配制，使得其在环境中存留足够长的时间，以允许其递送到害虫中。在此类实施例中，可将组合物施用到害虫所栖息的区域。在一个实施例中，将组合物外部地施用到植物(即，通过喷洒田间)以保护植物免受害虫影响。
在某些实施例中，本发明的构建体可与所关注的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠，以产生具有所需性状的植物。本文所用的性状是指衍生自特定序列或序列群组的表型。例如，本发明的多核苷酸可与任何其他编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的多核苷酸进行堆叠，所述多肽为例如其他苏云金芽孢杆菌毒蛋白(描述于美国专利No.5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiseretal.(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))、凝集素(VanDammeetal.(1994)PlantMol..24：825(VanDamme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页)、五邻体蛋白(pentin)(描述于美国专利No.5,981,722)等。所产生的组合还可包括所关注的多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。本发明的多核苷酸也可与任何其他基因或基因的组合堆叠，以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于：动物饲料所需的性状诸如高油基因(例如美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如大麦硫堇(hordothionin)(美国专利No.5,990,389；5,885,801；5,885,802和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamsonetal.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白质(Pedersenetal.(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kiriharaetal.(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)；以及Musumuraetal.(1989)PlantMol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))；增加的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的美国专利申请No.10/053,410)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国专利申请No.10/005,429))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。
本发明的多核苷酸也可与疾病或除草剂抗性所需的性状进行堆叠(例如伏马毒素脱毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒性和抗病性基因(Jonesetal.(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martinetal.(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinosetal.(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，诸如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合成酶的抑制剂如草胺膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因)；以及加工或过程产物所需的性状，诸如高油(例如，美国专利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸合成酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubertetal.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)；上述公开内容以引用方式并入本文。还可将本发明的多核苷酸与提供诸如雄性不育(例如参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、抗旱性(例如美国专利No.7,786,353)、开花时间之类的农艺性状或诸如细胞周期调节或基因靶向(例如WO99/61619；WO00/17364；WO99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合；将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法或遗传转化来对植物进行杂交育种。如果序列通过遗传转化植株来堆叠(即分子堆叠)，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包含一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化方案将性状与所关注多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况下，可能需要引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到，可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利以引用方式并入本文。
以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
