DE3587548T2

DE3587548T2 - Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.

Info

Publication number: DE3587548T2
Application number: DE85402596T
Authority: DE
Inventors: Hans J Bohnert; Anthony R Cashmore; Luis Herrera-Estrella; Albert P Kausch; Jeff Max Planck Inst Fu Schell; Peter Schreier; Michael P Timko; Den Broeck Guido Van; Montagu Marc Van
Original assignee: Plant Genetic Systems NV; Bayer AG
Current assignee: Bayer CropScience NV; Bayer AG
Priority date: 1984-12-28
Filing date: 1985-12-20
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 2005-12-21
Also published as: DE3587548D1; AU591087B2; JPH0728733B2; EP0189707A3; AU5166485A; US5728925A; EP0189707A2; US5717084A; US6063601A; IL77466A; EP0189707B1; US6130366A; ATE93542T1; JPS61224990A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Mittel, insbesondere rekombinante Vektoren, und auf Verfahren zur geregelten Einführung von Fremdgen- Produkten in Pflanzen-Chloroplasten.
Die folgende Beschreibung enthält Bezugszeichen in Form von Exponenten. Sie beziehen sich auf Fundstellen in der Literatur, die am Ende dieser Beschreibung aufgeführt werden. Auf andere Literatur wird im Verlauf der Beschreibung ebenfalls Bezug genommen, durch Nennung des Namens des ersten Autors und der Veröffentlichungsdaten. Alle diese Aufsätze bzw. Literaturstellen sowie die Patentanmeldungen, Patente usw., auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, sind dadurch in den Inhalt der Beschreibung mit aufgenommen.
Es ist allgemein bekannt, daß die Zellen von eukaryotischen Organismen und insbesondere Pflanzenzellen deutlich unterscheidbare, subzelluläre Kompartimente oder Organellen enthalten, die durch charakteristische Membransysteme begrenzt sind und innerhalb der Zelle spezialisierte bzw. spezielle Funktionen erfüllen. Bei Photosynthese-Blattzellen von höheren Pflanzen sind die auffälligsten Organellen die Chloroplasten, die innerhalb der Zelle halb autonom existieren, ihr eigenes genetisches System und Einrichtungen für die Proteinsynthese enthalten, aber für ihre Entwicklung und biosynthetischen Aktivitäten von einem engen Zusammenwirken mit dem nucleo-cytoplasmischen System abhängen¹.
Die wesentlichste Funktion der Chloroplasten ist die Durchführung der lichtgesteuerten Reaktionen der Photosynthese. Chloroplasten können aber auch zahlreiche andere biosynthetische Verfahren aus führen, die für die Pflanzenzelle wichtig sind. Beispielsweise werden alle Fettsäuren der Zelle von Enzymen erzeugt, die im Chloroplastenstroma lokalisiert sind unter Verwendung der dort leicht verfügbaren ATP, NADPH und Kohlenhydrate. Außerdem steuert die Reduktionskraft von lichtaktivierten Elektronen die Reduktion von Nitrit (NO&supmin;&sub2;) zum Ammoniak (NH&sub3;) in Chloroplasten. Dieses Ammoniak liefert der Pflanze den Stickstoff, der für die Synthese von Aminosäuren und Nucleotiden benötigt wird.
Die Chloroplasten nehmen auch an Verfahren teil, die für die agrochemische Industrie von besonderer Bedeutung sind.
Es ist insbesondere bekannt, daß zahlreiche Herbizide wirken, indem sie Funktionen blockieren, die innerhalb der Chloroplasten ablaufen. Jüngere Studien haben das spezifische Ziel von verschiedenen Herbiziden identifiziert. Beispielsweise hemmen von Triazin abgeleitete Herbizide die Photosynthese, indem sie ein Plastochinon- Molekül von seiner Bindungsstelle im 32 Kd Polypeptid des Fotosystems II entfernen bzw. verschieben. Dieses 32 Kd Polypeptid wird im Chloroplasten-Genom codiert und durch die Einrichtungen der Organelle synthetisiert. Mutanten-Pflanzen wurden erhalten, die gegenüber Triazin-Herbiziden resistent sind. Diese Pflanzen enthalten ein mutiertes 32 Kd Protein aus dem das Plastochinon nicht mehr durch Triazin-Herbizide verdrängt werden kann.
Von verschiedenen anderen Herbiziden ist bekannt, daß sie spezifische Stufen bei der Aminosäurensynthese blockieren. Sulfonyl-harnstoff ist dafür bekannt, daß er die Acetolactat-Synthase hemmt. Dieses Enzym ist an der Synthese von Isoleucin und Valin beteiligt. Glyphosat hemmt die Funktion von 5-Enol-pyruvyl-3-phosphoshikimat-synthase; dies ist ein Enzym, das an der Synthese von aromatischen Aminosäuren beteiligt ist. Alle diese Enzyme werden durch das nucleare bzw. Kern-Genom codiert, aber sie werden in die Chloroplasten transloziert, wo die tatsächliche Aminosäuresynthese stattfindet.
Für die gleichen Funktionen verantwortliche Enzyme sind auch in Prokaryoten vorhanden. Es sollte leicht sein, bakterielle Mutanten zu erhalten in denen das Enzym, welches interessiert, nicht länger gegenüber dem Herbizid empfindlich ist. Eine solche Strategie wurde mit Erfolg angewandt um Salmonella typhimurium Mutanten mit einem veränderten aro A Gen-Produkt zu erhalten, welches Resistenz gegenüber Glyphosat verleiht (Comai et al., Science 221, 370 (1983).
Daher kann die Verwendung von Chloroplasten- oder Bakterien-Genen um Pflanzenzellen Herbizidresistenz zu verleihen erfolgreich sein, wenn ihre Gen-Produkte wirksam in die Chloroplasten transportiert werden, in denen sie wirken.
Chloroplasten sind auch an den komplexen Mechanismen beteiligt, die das Ausmaß bzw. die Höhe von Aminosäuresynthese regeln. Einer der wichtigsten Regulationsmechanismen ist die sogenannte Retroregulation. Dieser Mechanismus schließt die Hemmung des Schlüsselenzyms eines gegebenen Wegs durch das/die Endprodukt/e dieses Wegs ein. Ist ein Schlüsselenzym nicht länger einer solchen Regulation unterworfen, dann erfolgt eine Überproduktion des entsprechenden Endproduktes (z. B. einer Aminosäure) durch den Organismus.
Die Isolierung von mutierten Genen, welche für Enzyme codieren, die gegenüber Hemmungen durch das entsprechende Endprodukt unempfindlich sind, ist in Bakterien gut dokumentiert. Es ist schwer, ähnliche Mutanten in Pflanzenzellen zu erhalten und es ist nur über wenige Beispiele berichtet worden. Außerdem ist die Isolierung von Genen aus Pflanzenzellen eine sehr komplexe bzw. komplizierte Aufgabe im Vergleich mit der Isolierung mit Genen aus Bakterien.
Wie vorher erwähnt, erfolgt der Hauptteil der Aminosäure-Synthese innerhalb der Chloroplasten.
Es besteht daher ein großes Interesse an der Entwicklung einer Arbeitsweise oder -technik für die Umwandlung von Pflanzenzellen mit Bakterien-Genen, die ein Enzym codieren, welches gegenüber der Hemmung durch das oben genannte Endprodukt unempfindlich ist, in einer solchen Weise, daß als Ergebnis dieses Transformationsverfahrens das Enzym in einen Pflanzen-Chloroplasten eingeführt wird. Das Endergebnis dieses Verfahrens würde eine Überproduktion von Aminosäure sein.
Dies sind nur ein paar Beispiele (weitere Beispiele werden später genannt) für die Aussichten auf beträchtliche Entwicklungen der Pflanzen-Gentechnologie, die den Spezialisten zur Verfügung stehen werden, sobald praktische Arbeitsweisen für das Einführen bestimmter Fremdpolypeptide oder -proteine in Chloroplasten verfügbar geworden sind.
In der Tat sind zahlreiche Techniken für den Transfer von DNA auf Pflanzen vorgeschlagen worden, beispielsweise direkte DNA-Aufnahme, Mikroinjektion von reiner DNA und die Verwendung von viralen Vektoren oder Plasmidvektoren. Plasmidvektoren, die sich als besonders wirksam erwiesen haben, sind diejenigen, die von tumorinduzierenden (Ti) Plasmiden des Mikroorganismus Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, welcher der Verursacher der Kronengallenkrankheit in dikotylen Pflanzen ist. Diese Plasmide können durch Entfernung der tumorverursachenden Gene aus ihrer T-DNA modifiziert werden. Die so modifizierten Plasmide greifen dann nicht länger störend in das normale Pflanzenwachstum und die Differenzierung ein und können nach Insertion eines vorbestimmten Fremdgens in eine geeignete Stelle des Plasmids verwendet werden um die Expression des Proteins, das durch das genannte vorbestimmte Gen in Pflanzenzellen codiert wird, zu begünstigen. Insbesondere kann das Fremdgen in der Nähe einer der Grenzsequenzen oder zwischen die zwei Grenzsequenzen, die das T-DNA in intakten Ti- Plasmiden umgeben, inseriert werden. Hierzu kann beispielhaft auf folgende Aufsätze verwiesen werden:
- A. CAPLAN et al. "Introduction of Genetic Material into Plant Cells", Science, 18. November 1983, Bd. 222, S. 815-821;
- L. HERRERA-ESTRELLA et al. titled "Expression of chimaeric genes transferred into plant genes using a Tiplasmid-derived vektors", Nature, Bd. 303, Nr. E914, S. 209-213, 19 Mai 1983;
- L. HERRERA-ESTRELLA et al. "Light-inducible and chloroplast associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti-plasmid vector", Nature, Bd. 310, Nr. 5973, S. 115- 120, 12. Juli 1984;
- oder auf die europäische Patentanmeldung Nr. 0 116 718 (oder die US Anmeldung Nr. 570 646) oder auf die internationale Anmeldung WO 84/02913, veröffentlicht unter PCT.
Auf alle diese Literaturstellen wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Alle diese Arbeitsweisen bzw. Techniken liefern aber kein wirksames und relativ einfaches Verfahren für die Transformation/Umwandlung von Chloroplasten trotz des beträchtlichen Arbeitsaufwandes, der dem Thema gewidmet worden ist, und trotz des bereits großen Umfangs an Kenntnis, die erworben worden ist, insbesondere hinsichtlich der Produktion von Proteinen in Pflanzenzellen und des Transfers in die Chloroplasten. Tatsächlich stehen derzeit Vektoren für die direkte Transformation von Chloroplasten nicht zur Verfügung. Außerdem können reife Proteine, einschließlich derjenigen, die normalerweise in den Pflanzenzellen codiert werden und die genannten Chloroplasten einschließen und schließlich auf natürliche Weise aus diesen Chloroplasten isolierbar sind, als solche nicht dazu veranlaßt werden, in die Chloroplasten einzudringen, wenn sie von außen zugeführt werden.
Die meisten Chloroplastenproteine werden in der DNA des Zellkerns codiert und sind die Produkte von Proteinsynthese auf cytoplasmischen Ribosomen, viele als lösliche höhermolekulare Vorläufer²&supmin;&sup9;. Diese Vorläufer werden dann durch entweder eine oder beide Hüllmembranen des Plastids transloziert, prozessiert und zu ihrem endgültigen organellaren Kompartiment oder Holoenzymkomplex zusammengestellt. In vitro Rekonstitutionsexperimente unter Verwendung von isolierten Chloroplasten haben gezeigt, daß die Aufnahme und das Processing von mehr als 100 kerncodierten cytoplasmisch synthetisierten Vorläufern durch Chloroplasten durch einen energieabhängigen¹&sup7; post-translationalen Mechanismus6, 10-17 erfolgt.
Das am ausführlichsten charakterisierte dieser kerncodierten Chloroplastenproteine ist die kleine Untereinheit von Ribulose-1,5- diphosphat(RuBP)-Carboxylase. Dieses Polypeptid wird auf freien Cytoplasma-Ribosomen als ein Vorläufer mit 20 000 Dalton synthetisiert der eine aminoterminale Verlängerung oder ein Transitpeptid von etwa 5 bis 6 000 Dalton enthält6-7, 9. Während oder unmittelbar nach dem Einbringen des Vorläufers in den Chloroplasten wird das Transitpeptid proteolytisch in zwei Stufen durch eine lösliche Protease entfernt¹&sup8;, wobei das reife kleine Untereinheit-Polypeptid von 15 000 Dalton erhalten wird. Dieses Polypeptid wird dann mit (einer) endogenen (großen) Untereinheit zu dem funktionellen RuBP Carboxylase-Holoenzym zusammengebaut11, 12.
Ähnliche Beobachtungen wurden mit den Chlorophyll a/b Bindungs- Proteinen gemacht. Diese Polypeptide werden als lösliche Vorläufer auf Cytoplasmid-Ribosomen synthetisiert (Apel und Kloppstech, 1978; Schmidt et al., 1981) und werden post-translational in Chloroplasten transloziert. Während oder nach der Translokation werden die NH&sub2;-terminale Transitpeptide proteolytisch gespalten (Schmidt et al., 1981) und liefern die reifen Polypeptide. Die mit Chlorophyll a und b assoziierten reifen A und B Polypeptide werden in die Thylakoid- Membran integriert. Die Transitpeptide von posttranslational transportierten Chloroplastenproteinen sind durch ein starkes Überwiegen von basischen Aminosäuren gekennzeichnet, ein Merkmal, das als wichtig bei der Wechselwirkung des Transitpeptids mit der Chloroplastenhülle angesehen wird¹&sup9;. Ein Vergleich von Transitpeptiden von kleinen Untereinheitvorläufern aus verschiedenen Pflanzenarten zeigt eine Variation bzw. Schwankung in der Aminosäuresequenz, aber eine relativ starke Beibehaltung bzw. Konservierung in der Stellung von Prolinen und geladenen Aminosäureresten²&sup0;&supmin;²² und eine wesentliche oder praktische Homologie in einer Region, die die Spaltstelle der Vorläufer umgibt, wie bei Sojabohnen (Berry-Lowe et al.; 1982), Erbsen (Cashmore, 1983), Entengrütze bzw. Wasserlinse (Stiekema et al.; 1983) und Weizen (Broglie et al.; 1983) beobachtet wurde. Diese gemeinsamen Eigenschaften können von funktioneller Bedeutung sein, da sowohl in vitro11,12 als auch in vivo²³ die kleinen Untereinheitvorläufer von einer Pflanzenart importiert und von den Chloroplasten anderer (Pflanzenarten) korrekt prozessiert werden können und umgekehrt.
Wie die posttranslationale Translokation von Polypeptiden in Chloroplasten auf molekularer Basis abläuft und welche Signale an diesem Verfahren beteiligt sind, insbesondere die anteiligen Beiträge des Transitpeptids und des reifen Proteins an dem Mechanismus der Aufnahme und des Processing, sind noch nicht voll aufgeklärt, obwohl bereits angenommen wurde, daß das Transitpeptid für die Translokation des reifen Proteins benötigt wird. In Übereinstimmung damit steht die Beobachtung, daß das reife kleine Untereinheiten-Protein nicht in Chloroplasten transloziert wird²&sup4;.
Die Erfindung beruht auf verschiedenen Beobachtungen, die von den Anmeldern gemacht wurden, als Ergebnis weiterer Untersuchungen der Translokationsmechanismen durch die Chloroplastenmembrane von Chloroplastenproteinvorläufern, die von der DNA des Zellkerns von Pflanzenzellen codiert werden. Es scheint als Ergebnis von weiteren mit RuBP durchgeführten Untersuchungen, daß kein Cytoplasma-Faktor für den Translokationsmechanismus selbst benötigt wird.
Weiterhin wurde gefunden, daß alle für die Translokation und den Tranport des reifen Proteins oder einer Untereinheit davon durch die Chloroplastenmembranen erforderliche Information innerhalb der Vorläuferuntereinheiten und sogar innerhalb der einzigen normalerweise damit assoziierten Transitpeptide beheimatet ist. Es zeigt sich auch, daß Transitpeptide nicht nur Translokation vermitteln, sondern auch Information enthalten, die für stellenspezifisches Processing der entsprechenden Proteine notwendig sind.
Diese verschiedenen Eigenschaften der Transitpeptide sind nützlich in rekombinierten DNAs, insbesondere rekombinanten Vektoren, die eine DNA-Seguenz einschließen, welche für ein bestimmtes Protein oder Polypeptid codiert, vor allem für ein Fremdprotein, das in Chloroplasten eingeführt und dort prozessiert werden soll, sowie in Verfahren für das Einführen eines solchen Fremdpolypeptids oder -proteins in die Chloroplasten, beispielsweise in die Tylakoid-Membrane oder vorzugsweise in deren Stroma. In der Tat besteht ein wesentliches Element von solchen rekombinanten Vektoren aus einer DNA-Sequenz, die für ein Transitpeptid codiert. Dieser Ausdruck, in der gesamten Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet, bezeichnet die in irgendeinem Chloroplastenproteinvorläufer enthaltene Aminosäuresequenz, die nach Import des Vorläufers proteolytisch während oder unmittelbar nach dem Import des Vorläufers in den Chloroplasten entfernt wird, um entweder das entsprechende funktionelle reife Protein oder eine Untereinheit davon zu liefern, vor allem wenn, wie im Falle von RuBP das abschließende Processing des reifen Proteins innerhalb des Chloroplasten stattfindet. Ein solches abschließendes oder endgültiges Processing umfaßt beispielsweise das Zusammenstellen bzw. den Zusammenbau der genannten Untereinheit mit einer anderen endogenen Untereinheit, um das Endprodukt funktionelles Protein zu erhalten. Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Bereitstellung eines Fremdproteins oder -polypeptids in einem Chloroplasten einer Pflanzenzelle durch folgende Stufen gekennzeichnet:
A. Exprimieren eines chimären Vorläufers des genannten Fremdproteins oder -polypeptids im Cytoplasma der genannten Zelle; dabei wird der Vorläufer durch eine chimäre DNA-Sequenz im Genom der genannten Zelle codiert, und die genannte chimäre DNA-Sequenz umfaßt:
i) eine erste Nucleinsäuresequenz, die für ein Transitpeptid eines cytoplasmischen Vorläufers eines Chloroplastenproteins oder -peptids einer Pflanzenart codiert und
ii) eine zweite Nucleinsäuresequenz, die für das genannte Fremdprotein oder -polypeptid codiert, das heterolog ist gegenüber der ersten Nucleinsäuresequenz und das sich stromabwärts von der ersten Nucleinsäuresequenz und in der gleichen Transkriptionseinheit befindet wie die erste Nucleinsäuresequenz; und darauf
B. Transportieren des genannten Fremdproteins oder -polypeptids vom Cytoplasma der genannten Zelle in den genannten Chloroplasten unter Entfernung des genannten Transitpeptids aus dem Fremdprotein oder -polypeptid.
Erfindungsgemäß werden weiterhin bereitgestellt: Pflanzenzellen, Pflanzenzellkulturen und Pflanzen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt worden ist, sowie Samen solcher Pflanzen. Die rekombinierte DNA nach der Erfindung, die in Pflanzenzellen eingeführt werden kann, ist durch das Vorhandensein darin eines chimären Gens charakterisiert, welches eine erste Nucleinsäure und eine zweite Nucleinsäure, miteinander rekombiniert, enthält, wobei die erste Nucleinsäure und die zweite Nucleinsäure von unterschiedlicher Herkunft sind, insbesondere einander gegenüber fremd sind, wobei die erste Nucleinsäure eine erste codierende Sequenz enthält, die wesentliche Sequenzhomologie mit einer natürlichen Gen-Sequenz aufweist, die für ein Transitpeptid codiert, das zu einem Vorläufer gehört, der mindestens die N-terminale Untereinheit eines Chloroplastenproteins umfaßt, die in den Chloroplasten der Pflanzenzellen transportiert oder innerhalb dieser prozessiert werden kann, und wobei die zweite Nucleinsäure eine zweite codierende Sequenz enthält, die von der Gen- Sequenz, welche für das Chloroplastenprotein oder die Chloroplastenprotein-Untereinheit codiert verschieden ist, und wobei die zweite Nucleinsäure stromabwärts von der ersten Nucleinsäure in Richtung der Transkription ihrer ersten bzw. zweiten Sequenzen gelegen ist. In gemeinsamen Anstrengungen haben die Erfinder zur Lösung des gestellten Problems, d. h. für die Bereitstellung von Verfahren und Mitteln zum Transportieren eines Proteins in Chloroplasten zwei Hauptwege entwickelt; beiden Wegen ist die Verwendung von DNA-Rekombinanten gemeinsam, die alle eine Sequenz einschließen, welche für ein Transitpeptid codiert. Diese beiden Wege führen zu den beiden bevorzugten Ausführungsformen, die nachfolgend als Beispiele erläutert werden und die sich beide als wirksam erwiesen haben.
