EA019574B1

EA019574B1 - Дельта-эндотоксиновый ген axmi-150 и способы его применения

Info

Publication number: EA019574B1
Application number: EA201170717A
Authority: EA
Inventors: Кимберли С. Сэмпсон; Дэниел Дж. Томсо; Фолькер Хайнрихс
Original assignee: Атеникс Корпорейшн
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2014-04-30
Also published as: WO2010075498A3; CN102388143A; UY38535A; UY32361A; US20120073016A1; EP2379724A2; US8084416B2; WO2010075498A2; AR075114A1; CO6400155A2; EP2379724B1; ES2534581T3; BRPI0923159A2; US8791326B2; MX2011006694A; CA2747826A1; EA201170717A1; ZA201104532B; US20100160231A1

Abstract

Изобретение относится к композициям и способам придания пестицидной активности бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. Изобретение относится к композициям, включающим кодирующую последовательность для пестицидных полипептидов. Кодирующие последовательности могут использоваться в ДНК-конструктах или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в растениях и бактериях. Композиции также включают трансформированную бактерию, растения, растительные клетки, ткани и семена. В частности, изобретение относится к выделенным пестицидным молекулам нуклеиновых кислот. Дополнительно охвачены аминокислотные последовательности, соответствующие полинуклеотидам. В частности, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, имеющим нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, а также их варианты или фрагменты.

Description

Область изобретения

Это изобретение относится к области молекулярной биологии. Оно относится к новым генам, которые кодируют пестицидные белки. Эти белки и последовательности нуклеиновых кислот, которые их кодируют, являются пригодными для получения пестицидных составов и получения трансгенных растений, устойчивых к вредителям.

Предпосылки изобретения

ВасШик 11шппщепк1к является грамположительной спорообразующей почвенной бактерией, характеризующейся ее способностью продуцировать кристаллические включения, которые проявляют специфическую токсичность в отношении определенных отрядов и видов насекомых, но безвредны для растений и других организмов, не являющихся мишенью. По этой причине композиции, включающие штаммы ВасШик 11шппщепк1к или их инсектицидные белки, могут применяться в качестве экологически приемлемых инсектицидов для борьбы с сельскохозяйственными насекомыми-вредителями или насекомыми-переносчиками различных заболеваний человека или животных.

Кристаллические (Сгу) белки (дельта-эндотоксины) из ВасШик 1Ниг1пц1спк1к имеют высокую инсектицидную активность главным образом по отношению к чешуекрылым, двукрылым и жесткокрылым личинкам. Эти белки также проявляли активность по отношению к вредителям отрядов Нутспор1сга. Нотор1сга. РЫЫгар1ега, Ма11ор1ада и Асап, а также других отрядов беспозвоночных, таких как №таШе1тШШек, Р1а1уйе1тШШек и 8атсотакйдогрйога (Рейе1коп (1993) Т1е ВасШик Т1шппщепк1к Гатйу 1гее. Абгапсеб Епдтеетеб Рекйс1бек, Магсе1 Эеккег, 1пс., Ыете Уотк, Ν.Υ.). Эти белки первоначально были классифицированы как Сту1-СтуУ, в первую очередь, на основе их инсектицидной активности. Основными классами были Ьер1бор1ега-специфический (I), Ьер1бор1ета- и Э|р1ега-специфический (II), Со1еор1ета-специфический (III), Э|р1ега-специфический (IV) и нематодо-специфический (V) и (VI). В дальнейшем белки были классифицированы в подсемейства; более родственные белки внутри каждого семейства обозначили буквами подразделения, такими как Сгу1А, Сгу1В, Сгу1С и т.д. Еще более близкородственным белкам внутри каждого подразделения были даны названия, такие как Сгу1С1, Сгу1С2 и т.д.

Недавно была описана новая номенклатура для генов Сгу, которая основывается скорее на гомологии аминокислотной последовательности, чем на специфичности по отношению к насекомым-мишеням (Спсктоге е1 а1. (1998) МютоЫок Мо1. Вю1. Кеу. 62:807-813). В новой классификации каждый токсин обозначается уникальным названием, включающим первый иерархический уровень (арабская цифра), второй иерархический уровень (заглавная буква), третий иерархический уровень (строчная буква) и четвертый иерархический уровень (другая арабская цифра). В новой классификации римские цифры в первом иерархическом уровне были заменены на арабские. Белки с менее чем 45%-ной идентичностью последовательностей имеют различные первые иерархические уровни, а для второго и третьего иерархических уровней критериями являются 78 и 95% соответственно.

Кристаллический белок не проявляет инсектицидной активности до того, как будет поглощен и растворен в средней кишке насекомого. Поглощенный протоксин в пищеварительном тракте насекомого гидролизируется протеазами до активной токсичной молекулы (Нойе апб \У1Ше1еу (1989) МютоЫок Рет. 53:242-255). Этот токсин связывается с рецепторами щеточной каемки на апикальной поверхности клетки в средней кишке личинки-мишени и встраивается в апикальную мембрану, создавая ионные каналы или поры, приводящие к смерти личинки.

Дельта-эндотоксины, как правило, имеют пять доменов с консервативной последовательностью и три консервативных структурных домена (см., например, бе Маадб е1 а1. (2001) Тгепбк Сепейск 17:193199). Первый консервативный структурный домен содержит семь α-цепей и вовлечен во встраивание в мембрану и образование поры. Домен II состоит из трех β-цепей, расположенных в конфигурации греческого ключа, а домен III состоит из двух антипараллельных β-слоев в конструкции сэндвич (бе Маадб е1 а1., 2001, см. выше). Домены II и III вовлечены в рецепторное распознавание и связывание и, следовательно, рассматриваются как детерминанты специфичности токсина.

В связи с ущербом, который могут причинить насекомые, и улучшениями в урожайности путем борьбы с насекомыми-вредителями существует постоянная необходимость открывать новые формы пестицидных токсинов.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к композициям и способам придания пестицидной активности бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. Композиции включают молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности пестицидных и инсектицидных полипептидов, векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, включающие векторы. Композиции также включают последовательности пестицидного полипептида и антитела к этим полипептидам. Нуклеотидные последовательности могут использоваться в ДНК конструктах или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в организмах, включая микроорганизмы и растения. Нуклеотидная или аминокислотная последовательности могут быть синтетическими последовательностями, которые были сконструированы для экспрессии в организме, включая, но без ограничения, микроорганизм или растение. Композиции также включают трансформированную бактерию, растения, растительные клетки, тка

- 1 019574 ни и семена.

В частности, изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют пестицидный белок. Дополнительно включены аминокислотные последовательности, соответствующие пестицидному белку. В частности, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ N0: 2 или нуклеотидную последовательность, приведенную в 8ЕС ΙΌ N0: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, а также их варианты или фрагменты. Также включены нуклеотидные последовательности, которые комплементарны нуклеотидной последовательности по изобретению или которые гибридизируются с последовательностью по изобретению.

Обеспечиваются способы продуцирования полипептидов по изобретению и применения таких полипептидов для борьбы или уничтожения чешуекрылого, жесткокрылого, нематоды или двукрылого вредителя. Также включены способы и наборы для обнаружения в образце нуклеиновых кислот и полипептидов изобретения.

Композиции и способы по изобретению являются пригодными для получения организмов с усиленной устойчивостью или толерантностью к вредителям. Эти организмы и композиции, включающие организмы, являются желательными для сельскохозяйственных целей. Композиции по изобретению также являются пригодными для образования измененных или улучшенных белков, которые обладают пестицидной активностью, или для обнаружения наличия пестицидных белков или нуклеиновых кислот в продуктах или организмах.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к композициям и способам регулирования устойчивости или толерантности к вредителям у организмов, особенно растений или растительных клеток. Под устойчивостью подразумевают уничтожение вредителя (например, насекомого) после поглощения или другого контакта с полипептидами по изобретению. Под толерантностью подразумевают уменьшение или нарушение двигательной активности, питания, воспроизводства или других жизненных функций вредителя. Способы включают трансформацию организмов нуклеотидной последовательностью, кодирующей пестицидный белок по изобретению. В частности, нуклеотидные последовательности по изобретению являются пригодными для получения растений и микроорганизмов, которые обладают пестицидной активностью. Таким образом, изобретение относится к трансформированным бактериям, растениям, растительным клеткам, растительным тканям и семенам. Композициями являются пестицидные нуклеиновые кислоты и белки ВасШиз или других видов. Последовательности находят применение в конструировании векторов экспрессии для последующей трансформации в интересующие организмы в качестве зондов для выделения других гомологичных (или частично гомологичных) генов и для образования измененных пестицидных белков с помощью способов, известных в данной области, таких как обмен доменами или перестановка в ДНК. Белки находят применение в борьбе с или уничтожении популяций чешуекрылых, жесткокрылых, двукрылых и нематодных вредителей и в получении композиций с пестицидной активностью.

Под пестицидным токсином или пестицидным белком подразумевается токсин, который обладает токсичной активностью в отношении одного или более вредителей, включая, но без ограничения, членов отрядов Бср|бор1сга. Э|р1сга и Со1еор1ета или класса №та1оба. или белок, который обладает гомологичностью к такому белку. Пестицидные белки выделены из организмов, включая, например, ВасИ1из зр., С1оз1пбшт ЫГегтегИапз и РаешЬасШиз рорййае. Пестицидные белки включают аминокислотные последовательности, полученные из полноразмерных нуклеотидных последовательностей, раскрытые в настоящей заявке, и аминокислотные последовательности, которые короче, чем полноразмерные последовательности, либо в результате использования альтернативного сайта инициации трансляции, либо в результате процессинга, который продуцирует более короткий белок, обладающий пестицидной активностью. Процессинг может происходить в организме, в котором экспрессируется белок, или во вредителе после поглощения белка.

Одним из видов белков с пестицидными свойствами являются дельта-эндотоксины. Дельтаэндотоксины включают белки, идентифицированные как ряд белков Сгу1 с Сгу43, Су11 и Су12 и Су!подобный токсин. На данный момент известно более 250 видов дельта-эндотоксинов с широким диапазоном специфичнности и токсичности. В отношении обширного списка см. Спсктоге е! а1. (1998), ΜίсгоЬю1. Мо1. Вю1. Кеу. 62:807-813, а постоянные обновления см. Спскшоге е! а1. (2003) ВасШиз Шит1пд1еп81з 1охш иотепс1а1иге на сайте \\л\л\\Ью1з.зизх.ас.ик/Но1пе/№П_С.’псктоге/В1/тбех.

Таким образом, изобретение относится к новым выделенным нуклеотидным последовательностям, которые обеспечивают пестицидную активность. Эти выделенные нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды с гомологией к известным дельта-эндотоксинам или бинарным токсинам. Изобретение также относится к аминокислотным последовательностям пестицидных белков. Белок, полученный в результате трансляции этого гена, позволит клеткам бороться с или уничтожать вредителей, которые их поглощают.

Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты и их варианты и фрагменты

Один аспект изобретения относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновой

- 2 019574 кислоты, включающим нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки и полипептиды или их биологически активные участки, а также молекулам нуклеиновой кислоты, достаточным для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих белки с участками с гомологичными последовательностями. В рамках данного изобретения под выражением молекула нуклеиновой кислоты подразумеваются молекулы ДНК (например, рекомбинантной ДНК, кДНК или геномной ДНК), молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, образованные из нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она является двухцепочечной ДНК.

Понятие выделенная последовательность нуклеиновой кислоты (или ДНК), используемое здесь, обозначает последовательность нуклеиновой кислоты (или ДНК), которая больше не находится в своем естественном окружении, например ίη νίίτο или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота не содержит последовательностей (предпочтительно последовательностей, кодирующих белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательности, расположенные в 5' и 3' концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Для целей изобретения выражение выделенный в случае, когда используется по отношению к молекулам нуклеиновой кислоты, исключает выделенные хромосомы. Например, в различных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дельта-эндотоксин, может содержать менее чем приблизительно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в естественных условиях фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клеток, из которой получена нуклеиновая кислота. В различных вариантах осуществления белок дельта-эндотоксин, который, по существу, не содержит клеточный материал, включает препараты белка, содержащие менее чем приблизительно 30, 20, 10 или 5% (по сухому весу) белка, не являющегося дельта-эндотоксином (также называемого здесь как загрязняющий белок).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки настоящего изобретения, включают последовательность, приводимую в 8ЕО ΙΌ N0: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и ее варианты, фрагменты и комплементы. Под комплементом подразумевают нуклеотидную последовательность, которая достаточно комплементарна данной нуклеотидной последовательности так, чтобы она могла гибридизироваться с данной нуклеотидной последовательностью и, таким образом, сформировать устойчивый дуплекс. Соответствующая аминокислотная последовательность для пестицидного белка, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью, приводится в 8ЕС ΙΌ N0: 2 или аминокислотные последовательности ΑΧΜΙ-004, описываемые в патенте США № 7355089 и патентной заявке США № 12/209354, поданной 12 сентября 2008 г. с названием Синтетические дельта-эндотоксиновые гены ΑΧΜΙ-004 и способы их применения, которые включены в настоящее описание ссылкой в их полном объеме.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются фрагментами этих нуклеотидных последовательностей, кодирующих пестицидные белки, также охвачены изобретением. Под фрагментом подразумевают часть нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активную часть пестицидного белка, или он может быть фрагментом, который может использоваться как гибридизационный зонд или праймер для ПЦР с применением способов, раскрытых ниже. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые являются фрагментами нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, включают по меньшей мере приблизительно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 смежных нуклеотидов или до такого числа нуклеотидов, которое присутствует в полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, раскрытый в настоящей заявке, в зависимости от предполагаемого использования. Под смежными нуклеотидами подразумевают нуклеотидные остатки, которые являются непосредственно примыкающими друг к другу. Фрагменты нуклеотидных последовательностей по изобретению кодируют белковые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность пестицидного белка и, следовательно, сохраняют пестицидную активность. Под сохраняет активность подразумевают, что фрагмент обладает по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70, 80, 90, 95% или более от пестицидной активности пестицидного белка. В одном варианте осуществления пестицидной активностью является активность по отношению к жесткокрылым. В другом варианте осуществления пестицидной активностью является активность по отношению к чешуекрылым. В другом варианте осуществления пестицидной активностью является активность по отношению к нематодам. В другом варианте осуществления пестицидной активностью является активность по отношению к двукрылым. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, Схар1а апб Ьапд (1990) 1. Есоп. Ейото1. 83:2480-2485; Апбтете οί а1. (1988) Вюсйет. 1. 252:199-206; Маггопе е1 а1. (1985) 1. οί Есопоиис ЕЩото1оду 78:290-293 и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящее описание ссылкой в их полном объеме.

Фрагмент нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, который кодирует биологически активную часть белка по изобретению, кодирует по меньшей мере приблизительно от 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 смежных аминокислот и вплоть до всего

- 3 019574 числа аминокислот, представленных в пестицидном белке полной длины по изобретению.

Предпочтительные пестицидные белки настоящего изобретения кодируются нуклеотидной последовательностью, достаточно идентичной к нуклеотидной последовательности ЗЕС ГО N0: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12. Под достаточно идентичный подразумевают аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60 или 65% идентична, приблизительно на 70 или 75% идентична, приблизительно на 80 или 85% идентична, приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентична референсной последовательности, с использованием одной из программ выравнивания, описанных здесь, использующей стандартные параметры. Специалисту в данной области понятно, что эти значения могут быть соответствующим образом откорректированы для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, принимая в учет вырожденность кодонов, сходство аминокислотных последовательностей, местонахождение рамки считывания и т.д.

Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для этих последовательностей (т.е. процентная идентичность = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся фрагментов) х100). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. В другом варианте осуществления процентную идентичность подсчитывают через целостность референсной последовательности (т.е. последовательности, раскрытой здесь как любой из 8ЕС ГО N0: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12). Процентная идентичность между двумя последовательностями может быть определена с применением методик, подобных тем, которые описаны ниже, вставляя или не вставляя гэпы. При подсчете процентной идентичности обычно подсчитывают точные совпадения.

Определение процентной идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с применением математического алгоритма. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, который используется для сравнения последовательностей, является алгоритм Кат1ш и А11зс1ш1 (1990) Ргос. Να11. Асаб. δει. И8А 87:2264, модифицированный, как описано в Катйи и А1!зсйи1 (1993) Ргос. №И. Асаб. δει. И8А 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в программы ΒΤΑ8ΤΝ и ВЬАЗТХ по АЙ8СЙи1 е! а1. (1990) 1. Мо1. Βίο1. 215:403. Поиск нуклеотидов в пакете программ ВЬАЗТ может быть проведен программой ΒΤΑ8ΤΝ, мера сходства = 100, длина выравнивания = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных пестицидно-подобным молекулам нуклеиновой кислоты по изобретению. Поиск белков в пакете программ ВЬАЗТ может быть проведен программой ВЬАЗТХ, мера сходства = 50, длина выравнивания = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных пестицидным белковым молекулам изобретения. Для получения выравниваний, содержащих гэпы, с целью сравнения может быть использована база данных Сарреб ВЬАЗТ (в ВЬАЗТ 2.0), как описано в А118СЙц1 е! а1. (1997) ШсШс Ас1бз Кез. 25:3389. Альтернативно может быть использована база данных Р81-В1аз! для проведения итеративного поиска, который обнаруживает дальние взаимоотношения между молекулами. См. АНзсНЫ е! а1. (1997) выше. Применяя программы ВЬАЗТ, Сарреб ВЬАЗТ и Р31-В1аз! можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ВЬАЗТХ и ВЬАЗТК). Выравнивания могут быть выполнены вручную, путем просмотра.

Другим неограничивающим примером математического алгоритма, который используется для сравнения последовательностей, является алгоритм С’1из1а1\У (Нщдшз е! а1. (1994) ШсШс Ас1бз Кез. 22:4673-4680). С1из!а1^ сравнивает последовательности и выравнивает аминокислотные или ДНК последовательности и, таким образом, может предоставить данные о сохранении последовательностью всей аминокислотной последовательности. Алгоритм С'1из1а1\У используют в некоторых коммерчески доступных пакетах программ ДНК/аминокислотного анализа, таких как модуль А^IСNX пакета Уес!от ΝΉ Ргодгат 8ш!е (компании 1пуйтодеи Сотрогабои, Карлсбад, Калифорния, США). После выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью алгоритма С1из!а1^ может быть оценена идентичность аминокислотного состава в процентах. Неограничивающим примером компьютерной программы, пригодной для анализа С1из!а1^ выравниваний, является СЕ№П0С™. СЕ№П0С™ (Каг1 №с1ю1аз) позволяет оценить аминокислотное (или ДНК) сходство и идентичность между множествами белков. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, который используется для сравнения последовательностей, является алгоритм Муетз и МШет (1988) САВ108 4:11-17. Такой алгоритм встроен в программу Λ6№Ν (версия 2.0), которая является частью пакета программ ССС \У1зсопзт Сеиейсз 8оП\таге Раскаде, версия 10 (имеется в наличии у компании Ассе1гуз, 1пс., 9685 Зсгап!ои Кб., Зап О|едо. СА, ИЗА). При использовании программы А^IСN для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть использованы таблица весовых остатков РАМ 120, штраф за удлинение 12 и штраф за гэп 4.

Если не утверждается иное, САР версии 10, который использует алгоритм по №еб1етаи апб \Уипзс1 (1970) 1. Мо1. 48(3):443-453, используют для определения идентичности или сходства последовательности с применением следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с применением значений для ГЭПа - 50 и для длины - 3, и матрицы подсчета иетздарбиа.стр;

- 4 019574 % идентичности или % сходства для аминокислотной последовательности с применением значений для ГЭПа - 8 и длины - 2 и программы подсчета ВЬО8иМ62. Также могут быть использованы эквивалентные программы. Под эквивалентной программой подразумевают любую программу сравнения последовательностей, которая для любых двух исследуемых последовательностей производит выравнивание, имеющее идентичные совпадения нуклеотидных остатков и идентичный процент сходства последовательностей по сравнению с соответствующим выравниванием, произведенным САР версии 10. Изобретение также охватывает вариантные молекулы нуклеиновой кислоты. Варианты нуклеотидных последовательностей, кодирующих пестицидный белок, включают такие последовательности, которые кодируют пестицидные белки, раскрытые в настоящей заявке, но которые консервативно отличаются из-за вырожденности генетического кода, а также такие, которые являются достаточно идентичными, как обсуждалось выше. Природные аллельные варианты могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных методов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методы гибридизации, как кратко описано ниже. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, которые образованы, например, с применением сайт-направленного мутагенеза, но которые еще и кодируют пестицидные белки, раскрытые в настоящем изобретении, как описано ниже. Вариантные белки, охваченные настоящим изобретением, являются биологически активными, т.е. они продолжают обладать желаемой биологической активностью нативного белка, т.е. пестицидной активностью. Под сохраняет активность подразумевают, что вариант обладает по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70% или по меньшей мере приблизительно 80% от пестицидной активности нативного белка. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, Схар1а и Ьаид (1990) 1. Есоп. Еи1ошо1. 83:2480-2485; Апбге\\ъ е! а1. (1988) Вюсйет. 1. 252:199206; Маггопе е! а1. (1985) 1. о£ Есоиотю Еи1ото1оду 78:290-293 и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящее описание ссылкой в их полном объеме.

Специалисту в данной области также понятно, что изменения могут быть внесены посредством мутации нуклеотидных последовательностей изобретения, приводя, таким образом, к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых пестицидных белков, без изменения биологической активности белков. Таким образом, выделенные вариантные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть созданы посредством введения одной или более нуклеотидных замен, добавлений или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящей заявке так, чтобы одна или более аминокислотных замен, добавлений или делеций являлись введенными в кодируемый белок. Мутации могут быть введены стандартными методами, такими как, сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Такие вариантные нуклеотидные последовательности также охвачены настоящим изобретением.

Например, консервативные аминокислотные замены могут быть сделаны в одном или более предсказанном, несущественном аминокислотном остатке. Несущественным аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен в последовательности дикого типа пестицидного белка без изменения биологической активности, в то время как незаменимый аминокислотный остаток необходим для обеспечения биологической активности. Консервативная аминокислотная замена является такой, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Дельта-эндотоксины, как правило, имеют пять доменов с консервативной последовательностью и три консервативных структурных домена (см., например, бе Маадб е! а1. (2001) Тгеибк Сеиебск 17:193199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи α-цепей и вовлечен во встраивание в мембрану и образование поры. Домен II состоит из трех β-цепей, расположенных в конфигурации греческого ключа, а домен III состоит из двух антипараллельных β-слоев в конструкции сэндвич (бе Маадб е! а1., 2001, см. выше). Домены II и III вовлечены в рецепторное распознавание и связывание и, следовательно, рассматриваются как детерминанты специфичности токсина.

Аминокислотные замены могут быть сделаны в неконсервативных участках, что обеспечивает сохранение функции. Как правило, такие замены не будут производиться для консервативных аминокислотных остатков или для аминокислотных остатков, располагающихся в пределах консервативного участка, где подобные остатки являются незаменимыми для белковой активности. Примеры остатков, которые являются консервативными и могут быть незаменимы для белковой активности, включают, например, остатки, которые являются идентичными для всех белков, включенных в выравнивание, подобных

- 5 019574 или родственных токсинов к последовательностям по изобретению (например, остатки, которые являются идентичными в выравнивании гомологичных белков). Примеры остатков, которые являются консервативными, но которые могут допускать консервативные аминокислотные замены и все еще сохранять активность, включают, например, остатки, которые могут иметь только консервативные замены для всех белков, содержащихся в выравнивании подобных или родственных токсинов к последовательностям по изобретению (например, остатки, которые имеют только консервативные замены для всех белков, включенных в выравнивание гомологичных белков). Однако специалист в данной области поймет, что функциональные варианты могут иметь незначительные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках.

Альтернативно, вариантные нуклеотидные последовательности могут быть созданы путем вставки мутаций случайным образом вдоль всей или части кодирующей последовательности, например насыщающим мутагенезом, а полученные мутанты можно подвергать скринингу на способность придания пестицидной активности для идентификации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован рекомбинантно, а активность белка можно определить, используя стандартные аналитические методики.

Используя такие способы, как ПЦР, гибридизацию и подобные, можно идентифицировать соответствующие пестицидные последовательности, при этом такие последовательности имеют существенную идентичность последовательностям изобретения. См., например, 8атЬтоок и Кикке11 (2001) Мо1еси1аг С1опшд: А ЬаЬота1оту Мапиа1. (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1оту Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ) и Ιηηίδ. е1 а1. (1990) РСК Рто1осо1к: А Ошбе 1о Мебюбк апб Аррйсабопк (Асабетк Ргекк, ΝΥ).

В гибридизационном способе вся или часть пестицидной нуклеотидной последовательности может быть использована для скрининга кДНК или геномных библиотек. Способы конструирования таких кДНК и геномных библиотек, как правило, известны в данной области и раскрыты в 8атЬтоок и Кикке11, 2001, см. выше. Так называемые гибридизационные зонды могут быть фрагментами геномной ДНК, фрагментами кДНК, фрагментами РНК или другими олигонуклеотидами и могут быть помечены детектируемой группой, такой как ³²Р, или любым другим детектируемым маркером, таким как радиоизотопы, флуоресцентное соединение, фермент или ферментный кофактор. Зонды для гибридизации могут быть созданы с помощью введения меток в синтетические нуклеотиды на основе известной нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, раскрытой в настоящей заявке. Можно дополнительно использовать вырожденные праймеры, разработанные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в нуклеотидной последовательности или кодируемой аминокислотной последовательности. Зонд обычно включает участок нуклеотидной последовательности, который гибридизируется в жестких условиях по меньшей мере с приблизительно 12, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 последовательными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок по изобретению или его фрагмент или вариант. Способы получения зондов для гибридизации, как правило, хорошо известны в данной области и раскрыты в работе 8атЬтоок и Кикке11, 2001, см. выше, включенной в настоящую заявку ссылкой.

Например, полная последовательность пестицидного белка, раскрытая в настоящей заявке, или одна или более ее часть может быть использована в качестве зонда, способного специфически гибридизироваться с соответствующими последовательностями пестицидных белковоподобных веществ и матричными РНК. Для достижения специфической гибридизации при различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов длиной или по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов длиной. Такие зонды могут использоваться для амплификации соответствующих пестицидных последовательностей из выбранного организма с помощью ПЦР. Эта методика может быть использована для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из желаемого организма или в качестве диагностического средства для определения наличия кодирующих последовательностей в организме. Методики гибридизации включают гибридизационный скрининг высеянных на чашки библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; см., например, 8атЬтоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С’кшпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1 (2б. еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Νον Уогк).

Гибридизация таких последовательностей может быть проведена при жестких условиях. Под жесткими условиями или жесткими условиями гибридизации подразумевают условия, при которых зонд будет гибридизироваться со своей целевой последовательностью до большей степени детектируемости, нежели с другими последовательностями (например, с сигналом по меньшей мере в 2 раза превышающим фон). Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Путем контролирования жесткости условий гибридизации и/или отмывки могут быть идентифицированы целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). Альтернативно, жесткость условий может быть отрегулирована, чтобы позволить некоторые несовпадения у последовательностей так, чтобы можно было обнаружить более низкие степени сходства (гетерологичное зондирование). Как правило, длина зонда, составляет менее чем приблизительно 1000 нуклеотидов в длину, предпочтительно менее чем приблизительно 500 нуклеотидов в длину.

В основном жесткими условиями будут такие, при которых концентрация солей составляет менее

- 6 019574 чем приблизительно 1,5М в пересчете на ионы Ыа, в основном приблизительно 0,01-1,0М ионов Να (или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, более чем 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих средств, таких как формамид. Примеры условий низкой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором 30-35% формамида, 1М Ναί'Ί. 1% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) при 37°С и промывку в 1Х-2Х 88С (20Х 88С = 3,0М ЫаС1/0,3М тринатрия цитрата) при 50-55°С. Примеры условий средней жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0М ЫаС1, 1% 8Ό8 при 37°С и промывку в 0,5Х-1Х 88С при 55-60°С. Примеры условий высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1М ЫаС1, 1% 8Ό8 при 37°С и промывку в 0,1Х 88С при 60-65°С. Факультативно, промывающий буфер может включать от приблизительно 0,1 до приблизительно 1% 8Ό8. Длительность гибридизации составляет, как правило, менее чем приблизительно 24 ч, обычно от приблизительно 4 до приблизительно 12 ч.

Специфичность в основном зависит от условий промывок после гибридизации, при этом критическими факторами являются ионная сила и температура раствора завершающей промывки. Для гибридов ДНК-ДНК Т_т может быть подсчитано из уравнения МешкоШ и \Уа111 (1984) Апа1. Вюскеш. 138:267-284: Т_т = 81,5°С + 16,6 (1од М) + 0,41 (% ОС) - 0,61 (% £отт) - 500/Ь; где М является молярностью одновалентных катионов, % ОС является процентным содержанием гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % £отт является процентным содержанием формамида в гибридизационном растворе, а Ь - длиной гибрида в парах оснований. Тт является температурой (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизируются с полностью совпадающим зондом. Т_т уменьшают на приблизительно 1 °С для каждого 1% несовпадений; таким образом, Тт условий гибридизации и/или промывки могут быть отрегулированы для гибридизации последовательностей желаемой идентичности. Например, если ищут последовательности с идентичностью >90%, Т_т можно уменьшить на 10°С. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы они были приблизительно на 5°С ниже, чем тепловая точка плавления (Т_т) для конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и значении рН. Однако в качестве условий высокой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже точки плавления (Тт); в качестве условий средней жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже точки плавления (Тт); в качестве условий низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем точка плавления (Т_т). Используя приведенное уравнение, сочетания условий для гибридизации и промывки и желаемой Т_т специалисты в данной области поймут, что степени жесткости в зависимости от условий применения растворов для гибридизации и/или промывки, по существу, описаны. Если желаемая степень несовпадений приводит к Т_т менее чем 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор формамида), то предпочтительным является повышение концентрации 88С так, чтобы могла быть использована более высокая температура. Обширную информацию по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Туззеп (1993) ЬаЬота(огу Тес11пк|иез ίη ВюсйетЩгу апй Мо1еси1аг Вю1оду-НуЬпЙ1/а1юп \νί11ι Ыис1ею Ааб РгоЬез, ч. I, гл. 2 (Е1зеу1ет, Ые\\' Уогк); и АизиЬе1 е! а1., изд. (1995) Ситгей Рто(осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, гл. 2 (Огеепе РиЬБзЫпд апб ^11еу-1п1егзс1епсе, Ые\\' Уогк). См. 8ашЬтоок е! а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1 (2-е изд., СоИ 8ртшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз, СоИ 8рттд НагЬог, Ые\т Уогк).

Выделенные белки и их варианты и фрагменты

Пестицидные белки также охвачены настоящим изобретением. Под пестицидным белком подразумевают белок, имеющий аминокислотную последовательность, предложенную в 8ЕО ГО ΝΟ: 2. Изобретение также относится к фрагментам, биологически активным частям и их вариантам, которые могут использоваться для осуществления способов по изобретению. Под выделенным белком обычно подразумевают белок, который не находится более в своем естественном окружении, например ίη νίΙΐΌ или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине.

