ES2534581T3

ES2534581T3 - Gen AXMI-150 de la delta-endotoxina y métodos para su uso

Info

Publication number: ES2534581T3
Application number: ES09804360.7T
Authority: ES
Inventors: Kimberly S. Sampson; Daniel J. Tomso; Volker Heinrichs
Original assignee: Athenix Corp
Current assignee: Athenix Corp
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2015-04-24
Anticipated expiration: 2029-12-23
Also published as: UY32361A; US8084416B2; BRPI0923159A2; EP2379724B1; ZA201104532B; WO2010075498A3; EA201170717A1; AR075114A1; US20100160231A1; CN102388143A; CO6400155A2; EA019574B1; US20120073016A1; US8791326B2; MX2011006694A; CA2747826A1; EP2379724A2; WO2010075498A2; UY38535A

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen AXMI-150 de la delta-endotoxina y métodos para su uso.

Campo de la invención 5

La invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

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Antecedentes de la invención

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva formadora de esporas que habita en el suelo, caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero inocuas para plantas y otros organismos no considerados dianas. Por esta razón, las 15 composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas se pueden usar como insecticidas aceptables para el medio ambiente para controlar las plagas agrícolas de insectos o los insectos vectores para varias enfermedades humanas o animales.

Los cristales proteínicos (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida 20 contra las larvas predominantemente de lepidópteros, dípteros y coleópteros. Estas proteínas han mostrado también actividad contra los órdenes de plagas de himenópteros, homópteros, ftirápteros, malófagos y ácaros, así como otros órdenes de invertebrados, tales como nematelmintos, platelmintos y sarcomastigóforos (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis Family Tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Estas proteínas se clasificaron originalmente como CryI a CryV basándose principalmente en su actividad insecticida. Las 25 clases principales fueron la específica de lepidópteros (I), la específica de lepidópteros y dípteros (II), la específica de coleópteros (III), la específica de dípteros (IV) y la específica de nematodos (V) y (VI). Las proteínas se clasificaron además en subfamilias; a las proteínas más estrechamente relacionadas con cada familia se le asignaron letras consecutivas tales como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. A las proteínas todavía más estrechamente relacionadas dentro de cada grupo se les dieron nombres tales como Cry1C1, Gy1C2, etc. 30

Recientemente se ha descrito una nueva nomenclatura para los genes Cry basada en la homología de las secuencias de aminoácidos en lugar de en la especificidad del insecto diana (Crickmore et al., (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807 - 813). En la nueva clasificación, a cada toxina se le asigna un único nombre que incorpora una categoría principal (un número arábigo), una categoría secundaria (una letra mayúscula), una categoría terciaria 35 (una letra minúscula) y una categoría cuaternaria (otro número arábigo). En la nueva clasificación, en la categoría principal los números romanos han sido sustituidos por números arábigos. Las proteínas con una identidad de secuencia inferior al 45 % tienen diferentes categorías principales y los criterios para las categorías secundaria y terciaria son 78 % y 95 %, respectivamente.

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La proteína cristal no presenta actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por proteasas en el tracto digestivo del insecto en una molécula tóxica activa. (Höfte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242 - 255). Esta toxina se une a receptores localizados en el borde en cepillo apical en el intestino medio de las larvas diana y se inserta en la membrana apical creando canales o poros iónicos que producen la muerte de la larva. 45

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193 - 199). El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y está implicado en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en 50 dos láminas beta antiparalelas en formación de “remolino” (de Maagd et al., 2001, citado anteriormente). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor y, por tanto, se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

El documento WO 2005/107383 se refiere a proteínas insecticidas secretadas y a composiciones génicas de Bacillus 55 thuringiensis y a usos de las mismas.

Debido a la devastación que los insectos pueden conferir y la mejora en el rendimiento al controlar las plagas de insectos, existe una necesidad continua de descubrir nuevas formas de toxinas plaguicidas.

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Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir actividad plaguicida a las bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. También se hace referencia a composiciones que incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos plaguicidas e insecticidas, vectores que comprenden dichas moléculas 65 de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones incluyen las secuencias de

polipéptidos plaguicidas. Las secuencias de nucleótidos se pueden utilizar en construcciones de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para su expresión en un organismo, incluyendo, entre otros, un microorganismo o una planta. También se hace referencia a composiciones que comprenden bacterias transformadas, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. 5

En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína plaguicida. Adicionalmente, están incluidas las secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína plaguicida. En particular, esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2 o una secuencia de nucleótidos 10 expuesta en las SEC ID Nº: 1, 3, 4, 5, 6 o 7. También se hace referencia a las secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención o que hibridan con una secuencia de la invención.

Se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención y para usar dichos polipéptidos para controlar o destruir una plaga de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros. También se hace referencia a 15 métodos y kits para detectar los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos con mayor resistencia o tolerancia a las plagas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas 20 que tienen actividad plaguicida, o para detectar la presencia de proteínas o ácidos nucleicos plaguicidas en los productos u organismos.

Por consiguiente, esta invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de ácidos nucleicos que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia 25 de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y 30

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

La invención proporciona además:

35

 un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, preferentemente que comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo;

 una célula huésped que contiene el vector de la invención, preferentemente que es:

(a) una célula huésped bacteriana; o 40

(b) una célula vegetal;

 una planta transgénica que comprende la célula huésped vegetal de la invención, preferentemente donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza de semilla 45 oleaginosa; y

 una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de la invención.

La invención proporciona adicionalmente un polipéptido con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en: 50

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2;

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

c) un polipéptido que está codificado por la SEC ID Nº: 1, 55

preferentemente que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

La invención proporciona adicionalmente una composición que comprende el polipéptido de la invención, donde:

60

(a) dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, polvo fino, bolita, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, y solución;

(b) dicha composición se puede obtener mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células bacterianas; o

(c) dicha composición comprende de 1 % a 99 % en peso de dicho polipéptido. 65

La invención también proporciona:

 un método para controlar una población de plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipéptido de la invención. 5

 un método para destruir una población de plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha plaga con, o alimentar a dicha plaga con, una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipéptido de la invención; y

 un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en las condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido. 10

La invención proporciona adicionalmente una planta que tiene incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

15

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; 20

donde dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal,

preferentemente donde dicha planta es una célula vegetal.

25

La invención también proporciona adicionalmente un método para proteger una planta de una plaga, que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

30

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 35 preferentemente donde dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros.

Descripción detallada

40

Esta invención se refiere a composiciones y métodos para regular la resistencia o tolerancia a las plagas en los organismos, particularmente plantas o células vegetales. Por “resistencia” se pretende decir que la plaga (por ejemplo, insecto) muere tras la ingestión u otro contacto con los polipéptidos de la invención. Por "tolerancia” se pretende decir una alteración o reducción del movimiento, alimentación, reproducción u otras funciones de la plaga. Los métodos implican transformar organismos con una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína 45 plaguicida de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para la preparación de plantas y microorganismos que poseen actividad plaguicida. Por lo tanto, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformados. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas plaguicidas de Bacillus. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la posterior transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o 50 parcialmente homólogos) y para la generación de proteínas plaguicidas alteradas mediante métodos conocidos en la técnica, tales como intercambio de dominios o barajado de ADN. Las proteínas encuentran uso en el control o eliminación de poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, dípteros y nematodos, y para la producción de composiciones con actividad plaguicida.

55

Por “toxina plaguicida” o “proteína plaguicida" se pretende decir una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, entre otras, miembros de los órdenes de lepidópteros, dípteros y coleópteros, o del filo de los nematodos, o una proteína que tiene homología con dicha proteína. Las proteínas plaguicidas se han aislado de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas plaguicidas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias de nucleótidos de longitud 60 completa divulgadas en el presente documento y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea por el uso de un sitio de inicio aguas abajo alternativo, o debido a un procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad plaguicida. El procesamiento se puede producir en el organismo donde se expresa la proteína, o en la plaga después de la ingestión de la proteína.

65

Las proteínas plaguicidas abarcan delta-endotoxinas. Las delta-endotoxinas incluyen las proteínas identificadas como cry1 a cry43, cyt1 y cyt2, y la toxina de tipo Cyt. Actualmente hay más de 250 especies conocidas de delta-endotoxinas con una amplia gama de especificidades y toxicidades. Para ver una lista extensa véase Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807 - 813, y para ver actualizaciones periódicas véase Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index. 5

Por tanto, en el presente documento se proporcionan nuevas secuencias de nucleótidos aisladas que confieren actividad plaguicida. Estas secuencias de nucleótidos aislados codifican polipéptidos con homología con delta-endotoxinas o toxinas binarias conocidas. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas plaguicidas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite que las células controlen o eliminen las 10 plagas que la ingieren.

Moléculas de ácido nucleico aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden 15 secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y polipéptidos plaguicidas o porciones biológicamente activas de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas con regiones de homología de secuencia. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de ácido nucleico" está destinada a incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN 20 o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, pero preferentemente es ADN de cadena doble.

Una secuencia de ácido nucleico (o ADN) "aislada" se usa en el presente documento para hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no está en su ambiente natural, por ejemplo en una célula huésped 25 recombinante bacteriana o vegetal. En algunas realizaciones, un ácido nucleico “aislado” carece de secuencias (preferentemente secuencias que codifican proteínas) que flanquean de forma natural al ácido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Para los fines de la invención, "aislado" cuando se utiliza para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias realizaciones, la delta-endotoxina aislada que 30 codifica la molécula de ácido nucleico puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias nucleotídicas que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. En varias realizaciones, una proteína delta-endotoxina que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, o 5 % (en peso seco) de la proteína que no es delta-endotoxina (también 35 denominada en el documento "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de esta invención incluyen la secuencia expuesta en las SEC ID Nº: 1, 3, 4, 5, 6 o 7, variantes y fragmentos que tienen una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 y que tienen actividad plaguicida, así como complementos de los 40 mismos. Por “complemento” se quiere decir una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria con una secuencia de nucleótidos dada de forma que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos dada para formar de este modo un dúplex estable. La correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína plaguicida codificada por esta secuencia de nucleótidos se expone en loa SEC ID Nº: 2 o las secuencias de aminoácidos AXMI-004 descritas en la patente de EE.UU. Nº 7.355.099 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 12/209.354, presentada el 45 12 de septiembre de 2008 titulada “Genes sintéticos AXMI-004 de la delta-endotoxina y métodos para su uso”, publicada como US 2009/0099081.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican proteínas plaguicidas también se incluyen en esta invención, donde son al menos un 95 % idénticas a la secuencia de 50 aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y tienen actividad plaguicida. Por “fragmento" se quiere decir una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos codifica una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.350, 1.400 55 nucleótidos contiguos o hasta el número de nucleótidos presente e una secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica una proteína plaguicida divulgada en el presente documento en función del uso pretendido. Por nucléotidos “contiguos” se pretende decir residuos de nucleótidos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de esta invención codificarán fragmentos de proteínas que conservan la actividad biológica de la proteína plaguicida y, por lo tanto, conservan la actividad plaguicida. Por 60 "conserva la actividad" se pretende decir que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de la actividad plaguicida de la proteína plaguicida. En una realización, la actividad plaguicida es actividad coleopterocida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad lepidopterocida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad nematocida. En otra realización, la actividad plaguicida es actividad nematocida. Los métodos para medir la actividad plaguicida 65 son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 - 2485;

Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199 - 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 - 293; y la patente de EE.UU. Nº 5.743.477.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 5 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contiguos o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína plaguicida de longitud completa de la invención.