实验
实例1：体外转录物dsRNA筛选方法
通过标准方法由新孵西方玉米根虫幼虫产生cDNA文库。在PCR中使用质粒骨架的通用引物在EST插入序列旁侧扩增包含表达序列标签的所选cDNA克隆。该通用引物还包含T7RNA聚合酶位点。该PCR反应的产物用作产生长双链RNA的体外转录(IVT)反应的模板。在酶消化并去除DNA模板和单链RNA之后，将IVT反应产物掺入如下所述的人工昆虫饵料中。
在本发明中使用不同的靶选择策略，以在基于玉米根虫饵料的测定法中识别具有杀昆虫活性的RNAi活性靶标。通过标准方法由新孵虫或3龄西方玉米根虫幼虫的中肠产生cDNA文库。在PCR中使用靶特异性引物(表1的正向和反向引物)扩增包含表达序列标签(EST)的随机选择的cDNA克隆，并提供于本文所包括的序列表中，以生成DNA模板。该靶特异性引物还包含T7RNA聚合酶位点(每条引物5’端的T7序列)。基于与来自其他昆虫(主要是黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster))的已知致死基因的同源性来选择第二组cDNA克隆。基于蛋白酶体功能的参与来测试第三组基因。对这些基因的识别基于渐进同源性搜索，所述渐进同源性搜索开始于与拟谷盗属(Tribolium)基因组数据库交叉引用的人类中识别出的蛋白酶体基因列表。然后使用来自拟谷盗属的命中结果来解析西方玉米根虫序列数据库。蛋白酶体基因被归类为26S亚基非ATP酶、26S亚基ATP酶、α型和β型基因。
通过PCR然后体外转录5(IVT)以产生长双链RNA，来产生WCRW基因的区域。将IVT反应产物在凝胶中定量并掺入到人工昆虫饵料中以用于如下所述的第一轮IVT筛选(FIS)。
昆虫生物测定法
将dsRNA以50ppm的最终浓度掺入96孔微量滴定板格式中的标准WCRW人工饵料中。将5μl的IVT反应物(300ng/ul)加入96孔微量滴定板的给定孔中。将25μl熔化的低熔点西方玉米根虫饵料加入样品中，并在定轨振荡器上振摇，以混合样品和饵料。一旦饵料已凝固，就用八个孔装上每个RNA样品。将预先调节的1龄WCRW(在转移到测试材料之前将新孵昆虫置于中性饵料上24小时)以3-5只昆虫/孔的比率加入96孔微量滴定板中。用聚酯薄膜将板密封，然后使用超细昆虫收集销在微量滴定板的每个孔上方穿刺所述聚酯薄膜两次。为了防止饵料干燥，首先将板与稍微潮湿的布料一起置于塑料袋内，并且将袋置于设定为28℃和70％RH的培养箱内。在7天后对测定法的死亡率和发育迟缓影响进行评分，并且基于对每种类别的影响所赋的数值来测定平均值(3＝死亡，2＝严重发育迟缓，1＝发育迟缓，0＝无影响)。这个及所有饵料测定法表格中报告的数值反映所有观察结果的平均评分。评分3表示所有观察结果中完全死亡。评分2.5将指示一半孔显示死亡并且一半孔被评分为严重发育迟缓。这些测定结果可见于表1A。
表1中列出了编码使用实例1中所述的测定法证实具有对于玉米根虫的杀昆虫活性(大于1.5的平均评分)的双链RNA的DNA序列。为了识别cDNA的全长或者RNAi活性靶基因的全长开放阅读框，进行EST克隆的全长插入测序和中肠RNA样品的转录组分析。表1中也列出了包含全长cDNA或更长转录物的所有靶转录物的序列。这些序列中的一些用于RNAi活性片段搜索。
实例2.具有杀昆虫活性的序列
以下示出了编码使用实例1中所述的测定法证实具有对于玉米根虫的杀昆虫活性的双链RNA的DNA序列。靶多核苷酸的非限制性例子在下表1A和B及以下序列中示出：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、15401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，包括例如，SEQIDNO：1、9、37、45、49、61、65、77、101、113、137、141、145、149、153、157、169、173、181、185、189、205、217、225、233、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、5684、685、686、687、688、689、690、691、692、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列，以及SEQIDNO：4、140、144、148、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、以及它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。
有效dsRNA的亚区被设计为改善饵料中的杀昆虫活性以及跗基节中的dsRNA表达。这些片段以与上述初始FIS测定法相同的方式进行测定。对表现出严重影响幼虫表型(死亡或严重生长迟缓)的区域进一步进行非正式抑制浓度(IC50)测定法。IC50测定法所用的剂量从50ppm开始并以1/2逐步稀释朝下扩展到25、12.5、6、3、1.5和0.75pppm。对于每个比率都包括12个观察结果。测定方法与上文对于初步筛选所述的方法相同。抑制的计算依赖于对死亡和严重发育迟缓两者的评分。对所选的片段进一步进行正式剂量响应测定法，其中对LC50和IC50值两者进行计算并描述于表2(SeqNo.561至728)中。这些测定法包括初始范围寻找测定法，然后是对于所选范围的剂量响应测定法，包括实验的3次重复。对证实IC50值低于2ppm的片段进一步进行植物转化载体构建。
蛋白酶体α亚基3型(PAT3)靶基因用作基因与构建体优化的模型。作为第一步骤，将基因分成1/3、1/6和1/12大小的片段(f)。另外，f11-13表示跨越前四个1/6片段的边界的区段。图5提供PAT3的各片段的示意图。
从活性RNAi基因靶标中识别出植物偏好的片段，并在dsRNA人工饵料测定法中进行测试。这些植物偏好的区域的选择基于避开去稳定元件和基序或者具有不合适碱基组成的区域。还采用同源性评估来避开可能的非靶标生物体。最后，具有150-250bp尺寸范围的片段是优选的。在选择片段时考虑所有规则，但不基于任何一种规则从考虑中排除片段。表2包括初始FIS样品和后续片段杀昆虫测定法的数据。对所选样品进一步进行IC50和LC50测定。