Фрагменты или биологически активные части включают фрагменты полипептида, включающие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные к аминокислотной последовательности, предложенной в 8ЕО ГО ΝΟ: 2, и которые проявляют пестицидную активность. Биологически активная часть пестицидного белка может быть полипептидом, т.е., например, длиной 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 или более аминокислотных остатков. Такие биологически активные части могут быть получены рекомбинантными техниками и оценены на пестицидную активность. Способы определения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, Схар1а апб Ьапд (1990) 1. Есоп. Еп!ото1. 83:2480-2485; Апбте^з е! а1. (1988) Вюскеш. 1. 252:199-206; Маггопе е! а1. (1985) 1. о£ Есопотю Еп(ото1оду 78:290-293 и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящее описание ссылкой в их полном объеме. В рамках данной заявки фрагмент включает по меньшей мере 8 смежных аминокислот в последовательности 8ЕО ГО ΝΟ: 2. Однако изобретение охватывает другие фрагменты, такие как любой фрагмент в белке больше чем приблизительно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот.

- 7 019574

Под вариантами подразумевают белки или полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 2. Варианты также включают полипептиды, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 или ее комплементом при жестких условиях. Варианты включают полипептиды, которые отличаются в аминокислотной последовательности по причине мутагенеза. См., например, варианты, раскрытые в экспериментальной части настоящей заявки. Вариантные белки, охваченные данным изобретением, являются биологически активными, т.е. они продолжают обладать желаемой биологической активностью нативного белка, т.е. сохраняют пестицидную активность. В некоторых вариантах осуществления варианты обладают повышенной активностью относительно нативного белка. Способы определения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, Схар1а и Ьапд (1990) 1. Есоп. Еп1ошо1. 83:2480-2485; Апбгете е! а1. (1988) Βίοсйет. 1. 252:199-206; Маггопе е! а1. (1985) 1. οί Есопотю Еп!ото1оду 78:290-293 и патент США № 5743477, все из которых включены в настоящее описание ссылкой в их полном объеме.

Бактериальные гены, такие как амш-гены по изобретению, достаточно часто обладают множественными метиониновыми инициирующими кодонами в непосредственной близости к началу открытой рамки считывания. Часто инициация трансляции в одном или более этих стартовых кодонах будет приводить к образованию функционального белка. Эти стартовые кодоны могут включать АТС-кодоны. Однако бактерии, такие как ВасШик кр., также распознают кодон СТС как стартовый кодон, а белки, инициирующие трансляцию в СТС-кодонах, содержат метионин как первую аминокислоту. В редких случаях трансляция в бактериальных системах может инициироваться в ТТС-кодонах, таким образом, в этом случае ТТС кодирует метионин. Более того, не очень часто определяется а рпоп. какие из этих кодонов используются у бактерии в природе. Таким образом, следует понимать, что использование одного из альтернативных метиониновых кодонов может также привести к образованию пестицидных белков. Эти пестицидные белки охвачены в данном изобретении и могут применяться в способах по изобретению. Следует понимать, что при экспрессии в растениях необходимо будет изменить альтернативный стартовый кодон на АТС для надлежащей трансляции.

Охватываются также антитела к полипептидам по изобретению, или к их вариантам, или их фрагментам. Способы получения антител хорошо известны в данной области (см., например, Наг1о\у и Ьапе (1988) Ап!1Ьоб1е§: А БаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ; патент США № 4196265).

Измененные или улучшенные варианты

Следует признать, что ДНК последовательности пестицидного белка могут быть изменены различными способами и что эти изменения могут привести к последовательностям ДНК, кодирующим белки с аминокислотными последовательностями, отличными от кодируемых пестицидным белком по изобретению. Этот белок может быть изменен различными способами, включая аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки одной или более аминокислот по 8Е0 ГО N0: 2, включая приблизительно до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155 или более аминокислотных замен, делеций или вставок. Способы таких манипуляций, как правило, известны в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности пестицидного белка могут быть получены мутациями в ДНК. Это можно также осуществить одной или несколькими формами мутагенеза и/или направленной эволюцией. В некоторых аспектах изменения, закодированные в аминокислотной последовательности, не будут значительно влиять на функцию белка. Такие варианты будут сохранять желаемую пестицидную активность. Однако следует понимать, что способность пестицидного белка наделять продукт пестицидной активностью может быть улучшена путем применения данных методик к композициям по изобретению. Например, специалист может экспрессировать пестицидный белок в клетках-хозяевах, которые проявляют высокие степени ошибок включения оснований при репликации ДНК, например штамма ХЬ-1 Кеб (компании 81га1адепе, Ля Джолла, Калифорния, США). После размножения в таких штаммах специалист может выделить ДНК (например, путем создания плазмидной ДНК или путем амплифицирования с помощью ПЦР и клонирования полученного фрагмента ПЦР в вектор), культивировать продуцентов мутантных форм пестицидного белка в немутагенный штамм и идентифицировать мутированных генов с пестицидной активностью, например путем проведения анализа, чтобы проверить пестицидную активность. Как правило, белок смешивают и используют в биологических испытаниях по воздействию при скармливании. См., например, Маггопе е! а1. (1985) 1. оГЕсопотю Еп1ото1оду 78:290-293. Такие биологические испытания могут включать вступление в контакт растений с одним или более паразитами и определение способности растения к выживанию и/или причины смерти паразитов. Примеры мутаций, которые приводят к повышенной токсичности, приводятся в 8сйперГ е! а1. (1998) МюгоЬю1. Мо1. Вю1. Ксу. 62:775-806.

Альтернативно, изменения могут быть сделаны в белковой последовательности у многих белков на амино- или карбоксиконце без существенного изменения активности. Сюда включают вставки, делеций или изменения, внесенные современными методами молекулярной биологии, такими как ПЦР, включая ПЦР амплификации, которые изменяют или удлиняют белковую кодирующую последовательность по

- 8 019574 средством свойства включения последовательности, кодирующей последовательности в олигонуклеотидах, используя ПЦР-амплификацию. Альтернативно, добавленные белковые последовательности могут включать полные последовательности, кодирующие белок, такие как традиционно использующиеся в данной области для образования составных белков. Такие составные белки часто используют для (1) повышения экспрессии белка, представляющего интерес, (2) привнесения связывающего домена, ферментной составляющей или эпитопа для облегчения или очистки белка, обнаружения белка или других экспериментальных применений, известных в данной области, (3) целевого выделения или трансляции белка во внутриклеточную органеллу, такую как периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий или эндоплазматический ретикулум эукариотических клеток, последнее из которых часто приводит к гликозилированию белка.

Вариантные нуклеотидные и аминокислотные последовательности настоящего изобретения также охватывают последовательности, полученные в результате мутагенных или вызывающих рекомбинацию процедур, таких как перестановка в ДНК. С помощью такой процедуры для создания нового пестицидного белка, обладающего желаемыми свойствами, могут быть использованы один или более различных участков, кодирующих пестицидный белок. Таким образом, создаются библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов из популяции полинуклеотидов родственных последовательностей, включая участки последовательности, которые обладают значительной идентичностью последовательности и могут быть гомологично рекомбинированы ίη νίίτο или ίη νίνο. Например, используя этот подход, звенья последовательностей, кодирующие представляющий интерес домен, могут быть перетасованы между пестицидным геном по изобретению и другими известными пестицидными генами для получения нового гена, кодирующего белок с улучшенным интересующим свойством, таким как повышенная инсектицидная активность. Стратегии для таких перестановок в ДНК известны в данной области. См., например, З!еттег (1994) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8οΐ. И8А 91:10747-10751; З!еттег (1994) Пинге 370:389-391; Статей е! а1. (1997) Пакте Бю1еск 15:436-438; Мооге е! а1. (1997) 1. Μοί. Βίο1. 272:336-347; Ζΐιηηβ е! а1. (1997) Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А 94:4504-4509; Статей е! а1. (1998) Пакте 391:288-291 и патенты США № 5605793 и 5837458.

Обмен доменами или перетасовка является еще одним механизмом для образования измененных пестицидных белков. Домены могут быть обменены между пестицидными белками, приводя к гибридным или химерным токсинам с повышенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Способы создания рекомбинантных белков и тестирование их на пестицидную активность хорошо известны в данной области (см., например, Νηίιηον е! а1. (2001) Арр1. Εηνίτοη. МюгоЬю1. 67:5328-5330; бе Маадб е! а1. (1996) Арр1. Εηνίτοη. МсгоЬю1. 62:1537-1543; Ое е! а1. (1991) 1. Βίο1. Сйет. 266:17954-17958; 8с1шерГ е! а1. (1990); 1. Βίο1. Сйет. 265:20923-20930; Ρηη§ е! а1. 91999) Арр1. Εηνίτοη. МсгоЬю1. 65:2918-2925).

Векторы

Пестицидные последовательности по изобретению могут быть представлены в экспрессионной кассете для экспрессии в интересующем растении. Под экспрессионной кассетой растения подразумевают конструкт ДНК, допускающий приведение к экспрессии белка из открытой рамки считывания в растительной клетке. Обычно они содержат промотор и кодирующую последовательность. Зачастую такие конструкты также будут содержать нетранслируемый участок 3'. Такие конструкты могут содержать сигнальную последовательность или лидерную последовательность для облегчения котрансляционного или посттрансляционного перемещения пептида к определенным внутриклеточным структурам, таким как хлоропласт (или другая пластида), эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи.

Под сигнальной последовательностью подразумевают последовательность, которая, как известно или как предполагается, приводит к котрансляционному или посттрансляционному транспорту пептида через клеточную мембрану. У эукариот это в основном включает секрецию в аппарат Гольджи с происходящим в результате некоторым гликозилированием. Инсектицидные токсины бактерий часто синтезируются как протоксины, которые протолитически активируются в пищеварительном тракте вредителя (Сйагщ (1987) Мебюбк Εηζутο1. 153:507-516). В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальная последовательность расположена в нативной последовательности или может быть получена из последовательности изобретения. Под лидерной последовательностью подразумевают любую последовательность, которая при трансляции приводит к аминокислотной последовательности, достаточной для запуска котрансляционного транспорта пептидной цепи во внутриклеточную органеллу. Таким образом, она включает лидерную последовательность, нацеливающую транспорт и/или гликозилирование путем переноса в эндоплазматический ретикулум, переноса в вакуоли, пластиды, включая хлоропласты, митохондрии и т.д.

Под вектором для трансформации растений подразумевают молекулу ДНК, которая необходима для эффективной трансформации растительной клетки. Такая молекула может состоять из одной или более экспрессионных кассет растений и может быть организована в более чем одну векторную молекулу ДНК. Например, бинарными векторами являются векторы для трансформации растений, которые используют два несмежных ДНК-вектора, чтобы кодировать все необходимые находящиеся в цис- и транс-положении функциональные группы для трансформации растительных клеток (ИеНет и Ми11теаих (2000) Тгеибк ίη Р1аШ Заенсе 5:446-451). Вектор относится к конструкту нуклеиновой ки

- 9 019574 слоты, предназначенному для перемещения между различными клетками-хозяевами. Вектор экспрессии относится к вектору, у которого есть способность встраивать, интегрировать и экспрессировать гетерологичные последовательности ДНК или фрагменты в чужеродной клетке. Кассеты будут включать регуляторные последовательности на 5'- и 3'-концах, функционально связанные с последовательностью по изобретению. Под функционально связанный подразумевают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, при этом последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанный означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, будучи соединенными, являются смежными и, где необходимо соединить два участка, кодирующих белки, смежными и в той же рамке считывания. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, который нужно совместно трансформировать в организм. Альтернативно, на множественных экспрессионных кассетах может быть обеспечен дополнительный ген (гены).

Промотор относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая предназначена для направления процесса транскрипции кодирующей последовательности по ходу транскрипции. Промотор вместе с другими последовательностями нуклеиновых кислот, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также называемые контрольные последовательности), являются необходимыми для экспрессии интересующей последовательности ДНК.

Такая экспрессионная кассета снабжена множеством сайтов рестрикции для вставки пестицидной последовательности, транскрипция которой находится под управлением регуляторных участков.

Экспрессионная кассета включает в направлении 5'-3'-концов транскрипции участок инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК по изобретению и участок терминации трансляции и транскрипции (т.е. участок терминации), являющийся функциональным у растений. Промотор может быть нативным, или аналогичным, или чужеродным, или гетерологичным растениюхозяину и/или последовательности ДНК по изобретению. Дополнительно промотор может быть природной последовательностью или, альтернативно, синтетической последовательностью. Там, где промотор является нативным или гомологичным растению-хозяину, подразумевают, что промотор обнаружен в нативном растении, в которое введен промотор. Когда промотор является чужеродным или гетерологичным последовательности ДНК по изобретению, подразумевают, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для функционально связанной последовательности ДНК по изобретению.

Участок терминации может быть нативным с участком инициации транскрипции, может быть нативным с функционально связанной интересующей последовательностью ДНК, может быть нативным по отношению к растению-хозяину или может быть получен из другого источника (т.е. чужеродный или гетерологичный промотору, интересующей последовательности ДНК, растению-хозяину или любой их комбинации). Распространенные участки терминации можно получить из Τί-плазмиды А. 1итсГас1СП5. такие как участки терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Сиетшеаи е! а1. (1991) Мо1. Сеп. Сепе!. 262:141-144; РтоибГоо! (1991) Се11 64:671-674; ЗапГасоп е! а1. (1991) Сепек Эе\. 5:141-149; Моден е! а1. (1990) Р1ап! Се11 2:1261-1272; Мипгое е! а1. (1990) Сепе 91:151-158; Ва11ак е! а1. (1989) Ыискю Аск1к Век. 17:7891-7903 и 1окЫ е! а1. (1987) Ыискю Ас1б Век. 15:9627-9639.

В случае необходимости ген(ы) может(гут) быть оптимизирован(ы) для повышенной экспрессии в трансформированной клетке-хозяине. То есть гены могут быть синтезированы с применением предпочтительных для клеток-хозяев кодонов для улучшенной экспрессии или могут быть синтезированы с использованием кодонов с предпочтительной для хозяина периодичностью использования кодонов. Как правило, содержание СС в гене будет повышено. См., например, СатрЬе11 и Со\тп (1990) Р1ап! Рйукю1. 92:1-11, что касается обсуждения использования предпочтительных кодонов клеткой-хозяином. Способы синтеза генов, предпочтительных для растения, описаны в данной области. См., например, патенты США №№ 5380831 и 5436391, а также Миггау е! а1. (1989) ШсЫс Ас1бк Век. 17:477-498, включенные посредством ссылки.

В одном варианте осуществления пестицидный белок нацелен на хлоропласт для экспрессии. Таким образом, где пестицидный белок непосредственно не встроен в хлоропласт, экспрессионная кассета дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую транзитный пептид для доставки пестицидного белка к хлоропластам. Такие транзитные пептиды известны в данной области. См., например, Уоп Неупе е! а1. (1991) Р1ап! Мо1. Вю1. Вер. 9:104-126; С1агк е! а1. (1989) 1. Вю1. СНет. 264:17544-17550; Эе11аСюрра е! а1. (1987) Р1ап! Рйукю1. 84:965-968; Вотег е! а1. (1993) Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 196:1414-1421 и ЗНаН е! а1. (1986) Заепсе 233:478-481.

Пестицидный ген, который должен быть нацелен на хлоропласт, может быть оптимизирован для экспрессии в хлоропласт, чтобы учитывать различия в использовании кодонов между ядром растения и данной органеллой. Таким образом, нуклеиновые кислоты, представляющие интерес, могут быть синтезированы с применением предпочтительных для хлоропластов кодонов. См., например, патент США № 5380831, включенный в данную заявку ссылкой.