Proteínas plaguicidas preferidas de esta invención están codificados por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº: 1, 3, 4, 5, 6 o 7. Por “suficientemente 10 idéntica" se quiere decir una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineamiento descritos en el presente documento utilizando parámetros convencionales. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración 15 de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad 20 = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones solapantes) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otra realización, el porcentaje de identidad se calcularon la totalidad de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia divulgada en el presente documento como cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 3, 4, 5, 6 o 7). El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas a continuación permitiendo o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje 25 de identidad, se cuentan típicamente emparejamientos exactos.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:2264, modificado como en Karlin y 30 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 - 5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud del texto= 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico de tipo plaguicida de la invención. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud del texto= 3, para obtener secuencias de nucleótidos 35 homólogas a las moléculas de las proteínas plaguicidas de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos se puede usar Gapped BLAST (en BLAST 2,0) tal como se describe en Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, se puede usar PSI-BLAST para realizar una búsqueda reiterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) citado anteriormente. Al usar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST se pueden usar los parámetros preseleccionados de los 40 respectivos programas (p. ej., BLASTX y BLASTN). La alineación también se puede realizar manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673 - 4680). ClustalW compara secuencias y alinea la 45 totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN y, por lo tanto, puede proporcionar datos acerca de la conservación de la secuencia de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de soporte lógico de análisis de ADN/aminoácidos disponibles en el mercado, tales como el módulo ALIGNX del Grupo de programas Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después del alineamiento de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede evaluar el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un 50 ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de alineamientos ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la evaluación de la similitud y la identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del Paquete de software GCG Wisconsin Genetics, versión 10 55 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE.UU.). Al usar el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de residuos de pesos PAM 120, una penalización por la longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

A menos que se indique lo contrario, se podrá utilizar GAP Versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman y 60 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443 - 453, para determinar la identidad o similitud de secuencia utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando un peso del hueco de 50 y un peso de la longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un peso por hueco de 8 y un peso por longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62. También se pueden utilizar programas equivalentes. Por “programa equivalente" se 65 quiere decir cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión,

genera un alineamiento que tiene emparejamientos de residuos de nucleótidos idénticos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con el alineamiento correspondiente generado por GAP, versión 10. La invención también abarca variantes de moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y actividad plaguicida. “Variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican proteína plaguicida incluyen aquellas 5 secuencias que codifican las proteínas plaguicidas divulgadas en el presente documento, pero que difieren de forma conservadora debido a la degeneración del código genético, así como las que son suficientemente idénticas como se ha tratado anteriormente. Las variantes alélicas naturales se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas como, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación, como se indica más adelante. Las secuencias de nucléotidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos 10 derivados sintéticamente que se han generado, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitio pero que todavía codifican las proteínas plaguicidas divulgadas en esta invención como se trata más adelante. Las proteínas variantes abarcadas por esta invención son biológicamente activas, es decir siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad plaguicida. Por "conserva la actividad" se pretende decir que la variante tendrá al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 80 % de la 15 actividad plaguicida de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480 - 2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199 - 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 - 293; y la patente de EE.UU. Nº 5.743.477.

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El experto en la técnica apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención que conducen de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas plaguicidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas variantes se pueden crear introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, de tal manera que 25 se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Tales secuencias de nucleótidos variantes también están abarcadas por esta invención, en las que tiene una identidad de al menos 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y actividad plaguicida. 30

Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse desde la secuencia de tipo salvaje de una proteína plaguicida sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos 35 conservadora" es una en la cual se reemplaza el residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales 40 no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales 45 conservados (véase, por ejemplo Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193 - 199). El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y está implicado en la inserción en la membrana y la formación de poros. El dominio II consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de “remolino” (de Maagd et al., 2001, citado anteriormente). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión al receptor y, por tanto, se consideran 50 determinantes de la especificidad de la toxina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en regiones no conservadas que mantienen la función. En general, dichas sustituciones no se harían para residuos de aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, en donde tales residuos son esenciales para la actividad 55 de la proteína. Ejemplos de residuos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, los residuos que son idénticos en una alineación de proteínas homólogas). Ejemplos de los residuos que se conservan, pero que pueden permitir sustituciones conservadoras de aminoácidos y todavía mantener la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que 60 tienen sólo sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que solo tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en el alineamiento de proteínas homólogas). Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que las variantes funcionales pueden tener alteraciones mínimas conservadas o no conservadas en los residuos conservados. 65

Como alternativa, las secuencias de nucleótidos variantes se pueden realizar mediante la introducción de mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden someterse a detección selectiva para determinar su capacidad para conferir actividad de plaguicida para identificar mutantes que conservan la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante y la actividad de la proteína se puede determinar 5 utilizando técnicas de análisis convencionales.

Utilizando métodos tales como PCR, hibridación, y similares se pueden identificar las correspondiente secuencias de plaguicidas, teniendo dichas secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véanse, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos de plaguicida se puede utilizar para la detección selectiva genotecas de ADNc o genómicas. Generalmente, en la técnica se conocen métodos para la 15 construcción de tales genotecas de ADNc y genómicas y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden marcarse con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tales como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Las sondas para hibridación se pueden preparar mediante marcaje con oligonucleótidos 20 sintéticos basados en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína plaguicida conocida divulgada en el presente documento. Adicionalmente se pueden utilizar cebadores degenerados diseñados sobre la base de los nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 25 100, 125, 150, 175 o 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida de la invención o un fragmento o variante de la misma. Generalmente, en la técnica se conocen métodos para la preparación de sondas para la hibridación y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente.

Por ejemplo, la totalidad de una secuencia de proteína plaguicida divulgada en el presente documento, o una o más 30 porciones del mismo, se puede usar como sonda capaz de hibridar específicamente con las correspondientes secuencias de tipo proteína plaguicida y ARN mensajeros. Para conseguir una hibridación específica en diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen, preferentemente, una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos o una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleótidos. Dichas sondas se pueden usar para amplificar las correspondientes secuencias plaguicidas de un organismo escogido mediante PCR. 35 Esta técnica se puede usar para aislar secuencias de codificación adicionales a partir de un organismo deseado o como ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen detección selectiva de hibridación de bibliotecas de ADN sembrado (bien placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). 40

La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo en condiciones rigurosas. Por “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” se quiere decir condiciones en las que una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente superior que con otras secuencias (p. ej., al menos 2 veces sobre el basal). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias distintas. Controlando la 45 rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, las secuencias diana que son 100 % complementarias con la sonda se pueden identificar (sondaje homólogo). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para permitir algunos apareamientos erróneos en las secuencias de modo que se detectan grados menores de similitud (sondaje heterólogo). En general, una sonda tiene una longitud de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos, preferentemente menos de 500 nucleótidos de longitud. 50

Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquéllas en las que la concentración de sales es inferior a aproximadamente 1,5M de ion Na, normalmente una concentración del ion Na (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0M a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 ºC para las sondas cortas (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60 ºC para las sondas largas (p. ej., de más de 50 55 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden conseguir con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Condiciones de rigurosidad baja de ejemplo incluyen hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, NaCl 1M, 1 % de SDS (dodecilsulfato sódico) a 37 ºC y un lavado en de 1X a 2X de SSC (20 x SSC= NaCl 3,0,0M/citrato sódico 0,3M) a una temperatura de 50 a 55 ºC. Condiciones de rigurosidad moderada de ejemplo incluyen hibridación en de 40 a 45 % de formamida, NaCl 1M, 1 % de SDS a 37 ºC y un 60 lavado en de 0,5X a 1X de SSC a una temperatura de 55 a 60 ºC. Condiciones de rigurosidad alta de ejemplo incluyen hibridación en 50 % de formamida, NaCl 1M, 1 % de SDS a 37 ºC y un lavado en de 0 X SSC a una temperatura de 60 a 65 ºC. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1 % de SDS. La duración de la hibridación es, en general, menor de aproximadamente 24 horas, normalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. 65

Normalmente, la especificidad es función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la Tm puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) 0,61 (% forma) 500/l; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % forma es el porcentaje de formamida en la solución 5 de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (a la fuerza iónica y el pH definidos) a la cual el 50 % de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente apareada La Tm se reduce en aproximadamente 1 ºC por cada 1 % de apareamiento erróneo; por tanto, la Tm de hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad ≥ 90 %, la Tm se puede reducir 10 ºC. En general, las condiciones 10 rigurosas se seleccionan de modo que sea 5 ºC menor que el punto de fusión térmica ™ para la secuencia específica y su complementaria a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, condiciones intensamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones poco rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 15 14, 15, o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos entenderán que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado de resultados de apareamientos incorrectos en una Tm inferior a 45 ºC (solución acosa) o 32 ºC (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de modo que se pueda usar una temperatura superior. Se puede encontrar una extensa guía 20 para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). 25

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Las proteínas plaguicidas también están abarcadas por esta invención. Mediante "proteína plaguicida" se quiere decir una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2. También se proporcionan 30 fragmentos, porciones biológicamente activas, y variantes de los mismas que tienen una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y actividad plaguicida y se pueden usar para poner en práctica los métodos de esta invención. Una "proteína aislada" se usa hacer referencia a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped vegetal o bacteriana recombinante.

35

"Fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: y que presentan actividad plaguicida. Una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 1010, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluar su actividad plaguicida. Los métodos para 40 medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 - 2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199 - 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 - 293; y la patente de EE.UU. Nº 5.743.477. Según se utiliza en la presente memoria, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 2. La invención abarca otros fragmentos, no obstante, tal como cualquier fragmento en la proteína superior a aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 45 250 o 300 aminoácidos.

Por "variantes" se quiere decir proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula 50 de ácido nucleico de las SEC ID Nº: 1, 3, 4, 5, 6 o 7, o una complementaria de la misma, en condiciones rigurosas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Véanse, por ejemplo, las variantes divulgadas en la sección de Ejemplos Experimentales en el presente documento. Las proteínas variantes abarcadas por esta invención son biológicamente activas, es decir siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, retienen la actividad plaguicida. En algunas realizaciones, las 55 variantes tienen una actividad mejorada con respecto a la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480 - 2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199 - 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 - 293; y la patente de EE.UU. Nº 5.743.477.