Beispiel I erläutert den ersten Weg, bei welchem die Möglichkeit in Rechnung gestellt wurde, daß ein größerer Teil der Zellkern-Gene, einschließlich der gesamten Region hoher Homologie um die Spaltstelle der Vorläufer herum ein notwendiges Erfordernis für Transport und Processing von Proteinen, insbesondere von Fremdproteinen in Chloroplasten sein würde. Dies führte zu einer ersten Reihe von bevorzugten rekombinierten DNAs nach der Erfindung, insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß die erste Nucleinsäure, wie oben definiert, eine dritte Sequenz enthält, welche zumindest teilweise einer Nucleinsäure korrespondiert, die die N-terminale Cytoplasma-Untereinheit eines Chloroplastenproteins stromabwärts von der ersten Sequenz codiert und daß das Ende der dritten Sequenz direkt praktisch dem Ende der ersten Nucleinsäure benachbart ist bzw. diesem anliegt.
Vorzugsweise erstreckt sich die dritte Sequenz nicht über die Nucleotide hinaus, die das C-terminale Ende der Cytoplasma-Untereinheit des Chloroplastenproteins codieren, umfaßt jedoch ein Intron, vor allem dasjenige, das ursprünglich dem gleichen Gen angehört, wie die Exons, die die Peptidbereiche codieren, die abschließend die Vorläuferuntereinheit des entsprechenden natürlichen Chloroplastenproteins liefern.
Es wird gezeigt werden, daß eine bevorzugte Ausführungsform einer DNA- Rekombinanten, die dem obengenannten ersten Weg entspricht, eine erste Sequenz einschließt, die das Transitpeptid codiert und eine dritte Sequenz, die ursprünglich dem gleichen Gen angehörte und die die ersten 22 Aminosäuren des kleinen Untereinheit-Gens (rbcS) von Pisium sativum (Cashmore, 1983) codiert, daß das dritte Gen dann mit dem codierenden Bereich eines Fremdproteins fusioniert wird, beispielsweise mit dem nptII-Gen, das für Neomycin-phosphotransferase II (npt(II) Gen, erhalten aus einem Tn5 Transposon) codiert.
Beispiel II erläutert die Deutung oder Konstruktion, die mit Hilfe des zweiten Weges zur Lösung der gleichen Probleme unternommen werden kann. Bei dieser Ausführungsform wurde die nptII codierende Sequenz direkt in die Transitpeptid-codierende Sequenz fusioniert, so daß die potentielle Proteinspaltungsstelle keine Aminosäuren enthielt, die sich von dem reifen kleinen Untereinheit-Protein ableiteten, ausgenommen Methionin, welches auf die letzte Aminosäure des Transitpeptids folgt. Allgemeiner und bevorzugt ist das erste Codon der zweiten Sequenz (die das Protein, insbesondere ein Fremdprotein, dessen Translokation in die Chloroplasten angestrebt wird, codiert) unmittelbar benachbart dem letzten Codon in der genannten ersten DNA-Sequenz, die für das Transitpeptid codiert. So wird, vor allem wenn die obengenannte zweite Sequenz ein Polypeptid oder Protein codiert, das sich von dem Chloroplastenprotein unterscheidet, welches normalerweise mit dem Transitpeptid, das durch die erste Sequenz codiert wird, assoziiert ist, die der genannten ersten Sequenz in dem genannten chimären Gen zunächst benachbarte Nucleotidsequenz allgemein (möglicherweise ausgenommen ein erstes Codon, das für Methionin codiert) frei von Sequenzhomologie mit der Nucleotidsequenz, welche den endterminalen Teil des normalen Chloroplastenproteins codiert, sein. Es kann aber das letzte Codon der ersten Sequenz und das erste Codon der zweiten Sequenz durch eine beliebige Anzahl von Nucleotid-Tripletts, vorzugsweise in Abwesenheit irgendeines Introns oder Stop-Codons getrennt sein. Beispielsweise kann eine "dritte Sequenz", die die ersten Aminosäuren des reifen Proteins codiert, das normalerweise mit dem betreffenden Transitpeptid in dem entsprechenden natürlichen Vorläufer assoziiert ist (vor allem diejenigen, welche von dem Exon codiert werden, das die erste Sequenz, welche das Transitpeptid codiert enthält) zwischen der ersten und der zweiten Sequenz vorhanden sein. Diese "dritte Sequenz" kann aus dem Bereich hoher Homologie bestehen, den die N-terminalen Teile der Cytoplasma-Vorläuferuntereinheiten von Chloroplastenproteinen von Sojabohnen, Erbsen, Wasserlinse und Weizen gemein haben. Beispielsweise codiert eine solche "dritte Sequenz" (sowohl bei den Konstruktionen, die aus dem "ersten Weg" resultieren als auch bei den Konstruktionen aus dem "zweiten Weg", wie oben betrachtet) die Pentapeptidsequenz M-Q-V-W-P. Diese Buchstaben entsprechen den Standardbezeichnungen der natürlichen Aminosäuren abgekürzt durch einen Buchstaben. Offensichtlich können andere "dritte Sequenzen" von Nucleotidsequenzen stromaufwärts oder/und auch stromabwärts der oben definierten zweiten Sequenz soweit in Betracht gezogen werden, wie die codierten Aminosäuresequenzen nicht wahrscheinlich die biologischen Eigenschaften des dann gebildeten und in die Chloroplasten translozierten Hybridproteins verändern. Aber bei den am meisten bevorzugten Konstruktionen bzw. Ausführungsformen dieses Typs wird die zweite Sequenz vorzugsweise in Phasen-Register mit der ersten Sequenz fusioniert, die daran unmittelbar anliegt, wie oben erwähnt, oder davon durch nicht mehr als eine kurze Peptidsequenz getrennt ist, wie diejenige, die durch einen synthetischen Nucleotid-Linker codiert wird, der möglicherweise zur Durchführung der Fusion verwendet wird. Wie von Beispiel II gezeigt, ist eine solche Konstruktion dann in der Lage, die Translokation in die Chloroplasten irgendeines Proteins oder Proteinfragmentes mit geregelter Aminosäuresequenz sicherzustellen, beispielsweise ein Bakterienprotein oder -proteinfragment oder ein synthetisches Polypeptid, frei von Hybridisierung, mit irgendeiner bestimmten Peptidsequenz, die auch ein Chloroplastenprotein oder Vorläufer besitzt.
Es sei darauf hingewiesen, daß in den vorangegangenen Definitonen "Transitpeptid" die oben angegebene breite Bedeutung hat. Das Transitpeptid kann weiterhin, je nach der Pflanzenart die transformiert werden soll, ausgewählt werden, obwohl, wie vorher erwähnt, Transitpeptide oder kleinere Untereinheit-Vorläufer, die solche Transitpeptide enthalten, häufig nicht pflanzenspezifisch sind. Untereinheiten-Vorläufer einer Pflanzenart können häufig importiert und von Chloroplasten einer anderen Pflanzenart direkt prozessiert werden.
Bevorzugte DNA-Sequenzen, die ein Transitpeptid zur Verwendung bei den DNA-Rekombinanten gemäß der Erfindung codieren, entsprechen irgendeiner der Sequenzen, die ein Transitpeptid assoziiert mit der kleinen Untereinheit von RuBP von Erbsenzellen oder auch von Weizen- oder Sojabohnenzellen codieren.
Bevorzugte "erste Nucleotidsequenzen", die für Transitpeptide codieren, werden nachfolgend lediglich beispielhaft definiert bzw. angegeben. Dabei ist zu beachten, daß die Buchstaben oberhalb der Linien, die sich auf die Nucleotidsequenz per se beziehen, die aufeinanderfolgenden Aminosäuren bezeichnen, die von den aufeinanderfolgenden Tripletts der Nucleotidsequenz codiert werden. Die Buchstaben unterhalb besagter Linie entsprechen den Bezeichnungen von Nucleotiden, die anstelle der Bezeichnungen unmittelbar über ihnen in der Nucleotidsequenz verwendet werden können:
Selbstverständlich können DNA-Sequenzen, die für andere Transitpeptide codieren, ebenfalls bei der Konstruktion des chimären Gens nach der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können "erste Sequenzen" innerhalb der Bedeutung dieser Anmeldung aus einer Sequenz bestehen, die das Transitpeptid des licht-erntenden Chlorophyll a/b-Proteinkomplexes codiert, üblicherweise in Thylakoid-Membranen lokalisiert wie:
Die für das Transitpeptid codierende DNA-Sequenz ist vorteilhafterweise der natürliche Zellkern-DNA-Genbereich oder eine cDNA, erhalten aus der entsprechenden mRNA.
Natürlich können diese durch irgendeine andere DNA-Sequenz, die ähnliche bzw. gleichartige Aminosäuresequenzen codiert, ersetzt werden. Beispielsweise kann in Betracht gezogen werden, eine synthetisch produzierte DNA-Sequenz einzusetzen, in der einige der Codons sich von den entsprechenden Codons in der natürlichen DNA- Sequenz unterscheiden, aber dennoch für die gleichen entsprechenden Aminosäuren codieren. In diesem Zusammenhang wird der Begriff "Transitpeptid" auch so verwendet, daß er sich auf irgendein Peptid erstreckt, das sich von einem natürlichen Transitpeptid auf der Ebene einiger der Aminosäuren unterscheidet, und zwar soweit die in Betracht gezogenen Substitutionen die Fähigkeit des erhaltenen Peptids nicht beinträchtigen, die Translokation in den Chloroplasten des Fremdpolypeptids oder -proteins zu begünstigen, das von der DNA-Sequenz codiert wird, welche mit der Sequenz, die ein solches Peptid codiert, assoziiert oder ihr benachbart ist. Daher können die chimären Gene nach der Erfindung mit irgendeiner "ersten Sequenz" konstruiert werden, die substantielle Sequenzhomologie mit einer natürlichen DNA- Sequenz, die ein natürliches Transitpeptid codiert, besitzt. Das von der oben genannten "zweiten Sequenz" codierte Protein oder Polypeptid kann aus irgendeinem Protein oder Polypeptid bestehen, das in die Chloroplasten von bestimmten Pflanzen eingeführt oder in diesen prozessiert werden soll. Infolgedessen ist die dafür codierende DNA- Sequenz allgemein fremd oder heterolog mit Bezug auf die DNA-Sequenz, die das Polypeptid oder Protein codiert, welches üblicherweise mit dem gewählten Transitpeptid assoziiert ist. Anders gesagt: Die erste DNA- Sequenz und die zweite DNA-Sequenz stammen für gewöhnlich aus verschiedenen Quellen. Vor allem die zweite Sequenz wird ein Fremdprotein oder -polypeptid z. B. bakterieller Herkunft codieren. Aber die Erfindung erstreckt sich auch auf Proteine, die von Natur aus endogen sind in Chloroplasten von Pflanzen, die sich von der oben in Betracht gezogenen "bestimmten Pflanze" unterscheiden oder auch in Chloroplastenproteinen, die natürlichen Chloroplastenproteinen der gleichen Pflanze entsprechen, sich aber davon nur durch ein paar Aminosäuren unterscheiden ("mutiertes Protein"). Arbeitsweisen bzw. Techniken, um solche Mutation zu dirigieren (entweder in der ersten Sequenz oder in der zweiten Sequenz) werden beispielhaft in einer Veröffentlichung von S. Gutteridge et al., "A site specific mutation within the active site of ribulose-1,5-diphosphate carboxylase of "Rhodospirillum rubrum" (1984) angegeben.
Weiterhin umfaßt das chimäre Gen einer bevorzugten DNA-Rekombinanten nach der Erfindung einen Promotorbereich stromaufwärts der oben erwähnten fusionierten Sequenzen unter solchen Bedingungen, daß, wenn das genannte chimäre Gen in einen geeigneten Vektor inseriert wird, die Transkription von beiden obengenannten ersten und zweiten Sequenzen unter der Kontrolle des genannten Promotors sind. Der oben in Betracht gezogene Promotorbereich sollte natürlich unter denjenigen ausgewählt werden, die von den Polymerasen erkannt werden, welche der Pflanze, die transformiert werden soll, endogen sind. Von besonderem Vorteil sind die in Erbsen-, Weizen-, Sojabohnen- oder Tabakzellen wirksamen Promotoren. Der Promotor kann derjenige sein, der normalerweise mit der Sequenz, die das gewählte Transitpeptid codiert, assoziiert ist. Er kann aber auch davon verschieden sein. Ein Konstruktionsbeispiel für die Verwendung eines anderen Promotors wird weiter unten in den Beispielen angegeben. Beispielsweise sind geeignete Promotoren solche, die zu den Genen von Plastocyanin, Ferredoxin- NADP&spplus;, Oxydoreductase usw. gehören. Andere geeignete Promotoren sind in der Literatur, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, beispielhaft angegeben.
Vorzugsweise steht die Sequenz, die für das Transitpeptid codiert, unter direkter Kontrolle des gewählten Promotors. Dies bedeutet, daß das erste Nucleotid-Triplett, das unter der Kontrolle des Promotors transcribiert und exprimiert wird, vorzugsweise dasjenige der Sequenz, die das Transitpeptid codiert, ist. Dies ist natürlich nicht kritisch, wie beispielsweise durch das erste Beispiel belegt.
Schließlich bezieht sich die Erfindung auch auf rekombinante Vektoren, vor allem auf Plasmide, die in Pflanzenzellen eingeführt und dort gehalten werden können und die das oben genannte chimäre Gen enthalten, einschließlich des oben definierten Promotorbereichs.
Bevorzugte Vektoren dieses Typs sind diejenigen, die sich von den oben genannten Ti-Plasmiden ableiten. Mehr bevorzugt umfaßt ein bevorzugter Vektor dieses Typs zusätzlich zu dem chimären Gen ein DNA-Fragment, das mit Bezug auf das genannte Fremdgen zweckmäßig angeordnet ist und wesentliche Sequenz-Homologie mit der DNA eines Ti-Plasmids, welches ein T-DNA-Fragment einschließt, aufweist; der Vektor umfaßt weiterhin die Sequenzen, die die wesentlichen Funktionen codieren, welche in der Lage sind, den Transfer des T-DNA-Fragmentes und des chimären Gens in die Pflanzenzellen zu verursachen. Insbesondere enthält ein bevorzugter Vektor nach der Erfindung eine T-DNA-Grenzsequenz und das chimäre Gen ist benachbart dazu angeordnet. Bezüglich allgemeiner Verfahren zum Inserieren des chimären Gens in Ti-Plasmide wird beispielhaft auf die oben genannten Patente bzw. Patentschriften verwiesen.
Vorteilhafterweise sollte die DNA-Rekombinante (sowohl des chimären Gens als solchem oder auch des Vektors, welches es enthält) vorzugsweise die geeignete stelle für die Initiierung der entsprechenden RNA- Transkription stromaufwärts des ersten Codons, das translatiert werden soll, in den meisten Fällen ein ATG-Codon, enthalten. Von Vorteil ist es auch, wenn die DNA-Rekombinante stromabwärts des Fremdgens, das exprimiert werden soll, geeignete Signale für Transkriptionstermination und Polyadenylierung enthält.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Ausführung und Regelung der Einführung eines bestimmten Proteins oder Polypeptids (oder eines Fragmentes eines solchen Proteins oder Polypeptids) in die Chloroplasten von bestimmten Pflanzenzellen. Es kann auf irgendein geeignetes Verfahren zur Durchführung dieses Einbaues zurückgegriffen werden. Vorteilhafterweise verwendet man Vektoren des beispielhaft erläuterten und durch ein chimäres Gen nach der Erfindung modifizierten Typs, die eine "zweiten codierende Sequenz" umfassen, welche ein Protein oder Polypeptid codiert. Es kann aber von jedem anderen Verfahren Gebrauch gemacht werden. Beispielsweise kann ein chimäres Gen nach der Erfindung einfach mit Hilfe der Calciumchlorid-Polyethylenglykol Fällungsmethoden in die Pflanzenzellen inseriert werden oder auch durch Mikroinjektion in die Pflanzenzellen.
Weitere Merkmale der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der Bedingungen hervor, unter denen die strukturellen Erfordernisse für Vektoren bestimmt wurden, die in der Lage sind, Pflanzenzellen zu transformieren, um schließlich ein bestimmtes Fremdgen-Produkt zu verursachen in Chloroplasten inseriert zu werden. Bezug genommen wird auf die Zeichnungen; in diesen zeigen:
- Fig. 1A diagrammatisch die aufeinanderfolgenden Stufen der Konstruktion von bevorzugten DNA-Rekombinanten, einschließlich eines Vektors, der für die Transformation von Pflanzenzellen geeignet ist, enthaltend ein chimäres Gen, entsprechend einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
- Fig. 1B zeigt die Struktur des charakteristischen Teils des chimären Gens nach der Erfindung, das die oben genannten DNA-Rekombinanten einschließt.
- Fig. 2 zeigt die Ergebnisse, die bei Southern Hybridisierungsversuchen mit DNA-Rekombinanten nach der Erfindung erhalten wurden, und zwar mit Bezug auf den Nachweis, des Einbaus des oben genannten chimären Gens in das Genom von Pflanzenzellen;
- Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Organisation der Genfusion und der Pflanzen-Vektor-Sequenzen des Vektors von Fig. 1A, modifiziert durch das genannte chimäre Gen.
- Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von RNA-Hybridisierungsversuchen, die mit Bezug auf den Nachweis der transkriptionellen Aktivität des in dem chimären Gen nach der Erfindung eingeschlossenen Promotors durchgeführt wurden.
- Fig. 5A und 5B zeigen vergleichende Ergebnisse von Transkriptionsversuchen unter der Kontrolle eines lichtabhängigen Promotors in Pflanzenmaterialien transformiert durch die DNA-Rekombinanten nach der Erfindung.
- Fig. 6A zeigt die Ergebnisse von Versuchen, die darauf abzielten, den Transport der Produkte, die von dem oben genannten chimären Gen codiert wurden, in Chloroplasten von Pflanzenzellen zu zeigen.
- Fig. 6B ist eine graphische Darstellung der relativen Mobilität der verschiedenen Aktivitäten des in Fig. 6A nachgewiesenen Gen- Produktes.
- Fig. 7 zeigt die Ergebnisse von Assays bzw. Versuchen (um die lichtabhängige Expression des von dem chimären Gen codierten Fusionsproteins zu zeigen).
- Fig. 8A zeigt diagrammatisch die aufeinanderfolgenden Stufen bei der Konstruktion von bevorzugten DNA-Rekombinanten gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, sowie von anderen DNA-Rekombinanten für Untersuchungszwecke.
- Fig. 8B zeigt die Aminosäuresequenzen, die von einem Teil eines chimären Gens codiert werden, das diagrammatisch in Fig. 8A gezeigt ist, vor allem an der Berührungszone der DNA-Sequenz, die für das ausgewählte Transitpeptid eines Gens codiert, welches den Aminoterminus der bakteriellen Neomycin-Phosphotransferase II (NPT (II)) codiert, die als Modell eine Proteins bakterieller Herkunft, das in die Chloroplasten transportierbar ist, verwendet wurde.
- Fig. 9 ist eine diagrammatische Wiedergabe eines anderen beispielhaft belegten chimären Gens nach der Erfindung.
- Fig. 10 bis 13 sind Autoradiogramme der Beobachtungen, die in Gel-Trennung-Versuchsreihen gemacht wurden, die weiter unten beschrieben werden.
In den folgenden Beispielen diente der eingeschlagene Weg der Konstruktion eines chimären Gens, das ein Fusionsprotein codiert, welches das Transitpeptid des Vorläufers der kleinen Untereinheit von RuBP- Carboxylase aus der Erbse enthält, sowie eine codierende Sequenz der bakteriellen Neomycin-Phosphotransferase (II) (abgekürzt als NPT(II)). Das NPT(II)-Protein wurde gewählt, weil NPT(II)-Protein Pflanzen Kanamycinresistenz verleiht (HERRERA-ESTRELLA et al., 1983, FRALEY et al., 1983, BEVAN et al., 1983), Fusionsproteine biologisch aktiv sind (Reiss et al, 1984b) und weil ein enzymatischer Assay für den in situ Nachweis von NPT(II) oder NPT(II)-Fusionsproteinen in nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen vor kurzem beschrieben worden ist&sup4;&sup7;. Dieses Verfahren ist besonders brauchbar um prozessierte Formen von nichtprozessierten Formen des Fusionsproteins zu unterscheiden.