Трансформация растения

Способы по изобретению включают введение нуклеотидного конструкта в растение. Под введени

- 10 019574 ем подразумевают представление растению нуклеотидного конструкта таким образом, что конструкт получает доступ во внутреннее пространство клетки растения. Способы по изобретению не нуждаются в использовании определенного способа введения нуклеотидного конструкта в растение, лишь бы нуклеотидный конструкт получал доступ во внутреннее пространство по меньшей мере одной клетки растения. Способы введения нуклеотидных конструктов в растения известны в данной области, включая, но без ограничения, способы устойчивой трансформации, способы временной трансформации и способы, опосредованные вирусом.

Под растением подразумевают целые растения, органы растения (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, побеги, зародыши и их потомство. Растительные клетки могут быть дифференцированными или недифференцированными (например, каллюс, клетки суспензионной культуры, протопласты, клетки листьев, клетки корня, клетки флоэмы, пыльца).

Трансгенные растения, или трансформированные растения, или устойчиво трансформированные растения, или клетки, или ткани относятся к растениям, которые имеют встроенные или интегрированные в растительную клетку экзогенные последовательности нуклеиновой кислоты или фрагменты ДНК. Эти последовательности нуклеиновой кислоты включают таковые, которые являются экзогенными или не присутствуют в нетрансформированной растительной клетке, а также таковые, которые могут быть эндогенными или присутствуют в ^трансформированной растительной клетке. Понятие гетерологичные, как правило, относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые не являются эндогенными по отношению к клетке или части нативного генома, в котором они присутствуют, и были добавлены в клетку посредством инфекции, трансфекции, микроинъекции, электропорации, микропроекции и т.п.

Трансформация клеток растения может быть произведена по нескольким технологиям, известным из области техники. Пестицидный ген по изобретению может быть модифицирован для достижения или усиления экспрессии в растительных клетках. В основном, конструкт, который экспрессирует такой белок, содержит промотор для управления транскрипцией гена, а также 3' нетранслируемый участок, чтобы позволить терминацию транкскрипции и полиаденилирование. Организация таких конструктов хорошо известна в данной области. В некоторых случаях может быть полезным конструирование гена таким образом, чтобы полученный пептид выделялся или иначе нацелевался внутри растительной клетки. Например, ген может быть сконструирован так, чтобы содержать сигнальный пептид для облегчения переноса пептида в зндоплазматический ретикулум. Предпочтительным может быть также конструирование экспрессирующей кассеты растения, содержащей интрон так, чтобы для экспрессии был необходим процессинг мРНК с удалением интронов.

Обычно эта экспрессионная кассета растения вводится в вектор для трансформации растения. Этот вектор для трансформации растения может содержать один или более ДНК-векторов, необходимый для достижения трансформации растения. Например, использование векторов для трансформации растения, которые включают более чем один смежный сегмент ДНК, является обычной практикой в данной области. Такие векторы часто называют в данной области бинарными векторами. Бинарные векторы, а также векторы со вспомогательными плазмидами, очень часто применяются для трансформации, опосредованной ЛдгоЬас1егшш, где размер и сложность сегментов ДНК, необходимых для достижения достаточной трансформации, являются достаточно большими, и выгодным является разделение функций между отдельными молекулами ДНК. Бинарные векторы, в основном, содержат плазмидный вектор, который содержит действующие в цис-положении последовательности, необходимые для переноса Т-ДНК (такие как левая граница и правая граница), селектируемый маркер, который сконструирован так, чтобы быть способным к экспрессии в растительной клетке, и интересующий ген (ген, сконструированный так, чтобы быть способным к экспрессии в клетке растения, для которого желательно образование трансгенной разновидности). На этом плазмидном векторе присутствуют также последовательности, необходимые для бактериальной репликации. Действующие в цис-положении последовательности расположены таким образом, чтобы позволить эффективный перенос в растительные клетки и экспрессию в них. Например, селектируемый маркерный ген и пестицидный ген расположены между левой и правой границами. Зачастую второй плазмидный вектор содержит действующие в транс-положении факторы, которые опосредуют перенос Т-ДНК из ЛдгоЬаСегшш в растительные клетки. Эта плазмида зачастую содержит участки, ответственные за вирулентность (Уй-гены), которые позволяют инфицировать растительные клетки с помощью АдгоЬас1етшш, и переносит ДНК посредством разрыва пограничных последовательностей и опосредованного вирусом переноса ДНК, как это понятно из данной области (Не11еи§ и МиШиеаих (2000) Ттеибк ίη Р1ап1 8с1еисе 5:446-451). Для трансформации растений могут быть использованы некоторые из штаммов АдгоЬас1егшш (например, БВЛ4404. ОУ3101, ЕНА101, ЕНА105 и т.д.). Второй плазмидный вектор не является необходимым для трансформации растений другими способами, такими как микропроекция, микроинъекция, электропорация, полиэтиленгликоль и т.д.

Как правило, способы трансформации растений включают перенос гетерологичной ДНК в растительные клетки-мишени (например, незрелые или зрелые зародыши, суспензионные культуры, недифференцированный каллюс, протопласты и т.д.), с последующим применением максимально допустимого уровня соответствующего селектирующего агента (в зависимости от селектируемого маркерного гена)

- 11 019574 для выделения трансформированных растительных клеток из группы нетрансформированной клеточной массы. Эксплантаты обычно переносят в свежую порцию той же среды и культивируют обычным способом. Далее трансформированные клетки дифференцируют на побеги после помещения их на среду для регенерации, в которую введен максимально допустимый уровень селектирующего агента. Побеги затем переносят на селективную среду корнеобразования для восстановления укоренившихся побегов или проростков. Трансгенный проросток затем вырастает в зрелое растение и продуцирует всхожие семена (например, Нйей е! а1. (1994) ТНе Р1ап! 1оигпа1 6:271-282; йкЫба е! а1. (1996) Ыа!иге Вю!есйпо1оду 14:745-750). Эксплантаты обычно переносят в свежую порцию той же среды и культивируют обычным способом. Общее описание технологий и методов получения трансгенных растений представлено в работах Аугек апб Рагк (1994) СгШса1 Кеуйе^к ίη Р1ап! 8сйепсе 13:219-239 и Воттшеш и йаийаг (1997) Маубйса 42:107120. Так как трансформированный материал содержит множество клеток, то в любой части подвергнутого воздействию каллюса-мишени, или ткани, или группы клеток присутствуют как трансформированные, так и не трансформированные клетки. Способность уничтожать ^трансформированные клетки и позволять трансформированным клеткам пролиферировать дает в результате трансформированные растительные культуры. Зачастую способность удалять ^трансформированные клетки является ограничением для быстрого выделения трансформированных растительных клеток и успешного образования трансгенных растений.

Протоколы трансформации, а также протоколы введения нуклеотидных последовательностей в растения могут изменяться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. однодольное или двудольное, которые являются объектами трансформации. Образование трансгенных растений может быть выполнено одним из нескольких способов, включая, но без ограничения, микроинъекцию, электропорацию, прямой перенос гена, введение гетерологичной ДНК с помощью АдгоЬас!егшт в растительные клетки (трансформация, опосредованная АдгоЬас!егшт), бомбардировку растительных клеток гетерологичной чужеродной ДНК, закрепленной на частицах, баллистическое ускорение частиц, трансформацию аэрозольным потоком (опубликованная заявка на патент США № 20010026941; патент США № 4945050; международная заявка №О 91/00915; опубликованная заявка США № 2002015066), использование семядолей в качестве эксплантантов для трансформации и различные другие способы для переноса ДНК, не опосредованные напрямую частицами.

Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. См., например, 8уаЬ е! а1. (1990) Ргос. Наб. Асаб. 8ск И8А 87:8526-8530; 8уаЬ и Майда (1993) Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А 90:913-917; 8уаЬ и Майда (1993) ЕМВО Т 12:601-606. Способ основан на доставке биобаллистической пушкой ДНК, которая содержит селектируемый маркер, и нацеливание ДНК на пластидный геном посредством гомологичной рекомбинации. Дополнительно трансформация пластид может быть осуществлена трансактивацией молчащего трансгена пластидного происхождения с помощью предпочтительной для ткани экспрессией РНК-полимеразы, которая кодируется ядерной ДНК и регулируется пластидами. Такая система была изложена в работе МсВпбе е! а1. (1994) Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 91:7301-7305.

После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки используют максимально допустимый уровень соответствующего селектирующего агента в среде для уничтожения нетрансформированных клеток и отделения и пролиферации предполагаемо трансформированных клеток, которые выживают в результате этой селекционной обработки, посредством регулярного переноса на свежую среду. Посредством непрерывного пассирования и контрольного заражения с соответствующей селекцией идентифицируют и пролиферируют клетки, которые трансформированы плазмидным вектором. После этого могут быть использованы методы молекулярной биологии и биохимии для подтверждения наличия интегрированного гетерологичного гена, представляющего интерес, в геноме трансгенного растения.

Клетки, которые были трансформированы, могут быть выращены в растениях в соответствии с общепринятыми способами. См., например, МсСогтйск е! а1. (1986) Р1ап! Се11 Керойк 5:81-84. Эти растения затем можно вырастить, а также опылить либо той же трансформированной линией или различными линиями и идентифицировать полученные гибриды, обладающие конститутивной экспрессией желаемого фенотипического признака. Могут быть выращены два или более поколений, чтобы удостовериться, что экспрессия желаемого фенотипического признака стабильно поддерживается и наследуется, а затем собираются семена, чтобы удостовериться, что достигнута экспрессия желаемого фенотипического признака. Таким образом, изобретение обеспечивает трансформированное семя (также называемое трансгенное семя), содержащее нуклеотидный конструкт по изобретению, например экспрессионную кассету по изобретению, устойчиво встроенную в их геном.

Оценка трансформации растений

После введения гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки трансформацию или интеграцию гетерологичного гена в растительный геном подтверждают различными способами, такими как анализ нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, связанных с интегрированным геном.

Анализ ПЦР является быстрым способом обследования трансформированных клеток, ткани или побегов на наличие встроенного гена на ранней стадии перед пересаживанием в почву (8атЬгоок и Кикке11 (2001) Мо1еси1аг Сйошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог,

- 12 019574

ΝΥ). ПЦР проводят с применением олигонуклеотидных праймеров, которые специфичны для интересующего гена или вектора АдтоЬас!етшт в качестве фона и т.д.

Трансформация растения может быть подтверждена анализом геномной ДНК методом саузернблоттинга (8атЬтоок и Ки88е11, 2001, см. выше). Как правило, всю ДНК выделяют из трансформанта, расщепляют соответствующими ферментами рестрикции, разделяют в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану. Затем мембрану или блот зондируют, например, целевым фрагментом ДНК, меченным радиоактивным ³²Р, для подтверждения интеграции введенного гена в геном растения в соответствии со стандартными методиками (8атЬгоок и Ки88е11, 2001, см. выше).

В нозерн-блоттинг анализе РНК выделяют из конкретных тканей трансформанта, разделяют в агарозном геле с формальдегидом и блоттируют на нейлоновом фильтре в соответствии со стандартными процедурами, которые обычно используются в данной области (8атЬгоок и К.и88е11, 2001, см. выше). Экспрессию РНК, кодируемой пестицидным геном, затем тестируют гибридизацией содержимого фильтра с радиоактивным зондом, полученным из пестицидного гена при помощи методов, известных в данной области (8атЬгоок и К.и88е11, 2001, см. выше).

Для подтверждения наличия белка, кодируемого пестицидным геном, на трансгенных растениях можно провести вестерн-блоттинг, биохимические анализы и т.п. с помощью стандартных процедур (8атЬгоок и Ки88е11, 2001, см. выше) с применением антител, которые связывают один или более эпитопов, присутствующих на пестицидном белке.

Пестицидная активность у растений

В другом аспекте этого изобретения можно создавать трансгенные растения, экспрессирующие пестицидный белок, который обладает пестицидной активностью. Способы, описанные ранее посредством примера, могут быть использованы для создания трансгенных растений, но способ, которым создают трансгенные растительные клетки, не является критичным для изобретения. Способы, известные или описанные в данной области, такие как трансформация, опосредованная АдгоЬас!етшт, биолистическая трансформация и способы для переноса ДНК, не опосредованные частицами, могут быть использованы на усмотрение экспериментатора. Растения, экспрессирующие пестицидный белок, могут быть выделены обычными способами, описанными в данной области, например трансформацией каллюса, селекцией трансформированного каллюса и регенерацией плодоносных растений из такого трансгенного каллюса. В таких процессах можно использовать любой ген в качестве селектируемого маркера до тех пор, пока его экспрессия в растительных клетках дает возможность идентифицировать или отбирать трансформированные клетки.

Некоторое количество маркеров было разработано для применения с растительными клетками, такие как устойчивость к хлорамфениколу, аминогликозиду С418, гигромицину или подобным. Другие гены, кодирующие продукт, вовлеченный в метаболизм хлоропласта, также можно использовать в качестве селектируемых маркеров. Например, гены, которые обеспечивают устойчивость к растительным гербицидам, таким как глифосат, бромоксинил или имидазолинон, могут найти особенное применение. Такие гены были описаны (81а1кет е! а1. (1985) 1. Вю1. Сйет. 263:6310-6314 (ген нитрилазы, обеспечивающий устойчивость к бромоксинилу); и 8а!йа81уап е! а1. (1990) №с1. Ас1бб Кез. 18:2188 (ген синтетазы ацетогидроксикислот (АНА8), обеспечивающий устойчивость к имидазолинону). Кроме того, гены, раскрытые в настоящей заявке, являются пригодными в качестве маркеров для оценки трансформации бактериальных или растительных клеток. Методы обнаружения наличия трансгена в растении, органе растения (например, листьях, стеблях, корнях и т.д.), семени, растительной клетке, побеге, зародыше или их потомстве, хорошо известны в данной области. В одном варианте осуществления наличие трансгена определяют путем тестирования на пестицидную активность.

Плодоносные растения, экспрессирующие пестицидный белок, могут быть протестированы на пестицидную активность, и растения, показавшие оптимальную активность, выбирают для дальнейшего культивирования. В данной области известны методы анализа активности по отношению к вредителю. Как правило, белок смешивают и применяют в анализах скармливания. См., например, Маггопе е! а1. (1985) 1. о£ Есопотк Еп!ото1оду 78:290-293.

Настоящее изобретение может использоваться для трансформации любых видов растений, включая, но без ограничения, однодольные и двудольные. Примеры растений, представляющих интерес, включают, но без ограничения, кукурузу (маис), сорго, пшеницу, подсолнечник, томат, крестоцветные, перцы, картофель, хлопчатник, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень и масляный рапс, Вгазбка зр., люцерну, рожь, просо, сафлор, арахис, сладкий картофель, маниоку, кофе, кокос, ананас, цитрусовые деревья, какао, чай, банан, авокадо, инжир, гуаяву, манго, оливу, папайю, анакардию западную, макадамию, миндаль, овес, овощи, декоративные и хвойные растения.

Овощи включают, но без ограничения, томаты, салат-латук, зеленую фасоль, фасоль Лима, горох и членов рода Сигсит18, таких как огурец, канталупа и мускусная дыня. Декоративные растения включают, но без ограничения, азалию, гортензию, гибискус, розы, тюльпаны, нарциссы желтые, петунии, гвоздику, пуансеттию и хризантему. Предпочтительно растениями по изобретению являются сельскохозяйственные культуры (например, маис, сорго, пшеница, подсолнечник, томат, крестоцветные, перцы, картофель, хлопчатник, рис, соя, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень, масляный рапс и т.д.).

