BR112020023800A2 - elementos reguladores de planta e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

a presente revelação se refere ao campo de biologia molecular de plantas, mais particularmente, a regulação de expressão genética em plantas.

Description

ELEMENTOS REGULADORES DE PLANTA E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE
[0001] Uma listagem de sequência que tem o nome de arquivo "7439WO_SeqList.txt", criada em 18 de maio de 2019 e que tem um tamanho de 25 quilobytes é depositada na forma legível por computador concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequências faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0002] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos no 62/674.994, depositado em 5 de maio de 2018, que é incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.
CAMPO
[0003] A presente revelação refere-se ao campo de biologia molecular de plantas, mais particularmente, à regulação de expressão genética em plantas.
ANTECEDENTES
[0004] A expressão de sequências de DNA heterólogas em um hospedeiro de planta é dependente da presença de elementos reguladores operacionalmente ligados que são funcionais dentro do hospedeiro de planta. A escolha da sequência promotora pode determinar quando e onde dentro do organismo a sequência de DNA heteróloga é expressa. Quando a expressão em tecidos ou órgãos específicos é desejada, promotores preferenciais de tecido podem ser usados. Quando a expressão genética em resposta a um estímulo é desejada,
promotores induzíveis são o elemento regulador de escolha. Em contraste, quando a expressão contínua é desejada ao longo das células de uma planta, os promotores constitutivos são utilizados. As sequências reguladoras adicionais a montante e/ou a jusante da sequência promotora nuclear podem ser incluídas nos construtos de expressão de vetores de transformação para gerar níveis variáveis de expressão de sequências de nucleotídeos heterólogos em uma planta transgênica.
[0005] Frequentemente, é desejável expressar uma sequência de DNA e tecidos ou órgãos particulares de uma planta. Por exemplo, a resistência aumentada de uma planta à infecção por patógenos de solo e aéreos deve ser obtida por manipulação genética do genoma da planta para compreender um promotor preferido de tecido operacionalmente ligado a um gene de resistência a patógenos heterólogo de modo que as proteínas de resistência a patógenos sejam produzidas no tecido de planta desejado. Alternativamente, pode ser desejável inibir a expressão de uma sequência de DNA nativo dentro de tecidos de uma planta para alcançar um fenótipo desejado. Nesse caso, tal inibição pode ser alcançada com a transformação da planta para compreender um promotor preferencial de tecido operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos antissenso, de modo que a expressão da sequência antissenso produza uma transcrição de RNA que interfira na tradução do mRNA da sequência de DNA nativa.
[0006] Alterar geneticamente as plantas através do uso de técnicas de manipulação genética e produzir, desse modo, uma planta com traços úteis pode exigir a disponibilidade de uma variedade de elementos reguladores. Um acúmulo de promotores e outros elementos reguladores poderia possibilitar que o investigador expresse em níveis e locais celulares desejados moléculas de DNA recombinante. Portanto, uma coleta de promotores permitiria que um traço novo fosse expresso no nível desejado no tecido desejado. Desse modo, isolamento, caracterização e criação de elementos reguladores que possam produzir um padrão de expressão que é único e servem como regiões reguladoras para a expressão de sequências de nucleotídeos heterólogos de interesse são úteis para a manipulação genética de plantas.
SUMÁRIO
[0007] Composições e métodos para regular a expressão de uma sequência de nucleotídeos heterólogos de interesse em uma planta ou célula de planta são fornecidos. As moléculas de DNA que compreendem sequências de polinucleotídeos inovadoras para elementos reguladores que iniciam a transcrição são fornecidas. Em algumas concretizações, o elemento regulador tem atividade promotora que inicia a transcrição em uma célula de planta. Certas concretizações compreendem as sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-12. Estão também incluídos fragmentos, segmentos ou variantes funcionais das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 a 12, em que as ditas sequências iniciam a transcrição em uma célula de planta, ou uma sequência de polinucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 a 12, em que as ditas sequências iniciam a transcrição na célula de planta. As concretizações também incluem construtos de DNA que compreendem um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse, em que o dito promotor tem capacidade para acionar a expressão da dita sequência de nucleotídeos heteróloga em uma célula de planta e o dito promotor compreende uma das sequências de nucleotídeos reveladas no presente documento. As concretizações também incluem construtos de DNA que compreendem um aprimorador e um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos heteróloga de interesse, em que o dito aprimorador e o promotor heterólogo têm capacidade para acionar a expressão da dita sequência de polinucleotídeos em uma célula de planta e o dito promotor heterólogo compreende uma das sequências de polinucleotídeos apresentadas em SEQ ID NOs: 1-12. As concretizações fornecem, ainda, vetores de expressão e plantas ou células de planta que têm incorporado estavelmente em seus genomas um construto de DNA conforme é descrito acima. Adicionalmente, as composições incluem semente transgênica de tais plantas.
[0008] As concretizações também incluem construtos de DNA que compreendem um promotor de Actina7 de Brachypodium distachyon (Bd-Actin7) operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos heterólogos de interesse, em que o dito promotor tem a capacidade para acionar a expressão da dita sequência de polinucleotídeos heterólogos em uma célula de planta, e o dito promotor compreende uma das SEQ ID NOs: 1 a 12, ou um fragmento funcional das mesmas, conforme revelado no presente documento. As concretizações fornecem, ainda, vetores de expressão e plantas ou células de planta que têm incorporado estavelmente em seus genomas um construto de DNA conforme é descrito acima. Adicionalmente, as composições incluem semente transgênica de tais plantas.
[0009] A jusante da região de iniciação de transcrição do elemento regulador estará uma sequência de interesse que promoverá a modificação do fenótipo da planta. Tal modificação inclui modular a produção de um produto endógeno, como quantidade, distribuição relativa, ou semelhantes, ou produção de um produto de expressão exógena para fornecer uma função inovadora ou modulada ou produto na planta. Por exemplo, uma sequência de polinucleotídeos heteróloga que codifica um produto de gene que confere resistência ou tolerância a herbicida, sal, frio, seca, patógeno, nematódeos ou insetos é abrangida.
[0010] Em outra concretização, é fornecido um método para modular a expressão de um gene em uma planta estavelmente transformada que compreende as etapas de (a) transformar uma célula de planta com um construto de DNA que compreende um elemento regulador revelado no presente documento, ou um fragmento funcional do mesmo, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de polinucleotídeos heteróloga; (b) cultivar a célula de planta sob condições de crescimento de planta e (c) regenerar uma planta estavelmente transformada a partir da célula de planta, em que a expressão da sequência de nucleotídeos ligada altera o fenótipo da planta. Em outra concretização,
o construto de DNA compreende, ainda, um elemento aprimorador heterólogo.
[0011] Os cassetes de expressão que compreendem sequências de elemento regulador das SEQ ID NOs: 1 a 12 operacionalmente ligadas a uma sequência de polinucleotídeos heterólogos de interesse são fornecidos. São adicionalmente fornecidas as células de planta transformada, tecidos de planta, sementes e plantas que compreendem os ditos cassetes de expressão.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0012] A Figura 1 mostra a estrutura da região reguladora de Bd-Actin7 de comprimento completo (3.122 bp) e truncamentos da região reguladora. A região reguladora foi truncada (TR) da extremidade 5' a segmentos que compreendiam 2852bp (SEQ ID NO: 5), 2174bp (SEQ ID NO: 6), 1666bp (SEQ ID NO: 7), 1161bp (SEQ ID NO: 8), 907bp (SEQ ID NO: 9) e 528bp (SEQ ID NO: 10). Descrição das Sequências Tabela 1. Descrição da Listagem de Sequências SEQ ID NO Nome da sequência 1 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) 2 BD-ACTIN7 PRO (anotação em Phytozome) 3 ÍNTRON de BD-ACTIN7 em PRO (anotação em Phytozome) 4 ÍNTRON 1 de BD-ACTIN7 (MOD1) 5 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR1) 6 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR2) 7 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR3)
8 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR4) 9 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR5) 10 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR6) 11 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR7) 12 BD-ACTIN7 PRO (MOD1) (TR8) 13 Aprimorador 3xMMV 14 Íntron 1 de Zm-HPLV9 15 Íntron 1 de Zm-HPSV11 16 Íntron 1 de ADH
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0013] O artigo "um" e "uma" são usados no presente documento para referir-se a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um ou mais elemento.
[0014] A revelação refere-se a composições e métodos direcionados a elementos reguladores de planta e métodos de seu uso. As composições compreendem sequências de nucleotídeos para a região reguladora de Actina7 de Brachypodium distachyon (Bd-Actin7). As composições compreendem adicionalmente construtos de DNA que compreendem pelo menos uma sequência de polinucleotídeos para a região reguladora do promotor de Bd-Actin7 operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos heterólogos de interesse. Em particular, as moléculas de ácido nucleico isoladas que compreendem as sequências de polinucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 a 13, e fragmentos, variantes e complementos das mesmas são fornecidas.
[0015] As sequências de elemento regulador, SEQ ID NOs: 1-13, incluem construtos de polinucleotídeo que permitem a iniciação da transcrição em uma planta. Em concretizações específicas, um elemento regulador permite a iniciação de transcrição de uma maneira constitutiva. Tais construtos podem compreender regiões de iniciação de transcrição regulada associadas à regulação de desenvolvimento de planta. Assim, as composições reveladas no presente documento podem incluir construtos de DNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos de interesse ligada de modo operacional a um promotor de planta, particularmente uma sequência promotora constitutiva, mais particularmente, um promotor e uma sequência de íntrons. Em outra concretização preferencial, o construto de DNA compreende, ainda, um elemento aprimorador heterólogo. Em uma concretização, um elemento aprimorador heterólogo compreendas SEQ ID NOs: 13.
[0016] As sequências de nucleotídeos podem ter também uso na construção de vetores de expressão para expressão subsequente de uma sequência de nucleotídeos heterólogos em uma planta de interesse ou como sondas para o isolamento de outros elementos reguladores. É fornecida uma concretização para construtos de DNA que compreendem uma sequência de polinucleotídeos de elemento regulador apresentada nas SEQ ID NOs: 1 a 13, ou um fragmento funcional ou variantes do mesmo, operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos heteróloga de interesse e quaisquer combinações dos mesmos.
[0017] O termo “elemento regulador” se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem atividade reguladora de gene, isto é, que tem a capacidade para afetar o padrão de expressão de transcrição e/ou tradução de um polinucleotídeo passível de transcrição operacionalmente ligado. O termo "atividade reguladora de gene" refere-se, desse modo, à capacidade para afetar a expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de modo operacional afetando-se a transcrição e/ou a tradução dessa molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada. A atividade reguladora de gene pode ser positiva e/ou negativa e o efeito pode ser caracterizado por suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento de tecido, ambientais, fisiológicas, patológicas, de ciclo de célula e/ou qualidades quimicamente responsivas, assim como por indicações quantitativas ou qualitativas.
[0018] Os elementos reguladores como promotores, aprimoradores, líderes e regiões de íntron são moléculas de ácido nucleico que têm atividade reguladora de gene e têm uma função integral na expressão geral de genes nas células vivas. Os elementos reguladores isolados, como promotores e líderes que funcionam em plantas, são úteis, portanto, para modificar fenótipos de planta através dos métodos de manipulação genética. Um promotor é útil como um elemento regulador para modular a expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada.
[0019] Conforme usado no presente documento, um "padrão de expressão de gene" é qualquer padrão de transcrição de uma molécula de ácido nucleico ligada de modo operacional em uma molécula de RNA transcrita. A expressão pode ser caracterizada por suas qualidades temporais,
espaciais, de desenvolvimento, de tecido, ambientais, fisiológicas, patológicas, de ciclo de célula e/ou qualidades quimicamente responsivas, assim como por indicações quantitativas ou qualitativas. A molécula de RNA transcrita pode ser traduzida para produzir uma molécula de proteína, ou pode fornecer uma molécula de RNA reguladora antissenso ou outra, como um dsRNA, um tRNA, um rRNA, um miRNA, e semelhantes.
[0020] As sequências de elementos reguladores, ou variantes ou fragmentos das mesmas, quando operacionalmente ligadas a uma sequência de polinucleotídeos heterólogos de interesse podem acionar expressão constitutiva da sequência de polinucleotídeos heteróloga no tecido da planta que expressa esse construto. O termo "expressão constitutiva" significa que a expressão da sequência de nucleotídeos heterólogos é encontrada por toda a planta e na maioria dos tecidos da planta.
[0021] Conforme usado no presente documento, o termo "expressão de proteína" é qualquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrita em uma molécula de proteína. A expressão de proteína pode ser caracterizada por suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento ou morfológicas, assim como por indicações quantitativas ou qualitativas.
[0022] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor" refere-se geralmente a uma molécula de ácido nucleico que está envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase II e outras proteínas (fatores de transcrição de atuação trans) para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser inicialmente isolado da região de flanqueamento 5′ de uma cópia genômica de um gene. Alternadamente, os promotores podem ser moléculas de DNA sinteticamente produzidas ou manipuladas. Elementos reguladores podem compreendem promotores e atividade promotora. Conforme usado no presente documento, "atividade de promotor" refere-se à capacidade de um elemento regulador para iniciar transcrição. A atividade de promotor pode ocorrer in vivo, tal como em uma célula, ou in vitro.