Beispiel 1

Allgemeine Verfahrensweise

Konstruktion von Plasmiden pSNIP und pSNIF, die das chimäre Gen (tt-ss nptII) enthalten.
Ein Genom-Klon für eines der rbcS Gene der Erbse wurde von Dr. A. CASHMORE, Rockefeller University, New York isoliert, sequenziert und verfügbar gemacht (pPSR6). Aus diesem Klon wurden die Promotorsignale (CASHMORE 1983; HERRERA-ESTRELLA et al., 1984), das erste Exon, das für das rbcS Transitpeptid codiert und die zwei ersten Codons des reifen kleinen Untereinheiten-Proteins, gefolgt von dem ersten Intron (83pb) und einem Teil des zweiten Exon (66bp), die/das für den Aminoterminus des reifen kleinen Untereinheit-Proteins codieren/codiert, über eine Sau3A Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle mit der BamHI-Stelle des Plasmids pKm109/9 (REISS et al., 1984b), das den Codierungsbereich für das nptII Gen von Tn5 enthält, fusioniert (BECK et al., 1982).
Das erhaltene Fusions-Gen, das die Transitsequenz (56 Codons) enthielt und 22 Codons des reifen rbcS Gens, gebunden über sieben künstliche Codons an das zweite Codon des nptII Gens (Fig. 1B) erwiesen sich als ähnlich bzw. gleichartig aktiv. Der Umfang bzw. die Größe des codierenden Bereiches des nptII Gens betrug 1130 bp. Die Fusions- Verbindung wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert (keine Daten angegeben) (MAXAM und GILBERT, 1977). Das chimäre Protein sollte eine Größe von Mr 38 023 in der nichtprozessierten Form und von Mr 32 298 in der prozessierten Form aufweisen. Hybridisierungsdaten (Fig. 2) vom Southern Typ (SOUTHERN 1975) bestätigten, daß die transformierten Pflanzengewebe die chimären Gen-Konstrukte in der DNA des Zellkerns enthielten und daß keine nachweisbaren DNA-Umlagerungen während der Integration stattgefunden hatten. Eine schematische Darstellung der Ergebnisse ist in Fig. 3 gegeben.
Eine detailliertere Beschreibung der Konstruktion wird nachfolgend gegeben, insbesondere mit Bezug auf die Fig. 1A, 1B und 3. Produktion von Vektoren, die Pflanzen transformieren können.
Um die chimären Gene in das Kern-Genom von Pflanzen einzuführen, wurde das Plasmid in die T-DNA von pGV3851 und von pGV3850 inseriert, beides sind Derivate des Ti Plasmids pTIC58, in dem Teile der T-DNA durch pBR322 substituiert worden sind (ZAMBRYSKI et al. 1983, 1984). Die T- DNA von pGV3851 enthält noch die Gene, die für Transkripte 4, 6a und 6b codieren (WILLMITZER et al., 1983), was zu einem teratomartigen Wachstum des transformierten Gewebes führt (JOOS et al. 1983), während alle tumorkontrollierenden Gene in pGV3850 eliminiert worden waren, mit dem Ergebnis, daß die mit diesem Vektor transformierten Pflanzenzellen differenzieren und wie normale Pflanzen wachsen können (ZAMBRYSKI et al., 1983; DE BLOCK et al., 1984). Die Gen-Konstruktionen wurden in pGV3850 und pGV3851 Ti-Plasmide durch homologe Rekombination nach Mobilisierung aus E. coli zu Agrobacterium mit Hilfe der Plasmide R64drd11 und J G28 eingeführt (VAN HAUTE et al., 1983)
Cointegrate wurden auf Spectinomycin und Streptomycin enthaltenen Platten selektiert und ihre Struktur wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung (SOUTHERN 1975) verifiziert unter Verwendung verschiedener Teile der Konstruktionen als Sonden (Ergebnisse nicht gezeigt).

Pflanzen-Transformation

Die chimären Gene wurden in Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 oder SR1 eingeführt durch Inokulieren eines verletzten Pflänzchens oder durch Cokultivierung von Protoplasten mit Agrobacterium. Durch Verletzen erhaltenes transformiertes Material wurde bezüglich der Anwesenheit von Nopalin-Synthaseaktivität, einem cotransferierten Marker, gescreent (OTTEN 1982). Transformanten (pGV3851: :pSNIP) wuchsen auf 250 ug/ml Kanamycin als grünes Teratoma-Gewege und legten nahe, daß ein funktionelles chimäres Gen vorhanden und transkribiert war. Bei Cokultivierungsversuchen wurden N. tabacum SR1 Protoplasten mit Agrobacterium, das (pGV3850::SNIF) enthielt, inkubiert und nach zwei Wochen mit 100 ug/ml Kanamycin selektiert. Aus 9 individuellen Kolonien, die beim Test auf NPTII-Aktivität positiv waren, wurde eine ausgewählt und unter konstantem ausgewählten Druck zu einer vollständig normal aussehenden Pflanze regeneriert. Die genetische Analyse zeigte die Vererbung des NPTII-Markers in einer klassischen Mendelschen Erbfolge. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Transkripte der chimären Gene richtig prozessiert, aus dem Zellkern heraustransportiert und in ein funktionell aktives Protein translatiert worden waren

Lichtinduktion des chimären Gens

Poly(A)+ und Poly(A)-RNA aus dem Wildtyp und aus transformierten Geweben (pGV3851::pSNIP) wurde isoliert und mit Hilfe der sogenannten "Northern"-Gel-Hybridisierungen analysiert. Wenn die codierende Region des nptII Gens (BamHI-SmaI Fragment aus pKM109/9) als Sonde verwendet wurde, wurde ein komplexes Hybridisierungsmuster mit RNAs beobachtet, deren Größe im Bereich von 5 500 Nucleotiden und 8 000 Nucleotiden lag. Diese RNAs wurden nur in im Licht gewachsenen bzw. gezüchteten Teratoma nachgewiesen. Vier Tage Dunkelheit nach einem Tag/Nacht- Rhythmus von 12 h führte zu einer deutlichen Abnahme der Signale (Fig. 4). Der sehr große Umfang dieser Transkripte ergibt sich wahrscheinlich aus der Tatsache, daß keine eigentlich Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminationsstelle in der Nähe des Translationsterminationssignals eingeführt worden war. Keine Signale von vergleichbarer Größe oder Stärke wurden bei Wildtyp Wisconsin 38 Tabak oder in Material beobachtet, das von einer Pflanze, die nur mit dem pGV3850 Vektor transformiert worden war, beobachtet (Fig. 4). Um die lichtabhängige Transkription des chimären Gens mit derjenigen des endogenen rbcS Gens und des Chloroplasten Gens, welches für die große Untereinheit von Rubisco (rbcL) codiert zu vergleichen, wurde Poly(A)+ und Poly(A)-RNA aus im Licht und im Dunkeln gezüchteten Teratoma zu spezifischen Sonden für jedes dieser Gene hybridisiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 5A gezeigt. Signale der endogenen rbcS Transkripte (850 Nucleotide) wurden an der erwarteten Stelle beobachtet. In gleicher Weise wurde ein Transkript von/aus 1750 Nucleotiden beobachtet, wenn eine rbcL-spezifische Probe verwendet wurde (ZURAWSKI et al. 1981). Die Ergebnisse legen nahe, daß der Promotor des rbcL-Gens, der in den Chloroplasten zu Hause ist, gegenüber Anregungen durch Licht weniger empfindlich oder empfänglich ist als sowohl das endogene rbcS als auch das neue eingeführte chimäre Gen. Dot-Blot-Versuche wurden eingeschlossen, um diese Ergebnisse zu quantifizieren (Fig. 5B). Die ame-Sonden wurden, wie zuvor erwähnt, verwendet. Individuelle Dots wurde ausgeschnitten und die Radioaktivität wurde gezählt. Ein Unterschied von etwa dem 25fachen wurde zwischen Poly(A)+RNA aus im Licht und im Dunkeln gezüchteten Teratomasprößlingen gemessen, die mit entweder rbcS oder nptII Sequenz sondiert worden waren. Im Gegensatz dazu betrug der Unterschied für Poly(A)-RNA, die spezifisch ist für rbcL Sequenzen, lediglich das 5fache. Diese Ergebnisse unterstützen die Northern-Experimente, welche anzeigten, daß die Transkripte des Chloroplasten-Gens, das für die große Untereinheit codiert, weniger empfänglich sind für den Einfluß von Licht im Vergleich mit dem Kern- Gen für die kleine Untereinheit. Zusätzlich scheint es, daß der Erbsen rbcS Promotor des induzierten chimären Gens eine Empfänglichkeit/Empfindlichkeit gegenüber unterschiedlichen Lichtsystemen besitzt, die vergleichbar ist derjenigen des endogenen Promotors oder der endogenen Promotoren, die im Tabak-Teratomagewebe gemessen wurde.