60

Los genes bacterianos, tales como los genes axmi de esta invención, muy a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en la proximidad del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de iniciación conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de iniciación pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de iniciación, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una 65 metionina en el primer aminoácido. Rara vez, la traducción en los sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón

TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Además, no muy a menudo se determina a priori cuál de estos codones se utiliza de forma natural en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos también puede conducir a la generación de proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas están abarcadas por esta invención y pueden usarse en los métodos de esta invención. Se entenderá que cuando se expresa en plantas, será necesario alterar el codón de iniciación alternativo a ATG para una 5 traducción adecuada.

Los anticuerpos frente a los polipéptidos de esta invención o frente a variantes o fragmentos de los mismos se denominan: Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; patente de 10 EE.UU. Nº 4.196.265).

Variantes alteradas o mejoradas

Se reconoce que las secuencias de ADN de una proteína plaguicida pueden alterarse mediante diversos métodos, y 15 que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes que las codificadas por una proteína plaguicida de esta invención. Esta proteína se puede alterar de varias maneras, incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, 20 aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 25 130, aproximadamente 135, aproximadamente 140, aproximadamente 145, aproximadamente 150, aproximadamente 155, o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, en las que la proteína alterada tiene una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y actividad plaguicida. En general, en la técnica se conocen métodos para dichas manipulaciones. Por ejemplo, se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína plaguicida mediante mutaciones en el ADN. Esto 30 también se puede lograr por una de las varias formas de mutagénesis y/o de evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad plaguicida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína plaguicida para conferir actividad plaguicida puede mejorarse mediante el uso de tales técnicas sobre las composiciones de esta invención. Por ejemplo, se puede expresar una proteína plaguicida en células huésped 35 que exhiben altas tasas de incorporación errónea de bases durante la replicación del ADN, tales como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la propagación en tales cepas, se puede aislar el ADN (por ejemplo mediante la preparación de ADN plasmídico o mediante amplificación mediante PCR y clonación del fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la proteína plaguicida en una cepa no mutagénica e identificar los genes mutados con actividad plaguicida, por ejemplo mediante la realización de un ensayo para 40 determinar la actividad plaguicida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290 - 293. Dichos ensayos pueden incluir poner en contacto las plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. Ejemplos de mutaciones que dan como resultado un aumento de la toxicidad se encuentran en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775 - 806. 45

Como alternativa se pueden llevar a cabo alteraciones en la secuencia proteica de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi, sin que ello afecte sustancialmente a la actividad. Esto puede incluir inserciones, deleciones o alteraciones introducidas mediante métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluyendo amplificaciones por PCR que alteran o prolongan la secuencia de codificación de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias de 50 codificación de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Como alternativa, las secuencias proteicas añadidas pueden incluir secuencias de codificación de proteínas completas, tales como las utilizadas habitualmente en la técnica para generar proteínas de fusión. Tales proteínas de fusión se utilizan a menudo para (1) incrementar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar la purificación de la proteína, la detección de la proteína u otros usos 55 experimentales conocidos en la técnica (3) dirigir la secreción o la traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de una bacteria Gram negativa, o el retículo endoplasmático de células eucariotas, el último de los cuales a menudo tiene como resultado la glicosilación de la proteína.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos variantes de esta invención también incluyen secuencias derivadas de 60 métodos mutagénicos y recombinogénicos, tales como el barajado de ADN. Con dicho método, se pueden usar una o más regiones de codificación de proteína plaguicida diferentes para crear una nueva proteína plaguicida que posea las propiedades deseadas. De este modo, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tiene una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Por 65 ejemplo, usando este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés pueden barajarse entre

un gen plaguicida de la invención y otros genes plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, Tal como una actividad insecticida aumentada. En la técnica se conocen estrategias para dicho barajado de ADN. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747 - 10751; Stemmer (1994) Nature 370:389 - 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436 - 438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336 - 347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504 - 4509; Crameri et al. 5 (1998) Nature 391:288 - 291; y las patentes de EE.UU. Nº: 5.605.793 y 5.837.458.

El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar proteínas plaguicidas alteradas. Los dominios se pueden intercambiar entre las proteínas plaguicidas, dando como resultado toxinas híbridas o quimérica con una actividad plaguicida o espectro diana mejorados. Los métodos para generar proteínas recombinantes y 10 someterlas a ensayo para determinar la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naimov et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328 - 5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537 - 1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954 - 17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923 - 20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918 - 2925).

15

Vectores

Se puede proporcionar una secuencia plaguicida de la invención en un casete de expresión para su expresión en una planta de interés. Por "casete de expresión vegetal" se quiere decir una construcción de ADN que es capaz de dar como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. 20 Normalmente, estas contienen un promotor y una secuencia de codificación. A menudo, tales construcciones también contendrán una región no traducida en 3'. Tales construcciones pueden contener una "secuencia señal" o una "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a ciertas estructuras intracelulares, tales como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplasmático o el aparato de Golgi.

25

Mediante "secuencia señal" se quiere decir una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado el transporte cotraduccional o postraduccional de péptidos a través de la membrana celular. En eucariotas, esto implica típicamente la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glicosilación resultante. Las toxinas insecticidas de las bacterias a menudo se sintetizan como protoxinas, que se activan protolíticamente en el intestino de la plaga diana (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507 - 516). En algunas realizaciones de esta invención, la secuencia señal se 30 localiza en la secuencia nativa o puede derivar de una secuencia de la invención. Por "secuencia líder" se quiere decir cualquier secuencia que, cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líder que dirigen el transporte y/o la glicosilación mediante el paso al retículo endoplasmático, el paso a las vacuolas, los plástidos, incluyendo cloroplastos, las mitocondrias y similares. 35

Por "vector de transformación vegetal" se quiere decir una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión vegetales y se puede organizar en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de vegetales que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas 40 funciones que actúan en cis y trans necesarias para la transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446 - 451). "Vector" hace referencia a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" hace referencia a un vector que tiene la capacidad para incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogos en una célula extraña. El casete incluirá secuencias reguladoras en 5’ y 3’ unidas operativamente a una secuencia de la invención. 45 Mediante "unido operativamente" se quiere decir un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia promotor inicia y participa en la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, unido operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que están unidas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. Adicionalmente, el casete puede contener al menos un gen adicional para contransformarse en el 50 organismo. Como alternativa, el(los) gene(s) adicional(es) se pueden proporcionar sobre muchos casetes de expresión.

"Promotor" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia de codificación aguas abajo. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la 55 transcripción y de la traducción (también denominadas "secuencias de control") es necesario para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Dicho casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia plaguicida esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. 60

El casete de expresión incluirá en la dirección 5’-3’ de la transcripción, una región de inicio de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención y una región de terminación de la transcripción y de la traducción (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, con respecto al huésped vegetal y/o con respecto a la secuencia de ADN 65 de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o, como alternativa, una secuencia

sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" con respecto al huésped vegetal, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa donde se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" con respeto a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o de origen natural de la secuencia de ADN unida operativamente de la invención.

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La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN unida operativamente de interés, puede ser nativa con el huésped vegetal o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped vegetal o cualquier combinación de los mismos). Existen regiones de terminación convenientes procedentes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase, también 10 Guerineau y col. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 - 144; Proudfoot (1991) Cell 64:671 - 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141 - 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261 - 1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151 - 158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 - 7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627 - 9639.

Cuando sea adecuado, el o los genes se pueden optimizar para incrementar la expresión en la célula huésped 15 transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse utilizando los codones preferidos por la célula huésped para mejorar la expresión, o pueden sintetizarse utilizando los codones a una frecuencia de uso de codones preferida por el huésped. Generalmente, el contenido de GC del gen se incrementará. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11, una discusión del uso de codones preferidos del huésped. Se dispone de métodos en la técnica para sintetizar los genes preferidos de la planta. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.380.831 20 y 5.436.391, y Murray y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una realización, la proteína plaguicida es dirigida al cloroplasto para su expresión. De esta manera, cuando la proteína plaguicida no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la proteína plaguicida a los cloroplastos. Tales péptidos 25 de tránsito son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al., (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen plaguicida que se va a dirigir al cloroplasto puede optimizarse para la expresión en el cloroplasto para 30 representar las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse utilizando los codones preferidos por los cloroplastos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.380.831.

Transformación de plantas 35

Los métodos de la invención implican la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Con "introducir” se pretende presentar a la planta la construcción de nucleótidos de un modo tal que la construcción obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren el uso de un método concreto para introducir una construcción nucleotídica en una planta, solo que la construcción nucleotídica obtenga 40 acceso al interior de al menos una célula de la planta. En la técnica se conocen métodos para introducir construcciones nucleotídicas en las plantas, incluidos, entre otros, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

Por "planta" se quiere decir plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, 45 células vegetales, propágulos, embriones y progenie de la misma. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíz, células de floema, polen).

Las "plantas transgénicas" o las "plantas transformadas" o las plantas o células o tejidos "transformados de forma 50 estable" hacen referencia a plantas que han incorporado o han integrado secuencias de ácido nucleico o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácidos nucleicos incluyen las que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como aquellas que pueden ser endógenas, o están presentes en la célula vegetal no transformada. "Heterólogo" generalmente hace referencia a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes y se han 55 añadido a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares.

La transformación de células vegetales se puede lograr mediante una de varios técnicas conocidas en la técnica. El gen plaguicida de la invención puede modificarse para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Normalmente, una construcción que expresa dicha proteína contendría un promotor para dirigir la transcripción del 60 gen, así como una región no traducida en 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de tales construcciones es bien conocida en la técnica. En algunos casos, puede ser útil diseñar el gen de modo que el péptido resultante sea secretado, o de otro modo dirigido, al interior de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede diseñarse para que contenga un péptido señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. También puede ser preferible diseñar el casete de expresión vegetal para que contenga un 65 intrón, de manera que se requiera para la expresión el procesamiento del ARNm del intrón.

Típicamente este "casete de expresión vegetal" se insertará en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación vegetal que se componen de más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se denominan en la técnica "vectores binarios". Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos colaboradores son los más 5 utilizados para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficaz son bastante grandes, y son ventajosos para separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios contienen típicamente un vector plasmídico que contiene las secuencias que actúan en cis requeridas para la transferencia de ADN-T (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que está diseñado para que pueda expresarse en una célula vegetal, 10 y un gen "de interés" (un gen diseñado para que pueda expresarse en una célula vegetal para la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis se disponen de manera que permitan la transferencia eficiente en células vegetales y su expresión en ellas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen plaguicida se encuentran entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plasmídico 15 contiene los factores que actúan en trans que participan en la transferencia de ADN-T a partir de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales por Agrobacterium y la transferencia de ADN mediante escisión en las secuencias del borde y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Se pueden utilizar varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, 20 LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación vegetal. El segundo vector plasmídico no es necesario para la transformación de las plantas mediante otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los métodos de transformación vegetal implican la transferencia de ADN heterólogo a células vegetales 25 diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos no diferenciados, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas a partir de un grupo de masa de células no transformadas. Los explantes normalmente se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocar en medio de 30 regeneración suplementado con un nivel umbral máximo del agente de selección. Después, los brotes se transfieren a un medio selectivo de enraizamiento para recuperar los brotes o plántulas enraizados. La plántula transgénica crece a continuación en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al., (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes normalmente se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y 35 métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células; hay presentes células tanto transformadas como no transformadas en cualquier porción de callo o tejido o grupo de células diana sometidos. La capacidad para destruir células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de 40 eliminar las células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células vegetales transformadas y la generación satisfactoria de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación, además de los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar en función del tipo de planta o célula vegetal, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas, dirigido 45 para la transformación. La generación de plantas transgénicas se puede realizar mediante uno de varios métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo mediante Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, aceleración balística de partículas, transformación por haces de aerosol (solicitud publicada de EE.UU. Nº 20010026941; patente de EE.UU. 50 Nº 4.945.050; publicación internacional Nº WO 91/00915; solicitud publicada de EE.UU. Nº 2002015066), transformación con Lec1 y otros diversos métodos para transferencia de ADN no mediados por partículas dirigidas.

Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab Y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab 55 Y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la liberación con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y redireccionamiento del ADN al genoma del plástido mediante recombinación homóloga. Adicionalmente, la transformación de plástidos se puede lograr mediante transactivación de un transgén silente transportado por plástidos mediante la expresión preferida en el tejido de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida al plástido. Tal sistema se ha notificado en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60 91:7301-7305.

Tras la integración de ADN heterólogo extraño en células vegetales, se aplica un nivel umbral máximo de selección apropiada en el medio para destruir las células no transformadas y separar y hacer proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven en este tratamiento de selección mediante transferencia periódica a 65 un medio fresco. Mediante el paso continuo y exposición a la selección apropiada, se identifican y se hacen proliferar

las células que son transformadas con el vector plasmídico. Se pueden usar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que se han transformado pueden crecer en plantas de acuerdo con los modos convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick y col. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. A continuación, estas plantas pueden crecer y 5 polinizarse con la misma cepa transformada o con diferentes cepas y el híbrido resultante tendrá la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda, y, después, se ha conseguido las semillas cosechadas para garantizar la expresión de la característica fenotípica deseada. De este modo, esta invención proporciona semillas transformadas (también denominadas “semillas 10 transgénicas”) que tienen una construcción nucleotídica de la invención, por ejemplo un casete de expresión de la invención, incorporado de forma estable en su genoma.

Evaluación de la transformación en plantas

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Después de la introducción del ADN heterólogo extraño en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante varios métodos tales como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis de PCR es un método rápido para la detección selectiva de células, tejido o brotes transformados de la 20 presencia de un gen incorporado en la etapa temprana anterior al transplante en el suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores oligonucleótidos específicos del gen de interés o un fondo de vectores de Agrobacterium, etc.

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La transformación vegetal se puede confirmar mediante análisis de transferencia de tipo Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente). En general, el ADN total se extrae a partir del transformante, se digiere con enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. La membrana o "transferencia" se sondea, por ejemplo, con un fragmento de ADN diana radiomarcado con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con 30 técnicas convencionales (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente).

En el análisis de transferencia de tipo Northern, el ARN se aísla de los tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído y se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con métodos convencionales que se utilizan habitualmente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente). La 35 expresión del ARN codificado por el gen plaguicida se analiza a continuación mediante hibridación del filtro con una sonda radioactiva derivada de un gen plaguicida, mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente).

La transferencia de tipo Western, los análisis bioquímicos y similares se pueden llevar a cabo en las plantas 40 transgénicas para confirmar la presencia de la proteína codificada por el gen plaguicida mediante métodos convencionales (Sambrook y Russell, 2001, citado anteriormente) utilizando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína plaguicida.

Actividad plaguicida en las plantas 45

En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresan una proteína plaguicida que tiene actividad plaguicida. Se pueden utilizar los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo para generar plantas transgénicas, pero la manera donde se generan las células vegetales transgénicas no es crucial para esta invención. Los métodos conocidos o descritos en la técnica, tales como la transformación mediada por 50 Agrobacterium, la transformación biolística y los métodos no mediados por partículas se pueden usar a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una proteína plaguicida se pueden aislar mediante métodos habituales descritos en la técnica, por ejemplo mediante transformación del callo, selección de callo transformado y regeneración de las plantas fértiles a partir de tal callo transgénico. En tal proceso se puede utilizar cualquier gen como marcador seleccionable siempre que su expresión en células vegetales confiera capacidad para identificar o 55 seleccionar las células transformadas.

Se han desarrollado diversos marcadores para su uso con células vegetales, tales como resistencia a cloranfenicol, al aminoglucósido G418, a higromicina, o similares. También se pueden usar como marcadores seleccionables otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo del cloroplasto. Por ejemplo, pueden encontrar un uso 60 particular los genes que proporcionan resistencia a herbicidas vegetales tales como glifosato, bromoxinilo o imidazolinona. Tales genes se han notificado (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa con resistencia a bromoxinilo); y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gen de AHAS con resistencia a imidazolinona). Adicionalmente, los genes divulgados en el presente documento son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgén 65 en una planta, órgano de la planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos,

embriones o progenie de la misma son bien conocidos en la técnica. En una realización, la presencia del transgén se detecta analizando la actividad plaguicida.

Las plantas fértiles que expresan una proteína plaguicida se pueden analizar para determinar la actividad plaguicida, y seleccionar las plantas que presentan una actividad óptima para la reproducción ulterior. En la técnica se dispone 5 de métodos para analizar la actividad de las plagas. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

Esta invención se puede usar para transformación de cualquier especie de planta, incluidas, entre otras, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, entre otros, maíz, sorgo, trigo, girasol, 10 tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza de semilla oleaginosa, especies de Brassica, alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, batata, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

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Las hortalizas incluyen, entre otras, tomates, lechuga, judías verdes, frijol lima, guisantes, y miembros del género Curcumis tales como pepino, melón cantalupo y melón. Las plantas ornamentales incluyen, entre otras, azalea, hortensia, hibiscos, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemo. Preferentemente, las plantas de esta invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza de semilla 20 oleaginosa, etc.).

Uso en el control de plagas

Los métodos generales para emplear las cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de esta invención, o 25 una variante de la misma, en el control de plagas o en el diseño de otros organismos como agentes plaguicidas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo la patente de EE.UU. Nº 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de esta invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que se han alterado genéticamente para contener un gen plaguicida y la proteína pueden 30 usarse para proteger de las plagas cultivos y productos agrícolas. En un aspecto de la invención, las células enteras, es decir, no lisadas, de un organismo productor de toxina (plaguicida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la plaga o las plagas diana.

Como alternativa, el plaguicida se produce introduciendo un gen plaguicida en un huésped celular. La expresión del 35 gen plaguicida da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. En un aspecto de esta invención, estas células se tratan después en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la plaga o las plagas diana. El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos plaguicida encapsulados de forma natural se pueden formular de acuerdo con técnicas convencionales para la aplicación en el entorno que aloja una plaga diana, por 40 ejemplo, suelo, agua y follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, el documento EPA 0192319, y las referencias citadas en el mismo. Como alternativa, se pueden formular las células que expresan un gen de esta invención de manera que se permita la aplicación del material resultante como un plaguicida.

Normalmente, los ingredientes activos de la presente invención se aplican en forma de composiciones y se pueden 45 aplicar al área o planta de cultivo que se va a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, agentes tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites latentes, polímeros, y/o formulaciones portadoras de liberación controlada o biodegradables que permiten una dosificación a largo plazo de una zona diana tras una única aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicas, virucidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, 50 bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con vehículos adicionales agrícolamente aceptables, tensioactivos, o aplicación de adyuvantes estimulantes de uso habitual en la técnica de la formulación. Vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponder a las sustancias habitualmente empleadas en la tecnología de la formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes de humectación, agentes de adherencia, 55 espesantes, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones se pueden preparar como "cebos" comestibles o en forma de "trampas" para plagas para permitir la alimentación o la ingestión por una plaga diana de la formulación plaguicida.

Métodos de aplicar un ingrediente activo de esta invención o una composición agroquímica de esta invención que 60 contiene al menos una de las proteínas plaguicidas producidas por las cepas bacterianas de esta invención incluyen aplicación foliar, recubrimiento de semillas y aplicación en el terreno. El número de aplicaciones y la frecuencia de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la correspondiente plaga.

La composición se puede formular como un polvo, DUST, bolita, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, solución, o 65 similares, y se puede preparar por medios convencionales tales como desecación, liofilización, homogeneización,

extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido. En todas estas composiciones que contienen al menos uno de tales polipéptidos plaguicidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso.

Mediante los métodos de la invención se pueden eliminar o reducir plagas de lepidópteros, dípteros o coleópteros, 5 en una zona determinada, o se pueden aplicar profilácticamente a una zona medioambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere o se pone en contacto con, una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido. Mediante "cantidad eficaz como plaguicida" se quiere decir una cantidad del plaguicida que es capaz de provocar la muerte de al menos una plaga, o de reducir notablemente el crecimiento, la alimentación o desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, 10 por ejemplo, las plagas diana específicas a controlar, el entorno específico, la localización, la planta, el cultivo, o la localización agrícola a tratar, las condiciones ambientales, y el método, la tasa, la concentración, la estabilidad, y la cantidad de aplicación de la composición de polipéptido eficaz como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones ambientales, y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación de la plaga. 15

Las composiciones plaguicidas descritas se pueden preparar formulando la célula bacteriana, el cristal y/o la suspensión de esporas, o el componente proteico aislado con el vehículo agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones se pueden formular antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizar, secar por congelación, desecar, o en un vehículo, medio o diluyente acuosos adecuado, tal como solución salina u otro 20 tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un material espolvoreable o granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o agua o emulsiones de aceite/agua, o en forma de un polvo humectable o en combinación con cualquier otro material vehículo adecuado para la aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "vehículo agrícolamente aceptable" cubre todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes taquificantes, 25 aglutinantes, etc., que se usan normalmente en la tecnología de formulación de plaguicidas, los cuales son bien conocidos por los expertos en la formulación de plaguicidas. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mezclando, combinando y/o moliendo homogéneamente la composición plaguicida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y métodos de aplicación adecuados se describen en la patente de EE.UU. Nº 30 6.468.523.

"Plaga" incluye, entre otros, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas, y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes coleópteros, dípteros, himenópteros, lepidópteros, malófagos, homópteros, hemípteros, ortópteros, tisanópteros, dermápteros, isópteros, anopluros, sifonápteros, 35 tricópteros etc., particularmente coleópteros, lepidópteros y dípteros.