[0023] Em uma concretização, fragmentos são fornecidos de um elemento regulador revelado no presente documento. Os fragmentos de elementos reguladores podem exibir atividade promotora e podem ser úteis sozinhos ou em combinação com outros elementos reguladores e fragmentos de elementos reguladores, tais como na construção de elementos reguladores híbridos de construção (consultar a Publicação de Patente Internacional número WO 2017/222821). Em concretizações específicas, os fragmentos de um elemento regulador são fornecidos compreendendo, ou alternativamente consistindo em ou consistindo essencialmente em, pelo menos cerca de 50, 95, 150, 250, 500 ou cerca de 750 ou mais nucleotídeos contíguos de uma molécula de polinucleotídeo que tem atividade promotora revelada no presente documento. Tais fragmentos podem exibir pelo menos cerca de 85 por cento, cerca de 90 por cento, cerca de 95 por cento, cerca de 98 por cento, ou cerca de 99 por cento, ou mais, de identidade com uma sequência de referência revelada no presente documento quando alinhados de modo ideal com a sequência de referência. Conforme usado no presente documento, o termo "segmento de elemento regulador” é um fragmento de um elemento regulador caracterizado por uma abundância de motivos de elemento regulador reconhecíveis (consultar Higo, K et al. (1998) Nucleic Acids Research), em que o segmento de elemento regulador produz um padrão de expressão único ou desejado quando combinado pelo menos com dois segmentos de elemento regulador.
[0024] Um elemento regulador ou um segmento de elemento regulador pode também ser analisado pela presença de motivos promotores conhecidos, isto é, características de sequência de DNA, tais como uma caixa TATA e outros motivos de local de ligação de fator de transcrição conhecidos. A identificação de tais motivos conhecidos pode ser usada por um indivíduo versado na técnica para projetar elementos reguladores híbridos que têm um padrão de expressão desejado ou único quando comparados ao elemento regulador fonte ou parental. Motivos de sequência de nucleotídeos encontrados em elementos reguladores foram previamente caracterizados, e muitos estão disponíveis no banco de dados PLACE (Higo, K et al. (1998) Nucleic Acids Research; dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/, que pode ser acessado pela internet com o uso do prefixo "www"; Consultar também, o Pedido PCT número WO 2014/164399). Em algumas concretizações, um segmento de elemento regulador compreende cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 motivos por 1.000 nucleotídeos. Em algumas concretizações, um elemento regulador compreende pelo menos um motivo para cerca de cada 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nucleotídeos. Em uma concretização, um elemento regulador híbrido compreende um segmento, fragmento ou variante das SEQ ID NOs: 1 a 13, em que o segmento, fragmento ou variante das SEQ ID NOs: 1 a 13 compreende cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 motivos por 1.000 nucleotídeos.
[0025] Conforme usado no presente documento, o termo "aprimorador" ou "elemento aprimorador" refere-se a um elemento regulador de transcrição de atuação cis, também conhecido como elemento cis, que confere um aspecto do padrão de expressão geral, mas é normalmente insuficiente sozinho para acionar a transcrição, de uma sequência de polinucleotídeos ligada de modo operacional. Diferente de promotores, os elementos aprimoradores não incluem normalmente o local de começo de transcrição (TSS) ou caixa TATA. Um elemento regulador pode compreender naturalmente um ou mais elementos aprimoradores que afetam a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos ligada de modo operacional. Um elemento aprimorador isolado também pode ser fundido a um promotor heterólogo para produzir um elemento cis de promotor heterólogo, o qual confere um aspecto da modulação geral de expressão de gene. Um elemento regulador ou fragmento de elemento regulador revelado no presente documento pode compreender um ou mais elementos aprimoradores que efetuam a transcrição de genes operacionalmente ligados. Acredita-se que muitos elementos aprimoradores ligam proteínas de ligação de DNA e/ou afetam a topologia de DNA, produzindo conformações locais que permitem ou restringem seletivamente o acesso de RNA polimerase ao modelo de DNA ou facilitam a abertura seletiva da hélice dupla no local de iniciação de transcrição.
Um elemento aprimorador pode funcionar para ligar fatores de transcrição que regulam a transcrição.
Alguns elementos aprimoradores ligam mais de um fator de transcrição, e fatores de transcrição podem interagir com afinidades diferentes com mais de um domínio aprimorador.
Os elementos aprimoradores podem ser identificados por várias técnicas, incluindo análise de deleção, isto é, deletar um ou mais nucleotídeos da extremidade 5′ ou internos a um promotor; análise de proteína de ligação de DNA com o uso de footprinting de DNase I, interferência de metilação, ensaios de deslocamento de mobilidade de eletroforese, footprinting genômico in vivo por PCR mediada por ligação, e outros ensaios convencionais; ou por análise de similaridade de sequência de DNA com o uso de motivos de elemento cis conhecidos ou elementos aprimoradores como uma sequência- alvo ou motivo-alvo com métodos de comparação de sequência de DNA convencionais, como BLAST.
A estrutura fina de um domínio aprimorador pode ser adicionalmente estudada por mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou por outros métodos convencionais.
Os elementos aprimoradores podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento de elementos reguladores que incluem tais elementos, e os mesmos podem ser sintetizados com nucleotídeos de flanqueamento adicionais que contêm sítios de enzima de restrição úteis para facilitar a manipulação de subsequência.
Desse modo, o projeto, a construção e o uso de elementos aprimoradores de acordo com os métodos revelados no presente documento para modular a expressão de moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas ligadas de modo operacional são abrangidos.
[0026] Conforme usado no presente documento, o termo "região de flanqueamento 5'" se refere a uma molécula de DNA isolada a partir de uma cópia genômica de um gene e é definida em geral como um segmento de polinucleotídeo que começa no local de início da sequência de codificação de proteína e se estende 5' pela região não traduzida 5' e até a região de promotor. Essas sequências, ou líderes, podem ser elementos de DNA sinteticamente produzidos ou manipulados. Um líder poder ser usado como um elemento regulador 5′ para modular a expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada de modo operacional. As moléculas líderes podem ser usadas com elementos heterólogos ou com elementos nativos das mesmas.
[0027] Conforme usado no presente documento, o termo "híbrido" se refere a uma molécula de DNA sintética única produzida fundindo-se uma primeira molécula de DNA a uma segunda molécula de DNA, em que nem a primeira, nem a segunda molécula de DNA seriam normalmente encontradas naquela configuração, isto é, fundidas uma à outra. Portanto, a molécula de DNA híbrida é uma molécula de DNA nova não normalmente encontrada na natureza. Conforme usado no presente documento, o termo "elemento regulador híbrido" se refere a um elemento regulador produzido através de tal manipulação de moléculas de DNA. Um elemento regulador híbrido pode combinar três ou mais fragmentos de DNA. Desse modo, o projeto, a construção e o uso de elementos reguladores híbridos de acordo com os métodos revelados no presente documento para modular a expressão de moléculas de polinucleotídeo passíveis de transcrição ligadas de modo operacional são abrangidos.
Em uma concretização, um elemento regulador híbrido compreende três ou mais segmentos definidos por DNA.
Em outra concretização, um elemento regulador híbrido compreende 4 ou mais fragmentos de DNA.
Em uma concretização, um fragmento de DNA pode ser um fragmento parental.
Conforme usado no presente documento, um "segmento," e "segmento parental" são intercambiáveis e pretendem se referir a fragmentos de "elementos reguladores parentais" nativos que foram analisados pelos motivos que são previstos para produzir um padrão de expressão de tecido regional.
Uma combinação de segmentos parentais ou variantes dos mesmos pode resultar em um elemento regulador híbrido que expressa um gene de interesse em um padrão de expressão de tecido ubíquo que é único a partir de cada padrão de expressão individual dos elementos reguladores parentais.
Em uma concretização, um segmento parental pode ser uma variante de um elemento regulador parental.
Em uma concretização, elementos reguladores parentais apresentados nas SEQ ID NOs: 1 a 13 podem ser usadas como elementos reguladores parentais para gerar segmentos parentais e variantes dos mesmos.
Também são incluídos como elementos reguladores parentais fragmentos funcionais, segmentos, ou variantes das sequências de polinucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 a 13, em que as ditas sequências de polinucleotídeos iniciam a transcrição em uma célula de planta, e uma sequência de polinucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 85% de identidade de sequência com as sequências de polinucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 a 13, em que as ditas sequências de polinucleotídeos iniciam a transcrição em uma célula de planta.
[0028] Elementos reguladores híbridos são fornecidos, os quais produzem um padrão de expressão em plantas que é único em relação aos elementos reguladores parentais, em que o elemento regulador híbrido contém segmentos ou fragmentos de mais de um elemento regulador parental. Em uma concretização, o elemento regulador híbrido produz um padrão de expressão específico de tecido que é diferente em relação aos elementos reguladores. Em outra concretização, os elementos reguladores híbridos ampliam o padrão de expressão para um padrão de expressão ubíquo em um tecido de planta em relação a padrões de expressão de tecido regional expressos a partir de um determinado conjunto de elementos reguladores parentais. Em outra concretização, os elementos reguladores híbridos expressam uma faixa mais estreita de expressão em relação a uma faixa mais ampla de padrões de expressão expressos a partir de um conjunto de elementos reguladores parentais. Em outra concretização, os elementos reguladores de raiz híbridos podem produzir um padrão de expressão constitutivo que difere de um padrão de expressão não constitutivo dos elementos reguladores parentais.
[0029] Em uma concretização, as sequências de polinucleotídeos reveladas no presente documento, localizadas dentro dos íntrons, ou 3' da sequência de região de codificação pode contribuir também com a regulação da expressão de uma região de codificação de interesse. Os exemplos de íntrons adequados incluem, mas sem limitação, o íntron IVS6 de milho, ou o íntron de actina de milho. Um elemento regulador também pode incluir aqueles elementos localizados a jusante (3') do local de iniciação de transcrição ou dentro de regiões transcritas, ou ambos. Um elemento regulador pós-transcrição pode incluir elementos que são ativos após a iniciação de transcrição, por exemplo, aprimoradores de tradução e transcrição, repressores de tradução e transcrição e determinantes de estabilidade de mRNA.
[0030] Os elementos reguladores, ou variantes ou fragmentos dos mesmos, podem estar operacionalmente associados a um ou mais elementos reguladores heterólogos a fim de modular a atividade do elemento regulador heterólogo. Tal modulação inclui aprimorar ou reprimir a atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo, modular os eventos pós-transcrição, ou aprimorar ou reprimir a atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo e modular os eventos pós-transcrição. Por exemplo, um ou mais elementos reguladores, ou fragmentos dos mesmos, podem ser associados de modo operacional a promotores constitutivos, induzíveis ou específicos de tecido ou fragmento dos mesmos para modular a atividade de tais promotores dentro de tecidos desejados em células de planta.
[0031] As composições podem abranger ácido nucleico isolado ou recombinante. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou "recombinante" (ou DNA) é usada no presente documento para referir-se a uma sequência de ácidos nucleicos (ou DNA) que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, em uma ou célula hospedeira in vitro ou bacteriana ou de planta recombinante heteróloga. Uma molécula de ácido nucleico isolada ou recombinante, ou porção biologicamente ativa da mesma, é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Um ácido nucleico isolado ou recombinante é livre de sequências (sequências de codificação de proteína de modo ideal) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em várias concretizações, a molécula de ácido nucleico isolada pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. As sequências de elemento regulador reveladas no presente documento podem ser isoladas da região de não traduzida 5’ que flanqueia os respectivos sítios de iniciação de transcrição das mesmas. Conforme usados no presente documento, os termos tanto "polinucleotídeo" como "nucleotídeo" destinam-se a significar um ou mais nucleotídeos e podem ser usados de forma intercambiável no singular ou no plural.
[0032] Fragmentos e variantes das sequências de polinucleotídeos de elemento regulador revelados também são abrangidos pela presente revelação. Conforme usado no presente documento, o termo "fragmento" se refere a uma porção da sequência de ácidos nucleicos. Os fragmentos de sequências reguladoras podem reter a atividade biológica de iniciação de transcrição, mais particularmente de acionamento de transcrição de um modo específico de tecido ou de subtecido. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que são úteis como sondas de hibridização podem não necessariamente reter atividade biológica. Os fragmentos de uma sequência de polinucleotídeos para a região reguladora podem estar na faixa de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos e até o comprimento completo de SEQ ID NOs: 1-13.
[0033] Uma porção biologicamente ativa de um elemento regulador pode ser preparada isolando-se uma porção da sequência reguladora e avaliando-se a atividade promotora da porção. Moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de polinucleotídeos reguladores compreendem pelo menos cerca de 16, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou 800 nucleotídeos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência reguladora de comprimento completo revelada no presente documento.
[0034] Para as sequências de polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais internos dentro da sequência de polinucleotídeos nativa e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo nativo. Para sequências de polinucleotídeos,
as variantes podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, com técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização, conforme destacado abaixo. Sequências de polinucleotídeos variantes podem incluir sequências de polinucleotídeos sinteticamente derivadas, tais como aquelas geradas, por exemplo, com o uso de mutagênese direcionada a local. Geralmente, as variantes de uma sequência de nucleotídeos particular da revelação terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com aquela sequência de nucleotídeos particular conforme determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro local no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma sequência de polinucleotídeos da revelação pode diferir daquela sequência por apenas 1 a 15 resíduos de ácido nucleico, apenas 1 a 10, apenas 6 a 10, apenas 5, apenas 4, 3, 2 ou até mesmo 1 resíduo de ácido nucleico.
[0035] As sequências de polinucleotídeos variantes também abrangem as sequências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico, tal como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, as sequências de polinucleotídeo de elemento regulador podem ser manipuladas para criar elementos reguladores novos. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747 a 10751; Stemmer (1994) Nature 370:389 a 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436 a 438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504 a 4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288 a 291; e Patentes nº U.S. 5.605.793 e 5.837.458.
[0036] As sequências de polinucleotídeos da revelação podem ser usadas para isolar as sequências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outras monocotiledôneas. Dessa maneira, os métodos, como PCR, hibridização, e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua homologia de sequência com as sequências apresentadas no presente documento. Sequências isoladas com base em sua identidade de sequência com as sequências inteiras apresentadas no presente documento ou com fragmentos das mesmas estão englobadas pela presente revelação.
[0037] Em uma abordagem de PCR, os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar as sequências de DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra. Consultar também, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, edições (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque);
e Innis e Gelfand, edições (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não estão limitados a métodos que usam iniciadores emparelhados, iniciadores internos, iniciadores específicos individuais, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de genes, iniciadores específicos de vetor, iniciadores com emparelhamento errado parcialmente e semelhantes.