Merkmale von Fusionsproteinen

Um das zwischen dem Transitpeptid, dem NH&sub2;-terminalen Bereich der reifen kleinen Untereinheit und dem NPTII-Protein in Pflanzen gebildete Fusionsprotein nachzuweisen, wurde ein Versuch zum Nachweis der Phosphotranferase-II-Aktivität in rohen Pflanzenextrakten entwickelt. Die Methode wurde aus veröffentlichten Verfahren (REISS et al., 1984a) adaptiert und elimierte die meisten der endogenen selbstphosphorylierenden Proteine, die bei dem Versuch mit Proteinase K- Behandlung stören. Die in Fig. 6 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß NPTII-Aktivität in einem rohen Extrakt (Bahn 4) von Blättern von Tabakpflanzen, die das pGV3850::psNIF Konstrukt enthielten, nachgewiesen wurde. Die Aktivität wanderte in dem Gelassay bzw. -versuch mit einer Mobilität, die zwischen derjenigen des TP-NPTII Fusionsprotein (35,5 kd) und derjenigen des normalen NPTII Proteins (29 kd) aus Extrakten von E. coli (Bahn 1) lag. Die relative Mobilität der NPTII- Aktivität in Bahn 4 stimmte überein mit einer Schlußfolgerung, daß es die prozessierte Form des Vorläuferproteins ((SS-NPTII) darstellt, das ein theoretisches Molekulargewicht von 32 298 besitzt. Da der Polaritätsindex (CAPALDI und VANDERKOOI, 1972) der drei Proteine 41 für NPTII, 40 für SS-NPTII und 41 für TP-NPTII beträgt, ist es legitim, die drei Proteine durch ihre Mobilität auf nativen Polyacrylamidgelen zu vergleichen (siehe Fig. 6B). Das nichtprozessiert TP-SS- NPTII Protein hat nämlich ein Molekulargewicht von 38 000 und wird daher wahrscheinlich langsamer wandern als der TP-NPTII Marker. Das SS- NPTII Fusionsprotein wird in vitro nach Isolierung abgebaut, wobei aktive Subfragmente mit einer Mobilität, die derjenigen des normalen NPTII Enzyms nahe kommt entstehen. Daß die Spots bzw. Tüpfel für niedrigeres Molekulargewicht, die in den Fig. 6A und 7 zu sehen sind, auf unspezifischem Abbau beruhen, wurde gezeigt indem nachgewiesen wurde, daß dieses und andere NPTII Fusionsproteine tatsächlich sowohl in Bakterienextrakten wie in Pflanzenextrakten abgebaut werden (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Inkubierung in Gegenwart von Proteaseinhibitoren konnte diesen Abbau nicht vollständig verhindern. Keine Aktivität wurde in Kontrollextrakten aus Tabak nachgewiesen, bei denen das TP-SS-NPTII chimäre Gen fehlte (Bahn 3). Die in rohen Extrakten beobachtete SS-NPTII-Aktivität kann auch in isolierten Chloroplasten nachgewiesen werden (Bahn 2). Die relative Menge an nachgewiesener Aktivität in den Chloroplasten ist signifikant geringer als die in rohen Extrakten beobachtete Aktivität. Dies beruht vermutlich darauf, daß Aktivität aus den Chloroplasten während der Chloroplastenisolierung verloren geht. Das angewandte Verfahren zur Isolierung von Chloroplasten führte nämlich mit diesem speziellen Pflanzenmaterial zu einer wesentlichen Beschädigung der Chloroplasten. Mehr als 90% des Chloroplastenmaterials wurde entweder sichtbar beschädigt oder lief bei mit verminderter Dichte in den Percollgradienten. Weitere Manipulationen während der Rückgewinnung bzw. Isolierung und der Konzentrierung/Einengung vor dem NPTII Assay konnten zu weiterer geringfügiger Beschädigung beitragen, die zu einem signifikanten Verlust des Proteins durch Leckage führte. Diese Beobachtungen schließen nicht die Möglichkeit aus, daß obwohl das gesamte Vorläufer des TT-SS-NPTII Protein in die SS-NPTII Form prozessiert worden ist, es nicht tatsächlich insgesamt in vivo in das Stroma der Chloroplasten transportiert wird. Jedoch zeigen die erhaltenen Ergebnisse deutlich, daß zumindest ein Teil des prozessierten SS-NPTII Proteins sich innerhalb der Stromafraktion der Chloroplasten befindet. In der Tat wurde gezeigt, daß mit Chloroplasten assoziierte Aktivität innerhalb des Stromas lokalisiert ist, indem nachgewiesen wurde, daß gebrochene Chloroplasten keine nachweisbare NPTII-Aktivität enthielten und daß die NPT- Aktivität in intakten Chloroplasten nicht durch Trypsinbehandlung entfernt werden konnte (Ergebnisse nicht gezeigt). Ein weiterer Beweis dafür, daß die nachgewiesene SS-NPTII-Aktivität sich von dem eingeführten lichtinduzierbaren chimären Gen ableitet, wurde erhalten indem gezeigt wurde, daß die Aktivität signifikant abnahm, wenn Tabakpflanzen, die das pGV3850::psNIF Konstrukt enthielten und im Gewächshaus in einem 12 h Licht/Dunkel Zyklus gezüchtet worden waren (Fig. 7, Bahn 3), für 96 h in vollständige Dunkelheit überführt wurden (Fig. 7, Bahn 2).
Die Einzelheiten betreffend die Bedingungen unter denen die Konstruktionen von DNA Rekombinanten erhalten wurden und die angewandten Methoden zur Bewerten der oben aufgeführten Ergebnisse werden, soweit sie nicht aus der vorangehenden Diskussion erkennbar sind, nachfolgend näher erläutert.

Materialien und Methoden

Stämme und Plasmide

E. coli DH1 wurden für in vitro Transformation verwendet. Agrobacterium C58CIRif war Rezeptorstamm in allen bakteriellen Konjugationen. Die Konjugation folgte dem von Van Haute et al. (1983) und von ZAMBRYSKI et al. (1984) beschriebenen Protokoll.

DNA-Techniken

Restriktionsendonucleasen und andere DNA modifizierende Enzyme wurden verwendet wie von den Herstellern empfohlen. Andere Techniken wurden angewandt wie von MANIATIS et al. (1982) beschrieben.

Nopalin Assay

Das Vorhandensein oder die Synthese von Nopalin aufgrund der Expression des nos Gens in transformierten Kalli und regenerierenden Trieben aus diesen Kalli wurde entsprechend OTTEN (1982) überwacht.

Pflanzentransformation

Kleine axenisch wachsende Pflanzen wurden in 1/2 M+S Medium (MURASHIGE und SKOOG 1962) in Krügen gehalten und nach Decapitation mit Agrobacterium-Stämmen, wie beschrieben, inokuliert (ZAMBRYSKI et al., 1984). Verletzte Kalli wurden entfernt und auf ein Medium gegeben, das 0,2 mg/l Benzaminopurin und 0,6 mg/l Indolessigsäure sowie 0,5 mg/ml Cefotaxim (HOECHST) enthielt. Nach ca. 4 Wochen wurde das Kallusmaterial auf ein hormonfreies Medium transferiert und die auflaufenden Triebe wurden bezüglich der Nopalinproduktion getestet. Nopalinsynthase-positive Triebe wurden vermehrt und auf 100 bis 500 ug/ml Kanamycin getestet. Teratomatriebe, die auf Konzentrationen von 100 ug/ml oder höher wuchsen, wurden für die Analyse verwendet. Protoplasten wurden in Cokultur mit Agrobacteria gehalten, entsprechend MARTON et al. (1979), mit Modifizierungen, die von HAIN et al. (1985) beschrieben worden sind.

Analyse von DNA und RNA

DNA wurde entsprechend BEDBROOK (1981) aus Kernpräparaten isoliert. Die DNA wurde mit Restriktionsendonucleasen digeriert (10 bis 30 ug/Bahn, über Nacht Abbau mit einem 3fachen Überschuß an Enzym), auf Agarosegelen entsprechend der Größe getrennt und auf Nitrocellulosefilter transferiert (THOMAS 1983). Hybridisierung mit radioaktiven Sonden wurde in 50% Formamid, 4mal SSC, 10mal Denhardt's Lösung, 0,2 SDS und 0,1 ug/ml Kälberthymus-DNA bei 50ºC während 48 h ausgeführt (BOHNERT et al., 1982). Die Filter wurden 2mal während 15 min jeweils in 50%igem Formamid gewaschen, 4mal SSC bei Hybridisierungstemperatur, gefolgt von Waschen in 50%igem Formamid, 3mal SSC bei Raumtemperatur (1 bis 4 h) und 2mal SSC bei Raumtemperatur (1 h). Dot-Blot-Hybridisierungen wurden entsprechend THOMAS (1983) vorgenommen mit DNA Mengen, die einen Bereich von 1000 bis 0,1 Gen-Kopien je Probe abdeckten. Die Hybridisierung erfolgte wie oben beschrieben. RNA wurde entsprechend CHIRGWIN et al. (1979) isoliert und in Poly(A)+ und Poly(A)-RNA getrennt durch Leiten über Oligo-d(T)-Cellulose (Collaborative Research, Typ III), entsprechend dem Verfahren von AVIV und LEDER (1972). RNAs wurden entsprechend der Größe in 1%igen Agarosegelen, die 5 mM Methylquecksilberhydroxid enthielten, getrennt (BAILEY und DAVIDSON, 1976). Hybridisierungen mit ³²P-markierten Nick-translatierten Sonden, wurden wie beschrieben (BOHNERT et al., 1982) ausgeführt; es wurden zwischen 2 und 3·10&sup6; cpm/Bahn verwendet.

Neomycin-Phosphotransferase-Aktivitätsassay

Dieser Versuch wurde für Pflanzenextrakte aus einem Verfahren adaptiert, das für Bakterien- und Tierzellenlysate ausgearbeitet worden war (REISS et al., 1984a). Es wurden zwischen 20 und 100 mg Gewebe aus transformierten Pflanzen in 0,1 ml Puffer (10% Glycerin, 5% ∞-Mercaptoethanol, 62,5 mM Tris/HCl, pH 6,8, 50 ug/ml Bromphenolblau und 0,1% SDS) zerstoßen. Verschiedene Inhibitoren wurden in einem Versuch, die spezifischen und unspezifischen Proteasen zu inhibieren, verwendet. Aprotinin (Handelsbezeichnung Trasylol) wurde in einer Endkonzentration von 100 ug/ml in Wasser verwendet. p-Hydroxymercuri-benzoat (PHMB) wurde in einer Konzentration von 1 mM eingesetzt, &epsi;-Amino-n-capronsäure und 1-10-Phenantrolin wurden bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt. Proteaseinhibitoren wurden entsprechend Gray (1982) verwendet. Kristallines Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wurde unmittelbar vor der Verwendung in einer Konzentration von 100 ug/ml zugesetzt. Das geklärte Homogenat (5 min 13 000 UpM, Eppendorf Zentrifuge) wurde auf 10% nicht-denaturierende Polyacrylamidgele aufgegeben (Laemmli 1970 ohne SDS). Nach der Elektrophorese wurde der Puffer in einem Gel gegen 67 mM Tris/Maleat 42 Mm MgCl&sub2;, 400 mM NH&sub4;Cl, pH 7,1 ausgetauscht und das Acrylamidgel wurde mit einem Agarosegel (1%) bedeckt, das Kanamycinsulfat (1 mg/ml) und γ³²P-ATP (5 uCi/um pf bei einer spezifischen Aktivität von 2000 bis 3000 Ci/mMol) in dem gleichen Puffer wie das Polyacrylamidgel enthielt. Das Gel-Sandwich wurde mit Whatman P81 Papier, Whatmann 3MM Papier und mit Papiertüchern bedeckt. Nach 3 h wurde das P81 Papier während 30 min in einer Lösung, die 1% SDS und 1 mg/ml Proteinase K in Wasser enthielt, bei 60ºC inkubiert und anschließend mehrere Male in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) bei 80ºC gewaschen, getrocknet und einem Kodak XR5 Film während bis zu 48 h exponiert. Das Prinzip dieser Methode ist die Bindung von Kanamycin an das phosphorylierte DEAE Papier, wodurch die Stellungen in dem Gel aufgedeckt werden, wo eine Kanamycin-phosphorylierende Aktivität gewandert ist. Die zusätzliche Proteinasebehandlung unterdrückt Signale von Pflanzenaktivitäten, die nach der Phosphorylierung an P81 Papier binden, aber nicht Phophorylatkanamycin.

Isolierung von Chloroplasten

Chloroplaste wurden aus 1-2 g Blättern der transformierten Pflanzen isoliert. Strukturell intakte Chloroplaste wurde aus Percoll (Pharmacia) Gradienten gesammelt (Ortiz et al., 1980). Die gewaschenen Chloroplasten wurden durch Zentrifugieren konzentriert, lysiert und dann für den in situ Nachweis von NPTII-Aktivität, wie oben beschrieben, verwendet. Trypsinisierung von Chloroplasten wurde entsprechend BARTLETT et al. (1982) ausgeführt.

Konstruktionelle Details und Verfahrens-Ausführungsformen mit Bezug auf die Zeichnungen