- 13 019574

Применение в пестицидном контроле

Общие способы применения штаммов, содержащих нуклеотидную последовательность настоящего изобретения или ее вариант, в пестицидном контроле или в конструировании других организмов в качестве пестицидных агентов известны в данной области. См., например, патент США № 5039523 и европейский патент № 0480762 А2.

Штаммы ВасШиз, содержащие нуклеотидную последовательность настоящего изобретения или ее вариант, или микроорганизмы, которые были генетически изменены для того, чтобы содержать пестицидный ген и белок, могут быть использованы для защиты сельскохозяйственных культур и продуктов от вредителей. В одном аспекте изобретения целые, т.е. нелизированные, клетки организма, продуцирующего токсин (пестицид), обрабатывают реагентами, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, в том случае, когда клетку вносят в окружающую среду вредителя(ей)-мишени(ей).

Альтернативно, пестицид получают путем введения пестицидного гена в клетку-хозяина. Экспрессия пестицидного гена приводит, непосредственно или опосредованно, к внутриклеточному продуцированию и сохранению пестицида. В одном аспекте изобретения эти клетки затем обрабатывают при условиях, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, в случае, когда клетку вносят в среду, окружающую вредителя(ей)-мишени(ей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти естественно инкапсулированные пестициды могут быть потом переведены в готовую к применению форму в соответствии с обычными технологическими приемами для внесения в среду обитания целевого вредителя, например почву, воду и листву растений. См., например, ЕРА 0192319 и ссылки, цитируемые там. Альтернативно, можно перевести клетки, экспрессирующие ген согласно настоящему изобретению, в готовую форму таким образом, чтобы обеспечить применение полученного материала в качестве пестицида.

Активные ингредиенты по изобретению в норме наносятся в форме композиций и могут наноситься на посевную площадь или растение, которое нужно обработать, одновременно или последовательно с другими соединениями. Этими соединениями могут быть удобрения, гербициды, криопротекторы, поверхностно-активные вещества, детергенты, пестицидные мыла, масла, применяемые во время состояния вегетативного покоя, полимеры и/или составы носителей, высвобождающихся со временем или разлагаемых микроорганизмами, которые позволяют долговременное дозирование целевой области после однократного нанесения состава. Они также могут быть селективными гербицидами, химическими инсектицидами, вируцидными средствами, микробицидами, амебицидами, пестицидами, фунгицидами, бактерицидами, нематоцидами, моллюскоцидами или смесями нескольких таких препаратов, по желанию, вместе с дополнительными сельскохозяйственно-приемлемыми носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными веществами, способствующими нанесению, которые обычно используются в данной области приготовления состава. Подходящие носители и вспомогательные вещества могут быть твердыми или жидкими и соответствовать веществам, которые обычно используются в технологии составов, например природные или полученные в результате переработки минеральные вещества, растворители, диспергирующие средства, смачивающие средства, усилители клейкости, связующие или удобрения. Подобным образом могут быть приготовлены составы в форме съедобных приманок или оформлены в ловушки для вредителей, чтобы дать возможность вредителям-мишеням съесть или поглотить пестицидный состав.

Способы нанесения активного ингредиента по изобретению или агрохимической композиции по изобретению, содержащей по меньшей мере один из пестицидных белков, которые продуцируются бактериальными штаммами по изобретению, включает нанесение на листву, покрытие семян и нанесение на почву. Количество нанесений и норма внесения зависят от интенсивности заражения соответствующим вредителем.

Композиция может быть составлена как порошок, дуст, таблетка, гранула, аэрозоль, эмульсия, коллоид, раствор или им подобные и может быть приготовлена такими традиционными средствами, как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрация, центрифугирование, седиментация или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид. Во всех таких композициях, которые содержат по меньшей мере один такой пестицидный полипептид, полипептид может быть представлен в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 99 вес.%.

Чешуекрылые, двукрылые или жесткокрылые вредители могут быть уничтожены или уменьшены в количествах на данной площади посредством способов по изобретению, или композиции могут профилактически наносится на природную территорию для предотвращения заражения восприимчивым к ним вредителем. Предпочтительно вредитель поглощает или вводится в контакт с пестицидно эффективным количеством полипептида. Под пестицидно эффективным количеством подразумевают количество пестицида, которое способно привести к гибели по меньшей мере одного вредителя или заметно уменьшить рост числа вредителей, питание или нормальное физиологическое развитие. Это количество может изменяться в зависимости от таких факторов как, например, конкретный вид вредителей-мишеней, с которыми необходимо бороться, конкретная окружающая среда, характер местности, растение, культура или сельскохозяйственный участок, который необходимо обработать, условия окружающей среды и способ, норма, концентрация, устойчивость и количество нанесений пестицидно эффективной композиции

- 14 019574 полипептида. Составы могут также изменяться в соответствии с климатическими условиями, экологическими факторами, и/или частотой нанесения, и/или степенью заражения вредителями.

Описанные пестицидные композиции могут быть получены путем приготовления готовой формы из бактериальной клетки, суспензии кристаллов и/или спор или выделенного белкового компонента с желаемым сельскохозяйственно-приемлемым носителем. Композиции могут быть составлены перед нанесением в соответствующем материале, таком как в лиофилизированном, высушенным заморозкой, обезвоженным или водном носителе, среде или подходящем растворителе, таком как солевой раствор или другой буфер. Составленные композиции могут быть в форме дуста, или гранулированного материала, или суспензии в масле (растительном или минеральном), или водных или масляно/водных эмульсий, или в виде смачиваемого порошка, или в сочетании с любым другим материалом-носителем, пригодным для сельскохозяйственного применения. Пригодные сельскохозяйственные носители могут быть твердыми или жидкими и хорошо известны в данной области техники. Понятие сельскохозяйственно-приемлемый носитель охватывает все добавки, инертные компоненты, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, усилители клейкости, связующие и т.д., которые обычно применяются в технологии пестицидных составов; они хорошо известны специалистам, работающим с пестицидными составами. Составы могут быть смешаны с одной или более твердыми или жидкими добавками и приготовлены различными средствами, например путем гомогенизации, смешивания и/или измельчения пестицидной композиции с соответствующими добавками с применением традиционных методик приготовления составов. Пригодные составы и способы нанесения описаны в патенте США № 6468523, включенном в настоящую заявку ссылкой.

Вредитель включает, но не без ограничения, насекомых, грибы, бактерии, нематоды, клещи, иксодовые клещи и подобное. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Со1еор1ега. О|р1ега. НутепорЮга. Ьер|бор1ега. Ма11орНада, Нотор1ега. НеиирЮга. 0г(Нгор(ега. ТНузапорЮга. Эегтар1ега. 1зор1ега. Апор1ига, 81рНопар1ега.. ТпсНорЮга и т.д., в особенности Со1еор1ега. Еер1бор1ега и О|р1ега.

Отряд Со1еор1ега включает подотряды АберНада и Ро1урНада. Подотряд АберНада включает надсемейства СагаЬо1беа и Оуппо1беа, в то время как подотряд Ро1урНада включает надсемейства НубгорН11о1беа, 81арйу1то1беа, СагИНагснбеа. С1его1беа, Е1а1егснбеа. ОазсШо1беа, Огуоро1беа, Вуггйо1беа, Сиси)о1беа. Ме1о1беа, Могбе11о1беа, ТепеЬпопо1беаг Воз1псйо1беа, 8сагаЬаео1беа, СегатЬусо1беа, СНгу§оте1о1беа и Сигси1юпо1беа. Надсемейство СагаЬо1беа включает семейства Сютбейбае, СагаЫбае и БуИзабае. Надсемейство Оуппо1беа включает семейство Супшбае. Надсемейство НубгорН11о1беа включает семейство НубгорНШбае. Надсемейство 81арйу1то1беа включает семейства 8йрЫбае и 81арйу11шбае. Надсемейство СагИНагснбеа включает семейства СайНапбае и Ьатрупбае. Надсемейство С1его1беа включает семейства С1епбае и ЭегтеШбае. Надсемейство Е1а1егснбеа включает семейства Е1а1епбае и Виргезйбае. Надсемейство Сиси)о1беа включает семейство СосстеШбае. Надсемейство Ме1о1беа включает семейство Ме1о1бае. Надсемейство ТепеЬпопо1беа включает семейство ТепеЬпошбае. Надсемейство 8сагаЬаео1беа включает семейства РаззаПбае и 8сагаЬае1бае. Надсемейство СегатЬусо1беа включает семейство СегатЬус1бае. Надсемейство СНгузоте1о1беа включает семейство СНгузотейбае. Надсемейство Сигси1юпо1беа включает семейства Сигсийошбае и 8со1уйбае.

Отряд О|р1ега включает подотряды ЖтаЮсега. Вгасйусега и Сус1оггйарйа. Подотряд ЖтаЮсега включает семейства Т1ри11бае£ Рзусйоб1бае, Си1ю1бае, СегаЮродошбае. СН1гопот1бае, 81ти1ибае, В1Ьюшбае и Сеаботуибае. Подотряд Вгасйусега включает семейства 81га1юту|бае. ТаЬашбае, ТНеге^лбае. АзШбае, Муб1бае, ВотЬуШбае и Пойсйороб1бае. Подотряд Сус1оггйарНа включает группы АзсЫха и 8сЫхорНога. Группа АзсЫха включает семейства РНопбае. 8угрН1бае и Сопор1бае. Группа 8сН|хорНога включает секции Аса1ур1га1ае и Са1ур1га1ае. Секция Аса1ур1га1ае включает семейства 0(Н1бае. ТерНпйбае, Адготу/|бае и ОгозорНШбае. Секция Са1ур(га(ае включает семейства Н1рроЬозс1бае, 0ез1пбае_г ТасЫшбае, АпПютупбае. Мизабае, СаШрйопбае и 8агсорНад1бае.

Отряд Е-ер|бор1ега включает семейства РарШошбае, Р1епбае, Ьусаешбае, ЖтрНаКбае. Оапа1бае, 8а1уг1бае. Незретбае, 8рЫпд1бае, 8а1игпббае. Сеоте1пбае. АгсШбае. №с1шбае. ЕутагИгпбае. 8езибае и Т1пе1бае.

Насекомые-вредители по изобретению для большинства основных сельскохозяйственных культур включают - кукуруза: 0з1пша пиЬйайз, европейский кукурузный мотылек; Адгойз |рзПоп. совка ипсилон; Не1юо\'егра хеа. совка хлопковая; 8робор1ега йид1регбаг совка травяная; О1а1гаеа дгапбюзеИа, огневка кукурузная юго-западная; Е1азтора1риз йдпозе11из, малый мотылек кукурузный; О|а1гаеа зассНагайз, огневка сахарного тростника; П1аЬгобса νίΓ^ίΓαΓη. западный кукурузный жук; П1аЬгобса 1опдюогшз ЬагЬеп, северный кукурузный жук; П1аЬгобса ипбесиприпсЕИа йотагбц блошка 11-точечная Говарда; Ме1апоШз зрр., проволочники; Сус1осерНа1а ЬогеаПз, северный масковый хрущ (личинка хруща); Сус1осерНа1а 1ттаси1а!а, южный масковый хрущ (личинка хруща); Рорййа _)арошса, хрущик японский; СНаеЮспета рийсапа, земляная кукурузная блошка; 8рНепорНогиз та1б1з, долгоносик кукурузный; Кйора1оз1рйит та1б1з, тля кукурузная листовая; АпигарЫз та1биабю1з, тля кукурузная корневая; Вйззиз 1еисор1егиз 1еисор1егиз. клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Ме1апор1из ГетштиЬгиш, краснобедрая кобылка; Ме1апор1из запдшшрез, мигрирующий кузнечик; Ну1етуа р1а(ыга. личинка мухи ростковой; Адготуха

- 15 019574 рагуюогшк, кукурузная минирующая мушка; АиарйоИпрк оЬксгигик, трипе злаковый; 8о1еиорк1к тПек1а, муравей-вор; Тейаиусйик игйсае, клещ паутинный; сорго: Сййо райейик, сорговая огневка; 8робор1ега Ггищрегба, совка травяная; Нейсоуегра хеа, совка хлопковая; Е1актора1рик йдиокейик, малый мотылек кукурузный; Ре1йа киЫеггаиеа, совка зернистая; Рйу11орйада спица, личинка хруща; Е1еобек, Соиобегик и Аео1ик крр., проволочники; Ои1ета те1аиорик, пьявица красногрудая; Сйае!осиета рийсапа, земляная кукурузная блошка; 8рйеиорйогик та1б1к, долгоносик кукурузный; Вйора1ок1рйит та1б1к; тля кукурузная листовая; 81рйа Лага, желтая тля сахарного тростника; Вйккик 1енсор1егнк 1енсор1егнк, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Сойапша когдйюо1а, галлица сорговая; Тейаиусйик стиаЬагтик красный паутинный клещ; Тебаиусйик игйсае, обыкновенный паутинный клещ; пшеница: Ркеиба1ейа ишриис1а1а, походный червь; 8робор1ега Ггищрегба, совка травяная; Е1актора1рик йдиокейик, малый мотылек кукурузный; Адгойк оййодоша, совка прямоугольная; Е1актора1рик йдиокейик, малый мотылек кукурузный; Ои1ета те1аиорик, пьявица красногрудая; Нурега риисЕНа, долгоносик точечный; П1аЬгобса иибеатриис1а1а йо\уагбк блошка 11-точечная Говарда; русская пшеничная тля; 8с1пхар1нк дгаттит, тля злаковая обыкновенная; Масгоырйит агеиае, английская тля листовая; Ме1аиор1ик ГетштиЬгит, краснобедрая кобылка; Ме1аиор1ик бйГегеийайк, кобылка отличительная; Ме1аиор1ик каиду1шрек, мигрирующий кузнечик; Мауейо1а бек1гнсЮг, гессенская мушка; 8йоб1р1ок1к токе11аиа, комарик пшеничный; Меготуха атепсаиа, личинка американской меромизы; Ну1етуа соагсЕНа, муха озимая; Ρ^аηк1^η^е11а Гикса, табачный шрипс; Серйик стсШк, стеблевой пилильщик хлебный; Асепа Шйрае, луковичный клещ тюльпанов; подсолнечник: 8и1е1та йейаШйаиа, листовертка подсолнечниковая; Нотоеокота е1ес1е11нт, огневка подсолнечниковая; худодгатта ехс1атайотк, совка подсолнечниковая восклицательная; Во1йугнк дФЬокик, жук морковный; №о1акюр1ега ти^ίίе1бΐ^аηа, мошка семян подсолнечника; хлопчатник; Нейо1й1к У1гексеик, листовертка табачная, Нейсоуегра хеа, совка хлопковая; 8робор1ега ех1диа, совка малая; Ресйиорйога доккур1е11а, розовый коробочный червь; АиНоиотик дгшк, долгоносик хлопковый; АрЫк доккурп, тля хлопковая; РкенбаЮтоксейк кепаШк, хлопковый слепняк; Тпа1еигобек аЬиШоиеа, окаймленная белокрьшка; Ьудик йиео1апк, клоп травяной; Ме1аиор1ик ГетиггиЬгит, краснобедрая кобылка; Ме1аиор1ик бйГегеийайк, кобылка отличительная; Тйпрк 1аЬаск луковичный трипе; Егаг1к1тк1е11а Гикса, табачный трипе; Тейаиусйик с^ηηаЬа^^иик, красный паутинный клещ; Тейаиусйик игйсае, обыкновенный паутинный клещ; рис: О|а1гаеа кассйагайк, огневка сахарного тростника; 8робор1ега £гид1регба, совка травяная; Нейсоуегра хеа, совка хлопковая; Со1акр1к Ьгиииеа, коласпис виноградный; Ыккогйорйик огухорййик, долгоносик рисовый водяной; 8йорй11ик огухае, долгоносик рисовый; №рйо1еШх ЫдгоркЫк, рисовая цикадка; Вйккик 1еисор1егнк 1енсор1егнк, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Асгойегиит ййаге, клоп-щитник; соя: Ркеибор1ик1а тсЫбеик, соевая пяденица; Аийсагыа деттаЫйк, гусеница бархатной фасоли; Р1а!йуреиа ксаЬга, гусеница клеверной совки; Ок1гйиа ииЬйайк, европейский кукурузный мотылек; Адгойк 1ркйои, совка ипсилон; 8робор1ега ех1диа, совка малая; Нейо1Ык уйексеик, листовертка табачная; Нейсоуегра хеа, совка хлопковая; Ерйасйиа уапгекйк, божья коровка бобовая мексиканская; Мухик регкюае, тля персиковая зеленая; Етроакса ГаЬае, цикадка картофельная; Асгойегиит ййаге, клоп-щитник; Ме1аиор1ик ГетиггиЬгит, краснобедрая кобылка; Ме1аиор1ик бйРегеийайк, кобылка отличительная; Ну1етуа р1а1ига, личинка мухи ростковой; 8епсо1йпрк уапаЬШк, соевый трипе; Тйпрк 1аЬаск луковичный трипе; Тейаиусйик 1игкек1аш, клещ паутинный клубничный; Тейаиусйик игйсае, обыкновенный паутинный клещ; ячмень: Ок1гйиа ииЬйайк, европейский кукурузный мотылек; Адгойк 1ркйои, совка ипсилон; 8сй1харЫк дгаттит, тля злаковая обыкновенная; Вйккик 1енсор1егнк 1енсор1егнк, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Асгойетит ййаге, клоп-щитник; ЕиксЫкШк кегуик, бурый клоп-щитник; Иейа р1а1ига, личинка мухи ростковой; Мауейо1а бек1гнс1ог, гессенская мушка; РейоЫа 1а1еик, клещ бурый пшеничный; масличный рапс: Вгеуюогуие Ьгаккюае, тля капустная; Рйу11о1ге1а сгисйегае, земляная блошка; Матекйа соиЛдитЕ-к совка латуковая; Р1н1е11а ху1ок!е11а, моль капустная; Иейа ккр., весенняя капустная муха.