[0038] Em técnicas de hibridização, toda ou parte de uma sequência de polinucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que se hibridiza seletivamente com outras sequências de polinucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas de genômicas ou de cDNA) a partir de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como 32P ou qualquer outro marcador detectável. Desse modo, por exemplo, as sondas para hibridização podem ser produzidas identificando-se oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências de elemento regulador da revelação. Métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook, supra.
[0039] Por exemplo, uma sequência de elemento regulador inteira revelada no presente documento, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser usada como uma sonda com capacidade para hibridizar especificamente sequências de elementos reguladores correspondentes e RNAs mensageiros. Para obter hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas dentre sequências de elementos reguladores e têm, de modo geral, de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências de elementos reguladores correspondentes a partir de uma planta escolhida através de PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências codificadoras adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de sequências codificadoras em um organismo. Técnicas de hibridização incluem exame de hibridização de bibliotecas de DNA em placa (sejam placas ou colônias, consultar, por exemplo, Sambrook, supra).
[0040] A hibridização de tais sequências pode ser executada sob condições estringentes. Os termos "condições estringentes" ou “condições de hibridização estringentes" são destinados a significar condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua sequência-alvo até um grau maior de modo detectável do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre fundo). As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando a estringência das condições de hibridação e/ou de lavagem, as sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum emparelhamento defeituoso entre as sequências de modo que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é menor que cerca de 1.000 nucleotídeos em comprimento, de modo ideal, menor que 500 nucleotídeos em comprimento.
[0041] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de íon Na a 1,5 M, tipicamente cerca de concentração de íon Na a 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. Condições de baixa estringência exemplificativas incluem hibridização com uma solução de tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS a 1% (sulfato de dodecila de sódio) a 37 °C e uma lavagem em SSC de 1 vez a 2 vezes (SSC de 20 vezes = NaCl 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) em 50 a 55 °C. Condições de estringência moderada exemplificativas incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em SSC de 0,5 vez a 1 vez em 55 a 60 °C. Condições de estringência alta exemplificativa incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37 °C e um lavagem final em SSC de 0,1 vez em 60 a 65 °C por uma duração de pelo menos 30 minutos. A duração de hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um comprimento de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.
[0042] A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, em que os fatores críticos são a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA e DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximado da equação de Meinkoth e Wahl, (1984) Anal. Biochem 138:267 a 284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de forma) - 500/l; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % de GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % de forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento dos pares de base em híbrido. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de incompatibilidade, assim, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com sequências da identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com 90% de identidade são observadas, a Tm pode ser diminuída 10 °C. De modo geral, condições estringentes são selecionadas de modo a serem cerca de 5 °C menores que a Tm para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C menor que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C menor que a Tm; condições de estringência baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C menor que a Tm. Usando a equação, composições de hibridação e lavagem e Tm desejada, os com perícia habitual entenderão que são inerentemente descritas variações na estringência das soluções de hibridação e/ou lavagem. Se o grau desejado de emparelhamentos defeituosos originar uma Tm menor do que 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), é preferencial aumentar a concentração de SSC de modo a poder ser usada uma temperatura mais elevada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., edições (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Também consultar, Sambrook.
[0043] Assim, sequências isoladas que têm atividade promotora e que hibridizam sob condições estringentes com as sequências reguladoras reveladas no presente documento ou com fragmentos das mesmas, são englobadas pela presente revelação.
[0044] Em geral, as sequências que têm atividade promotora e hibridizam-se às sequências de polinucleotídeos, e fragmentos das mesmas, reveladas no presente documento serão pelo menos 40% a 50% homólogas, cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% a 98% homólogas ou mais com as sequências reveladas. Isto é, a similaridade de sequência de sequências pode estar na faixa de, compartilhando pelo menos cerca de 40% a 50%, cerca de 60% a 70% e cerca de 80%, 85%, 90%, 95% a 98% de similaridade de sequência.
[0045] “Porcentagem (%) de identidade de sequência” relativamente a uma sequência de referência (tema) é determinada como a porcentagem de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em uma sequência candidata (de busca) que é idêntica aos resíduos de aminoácido respectivos ou nucleotídeos na sequência de referência, depois do alinhamento das sequências e da introdução de intervalos, se necessário, para se alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas de aminoácido como parte da identidade de sequência. O alinhamento com propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da habilidade da técnica, por exemplo, com o suo de software de computador publicamente disponível, tal como BLAST, BLAST-2. Os indivíduos versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento das sequências que estão a ser comparadas. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (por exemplo, identidade percentual de sequência de busca = número de posições idênticas/número total de posições de sequência de busca ×100).
[0046] Outra indicação de que as sequências de polinucleotídeos são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridam entre si sob condições estringentes. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C inferiores à Tf para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Contudo, condições estringentes abrangem temperaturas na gama de cerca de 1 °C a cerca de 20 °C inferiores à Tf, dependendo do grau de estringência desejado, como de outro modo aqui qualificado.
[0047] As modificações das sequências de elementos reguladores isoladas da presente revelação podem fornecer uma faixa de expressão da sequência de polinucleotídeos heteróloga. Desse modo, as mesmas podem ser modificadas para serem promotores fracos ou promotores fortes. Geralmente, um "promotor fraco" significa um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Um "nível baixo" de expressão é destinado a significar expressão em níveis de cerca de 1/10.000 transcrições a cerca de 1/100.000 transcrições a cerca de 1/500.000 transcrições. Em contrapartida, um promotor forte aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível alto, ou em cerca de 1/10 transcrições a cerca de 1/100 transcrições a cerca de 1/1.000 transcrições.
[0048] Os elementos reguladores revelados no presente documento podem ser usados para aumentar ou diminuir a expressão, resultando, desse modo, em uma mudança em fenótipo da planta transformada. As sequências de polinucleotídeos reveladas no presente documento, assim como variantes e fragmentos das mesmas, são úteis na manipulação genética de qualquer planta. As sequências de elemento regulador são úteis nesse aspecto quando operacionalmente ligadas a uma sequência de nucleotídeos heterólogos cuja expressão deve ser controlada para obter uma resposta fenotípica desejada. O termo “operacionalmente ligado" significa que a transcrição ou tradução da sequência de nucleotídeos heterólogos está sob a influência da sequência de elemento regulador. Dessa maneira, as sequências de elementos reguladores reveladas no presente documento podem ser fornecidas em cassetes de expressão juntamente com sequências de polinucleotídeos heterólogos de interesse para expressão na planta de interesse, mais particularmente para expressão no tecido reprodutivo da planta transformada.
[0049] Os elementos reguladores das concretizações podem ser fornecidos em construtos de DNA para expressão no organismo de interesse. Um "cassete de expressão", conforme usado no presente documento, significa um construto de DNA que compreende um elemento regulador das concretizações ligadas de modo operacional a um polinucleotídeo heterólogo que expressa uma transcrição ou gene de interesse. Tais cassetes de expressão compreenderão uma região de iniciação de transcrição que compreende uma das sequências de polinucleotídeos de elemento regulador da presente revelação, ou variantes ou fragmentos das mesmas, operacionalmente ligados à sequência de nucleotídeos heterólogos. Tal cassete de expressão pode ser dotado de uma pluralidade de locais de restrição para inserção da sequência de polinucleotídeos sob a regulação de transcrição das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode conter genes marcadores adicionalmente selecionáveis assim como regiões de terminação 3’.
[0050] O cassete de expressão pode incluir, na direção 5'-3' de transcrição, uma região de iniciação de transcrição (isto é, um promotor híbrido, ou variante ou fragmento do mesmo, da revelação), uma região de iniciação de tradução, uma sequência de polinucleotídeos heterólogos de interesse, uma região de terminação de tradução funcional e, opcionalmente, uma região de terminação de transcrição funcional no organismo hospedeiro. As regiões reguladoras (isto é, promotores, aprimoradores, regiões reguladoras de transcrição, e regiões de terminação de tradução) e/ou o polinucleotídeo das concretizações podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeo das concretizações podem ser heterólogos à célula hospedeira ou entre si.
[0051] Conforme usado no presente documento, "heterólogo" em referência a uma sequência é uma sequência que se origina a partir de uma espécie estranha ou, se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um elemento regulador operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado, ou, se de espécie igual/análoga, um ou ambos são substancialmente modificados em relação à sua forma original e/ou lócus genômico, ou o elemento regulador não é o elemento regulador nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado.
[0052] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao elemento regulador, em que a sequência de DNA é expressa, o hospedeiro de planta ou qualquer combinação dos mesmos).
[0053] Os elementos reguladores revelados no presente documento, assim como variantes e fragmentos dos mesmos, são úteis para engenharia genética de plantas, por exemplo, para a produção de uma planta transformada ou transgênica, para expressar um fenótipo de interesse. Conforme usado no presente documento, os termos "planta transformada" e "planta transgênica" se referem a uma planta que compreende dentro do seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo está integrado de forma estável no genoma de uma planta transgênica ou transformada de tal modo que o polinucleotídeo é passado para sucessivas gerações. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de uma construção de DNA recombinante. Deve ser entendido que, conforme usado no presente documento, o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta em que o genótipo foi alterado pela presença de ácido nucleico heterólogo que inclui aqueles transgênicos inicialmente alterados, assim como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexual a partir do transgênico inicial.
[0054] Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células de planta com um construto de DNA heterólogo, incluindo um cassete de expressão de ácido nucleico que compreende um transgene de interesse, a regeneração de uma população de plantas resultante de inserção do transgene no genoma da planta e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em um local de genoma particular. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene. No nível genético, um evento é parte da constituição genética de uma planta. O termo "evento" também se refere à progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra planta, em que a progênie inclui o DNA heterólogo.
[0055] Conforme usado no presente documento, o termo planta inclui plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecido de célula vegetal das quais as plantas podem ser regeneradas, calos da planta, tufos de planta e células vegetais que são intactas em plantas ou partes de plantas, tais como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutas, caroços, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras e similares. Grão destina-se a significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos diferentes de cultivo ou reprodução da espécie. Progênie, variantes e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídos no escopo da revelação, visto que essas partes compreendem os polinucleotídeos introduzidos.
[0056] As composições e métodos revelados no presente documento podem ser usados para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, porém, sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os exemplos de espécies de planta incluem milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço (por exemplo, mexoeira (Pennisetum glaucum), painço-branco (Panicum miliaceum), milho-painço (Setaria italica), capim-pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), castanha de caju (Anacardium occidentale), noz de macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-
açúcar (Saccharum spp.), aveias, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.
[0057] Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijão- comum (Phaseolus vulgaris), feijão de lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, tal como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) e melão (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hidrângea (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), craveiro (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.
[0058] As coníferas que podem ser usadas incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro Loblolly (Pinus taeda), pinheiro americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro-lodgepole (Pinus contorta), e pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); tsuga oriental (Tsuga canadensis); pinheiro-do-Canadá (Picea glauca); sequoia- vermelha (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). Em concretizações específicas, as plantas podem ser plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, açafrão-bastardo, amendoim, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.). Em outras concretizações, plantas de milho e soja são ideais e, ainda em outras concretizações, plantas de milho são ideais.
[0059] Outras plantas de interesse incluem plantas de grão que fornecem sementes de interesse, plantas de semente oleaginosa e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de grão, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. As plantas de semente oleaginosa incluem algodão, soja, açafrão-bastardo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palmeira, coco, etc. As plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem goma guar, alfarrobeira, feno-grego, soja, feijão comum, feijão caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão- fava, lentilha, grão de bico, etc.
[0060] As sequências de codificação heterólogas expressas por uma sequência de elementos reguladores da revelação podem ser usadas para variar o fenótipo de uma planta. Várias alterações em fenótipo são de interesse incluindo modificar a expressão de um gene em uma planta, alterar um patógeno de planta ou mecanismo de defesa de inseto, aumentar uma tolerância da planta aos herbicidas, alterar desenvolvimento de planta para responder ao estresse ambiental, modular a resposta de planta ao sal, temperatura (quente e fria), seca e semelhantes. Esses resultados podem ser alcançados pela expressão de uma sequência de polinucleotídeos heterólogos de interesse que compreende um produto de gene apropriado. Em concretizações específicas, a sequência de polinucleotídeos heterólogos de interesse é uma sequência de planta endógena cujo nível de expressão é aumentado na planta ou parte de planta. Os resultados podem ser atingidos fornecendo-se expressão alterada de um ou mais produtos de gene endógenos, particularmente hormônios, receptores, moléculas de sinalização, enzimas, transportadores ou cofatores, ou afetando-se a absorção de nutrientes na planta. Essas alterações resultam em uma alteração em fenótipo da planta transformada. Em determinadas concretizações, os padrões de expressão dos elementos reguladores revelados no presente documento são úteis para muitos tipos de triagem.
[0061] As categorias gerais de sequências de polinucleotídeos de interesse que podem ser usadas com as sequências reguladoras reveladas no presente documento incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informações, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tais como as quinases e aqueles envolvidos em manutenção, tais como proteínas de choque térmico. Categorias mais específicas de transgenes incluem, por exemplo, genes codificadores de traços importantes para agronomia, resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas, resistência ao estresse ambiental (tolerância alterada ao frio, sal, à seca, etc.) e características de grão. Ainda outras categorias de transgenes incluem genes para induzir expressão de produtos exógenos, tais como enzimas, cofatores e hormônios de plantas e outros eucariotas, assim como organismos procariotas. É reconhecido que qualquer gene de interesse pode ser operacionalmente ligado ao elemento regulador da revelação e expresso na planta.
[0062] A título de ilustração, sem limitação, o seguinte é uma lista de outros exemplos dos tipos de genes que podem ser usados em conexão com os elementos reguladores revelados no presente documento.