1) Konstruktion der chimären rbcS-npt-II Gene pSNIP und pSNIF (Fig. 1A).
Ein BamHI-SalI Fragment aus pKM109/9 (REISS et al., 1984b), das den gesamten Codierungsbereich aus einem nptII Gen von Tn5 (BECK et al., 1982) enthielt, wurde in Plasmid pPSR6 Δ-RV nächst einem 950 bp DNA- Fragment (EcoRI-EcoRV) inseriert, das den Promotorbereich und das 5'-Ende des rbcS Gens enthielt und in Plasmid I-22 resultierte. In diesem Plasmid wurde das HindIII-BamHI Fragment durch ein HindIII- Sau3A Fragment (53 bp) aus dem ursprünglichen rbcS Klon (pPSR6) ersetzt, um das Plasmid II-4 zu bilden, welches das Fusions-Gen enthielt. Die pBR abgeleitete Region in II-4 wurde gegen ein EcoRI- SalI Fragment von pGV710 ausgetauscht, um Streptomycin- und Spectinomycinresistenz zu induzieren für die Verwendung als Marker, um für Cointegration dieses abschließenden Plasmids (pSNIP (10,4 kbp)) mit dem Ti-Plasmid in Agrobacterium zu selektieren. Plasmid pSNIF (12,3 kbp) wurde durch Ersatz des SmaI-SalI Fragmentes von pSNIP mit einem PvuII-XhoI Fragment aus dem Octopinsynthase-Gen von Plasmid pAGv40 (HERRERA-ESTRELLA et al., 1983, DE GREVE et al., 1983) welches die Polyadenylierungsstelle dieses Gens nächst einer BamHI Restriktionsstelle beherbergt konstruiert.
2)Struktur des rbcS-npt-II chimären Gens. (Fig. 1B).
Der schwarze Streifen zeigt die Transitpeptidsequenz mit dem ersten ATG, der weiße Bereich (zwei Codons in Exon 1 und 22 Codons in Exon 2) wird durch das erste Intron unterbrochen und gibt die reife rbcS Sequenz wieder. Der schraffierte Bereich gibt die npt-II Sequenz wieder.
3) Southern-Hybridisierungsversuche (Fig. 2).
Hybridisierung von verschiedenen Sonden auf nucleare DNA aus transformierten (pGV3851::pSNIP) (a, c und e) und nichttransformiertem (b und d) Tabak. In Southern Hybridisierungsversuchen (Southern 1975) trennen Bahn a und b Banden von unterschiedlicher Größe, die der kleinen Untereinheit-Genfamilie ähneln, wenn ein 661 bp EcoRV-AvaIII DNA Fragment aus dem genomischen kleinen Untereinheitklon als Sonde verwendet wurde (Casmore, 1983). Eine zusätzliche Bande von 10,4 kbp zeigte das chimäre Genfragment in Bahn a. In den Bahnen c, d und e wurde DNA mit PstI und EcoRI abgebaut und es wurden entweder die Promotorregion des kleinen Untereinheit-Gens (972 bp EcoRI/HindIII Fragment) (Bahn c und d) oder die codierende Region des nptIII Gens (1000 bp BamHI/SmaI Fragment aus Plasmid pKM109/9) als Sonden verwendet. In Bahn c wird ein starkes Signal aus nichttransformiertem Material (Bahn d) nachgewiesen. Schwache Signale in Bahn c sind höchstwahrscheinlich der Kreuzhybridisierung von rbcS Sequenzen oder dem unvollständigen Abbau der DNA zuzuschreiben. In Bahn e erhellt eine Bande von 0,9 kbp das interne PstI Fragment des npt-II Gens und die schwächere Bande zeigt erneut das 1,5 kbp Fragment aus Bahn c infolge einer geringfügigen Überlappung zwischen der Sonde und der Promotorregion des Chimären.
4) schematische Darstellung der Organisation der Fusion und der flankierenden Vektorsequenzen (Fig. 3).
Die Größen werden in kbp angegeben; die chimäre rbcS-npt-II codierende Region ist durch einen offenen Streifen angegeben, die 5'-flankierende Sequenz durch einen geschlossenen Streifen. EcoRI und PstI zeigen Restriktionsendonuclease-Stellen an. SpR und ApR stellen Marker für antibiotische Resistenz gegen Spectinomycin und Ampicillin dar. Zahlen geben die Größe von Fragmenten an, die bei den Southern Experimenten (Fig. 2) erhalten wurden. Die DNA Fragmente zwischen der Genfusion und dem rechten Teil der T-DNA stellen die pBR322 Sequenzen dar, die in Vektor pGV3851 vorhanden sind.
5) Transkriptionsaktivität des rbcS Promotors (Fig. 4).
RNA wurde in den denaturierenden 1% Agarosegelen abgetrennt und auf Nitrocellulosefilter verbracht, die mit verschiedenen Teilen der Konstruktion sondenmäßig behandelt wurden. Die codierende Region des npt-II Gens (BamHI-SmaI Fragment aus pKM109/9) wurde als eine Sonde verwendet. Bahn 1: RNAs aus im Licht gezüchteten Teratomatrieben. Bahn 2: RNAs aus Pflanzenmaterial, das nach einem Tag/Nacht-Rhythmus von 12 h 4 Tage lang im Dunkel gehalten worden war. Bahn 3: RNAs aus Pflanzenblättern transformiert mit pGV3850. Bahn 4: RNAs aus Wildtyp Wisconsin 38. Schwache Signale in dem letzteren sind wahrscheinlich kontaminierendem Material in der Sonde zuzuschreiben, das/die zu mRNA hybridisiert, die durch die pBR322 Sequenzen aus einem Promotor aktiv in der T-DNA oder nahe der Insertionsstelle in Pflanzenchromosom transkribiert wird. Die Zahlen auf der linken Seite geben die Größe in Nucleotiden an, die Zahlen auf der rechten Seite beziehen sich auf die Svedberg-Werte von RNA-Markern.
6) Vergleich der Lichtabhängigkeit von rbcS und rbcL Promotoren (Fig. 5A).
Poly(A)+RNA aus Teratomatrieben, die in einem Tagesrhythmus von 12 h Licht/Dunkel (L) aus Material, das anschließend 4 Tage im Dunkeln gehalten worden war (D), gezogen worden waren, wurden zu einer npt-II spezifischen Sonde hybridisiert (siehe Fig. 4) und zu einer rbcS spezifischen Sonde (siehe Fig. 2). Die endogenen rbcs Transkripte wurden an der Stellung von 850 Nucleotiden beobachtet. Poly(A)-3NA wurde mit der gleichen Technik analysiert, die mit einem 1750 bp Fragment aus einem rbcL Gen (ZURAWSKI et al., 1981) behandelt worden war. Die Zahlen auf der linken Seite beziehen sich auf Svedberg-Werte von RNA Markern; die Zahlen auf der rechten Seite beziehen sich auf die Größe der mRNA.
7) Dot-blot-Hybridisierung zur RNA aus transformierten (pGV3851: :pSNIP) Pflanzenmaterial (Fig. 5B).
L bezeichnet das im Licht in einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus gezogene Material. D bezeichnet den anschließenden Wuchs im Dunkeln während 4 Tagen. Einzelne Dots bzw. Punkte wurde ausgeschnitten und die Radioaktivität gemessen.
8) Nachweis des Transports des TP-ss-NPTII Vorläufers in Chloroplasten von Tabakpflanzen, die das pGV3850::pSNIF Konstrukt enthalten (Fig. 6A).
Die in jeder Bahn erhaltenen Ergebnisse werden nachfolgend kommentiert:
Bahn 1: Extrakte aus E. choli pGLT neol, das ein TP-NPTII Protein exprimiert (VAN DEN BROECK et al., Nature, im Druck) und E. coli pKM2, das das von Tn5 codierte NPTII Enzym enthält.
Bahn 2: Neomycin-Phosphotransferaseaktivität in gereinigten Chloroplasten aus Blättern von Tabakpflanzen, die das chimäre tp-ss-nptII Gen enthalten.
Bahn 3: Roher Extrakt aus Blättern einer SR1 Tabakpflanze zur Kontrolle.
Bahn 4: Roher Extrakt aus Blättern von Tabakpflanzen, die das chimäre tp-ss-nptII Gen enthielten. Man nimmt an, daß die P.K. Bande einem cytoplasmisch selbstphosphorylierenden Protein zuzuschreiben ist und daß C.P.K. einem selbstphosphorylierenden Protein eines Chloroplasten zuzuschreiben ist.
9) Graphische Wiedergabe der relativen Mobilität der verschiedenen NPIII-Aktivitäten, nachgewiesen in Fig. 6A (Fig. 6B).
Wie oben beschrieben ist es legitim, davon auszugehen, daß diese Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht auf diesen nativen Gelen aufgrund ihres sehr ähnlichen Polaritätsindex getrennt werden (CAPALDI und VANDERKOOI; 1972).
10) Lichtabhängige Expression des SS-NPTIII Fusionsproteins (Fig. 7).
Bahn 1: Idem wie für Fig. 6A.
Bahn 2: Idem wie für Fig. 6A Bahn 4, mit der Ausnahme/Abwandlung, daß die Pflanzen während 96 h vor der Extraktion in vollständiger Dunkelheit gehalten worden waren. Bahn 3: Idem wie für Fig. 6A Bahn 4.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung von Agrobacterium-Vektoren, um Gene in Pflanzenzellen zu transferieren und zu exprimieren (in weitem Umfang dokumentiert von CAPLAN et al., 1983, ZAMBRYSKI et al., 1983; 1984; HERRERA-ESTRLLA et al. 1983 und 1984), erweitert werden kann, um ein Fremdprotein für ein speziellen Zellkompartiment, nämlich den Chloroplasten, zu treffen. Die Ergebnisse zeigen weiterhin,
(i) daß die Genfusion in der Kern-DNA von Tabak ohne Umlagerung der DNA integriert ist,
(ii) daß die Transkription dieses chimären Gens (das eine durch Licht induzierbare Promotorsequenz enthält) durch Licht geregelt wird.
Es ist wichtig festzuhalten, daß die induzierte Transkription dieses eingeführten Gens ebenso effizient ist, wie diejenige des bzw. der Gens/e der kleinen Untereinheit und eher effizienter als zuvor bei Tabak mit einem anderen chimären Gen unter Verwendung des gleichen Erbsen-kleine Untereinheit-Promotors beobachtet (HERRERA-ESTRELLA et al., 1984). Möglicherweise ist der höhere Anteil an induzierter Gleichgewichts-mRNA in diesen Geweben auf verbesserte mRNA Stabilität zurückzuführen. Die Anwesenheit eines Introns in dem Transkript abgeleitet von diesem Transitpeptid kleine Untereinheit Neomycin- Phosphotransferase chimären Gen (tp-ss-nptII) und die Abwesenheit irgendeines Introns in der Konstruktion beschrieben von HERRERA- ESTRELLA et al., (1984) kann eine erhöhte Stabilität dieser RNA erklären (Hamer und Leder, 1978). Unsere Beobachtungen zeigen auch, daß der Erbsen-kleine-Untereinheit-Promotor in Blättern von normalen Tabakpflanzen aktiv sein kann. Dies steht im Gegensatz zu früheren Beobachtungen in verschiedenen Laboratorien, welche anzeigten, daß der Erbsen-kleine-Untereinheit-Promotor zwar in Tabakgewebskulturen und Teratoma aktiv, jedoch in Blättern von normalen Pflanzen inaktiv war. Möglicherweise ist ein Positionseffekt an dieser Erscheinung beteiligt. Das chimäre tp-ss-nptII Gen in (pGV3851::pSNIP) enthielt kein Polyadenylierungs- oder Transkriptionsterminationssignal und dies erklärt wahrscheinlich die beobachteten sehr großen Transkripte. Es wird in Beispiel II gezeigt werden, daß die Bereitstellung eines geeigneten Polyadenylierungs- oder eines Transkriptionsterminationssignals an der geeigneten stelle nach dem nptII Gen dazu führt, daß Transkripte mit im wesentlichen gleichen Längen wie die Transkripte des nptII in seiner natürlichen Umgebung produziert werden.
Die hier oben erzielten Daten bzw. Ergebnisse zeigen, daß das chimäre tp-ss-nptII Gen, das nach der Expression ein Fusionsprotein mit einem Transitpeptid und die konservierte Aminosäuresequenz, welche die Processingstelle flankiert, liefert, in der Tat zu den Chloroplasten transloziert und prozessiert wird, um ein im Stroma gelegenes Protein zu liefern, das aus dem NH&sub2;-terminalen Ende des Proteins der kleinen Untereinheit und aus einem aktiven NPTII Protein besteht. Dieses SS- NPTII Fusionsprotein wandert im Gel NPTII-Assay mit einer elektrophoretischen Mobilität, die zwischen dem TP-NPTII (35,5 kd) und derjenigen der ursprünglichen NPTII-Aktivität (29 kd) liegt. Die Mobilität steht in sehr guter Übereinstimmung mit dem Molekulargewicht (32 298) des SS-NPTII Fusionsproteins. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen an, daß dieses Fusionsprotein, das den transformierten Tabakpflanzen Kanamycinresistenz verleiht, innerhalb der Chloroplasten vorhanden ist und daraus entweichen kann, wenn die Chloroplasten ge/zerbrochen werden.
Jedoch zeigen die Ergebnisse, die mit dem im nachfolgenden Beispiel II beschriebenen Konstrukt erhalten wurden, daß die NPTII-Komponente eines Vorläuferproteins, das nur die unmittelbar mit dem NPTII Protein fusionierte Transitpeptidsequenz enthält und dem somit ein Teil der konservierten Aminosäuresequenz fehlt, welche die Processingstelle flankiert, ebenfalls durch die Chloroplastenhülle transloziert und offensichtlich sauber prozessiert wird. Die letzteren Ergebnisse zeigen an, daß die Transitpeptidsequenz alleine ausreicht, um Vorläuferproteine in Chloroplasten sowohl zu transportieren als auch zu prozessieren.

Beispiel II

In diesem Beispiel wurde ein chimäres Gen konstruiert, das für ein Fusionsprotein codiert, bestehend aus dem Transitpeptid des Vorläufers für die kleine Untereinheit von RuBP-Carboxylase aus Erbse&sup4;&sup4; direkt gebunden an den Amino-Terminus von NPT(II).
Mit anderen Worten, das bakterielle Enzym in einem neuen "Vorläufer"polypeptid wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit getestet, post-translational importiert und von Chloroplasten prozessiert zu werden, unter sowohl in vivo als auch in vitro Bedingungen.

Allgemeine Darstellung der Plasmid Konstruktion:

Zwei Plasmide wurden konstruiert, die chimäre Gene enthielten, welche für TP-NPT(II) codieren (Fig. 8A). Im ersten Plasmid, pGSSTneo3, war die codierende Sequenz für TP-NPT(II) unter Kontrolle des Erbsen ss3.6 Promotors, der die Expression von chimären Genen in Pflanzenzellen dirigiert42,45. Diese Konstruktion wurde verwendet, um das Schicksal des Fusionsproteins in vivo in transformierten Tabakzellen zu untersuchen. Ein anderes Plasmid, pGLTneol wurde konstruiert um die Synthese von TP-NPT(II) in E. coli unter Kontrolle des lacUV5 Promotors&sup4;&sup5; zu dirigieren, um ausreichende Mengen des Fusionsproteins für die Verwendung bei in vitro Rekonstitutionsversuchen mit isolierten Chloroplasten zu erhalten. Das in beiden Plasmiden codierte Fusionsprotein bestand aus dem 57-Aminosäure-Transitpeptid und dem ersten Methionin des reifen kleine Untereinheit-Polypeptids, das von dem Erbsen ss3.6 Gen&sup4;&sup4; codiert wird, einem 7-Aminosäure-Linkerfragment, und dem NPT(II) frei von dem ersten Methionin&sup4;&sup5; (263 Aminosäuren). Die Aminosäuresequenzen in dem authentischen kleine Untereinheit-Vorläufer, codiert von ss3,6, und von dem Fusionsprotein werden in Fig. 8B miteinander verglichen. Es ist zu sehen, daß die Cys/Met Spaltungsstelle des Vorläufers zur kleinen Untereinheit im TP-NPT(II) Fusionsprotein intakt geblieben ist.
Um das Schicksal des TP-NPT(II) Fusionsproteins in vivo zu untersuchen, mußten zuerst transformierte Zellen erhalten werden, die das tp-npt(II) Genprodukt exprimieren.
Das tp-npt(I) Gen von pGSSTneo3 wurde mit Hilfe des Vektors pGV3851, einem Derivat des Agrobacterium Ti-Plasmids pTiC58 in das Genom von Pflanzenzellen gebracht&sup4;&sup8;. Das Plasmid pGV3851 enthält eine Deletion, die mehrere der T-DNA codierten Transkripte entfernt, einschließlich derjenigen, die an der Auxinproduktion beteiligt sind, die aber das an der Cytokinin-Synthese beteiligte Gen zurückhält. Das Ergebnis dieser Modifikation ist, daß Agrobacterium, welches pGV3851 beherbergt, Triebe-bildende Tumoren induziert. In pGV3851 ist der deletierte Bereich oder Teil durch pBR322 ersetzt worden. pGSSTneo3 wurde in die T-DNA von pGV3851 inseriert mittels Rekombination durch die pBR322 Homologie&sup4;&sup9;.
Die T-DNA von verschiedenen Agrobacterium Exkonjuganten, die aus Kanamycin-enthaltenden Schalen erhalten worden waren, wurden mittels Southern Hybridisierungsanalyse&sup5;&sup0; untersucht, um zu bestätigen, daß die eigene/eigentliche Cointegration zwischen pGSSTneo3 und der T-DNA von pGV3851 stattgefunden hatte. Die Ergebnisse, die für eines dieser pGV3851::pGSSTneo3 Exkonjuganten erhalten wurden, sind in Fig. 9a gezeigt.
Stiele von sterilen Tabaksämlingen wurden mit diesem Stamm inokuliert, nachdem sie mit einer Nadel unterhalb des ersten Internodiums verletzt worden waren. Nach 2 bis 3 Wochen zeigten sich grüne Triebe bildende Tumoren. Steriles Gewebe wurde erhalten, indem das transformierte Gewebe in vitro auf Murashige und Skoog (MS) Medium&sup5;² gezüchtet wurde, das 500 ug/ml Cefotaximum enthielt, ein Antibiotikum, auf das ampicillinresistente Agrobacterien reagieren. Während der Vermehrung des Gewebes wurde der Saccharose-Gehalt des MS-Mediums von 3% auf 1% verringert, um das Grünwerden zu verbessern. Die grünen Gewebe waren in der Lage, auf einem Medium zu wachsen, das 200 ug/ml Kanamycin enthielt. Dies zeigte an, daß das tp-npt(II) Gen vorhanden und funktionell exprimiert war. Die Anwesenheit des tp-npt(II) Gens wurde durch Southern Hybridisierungsanalyse&sup5;&sup0; von Genom-DNA erhalten aus dem transformierten Kallusgewebe, bestätigt (Fig. 8B).
Eine parallele Reihe von Cointegrations- und Transformationsversuchen (Ergebnisse sind nicht gezeigt) lieferte Tabaktumoren, die ein zweites chimäres Gen, nos-npt(II)ref 40 enthielten, das für das unveränderte NPT(II) Protein unter Kontrolle des Promotors aus dem Nopalinsynthase Gen35, 43 codierte. Dies ermöglichte die Untersuchung des Schicksals von NPT(II) selbst in transformierten Zellen.