Нематоды включают паразитических нематод, таких как яванская галловая нематода, цистовую и ранящую нематоды, включая Не1егобега крр., Ме1о1бодуие крр. и С1оЬобега крр.; особенно членов цистовых нематод, включая, но без ограничения до, Не1егобега д1усшек (соевая цистовая нематода); Не1егобега ксйасйШ (свекловичная нематода); Не1егобега агеиае (цистовая нематода зерновых); и С1оЬобега гок!осЫеиык и С1оЬобега ра1йба (картофельные нематоды). Ранящие нематоды включают Рга1у1еисйнк крр.

Способы увеличения урожайности растений

Изобретением обеспечиваются способы увеличения урожайности растений. Способы включают введение в растение или растительную клетку полинуклеотида, содержащего пестицидную последовательность, раскрытую в настоящей заявке. Как определено в настоящей заявке, урожайность растения относится к количеству и/или качеству биомассы, производимой растением. Под биомассой подразумевают любой измеряемый растительный продукт. Увеличением производимой биомассы является любое улучшение в урожайности измеряемого растительного продукта. Увеличение урожайности растений имеет несколько коммерческих применений. Например, увеличение лиственной биомассы растения может увеличить урожайность листовых овощей для потребления людьми и животными. Кроме этого, увеличение лиственной биомассы может использоваться для увеличения производства фармацевтических или промышленных продуктов, полученных из растений. Повышение урожайности может включать любое статистически значимое увеличение, включая, но без ограничения, по меньшей мере до 1%-го увели

- 16 019574 чения, по меньшей мере 3%-го увеличения, по меньшей мере 5%-го увеличения, по меньшей мере 10%го увеличения, по меньшей мере 20%-го увеличения, по меньшей мере 30%-го, по меньшей мере 50%-го, по меньшей мере 70%-го, по меньшей мере 100%-го или большее увеличение урожайности по сравнению с растением, которое не экспрессирует пестицидную последовательность.

Растения могут обрабатываться одной или более химической композицией, включая один или более гербицид, инсектициды или фунгициды. Примерные химические композиции включают гербициды для фруктовых и овощных культур: атразин, бромацил, диурон, глифосат, линурон, метрибузин, симазин, трифлуралин, флуазифоп, глуфосинат, галосульфурон компании Со^ап, паракват, пропизамид, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, индазифлам; инсектициды для фруктовых и овощных культур: альдикарб, ВасШик 1кшлепд1еп81к, карбарил, карбофуран, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, диазинон, малатион, абамектин, цифлутринф-цифлутрин, эсфенвалерат, λ-цигалотрин, ацехиноцил, бифеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тиаклоприд, динотефуран, флуакрипирим, толфенпирад, клотианидин, спиродиклофен, γ-цигалотрин, спиромезифен, спиносад, ринаксипир, циазипир, спинотерам, трифлумурон, спиротетрамат, имидаклоприд, флубендиамид, тиодикарб, метафлумизон, сульфоксафлор, цифлуметофен, цианопирафен, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, спиноторам, тиодикарб, флоникамид, метиокарб, эмамектин-бензоат, индоксакарб, фостиазат, фенамифос, кадусафос, пирипроксифен, фенбутатин оксид, гекситиазокс, метомил, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он; фунгициды для фруктовых и овощных культур: карбендазим, хлороталонил, этиленбисдитиокарбоматы (ЕВЭС), сера, тиофанат-метил, азоксистробин, цимоксанил, флуазинам, фосетил, ипродион, кресоксим-метил, металаксил/мефеноксам, трифлоксистробин, этабоксам, ипроваликарб, трифлоксистробин, фенгексамид, окспоконазол фумарат, циазофамид, фенамидон, зоксамид, пикоксистробин, пираклостробин, цифлуфенамид, боскалид; гербициды для зерновых: изопротурон, бромоксинил, иоксинил, феноксильные, хлорсульфурон, клодинафоп, диклофоп, дифлуфеникан, феноксапроп, флорасулам, флуроксипир, метсульфурон, триасульфурон, флукарбазон, йодсульфурон, пропоксикарбазон, пиколинафен, мезосульфурон, бефлубутамид, пиноксаден, амидосульфурон, тифенсульфурон, трибенурон, флупирсульфурон, сульфосульфурон, пирасульфотол, пироксулам, флуфенацет, тралкоксидим, пироксасульфон; фунгициды для зерновых: карбендазим, хлороталонил, азоксистробин, ципроконазол, ципродинил, фенпропиморф, эпоксиконазол, крезоксим-метил, хиноксифен, тебуконазол, трифлоксистробин, симеконазол, пикоксистробин, пираклостробин, димоксистробин, протиоконазол, флуоксастробин; инсектициды для зерновых: диметоат, λ-цигалотрин, δ-метрин, α-циперметрин, β-цифлутрин, бифентрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, хлорпирифос, метамидофос, оксидеметон-метил, пиримикарб, метиокарб; гербициды для кукурузы; атразин, алахлор, бромоксинил, ацетохлор, дикамба, клопиралид, 8-диметенамид, глуфосинат, глифосфат, изоксафлутол, 8-метолахлор, мезотрион, никосульфурон, примисульфурон, римсульфурон, сулькотрион, форамсульфурон, топрамезон, темботрион, сафлуфенацил, тиенкарбазон, флуфенацет, пироксасульфон; инсектициды для кукурузы; карбофуран, хлорпирифос, бифетрин, фипронил, имидаклоприд, λцигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тиаметоксам, клотианидин, спиромесифен, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир (Купахуруг), дельтаметрин, тиодикарб, β-цифлутрин, циперметрин, бифентрин, луфенурон, трифлуморон, тефлутрин, тебупиримфос, этипрол, циазипир (Суахуруг), тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, авермектин, метиокарб, спиродиклофен, спиротетрамат; фунгициды для кукурузы: фенитропан, тирам, протиоконазол, тебуконазол, трифлоксистробин; гербициды для риса: бутахлор, пропанил, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даймурон, фентразамид, имазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, пиразосульфурон, пирибутикарб, хинклорак, тиобенкарб, инданофан, флуфенацет, фентразамид, галосульфурон, оксазикломефон, бензобициклон, пирифталид, пеноксулам, биспирибак, оксадиаргил, этоксисульфурон, претилахлор, мезотрион, тефурилтрион, оксадиазон, феноксапроп, пиримисульфан; инсектициды для риса: диазинон, фенитротион, фенобукарб, монокротофос, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фипронил, имидаклоприд, изопрокарб, тиаклоприд, хромафенозид, тиаклоприд, динотефуран, клотианидин, этипрол, флубендиамид, ринаксипир (Купахуруг), дельтаметрин, ацетамиприд, тиаметоксам, циазипир (Суахуруг), спиносад, спиноторам, эмамектин-бензоат, циперметрин, хлорпирифос, картап, метамидофос, этофенпрокс, триазофос, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, карбофуран, бенфуракарб; фунгициды для риса: тиофанат-метил, азоксистробин, карпропамид, эдифенфос, феримзон, ипробенфос, изопротиолан, пенцикурон, пробеназол, пирохилон, трициклазол, трифлоксистробин, диклоцимет, феноксанил, симеконазол, тиадинил; гербициды для хлопка: диурон, флуометурон, М8МА (мононатрийметиларсонат), оксифторфен, прометрин, трифлуралин, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, глифосат, норфлуразон, пендиметалин, пиритиобак-натрий, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глуфосинат, флумиоксазин, тидиазурон; инсектициды для хлопка; ацефат, алдикарб, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, малатион, монокротофос, абамектин, ацетамиприд, эмамектин бензоат, имидаклоприд, индоксакарб, λ-цигалотрин, спиносад, тиодикарб, γ-цигалотрин, спиромесифен, пиридалил, флоникамид, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, β-цифлутрин, спиротетрамат, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, динетофуран, флубендиамид, циазипир (Суахуруг), спиносад, спиноторам, γ-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2

- 17 019574 дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, тиодикарб, авермектин, флоникамид, пиридалил, спиромесифен, сульфоксафлор, профенофос, триазофос, эндосульфан; фунгициды для хлопка; этридиазол, металаксил, хинтозен; гербициды для сои: алахлор, бентазон, трифлуралин, хлоримурон-этил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, глифосат, имазамокс, имазахин, имазефапир, 8-метолахлор, метрибузин, пендиметалин, тепралоксидим, глуфосинат; инсектициды для сои: λ-цигалотрин, метомил, паратион, тиокарб, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксан, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, флубендиамид, ринаксипир (Купахуруг), циазипир (Суахуруг), спиносад, спиноторам, эмамектинбензоат, фипронил, этипрол, δ-метрин, β-цифлутрин, γ- и λ-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, спиротетрамат, спинодиклофен, трифлумурон, флоникамид, тиодикарб, β-цифлутрин; фунгициды для сои: азоксистробин, ципроконазол, эпоксиконазол, флутриафол, пираклостробин, тебуконазол, трифлоксистробин, протиоконазол, тетраконазол; гербициды для сахарной свеклы: хлоридазон, десмедифам, этофумезат, фенмедифам, триаллат, клопиралид, флуазифоп, ленацил, метамитрон, хинмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, хизалофоп; инсектициды для сахарной свеклы: имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динетофуран, δ-метрин, β-цифлутрин, γ/λ-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, тефлутрин, ринаксипир (Купахуруг), циазипир (Суагуруг), фипронил, карбофуран; гербициды для канолы: клопиралид, диклофоп, флуазифоп, глуфосинат, глифосат, метазахлор, трифлуралин этаметсульфурон, хинмерак, хизалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгициды для канолы: азоксистробин, карбендазим, флудиоксонил, ипродион, прохлораз, винклозолин; инсектициды для канолы: карбофуран, органофосфаты, пиретроиды, тиаклоприд, дельтаметрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксан, ацетамиприд, динетофуран, β-цифлутрин, γ- и λ-цигалотрин, τ-флувалериат, этипрол, спиносад, спиноторам, флубендиамид, ринаксипир (Купахуруг), циазипир (Суагуруг), 4-[[(6хлорпиридин-3 -ил)метил] (2,2-дифторэтил)амино] фуран-2(5Н)-он.

Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не для ограничения.

Экспериментальные примеры

Пример 1. Выделение плазмидной ДНК.

Была идентифицирована полная последовательность ДНК из выбранного штамма с помощью молекулярно-генетического метода МЮА8 по следующей схеме.

Приготовление внехромосомной ДНК из штамма. Внехромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всех следующих компонентов: плазмиды различного размера; фаговые хромосомы; фрагменты геномной ДНК, не отделенные по протоколу очистки; другие неидентифицированные внехромосомные молекулы.

Механическое или ферментативное фрагментирование внехромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов.

Секвенирование фрагментированной ДНК с помощью методов высокоэффективного пиросеквенирования.

Идентификация предполагаемых токсинных генов с помощью анализа гомологичных последовательностей и/или других компьютерных анализов.

При необходимости завершение последовательности интересующего гена с помощью одной или нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, ТА1Б-ПЦР).

Пример 2. Гетерологичная экспрессия АХМ1-150.

Всю открытую рамку считывания ахт1-150 (~2 т.п.н., которые кодируют белок молекулярной массой ~77,5 кДа) клонировали экспрессией в клетках Е. со11 вектора рК8Е1Ь (для создания рАХ5482). Генную последовательность ахт1-150, начинающуюся с внутреннего метионина (19 аминокислот по ходу транскрипции, начиная от исходного метионина в рАХ5482), также клонировали в вектор для экспрессии рК8Е1Ь для создания рАХ5484.

Последовательность, кодирующую ахт1-150, также клонировали в вектор экспрессии рАХ916 токсина ВасШик (для создания рАХ5483). Все образовавшиеся клоны подтвердили рестрикционным анализом и окончательно полным секвенированием клонированного гена.

Для экспрессии в Е. со11 трансформировали ВБ21*ОЕ3 с рАХ5482 или рАХ5484. Одну колонию высевали в ЬВ-бульон с добавлением канамицина и выращивали в течение ночи при 37°С. На следующий день высевали в свежую среду, в две порции, 1% выращенной за ночь культуры и выращивали при 37°С до фазы логаритмического роста. Затем культуры индуцировали 1 мМ 1РТС в течение 3 ч при 37°С или в течение ночи при 20°С. Каждый клеточный конгломерат суспендировали в 50 мМ буфера на основе карбоната натрия, рН 10,5 с добавлением 1 мМ ΌΤΤ (дитиотреитол) и воздействовали ультразвуком. Методом δΌδ-РАбЕ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) была обнаружена экспрессия белка ~78 кДа, соответствующего АХМ1-150.

Для экспрессии в ВасШик В151 был трансформирован с рАХ5483, и отдельную колонию выращивали в среде СУ8-д1н в течение 3 дней до спорообразования. Затем клеточный конгломерат экстрагировали с помощью буфера 50 мМ Тпк С1, рН 8,0 или 50 мМ буфера на основе карбоната натрия, рН 10,5, с добавлением в каждый 1 мМ ΌΤΤ (дитиотреитол). Растворимая фракция показала наличие белка Ахт1-150

- 18 019574 с молекулярной массой 78 кДа. Трипсинизация АХМ1-150 дала слабую полосу белка около 55 кДа.

Последовательность открытой рамки считывания АХМ1-150 описана как 8Е0 ΙΌ N0: 1 в настоящем изобретении и кодирует белок АХМ1-150 (8Е0 ΙΌ N0: 2).