实例3.从其他昆虫中识别RNAi活性靶标
为了从其他重要的玉米害虫或非靶标昆虫中识别RNAi活性基因，使用来自北方玉米根虫(Diabroticabarberi)、南方玉米根虫(Diabroticaundecimpunctata)、墨西哥豆瓢虫(Epilachnavarivestis)、科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、狡诈花蝽(Oriusinsidiosus)和褐斑瓢虫(Coleomegillamaculata，[CMAC])的3龄幼虫完成转录组实验。RNAi活性前导序列的同源转录物列于表3(SeqNo.693至723)中。该序列数据对于设计抑制靶害虫基因并避免下调非靶昆虫中的相同基因的片段是重要的。
实例4.WCRW中肠中的杀昆虫RNA靶标
通过随机cDNAFIS筛选来识别两个RNAi活性靶标Ryanr和HP2(表1和表2)。在此前的FIS筛选(US2011/0054007A1)中识别出了Ryanr。这些靶标的片段显示出了非常强的杀昆虫活性。同源搜索揭示了Ryanr和HP2分别显示出与果蝇Ssk和Mesh具有54％和49％同一性。果蝇中肠中的间壁连接形成需要Mesh-Ssk蛋白复合物。参见图4中的WCRWRyanr和果蝇Ssk的氨基酸序列比对。
实例5.玉蜀黍的转化
用质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉蜀黍胚，所述质粒包含有效连接到组织特异性、组织选择性或组成型启动子的本发明沉默元件以及赋予针对除草剂双丙氨膦的抗性的选择性标记基因PAT(Wohllebenetal.(1988)Gene70：25-37(Wohlleben等人，1988年，《基因》，第70卷，第25-37页))。在一个实施例中，构建体将表达表3中示出的靶序列的长双链RNA。这种构建体可连接到UBIZM启动子。或者，在单独的质粒上提供该选择性标记基因。如下进行转化。培养基配方见下文。
靶标组织的制备
将穗去壳并在30％Clorox漂白剂加0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。
制备质粒载体，所述质粒载体包含有效连接到组织特异性、组织选择性或组成型启动子的所关注沉默元件。使用如下的CaCl2沉淀程序将该质粒DNA加上含有PAT选择标记的质粒DNA沉淀于1.1μm(平均直径)的钨小球上：100μl水中的所制备的钨粒子；10μl(1μg)TrisEDTA缓冲液中的DNA(总计1μgDNA)；100μl2.5MCaCl2；以及10μl0.1M亚精胺。
将每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时保持在多管式涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml100％乙醇洗涤，离心30秒。再次移除液体，将105μl100％乙醇加至最终的钨粒子小球。为了粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。
将样品板在粒子枪中以水平#4进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。
在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2星期进行传代培养。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行萌发并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的平板衬垫(insertsinflats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1星期，随后在温室中再生长1-2个星期，然后转移到经典的600个盆(1.6加仑)并生长至成熟。
针对合适标记诸如鞘翅目植物害虫如叶甲属植物害虫的防治对植物进行监测并评分，并且这些植物具有杀昆虫活性。例如，给西方玉米根虫幼虫(WCR，Diabroticavirgifera)喂食R0植物根。将转基因玉米根转移到装有包含用于体外选择的抗生素和草甘膦的MSOD培养基的培养皿中。用细尖画笔在每个培养皿中以每条根两个WCR幼虫进行侵染。用封口膜密封培养皿以防止幼虫逃出。使测定法处于27℃、60％RHPercival培养箱不完全黑暗中。监测污染和幼虫质量。在喂食根组织六天后，将幼虫转移到96孔板中的WCR饵料中。使幼虫摄食饵料八天，使得全部测定法长达十四天。记录幼虫生物量和存活率以进行分析。对幼虫生物量数据进行单因素方差分析和邓奈特检验以查看与未转化阴性对照(HC69)相比的统计学显著性。在摄食两个事件之后，测量WCR幼虫发育迟缓，并且与摄食阴性对照植物的幼虫的生长进行比较。
在其他测定法中，在达到适当尺寸之后，将所生成的转基因玉米植物(R0)种植在包含Metromix土壤的10英寸盆中。当植物达到V4生长阶段时，大约400只西方玉米根虫(WCR，Diabroticavirgifera)卵侵染到根区中。相同基因型的非转基因玉米在相似生长阶段被侵染，以用作阴性对照。预先温育卵，使其在侵染24小时内发生孵化。使幼虫摄食根系统3周。将植物从土壤移除并洗净，以使得可针对幼虫摄食来评估根。使用结节损伤标度(NIS)对根损伤进行评级，以对损伤水平进行评分，其中0指示无损伤，1指示根的一个结节被啃食到1.5英寸内，2指示2个结节被啃食，而3指示3个结节被啃食。因为用于评估的植物在转化后直接取自组织培养，并且因为转化事件是唯一的，此时每个事件只评估单个植物。测定法中存在幼虫摄食的迹象或症状的植物指示获得成功的侵染。平均而言阴性对照植物根遭到中等到严重的损伤，而转基因植物的根提供幼虫摄食的实质控制，且玉米根虫结节损伤评分(“CRWNIS”)为约0.2或更少。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/lN6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4-D(用KOH调至pH5.8后用去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)(MurashigeandSkoog(1962)Physiol.Plant.15：473(Murashige和Skoog，1962年，《植物生理学》，第15卷，第473页))、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调至pH5.6后用精制去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/lMS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH5.6后用精制去离子水定容)和6g/l细菌培养用琼脂(在用精制去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。