Schicksal des tp-npt(II) Genprodukts in Pflanzenzellen

Da das TP-NPT(II) Fusionsprotein keine normale Komponente von Pflanzenzellen ist, war es interessant, die endgültige Stellung/Lage des Fusionsproteins in transformierten Zellen zu bestimmen. Im spezifischen Falle wünschten wir zu wissen, ob das Transitpeptid alleine in der Lage ist, die Aufnahme und das Processing des TP- NPT(II) Fusionsproteins durch Chloroplasten in vivo zu dirigieren bzw. zu lenken. Deshalb wurde die folgende Versuchsreihe durchgeführt, um das Schicksal von sowohl TP-NPT(II) Fusionsprotein als auch unverändertem NPT(II) in transformierten Tabakzellen zu bestimmen.
Das Vorhandensein von NPT(II) oder aktiven NPT(II) Fusionsproteinen in einem gegebenen Extrakt kann mit Hilfe eines in situ enzymatischen Assays für die Phosphotransferaseaktivität nach Gel-Elektrophorese bestimmt werden (Fig. 10). Die Positionen des ursprünglichen NPT(II) und des TP-NPT(II) Fusionsproteins wurden bestimmt, indem Extrakte von E. coli, die entweder pBR322::TnS oder pGLTneol beherbergten, hergestellt wie beschrieben&sup4;&sup7;, untersucht wurden. Wie gezeigt (Bahn 3, Fig. 10) treten bei der enzymatischen Untersuchung von Extrakten von Pflanzengewebe, das nicht die NPT(II) codierende Sequenz in seinem Genom enthält, zwei Banden von Phosphotransferase- oder Kinaseaktivität auf (diese werden mit P.K., Pflanzenkinase bezeichnet). Diese Banden geben nicht NPT(II)-Aktivität wieder, weil sie auch beobachtet werden können, wenn kein Kanamycin als Substrat in die enzymatische Reaktion eingeschlossen wird (Ergebnisse nicht gezeigt). Die schneller wandernde Bande wird auch bei Chloroplastpräparaten aus dem gleichen Gewebe gefunden (Bahn 4, Fig. 10). Wenn ein Bakterienextrakt, der das von pGLTneol codierte TP-NPT(II) Fusionsprotein enthält, mit dem Pflanzenextrakt vermischt wird, erscheint eine neue Hauptbande von NPT-Aktivität (Bahn 2, Fig. 10). Diese Bande wandert langsamer als NPT(II), das von Tn5 codiert wird (Bahn 1, Fig. 10) und entspricht wahrscheinlich dem bona fide TP-NPT(II). Die Mobilitätsänderung beruht auf einer Änderung sowohl des Molekulargewichtes als auch der Ladung als Ergebnis der Addition des Transitpeptids. In Bahn 2 (Fig. 10) können auch kleinere Banden mit höherer Mobilität beobachtet werden. Diese entsprechen wahrscheinlich entweder Abbauprodukten des Fusions- Polypeptids oder kleineren Polypeptiden, die aus einem internen ATG der TP-NPT(II) codierenden Sequenz translatiert sind.
Rohe Extrakte, erhalten aus transformierten Gewebe, enthaltend ein nos-npt(II) chimäres Gen, enthalten NPT(II)-Aktivität (Bahn 5, Fig. 10). Jedoch haben intakte Chloroplasten, die aus dem gleichen Gewebe isoliert sind, keine nachweisbare, mit ihnen assoziierte NPT(II)- Aktivität (Bahn 5, Fig. 10). Diese Beobachtung legt nahe, daß dem Produkt dieses chimären Gens die Information fehlt, die notwendig ist, um seine Translokation in Chloroplasten hineinzuvermitteln. Rohe Extrakte aus Gewebe, das das tp-npt(II) chimäre Gen enthält, enthalten auch beträchtliche NPT(II)-Aktivität (Bahn 7, Fig. 10). Werden intakte Chloroplasten aus diesem Gewebe isoliert, so wird gefunden, daß beträchtliche Mengen an NPT(II)-Aktivität mit ihnen assoziiert sind (Bahn 8, Fig. 11). Außerdem wandert das eine Neomycin-phosphorylierende Protein, das sowohl im rohen Extrakt als auch in den isolierten Chloroplasten beobachtet wurde, mit der gleichen Mobilität wie das Tn5 authentische Protein und unterscheidet sich von dem NPT(II) Fusionsprotein aus E. coli, welches das tp-npt(II) chimäre Gen beherbergt (siehe auch Fig. 11, Bahnen 1, 2, 3). Selbst nach längerer Exposition des Autoradiogramms gab es kein Anzeichen für das Vorhandensein dieses NPT(II) Fusionsproteins. Diese Beobachtungen zeigen, daß die NPT(II)-Aktivität in der Chloroplastenfraktion konzentriert ist und daß das TP-NPT(II) Fusionsprotein sehr wirksam nahe der Fusionsstelle gespalten wird unter Entfernung des Transitpeptids. Da das reife SS Polypeptid Teil eines im Stroma vorhandenen löslichen Proteins ist, war es von Interesse zu bestimmen, ob die mit der isolierten Chloroplastenfraktion assoziierte NPT(II)-Aktivität auch in dem gleichen suborganellen Kompartiment eingekapselt ist. Infolgedessen wurden Chloroplasten aus pGV385l: :pG55Tneo3-transformiertem Gewebe durch Resuspension in einem hypo-osmotischen Puffer lysiert und in Stroma- und Membranfraktionen fraktioniert/getrennt. Die Membranfraktion wurde zusätzlich gewaschen, um Verunreinigungen durch Stroma zu entfernen. Aliquots dieser Fraktionen wurden dann der Elektrophorese auf nichtdenaturierenden Gelen unterworfen und in situ bezüglich NPT(II)-Aktivität analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse (Fig. 11) zeigen deutlich, daß die gesamte Enzymaktivität, die mit der aus transformierten Gewebe isolierten Chloroplastenfraktion assoziiert ist, eher in der Stromafraktion (Bahn 3, Fig. 11) als in der Membranfraktion (Bahn 4, Fig. 11) der Plastide lokalisiert ist. Um sicherzustellen, daß diese Befunde die Aufnahme des Fusionsproteins durch die Chloroplasten und nicht unspezifische Bindung an die Plastidhülle und Freisetzung während der Organellenfraktionierung wiedergeben, wurden aliquote Anteile von isolierten Chloroplasten einer Proteasebehandlung&sup5;³ unterworfen. Gleiche Mengen an Chloroplasten aus mit Protease behandelten und nichtbehandelten Präparaten wurden dann wie oben beschrieben fraktioniert und die Stromafraktion bezüglich der NPT(II)- Aktivität analysiert. Ein großer Prozentsatz der in nichtbehandelten Chloroplasten vorhandenen NPT(II)-Aktivität (Bahn 3, Fig. 12) bleibt in proteasebehandelten Chloroplasten vorhanden (Bahn 4, Fig. 12), bis diese Chloroplasten aufgebrochen werden (Bahn 2 Fig. 12). Die beobachtete leichte Aktivitätsabnahme ist wahrscheinlich das Ergebnis von Verlusten aus der Plastidlyse und nicht ein Mangel an Einkapselung des prozessierten Fusionsproteins innerhalb des Chloroplasten.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß das TP-NPT(II) Fusionsprotein auf den Chloroplasten trifft, in das Stroma transloziert und in einer gleichen/ähnlichen Weise wie das kleine Untereinheit-Polypeptid prozessiert wird.
In vitro Aufnahme und Processing des Fusionsproteins durch isolierte Chloroplasten.
Alternativ wurde eine Reihe von in vitro Rekonstitutionsversuchen mit isolierten intakten Chloroplasten durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Transitpeptid alleine ausreicht, um die posttranslationale Aufnahme von anderen Proteinen als dem reifen kleinen Untereinheit Polypeptid in Chloroplasten zu dirigieren bzw. zu lenken und um zu testen, ob Chloroplasten das Transitpeptid aus einem Fusionsprotein erkennen und proteolytisch entfernen können. Es ist (schon) früher gezeigt worden, daß der in vitro Weg nützlich ist für die Vorgänge der Chloroplasten-Translokation6,10-17. Hier haben wir diese Methode adaptiert, um sie mit von E. coli produzierten Fusionsproteinen anzuwenden.
Bakterienextrakte, die das TP-NPT(II) Fusionsprotein enthielten, wurden durch Beschallung von exponentiell wachsenden Flüssigkulturen von Escherichia coli, welches pGLTneol beherbergt, hergestellt.
Aliquote Anteile der TP-NPT(II) enthaltenden geklärten Bakterienextrakte wurden 1 h lang mit aus Erbsehblättern isolierten Chloroplasten&sup5;³ inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Chloroplasten erneut aus dem Inkubationsgemisch isoliert und mehrere Male mit einem isotonischen Puffer gewaschen, bis keine TP-NPT(II)- Aktivität mehr im Überstand nachgewiesen wurde.
Dieses Präparat wurde verwendet um zu bestimmen, ob NPT(II)-Aktivität assoziiert mit der Stroma- oder der Membranfraktion dieser Chloroplasten vorhanden war. Die Bahnen 1 und 2 der Fig. 13 zeigen die Stellung/Lage von NPT(II) und von TP-NPT(II), das in den Bakterienextrakten vorhanden ist. Bahn 3 (Fig. 13) zeigt, daß vor der Inkubation mit E. coli Extrakten, die TP-NPT(II) enthalten, das Stroma von aus Erbse isolierten Chloroplasten keinerlei Phosphotransferase- oder Kinaseaktivität enthält, die zusammen mit entweder dem TP-(NPT(II) Fusionspolypeptid oder mit authentischem NPT(II) wandert. Jedoch, wie früher bei Tabak beobachtet, zeigen unsere Versuchsbedingungen eine endogene Kinaseaktivität (P.K), die mit Chloroplasten assoziiert ist. Nach dem Inkubieren dieser Chloroplasten mit Bakterienextrakten, die TP-NPT(II) enthalten, enthält die aus den isolierten Organellen erhaltene Stromafraktion einen beträchtlichen Anteil an NPT(II)- Aktivität (Bahn 4, Fig. 13), während die Membranfraktionen diese Aktivität nicht enthalten (Bahn 6 Fig. 13). Diese NPT(II)-Aktivität wandert, wie das ursprüngliche Bakterienenzym, was Processing anzeigt. Um zu bestätigen, daß die in der Stromafraktion von Chloroplasten, die in Gegenwart des TP-NPT(II) Fusionsproteins inkubiert worden waren, beobachtete NPT(II)-Aktivität das Ergebnis einer Aufnahme und nicht das Ergebnis einer Freisetzung von Protein gebunden an die Chloroplastenhülle während des Fraktionierungsverfahrens war, wurden Chloroplasten erneut aus dem Aufnahme-Inkubationsgemisch isoliert, gewaschen und einer begrenzten Proteolyse&sup5;³ unterworfen. Nach erneuter Reinigung wurden Protease-behandelte Chloroplasten wie oben fraktioniert und die NPT(II)-Aktivität wurde in der Stromafraktion und in der Membranfraktion bestimmt. Die meiste Stroma NPT(II)-Aktivität erwies sich als gegen Protease-Abbau geschützt, da die Menge an zurückgewonnener Aktivität (Bahn 5, Fig. 13) gleich bzw. ähnlich ist derjenigen in nichtbehandelten Chloroplasten (Bahn 4, Fig. 13). Die Membranfraktion von Protease-behandelten Chloroplasten war vollständig frei von Aktivität (Bahn 7, Fig. 13). Gleiche Ergebnisse wurden für in vitro Aufnahme des TP-NPT(II) Fusionsproteins erhalten, unter Verwendung von intakten Chloroplasten, die aus jungen expandierenden Tabakblättern isoliert worden waren (Ergebnisse nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Transitpeptid des Vorläufers zur kleinen Untereinheit von Ribulose-1,5-diphosphat in der Lage ist, die Aufnahme von anderen Polypeptiden als der reifen kleinen Untereinheit durch Chloroplasten unter in vitro Versuchsbedingungen zu vermitteln. Daß die Aufnahme des NPT(II) Proteins durch Chloroplasten in vitro bei Abwesenheit des Transitpeptids nicht stattfindet (Ergebnisse nicht gezeigt) stimmt mit unseren in vivo Beobachtungen überein, daß Chloroplasten, hergestellt aus Kallus-Gewebe, transformiert mit nosnpt(II), eine Aktivität enthalten. Diese Beobachtungen bestätigen weiterhin, daß das Transitpeptid im Translokationsvorgang notwendig ist.
Anders als bei früheren in vitro-Aufnahme Untersuchungen6, 11-17, die auf der Verwendung von Weizenkeimextrakten für die Synthese von Vorläuferpolypeptiden beruhten, haben wir ein E. coli Expressionssystem für die Herstellung unseres Fusionsproteins verwendet. Da die Translokation des Fusionsproteins in diesem in vitro Aufnahmesystem abläuft, kann dies als Nachweis dafür gewertet werden, daß zusätzliche Cytoplasmafaktoren im Translokationsmechanismus nicht erforderlich sind. Jedoch ist es im Gegensatz zu Translokationsuntersuchungen mit mikrosomalen Membranen&sup5;&sup4; nicht praktisch, Chloroplastpräparate mit stark salzhaltigen Puffern zu waschen. Infolgedessen können wir nicht vollständig die Möglichkeit eliminieren, daß die Translokation von Chloroplast-Proteinen zusätzliche Cytoplasma-Faktoren erfordert, die fest an unsere Chloroplast-Präparate gebunden sein können. Die Konstruktionen von Beispiel II und die Bedingungen unter denen die bisher genannten Ergebnisse erzielt wurden, werden nun, so weit sie nicht aus der bisherigen Beschreibung zu entnehmen sind, in detaillierterer Weise erläutert.
1- Detaillierte Beschreibung der Konstruktion von Plasmiden, welche chimäre Gene enthalten, die das TP-NPT(II) Fusionsprotein codieren (Fig. 8A).
Ein 1-kb EcoRI-SphI Restriktionsfragment von pPSR6, einem pBR327 Derivat, daß das Erbsen kleine Untereinheit ss3,6 Gen&sup4;&sup4; enthält, wurde aus einem 1% Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment, das die Promotorregion, Nucleotidsequenzen, die das Transitpeptid codieren und das erste Methionin Codon des reifen kleine Untereinheit Polypeptids enthält, wurde in mit EcoRI/BamHI-geschnittenes pKM 109/9 ligasiert, um das kleine EcoRI/BamHI Fragment gegenüber der NPT(II)-codierenden Region zu ersetzen. Das Plasmid pKm109/9 ist ein pBR322 Derivat, das das npt(II) Gen vom Tn5 ohne seine 5'-nichttranslatierte Region und das erste Methionin Codon enthält&sup4;&sup5;. Um das 3'-überhängende Ende der SphI Restriktionsstelle mit dem 5'-überhängenden Ende der BamHI Restriktionsstelle zu fusionieren, wurde ein einsträngiges Oligonucleotid 5' GATCCATG 3', komplementär für beide vorstehenden Enden, synthetisiert und dem Ligasierungsgemisch zugesetzt&sup5;&sup5;. Nach der Fusion ist die SphI Stelle abgeschafft bzw. nicht mehr vorhanden, aber die BamHI Stelle verbleibt. Das erhaltene Plasmid pGSSTneol wurde mit SmaI und einem 700-bp PvuII Fragment enthaltend das Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignal aus dem ocs Gen&sup5;&sup6; gespalten, in die Stelle ligasiert, um die eigentliche 3'-Transkriptionstermination und das Processing sicher zu stellen. Das als Zwischenprodukt auf tretende pGSSTneo2 Plasmid wurde dann in zwei verschiedenen Klonierungsstufen verwendet.
(A) Ein 1400 bp BamHI Fragment aus pUC4K&sup5;&sup7;, welches das Kanamycinresistenz-Gen von Tn903 codiert, wurde isoliert und in die einzige bzw. einzigartige BglII Restriktionsstelle von pGSSTneo2 kloniert, wobei das Plasmid pGSSTneo3 erhalten wurde. Kanamycinresistenz wurde als ein Marker verwendet, um für die Cointegration von pGSSTneo³ mit dem Ti-Plasmid in Agrobacterium zu selektieren.
(B) Ein 200 bp EcoRI/HindIII Fragment aus pKM109/3&sup4;&sup5;, das die lacUV5 Promotorregion enthielt, wurde gegen das kleine EcoRI/HindIII Fragment von pGSSTneo2 ausgetauscht. Dies ermöglichte die Expression des TP- NPT(II) Fusionsproteins in E. coli. Das erhaltene Plasmid wird als pGLTneo1 bezeichnet. Abkürzungen: APR Ampicillinresistenz; KmR Kanamycinresistenz, Symbole: pBR322 Sequenz; [[[neo.::, Codierungsregion für NPT(II); [→ ::, lac UV 5 Promotorregion; Δ, 3' Ende. Darstellung des Octopinsythase-Gens: [Pocs ::, Promotorregion; [ocs :: Codierungsregion. Darstellung des Gens für die kleine Untereinheit von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase : [=== :: Promotor und 5'-nichttranslatierte Region; [/// ::, Sequenz, die für das Transitpeptid codiert; [:: exon; [:: intron.
2 - Vergleich der partiellen Aminosäuresequenz des TP-NPT(II) Fusionsproteins und des Vorläufers für das Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase kleine Untereinheit-Polypeptid (Fig. 8B).
Es werden partielle Aminosäuresequenzen für den Vorläufer zu dem kleine Untereinheit Polypeptid oder Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase, codiert durch das Erbsen ss3,6 Gen&sup4;&sup4; (obere Linie) und das TP-NPT(II) Fusionsprotein (untere Linie) dargestellt. Der Bereich nahe der Processingstelle des Vorläufers für die kleine Untereinheit und der Fusionspunkt für das TP-NPT(II) Fusionsprotein werden gezeigt. Die Pfeile zeigen die proteclytische Processingstelle definiert für den Vorläufer der kleinen Untereinheit. Die aus dem ursprünglichen NPT(II) Protein stammenden Aminosäurereste sind unterstrichen. Aminosäurereste sind über den Sequenzen numeriert, wobei der erste Methioninrest des reifen kleinen Untereinheit-Proteins als Aminosäure Nr. 1 angenommen wird.
3) Einbau des tp-npt(II) Gens in das Genom von Pflanzenzellen.
Um pGSSTneoIII zwischen die PFV3851 T-DNA Grenzen zu inserieren, wurde pGSSneoIII zunächst in den E. coli Stamm Gj23 eingeführt, der die Helferplasmide R64drdII und Gj28 beherbergt. Diese letzten zwei Plasmide stellten die Tra- und Mob-Funktionen bereit, die benötigt werden, um pGSSTneo3 von E. coli zu Agrobaceterium tumefaciens (welches pGV3851 beherbergt) hin zu mobilisieren. So wurden nach der Konjugation zwischen den entsprechenden E. coli und A. tumefaciens- Stammen, Agrobacterium Exkonjuganten, das Cointegrat zwischen pGSSTneoIII und pGV3851, auf Kanamycin enthaltenden Schalen selektiert.
Die T-DNA von verschiedenen Kanamycin-resistenten Agrobacterium Exkonjuganten wurde mittels Southern Hybridisierungsanalyse&sup5;&sup0; untersucht, um zu bestätigen, daß die eigentliche Cointegration zwischen pGSSTneo3 und der T-DNA von pGV3851 stattgefunden hatte. Das für eines dieser pGV3851::pGSSTneo3 Exkonjuganten erhaltene Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt.
Es wird auch auf die detailliertere Beschreibung von Fig. 10, welche folgt, hingewiesen.
4) Southern Hybridisierungsanalyse von Agrobacterium- und Pflanzen DNA (Fig. 9).
Das obige Autoradiogramm zeigt die Ergebnisse der Southern Hybridisierungs&sup5;&sup0;-Analyse, welche das Vorhandensein und die Struktur des tp-npt(II) chimären Gens sowohl in dem Cointegrat pGV3851::pGSSTneo3 DNA als auch in Genom DNA aus transformierten Tabakzellen bestätigt. Bahn 1, gesamte Agrobacterium DNA aus pGV3851::pGSSTneo3; Bahn 2, Pflanzengenom DNA aus Tabakkallus transformiert mit pGV3851::pGSSTneo3. In beiden Bahnen hybridisieren zwei Fragmente mit der spezifischen Sonde: Ein Fragment von 2,6 kb stellt das EcoRI/BamHI Fragment von pGSSTneo3 enthaltend das KmR Gen von Tn903 und den SS Promotor und die Transitpeptidregion dar; ein zweites Fragment von 1,85 kb stellt das BamHI/SaII Fragment von pGSSTneo3 dar, das die Codierungsregion von NPT(II) und das OCS 3' Ende enthält.
Gesamtagrobacterium DNA&sup5;&sup8; und Pflanzengenom DNA aus transformierten Kallusgewebe&sup5;&sup9; wurde hergestellt und mit EcoRI, BamHI und SalI gespalten. Die Abbauprodukte wurden auf einem 1% Agarosegel fraktioniert, auf Nitrocellulosepapier übertragen und mit einer ³²P-markierten Sonde, die spezifisch war für den Promotor und die Codierungsregion des TP-NPT(II) Fusionsproteins hybridisiert (die Sonde war das kleinere EcoRI/SalI Fragment von pGssTneo1, siehe Fig. 8A).
5. Lokalisierung von NPT(II)-Aktivität in Chloroplasten-Kallusgewebe (Fig. 10).
Das Autoradiogramm zeigt die Anwesenheit und die Mobilität von NPT(II)-Aktivität in Bakterienextrakten und in Zellfraktionen nach in situ Lokalisierung auf einem 10% nichtdenaturierenden Polyacrylamidgel&sup4;&sup7;. Bahn 1, E. coli Extrakte, die NPT(II) enthielten, vermischt mit rohem Extrakt von grünem pGV3851-transformiertem Tabakgewebe; Bahn 2, E. coli Extrakt der TP-NPT(II) enthält, vermischt mit rohem Extrakt von grünem pGV3851-transformiertem Tabakgewebe; Bahn 3, roher Extrakt aus grünem pGV3851-transformiertem Tabakgewebe; Bahn 4, intakte Chloroplasten aus grünem pGV3851-transformiertem Tabakgewebe; Bahn 5, rohe aus grünem pGV3851::pLGV23neo-transformiertem Tabakgewebe; Bahn 6, intakte Chloroplaste aus grünem pGV3851: :pLGV23neo-transformiertem Tabakgewebe; Bahn 7, roher Extrakt aus grünem pGV3851: :pG55Tneo3-transformierten Tabakgewebe; Bahn 8, intakte Chloroplasten von grünem pGV3851: :pG55Tneo3-transformierten Tabakgewebe P.K. (?): nichtspezifische Bande, vorhanden bei nichttransformiertem Pflanzengewebe, wahrscheinlich aufgrund der Aktivität von Pflanzenkinase.
Methoden: 3 g grüner Kallus wurden durch mehrfaches kurzzeitiges Einschalten bei niedriger Geschwindigkeit in einem Waring Blendor in GR Puffer (0,33 M Sorbit, 50 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM MnCl&sub2;, 1 mM Na&sub2;-EDTA, 2 mM Na&sub2;-EDTA, 1 mg/ml Isoascorbat, 0,5 mg/ml BSA) homogenisiert. Das Homogenat wurde durch zwei Schichten Mira-Gewebe filtriert und das Filtrat wurde von 0 bis 4340·g zentrifugiert und innerhalb der kürzest möglichen Zeit abgebremst. Das rohe Chloroplasten-Pellet wurde in wenigen ml GR Puffer resuspendiert. Intakte Chloroplasten wurden aus den rohen Chloroplasten-Pellets durch Sedimentation in Percoll Dichtegradienten&sup5;³ hergestellt. Gradientengereinigte intakte Chloroplasten wurden mit GR gewaschen und in 25 mM Tris-HCl (ph 7,5) enthaltend 0,5% β-Mercaptoethanol lysiert.
Rohe Kallusextrakte wurden hergestellt, indem 70 mg Gewebe in 70 ul Extraktionspuffer (1% β-Mercaptoethanol, 50 mM Tris, pH 6,8, 0,13 mg/ml Leupeptin) homogenisiert wurden und das Homogenat (2 Minuten bei 18 800 g) geklärt wurde. Rohe Extrakte von E. coli wurden durch Beschallung in einem Puffer, enthaltend 10 mM Tris·HCl (pH 7,5) 10 mM MgCl&sub2;, 25 mM NH&sub4;Cl und 10 mM DTT&sup6;&sup0; und anschließendes Zentrifugieren zur Entfernung von Zelltrümmern hergestellt. Der Assay auf NPT(II)-Aktivität ist eine Modifizierung des beschriebenen in situ Nachweisverfahrens&sup4;&sup7;. Proben, die mit einem 10·Beladungspuffer (50% Glycerin, 0,5% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 0,005% Bromphenolblau) verdünnt worden waren, wurden auf einem 10% (Gewicht/Volumen) nichtdenaturierenden Polyacrylamidgel getrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel zweimal während 10 min mit destilliertem Wasser gewaschen und dann 30 min in 2· Reaktionspuffer (100 mM Tris, pH 7,5, 50 mM MgCl&sub2;, 400 mM NH&sub4;Cl, 1 mM DTT) äquilibriert. Das Gel wurde dann auf eine Glasschale übertragen und mit einem 1% Agarosegel überschichtet, das 30 ug/ml Kanamycinsulfat und 200 uCi γ³²P-ATP in 1· Reaktionspuffer enthielt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde das Gelsandwich mit Whatman P81 Phosphocellulosepapier, zwei Blatt Whatman 3MM Papier und einem Stapel Löschpapier bedeckt und mit 1 kg belastet, um zu ermöglichen, daß das phosphorylierte Kanamycin sich an das P81 Papier in einem Transfer oder Übergang vom Southern-Typ band. Nach 3 h wurde das P81 Papier 5 min lang mit 500 ml heißem Wasser (80ºC) und während 3 h verschiedene Male mit einem 50 mM Natriumphosphatpuffer (PH 7,0) gewaschen. Das P81 Papier wurde getrocknet und über Nacht autoradiographiert unter Verwendung eines verstärkenden Bildschirms, um das an der Stellung, an der die Proteine mit NPT(II)-Aktivität in das Polyacrylamidgel wandern, gebildete radioaktiv markierte Kanamycin sichtbar zu machen.
6) Lokalisierung der NPT(II)-Aktivität in der Stromafraktion von Chloroplasten, die aus pGV3851::pGSSTneo3 transformiertem Tabakgewebe isoliert worden waren (Fig. 1).
Intakte Chloroplasten wurden aus pGV3851::pGSSTneo3 transformiertem Kallusgewebe isoliert und in Stroma- und Membranfraktionen fraktioniert. Die mit jeder dieser Fraktionen assoziierte NPT(II)- Aktivität wurde untersucht. Bahn 1, E. coli Extrakt enthaltend NPT(II); Bahn 2, E. coli Extrakt enthaltend TP-NPT(II); Bahn 3, Stromafraktion von Chloroplasten isoliert aus grünem pGV3851: :pGSSTneo3 transformiertem Tabakgewebe. Bahn 4, Membranfraktion von Chloroplasten in Bahn 3. Bahn 5, war (Teil) der in Bahn 4 gezeigten Membranfraktion. P.K. (?) siehe Fig. 10.
Intakte Chloroplasten wurden aus grün gewordenem Tabakgewebe isoliert wie in der Legende zu Fig. 10 beschrieben. Die zweimal mit Sorbit- Hepes Puffer gewaschenen und durch Zentrifugieren gewonnen Chloroplasten wurden in Stroma- und Membranportionen getrennt, indem Plastide in 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) enthaltend 0,5% β-Mercaptoethanol resuspendiert und anschließend bei 18.800·g zentrifugiert wurden. Die Membranfraktionen wurden zweimal gewaschen und pelletisiert, um Stroma-Restverunreinigung zu entfernen. Die Waschfraktionen wurden routinemäßig bezüglich NPT(II) Restaktivität getestet.
7) Schutz der in den Chloroplasten von pGV3851::pGSSTneo3 transformierten Tabakzellen vorhandenen NPT(II)-Aktivität gegen über Proteasebehandlung (Fig. 12).
Intakte Chloroplasten, isoliert aus PGV3851: :pGSSTneo3 transformierten Tabakkallusgewebe, wurden einem begrenzten proteolytischen Abbau unterworfen und dann in die Stroma- und Membrankomponenten getrennt, bzw. fraktioniert. Es wurde die Protease-Unempfindlichkeit von NPT(II)-Aktivität, die mit diesen Fraktionen assoziiert war, getestet. Bahn 1, E. coli Extrakt enthaltend NPT(II); Bahn 2, Stromafraktion von intakten Chloroplasten isoliert aus grünem PGV3851::pGSSTneo3 transformiertem Tabakgewebe und lysiert vor der Proteasebehandlung; Bahn 3, Stromafraktion von nicht mit Protease behandelten intakten Chloroplasten, isoliert aus grünem PGV3851: :pGSSTneo3 transformiertem Tabakgewebe; Bahn 4, Stromafraktion von mit Protease behandelten intakten Chloroplasten, isoliert aus grünem PGV3851::pGSSTneo3 transformiertem Tabakgewebe; P.K. (?) siehe Fig. 3.
Intakte Chloroplaste wurde aus grün gewordenem Tabakkallusgewebe isoliert, wie in der Legende zu Fig. 10 beschrieben. Die Proteasebehandlung von isolierten Chloroplasten wurde wie zuvor beschrieben 53 vorgenommen. Mit Protease behandelte und nichtbehandelte Plastide wurden, wie in der Legende zu Fig. 5 beschrieben, fraktioniert.
8) In vitro Aufnahme von TB-NPT(II) Fusionsprotein durch isolierte Erbsenchloroplasten (Fig. 13).
Ein Autoradiogramm wird gezeigt, daß die in situ Lokalisierung von NPT(II)-Aktivität in Bakterien- und Chloroplastenfraktionen nach der Fraktionierung auf nicht denaturierenden Polyacrylamidgelen zeigt. Bahn 1, Extrakt aus E. coli, das pBR322::TnS (NPT(II) beherbergt; Bahn 2, Extrakt aus E. coli, das pGLTneol (TP-NPT(II)) beherbergt; Bahn 3, Stromafraktion von Erbsenchloroplasten vor der Inkubation mit Bakterienextrakten; Bahn 4, Stromafraktion von Erbsenchloroplasten inkubiert mit Bakterienextrakten, die das TP-NPT(II) Fusionsprotein enthalten; Bahn 5, Stromafraktionen von mit Protease behandelten Erbsenchloroplasten (gleiche Menge wie bei Bahn 4), inkubiert mit Bakterienextrakten, die das TP-NPT(II) Fusionsprotein enthalten, Bahn 6, gewaschene Membranfraktionen der gleichen Chloroplasten wie in Bahn 5; Bahn 7, gewaschene Membranfraktion der gleichen Chloroplasten wie in Bahn 4.