El orden Coleoptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gyrinoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, 40 Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea y Curculionoidea. La superfamilia Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae y Dytiscidae. La superfamilia Gyrinoidea incluye la familia Gyrinidae. La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae. La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphylinidae. La superfamilia Cantharoidea incluye las familias Cantharidae y Lampyridae. La superfamilia Cleroidea incluye las familias Cleridae y Dermestidae. La superfamilia Elateroidea 45 incluye las familias Elateridae y Buprestidae. La superfamilia Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae. La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae. La superfamilia Tenebrionoidea incluye la familia Tenebrionidae. La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae. La superfamilia Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia Chrysomelidae. La superfamilia Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae. 50

El orden Diptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae y Cecidomyiidae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, y Dolichopodidae. El suborden Cyclorrhapha incluye las divisiones Aschiza y Aschiza. La 55 división Aschiza incluye las familias Phoridae, Syrphidae, y Conopidae. La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae y Sarcophagidae.

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El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae y Tineidae.

Las plagas de insectos de la invención para los cultivos principales incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, perforador del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusano cortador grasiento; Helicoverpa zea, gusano elotero; Spodoptera frugiperda, 65 cogollero del maíz; Diatraea grandiosella, perforador del maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano

picador; Diatraea saccharalis, barrenador del tallo; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz occidental; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos alambre; Cyclocephala borealis, escarabajo enmascarado del norte (escarabajo blanco); Cyclocephala immaculata, escarabajo enmascarado del sur (escarabajo blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; 5 Rhopalosiphum maidis, áfido de la hoja del maíz; Anuraphis maidiradicis, áfido de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinches; Melanopus femurrubrum, saltamontes de pata roja; Meanopus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, minadora mancha del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, ácaros araña con dos manchas; Sorgo: Chilo partellus, taladrador del sorgo; Spodoptera frugiperda, cogollero del maíz; 10 Helicoverpa zea, gusano elotero; Elasmopalpus lignoselus, taladrador del cuello del maíz; Feltia subterranea, cortador pequeño; Phyllophaga crinita, escarabajo blanco; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., lombrices; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis; áfido de la hoja del maíz; Sipha flava, áfido amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, 15 ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña con dos manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus, taladrador del cuello del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador occidental; Elasmopalpus lignosellus, taladrador del cuello del maíz; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Hypera punctata, gorgojo de la hoja de trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; áfido del trigo de Rusia; Schizaphis graminum, 20 escarabajo verde; Macrosiphum avenae, áfido del grano inglés; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de pata roja; Melanoplus differentialis, saltamontes; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca de Hess; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca de sierra del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro enrollador de la hoja del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla de los brotes del 25 girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano bellotero; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, picudo; Aphis gossypii, áfido del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltona del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca con bandas 30 de color en las alas; Lygus lineolaris, chinche opaca; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de pata roja; Melanoplus differentialis, saltamontes; Thrips tabaci, trip de la cebolla; Franklinkiella fusca, trip del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña con dos manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, taladrador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano elotero; Colaspis brunnea, colaseis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, rice gorgojo acuático del arroz; Sitophilus oryzae, 35 gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahoja del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, gusano de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga del frijol terciopelo; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Ostrinia nubilalis, taladrador del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Heliothis virescens, gusano cogollero del algodón; Helicoverpa zea, gusano bellotero del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo mejicano de 40 la judía; Myzus persicae, áfido del verde del melocotonero; Empoasca fabae, saltahojas de la patata; Acrosternum hilare, chinche verde; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trip de la soja; Thrips tabaci, trip de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña amarilla de la fresa; Tetranychus urticae, arañuela roja; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, áfido verde; Blissus 45 leucopterus leucopterus, chinche pequeña de los cereales; Acrosternum hilare, chinche hedionda verde; Euschistus servus, chinche hedionda parda; Delia platura, gusano de la semilla del maíz; Mayetiola destructor, mosquito del trigo; Petrobia latens, ácaro pardo del trigo; Colza de semilla oleaginosa: Brevicoryne brassicae, áfido de la col; Phylotreta cruciferae, pulguilla; Mamestra configurata, gusano soldado; Plutella xylostella, polilla dorso de diamante; Delia ssp., larvas de la raíz. 50

Nematodos incluyen nematodos parásitos tales como nematodos de la raíz-nudo, quistes y lesiones, incluidos Heterodera spp., Meloidogyne spp, y Globodera spp.; particularmente miembros de los nematodos de quistes, incluidos, entre otros, Heterodera glycines (nematodos de los quistes de soja); Heterodera schachtii (nematodos de los quistes de la remolacha); Heterodera avenae (nematodos de los quistes de cereales); y Globodera rostochiensis 55 y Globodera pailida (nematodos de los quistes de la patata). Los nematodos de las lesiones incluyen Pratylenchus spp.

Métodos para aumentar el rendimiento de la planta

60

Se proporcionan métodos para aumentar el rendimiento de la planta. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia plaguicida divulgada en el presente documento. Como se define en el presente documento, el "rendimiento" de la planta hace referencia a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se quiere decir cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El 65 aumento de rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa

de hoja de la planta puede aumentar el rendimiento de las hortalizas de hoja para el consumo humano o animal. Adicionalmente, se puede utilizar el aumento de la biomasa de hoja para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo, incluyendo, entre otros, al menos, un aumento de 1 %, al menos un aumento del 3 %, al menos un aumento del 5 %, al menos un aumento del 10 %, al menos un aumento del 20 %, al menos un 5 aumento del 30 %, al menos un aumento del 50 %, al menos un aumento del 70 %, al menos un aumento del 100 % o mayor en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia de plaguicida.

Las plantas también se pueden tratar con una o más composiciones químicas, incluidos uno o más de herbicidas, insecticidas o fungicidas. Composiciones químicas de ejemplo incluyen: Herbicidas de frutas/hortalizas: atrazina, 10 bromacil, diuron, glifosato, linuron, metribuzina, simazina, trifluralina, fluazifop, glufosinato, halosulfurón gowan, paraquat, propizamida, setoxidima, butafenacilo, halosulfurón, indaziflam; Insecticidas de frutas/hortalizas: aldicarb, Bacillus thuriengiensis, carbarilo, carbofurano, clorpirifos, cipermetrina, deltametrina, diazinon, malatión, abamectina, ciflutrina/beta-ciflutrina, esfenvalerato, Lambda-cihalotrina, acequinocil, bifenazato, metoxifenozida, novalurón, cromafenozida, tiacloprid, dinotefurano, fluacripirim, tolfenpirad, clotianidina, espirodiclofeno, gamma-cihalotrina, 15 espiromesifeno, espinosad, rinaxipir, ciazipir, espinoteram, triflumuron,espirotetramat, imidacloprid, flubendiamida, tiodicarb, metaflumizona, sulfoxaflor, ciflumetofeno, cianopirafeno, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, espinotoram, tiodicarb, flonicamid, metiocarb, emamectina-benzoato, indoxacarb, foztiazato, fenamifos, cadusafos, piriproxifeno, fenbutatina-oxid, hextiazox, metomilo, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona;

Fungicidas de frutas/hortalizas: 20

carbendazim, clortalonil, EBDC, azufre, tiofanato-metilo, azoxistrobina, cimoxanilo, fluazinam, fosetilo, iprodiona, kresoxim-metilo, metalaxil/mefenoxam, trifloxistrobina, etaboxam, oprovalicarb, trifloxistrobia, fenhexamid, oxpoconazol fumarato, ciazofamid, fenamidona, zoxamida, picoxistrobina, piraclostrobina, ciflufenamid, boscalid; Herbicidas de cereales: isoproturón, bromoxinilo, ioxonilo, fenoxis, clorsulfurón, clodinafop, diclofop, diflufenican, fenoxaprop, florasulam, fluroxipir, metsulfurón, triasulfurón, flucarbazona, yodosulfurón, propoxicarbazona, 25 picolinafen, mesosulfurón, beflubutamid, pinoxaden, amidosulfurón, tifensulfurón, tribenuron, flupirsulfurón, sulfosulfurón, pirasulfotol, piroxsulam, flufenacet, tralcoxidim, piroxasulfon; Fungicidas de cereales: carbendazim, clorotalonil, azoxistrobina, ciproconazol, ciprodinil, fenpropimorph, epoxiconazol, Kresoxim-metilo, quinoxifen, tebuconazol, trifloxistrobina, simeconazol, picoxistrobina, piraclostrobina, dimoxistrobina, protioconazol, fluoxastrobina; Insecticidas de cereales: dimetoato, Lambda-cihalotrina, deltametrina, alfa-cipermetrina, ß-ciflutrina, 30 bifentrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofuran, clorpirifos, metamidofos, oxidemeton-metilo, pirimicarb, metiocarb; Herbicidas del maíz: atrazina, alaclor, bromoxinil, acetoclor, dicamba, clopiralid, (S-)Dimetenamid, glufosinato, glifosato, isoxaflutol, (S-)metolaclor, mesotriona, nicosulfurón, primisulfurón, rimsulfurón, sulcotriona, foramsulfurón, topramezona, tembotriona, saflufenacilo, tiencarbazona, flufenacet, piroxasulfon; Insecticidas del maíz: carbofuran, clorpirifos, bifentrina, fipronil, imidacloprid, lambda-cihalotrina, 35 teflutrina, terbufos, tiametoxam, clotianidina, espiromesifen, flubendiamida, triflumurón, rinaxipir, deltametrina, tiodicarb, ß-ciflutrina, cipermetrina, bifentrina, lufenurón, triflumorón, teflutrina ,tebupirimfos, etiprol, ciazipir, tiacloprid, acetamiprid, dinaetofuran, avermectina, metiocarb, espirodiclofeno, espirotetramat; Fungicidas del maíz: fenitropan, tiram, protioconazol, tebuconazol, trifloxistrobina; Herbicidas del arroz: butaclor, propanil, azimsulfurón, bensulfurón, cihalofop, daimurón, fentrazamida, imazosulfurón, mefenacet, oxaziclomefona, pirazosulfurón, piributicarb, 40 quinclorac, tiobencarb, indanofan, flufenacet, fentrazamida, halosulfurón, oxaziclomefona, benzobiciclon, piriftalid, penoxsulam, bispiribac, oxadiargil, etoxisulfurón, pretilaclor, mesotriona, tefuriltriona, oxadiazona, fenoxaprop, pirimisulfan; Insecticidas del arroz: diazinon, fenitrotion, fenobucarb, monocrotofos, benfuracarb, buprofezin, dinaotefuran, fipronil, imidacloprid, isoprocarb, tiacloprid, cromafenozida, tiacloprid, dinaotefuran, clotianidina, etiprol, flubendiamida, rinaxipir, deltametrina, acetamiprid, tiametoxam, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamectina-45 benzoato, cipermetrina, clorpirifos, cartap, metamidofos, etofenprox, triazofos, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5h)-ona, carbofurano, benfuracarb; Fungicidas del arroz: tiofanato-metilo, azoxistrobina, carpropamid, edifenfos, ferimzona, iprobenfos, isoprotiolano, pencicuron, probenazol, piroquilon, triciclazol, trifloxistrobina, diclocimet, fenoxanil, simeconazol, tiadinil; Herbicidas del algodón: diuron, fluometuron, MSMA, oxifluorfen, prometrina, trifluralin, carfentrazona, cletodim, fluazifop-butilo, glifosato, norflurazon, pendimetalina, piritio 50 bac-sodio, trifloxisulfurón, tepraloxidim, glufosinato, flumioxazina, tidiazurón; Insecticidas del algodón: acefato, aldicarb, clorpirifos, cipermetrina, deltametrina, malatión, monocrotofos, abamectina, acetamiprid, emamectina benzoato, imidacloprid, indoxacarb, lambda-cihalotrina, espinosad, tiodicarb, gamma-cihalotrina, espiromesifen, piridalil, flonicamid, flubendiamida, triflumuron, rinaxipir, beta-ciflutrina, espirotetramat, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, dinetofuran, flubendiamida, ciazipir, espinosad, espinotoram, gamma cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-55 il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5h)-on, tiodicarb, avermectina, flonicamid, piridalil, espiromesifen, sulfoxaflor, profenofos, triazofos, endosulfano; Fungicidas del algodón: etridiazol, metalaxil, quintozeno; Herbicidas de la soja: alaclor, bentazona, trifluralin, clorimuron-etil, cloransulam-metil, fenoxaprop, fomesafen, fluazifop, glifosato, imazamox, imazaquin, imazetapir, (s-)metolaclor, metribuzina, pendimetalina, tepraloxidim, glufosinato; Insecticidas de la soja: lambda-cihalotrina, metomil, paratión, tiocarb, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, 60 acetamiprid, dinaetofuran, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamectina-benzoato, fipronil, etiprol, deltametrina, ß-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, espirotetramat, espinodiclofeno, triflumuron, flonicamid, tiodicarb, beta-ciflutrina; Fungicidas de la soja: azoxistrobina, ciproconazol, epoxiconazol, flutriafol, piraclostrobina, tebuconazol, trifloxistrobina, protioconazol, tetraconazol; Herbicidas de la caña de azúcar: cloridazon, desmedifam, etofumesato, fenmedifam, trialato, clopiralid, 65 fluazifop, lenacil, metamitron, quinmerac, cicloxidim, triflusulfurón, tepraloxidim, quizalofop; Insecticidas de la caña de