实例6.农杆菌介导的玉蜀黍转化
对于包含如本文所公开的沉默元件的所公开多核苷酸构建体进行的农杆菌介导的玉蜀黍转化，采用了Zhao的方法(美国专利No.5,981,840和国际专利公布No.WO1998/32326，据此将它们的内容以引用方式并入)。简单而言，从玉蜀黍分离出未成熟胚并使胚接触农杆菌的悬浮液，其中该细菌能够将包含如本文所公开的沉默元件的所需所公开多核苷酸构建体(例如，图6中所示的多核苷酸构建体)转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在这个步骤中，将未成熟胚浸入农杆菌悬液中以启动接种。使胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上进行培养。在这个共培养期之后，可以有一个任选的静息步骤。在这个静息步骤中，在不添加植物转化体选择剂的情况下将胚在至少一种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下进行温育(步骤3：静息步骤)。为了消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息期，将未成熟胚在含有抗生素但不含选择剂的固体培养基上培养。接着，在含有选择剂的培养基上培养接种的胚，并且回收生长的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚，从而导致转化细胞的选择性生长。然后使愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并且在固体培养基上培养在选择性培养基上培育的愈伤组织以便再生植株。
实例7：沉默元件在玉蜀黍中的表达
使用上文在实例6中所述的转化技术在玉蜀黍植物中以发夹形式表达沉默元件，并且测试所述植物对于玉米根虫的杀昆虫活性。来自这些研究的数据示于表4(图7)中。
用包含表4(图7)中所列的基因的质粒转化玉蜀黍植物，并且将表达沉默元件的植物从272V盘移栽到装有FafardSuperfine盆栽混合物的温室浅箱中。在移栽后大约10至14天，将植物(此时处于生长阶段V2-V3)移栽到装有FafardSuperfine盆栽混合物的树盆中。在温室发送日期后14天时，以200个西方玉米根虫(WCRW)卵/植物对植物进行侵染。对于随后组，在第一次侵染后7天以200个WCRW卵/植物进行第二次侵染，并且在第二次侵染后14天进行评分。在侵染后21天，使用CRWNIS对植物进行评分。将≤0.5评分的那些植物移栽到装有SB300的大盆中以便得到T1种子。表4和图8中的数据表明，与非转基因HC6对照植物相比，PHP58050、PHP61599、PHP68041、PHP68142和PHP68043显示显著减小的CRWNIS。
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除非上下文另外明确规定，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该蛋白”包括提及一种或多种蛋白以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。除非另外明确指明，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
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虽然为了清楚理解的目的已通过例证和实例的方式详细地描述的前述发明，但一些变化和修改可在所附权利要求的范围内实施。

Claims (39)

1.一种表达盒，所述表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(a)包含如下任何一者的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；
(b)与如下任何一个核苷酸具有至少90％序列同一性的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；或者
(c)包含如下任何一者的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；
其中所述多核苷酸编码具有针对鞘翅目植物害虫的杀昆虫活性的沉默元件。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述鞘翅目植物害虫为叶甲属(Diabrotica)植物害虫。
3.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述多核苷酸有效连接到异源启动子。
4.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述多核苷酸被表达为双链RNA。
5.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述多核苷酸包含沉默元件，所述沉默元件被表达为发夹RNA。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其中所述沉默元件依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与如下任何一者中示出的靶序列具有至少90％序列互补性的至少约19个核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；