Methoden:

Intakte Chloroplasten wurden aus Erbsenblättern (Pisum sativum) mittels Sedimentation durch Percoll Dichtegradienten&sup5;³ isoliert. Die intakten Chloroplasten wurden gewaschen und in Sorbit- Hepespuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 0,33 M Sorbit) resuspendiert und bei 0ºC aufbewahrt. Die in vitro Aufnahme in isolierte Chloroplasten wurde im wesentlichen wie beschrieben&sup5;³ durchgeführt, mit der Abwandlung, daß das Inkubationsgemisch für die Verwendung mit Bakterienextrakten modifiziert wurde. Aufnahmereaktionen (300 ul Endvolumen) enthielten intakte Chloroplasten (äquivalent 200 bis 300 ug Chlorophyll) und 50 ul Bakterienextrakt (wie in der Legende zu Fig. 10 beschrieben) in einem Puffer, der 0,33 M Sorbit, 50 mM Hepes- KOH (pH 7,5), 1 mM MgCl&sub2; und 1 mM Na&sub2;-EDTA enthielt. Nach der Inkubation bei 20 bis 22ºC im Licht unter leichtem Schütteln während 1 h, wurden die Chloroplasten mit Sorbit-Hepes Puffer verdünnt und die intakten Chloroplasten wurden durch Zentrifugieren bei 4340·g isoliert. Die zweimal mit Sorbit-Hepes Puffer gewaschenen und durch Zentrifugieren isolierten/gewonnenen Chloroplasten wurden entweder unmittelbar anschließend fraktioniert (siehe Legende zu Fig. 11) oder einer Proteasebehandlung, wie zuvor beschrieben&sup5;³ unterworfen. Aliquote Anteile der Proben wurden entweder unmittelbar auf NPT(II) analysiert oder bei -80ºC aufbewahrt und zu einem späteren Zeitpunkt analysiert.
Die in diesem Beispiel gezeigten Ergebnisse aus den in vivo und in vitro Untersuchungen zeigen deutlich, daß die NPT(II) Komponente des TP-NPT(II) Fusionsproteins über die Chloroplastenhülle hinweg transloziert und schließlich im Stroma loziert wird. Daß für diesen Vorgang das Transitpeptid notwendig ist, wird dadurch gezeigt, daß eine Aufnahme vom NPT(II) durch Chloroplasten nicht nachgewiesen werden kann, wenn das Transitpeptid nicht mit dem NPT(II) fusioniert worden ist bzw. hat. Das TP-NPT(II) Fusionsprotein jedoch zeigt keine Ähnlichkeit/Gleichheit in der Aminosäuresequenz mit dem kleine Untereinheit-Vorläufer, vor allem in der Nähe der Processingstelle davon, auf die unmittelbar das Transitpeptid folgt. Dies legt nahe, daß die gesamte Sequenzinformation, die für Translokation benötigt wird, sich innerhalb des Transitpeptid befindet.
Unter normalen physiologischen Wachstumsbedingungen für Pflanzen wird der kleine Untereinheit-Vorläufer schnell aufgenommen und durch die Chloroplasten prozessiert, und ein großer freier Pool von nichtprozessiertem Vorläufer wird nicht beobachtet1,10. Es wurde hier gezeigt, daß in Tabakzellen transformiert mit pGV3851::pGSSTneo3 die gesamte in entweder rohen Zellextrakten oder isolierten Chloroplastenfraktionen beobachtete NPT(II)-Aktivität auf dem verwendeten Gelsystem&sup4;&sup7; mit gleicher elektrophoretischer Mobilität zum ursprünglichen NPT(II) wandert. Processing des TP-NPT(II) Proteins wird wahrscheinlich mit der gleichen löslichen, mit Chloroplasten assoziierten Protease¹&sup8; ausgeführt, die für das Processing des Vorläufers der kleinen Untereinheit verantwortlich ist. Es ist daher wahrscheinlich, daß das Processing des TP-NPT(II) Fusionsproteins an der gleichen Cys/Metstelle (Fig. 8B) erfolgt, die in dem Vorläufer für die kleine Untereinheit verwendet wurde. Es kann daher hypothetisch angenommen werden, daß das Transitpeptid nicht nur Translokation sondern auch stellenspezifisches Processing vermitteln kann. Weiterhin erfolgen beide Translokations- und Processingstufen offensichtlich ziemlich wirksam in pGV3851::pGSSTneo3-transformierten Tabakzellen, da innerhalb der Nachweisgrenzen unseres Versuchssystems die gesamte beobachtete NPT(II)-Aktivität der prozessierten Form des TP-NPT(II) Fusionsproteins entsprach.
Die hier wiedergegebenen Ergebnisse zeigen erneut deutlich, die Anwendbarkeit der Verwendung bzw. des Einsatzes von Agrobacterium-vermittelter Zelltransformation, um Fremdgene in Pflanzen einzuführen.

Beispiel III

Konstruktion eines Plasmids, das für ein chimäres Gen codiert, welches das TP-NPT(II) Fusionsprotein codiert und worin die codierenden Sequenzen unter der Kontrolle eines Fremdpromotors sind (Fig. 14). Die Konstruktion startet von pGSSTneo3. Dieses Plasmid wurde dann mit EcoRI und Hind III abgebaut. Die überstehenden Enden der langen Fragmente wurden mit der Klenow Polymerase aufgefüllt. Die erhalten DNA wurde dann an ein SauIIIA Fragment (270 bp) ligasiert, das vom Plasmid pLGV 2382 veröffentlicht von . . . stammte.
Dieses SauIIIA Fragment enthielt den Promotor der Nopalinsynthase (HERRERA-ESTRELLA L. et al. (1983) Embo. J., 2, 987-995). Das letztere Fragment wurde auch mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase behandelt. Das so reparierte SauIIIA Fragment und das reparierte Fragment vom pGSSTneo3 wurden dann mit T4 Ligase ligasiert, wodurch Plasmid pLSSTneol erhalten wurde. Das Plasmid, das die in der richtigen Richtung orientierte Promotorregion enthielt, wurde durch Restriktionsanalyse mit dem SacII Restriktionsenzym und BamHI identifiziert. Das Plasmid (pLSSTneo1), das erwiesenermaßen das größte SacII-BamHI Fragment enthielt, war auch dasjenige, welches die Promotorregion und das TP-NPTII Fragment in der richtigen Orientierung und unter Kontrolle des genannten Promotors enthielt.
Es wird somit ein anderes Plasmid gezeigt, das dieses Mal einen konstitutiven Promotor anstelle des normalen blattspezifischen Lichtinduzierbaren Promotors besitzt. Infolgedessen wurde ein Plasmid erhalten, welches das stromabwärts von dem Promotor lokalisierte Protein veranlassen kann, auch im Dunkeln exprimiert zu werden und auch in anderen Geweben der Pflanze. Auf eine solche Weise kontrolliert man das Ausmaß der Produktion von Metaboliten, die von Interesse sind, beispielsweise Fettsäuren oder Aminosäuren.
Es sei darauf hingewiesen, daß die Erfindung es auch ermöglicht, ein Gen, welches normalerweise unter photosynthetischen Bedingungen exprimiert wird, unter die Kontrolle eines Promotors zu stellen, der normalerweise konstant (Tag und Nacht) arbeitet. Auf solch einem Weg und beispielsweise kann man die konstante/beständige Produktion einer bestimmten Aminosäure unter Kontrolle eines Promotors, der in Saaten bzw. Samen wirkt, erhalten.
Die Erfindung öffnet damit den Weg zu bedeutenden landwirtschaftlichen Anwendungen, an denen Chloroplastfunktionen beteiligt sind. Im einzelnen ermöglicht sie das Einführen bzw. Einbauen von Proteinen kontrollierter Struktur in Pflanzenzellen-Chloroplasten. Diese Proteine können in den Chloroplasten entweder als solche oder als Fusionen mit Proteinen oder Proteinuntereinheiten, die durch natürliche Gene codiert und normalerweise in den Pflazenzellen-Chloroplasten transportiert werden, eingeführt werden. Diese Proteine können entweder Fremdproteine für die Pflanzenzellen die transformiert werden sollen sein, oder endogenen Proteinen ähnlich sein, sich jedoch von diesen durch kontrollierte Mutationen unterscheiden. Insbesondere bietet die Erfindung nun die Möglichkeit, nach Wunsch Gene zu modifizieren, die ein bestimmtes Protein enthalten, beispielsweise um die Aktivität des Enzyms, das durch die Chloroplasten-Gene codiert wird zu verbessern. Die Erfindung bringt auch die Möglichkeit den im natürlichen Gen eingeschlossenen endogenen Promotor durch einen anderen Promotor zu ersetzen, um so in einer kontrollierten Weise die Produktion der Chloroplastenproteine zu regeln.
Die Erfindung bietet weiterhin wertvolle Werkzeuge für ein besseres Verständnis der Rolle, die von verschiedenen Bereichen von transportierten Proteinen, welche mit Chloroplast-codierten Proteinen in Wechselwirkung stehen, eingenommen wird. Sie ermöglicht auch die Untersuchung, ob bestimmte chimäre Gene den Transfer von normalerweise durch den Chloroplasten codierten Proteinen in diese Organelle zurücklenken können. Modellsysteme von Chloroplast-codierten Genen, die für Grundlagenforschung und für landwirtschaftliche Anwendung wichtig sind, stehen leicht zur Verfügung, beispielsweise die große Untereinheit von RuBP Carboxylase, die die katalytische Stelle des Holoenzyms enthält, oder das 32 K Protein, welches Resistenz gegenüber bestimmten Herbiziden verleiht. Die Ähnlichkeit/Gleichheit zwischen den Ergebnissen die bei in vivo und in vitro Untersuchungen erhalten werden, legt auch nahe, daß die Produktion in E. coli von Fusionsproteinen, die aus Segmenten von Kern-codierten Organellen- Polypeptiden und einem enzymatischen Reporter zusammengesetzt sind, eine kraftvolle Technik für die schnelle Analyse der am Proteinimport durch isolierte Organellen beteiligten Signale und Vorgänge ist.
Die Erfindung stellt weiterhin die Mittel bereit, die chimäre Veränderung von Pflanzen mit einem Potential für Aminosäureüberproduktion oder Verbesserung von Pflanzenproduktivität ermöglichen und daher Bedürfnissen gerecht werden, die bereits in der Einleitung dieser Anmeldung aufgezählt worden sind.
Die Verwendung von Transitpeptiden, um spezifisch Polypeptide im Chloroplasten zu treffen, bietet auch die Möglichkeit, Gene, die Sequenzen enthalten, welche Schlüsselenzyme gegebener Wege enthalten, in solcher Weise gentechnisch zu verändern, daß die genannten Schlüsselenzyme nicht länger den normalen Regulationssystemen in den natürlichen Pflanzenzellen unterliegen.
Die Erfindung bietet auch Mittel zur Lösung anderer Probleme, die in der Beschreibungseinleitung genannt worden sind, beispielsweise die Produktion von herbizidresistenten Pflanzen. Tatsächlich stellt die Erfindung nun eine Methode zur Verfügung zur Fusion einer "zweiten Sequenz", die das interessierende Protein codiert, mit einer ersten Sequenz, die das Transitpeptid codiert, wobei das so produzierte chimäre Gen in der Lage ist, nach seiner Insertion in die genetische DNA der Zellen der Pflanzen, welche interessiert, die Translokation des interessierenden Proteins in die Chloroplasten zu kontrollieren.
Die Erfindung öffnet den Weg zu zahlreichen anderen Anwendungen. Ein paar zusätzliche Beispiele werden nachfolgend gegeben, in denen das Enzym Ribulose-diphosphat-carboxylase (RuBPCase) ins Spiel gebracht werden kann.

a) Verbesserung des Verhältnissses Carboxylase/Oxidase.

Dieses Enzym katalysiert zwei enzymatische Reaktionen:
1) Die Kondensation von einem Molekül Ribulosediphosphat mit einem Molekül CO&sub2; unter Bildung von zwei Molekülen Phosphoglycerinsäure (Carboxylasereaktion).
2) Reaktion eines Ribulose-diphosphat-Moleküls mit einem Molekül Sauerstoff unter Bildung von Phosphoglycolat (Oxidasereaktion).
Die letztere ist eine mit der Carboxylierung konkurrierende Reaktion. Infolgedessen begrenzt sie die Wirksamkeit der Umwandlung von CO&sub2; in organische Verbindungen.
Die Erfindung bietet nun eine Technik der stellengerichteten Mutagenese, die die kontrollierte Veränderung eines bestimmten Proteins ermöglicht, um diesem den vollen Effekt zu geben. Beispielsweise kann jeweils die Modifizierung der RuBPCase in solcher Weise in Betracht gezogen werden, daß das Carboxylase/Oxidase-Verhältnis sehr viel günstiger ist. Ein anderer Weg ist, einfach ein Gen, das für die RuBPCase codiert, aus einer anderen Pflanzen zu nehmen, oder aus einem anderen Organismus wie Cyanobakterien, die ein günstigeres Verhältnis haben, es mit einem Nucleinsäurefragment zu fusionieren, das einen Promotor und ein Transitpeptid enthält, die in der Pflanze, welche interessiert, wirksam sind und das erhaltene chimäre Gen in die Pflanze einzuführen.

b) Verbesserung von Pflanzenproduktivität.

Es gibt mehrere Faktoren, die die Pflanzenproduktivität begrenzen, beispielsweise Mangel an Nährstoffen und geringe Effizienz in Lichternte bzw. Lichtausnutzung oder CO&sub2;-Assimiliation. Da der Mangel an Nährstoffen durch Einsatz von Düngemitteln behoben werden kann, wird einer der hauptsächlichen einschränkenden Faktoren für Pflanzenproduktivität die CO&sub2;-Assimilation. Die CO&sub2;-Aufnahme durch ein Blatt hängt überwiegend von zwei Faktoren ab:
1) Die stoffliche Diffusion von CO&sub2; entlang der Pflanzenzellen und
2) die Wirksamkeit der CO&sub2;-Umwandlung zur organischen Verbindung. Es gibt-zwar verschiedene Wege für die CO&sub2;-Assimilation in höheren Pflanzen, aber gemeinsam ist ihnen die begrenzende Stufe und zwar die Effizienz bzw. Wirksamkeit des Enzyms RuBPCase. Hier erneut bietet die Erfindung Mittel zur Überwindung dieses Problems, zumindest teilweise, beispielsweise beim Einführen in die Zellen der Pflanze eines chimären Gens, welches einerseits miteinander fusionierte Sequenzen, die eine Promotorregion sowie ein Fragment, das für ein Transitpeptid codiert, die in dieser Pflanzen besonders wirksam sind enthalten und andererseits eine Sequenz, die eine stärker effiziente RuBPCase codiert und aus einer anderen Pflanze stammt, enthält.
Kulturen, die Plasmide, Zwischen-Klonierungs-Vektoren und Mikroorganismen, hergestellt durch die Verfahren nach der Erfindung umfassen, werden beispielhaft erläutert durch Kulturen, die in der deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) Göttingen/Deutschland hinterlegt sind. Diese Kulturen werden nachfolgend identifiziert:
(1) E. coli HB 101 (pSRP6)
(2) E. coli HB 101 (pKM 109/9)
(3) E. Coli HB 101 (pGSST3)
Diese Kulturen wurden am 27. Dezember 1984 hinterlegt. Diesen Kulturen wurden die Zugangs- bzw. Hinterlegungsnummern 3172 (1), 3171 (2), 3170 (3) zugeteilt.
Andere in dieser Anmeldung genannte Kulturen wurden ebenfalls am oder vor dem 27. Dezember, d. h. am 20. Dezember 1984 hinterlegt. Plasmide wurden in den Mikroorganismen gehalten, die in der linken Spalte der nachfolgenden Tabelle identifiziert sind.
Diesen Kulturen wurden die folgenden Hinterlegungsnummern zugeteilt: Internationaler Code/Taxonomische Bezeichnung Plasmid im Stamm DSM Nr.

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Claims

1. Verfahren zur Bereitstellung eines Fremdproteins oder -polypeptids in einem Chloroplasten einer Pflanzenzelle, das durch folgende Stufen gekennzeichnet ist:

A. Exprimieren eines chimären Vorläufers des genannten Fremdproteins oder -polypeptids im Cytoplasma der genannten Zelle; dabei wird der Vorläufer durch eine chimäre DNA-Sequenz im Genom der genannten Zelle codiert, und die genannte chimäre DNA-Sequenz umfaßt:

i) eine erste Nucleinsäuresequenz, die für ein Transitpeptid eines cytoplasmischen Vorläufers eines Chloroplastenproteins oder -peptids einer Pflanzenart codiert und

ii) eine zweite Nucleinsäuresequenz, die für das genannte Fremdprotein oder -polypeptid codiert, das heterolog ist gegenüber der ersten Nucleinsäuresequenz und das sich stromabwärts von der ersten Nucleinsäuresequenz und in der gleichen Transkriptionseinheit befindet wie die erste Nucleinsäuresequenz; und darauf

B. Transportieren des genannten Fremdproteins oder -polypeptids vom Cytoplasma der genannten Zelle in den genannten Chloroplasten unter Entfernung des genannten Transitpeptids aus dem Fremdprotein oder -polypeptid.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdprotein oder -polypeptid, wenn in Chloroplasten von Zellen der genannten Pflanze vorhanden, dieser Pflanze Widerstandsfähigkeit gegenüber einem Herbizid verleiht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte chimäre DNA-Sequenz auch eine dritte Nucleinsäuresequenz umfaßt, die eine N-terminale Region des genannten Chloroplastenproteins oder -polypeptids der genannten Pflanzenart codiert und die sich stromabwärts von der genannten ersten Nucleinsäuresequenz befindet; wobei das 5'-Ende der genannten dritten Nucleinsäuresequenz dem 3'-Ende der genannten ersten Nucleinsäuresequenz unmittelbar benachbart ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Nucleinsäuresequenz mindestens einen Teil einer Cytoplasma-Untereinheit des genannten Chloroplastenproteins oder -polypeptids der genannten Pflanzenart codiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Nucleinsäureseqenz nicht mehr als die genannte Cytoplasma-Untereinheit des genannten Chloroplastenproteins oder -polypeptids der genannten Pflanzenart codiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die dritte Nucleinsäuresequenz jeweils ein Exon enthalten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Nucleinsäuresequenz ein Intron enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Nucleinsäuresequenz im wesentlichen aus einer Nucleinsäuresequenz mit Sequenzhomologie gegenüber Nucleinsäuresequenzen, die N-terminale Teile von Cytoplasma-Untereinheiten von Chloroplastenproteinen oder -polypeptiden, die der Sojabohne, der Erbse, der Wasserlinse und Weizen gemeinsam sind, codieren, besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Nucleinsäuresequenz das Pentapeptid M-Q-V-W-P codiert.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das 3'-Ende der ersten Nucleinsäuresequenz im wesentlichen dem 5'-Ende der zweiten Nucleinsäuresequenz direkt anliegt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nucleotid-Linker zwischen der ersten und der zweiten Nucleinsäuresequenz vorhanden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Nucleinsäuresequenz nicht für eine N-terminale Region eines Chloroplastenproteins oder -polypeptids codiert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die chimäre DNA-Sequenz frei ist von einem Intron zwischen der ersten und der zweiten Nucleinsäuresequenz.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Codon der zweiten Nucleinsäuresequenz für Methionin codiert und dem letzten Codon der ersten Nucleinsäuresequenz benachbart ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die chimäre DNA-Sequenz auch einen Promotor umfaßt, der sich stromaufwärts von der ersten Nucleinsäuresequenz befindet, so daß sowohl die erste als auch die zweite Nucleinsäuresequenz unter Transkriptionskontrolle des Promotors stehen; und worin der Promotor eine Nucleinsäuresequenz enthält, die von Polymerasen der Zelle erkannt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor und die erste Nucleinsäuresequenz heterolog sind.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor aus einem Plastocyanin-Gen, einem Ferredoxin- NADP+-Oxydereductase-Gen oder einem Nopalinsynthase-Gen stammt oder normalerweise mit der ersten Nucleinsäuresequenz assoziiert ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Nucleinsäuresequenz für ein Transitpeptid eines Cytoplasma-Verläufers einer kleinen Untereinheit einer Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Oxygenase codiert.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Nucleinsäuresequenz für ein Bakterien- oder ein Pflanzenprotein oder -polypeptid codiert.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Nucleinsäuresequenz für ein Chloroplastenprotein oder -polypeptid oder für ein mutiertes Chloroplastenprotein oder -polypeptid codiert.

21. Zelle, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, oder Pflanze oder Pflanzenzellkultur, die solche Zellen enthält, wobei jede solche Zelle i) die chimäre DNA-Sequenz in ihrem Genom, vorzugsweise in ihrem Kerngenom, enthält, und ii) einen Chloroplasten enthält, der das Fremdprotein oder -polypeptid frei von dem Transitpeptid enthält.

22. Samen der Pflanze nach Anspruch 21.