Поиск аминокислотной последовательности АХМ1-150 в сравнении с общедоступными базами данных последовательностей показывает, что АХМ1-150 гомологичен белку АХМ1-004 (патент США № 7355099). АХМ1-150 проявляет также аминокислотную гомологию к сгу1Са4 и к группе АХМ1-004подобных белков, описанных в опубликованной международной заявке № \¥0 2005/107383.

Известные гомологи и приблизительная идентичность в процентах:

АХМ1-004 - 85,5%.

Сгу1Са4 (домен токсина) - 51,8%.

Пример 3. Пестицидная активность АХМ1-150.

Растворимые экстракты, содержащие АХМ1-150, были проверены в биологических испытаниях на насекомых с соответствующими контролями. Пятидневное считывание планшетов показало, что АХМ1150 обладает пестицидной активностью по отношению к европейскому кукурузному мотыльку (ЕСВ), гусенице бархатной фасоли (УВС) и обеспечивают высокую летальность (>50%) капустной моли (ИВМ) и юго-западной кукурузной огневки (8\УСВ).

В табл. 1 представлено описание метода присвоения баллов, используемого в данной заявке.

Таблица 1

Описание системы присвоения баллов

Балл	Описание
0	не наблюдалось никакого эффекта
1	слабая неоднородная низкорослость
2	умеренная неоднородная низкорослость
3	от умеренной до сильной однородной низкорослости
4	смертность (<100%) с однородной низкорослостью
5	полная смертность

Таблица 2

Пестицидная активность АХМ1-150

Пример 4. Дополнительные биологические испытания на пестицидную активность.

Нуклеотидные последовательности по изобретению можно проверять на их способность продуцировать пестицидные белки. Способность пестицидного белка действовать как пестицид на вредителя часто оценивают рядом способов. Один способ, хорошо известный в данной области, заключается в выполнении анализа скармливания. В таком анализе скармливания на вредителя воздействуют пробой, содержащей либо соединения, подлежащие проверке, либо контрольные пробы. Часто это выполняют, помещая материал, подлежащий проверке, или соответствующее разбавление такого материала на материал, который вредитель поглотит, такой как искусственный корм. Материал, подлежащий проверке, может быть жидким, твердым или представлять собой взвесь. Материал, подлежащий проверке, можно поместить на поверхность и затем позволить высохнуть. Альтернативно, материал, подлежащий проверке, можно смешать с растопленным искусственным кормом, затем распределить по аналитической камере. Аналитической камерой может быть, например, планшет, чашка или лунка микротитровального планшета.

Биологические испытания для сосущих вредителей (например, тлей) могут включать отделение исследуемого материала от насекомого перегородкой, в идеале частью, которая может быть проколота частями сосущего ротового аппарата сосущего насекомого для поглощения исследуемого материала. Часто исследуемый материал смешивают со стимулятором питания, таким как сахароза, с целью содействия поглощению исследуемого соединения.

Другие типы биологических испытаний могут включать микроинъекцию исследуемого материала в рот или кишку вредителя, а также создание трансгенных растений с последующей проверкой способности вредителя питаться трансгенным растением. Испытание на растении может включать изолирование обычно потребляемых частей растения, например небольших клеток, присоединенных к листьям, или

- 19 019574 изолирование целых растений в клетках, содержащих насекомых.

Другие методы и подходы к биологическим испытаниям вредителей известны в данной области и могут быть найдены, например, у КоЬегкои и Ргс151сг. изд. (1992) РеФайе Ьюаккаук νίΐΐι аййгороФ, СКС, Воса Ка1ои, ЕЬ. В качестве альтернативы биологические испытания широко описаны в журналах ΛγΙΙιιόрой Мападетеи! Те515 и 1оигиа1 о! Есоиошк Еи1ото1оду или обсуждаются членами Американского энтомологического общества (Е8А).

Пример 5. Направленная эволюция ΑΧΜΙ-004.

Направленную эволюцию осуществляли на ΑΧΜΙ-004 (ЗЕЦ ΙΌ N0: 14). Три петли в связывающемся с рецептором участке были объектами мутагенеза. На первом этапе были образованы делеции петель 1 (соответствует остаткам 311-316 последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 14), 2 (соответствует остаткам 368-378 последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 14) и 3 (соответствует остаткам 434-438 последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 14), экспрессированы в В151 и испытаны на биоактивность. Делеции петель 2 и 3 сильно снизили растворимость белка, в то время как делеция петли 1 не повлияла на растворимость белка. Вариант делеции петли 1 проявил сниженную токсичность по отношению к европейскому кукурузному мотыльку (ЕСВ), однако сохранил свою активность по отношению к капустной моли (ΌΒΜ).

Потом мутагенезу подвергли в общей сложности 23 положения внутри данных 3 петель. Был создан набор точечных мутантов.

Плазмиду рАХ5485 (Нк6-ахш1-004-ш2 в рВБЕ1Ь) использовали для экспрессии ν( ахт1-004, она была также основой мутагенеза и экспрессии варианта.

Мутагенез проводили с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза ОЫКСНАНСЕ® (компании 81га1адеие), мутантов секвенировали и идентифицировали уникальные варианты. Была создана следующая вариабельность точечных мутантов.

Таблица 3

Петля 1

- 20 019574

Таблица 4

Петля 2

Положение	368	369	370	371	372	373	374	375	376	377	378
«ί	Р	1	0	0	₽	А	Р	А	Р	Р	Г
	А	А	Р	К	0	б	в	а	3	с	А
	С	И	5	Р	к	И	с	и	с	3	С
	т	С	С	5	V	5	А	с	т	т	т
	5	т	К	6	в	с	3	3	и	А	и
	С	к	и	т	N	Р	т	в	с	И	с
	к	м	А	ь	Ё	т	и	ϋ	А	В	3
	ъ	Р	т	V	Е	V	V	ь	В	0	в
	0	К	V	н	Н	N	н	V	I	I	V
	V	Е	Е	к	О	Е	Р	к	V	ь	У
	N	V	ь	г	м	э	ь	I	ь	н	к
	О	н	Υ	N	А	м	υ	Е	О	V	<2
	Е	I	I	π	0	I	Υ	И	Е	к	Ё
	Н			Υ	к	г	ΰ	Ώ	ΰ	0	I
	т			м	т	к	Е	м	м	О	Ь
				Е	3	Е	м		N	Е	I
					и	Ъ	N		Н	У	υ
						У
						н

ВСЕГО	14	12	12	15	16	18	14	14	16	16	16

Таблица 5

Петля 3

- 21 019574

Объединение вариантов для петли 1, петли 2 и петли 3 производили отдельно.

Экспрессия библиотеки и скрининг

Первичный скрининг.

Объединенные варианты библиотеки, а также рАХ5485 были трансформированы в клетки ВЬ21*ЭЕ3 и высеяны на планшеты с ЬВ-бульоном + канамицин (100 мкг/мл). Свежие колонии отбирали в жидкую среду из 16 мл ЬВ-бульона + канамицин (100 мкг/мл) и выращивали в блоках с 24 глубокими лунками при 37°С и при скорости кругового встряхивания 300 об./мин до достижения ΘΌ (оптической плотности) при 600 нм в 0,3-0,4. 1РТС (изопропилтиогалактозид) добавляли до конечной концентрации в 0,5 мМ и культуры инкубировали в течение последующих 18 ч при 20°С. Определяли оптическую плотность при 600 нм и клетки собирали посредством центрифугирования (10 мин при 4500 об./мин, 4°С). Клеточные конгломераты ресуспендировали в 50 мМ карбоната натрия, рН 10,5, 1 мМ ЭТТ с плотностью в 10 ΘΌ 600/мл. Клетки разрушали встряхиванием с шариками и получали растворимые экстракты после центрифугирования при 4000 об./мин в течение 15 мин при 4°С.

Экстракты анализировали на наличие активности по отношению к европейскому кукурузному мотыльку ЕСВ, юго-западной кукурузной огневке (8^СВ), листовертке табачной (Ηζ), гусенице бархатной фасоли (УВС) и капустной моли (ЭВМ), по 4 репликата на вариант каждого. По истечении 5 дней устанавливали баллы токсичности посредством расчета среднего значения из 4 репликатов. 122 объединенных варианта петли 1, 240 объединенных вариантов петли 2 и 121 объединенный вариант петли 3, соответственно, анализировали в рамках первичного скрининга, обеспечивая 1,5-кратное покрытие библиотеки.

Повторные биологические испытания и наращивание

Варианты, показавшие улучшенные результаты по отношению к ЕСВ или 8\УСВ, секвенировали и подвергали повторным биологическим испытаниям, по 4 репликата на вариант. Варианты, которые снова показывали улучшенные результаты по отношению к ЕСВ или 8\УСВ, выбирали для наращивания.

Для наращивания 3 свежетрансформированные колонии отбирали в среду из 70 мл ЬВбульона+канамицин (100 мкг/мл) и выращивали в 0,5-литровых колбах для встряхивания при 37°С и при скорости кругового встряхивания 150 об./мин до достижения значения ΘΌ при 600 нм, равного 0,3-0,4. 1РТС (изопропилтиогалактозид) добавляли до конечной концентрации в 0,5 мМ и культуры инкубировали в течение последующих 18 ч при 20°С. Определяли ΘΌ при 600 нм и собирали клетки посредством центрифугирования (10 мин при 5000 об./мин, 4°С). Клеточные конгломераты ресуспендировали в 50 мМ карбоната натрия, рН 10,5, 1 мМ ЭТТ с плотностью в 10 ΘΌ 600/мл. Клетки разрушали встряхиванием с шариками и получали растворимые экстракты после центрифугирования при 4000 об./мин в течение 15 мин при 4°С. Варианты Ахт1-004 из этих экстрактов количественно анализировали с помощью методики 8Э8-РЛСЕ с окрашиванием кумасси при сравнении серийных разбавлений экстракта со стандартом бычьего сывороточного альбумина известной концентрации. Все исследованные варианты белка экспрессируют на очень похожих уровнях.

Проводили биологические испытания выращенных препаратов по отношению к ЕСВ, 8\УСВ, УВС, Ηζ и ЭВМ по 16 репликатов на вариант и вредителя. Были подсчитаны средние баллы.

Следующие варианты петли 2 проявили повышенную токсичность в рамках первичного скрининга, повторного биологического испытания и при наращивании.

Таблица 6

	ЕСВ	5ИСВ
	Низкорослость	Процент смертности	Низкорослость	Процент смертности
ахтП1- 004	+++	13%		6%
Ь21В11	+	9%	+	16%
Ь21Г2	++	6%	+	14%
Ь23С5	+	9%	+	16%
Ь21А5	++			-
Ь22Н7	++
Ь22Е7	+
Ь22Г7
рВЗГ1Ь	-	-

Вариабельность последовательности в положениях 370, 373, 376 и 377 показана в табл. 7.

- 22 019574

Таблица 7

Таблица 8

	Ηζ	ЕСВ	УВС	овм	5НСВ
ахтЮ04	*	4-	++	+++++	+
1Н11	-	4-4-	4-	4- + +4- +	+
1Е8		++	++	+++++	нет данных
1Г9	4-	++	4-	++ + + +	нет данных

Все три улучшенных варианта имеют мутацию в положении 316 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 14, где аспарагиновый остаток мутировал в валин, пролин или фенилаланин в мутантах Ь11Е8, Б11Б9 и Б11Н11, соответственно, позволяя предположить, что было идентифицировано важное положение, связанное с повышенной активностью.

Следующие варианты петли 3 проявили повышенную токсичность в рамках первичного скрининга, повторных биологических испытаний активности по отношению к ЕСВ и при наращивании.

Таблица 9

Улучшенные варианты имеют мутацию в виде замены лизина в положении 434 АХМ1004 на треонин и валин в мутантах Б31В10 и Б31А11, соответственно, и пролина в положении 438 АХМ1004 - на серин в мутанте Б31Н11. В смоделированной кристаллической структуре этих АХМ1004 все боковые цепи мутированных положений в петлях 1, 2 и 3 имеют одно и то же общее направление. Это открытие предполагает, что аминокислоты в нескольких петлях могут участвовать в обычном молекулярном интерфейсе связывания. Дополнительные перестановки, включающие функционально улучшенную вариабельность в нескольких петлях, может, таким образом, обеспечить еще и дальнейшее повышение активности.

Пример 6. Направленная эволюция АХМ1-150.

Этот пример описывает направленную эволюцию АХМ1-150 (8Е0 ΙΌ N0: 2). Петля на предполагаемом участке процессинга была объектом мутагенеза.

Плазмиду рАХ5482 (Н1з6-ахт1-150 в рК8Б1Ь) использовали для экспрессии \\1 ахт1-150, и она была также основой для мутагенеза и экспрессии варианта. Мутагенез проводили с использованием набора ^υIКСНАNСЕ® (компании 81га!адеие), мутантов секвенировали и идентифицировали уникальные варианты. Была создана следующая вариабельность точечных мутантов.

- 23 019574

Таблица 10

	5	м	V	К	Н	β	N
		г	н		V	V	β
			Е			г	Ъ
			Υ				Υ
			К				м
							0
ВСЕГО	10	11	14	10	11	12	15

Экспрессия библиотеки и скрининг

Первичный скрининг.

Объединенные варианты библиотеки, а также рАХ5482 были трансформированы в клетки ВБ21*ЭЕ3 и высеяны на планшеты с ЬВ-бульоном + канамицин (100 мкг/мл). Свежие колонии отбирали в жидкую среду из 16 мл ЕВ-бульона + канамицин (100 мкг/мл) и выращивали в блоках с 24 глубокими лунками при 37°С и при скорости встряхивания 300 об./мин до достижения ΟΌ, равной 0,3-0,4 при 600 нм. 1РТС (изопропилтиогалактозид) добавляли до конечной концентрации в 0,5 мМ и культуры инкубировали в течение последующих 18 ч при 20°С. Определяли ΟΌ при 600 нм и клетки собирали посредством центрифугирования (10 мин при 4500 об./мин, 4°С). Клеточные конгломераты ресуспендировали в 50 мМ карбоната натрия, рН 10,5, 1 мМ ΌΤΤ с плотностью в 10 ΟΌ 600/мл. Клетки разрушали встряхиванием с шариками и получали растворимые экстракты после центрифугирования при 4000 об./мин в течение 15 мин при 4°С.

Экстракты подвергали биологическим испытаниям на наличие активности по отношению к ЕСВ, З^СВ, Ηζ, УВС и ЭВМ, по 4 репликата на вариант каждого. По истечении 5 дней определяли баллы токсичности посредством расчета среднего значения из 4 репликатов. 119 вариантов были подвергнуты скринингу, давая 1,5-кратное покрытие библиотеки.

Варианты, показавшие улучшенные результаты по отношению к ЕСВ или З^СВ, секвенировали и подвергали повторным биологическим испытаниям, по 4 репликата на вариант. Варианты, которые снова показывали улучшенные результаты по отношению к ЕСВ или З^СВ, выбирали для наращивания.

Для наращивания 3 свежетрансформированные колонии отбирали в среду из 70 мл ЕВ-бульона + канамицин (100 мкг/мл) и выращивали в 0,5-литровых кобах для встряхивания при 37°С и при скорости кругового встряхивания 150 об./мин до достижения ΟΌ, равной 0,3-0,4 при 600 нм. 1РТС (изопропилтиогалактозид) добавляли до конечной концентрации в 0,5 мМ и культуры инкубировали в течение последующих 18 ч при 20°С. Определяли ΟΌ при 600 нм и клетки собирали посредством центрифугирования (10 мин при 5000 об./мин, 4°С). Клеточные конгломераты ресуспендировали в 50 мМ карбоната натрия, рН 10,5, 1 мМ ΌΤΤ с плотностью в 10 ΟΌ 600/мл. Клетки разрушали встряхиванием с шариками и получали растворимые экстракты после центрифугирования при 4000 об./мин в течение 15 мин при 4°С. Варианты Ахт1-150 из этих экстрактов количественно анализировали с помощью методики ЗЭЗ-РАСЕ с окрашиванием кумасси при сравнении серийных разбавлений экстракта со стандартом бычьего сывороточного альбумина известной концентрации. Все исследованные варианты белка экспрессируют на очень похожих уровнях.