azúcar: imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofuran, deltametrina, ß-ciflutrina, gamma/lambda cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, teflutrina, rinaxipir, ciaxipir, fipronil, carbofuran; Herbicidas de la cánola: clopiralid, diclofop, fluazifop, glufosinato, glifosato, metazaclor, trifluralin etametsulfurón, quinmerac, quizalofop, cletodim, tepraloxidim; Fungicidas de la cánola: azoxistrobina, carbendazim, fludioxonil, iprodiona, procloraz, vinclozolina; Insecticidas de la cánola: carbofuran, organofosfatos, 5 piretroides, tiacloprid, deltametrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, acetamiprid, dinetofuran, ß-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, tau-fluvaleriato, etiprol, espinosad, espinotoram, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no como limitación. 10

Ejemplos experimentales

Ejemplo 1. Extracción de ADN plasmídico 15

La secuencia génica completa se identificó a partir de la cepa seleccionada a través del abordaje genómico MiDAS del siguiente modo:

Preparación de ADN extracromosómicos a partir de la cepa. El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o tofos los siguientes: plásmidos de varios tamaños; cromosomas de fagos; fragmentos de ADN 20 genómico no separados mediante el protocolo de purificación; otras moléculas extracromosómicas sin caracterizar.

Cizallamiento mecánico o enzimático del ADN extracromosómico para generar fragmentos distribuidos por tamaño.

25

Secuenciación del ADN fragmentado mediante métodos de pirosecuenciación de alto rendimiento.

Identificación de supuestos genes de toxinas mediante análisis de homología y/u otros análisis informáticos.

Cuando sea necesario, finalización de la secuencia del gen de interés mediante una de varias estrategias de PCR o 30 clonación (por ejemplo, TAIL-PCR).

Ejemplo 2. Expresión heteróloga de AXMI-150

El ORF complete de axmi-150 (~2 kb que codifican una proteína de ~77,5 kD) se clonó en un vector de expresión de 35 E. coli basado en pRSF1b (para dar pAX5482). La secuencia génica de axmi-150 comenzando con una metionina interna (19 aminoácidos cadena debajo de la metionina original en pAX5482) también se clonó en el vector basado en pRSF1b para dar pAX5484.

La secuencia que codifica axmi-150 también se clonó en un vector de expresión de Bacillus basado en pAX916 40 (para dar pAX5483). Todos los clones resultantes se confirmaron mediante análisis de restricción y, por último, mediante secuenciación completa del gen clonado.

Para la expresión en E. coli, BL21 *DE3 se transformó con pAX5482 o pAX5484. Se inoculó una única colonia en medio LB suplementado con kanamicina y se cultivó durante la noche a 37 °C. Al día siguiente se inoculó medio 45 fresco por duplicado con 1 % del cultivo durante la noche y se cultivó a 37 °C hasta la fase logarítmica. Después, se indujeron cultivos con IPTG 1mM durante 3 horas a 37 °C o durante la noche a 20 °C. Cada sedimento celular se suspendió en tampón de carbonato sódico 50mM, a pH 10,5 suplementado con DTT 1mM y se sometió a ultrasonidos. El análisis mediante SDS-PAGE detectó la expresión de una proteína de ~78kDa correspondiente a AXMI-150. 50

Para la expresión en Bacillus, Bt51 se transformó con pAX5483 y una única colonia se cultivó en medio CYS-glu durante 3 días hasta la esporulación. Después, el sedimento celular se extrajo con tampón Tris Cl 50mM, a pH 8,0, o con tampón de carbonato sódico 50mM, a pH 10,5, suplementado cada uno con DTT 1mM. La fracción soluble mostró presencia de una proteína de 78 kDa Axmi150. La tripsinización de AXMI-150 dio una ligera banda proteica 55 de aproximadamente 55 kDa.

La secuencia del marco de lectura abierto de axmi-150 se proporciona en el presente documento como la SEC ID Nº: 1 y codifica la proteína AXMI-150 (SEC ID Nº: 2).

La búsqueda de la secuencia de aminoácidos de AXMI-150 frente a las bases de datos de secuencias públicas 60 muestra que AXMI-150 es homóloga a la proteína AXMI-004 (patente de EE.UU. 7.355.099). AXMI-150 también exhibe homología de aminoácidos con crylCa4, y con un grupo de proteínas de tipo AXMI-004 descritas en la publicación de la solicitud internacional nº WO2005/107383.

Homólogos conocidos y porcentaje de identidad aproximado: 65

AXMI-004 - 85,5 %

CrylCa4 (dominio de la toxina) - 51,8 %

Ejemplo 3. Actividad plaguicida de AXMI-150

5

Los extractos solubles que contienen AXMI-150 se analizaron en ensayos de insectos con controles adecuados. Una lectura de 5 días de las placas mostró que AXMI-150 tenía actividad plaguicida sobre el taladrador europeo del maíz (ECB), la oruga del fríjol terciopelo (VBC), y una elevada mortalidad (> 50 %) sobre la polilla dorso de diamante (DBM) y el taladrador del suroeste del maíz (SWCB). La Tabla 1 muestra una descripción de las asignaciones de puntuación usadas en el presente documento. 10

Tabla 1. Descripción del sistema de puntuación

Puntuación: Descripción

0: No se observa ningún efecto

1: Aturdimiento leve no uniforme

2: Aturdimiento moderado no uniforme

3: Aturdimiento uniforme moderado a intenso

4: mortalidad (< 100 %) con aturdimiento uniforme

5: Mortalidad completa

Tabla 2. Actividad plaguicida de AXMI-150.

Plaga: Actividad de AXMI-150

Taladrador europeo del maíz: +++

Oruga del frijol terciopelo: +

Polilla de dorso de diamante: +++++

Taladrador del suroeste del maíz: ++++

15

Ejemplo 4. Ensayos adicionales para la actividad plaguicida

Las secuencias de nucléotidos de la invención se pueden analizar para determinar su capacidad para producir proteínas plaguicidas. La capacidad de una proteína plaguicida para actuar como plaguicida sobre una plaga a menudo se evalúa de varias formas. Una forma bien conocida en la técnica es realizar un ensayo de alimentación. 20 En dicho ensayo de alimentación, se expone la plaga a una muestra que contiene los compuestos a analizar o muestras control. A menudo esto se realiza colocando el material a analizar, o una dilución adecuada de dicho material, sobre un material que ingerirá la plaga, tal como una dieta artificial. El material a analizar puede estar compuesto por un líquido, sólido o suspensión espesa. El material a analizar se puede colocar sobre la superficie y después dejar secar. Como alternativa, el material a analizar se puede mezclar con una dieta artificial fundida, 25 después dispensar en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pocillo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para plagas de succionadores (por ejemplo áfidos) pueden implicar separar el material a analizar del insecto mediante partición, idealmente una porción que puede perforar las partes succionadoras de la boca del 30 insecto succionador, para permitir la ingestión del material a analizar. A menudo, el material a analizar se mezcla con un estimulante de la alimentación, tal como sacarosa, para estimular la ingestión del compuesto de ensayo.

Otros tipos de ensayos pueden incluir microinyección del material a analizar en la noca o intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido del análisis de la capacidad de la plaga a la que se va a 35 administrar la planta transgénica. El análisis de la planta puede implicar el aislamiento de las partes de la planta que normalmente se consumen, por ejemplo pequeñas jaulas fijadas a una hoja, o el aislamiento de plantas completas en jaulas que contienen insectos.

Otros métodos y abordajes para analizar plagas son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en, por 40 ejemplo, Robertson y Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Como alternativa, los ensayos normalmente se describen en las revistas Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology o mediante debates con miembros de la Sociedad Entomológica de América (ESA).

Ejemplo de referencia 1. Evolución directa de AXMI-004 45

La evolución directa se realizó con AXMI-004 (SEC ID Nº: 14). La mutagénesis estaba dirigida a tres bucles en la región de unión al receptor. Como primera etapa se generaron deleciones de los bucles 1 (correspondientes a los residuos 311 - 316 de la SEC ID Nº: 14), 2 (correspondientes a los residuos 368 - 378 de la SEC ID Nº: 14) y 3

(correspondientes a los residuos 434 - 438 de la SEC ID Nº: 14), se expresaron en Bt51 y se analizó la bioactividad. Las deleciones de los bucles 2 y 3 disminuyeron intensamente la solubilidad de las proteínas, mientras que la deleción del bucle 1 no afectó a la solubilidad de las proteínas. La deleción variante del bucle 1 mostró una toxicidad reducida contra el taladrador europeo del maíz (ECB), pero conservó su actividad contra la polilla dorso de diamante (DBM). 5

Después, dentro de estos 3 bucles se mutageneizó un total de 23 posiciones. Se generó un conjunto de mutantes puntuales.