1. Transgenes Que Conferem Resistência Aos Insetos Ou Doença e Que Codificam:
[0063] (A) Genes de resistência à doença de planta. Defesas de planta são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para modificar geneticamente plantas que são resistentes a cepas de patógenos específicos. Consultar, por exemplo Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonagem do gene Cf-9 de tomate para resistência ao Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1.432 (gene Pto de tomate para resistência ao Pseudomonas syringae pv. Tomate codifica uma proteína quinase); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1.089 (gene de Arabidopsis RSP2 para resistência ao Pseudomonas syringae); McDowell e Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178 a 183 e Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6):567 a
582. Uma planta resistente a uma doença é uma mais resistente a um patógeno em comparação à planta do tipo selvagem.
[0064] (B) Genes codificadores de uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma. Consultar, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que revela a clonagem e sequência de nucleotídeos de um gene de delta- endotoxina Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes delta-endotoxina podem ser comprados junto à American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por exemplo, com número de acesso ATCC® 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitantes de transgenes de Bacillus thuringiensis geneticamente modificados são dados nas patentes a seguir e nos pedidos de patente e são incorporados ao presente documento a título de referência com esse propósito: Patentes nos U.S. 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275;
5.986.177; 6.023.013, 6.060.594, 6.063.597, 6.077.824,
6.620.988, 6.642.030, 6.713.259, 6.893.826, 7.105.332;
7.179.965, 7.208.474; 7.227.056, 7.288.643, 7.323.556,
7.329.736, 7.449.552, 7.468.278, 7.510.878, 7.521.235,
7.544.862, 7.605.304, 7.696.412, 7.629.504, 7.705.216,
7.772.465, 7.790.846, 7.858.849 e documento nº WO 1991/14778; documento nº WO 1999/31248; documento nº WO 2001/12731; documento nº WO 1999/24581 e documento nº WO 1997/40162.
[0065] Genes que codificam proteínas pesticidas podem também ser empilhados o que inclui, mas sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp., tal como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de cepas de Pseudomonas protegens CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368 a 2386: nº de Acesso GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12.343 a 12.349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes
(Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45 a 50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss.
Organ Cult. 89:159 a 168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101 a 118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir.
Micro. 67:2.062 a 2.069), Patente número US 6.048.838 e Patente número US 6.379.946; um polipeptídeo PIP-1 de Número de Série US 13792861; um polipeptídeo AfIP- 1A e/ou AfIP-1B da Patente número US 13/800233; um polipeptídeo PHI-4 da Patente número US 13/839702; um polipeptídeo PIP-47 do documento PCT número PCT/US14/51063; um polipeptídeo PIP-72 do documento PCT número PCT/US14/55128; um polipeptídeo PtIP-50 e um polipeptídeo PtIP-65 do documento PCT número WO2015/120270; um polipeptídeo PtIP-83 da Publicação PCT número WO2015/120276 ; um polipeptídeo PtIP-96 do documento PCT/US15/55502; e δ- endotoxinas que incluem, mas sem limitação as classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51 e Cry55 de genes de δ- endotoxina e os genes Cyt1 e Cyt 2 citolíticos de B. thuringiensis.
Os membros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, porém sem limitação, Cry1Aa1 (número de acesso AAA22353); Cry1Aa2 (número de acesso número de acesso AAA22552); Cry1Aa3 (número de acesso BAA00257); Cry1Aa4 (número de acesso CAA31886);
Cry1Aa5 (número de acesso BAA04468); Cry1Aa6 (número de acesso AAA86265); Cry1Aa7 (número de acesso AAD46139); Cry1Aa8 (número de acesso I26149); Cry1Aa9 (número de acesso BAA77213); Cry1Aa10 (número de acesso AAD55382); Cry1Aa11 (número de acesso CAA70856); Cry1Aa12 (número de acesso AAP80146); Cry1Aa13 (número de acesso AAM44305); Cry1Aa14 (número de acesso AAP40639); Cry1Aa15 (número de acesso AAY66993); Cry1Aa16 (número de acesso HQ439776); Cry1Aa17 (número de acesso HQ439788); Cry1Aa18 (número de acesso HQ439790); Cry1Aa19 (número de acesso HQ685121); Cry1Aa20 (número de acesso JF340156); Cry1Aa21 (número de acesso JN651496); Cry1Aa22 (número de acesso KC158223); Cry1Ab1 (número de acesso AAA22330); Cry1Ab2 (número de acesso AAA22613); Cry1Ab3 (número de acesso AAA22561); Cry1Ab4 (número de acesso BAA00071 ); Cry1Ab5 (número de acesso CAA28405); Cry1Ab6 (número de acesso AAA22420); Cry1Ab7 (número de acesso CAA31620); Cry1Ab8 (número de acesso AAA22551); Cry1Ab9 (número de acesso CAA38701); Cry1Ab10 (número de acesso A29125); Cry1Ab11 (número de acesso I12419); Cry1Ab12 (número de acesso AAC64003); Cry1Ab13 (número de acesso AAN76494); Cry1Ab14 (número de acesso AAG16877); Cry1Ab15 (número de acesso AAO13302); Cry1Ab16 (número de acesso AAK55546); Cry1Ab17 (número de acesso AAT46415); Cry1Ab18 (número de acesso AAQ88259); Cry1Ab19 (número de acesso AAW31761); Cry1Ab20 (número de acesso ABB72460); Cry1Ab21 (número de acesso ABS18384); Cry1Ab22 (número de acesso ABW87320); Cry1Ab23 (número de acesso HQ439777); Cry1Ab24 (número de acesso HQ439778); Cry1Ab25 (número de acesso HQ685122); Cry1Ab26 (número de acesso
HQ847729); Cry1Ab27 (número de acesso JN135249); Cry1Ab28 (número de acesso JN135250); Cry1Ab29 (número de acesso JN135251); Cry1Ab30 (número de acesso JN135252); Cry1Ab31 (número de acesso JN135253); Cry1Ab32 (número de acesso JN135254); Cry1Ab33 (número de acesso AAS93798); Cry1Ab34 (número de acesso KC156668); tipo Cry1Ab (número de acesso AAK14336); tipo Cry1Ab (número de acesso AAK14337); tipo Cry1Ab (número de acesso AAK14338); tipo Cry1Ab (número de acesso ABG88858); Cry1Ac1 (número de acesso AAA22331); Cry1Ac2 (número de acesso AAA22338); Cry1Ac3 (número de acesso CAA38098); Cry1Ac4 (número de acesso AAA73077); Cry1Ac5 (número de acesso AAA22339); Cry1Ac6 (número de acesso AAA86266); Cry1Ac7 (número de acesso AAB46989); Cry1Ac8 (número de acesso AAC44841); Cry1Ac9 (número de acesso AAB49768); Cry1Ac10 (número de acesso CAA05505 ); Cry1Ac11 (número de acesso CAA10270); Cry1Ac12 (número de acesso I12418); Cry1Ac13 (número de acesso AAD38701); Cry1Ac14 (número de acesso AAQ06607); Cry1Ac15 (número de acesso AAN07788); Cry1Ac16 (número de acesso AAU87037); Cry1Ac17 (número de acesso AAX18704); Cry1Ac18 (número de acesso AAY88347); Cry1Ac19 (número de acesso ABD37053); Cry1Ac20 (número de acesso ABB89046 ); Cry1Ac21 (número de acesso AAY66992 ); Cry1Ac22 (número de acesso ABZ01836); Cry1Ac23 (número de acesso CAQ30431); Cry1Ac24 (número de acesso ABL01535); Cry1Ac25 (número de acesso FJ513324); Cry1Ac26 (número de acesso FJ617446); Cry1Ac27 (número de acesso FJ617447); Cry1Ac28 (número de acesso ACM90319); Cry1Ac29 (número de acesso DQ438941); Cry1Ac30 (número de acesso GQ227507); Cry1Ac31 (número de acesso GU446674);
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(número de acesso CAH56541); Cry49Aa2 (número de acesso CAJ86541); Cry49Aa3 (número de acesso CAJ86543); Cry49Aa4 (número de acesso CAJ86544); Cry49Ab1 (número de acesso CAJ86542); Cry50Aa1 (número de acesso BAE86999); Cry50Ba1 (número de acesso GU446675); Cry50Ba2 (número de acesso GU446676); Cry51Aa1 (número de acesso ABI14444); Cry51Aa2 (número de acesso GU570697); Cry52Aa1 (número de acesso EF613489); Cry52Ba1 (número de acesso FJ361760); Cry53Aa1 (número de acesso EF633476); Cry53Ab1 (número de acesso FJ361759); Cry54Aa1 (número de acesso ACA52194); Cry54Aa2 (número de acesso GQ140349); Cry54Ba1 (número de acesso GU446677); Cry55Aa1 (número de acesso ABW88932); Cry54Ab1 (número de acesso JQ916908); Cry55Aa2 (número de acesso AAE33526); Cry56Aa1 (número de acesso ACU57499); Cry56Aa2 (número de acesso GQ483512); Cry56Aa3 (número de acesso JX025567); Cry57Aa1 (número de acesso ANC87261); Cry58Aa1 (número de acesso ANC87260); Cry59Ba1 (número de acesso JN790647); Cry59Aa1 (número de acesso ACR43758); Cry60Aa1 (número de acesso ACU24782); Cry60Aa2 (número de acesso EAO57254); Cry60Aa3 (número de acesso EEM99278); Cry60Ba1 (número de acesso GU810818); Cry60Ba2 (número de acesso EAO57253); Cry60Ba3 (número de acesso EEM99279); Cry61Aa1 (número de acesso HM035087); Cry61Aa2 (número de acesso HM132125); Cry61Aa3 (número de acesso EEM19308); Cry62Aa1 (número de acesso HM054509); Cry63Aa1 (número de acesso BAI44028); Cry64Aa1 (número de acesso BAJ05397); Cry65Aa1 (número de acesso HM461868); Cry65Aa2 (número de acesso ZP_04123838); Cry66Aa1 (número de acesso HM485581); Cry66Aa2 (número de acesso ZP_04099945); Cry67Aa1 (número de acesso
HM485582); Cry67Aa2 (número de acesso ZP_04148882); Cry68Aa1 (número de acesso HQ113114); Cry69Aa1 (número de acesso HQ401006); Cry69Aa2 (número de acesso JQ821388); Cry69Ab1 (número de acesso JN209957); Cry70Aa1 (número de acesso JN646781); Cry70Ba1 (número de acesso ADO51070); Cry70Bb1 (número de acesso EEL67276); Cry71Aa1 (número de acesso JX025568); Cry72Aa1 (número de acesso JX025569).
[0066] Os exemplos de δ-endotoxinas também incluem, mas sem limitação, proteínas Cry1A das Patentes no US
5.880.275 e no 7.858.849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (Deleção de terminal N de variante de α-hélice 1 e/ou α-hélice 2 de proteínas Cry como Cry1A) das Patentes no US 8.304.604 e no
8.304,605; Cry1B do Pedido de Patente Número de Série US 10/525.318; Cry1C da Patente número US 6.033.874; Cry1F das Patentes no US 5.188.960, no 6.218.188; quimeras de Cry1A/F das Patentes no US 7.070.982; no 6.962.705 e no 6.713.063); uma proteína Cry2 como proteína Cry2Ab da Patente número US
7.064.249); uma proteína Cry3A incluindo, mas sem limitação, uma proteína inseticida híbrida manipulada (eHIP) criada fundindo-se combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas Proteínas cry diferentes (Publicação de Pedido de Patente Número US 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patentes no US 7.329.736, no 7.449.552, no
7.803.943, no 7.476.781, no 7.105.332, no 7.378.499 e no
7.462.760; uma proteína Cry9 como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7.145a 7.151; uma proteína Cry22, uma proteína Cry34Ab1 das Patentes no US 6.127.180, no 6.624.145 e no 6.340.593; uma proteína CryET33 e CryET34 das Patentes no US 6.248.535, no 6.326.351, no 6.399.330, no 6.949.626, no
7.385.107 e no 7.504.229; um homólogo de CryET33 e de CryET34 da Publicação de Patente número US 2006/0191034, 2012/0278954 e Publicação PCT Número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 das Patentes no US 6.083.499, no 6.548.291 e no 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma toxina TIC901 ou relacionada; TIC807 do documento no US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 do documento no PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Patente número US 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 do documento no US
7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 do documento no WO 2006/083891; AXMI-010 do documento no WO 2005/038032; AXMI- 003 do documento no WO 2005/021585; AXMI-008 do documento no US 2004/0250311; AXMI-006 do documento no US 2004/0216186; AXMI-007 do documento no US 2004/0210965; AXMI-009 do documento no US 2004/0210964; AXMI-014 do documento no US 2004/0197917; AXMI-004 do documento no US 2004/0197916; AXMI- 028 e AXMI-029 do documento no WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 do documento no WO 2004/074462; AXMI-150 da Patente número US
8.084.416; AXMI-205 do documento no US 2011/0023184; AXMI- 011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI- 037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI- 041, AXMI-063 e AXMI-064 do documento no US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas do documento no US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e
AXMI225z do documento no WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 do documento no WO11/103247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 e AXMI-184 da Patente número US 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 do documento no US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 do documento no US 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da Patente número US
8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 do documento no US 2010/0005543 e proteínas Cry como Cry1A e Cry3A que tem sítios proteolíticos modificados da Patente número US 8.319.019; e uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa de Bacillus thuringiensis VBTS 2528 da Publicação de Pedido de Patente Número US 2011/0064710. Outras proteínas Cry também são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica (consultar Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www”). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por um versado na técnica (para análise, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J.
Invert.
Path. 101:1 a 16). O uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um versado na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283 a 300 e CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um versado na técnica pode ser também expressa em plantas, tal como Vip3Ab e Cry1Fa (US2012/0317682), Cry1BE e Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA e Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F e CryCa (US2012/0317681), Cry1DA e Cry1BE (US2012/0331590), Cry1DA e Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1AB e Cry1BE (US2012/0324606), e Cry1Fa e Cry2Aa, Cry1I ou Cry1E (US2012/0324605) ); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab e Cry3Aa (US20130167268); Cry3A e Cry1Ab ou Vip3Aa (US20130116170); e Cry1F, Cry34Ab1, e Cry35Ab1 (PCT/US2010/060818). As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas incluindo lipídio acil hidrolases da
Patente Número U.S. 7.491.869, e colesterol oxidases, tais como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1.406 a 1.413). . As proteínas pesticidas também incluem toxinas de VIP (proteínas inseticidas vegetativas) das Patentes nos U.S. 5.877.012, 6.107.279,
6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e 8.237.020 e semelhantes. Outras proteínas VIP são bem conhecidas para um indivíduo versado na técnica (consultar lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis dentre organismos, tais como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes números US 7.491.698 e
8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida "autônoma" e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC "autônoma" (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser melhorada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme mencionado no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas independentes. As proteínas de Classe B ("Proteína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") aumentam a toxicidade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Os exemplos de proteínas de Classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC,
XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente no U.S. 8.334.366).
[0067] (C) Um hormônio específico de inseto ou feromônio, tal como um hormônio ecdisteroide e juvenil, uma variante do mesmo, um mimético baseado no mesmo, ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consultar, por exemplo, a revelação por Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um desativador de hormônio juvenil.
[0068] (D) Um peptídeo específico de inseto que, sob expressão, rompe a fisiologia da peste afetada. Por exemplo, consultar as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão rende DNA codificador para receptor de hormônio diurético de inseto); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163:1.243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33 a 54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300 a 310; Carlini e Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1.515 a 1.539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847 a 853 e Vasconcelos e Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385 a 403. Consultar também, Patente número US
5.266.317 de Tomalski, et al., que revela genes de codificação de toxinas específicas de inseto.
[0069] (E) Uma enzima responsável por uma hiperacumulação de um monterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula de não proteína com atividade inseticida.
[0070] (F) Uma enzima envolvida na modificação, que inclui a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Consultar o Pedido PCT número WO 93/02197 no nome de Scott, et al., o qual revela a sequência de nucleotídeos de um gene de calase. As moléculas de DNA que contêm sequências de codificação de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, a partir da ATCC sob os números de acesso 39637 e 67152. Também consultar Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que ensina a sequência de nucleotídeos de um cDNA codificador de ancilóstomo quitinase de tabaco, e Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que fornece a sequência de nucleotídeos do gene poliubiquitina ubi4-2 de salsa, documentos de Pedido de Patente no de série U.S. 10/389.432, 10/692.367 e o documento de Patente no U.S. 6.563.020.
[0071] (G) Uma molécula que estimula transdução de sinal. Por exemplo, consultar a revelação por Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 de sequências de nucleotídeo para clones de cDNA de calmodulina de feijão- mungo, e Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que fornece a sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina de milho.
[0072] (H) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Consultar o Pedido PCT nº WO 95/16776 e a revelação de Patente nº U.S. 5.580.852 (revelação de derivados de peptídeo de Taquiplesina que inibem os patógenos de planta fúngicos) e o Pedido PCT nº WO 95/18855 e a Patente nº U.S. 5.607.914 (ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças).
[0073] (I) Uma membrana permease, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, consultar a revelação por Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expressão heteróloga de um análogo de peptídeo cecropin- betalítico para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.
[0074] (J) Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de plantas transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados. Consultar Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. A resistência mediada por revestimento tem sido conferida em plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca do tabaco, vírus X da batata, vírus
Y da batata, vírus do entalhe do tabaco, tobravírus e vírus do mosaico do tabaco. Id.
[0075] (K) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo direcionado a uma função metabólica essencial nos intestinos do inseto poderia inativar uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor, et al., Resumo nº 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edinburgh, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênico por meio da produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única).
[0076] (L) Um anticorpo específico de vírus. Consultar, por exemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que mostra que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinantes são protegidas contra ataques de vírus.
[0077] (M) Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida na natura por um patógeno ou um parasita. Desse modo, endo alfa-1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutriente de planta solubilizando-se a homo-alfa-1,4-D- galacturonase de parede de célula vegetal. Consultar Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1.436. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.
[0078] (N) Uma proteína de prisão de desenvolvimento produzida na natura por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305 mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene de desativação de ribossomo de cevada têm uma resistência aumentada à doença fúngica.
[0079] (O) Genes envolvidos na Resposta de Resistência Adquirida Sistêmica (SAR) e/ou os genes relacionados à patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2):128 a 131, Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456 a 464 e Somssich, (2003) Cell 113(7):815 a
816.
[0080] (P) Genes antifúngicos (Cornelissen e Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709 a 712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183:258 a 264 e Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137 a 149. Consultar também, Pedido de Patente número US 09/950.933.
[0081] (Q) Genes de desintoxicação, tais como para fumonisina, beauvericina, moniliformina e zearalenona e seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo, consultar a Patente nº U.S. 5.792.931.
[0082] (R) Inibidores de cistatina e cisteína proteinase. Consultar Pedido número US 10/947.979.
[0083] (S) Genes de defensina. Consultar documento número WO03/000863 e Pedido número US 10/178.213.
[0084] (T) Genes que conferem resistência aos nematódeos. Consultar o documento no WO 03/033651 e Urwin, et. al., (1998) Planta 204:472 a 479, Williamson (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327 a 331.
[0085] (U) Genes, tais como rcg1, que conferem resistência ao apodrecimento de caule de Antracnose que é causado pelo fungo Colletotrichum graminiola. Consultar
Jung, et al., Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping of Anthracnose Stalk Rot genes in Maize, Theor. Appl. Genet. (1994) 89:413 a 418, assim como o Pedido de Patente Provisório no U.S. 60/675.664.
[0086] (V) Ácidos Nucleicos que se relacionam à regulação decrescente de expressão de genes de direcionamento em espécies de praga de inseto por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) interferentes, que controlam a espécie de praga de inseto. A Publicação PCT nº WO 2011/153254 descreve métodos para inibir a expressão de genes de direcionamento em pragas invertebradas incluindo pragas de planta Diabrotica. Adicionalmente, a Publicação PCT nº WO 2009/091864 descreve composições e métodos para a supressão de genes de direcionamento de espécies de praga de inseto, incluindo pragas do gênero Lygus.
2. Transgenes Que Conferem Resistência a um Herbicida, Por Exemplo:
[0087] (A) Um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Genes exemplificativos nesse código de categoria para enzima ALS e AHAS mutante, conforme descritos, por exemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1.241 e Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Consultar também, as Patentes número US 5.605.011;
5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732;
4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 e 5.378.824 e Publicação Internacional WO 96/33270.
[0088] (B) Glifosato (resistência transmitida por sintase de 5-enolpiruvl-3-fosfiquimato (EPSP) mutante e genes aroA, respectivamente) e outros compostos de fosfono, tal como glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferase (PAT) e fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces hygroscopicus (bar)) e ácidos propriônicos de piridinóxi ou fenóxi e cicloexonas (genes codificadores de inibidor ACCase). Consultar, por exemplo, a Patente nº U.S.
4.940.835 para Shah, et al., a qual revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. A Patente nº U.S. 5.627.061 de Barry, et al., também descreve os genes codificadores de enzimas EPSPS. Também consultar os documentos de Patente no U.S. 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497;
5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910;
5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366;
5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re.
36.449; RE 37.287 E e 5.491.288 e publicações internacionais EP1173580; WO 01/66704; EP1173581 e EP1173582. Resistência ao glifosato também é transmitida às plantas que expressam um gene que codifica uma enzima oxidorredutase de glifosato, conforme descrito mais completamente nos documentos de Patente no U.S. 5.776.760 e 5.463.175, que estão incorporados no presente documento em sua totalidade a título referência. Além disso, a resistência a glifosato pode ser conferida a plantas pela superexpressão de genes codificadores de glifosato N-acetiltransferase. Consultar, por exemplo, os Pedidos de Patente número U.S. 11/405.845 e 10/427.692 e Pedido PCT número US01/46227. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o Número de Acesso da ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é revelada na Patente número US 4.769.061 de Comai. O Pedido de Patente nº EP 0 333 033 de Kumada, et al. e a Patente nº U.S. 4.975.374 de Goodman, et al., revelam sequências de nucleotídeos de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas, tais como L- fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene fosfinotricina-acetil-transferase é fornecida na Patente nº EP 0 242 246 e 0 242 236 de Leemans, et al., De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, que descrevem a produção de plantas transgênicas que expressa os genes bar quiméricos que codificam a atividade de acetil transferase de fosfinotricina. Consultar também, Patente número US
5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675;
5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 e 5.879.903. Os genes exemplificativos que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e ciclo-hexonas, tais como setoxidim e haloxifope, são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
[0089] (C) Um herbicida que inibe fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene nitrilase). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169 descreve a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos de codificação de genes psbA mutantes. Sequências de nucleotídeos para genes nitrilase são reveladas no documento de Patente número U.S. 4.810.648 de Stalker, incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência, e moléculas de DNA que contêm esses genes estão disponíveis sob os Números de Acesso da ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa S-
transferase são descritas por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.
[0090] (D) Sintase de ácido acetoidróxico que demonstrou tornar plantas que expressam essa enzima em resistentes aos múltiplos tipos de herbicidas foi introduzida em uma variedade de plantas (consultar, por exemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet 246:419). Outros genes que conferem resistência a herbicidas incluem: um gene de codificação de uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e oxidorredutase P450 de citocromo de NADPH de levedura (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106:17 a 23), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1.687) e genes para várias fosfotransferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).
[0091] (E) Oxidase de protoporfirinogênio (protox) é necessária para a produção de clorofila que é necessária para sobrevivência de toda planta. A enzima protox serve como o direcionamento para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as espécies diferentes de plantas presentes, causando sua destruição total. O desenvolvimento de plantas que contêm atividade de protox alterada que são resistentes a esses herbicidas é descrito nas Patentes número U.S. 6.288.306 B1;
6.282.837 B1 e 5.767.373 e na Publicação Internacional número WO 01/12825.
3. Transgenes Que Conferem Ou Contribuem Para uma Característica de Grão Alterada, Tais Como:
[0092] (A) Ácidos graxos alterados, por exemplo, por (1) Regulação decrescente de estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consultar Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:2624 e WO99/64579 (Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn), (2) Elevação do ácido oleico por meio de modificação de gene de FAD-2 e/ou diminuição de ácido linolênico por meio de modificação de gene FAD-3 (consultar as Patentes números U.S. 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 e documento nº WO 93/11245). (3) Alteração de teor de linolênico conjugado ou ácido linolênico, como no documento nº WO 01/12800. (4) Alteração de genes LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1ps, de vários genes lpa, tais como lpa1, lpa3, hpt ou hggt. Por exemplo, consultar os documentos números WO 02/42424, WO 98/22604, WO 03/011015, Patente número US
6.423.886, Patente número US 6.197.561, Patente número US
6.825.397, Pedido de Patente números US 2003/0079247, 2003/0204870, WO02/057439, WO03/011015 e Rivera-Madrid, et. al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5.620 a 5.624.
[0093] (B) Teor de fósforo alterado, por exemplo, pela (1) Introdução de um gene codificador de fitase intensificaria a quebra de fitato, que adiciona mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, consultar Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para uma revelação da sequência de nucleotídeos de um gene de fitase de Aspergillus niger. (2) Regulação ascendente de um gene que reduz teor de fitato. Em milho, isso, por exemplo, poderia ser alcançado, clonando-se e, então, reintroduzindo-se DNA associado a um ou mais dentre os alelos, tais como os alelos de LPA, identificados em mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico, tal como em Raboy, et al., (1990) Maydica 35:383 e/ou alterando-se atividade de inositol quinase como no documento número WO 02/059324, na Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2003/0009011, WO 03/027243, na Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2003/0079247, WO 99/05298, no documento de Patente número U.S. 6.197.561, documento de Patente número U.S. 6.291.224, documento de Patente número U.S. 6.391.348, WO2002/059324, Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2003/0079247, WO98/45448, WO99/55882, WO01/04147.
[0094] (C) Carboidratos alterados efetuados, por exemplo, alterando-se um gene para uma enzima que afeta o padrão de ramificação de amido ou um gene que altera tiorredoxina, tal como NTR e/ou TRX (consultar o documento de Patente número U.S. 6.531.648) e/ou um knockout ou mutante de gama-zein, tal como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consultar o documento de Patente número U.S. 6.858.778 e as Publicações de Pedido de Patente número U.S. 2005/0160488 e 2005/0204418). Consultar Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeos de gene frutosiltransferase mutante de Streptococcus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeos de gene levansacarase de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeo de genes invertase de tomate), Søgaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22.480 (mutagênese dirigida a local de gene alfa-amilase de cevada) e Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima de ramificação de amido de endosperma de milho II), documento nº WO 99/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração de amido através da modificação de UDP-D-xilose 4-epimerase, Frágil 1 e 2, Ref1, HCHL, C4H), Patente nº U.S. 6.232.529 (método para produzir semente oleaginosa superior por modificação de níveis de amido (AGP)). Os genes de modificação de ácido graxo mencionados acima também podem ser usados para afetar o teor e/ou composição de amido através da correlação das vias de amido e óleo.
[0095] (D) Teor ou composição de antioxidante alterada, tal como alteração de tocoferol ou tocotrienóis. Por exemplo, consultar o documento de Patente número U.S.
6.787.683, a Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2004/0034886 e o documento número WO 00/68393 que envolvem a manipulação de níveis de antioxidante através de alteração de uma fitl-prenil-transferase (ppt), o documento número WO 03/082899, através de alteração de uma homogentisato geranil-geranil-transferase (hggt).
[0096] (E) Aminoácidos de semente essenciais alterados. Por exemplo, consultar o documento de Patente número U.S. 6.127.600 (método para aumentar o acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), documento de Patente número U.S. 6.080.913 (métodos binários para aumentar acúmulo de aminoácidos essenciais em sementes), documento de Patente número U.S. 5.990.389 (alta lisina), documento número WO99/40209 (alteração de composições de aminoácido em sementes), WO99/29882 (métodos para alterar teor de aminoácido de proteínas), documento de Patente número U.S.
5.850.016 (alteração de composições de aminoácido em sementes), documento número WO98/20133 (proteínas com níveis de aminoácidos essenciais intensificados), documento de Patente número U.S. 5.885.802 (alta metionina), documento de Patente número U.S. 5.885.801 (alta treonina), documento de Patente número U.S. 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácido vegetal), documento de Patente número U.S.
6.459.019 (lisina e treonina aumentadas), documento de Patente número U.S. 6.441.274 (subunidade beta de sintase de triptofano vegetal), documento de Patente número U.S.
6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), documento de Patente número U.S. 5.939.599 (alto enxofre), documento de Patente número U.S. 5.912.414 (metionina aumentada), documento número WO98/56935 (enzimas biossintéticas de aminoácido vegetal), documento número WO98/45458 (proteína de semente projetada que tem porcentagem mais elevada de aminoácidos essenciais), documento número WO98/42831 (lisina aumentada), documento de Patente número U.S. 5.633.436 (teor de aminoácido de enxofre crescente), documento de Patente número U.S. 5.559.223 (proteínas de armazenamento sintéticas com estrutura definida que contém níveis de aminoácidos essenciais programáveis para melhoramento do valor nutricional de plantas), documento número WO96/01905 (treonina aumentada), documento número WO95/15392 (lisina aumentada), Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2003/0163838, Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2003/0150014, Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2004/0068767, documento de Patente número U.S. 6.803.498, documentos número WO01/79516 e WO00/09706 (Ces A: sintase de celulose), documento de Patente número U.S. 6.194.638 (hemicelulose), documento de Patente número U.S. 6.399.859 e Publicação de Pedido de Patente número U.S. 2004/0025203 (UDPGdH), documento de Patente número U.S. 6.194.638 (RGP), incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência.
4. Genes que Controlam a Esterilidade Masculina
[0097] Há diversos métodos para conferir esterilidade masculina genética disponíveis, como múltiplos genes mutantes em localizações separadas dentro do genoma que confere esterilidade masculina, conforme revelado nas Patentes nos U.S. 4.654.465 e 4.727.219 de Brar, et al., e translocações cromossômicas, conforme descrito por Patterson nas Patentes nos U.S. 3.861.709 e 3.710.511. Além desses métodos, Albertsen, et al., Patente nº U.S. 5.432.068, descreve um sistema de esterilidade masculina nuclear que inclui: identificar um gene que é crítico à fertilidade masculina; silenciar esse gene nativo que é crítico à fertilidade masculina; remover o promotor nativo do gene de fertilidade masculina essencial e substituir o mesmo por um promotor induzível; inserir esse gene geneticamente modificado de volta na planta; e criando, desse modo, uma planta que é masculina estéril devido ao promotor induzível não estar "ligado", resultando no gene de fertilidade masculina não transcrito. A fertilidade é restaurada induzindo ou "ligando" o promotor, o que permite, por sua vez, que o gene que confere fertilidade masculina seja transcrito.
[0098] (A) Introdução de um gene deacetilase sob o controle de um promotor específico de tapetum e com a aplicação de N-Ac-PPT químico (documento nº WO 01/29237).
[0099] (B) Introdução de vários promotores específicos de estame (documentos nº WO 92/13956, nº WO 92/13957).
[0100] (C) Introdução do gene barnase e barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611 a 622).
[0101] Para exemplos adicionais de sistemas e genes nucleares de esterilidade masculina e feminina, também consultar as Patentes número U.S. 5.859.341; 6.297.426;
5.478.369; 5.824.524; 5.850.014 e 6.265.640.
5. Genes que criam um local para integração de DNA de local específico
[0102] Isso inclui a introdução de locais de FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT e/ou locais Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, consultar
Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925 a 932 e o documento WO 99/25821. Outros sistemas que podem ser usados incluem a recombinase Gin de fago Mu (Maeser, et al., 1991; Vicki Chandler, The Maize Handbook capítulo 118 (Springer- Verlag 1994), a recombinase Pin de E. coli (Enomoto, et al., 1983) e o sistema R/RS do plasmídeo pSRi (Araki, et al., 1992).
[0103] 6. Genes que afetam resistência ao estresse abiótico (que incluem, porém sem limitação, o desenvolvimento de flores, espiga e semente, intensificação de eficiência de utilização de nitrogênio, capacidade de resposta de nitrogênio alterada, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio e resistência ou tolerância ao sal) e rendimento aumentado sob estresse. Por exemplo, consultar o documento no WO 00/73475 em que a eficiência de uso de água é alterada através da alteração de malato; documento de Patente no U.S. 5.892.009, documento de Patente no U.S. 5.965.705, documento de Patente no U.S.
5.929.305, documento de Patente no U.S. 5.891.859, documento de Patente no U.S. 6.417.428, documento de Patente no U.S.
6.664.446, documento de Patente no U.S. 6.706.866, documento de Patente no U.S. 6.717.034, WO2000060089, documentos no WO2001026459, WO2001035725, WO2001034726, WO2001035727, WO2001036444, WO2001036597, WO2001036598, WO2002015675, WO2002017430, WO2002077185, WO2002079403, WO2003013227, WO2003013228, WO2003014327, WO2004031349, WO2004076638, WO9809521 e WO9938977 que descrevem genes, incluindo genes CBF e fatores de transcrição eficazes em mitigar os efeitos negativos de congelamento, alta salinidade e seca em plantas,
assim como conferir outros efeitos positivos em fenótipo de planta; a Publicação de Pedido de Patente no U.S. 2004/0148654 e documento no WO01/36596 em que ácido abscísico é alterado em plantas que resultam em fenótipo de planta melhorado, tal como rendimento aumentado e/ou tolerância ao estresse abiótico aumentada; documentos no WO2000/006341, WO04/090143, Pedido de Patente no de série U.S. 10/817483 e documento de Patente no U.S. 6.992.237, em que a expressão de citocinina é modificada, o que resulta em plantas com tolerância ao estresse aumentada, tal como tolerância à seca, e/ou rendimento aumentado, incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. Consultar também os documentos nº WO 200202776, nº WO 2003052063, JP 2002281975, Patente nº U.S. 6.084.153, documento nº WO 200164898, Patente nº U.S. 6.177.275 e Patente nº U.S.
6.107.547 (aprimoramento de utilização de nitrogênio e resposta de nitrogênio alterada). Para alteração de etileno, consultar a Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0128719, a Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2003/0166197 e o documento nº WO 2000/32761. Para fatores de transcrição de planta ou reguladores de transcrição de estresse abiótico, consultar, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0098764 ou Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2004/0078852.
[0104] Outros genes e fatores de transcrição que afetam crescimento vegetal e traços agronômicos tais como rendimento, floração, crescimento vegetal e/ou estrutura vegetal podem ser introduzidos ou introgredidos em plantas, consultar, por exemplo, os documentos número WO97/49811
(LHY), WO98/56918 (ESD4), WO97/10339 e o documento de Patente número U.S. 6.573.430 (TFL), documento de Patente número U.S. 6.713.663 (FT), WO96/14414 (CON), WO96/38560, WO01/21822 (VRN1), WO00/44918 (VRN2), WO99/49064 (GI), WO00/46358 (FRI), WO97/29123, documento de Patente número U.S. 6.794.560, o documento de Patente número U.S. 6.307.126 (GAI), WO99/09174 (D8 e Rht) e WO2004076638 e WO2004031349 (fatores de transcrição).
[0105] “RNAi" se refere a uma série de técnicas relacionadas para reduzir a expressão de genes (consultar, por exemplo, a Patente número US 6.506.559). As mesmas incluem "inibição antissenso", a produção de transcritos de RNA antissenso com capacidade para suprimir a expressão da proteína-alvo, e "cossupressão" ou "supressão de senso", que se refere à produção de transcritos de RNA senso com capacidade para suprimir a expressão de genes estranhos ou endógenos idênticos ou substancialmente similares (Patente número US 5.231.020). Tais técnicas dependem do uso de construtos que resulta no acúmulo de RNA de fita dupla com uma fita complementar ao gene-alvo a ser silenciado. As sequências reguladoras reveladas no presente documento podem ser usadas para acionar a expressão de construtos que resultará na interferência de RNA incluindo microRNAs e siRNAs.
[0106] As sequências reguladoras reveladas no presente documento podem ser usadas para acionar a expressão de construtos que têm como alvo a subunidade H da ATPase vacuolar, úteis para controlar uma infestação e população de praga de coleópteros conforme descrito na Publicação de
Pedido de Patente no US 2012/0198586. A Publicação PCT WO 2012/055982 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de filamento duplo) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica: uma proteína ribossômica de inseto, como a proteína ribossômica L19, a proteína ribossômica L40 ou a proteína ribossômica S27A; uma subunidade de proteassoma de inseto, como a proteína Rpn6, a Pros 25, a proteína Rpn2, a proteína de subunidade beta 1 de proteassoma ou a proteína Pros beta 2; um β-coatômero de inseto da vesícula COPI, o γ-coatômero da vesícula COPI, a proteína de β'-coatômero ou o ζ-coatômero da vesícula COPI; um proteína Tetraspanina 2 A de inseto que é uma proteína de domínio transmembranar putativo; uma proteína de inseto que pertence à família de actina, como Actina 5C; uma proteína ubiquitina-5E de inseto; uma proteína Sec23 de inseto que é um ativador de GTPase envolvido em transporte de proteína intracelular; uma proteína plissada de inseto que é uma miosina não convencional que está envolvida em atividade motora; uma proteína crooked neck de inseto que está envolvida na regulação de união de mRNA alternativo nuclear; uma proteína de subunidade G de H+-ATPase vacuolar de inseto e uma Tbp-1 de inseto, como uma proteína de ligação de Tat.
A Publicação PCT WO 2007/035650 descreve um ácido ribonucleico (RNA ou RNA de filamento duplo) que inibe ou regula de modo decrescente a expressão de um gene-alvo que codifica Snf7. A Publicação de Pedido de Patente nº US 2011/0054007 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeo que direciona RPS10. A Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2014/0275208 e US2015/0257389 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeo que direcionam RyanR, HP2 e PAT3. A Publicação de Pedido de Patente nº US 2011/0054007 descreve elementos de silenciamento de polinucleotídeo que direciona RPS10. As publicações PCT número WO 2016/060911, WO 2016/060912, WO 2016/060913 e WO 2016/060914 descrevem elementos de silenciamento de polinucleotídeo que direcionam moléculas de ácido nucleico de subunidade de coatômero COPI que conferem resistência às pragas Coleóptera e Hemíptera.
As Publicações de Pedido de Patente dos E.U.A. nº US 20120297501, e n.º 2012/0322660 descrevem os ácidos ribonucleicos interferentes (RNA ou RNA de fita dupla) que funcionam mediante captação por uma espécie de praga de inseto para regular de modo descendente a expressão de um gene de direcionamento na dita praga de inseto, em que o RNA compreende pelo menos um elemento de silenciamento, em que o elemento de silenciamento é uma região de RNA de fita dupla que compreende fitas complementares aneladas, em que uma fita compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de direcionamento de nucleotídeo dentro do gene de direcionamento.
A Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2012/0164205 descreve direcionamentos potenciais para ácidos ribonucleicos de fita dupla interferentes para inibir pragas invertebradas incluindo: uma Sequência Homóloga Chd3, uma Sequência Homóloga de Beta-Tubulina, uma Sequência Homóloga de ATPase V de 40 kDa, uma Sequência Homóloga de EF1α, uma Sequência Homóloga p28 de Subunidade de Proteassoma 26S, uma Sequência Homóloga de Hidrolase de Epóxido de Hormônio Juvenil, uma
Sequência Homóloga de Proteína de Canal de Cloreto Dependente de Inchaço, uma Sequência Homóloga de Proteína Glicose-6- Fosfato 1-Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Proteína Act42A, uma Sequência Homóloga de Fator 1 de Ribosilação de ADP, uma Sequência Homóloga de Proteína de Fator IIB de Transcrição, umas Sequências Homólogas de Quitinase, uma Sequência Homóloga de Enzima de Conjugação de Ubiquitina, uma Sequência Homóloga de Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase, uma Sequência Homóloga de Ubiquitina B, um Homólogo de Esterase de Hormônio Juvenil e uma Sequência Homóloga de Alfa Tubulina.
[0107] As sequências de elementos reguladores isoladas reveladas no presente documento podem ser modificadas para fornecer uma gama de níveis de expressão da sequência de nucleotídeos heterólogos. Desse modo, menos que a região de elemento regulador inteira pode ser utilizada, e a habilidade para acionar a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse é mantida. É reconhecido que os níveis de expressão do mRNA podem ser alterados de maneiras diferentes com deleções de porções das sequências promotoras. Os níveis de expressão de mRNA podem ser diminuídos, ou alternativamente, a expressão pode ser aumentada como resultado de deleções de elemento regulador se, por exemplo, houver um elemento regulador negativo (para um repressor) que é removido durante o processo de truncamento. Geralmente, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de uma sequência de elementos reguladores isolada serão usados para acionar a expressão de uma sequência de polinucleotídeos.
[0108] As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consultar também, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1.261 a 1.272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7.891 a 7.903; e Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9.627 a 9.639.
[0109] Os cassetes de expressão que compreendem as sequências reveladas no presente documento também podem conter pelo menos uma sequência de nucleotídeos adicional para um gene a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, a sequência (ou sequências) adicional pode ser fornecida em outro cassete de expressão.