Проводили биологические испытания выращенных препаратов по отношению к ЕСВ, З^СВ, УВС, Ηζ и ЭВМ по 16 репликатов на вариант и вредителя. Были подсчитаны средние показатели и определены стандартные отклонения.

- 24 019574

Активность вариантов, проявивших улучшения в рамках методики наращивания, представлены в табл. 11-13 ниже.

Таблица 11

η=16	активность по отношению к ЕСВ	активность по отношению к 5ИСВ
	Показатель низкорослости	Смертность	Показатель низкорослости	Смертность
ΑΧΜΙ150	4-	-	+ + +	25%
ишз	+	-	+++	33%
ЫЮ6	-	-	4 + 4-	25%

Ы1В6	4-	-	+++	16%
Б11Е5	-	-	+ + +	19%
рЕ5Г1Ь	-	-	-	-

Таблица 12

п=16	активность по отношению к ЕСВ	активность по отношению к 5ИСВ
	Показатель низкорослости	Смертность	Показатель низкорослости	Смертность
ΑΧΜΙ150	+	8%	+++ (п=12)	58%
Ы1С10	+	13%	++++	97%
Ы1С10	++	8%	+++	75%
Ы1Г10	+	-	+++	72%
Ы1Е12	+	-	+ (п=12)	31%

Таблица 13

П“16	активность по отношению к ЕСВ	активность по отношению к 5ИСВ
	Показатель низкорослости	Смертность	Показатель низкорослости	Смертность
ΑΧΜΙ150	+	-	+++	41%
1.1165	-		-	6%
Ь1Ю1	-	2%	+++	64%
Е11А6	-	3%	++	41%
Ы1В5	-	5%	+	19%
Л12С1	-	-	++	37%

Вариабельность последовательности этих улучшенных вариантов описана ниже.

Таблица 14

	116	117	118	119	120	121	122
ΑΧΜΙ150	N	N	т	0	3	3	К
Ь11А6	N	N	5	с	5	5	к
Ы1В5	N	N	N	с	3	А	к
Ы1В6	N	N	Т	б	5	3	к

Ы1С10	К	N	Т	с	3	3	к
Ь1Ю1	N	N	Т	Е	О	3	к
ыюю	N	N	Т	(3	0	5	к
шоз	N	N	Т	К	3	3	к
Ы1Г10	N	N	Т	с	3	Р	к

- 25 019574

Пример 7. Перенос генов с помощью векторов для экспрессии в растении.

Кодирующие участки изобретения соединены с соответствующими регуляторными последовательностями (промоторами и терминаторами) для экспрессии в растениях. Такие последовательности хорошо известны в данной области и могут включать актиновый промотор риса или убиквитиновый промотор кукурузы для экспрессии у однодольных, ИВЦ3-промотор из АгаЬ1борз1з или промотор СаМУ 358 для экспрессии у двудольных и терминаторы поз или ΡίπΙΙ. Методики получения и подтверждения конструктов промотор-ген-терминатор также хорошо известны в данной области.

В одном аспекте изобретения конструируют и получают синтетические последовательности ДНК. Такие синтетические последовательности имеют измененную нуклеотидную последовательность относительно родительской последовательности, но кодируют белки, которые по сути идентичны родительскому белку ΑΧΜΙ-150 (например, 8ЕЦ ГО N0: 3, 4, 5, 6 или 7).

Другой аспект изобретения охватывает синтетические последовательности ДНК, кодирующие белки, которые существенно идентичны белку ΑΧΜΙ-004 (например, 8ЕЦ ГО N0: 8-12). Белок ΑΧΜΙ-004 описан в патенте США № 7355089 и патентной заявке США № 12/209354, поданной 12.09.2008 г. с заголовком Синтетические дельта-эндотоксиновые гены ΑΧΜΙ-004 и способы их применения.

В другом аспекте изобретения модифицированные версии синтетических генов конструируют так, что образовавшийся пептид нацелен на растительную органеллу, такую как эндоплазматический ретикулум или апопласт. Пептидные последовательности, приводящие к нацеливанию слитых белков на растительные органеллы, известны в данной области. Например, из уровня техники известно, что Νтерминальный участок гена кислой фосфатазы из белого люпина Ьиртиз а1Ьиз (6ЕNВΑNΚ® ΙΌ 6Ι:14276838, МШег е! а1. (2001) Р1ап! Рйузю1оду 127: 594-606) приводит к нацеливанию на эндоплазматический ретикулум гетерологичных белков. Если образовавшийся слитый белок также содержит последовательность удержания в эндоплазматическом ретикулуме, включающую пептид Ν-концевой лизинаспарагиновая кислота-глютаминовая кислота-лейцин (т.е. КЭЕЬ-мотив, 8ЕЦ ГО N0: 13) на С-конце, слитый белок будет нацелен на эндоплазматический ретикулум. Если слитый белок не имеет нацеливающей на эндоплазматический ретикулум последовательности на С-конце, белок будет нацеленным на эндоплазматический ретикулум, но, в конечном итоге, будет секвестрирован в апопласте.

Таким образом, этот ген кодирует слитый белок, который содержит на Ν-конце тридцать одну аминокислоту гена кислой фосфатазы из белого люпина Ьиртиз а1Ьиз (6ЕNВΑNΚ® ΙΌ 6Е14276838, МШег е! а1., 2001, см. выше), слитые с Ν-концом аминокислотной последовательности по изобретению, а также последовательность КЭЕЬ на С-конце. Таким образом, образовавшийся белок, как предполагается, будет нацелен на эндоплазматический ретикулум растения при экспрессии в растительной клетке.

Растительные экспрессионные кассеты, описанные выше, объединены с подходящим растительным селектируемым маркером с целью содействия селекции трансформированных клеток и тканей и лигированы в векторы трансформации растения. Они могут включать бинарные векторы из опосредованной АдгоЬас!епит трансформации или простые плазмидные векторы для аэрозольной или биолистической трансформации.

Пример 8. Перенос генов с помощью векторов для экспрессии в растении.

Кодирующий участок ДНК генов по изобретению функционально связывают с соответствующими регуляторными последовательностями (промоторами и терминаторами) для экспрессии в растениях. Такие последовательности хорошо известны в данной области и могут включать актиновый промотор риса или убиквитиновый промотор кукурузы для экспрессии у однодольных, ИВЦ3 промотор из АгаЬ1борз1з или промотор СаМУ 358 для экспрессии у двудольных и терминаторы поз или РшП. Методики получения и подтверждения конструктов промотор-ген-терминатор также хорошо известны в данной области.

Растительные экспрессионные кассеты, описанные выше, объединяют с подходящим растительным селектируемым маркером с целью содействия селекции трансформированных клеток и тканей и лигируют в вектор для трансформации растения. Они могут включать бинарные векторы из опосредованной АдгоЬас!егшт трансформации или простые плазмидные векторы для аэрозольной или биолистической трансформации.

Пример 9. Трансформация клеток кукурузы генами пестицидных белков, описанными в данном документе.

Початки кукурузы лучше всего собирать на 8-12 день после опыления. Зародыши выделяют из початков, предпочтительны зародыши длиной 0,8-1,5 мм для применения для трансформации. Зародыши помещают на чашки щитком вверх, на приемлемую инкубационную среду, такую как среда ΌΝ62Α58 (3,98 г/л солей Ν6; 1 мл/л разбавленного в 1000 раз исходного раствора витаминов Ν6; 800 мг/л Ьаспарагина; 100 мг/л миоинозитола; 1,4 г/л Ь-пролина; 100 мг/л казаминовых кислот; 50 г/л сахарозы; 1 мл/л (исходного раствора 1 мг/мл) 2,4-Ό). Однако среда и соли, отличные от ΌΝ62Α58, приемлемы и известны в данной области. Зародыши инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте. Однако, по существу, нет необходимости инкубировать зародыши в течение ночи.

Образовавшиеся эксплантанты переносят на квадраты сетки (30-40 на чашку), нанесенные на осмотическую среду на приблизительно 30-45 мин, затем переносят на пластину для аэрозольной пучковой

- 26 019574 трансформации (см., например, РСТ публикацию νΟ/0138514 и патент США № 5240842).

Конструкты ДНК, предназначенные для генов по изобретению в растительных клетках, вводят в растительную ткань методом аэрозольной инжекции генетического материала в клетки с использованием условий, по сути описанных в РСТ-публикации νΟ/0138514. После аэрозольной инжекции зародыши инкубируют в течение приблизительно 30 мин на осмотической среде и помещают на инкубационную среду на ночь при 25°С в темноте. Для того чтобы избежать излишнего повреждения эксплантов, подвергнутых аэрозольной инжекции, их инкубируют в течение по меньшей мере 24 ч до переноса на восстанавливающую среду. Затем зародыши выкладывают на среду восстановительного периода на приблизительно 5 дней, 25°С в темноте, затем переносят на селекционную среду. Эксплантанты выращивают на селекционной среде до восьми недель в зависимости от природы и характеристик конкретной используемой селекции. После периода селекции образовавшийся каллюс переносят на среду созревания зародыша до завершения формирования зрелых соматических зародышей. Затем образовавшиеся зрелые соматические зародыши помещают под слабое освещение и процесс регенерации инициируют способами, известными в данной области. Образовавшимся побегам позволяют укорениться на среде для укоренения, а образовавшиеся растения переносят в цветочные горшки и размножают как трансгенные растения.

Материалы

Среда ΌΝ62Λ58

Компоненты	На литр	Источник
Среда СЬи'з N6, смесь основных солей (Νο: в каталоге С 416)	3,98 г/л	РЬуЬо1ес1то1оду ЬаЬз
Среда СЬи N6, раствор витаминов (Νο: в каталоге С 149)	1 мл/л (разбавленного в 1000 раз исходного раствора)	РЬуЬоЬес1шо1оду ЬаЬз
Ъ-аспарагин	800 мг/л	РЬуЬоЬес)1по1оду ЬаЬз
Мио-инозитол	100 мг/л	Згдта

Ь-пролин	1,4 г/л	РЬуЬоЬес1то1оду ЬаЬз
Казаминовые кислоты	100 мг/л	Е1зЬег ЗсхепЬШс
Сахароза	50 г/л	РЬу1:оЬесНпо1оду ЬаЬ з
2,4-Ό (Νο: в каталоге Ώ-7299)	1 мл/л (исходного раствора 1мг/мл)	ЗЬдта

рН раствора регулируют до рН 5,8 1Ν ΚΟΗ/1Ν КС1, добавляют Се1п(е (заменитель агара, компании 81дта) при концентрации до 3 г/л и среду автоклавируют. После охлаждения до 50°С добавляют 2 мл/л 5 мг/мл исходного раствора нитрата серебра (компании Рйу1о1есйпо1оду ЬаЬз).

Пример 10. Трансформация генов по изобретению в растительных клетках с помощью трансформации, опосредованной АдгоЬас1епит.

Початки кукурузы лучше всего собирать на 8-12 день после опыления. Зародыши выделяют из початков предпочтительно зародыши длиной 0,8-1,5 мм для применения в трансформации. Зародыши помещают на чашки щитком вверх на приемлемую инкубационную среду и инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте. Однако в сущности нет необходимости инкубировать зародыши в течение ночи. Зародыши вводят в контакт со штаммом АдгоЬас1епит, содержащим соответствующие векторы для опосредованного Т1 плазмидой переноса приблизительно на 5-10 мин, а затем высевают на среду для совместной культивации приблизительно на 3 дня (25°С в темноте). После совместной культивации эксплантанты переносят на восстановительную среду приблизительно на пять дней (при 25°С в темноте). Эксплантанты инкубируют в селекционной среде до восьми недель в зависимости от природы и характеристик конкретной используемой селекции. После периода селекции образовавшийся каллюс переносят на среду созревания зародыша до завершения формирования зрелых соматических зародышей. Затем образовавшиеся зрелые соматические зародыши помещают под слабое освещение и процесс регенерации инициируют, как это известно в данной области.

Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании, характерны для уровня специалиста в данной области, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в данный документ ссылкой так же, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка бы

- 27 019574 ла включена отдельно.

Хотя вышеупомянутое изобретение описано детально с использованием иллюстраций и примеров для ясности понимания, очевидно, что определенные изменения и модификации можно осуществить в пределах объема приложенной формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, обладающую пестицидной активностью, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из

a) нуклеотидной последовательности, представленной в 8ЕО ΙΌ N0: 1, 8, 9, 10, 11 или 12;

b) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2; и

c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность является синтетической последовательностью, которая сконструирована для экспрессии в растении.
3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где указанная последовательность представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 3, 4, 5, 6 или 7.
4. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
5. Вектор по п.4, дополнительно включающий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный полипептид.
6. Клетка-хозяин, которая содержит вектор по п.4.
7. Клетка-хозяин по п.6, которая является бактериальной клеткой-хозяином.
8. Клетка-хозяин по п.6, которая является растительной клеткой.
9. Трансгенное растение, включающее клетку-хозяина по п.8.
10. Трансгенное растение по п.9, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, томатов, крестоцветных, перцев, картофеля, хлопчатника, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.
11. Трансгенное семя, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
12. Выделенный полипептид с пестицидной активностью, выбранный из группы, состоящей из

a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2;

b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2; и

c) полипептида, который кодируется 8Е0 ΙΌ N0: 1.
13. Полипептид по п.12, дополнительно включающий гетерологичные аминокислотные последовательности.
14. Композиция, включающая полипептид по п.12.
15. Композиция по п.14, где указанная композиция выбрана из группы, состоящей из порошка, дуста, таблеток, гранул, аэрозоля, эмульсии, коллоида и раствора.
16. Композиция по п.14, где указанная композиция получена высушиванием, лиофилизацией, гомогенизацией, экстракцией, фильтрацией, центрифугированием, седиментацией или концентрированием культуры бактериальных клеток.
17. Композиция по п.14, включающая от около 1 до около 99 мас.% указанного полипептида.
18. Способ борьбы с популяцией чешуекрылых, жесткокрылых, нематодных или двукрылых вредителей, включающий контакт указанной популяции с пестицидно эффективным количеством полипептида по п.12.
19. Способ уничтожения чешуекрылого, жесткокрылого, нематодного или двукрылого вредителя, включающий контакт указанного вредителя с или скармливание указанному вредителю пестицидно эффективного количества полипептида по п.12.
20. Способ получения полипептида с пестицидной активностью, включающий культивацию клеткихозяина по п.6 при условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид.
21. Растение, имеющее стабильно встроенный в свой геном ДНК-конструкт, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, обладающий пестицидной активностью, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из

a) нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8, 9, 10, 11 или 12;

b) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2; и

c) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную

- 28 019574 последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 2, где указанная нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который управляет экспрессией кодирующей последовательности в растительной клетке.
22. Растение по п.21, где указанное растение является растительной клеткой.
23. Способ защиты растения от вредителя, включая введение в указанное растение или его клетку по меньшей мере одного вектора экспрессии, включающего нуклеотидную последовательность, которая кодирует пестицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из

a) нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 8, 9, 10, 11 или 12;

b) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; и

c) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 2.
24. Способ по п.23, где указанное растение продуцирует пестицидный полипептид, обладающий пестицидной активностью по отношению к чешуекрылому, жесткокрылому, нематодному или двукрылому вредителю.