(b)所述第二片段包含足够长度的环以允许所述沉默元件被转录为发夹RNA；以及，
(c)所述第三片段包含与所述第一片段具有至少85％互补性的至少约19个核苷酸。
7.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述多核苷酸的旁侧是在所述多核苷酸的一个末端处的第一有效连接的趋同启动子以及在所述多核苷酸的相对末端处的第二有效连接的趋同启动子，其中所述第一趋同启动子和所述第二趋同启动子能够驱动所述多核苷酸的表达。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1所述的异源表达盒。
9.一种植物细胞，所述植物细胞已在其基因组中稳定掺入了包含沉默元件的异源多核苷酸，其中所述沉默元件包含
(a)如下任何一者的至少19个连续核苷酸的片段：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；或者，
(b)与如下任何一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；其中所述沉默元件在被鞘翅目植物害虫摄取时能降低所述鞘翅目植物害虫中的靶序列水平并从而防治所述鞘翅目植物害虫。
10.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述鞘翅目植物害虫为叶甲属(Diabrotica)植物害虫。
11.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述沉默元件包含，
(a)包含如下任何一者示出的序列的多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；或者
(b)包含如下任何一者示出的序列的至少130个连续核苷酸的多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。
12.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述植物细胞包含根据权利要求6所述的表达盒。
13.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述沉默元件表达双链RNA。
14.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述沉默元件表达发夹RNA。
15.根据权利要求14所述的植物细胞，其中包含所述沉默元件的所述多核苷酸依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与如下任何一者中示出的靶序列具有至少90％序列互补性的至少约19个核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；
(b)所述第二片段包含足够长度的环以允许所述沉默元件被转录为发夹RNA；以及，
(c)所述第三片段包含与所述第一片段具有至少85％互补性的至少约19个核苷酸。
16.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述沉默元件有效连接到异源启动子。
17.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
18.根据权利要求17所述的植物细胞，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、大麦、粟、小麦或水稻。
19.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
20.根据权利要求19所述的植物细胞，其中所述植物是大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。
21.一种植物或植物部分，所述植物或植物部分包含根据权利要求9所述的植物细胞。
22.一种转基因种子，所述转基因种子来自根据权利要求21所述的植物。
23.一种用于防治鞘翅目植物害虫的方法，所述方法包括给鞘翅目植物害虫喂食包含沉默元件的组合物，其中所述沉默元件在被所述鞘翅目植物害虫摄取时能降低靶鞘翅目植物害虫序列的水平并从而防治所述鞘翅目植物害虫，其中所述靶鞘翅目植物害虫序列包含与如下任何一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述鞘翅目植物害虫包括叶甲属(Diabrotica)植物害虫。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述沉默元件包含：
(a)如下任何一者的至少19个连续核苷酸的片段：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；或者，
(b)与如下任何一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述叶甲属(Diabrotica)植物害虫包括西方玉米根虫(D.virgiferavirgifera)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)、南美叶甲(D.speciosa)、北方玉米根虫(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.virgiferazeae)或黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctatahowardi)。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述组合物包含植物或植物部分，所述植物或植物部分已在其基因组中稳定掺入了包含所述沉默元件的多核苷酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述沉默元件包含