El plásmido pAX5485 (His6-axmi004-m2 en pRSF1b) se usó para la expresión de axmi-004 salvaje y también fue la base para la mutagénesis y la expresión variante. La mutagénesis se realizó usando el kit de mutagénesis dirigida a 10 sitio óptica QUIKCHANGE® (Stratagene), se secuenciaron los mutantes y se identificaron variantes únicas. Se generó la siguiente diversidad de mutantes puntuales:

Tabla 3: Bucle 1:

Posición: 311 312 313 314 315 316

Salvaje: Y S V G R N

Diversidad: G R G P G G

: C G R R A R

: R P T C C A

: S C A S S S

: T A I A T P

: A E H T W T

: P Q D W P W

: V H Q H N K

: E V L L E I

: L N E V L E

: K L M D V F

: Q D M K V

: D K E Y Q

: I K D

: Q

: I

TOTAL: 14 13 11 14 16 13

15

Tabla 4: Bucle 2:

Posición: 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378

Salvaje: P L Q Q P A P A P P F

: A A P R D G R G S C A

: G W S P K R G W G S C

: T G G S V s A C T T T

: S T R G L C S S W A W

: C R W T N P T R C W G

: R M A L E T W D A R S

: L F T V F V V L R G R

: Q K V H H N H V I I V

: V E E K Q E F K V L Y

: N V L F M D L I L H K

: D H Y N A M D E D V Q

: E I I D G I Y H E K E

: H Y R F Q Q Q Q I

Posición: 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378

: I M T K E M M D L

: E S E M N E I

: W L N H Y D

: Y

: H

TOTAL: 14 12 12 15 16 18 14 14 16 16 16

Tabla 5: Bucle 3:

Posición: 434 435 436 437 438

Salvaje: K S G T P

MUTANTES: T R P A G

: G T R G R

: A G T P T

: R A A T S

: S P S S W

: W W V R A

: P L K I F

: E E E M L

: Q V L E V

: V M D H Q

: L D H Y K

: N H Q V F

: F N K I

: M D P

: I F N

: K L

: H N

TOTAL: 17 12 13 17 15

Las variantes para el bucle 1, el bucle 2 y el bucle 3 se combinaron por separado.

Expresión y detección selectiva en bibliotecas

5

Detección selectiva primaria:

Las variantes de la biblioteca combinada, así como pAX5485, se transformaron en células BL21*DE3 y se sembraron en LB+ Kanamicina (100 µg/ml). Las colonias frescas se introdujeron en 16 ml de medio líquido LB+ Kanamicina (100 µg/ml) y se cultivaron en bloques de 24 pocillos profundos a 37 ºC y 300 rpm hasta alcanzar una 10 DO600 nm de 0,3 - 0,4. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM y los cultivos se incubaron durante 18 horas adicionales a 20 ºC. La DO600 nm se determinó y las células se recogieron mediante centrifugación (10 minutos a 4.500 rpm, 4 ºC). Los sedimentos celulares se resuspendieron en carbonato sódico 50 mM a pH 10,5, DTT 1 mM a una densidad de OD600/ml 10. Las células se rompieron mediante batido con esferas y los extractos solubles se obtuvieron tras centrifugar a 4.000 rpm durante 15 minutos a 4 ºC. 15

Los extractos se analizaron para determinar la actividad contra el ECB, el taladrador del suroeste del maíz (SWCB), Heliothis virescens (Hz), la oruga del fríjol terciopelo (VBC) y el DBM a 4 duplicados por cada variante. Tras 5 días se determinaron las puntuaciones de la toxicidad mediante el promedio de las puntuaciones de 4 duplicados. Se analizaron 122 variantes del conjunto del bucle 1, 240 variantes del conjunto del bucle 2 y 121 variantes del conjunto 20 del bucle 3, respectivamente, en esta detección selectiva primaria, proporcionando una cobertura de 1,5x de la

biblioteca.

Repetición de los ensayos y escalado:

Las variantes que mostraban puntuaciones mejoradas sobre el ECB o el SWCB se secuenciaron y se volvieron a 5 analizar a 4 duplicados por variante. Las variantes que mostraban de nuevo una mejor actividad contra el ECB o el SWCB se seleccionaron para el escalado.

Para los escalados, se escogieron 3 colonias recién transformadas en 70 ml de LB+Kanamicina (100 µg/ml) y se cultivaron en matraces de agitación de 0,5 litros a 37 ºC y 150 rpm hasta alcanzar una DO600 nm de 0,3 - 0,4. Se 10 añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM y los cultivos se incubaron durante 18 horas adicionales a 20 ºC. La DO600 nm se determinó y las células se recogieron mediante centrifugación (10 minutos a 5000 rpm, 4 ºC). Los sedimentos celulares se resuspendieron en carbonato sódico 50 mM a pH 10,5, DTT 1 mM a una densidad de OD600/ml 10. Las células se rompieron mediante batido con esferas y los extractos solubles se obtuvieron tras centrifugar a 4.000 rpm durante 15 minutos a 4 ºC. Las variantes de Axmi-004 en dichos extractos se cuantificaron 15 en SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie comparando diluciones en serie del extracto con un patrón de BSA de concentración conocida. Todas las proteínas variantes analizados se expresan a niveles muy similares.

Las preparaciones de escalado se analizaron contra ECB, SWCB, VBC, Hz y DBM a 16 duplicados por variante y plaga. Se realizó el promedio de las puntuaciones.

Las siguientes variantes del bucle 2 mostraron una toxicidad mejorada en la detección selectiva primaria, la 20 repetición del ensayo y los escalados.

Tabla 6

: ECB SWCB

: Aturdimiento Porcentaje de mortalidad Aturdimiento Porcentaje de mortalidad

axmi-004: +++ 13 % - 6 %

L21B11: + 9 % + 16 %

L21F2: ++ 6 % + 14 %

L23G5: + 9 % + 16 %

L21A5: ++ - -

L22H7: ++

L22E7: +

L22F7: ++

pRSF1b: - -

La diversidad de la secuencia en las posiciones 370, 373, 376 y 377 se muestra en la Tabla 7. 25

Tabla 7

: 370 371 372 373 374 375 376 377 378

AXMI004: Q Q P A P A P P F

L21A5: Q Q P A P A P Q F

L21F2: R Q P A P A P P F

L21B11: Q Q P A P A T P F

L22F7: Q Q P A P A G P F

L23G5: Q Q P M P A P P F

Tres variantes de la biblioteca del bucle 1 mostraron una toxicidad mejorada en el ensayo principal y en la repetición del ensayo (Tabla 8). 30

Tabla 8.

: Hz ECB VBC DBM SWCB

axmi004: - + ++ +++++ +

L11H11: - ++ + +++++ +

L11E8: - ++ ++ +++++ Sin datos

L11F9: + ++ + +++++ Sin datos

Las tres variantes mejoradas están mutadas en la posición 316 de la SEC ID Nº: 14, donde el residuo de asparagina se mutó a valina, prolina o fenilalanina en los mutantes L11E8, L11F9 y L11H11, respectivamente, lo que sugiere que se ha identificado una posición importante relacionada con la actividad mejorada.

Las siguientes variantes del bucle 3 mostraron una toxicidad mejorada en la detección selectiva primaria, la repetición del ensayo de la actividad del ECB y los escalados. 5

Tabla 9:

: Puntuación de aturdimiento Mortalidad (porcentaje)

AXMI004: ++ 28 %

L31B10: ++ Sin datos

L31A11: ++ 20 %

L31H11: ++ 33 %

Las variantes mejoradas están mutadas desde lisina en la posición 434 de AXMI004 a treonina y valina en los mutantes L31B10 y L31A11, respectivamente, y de prolina en la posición 438 de AXMI004 a serina en el mutante 10 L31H11. En una estructura de cristal simulada de estos AXMI004, las cadenas laterales de las posiciones mutadas en los bucles 1, 2 y 3 miran todas en la misma dirección general. Este hallazgo sugiere que los aminoácidos en varios bucles pueden contribuir a una interfaz de unión común. Por tanto, las permutaciones adicionales que incorporan una diversidad funcionalmente mejorada en varios bucles pueden proporcionar todavía más mejoras en la actividad. 15

Ejemplo 5. Evolución dirigida de AXMI-150

Este ejemplo describe la evolución dirigida de AXMI-150 (SEC ID Nº: 2). La mutagénesis se ha dirigido a un bucle en la supuesta región de procesamiento. 20

El plásmido pAX5482 (His6-axmi150 en pRSF1b) se usó para la expresión de axmi-150 salvaje y también fue la base para la mutagénesis y la expresión variante. La mutagénesis se realizó usando el kit Lightning QUIKCHANGE® (Stratagene), se secuenciaron los mutantes y se identificaron variantes únicas. Se generó la siguiente diversidad de mutantes puntuales: 25

Tabla 10

: 116 117 118 119 120 121 122

AXMI150: N N T G S S K

: P T S A P A G

: R G P S T G C

: T S A E R T P

: G C R M C P S

: Y A G V A R T

: Q P N L G Q R

: K R D Q L E H

: A K M D E L I

: W E L H Q H E

: S M V K H D N

: F H V V D

: E F L

: Y Y

: K M

: Q

TOTAL: 10 11 14 10 11 12 15

Expresión y detección selectiva en bibliotecas

30

Detección selectiva primaria:

Las variantes de la biblioteca combinada, así como pAX5482, se transformaron en células BL21*DE3 y se sembraron en LB+ Kanamicina (100 µg/ml). Se seleccionaron las colonias frescas en 16 ml de medio líquido LB+ Kanamicina (100 µg/ml) y se cultivaron en bloques de 24 pocillos profundos a 37 ºC y 300 rpm hasta alcanzar una DO600 nm de 0,3 - 0,4. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM y los cultivos se incubaron durante 18 horas adicionales a 20 ºC. La DO600 nm se determinó y las células se recogieron mediante centrifugación (10 5 minutos a 4.500 rpm, 4 ºC). Los sedimentos celulares se resuspendieron en carbonato sódico 50 mM a pH 10,5, DTT 1 mM a una densidad de OD600/ml 10. Las células se rompieron mediante batido con esferas y los extractos solubles se obtuvieron tras centrifugar a 4.000 rpm durante 15 minutos a 4 ºC.

Los extractos se analizaron para determinar la actividad contra ECB, SWCB, Hz, VBC y DBM a 4 duplicados por 10 cada variante. Tras 5 días se determinaron las puntuaciones de la toxicidad mediante el promedio de las puntuaciones de 4 duplicados. Se cribaron 119 variantes, dando una cobertura 1,5x de la biblioteca.

Repetición de los ensayos y escalado:

15

Las variantes que mostraban puntuaciones mejoradas sobre el ECB o el SWCB se secuenciaron y se volvieron a analizar a 4 duplicados por variante. Las variantes que mostraban de nuevo una mejor actividad contra el ECB o el SWCB se seleccionaron para el escalado.