[0110] Quando apropriado, as sequências de polinucleotídeos cuja expressão deve estar sob o controle de uma sequência de elementos reguladores da presente revelação e qualquer sequência (ou sequências) de nucleotídeo adicional pode ser otimizada para expressão aumentada na planta transformada. Isto é, essas sequências de nucleotídeos podem ser sintetizadas com o uso de códons preferidos de planta para expressão melhorada. Consultar, por exemplo, Campbell e Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1 a 11 para uma discussão de uso de códon preferido de hospedeiro. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consultar, por exemplo, Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477 a
498.
[0111] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão genética em um hospedeiro celular. Essas incluem eliminação de sequências codificadoras de sinais de poliadenilação artificiais, sinais de local de divisão de éxon e íntron, repetições tipo transpóson e outras tais sequências bastante caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão genética. O teor de G-C da sequência de polinucleotídeos heterólogos pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, conforme calculado por referência para genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas.
[0112] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências-líder 5'. Tais sequências-líderes podem atuar para aprimorar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação: picornoavírus líderes, por exemplo, EMCV líder (região não codificadora 5’ de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86:6.126 a 6.130); potivírus líderes, por exemplo, TEV líder (Vírus Tobacco Etch) (Allison, et al., (1986) Virology 154:9 a 20); MDMV líder (Vírus Maize Dwarf Mosaic); proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90 a 94); líder não traduzido do mRNA de proteína de revestimento de vírus de mosaico de alfafa (AMV
RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622 a 625); vírus de mosaico de tabaco líder (TMV) (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237 a 256) e vírus mosqueado clorótico de milho líder (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382 a 385). Consultar, também, Della- Cioppa, et al., (1987) Plant Physiology 84:965 a 968. Os métodos conhecidos por aprimorar a estabilidade de mRNA também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons, como o íntron de Ubiquitina de milho (Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5:213 a 218; Christensen, et al., (1992) Plant Molecular Biology 18:675 a 689) ou o íntron de AdhI de milho (Kyozuka, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40 a 48; Kyozuka, et al., (1990) Maydica 35:353 a 357) e semelhantes.
[0113] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Para esse fim, os adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer locais de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou semelhantes. Com esse propósito, a mutagênese in vitro, o reparo de iniciador, a restrição, o anelamento, as ressubstituições, por exemplo, transições e transversões, podem ser envolvidos.
[0114] Os genes repórter ou genes marcadores selecionáveis podem ser também incluídos nos cassetes de expressão. Os exemplos de genes repórter adequados conhecidos na técnica podem ser encontrados em, por exemplo,
Jefferson et al. (1991) em Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin, et al., (Kluwer Academic Publishers), páginas 1 a 33; DeWet, et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725 a 737; Goff, et al., (1990) EMBO J. 9:2.517 a 2.522; Kain, et al., (1995) Bio Techniques 19:650 a 655; e Chiu, et al., (1996) Current Biology 6:325 a 330.
[0115] Os genes marcadores selecionáveis para a seleção de células transformadas ou tecidos podem incluir genes que conferem resistência antibiótica ou resistência a herbicidas. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, porém sem limitação, genes codificadores de resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987 a 992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209 a 213; Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807 a 820); higromicina (Waldron, et al., (1985) Plant Mol. Biol. 5:103 a 108 e Zhijian, et al., (1995) Plant Science 108:219 a 227); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86 a 91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131 a 137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171 a 176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127 a 136); bromoxinila (Stalker, et al., (1988) Science 242:419 a 423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478 a 481 e Pedidos de Patente no de série U.S. 10/004.357 e 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2.513 a 2.518).
[0116] Outros genes que podem ter utilidade na recuperação de eventos transgênicos incluiriam, porém sem limitação, exemplos como GUS (beta-glucuronidase; Jefferson
(1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescência verde; Chalfie, et al., (1994) Science 263:802), luciferase (Riggs, et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):8.115 e Luehrsen, et al., (1992) Methods Enzymol. 216:397 a 414) e os genes de milho que codificam a produção de antocianina (Ludwig, et al., (1990) Science 247:449).
[0117] O cassete de expressão que compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeos de interesse podem ser usados para transformar qualquer planta. Em outra concretização, um cassete de expressão que compreende as sequências das SEQ ID NOs: 1 a 13 ligadas de modo operacional a uma sequência de polinucleotídeos de interesse pode ser usado para transformar qualquer planta. Dessa maneira, as plantas geneticamente modificadas, células de planta, tecido de planta, semente, raiz e semelhantes podem ser obtidos.
[0118] Certos métodos revelados envolvem introduzir um polinucleotídeo em uma planta. Conforme usado no presente documento, “introduzir" destina-se a significar apresentar à planta o polinucleotídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da revelação não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir polinucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, métodos de transformação estável, transformação temporária e métodos mediados por vírus.
[0119] Uma "transformação estável” é uma transformação em que o construto de polinucleotídeo introduzido em uma planta integra-se ao genoma da planta e tem capacidade para ser herdada pela progênie da mesma. “Transformação temporária" significa que um polinucleotídeo é introduzido na planta de milho e não se integra no genoma da planta.
[0120] Os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para transformação. Métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células vegetais e inserção subsequente no genoma vegetal incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5.602 a 5.606), transformação mediada por Agrobacterium (Townsend, et al., documento de Patente no U.S.
5.563.055 e Zhao, et al., documento de Patente no U.S.
5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722) e aceleração de partícula balística (consultar, por exemplo, documentos de Patente no U.S. 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes, et al., (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, edição de Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923 a 926) e transformação de Lec1 (documento número WO 00/28058). Consultar também, Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer e McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319- 324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:4.305 a 4.309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (milho); Patentes nos U.S. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Patente nº U.S. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por fibras); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford, (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (milho por meio de Agrobacterium tumefaciens).
[0121] Em uma concretização, construtos de DNA que compreendem um elemento regulador podem ser fornecidos a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação temporária. Em outra concretização, construtos de DNA que compreendem as sequências reveladas nas SEQ ID NOs: 1 a 13 podem ser fornecidos a uma planta com o uso de uma variedade de métodos de transformação temporária. Tais métodos de transformação temporária incluem, mas sem limitação, sistemas de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de uma maneira que impeça a liberação subsequente do DNA. Portanto, a transcrição a partir do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que a mesma é liberada para se integrar ao genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143).
[0122] Em outras concretizações, um polinucleotídeo pode ser introduzido em plantas colocando-se as plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar um construto de polinucleotídeo da revelação dentro de um DNA viral ou molécula de RNA. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nos mesmos, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, as Patentes números US
5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209 a 221.
[0123] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em uma concretização, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é alcançada com o uso de um sistema de recombinação específico de local. Consultar, por exemplo, os documentos número WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853. Brevemente, o polinucleotídeo da revelação pode estar contido em cassete de transferência flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que tem um local-alvo estavelmente incorporado em seu genoma, o qual é flanqueado por dois locais de recombinação não idênticos que correspondem aos locais do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao local-alvo. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma de planta.
[0124] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consultar, por exemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Essas plantas podem ser, então, cultivadas e polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e a progênie resultante que tem expressão da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida. Dessa maneira, a presente revelação fornece a semente transformada (também denominada "semente transgênica") que tem um construto de nucleotídeo, por exemplo, um cassete de expressão que compreende uma das
SEQ ID NOs: 1 a 13, incorporadas de maneira estável em seu genoma.
[0125] Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir do tecido da planta. O método particular de regeneração dependerá do tecido de planta de partida e da espécie de planta particular a ser regenerada. A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto de planta únicos ou de vários explantes transformados são bem conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, (1988) em: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.). Esse processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas, cultivo dessas células individualizadas através de estágios usuais de desenvolvimento embrionário através do estágio de planta jovem com raiz. Embriões transgênicos e sementes são similarmente regenerados. Os brotos transgênicos com raiz resultantes são, depois disso, plantados em um meio de crescimento de planta adequado, tal como o solo. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. De outro modo, o pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas cultivadas a partir da semente de linhagens agronomicamente importantes. De modo contrário, o pólen de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica das concretizações que contêm um polinucleotídeo desejado é cultivada com o uso de métodos bem conhecidos por um versado na técnica.
[0126] As concretizações fornecem composições para triar compostos que modulam a expressão dentro de plantas. Os vetores, as células e as plantas podem ser usados para triar moléculas candidatas quanto a agonistas e antagonistas das sequências de elemento regulador das SEQ ID NOs: 1-13. Por exemplo, um gene repórter pode ser operacionalmente ligado a uma sequência reguladora e expresso como um transgene em uma planta. Compostos a serem testados são adicionados e expressão de gene repórter é medida para determinar o efeito sobre a atividade promotora.
[0127] Em uma concretização, um elemento regulador, por exemplo, sequências SEQ ID NOs: 1 a 13 podem ser editadas ou inseridas em uma planta por edição de genoma com o uso de um sistema de CRISPR/Cas9.
[0128] Em um aspecto, os elementos reguladores revelados podem ser introduzidos no genoma de uma planta com o uso de tecnologias de edição de genoma, ou elementos reguladores previamente introduzidos no genoma de uma planta podem ser editados com o uso de tecnologias de edição de genoma. Por exemplo, os elementos reguladores revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada no genoma de uma planta através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, tal como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e similares. Por exemplo, os elementos reguladores revelados podem ser introduzidos em uma localização desejada em um genoma com o uso de um sistema CRISPR-Cas com o propósito de inserção específica em um local. A localização desejada em um genoma de planta pode ser qualquer local alvo desejado para inserção, tal como uma região genômica favorável para melhoramento ou pode ser um local alvo localizado em uma janela genômica com um traço de interesse existente. Elementos reguladores existentes de interesse poderiam ser um elemento regulador endógeno ou elemento reguladores previamente introduzidos.
[0129] Em outro aspecto, quando o elemento regulador revelado foi anteriormente introduzido em um genoma, as tecnologias de edição de genoma podem ser usadas para alterar ou modificar a sequência de elementos reguladores introduzidos. As modificações específicas de local que podem ser introduzidas nas composições de elementos reguladores reveladas incluem aquelas produzidos com o uso de qualquer método para introduzir a modificação específica de local, incluindo, mas sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de gene (por exemplo, Publicação nº US 2013/0019349), ou através do uso de tecnologias de quebra de fita dupla, como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas e semelhantes. Tais tecnologias podem ser usadas para modificar o polinucleotídeo anteriormente introduzido através de inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos dentro do polinucleotídeo introduzido. Alternativamente, tecnologias de quebra de fita dupla podem ser usadas para adicionar sequências de nucleotídeos adicionais ao polinucleotídeo introduzido.
[0130] Um “local-alvo alterado”, “sequência-alvo alterada”, "local-alvo modificado" e "sequência-alvo modificada" são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma sequência-alvo conforme revelado no presente documento que compreende pelo menos uma alteração em comparação com a sequência-alvo não alterada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).
[0131] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos indivíduos versados na técnica à qual a presente revelação pertence. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma extensão que se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
[0132] A descrição acima de várias concretizações ilustradas da revelação não pretende ser exaustiva ou limitar o escopo à forma precisa revelada. Embora as concretizações específicas de exemplos sejam descritas no presente documento com propósitos ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da revelação, conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica relevante. Os ensinamentos fornecidos no presente documento podem ser aplicados com outros propósitos, diferentes daqueles dos exemplos descritos acima. Diversas modificações e variações são possíveis a luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
[0133] Essas e outras mudanças podem ser feitas a luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados como limitantes para as concretizações específicas reveladas no relatório descritivo e nas reivindicações.
[0134] Foram feitos esforços para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, concentrações, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser permitidos. A menos que indicado de outro modo, partes são partes em peso; peso molecular é o peso molecular médio; a temperatura está em graus centígrados; e a pressão está próxima ou à pressão atmosférica.
EXPERIMENTAL Exemplo 1: Sequências de elemento regulador de Actina7 de Brachypodium distachyon
[0135] O elemento regulador de SEQ ID NO: 1 foi obtido através de uma pesquisa de um banco de dados de RNA- seq proprietário que consiste nos valores de expressão espaciais para a linhagem endogâmica diploide de Brachypodium distachyon, Bd21 (Brachypodium distachyon (L.)Beauv USDA NPGS acesso PI 254867 (Bd21)). Tecido de plantas crescidas em estufas foi amostrado de cada um dos órgãos principais em estágios de desenvolvimento vegetativo e reprodutivo para também fornecer valores de expressão temporais para esses órgãos presentes em ambos os estágios (por exemplo, folhas/raízes). Três réplicas foram coletadas de cada amostra, com cada réplica consistindo em nove plantas. O RNA foi isolado de cada uma das réplicas, transcrito de modo reverso e sequenciado com o uso da tecnologia de sequenciamento de DNA Illumina. As etiquetas de sequência foram alinhadas com a sequência genômica para identificar o gene.
[0136] Uma comparação da expressão através de cada um dos tecidos foi realizada para identificar candidatos que se encaixam nos critérios de expressão em folhas e raízes em ambos os estágios vegetativo e reprodutivo, assim como no flósculo e caule de inflorescência no estágio reprodutivo. Diversos candidatos foram identificados incluindo um com uma etiqueta de sequência que se alinha ao gene de Actina7 de Brachypodium distachyon.
[0137] Com o uso do portal de genômica comparativa de plantas do Department of Energy's Joint Genome Institute (Phytozome), a região de flanqueamento 5' para Bd-Actin7 foi identificada. A sequência sintetizada para teste em milho consiste em 3.122 bp (apresentada na SEQ ID NO: 1) e tem uma caixa TATA putativa que começa aproximadamente de 39 bp a montante da extremidade 3' da sequência. Um sítio de início de transcrição putativo, denotado pelos nucleotídeos CA, está aproximadamente 24 bp a jusante da caixa TATA putativa. A sequência de 3.122 bp inteira é denominada no presente documento elemento regulador de "Bd-Actin7 FL" (comprimento completo) ou Bd-Actin7 FL. Os segmentos de deleção da extremidade 5' do elemento regulador de comprimento completo pode alterar o padrão de expressão e fornecer indicação em marcadores de sequência importantes na região reguladora. Cada uma das SEQ ID NOs: 6 a 12 é uma versão truncada do elemento regulador de comprimento completo (consultar a Figura 1;). Os elementos reguladores de Bd-Actin7 TR1, Bd-
Actin7 TR2, Bd-Actin7 TR3, Bd-Actin7 TR4, Bd-Actin7 TR5 Bd- Actin7 TR6, Bd-Actin7 TR7, Bd-Actin7 TR8, Bd-Actin7 TR9, Bd- Actin7 TR10, Bd-Actin7 TR11 consistem, respectivamente, em 821 bp, 514 bp, 431 bp, 283 bp e 116 bp e contêm a extremidade 3' do promotor de comprimento completo (SEQ ID NOs: 6 a 12, respectivamente). Exemplo 2: Análise de Expressão do Elemento Regulador de Bd-Actin7
[0138] Bd-Actin7 FL foi testado em diversas configurações de vetor diferentes. O mesmo foi operacionalmente ligado a seu primeiro íntron nativo (SEQ ID NO: 3). Esse íntron está localizado ~60 bp a jusante do começo do códon inicial na região de codificação de Bd-Actin7 e tem aproximadamente 90 bp de comprimento. Bd-Actin7 FL foi também operacionalmente ligado ao primeiro íntron do gene 1 de álcool desidrogenase de milho (íntron 1 de ADH1; (SEQ ID NO: 16) e os primeiros íntrons de Zm-HPLV9 (SEQ ID NO: 14) e ZM-HPLV11 (SEQ ID NO: 15). As sequências repórter para atividade de promotor incluíram β-glucuronidase (GUS) e um princípio ativo inseticida para Lepidópteros, Cry1A.88. Os íntrons foram incluídos com o propósito de expressão aumentada, visto que foi mostrado que, em células de planta de cereal, a expressão de transgenes é aprimorada pela presença de alguns íntrons proximais 5' (Consultar Callis et al. (1987) Genes and Development 1: 1183 a 1200; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353 a 357).
[0139] O promotor Ubi-1 e íntron de Zea mays foram ligadas de modo operacional ao gene GUS de modo que possa ser usado para comparar o padrão de expressão e os níveis de expressão dos elementos reguladores de Bd-Actin7. O promotor Ubi-1 é um promotor constitutivo forte na maioria dos tecidos de Zea mays.
[0140] As plantas transformadas estáveis foram criadas com o uso de protocolos de Agrobacterium (consultar o Exemplo 3) para permitir a caracterização de atividade promotora, incluindo expressão espacial e quantitativa direcionada pelo elemento regulador de Bd-Actin7 FL. As plantas cultivadas até o estágio V5/6 sob condições de estufa foram amostradas para material de folha e raiz para avaliar as mudanças de expressão por meio de análise de coloração de GUS histoquímica e ensaios fluorimétricos quantitativos. Os estágios de crescimento vegetativo foram determinados pelo número de folhas coloridas na planta. Portanto, uma planta no estágio V5 tem 5 folhas completamente coloridas. Permitiu- se, então, que as plantas crescessem até o estágio R1-R2, um ponto quando cabelos emergem para fora do bagaço (R1) e começam a secar (R2). Os tecidos, que incluíram tecidos reprodutivos, foram coletados e analisados para expressão (Tabela 2). Tabela 2: Resultados de Expressão de Planta para o Promotor de Bd-Actin7 (com íntron 1 de Bd-Actin7 e GUS) V5-V6 R1-R2 Folha Raiz Colmo Pendão Seda Pólen Bd-Actin7 FL 1 2 2 2 1 <0,1 Ubi-1 4 4 4 4 3 4 não 0 0 0 0 0 0 transformado
(controle negativo)
[0141] Os dados são mostrados em uma escala de 0 a 6 com a expressão direcionada de promotor Ubi-1 de milho como um comparador.
[0142] Em outro conjunto de experimentos, o elemento regulador de Bd-Actin7 FL (SEQ ID NO: 11) foi operacionalmente ligado a 4 íntrons diferentes (íntron 1 de Bd-Actin7, íntron 1 de ADH (SEQ ID NO: 16), íntron 1 de Zm- HPLV9 (SEQ ID NO: 14) e íntron 1 de Zm-HPSV11 (SEQ ID NO: 15)) e GUS para testar o efeito dos íntrons na expressão. As plantas transformadas estáveis foram criadas com o uso de protocolos de Agrobacterium (consultar o exemplo 3) e deixadas crescer até os estágios vegetativo (V5/V6) e reprodutivo (R1/R2) quando os tecidos foram amostrados (Tabela 3). Tabela 3: Resultados de Expressão de Planta para o Promotor de Bd-Actin7 e 4 Íntrons Diferentes V5-V6 R1-R2 Folha Raiz Colmo Casca Seda Pólen Sem íntron 2 2 2 4 2 <0,1 Íntron 1 de 3 1 3 4 1 <0,1 Bd-Actin7 ADH intron1 3 3 3 4 2 n.d. Íntron 1 de 4 5 5 6 3 n.d. Zm-HPLV9 Íntron 1 de 4 3 3 5 2 n.d. Zm-HPSV11 não transformado 0 0 0 0 0 0 (controle negativo)
[0143] Os dados são expressos em uma escala de 0 a
6.
[0144] Os resultados de ensaios imunossorbentes ligados à enzima (ELISA) contra Cry1A.88 mostraram a expressão direcionada de elemento regulador de FL de Bd- Actin7 (SEQ ID NO: 1) em tecidos de folha, caule e caroço de milho com esse repórter (Tabela 4). Tabela 4: Resultados de Expressão de Planta para o Elemento Regulador Bd-Actin7 FL (com Cry1A.88) V5-V6 R1-R2 Maturidade Folha Colmo Pólen Grãos Sem íntron 1 2 <0,1 1 Íntron 1 de Bd- 1 2 <0,1 1 Actin7 ADH intron1 0 1 <0,1 0 Íntron 1 de Zm- 1 2 <0,1 1 HPLV9 Íntron 1 de Zm- 1 1 <0,1 1 HPSV11 Ubi-1 4 5 3 4 não transformado (controle 0 0 0 0 negativo)
[0145] Os dados são mostrados em uma escala de 0 a 6 com a expressão direcionada de promotor Ubi-1 de milho como um comparador.
[0146] A exposição de tecidos de planta a insetos forneceu uma avaliação da expressão de proteína, na medida em que níveis suficientes são necessários para proteger o tecido dos insetos. A expressão insuficiente resultou em dano de alimentação. A Tabela 5 mostra o dano de alimentação de plantas transformadas com Bd-Actin7 FL (SEQ ID NO: 1) com diferentes íntrons para plantas transformadas com Ubi-1 fundido de modo operacional a Cry1A.88. Tabela 5: Dano de Alimentação de Lagarta-da-espiga-do-milho em Espigas Dano de alimentação de espiga médio (cm2) Sem íntron 2 Íntron 1 de Bd- 1 Actin7 ADH intron1 7 Íntron 1 de Zm- 2 HPLV9 Íntron 1 de Zm- 4 HPSV11 Ubi-1 1 não transformado (controle >10 negativo)
[0147] Três cópias do aprimorador transcricional do Vírus do Mosaico da Mirabilis (SEQ ID NO: 13) foram colocadas a montante do promotor de Bd-Actin7 FL. Em um vetor de expressão, o íntron de Bd-Actina 7 nativo, íntron 1 de Bd- Actin7 (SEQ ID NO: 3), estava presente e, em outro vetor de expressão, o íntron estava ausente. Os resultados das plantas de milho transgênicas são mostrados na Tabela 6. Tabela 6: Resultados de Expressão de Planta para o Promotor de Bd-Actin7 com o Aprimorador Transcricional 3xMMV V5-V6 R1-R2 Folha Raiz Colmo Casca Seda Pólen Sem aprimorador/sem 2 2 2 4 2 <0,1 íntron 3xMMV/sem >6 >6 >6 >6 >6 <0,1 íntron 3xMMV/íntron 1 >6 >6 >6 >6 >6 <0,1 de Bd-Actin7 não transformado 0 0 0 0 0 0 (controle negativo)
[0148] Os dados são mostrados em uma escala de 0 a
6.
[0149] Os elementos reguladores são uma coleta de motivos de sequência que funcionam juntos para ligar os fatores de transcrição que resultam nas características de expressão espacial, temporal e quantitativa de um promotor.
Entender a arquitetura e o posicionamento desses motivos aprimora o conhecimento que pertence ao elemento regulador. A análise de deleção de segmento é uma ferramenta importante que foi usada para começar a identificar regiões do elemento regulador que contêm motivos funcionalmente importantes. A remoção de segmentos da extremidade 5' pode mudar os padrões de expressão espaciais, temporais e/ou quantitativos direcionados pelo elemento regulador. As regiões que resultam em uma mudança podem, então, ser estudadas mais aproximadamente para avaliar as sequências e sua interação com fatores cis e trans. Os truncamentos também podem identificar uma sequência funcional mínima.
[0150] Sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição foram usados para remover as regiões de sequência 5' de Bd-Actin7 FL variando em tamanho de ~265 bp a ~693 bp. Cada fragmento de deleção foi operacionalmente ligado ao gene repórter GUS em um vetor de expressão para teste em plantas de milho para características de expressão relativas ao promotor de comprimento completo (consultar a Tabela 7). Tabela 7. Análise de Deleção Segmentar V5-V6 R1-R2 Folha Raiz Colmo Cabelo Bagaço Bd-Actin7 FL 100 100 100 100 100 Bd-Actin7 TR1 93 77 95 100 98 Bd-Actin7 TR2 102 87 99 109 101 Bd-Actin7 TR3 47 27 66 89 66 Bd-Actin7 TR4 50 30 74 79 89 Bd-Actin7 TR5 na na 69 76 122 Bd-Actin7 TR6 na na 0 0 0 não transformado 0 0 0 0 0 (controle negativo)
[0151] *Os dados mostrados como uma porcentagem do valor de expressão médio de eventos de Bd-Actin7 FL Exemplo 3: Transformação Mediada por Agrobacterium de Milho e Regeneração de Plantas Transgênicas
[0152] Para transformação mediada por Agrobacterium de milho com uma sequência de elementos reguladores da revelação, o método de Zhao foi empregue (Patente nº US 5,981,840, e publicação de patente nº PCT WO98/32326; cujo conteúdo é incorporado ao presente documento, a título de referência). Brevemente, os embriões imaturos foram isolados de milho e os embriões fizeram contato com uma suspensão de Agrobacterium sob condições pelas quais as bactérias tiveram capacidade para transferir a sequência de elemento regulador da revelação para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nessa etapa, os embriões imaturos foram imersos em uma suspensão de Agrobacterium para a iniciação de inoculação. Os embriões foram cocultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de cocultivar). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Após o período de cocultivo, uma etapa de "repouso" opcional foi realizada. Nessa etapa de repouso, os embriões foram incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transformadores de planta (etapa 3:
etapa de repouso). A seguir, os embriões inoculados foram cultivados em meio que contém um agente seletivo e os calos transformados por crescimento foram recuperados (etapa 4: a etapa de seleção). As plântulas foram regeneradas dos calos (etapa 5: a etapa de regeneração) antes da transferência para a estufa.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Polinucleotídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um polinucleotídeo que tem pelo menos 95 por cento de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 12; (b) um polinucleotídeo de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 12; ou (c) um fragmento de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 12; em que o polinucleotídeo recombinante tem atividade de promotor.
2. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um elemento regulador aprimorador.
3. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o elemento regulador aprimorador compreende a SEQ ID NO: 13.
4. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita operacionalmente ligada ao polinucleotídeo de elemento regulador, em que o polinucleotídeo de elemento regulador compreende: (a) um polinucleotídeo que tem pelo menos 95 por cento de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 12; (b) um polinucleotídeo de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 12; ou
(c) um fragmento de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 12, em que o polinucleotídeo de elemento regulador tem atividade de promotor.
5. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de elemento regulador compreende adicionalmente um elemento regulador aprimorador.
6. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o elemento regulador aprimorador compreende a SEQ ID NO: 13.
7. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita é um gene de interesse agronômico.
8. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita é um gene com capacidade para fornecer resistência a herbicidas em plantas.
9. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo heteróloga que pode ser transcrita é um gene com capacidade para fornecer controle de praga de planta em plantas.
10. Célula heteróloga caracterizada pelo fato de que é transformada estavelmente com a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 1.
11. Planta transgênica ou célula de planta caracterizada pelo fato de que é estavelmente transformada com o construto de DNA conforme definido na reivindicação 4.
12. Planta transgênica ou célula de planta, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que é uma célula de planta dicotiledônea.
13. Planta transgênica ou célula de planta, de acordo com a reivindicação 10, sendo que a planta transgênica é caracterizada pelo fato de que é uma célula de planta monocotiledônea.
14. Semente da planta transgênica conforme definida na reivindicação 10 caracterizada pelo fato de que compreende o construto de DNA.
15. Método para expressar um polinucleotídeo em uma planta caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em uma célula de planta um polinucleotídeo recombinante, sendo que o polinucleotídeo recombinante compreende um elemento regulador que tem capacidade para aumentar a expressão de um polinucleotídeo heterólogo, em que o dito elemento regulador compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 12; (b) uma sequência que é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 12; ou (c) uma sequência de nucleotídeos que compreende um fragmento ou uma variante da sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 12, sendo que a sequência de nucleotídeos inicia a transcrição em uma célula vegetal;
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto de gene que está envolvido em desenvolvimento de órgão, desenvolvimento de célula-tronco,
estimulação de crescimento de célula, organogênese, iniciação de embriogênese somática e desenvolvimento do meristema apical.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que um dito polinucleotídeo heterólogo é um gene endógeno da planta.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto de gene que confere tolerância à seca, tolerância ao frio, tolerância a herbicida, resistência a patógeno ou resistência a inseto.
19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma dicotiledônea.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma monocotiledônea.
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