(a)包含如下任何一者示出的序列的有义或反义序列的多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；
(b)包含与如下任何一者示出的序列具有至少95％序列同一性的序列的有义或反义序列的多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；或者
(c)包含具有如下任何一者的至少130个连续核苷酸的序列的有义或反义序列的多核苷酸：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述沉默元件表达双链RNA。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
31.根据权利要求30所述的方法，其中包含所述沉默元件的所述多核苷酸依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中
(a)所述第一片段包含与所述靶多核苷酸具有至少90％序列互补性的至少约19个核苷酸；
(b)所述第二片段包含足够长度的环以允许所述沉默元件被转录为发夹RNA；以及，
(c)所述第三片段包含与所述第一片段具有至少85％互补性的至少约19个核苷酸。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述沉默元件有效连接到异源启动子。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述沉默元件的旁侧是在所述沉默元件的一个末端处的第一有效连接的趋同启动子以及在所述多核苷酸的相对末端处的第二有效连接的趋同启动子，其中所述第一趋同启动子和所述第二趋同启动子能够驱动所述沉默元件的表达。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、大麦、粟、小麦或水稻。
36.根据权利要求27所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述植物是大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或棉花。
38.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：
(a)包含如下任何一者的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；
(b)与如下任何一个核苷酸具有至少90％序列同一性的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；或者
(c)包含如下任何一者的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQIDNO：1、4、5、8、9、12、13、16、17、20、21、24、25、28、29、32、33、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、54、55、56、57、60、61、64、65、68、69、72、73、76、77、80、81、84、85、88、89、92、93、96、97、100、101、104、105、108、109、112、113、116、117、120、121、124、125、128、129、132、133、136、137、140、141、144、145、148、149、152、153、156、157、160、161、164、165、168、169、172、173、176、177、180、181、184、185、188、189、192、193、196、197、200、201、204、205、208、209、212、213、216、217、220、221、224、225、228、229、232、233、236、237、240、241、244、245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272、273、276、277、280、281、284、285、288、289、292、293、296、297、300、301、304、305、308、309、312、313、316、317、320、321、324、325、328、329、332、333、336、337、340、341、344、345、348、349、352、353、356、357、360、361、364、365、368、369、372、373、376、377、380、381、384、385、388、389、392、393、396、397、400、401、404、405、408、409、412、413、416、417、420、421、424、425、428、429、432、433、436、437、440、441、444、445、448、449、452、453、456、457、460、461、464、465、468、469、472、473、476、477、480、481、484、485、488、489、492、493、496、497、500、501、504、505、508、509、512、513、516、517、520、521、524、525、528、529、532、533、536、537、540、541、544、545、548、549、552、553、556、557、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、700、701、702、703、706、707、708、709、712、713、714、715、718、719、720、721、724、725、726、727、728、或它们的活性变体和片段、以及它们的互补序列；
其中所述多核苷酸编码具有针对鞘翅目植物害虫的杀昆虫活性的沉默元件。
39.根据权利要求38所述的分离的多核苷酸，其中所述鞘翅目植物害虫为叶甲属(Diabrotica)植物害虫。
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