Para los escalados, se escogieron 3 colonias recién transformadas en 70 ml de LB+Kanamicina (100 µg/ml) y se 20 cultivaron en matraces de agitación de 0,5 litros a 37 ºC y 150 rpm hasta alcanzar una DO600 nm de 0,3 - 0,4. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM y los cultivos se incubaron durante 18 horas adicionales a 20 ºC. La DO600 nm se determinó y las células se recogieron mediante centrifugación (10 minutos a 5000 rpm, 4 ºC). Los sedimentos celulares se resuspendieron en carbonato sódico 50 mM a pH 10,5, DTT 1 mM a una densidad de OD600/ml 10. Las células se rompieron mediante batido con esferas y los extractos solubles se obtuvieron tras 25 centrifugar a 4.000 rpm durante 15 minutos a 4 ºC. Las variantes de Axmi-150 en dichos extractos se cuantificaron en SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie comparando diluciones en serie del extracto con un patrón de BSA de concentración conocida. Todas las proteínas variantes analizados se expresan a niveles muy similares.

Las preparaciones de escalado se analizaron contra ECB, SWCB, VBC, Hz y DBM a 16 duplicados por variante y plaga. Se realizó el promedio de las puntuaciones y se determinaron las desviaciones estándar. 30

Las actividades de las variantes que mostraban mejoras en los escalados se muestran en las Tablas 11-13 a continuación:

Tabla 11:

n= 16: Actividad contra ECB Actividad contra SWCB

: Puntuación de aturdimiento Mortalidad Puntuación de aturdimiento Mortalidad

AXMI150: + - +++ 25 %

L11D3: + - +++ 38 %

L11D6: - - +++ 25 %

L11B6: + - +++ 16 %

L11E5: - - +++ 19 %

pRSF1b: - - - -

35

Tabla 12

n= 16: Actividad contra ECB Actividad contra SWCB

AXMI150: + 8 % +++ (n=12) 58 %

L11C10: + 13 % ++++ 97 %

L11D10: ++ 8 % +++ 75 %

L11F10: + - +++ 72 %

L11E12: + - + (n=12) 31 %

Tabla 13

n= 16: Actividad contra ECB Actividad contra SWCB

AXMI150: + - +++ 41 %

L11G5: - - - 6 %

L11D1: - 2 % +++ 64 %

L11A6: - 3 % ++ 41 %

L11B5: - 5 % + 19 %

L12C1: - - ++ 37 %

La diversidad de la secuencia en dichas variantes mejoradas se describe a continuación:

Tabla 14 5

: 116 117 118 119 120 121 122

AXMI150: N N T G S S K

L11A6: N N S G S S K

L11B5: N N N G S A K

L11B6: N N T G S S K

L11C10: K N T G S S K

L11D1: N N T G G S K

L11D10: N N T G Q S K

L11D3: N N T K S S K

L11F10: N N T G S P K

Ejemplo 6. Vectorización de los genes para la expresión en plantas

Las regiones de codificación de la invención están unidas con las secuencias adecuadas del promotor y el terminador para la expresión en plantas. Dichas secuencias son bien conocidas en la técnica y pueden incluir el 10 promotor de la actina del arroz o el promotor de la ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor de UBQ3 de Arabidopsis o el promotor 35 S del CaMV para la expresión en dicotiledóneas y los terminadores nos o PinII. Las técnicas para producir y confirmar construcciones promotor-gen-terminador también son bien conocidas en la técnica.

15

En un aspecto de la invención, las secuencias de ADN sintético se diseñan y generan. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de nucleótidos alterada respecto a la secuencia parental, pero codifican proteínas que son esencialmente idénticas a la proteína AXMI-150 parental (por ejemplo, las SEC ID Nº: 3, 4,5,6, o 7).

En otro aspecto de la invención, se incluyen las secuencias de ADN sintético que codifican proteínas que son 20 esencialmente idénticas a la proteína AXMI-004 (por ejemplo, las SEC ID Nº: 8 - 12). La proteína AXMI-004 se describe en la patente de EE.UU. Nº 7.355.099 y la solicitud de la patente de EE.UU. Nº 12/209.354, presentada el 12 de septiembre de 2008, titulada “Synthetic AXMI-004 Delta-endotoxin Genes and Methods for Their Use," y publicada como documento US 2010/0099081.

25

En otro aspecto de la invención se diseñan versiones modificadas de los genes sintéticos de forma que el péptido resultante está dirigido a un orgánulo de la planta, tal como el retículo endoplasmático o el apoplasto. Las secuencias peptídicas que se sabe que dirigen las proteínas de fusión a los orgánulos de plantas se conocen en la técnica. Por ejemplo, la región en N-terminal del gen de la fosfatasa ácida del altramuz blanco Lupinus albus (ID en GENBANK® GI:14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594 - 606) que dan como resultado un retículo 30 endoplasmático diana de las proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención del retículo endoplasmático que comprende el extremo N-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL", SEC ID Nº: 13) en el extremo C, la proteína de fusión estará dirigida al retículo endoplasmático. Si la proteína de fusión carece de una secuencia de dirección del retículo endoplasmático en el extremo C, la proteína estará dirigida al retículo endoplasmático pero en última instancia será secuestrada en 35 el apoplasto.

Por tanto, este gen codifica una proteína de fusión que contiene los treinta y un aminoácidos en N-terminal del gen de la fosfatasa ácida del altramuz blanco Lupinus albus (ID en GENBANK® GI:14276838, Miller et al., 2001, citado anteriormente) fusionados con el extremo N de la secuencia de aminoácidos de la invención, así como la secuencia 40

KDEL en el extremo C. Por tanto, se ha predicho que la proteína resultante está dirigida al retículo endoplasmático de la planta tras la expresión en una célula vegetal.

Los casetes de expresión vegetal descritos anteriormente se combinan con un marcador seleccionable vegetal adecuado para ayudar en la selección de células y tejidos transformados, y se unen en los vectores de 5 transformación vegetales. Estos pueden incluir vectores binarios de la transformación mediada por Agrobacterium o simples vectores plasmídicos para transformación por aerosol o biolística.

Ejemplo 7. Vectorización de los genes para la expresión en plantas

10

Los ADN de la región de codificación de los genes de la invención están conectados operativamente con las secuencias adecuadas del promotor y el terminador para la expresión en plantas. Dichas secuencias son bien conocidas en la técnica y pueden incluir el promotor de la actina del arroz o el promotor de la ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor de UBQ3 de Arabidopsis o el promotor 35 S del CaMV para la expresión en dicotiledóneas y los terminadores nos o PinII. Las técnicas para producir y confirmar construcciones 15 promotor-gen-terminador también son bien conocidas en la técnica.

Los casetes de expresión vegetal descritos anteriormente se combinan con un marcador seleccionable vegetal adecuado para ayudar en la selección de células y tejidos transformados, y se unen en los vectores de transformación vegetales. Estos pueden incluir vectores binarios de la transformación mediada por Agrobacterium o 20 simples vectores plasmídicos para transformación por aerosol o biolística.

Ejemplo 8. Transformación de células de maíz con los genes de proteínas plaguicidas descritos en el presente documento

25

Las mazorcas de maíz se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas y se prefieren los embriones 0, 8-1, 5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Los embriones se siembran en placas con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como medio DN62A5S (Sales N6 3, 98 g/l; 1 ml/l (de reservas 1.000x) de vitaminas N6; 800 mg/l de L-asparagina; 100 mg/l de mio-inositol; 1, 4 g/l de L-Prolina; 100 mg/l de casaminoácidos; 50 g/l de sacarosa; 1 mL/l (del reservas de 1 mg/ml) de 2, 4-D). 30 No obstante, son adecuados medios y sales distintos a DN62A5S y son conocidos en la técnica. Los embriones se incuban durante la noche a 25 ºC en oscuridad. No obstante, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a medios osmóticos 35 durante aproximadamente 30-45 minutos, después se transfieren a una placa radiante (ver, por ejemplo, la publicación PCT Núm. WO/0138514 y la patente de EE.UU. Nº 5.240.842).

Las construcciones de ADN diseñadas para los genes de la invención en células vegetales se aceleran en el tejido vegetal usando un acelerador de haz de aerosol, usando las condiciones esencialmente como se describe en la 40 publicación PCT Nº WO/0138514. Después de la irradiación, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 minutos en medios osmóticos, a continuación se colocan en medios de incubación durante la noche a 25 °C en oscuridad. Para evitar dañar de forma indebida a los explantes irradiados, se incuban durante al menos 24 horas antes de la transferencia al medio de recuperación. Después, los embriones se esparcen sobre el medio para el período de recuperación, durante aproximadamente 5 días, a 25 °C en la oscuridad, a continuación se transfieren a 45 un medio de selección. Los explantes se incuban en medio de selección durante hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere al medio de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan a continuación con poca luz y el proceso de regeneración se inicia mediante métodos conocidos en la técnica. Se permite que los brotes resultantes 50 enraícen en medio de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

55

Medio DN62A5S

Componentes: Por litro Fuente

Mezcla de sales basales Chu N6 (Núm. de Prod. C 416): 3,98 g/l Phytotechnology Labs

Solución de vitamina Chu N6 (Núm. de Prod. C 149): 1 ml/l (de reservas 1.000x) Phytotechnology Labs

L-Asparagina: 800 mg/l Phytotechnology Labs

Mio-inositol: 100 mg/l Sigma

L-Prolina: 1,4 g/l Phytotechnology Labs

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: 5

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que 10 tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.
2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula vegetal.

15
3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que se ha diseñado para su expresión en una planta.
4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3, preferentemente que comprende adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo. 20
5. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 4, que es preferentemente:

(a) una célula huésped bacteriana; o

(b) una célula vegetal. 25
6. Una planta transgénica que comprende la célula huésped vegetal de la reivindicación 5, donde preferentemente dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza de semilla oleaginosa.

30
7. Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3.
8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en las SEC ID Nos: 3, 4, 5, 6 y 7. 35
9. Un polipéptido con actividad plaguicida, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2;

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al 40 menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

c) un polipéptido que está codificado por la SEC ID Nº: 1,

preferentemente que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

45
10. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 9, donde:

(a) dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un polvo, un polvo fino, una bolita, un gránulo, un aerosol, una emulsión, un coloide y una solución;

(b) dicha composición se puede obtener mediante desecación, liofilización, homogeneización, extracción, 50 filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células bacterianas; o

(c) dicha composición comprende del 1 % al 99 % en peso de dicho polipéptido.
11. Un método para controlar una población de plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipéptido de la 55 reivindicación 9.
12. Un método para destruir una población de plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende poner en contacto dicha plaga con, o alimentar a dicha plaga con, una cantidad plaguicidamente eficaz de un polipéptido de la reivindicación 9. 60
13. Un método para producir un polipéptido con actividad plaguicida, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.
14. Una planta que tiene incorporado establemente en su genoma una construcción de ADN que comprende una 65 secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de

nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y 5

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2;

donde dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en una célula vegetal. 10
15. Un método para proteger a una planta de una plaga, que comprende introducir en dicha planta o célula de la misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

15

a) la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; y

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, 20 donde preferentemente dicha planta produce un polipéptido plaguicida que tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros.