MX2011003266A - Mutantes de acetohidroxiacido sintasa resistentes a herbicidas y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona plantas transgénicas o no transgénicas con niveles mejorados de tolerancia a herbicidas inhibidores de AHAS. La invención proporciona también ácidos nucleicos que codifican para mutantes de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL), vectores de expresión, plantas que comprenden los ácidos nucleicos que codifican para las subunidades de AHASL que contienen una, dos o más mutaciones, plantas que comprenden estos ácidos nucleicos mutantes de la subunidad de AHASL, métodos para elaborar y usar los mismos, y métodos para controlar malezas.

Description

MUTANTES DE ACETOHIDROXIACIDO SINTASA RESISTENTES A HERBICIDAS Y METODOS DE USO Campo de la Invención La invención se refiere a plantas de Brassica resistentes a los herbicidas y a nuevas secuencias de polinucleótidos que codifican a proteínas de subunidades grandes de acetohidroxiácido sintasa de Brassica resistente a herbicidas que inhiben la AHAS, semillas de tales plantas, y a métodos que usan tales plantas.

Antecedentes de la Invención La acetohidroxiácido sintasa (AHAS; EC 4.1.3.18, conocida también como acetolactato sintasa o ALS) es la primera enzima que cataliza la síntesis bioquímica de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine" , en Plant Amino Acid, Singh, B. K. , ed. , Marcel Dekker Inc. Nueva York, Nueva York, págs . 227-247) . AHAS es el sitio de acción de cinco familias de herbicidas estructuralmente diferentes incluyendo las sulfonilureas (Tan et al. (2005) Pesfc Manag. Sci. 61-246-57; Mallory-Smith y Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626; 'LaRossa y Falco (1984) Trends Biotechnol . 2: 158-161), las imidazolinonas (Shaner et al. (1984) Plant Physiol . 76: 545-546), las triazolopirimidinas (Subramanian y Gerwick (1989) REF . : 218858 "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines" , en Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J. R. y Sonnet, P.E., eds . , ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., págs . 277-288); Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith y Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626); y los N-sulfonilamino carbonilos. Los herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea son ampliamente usados en la agricultura moderna debido a su efectividad a bajas dosis de aplicación y relativa falta de toxicidad en animales. Inhibiendo la actividad de AHAS, estas familias de herbicidas evitan el crecimiento y desarrollo ulterior de plantas susceptibles incluyendo muchas especies de malezas.

Para permitir que los granjeros tengan mayor flexibilidad en los tipos y dosis de herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea que usan, se desea frecuentemente una mayor tolerancia a los herbicidas. Además, los cultivadores de plantas que desarrollan variedades tolerantes a herbicidas desean trabajar con mutaciones que provean mayor tolerancia a herbicidas, permitiéndoles mayor flexibilidad en las bases de germoplasma que usan para desarrollar sus variedades. Para producir tales variedades resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS, los cultivadores de plantas necesitan desarrollar líneas de selección adicionales, preferentemente con mayor resistencia a herbicidas que inhiben la AHAS . Por lo tanto, se necesitan variedades de plantas de cultivo y líneas de selección resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS adicionales, así como también métodos y composiciones para la producción y el uso de variedades y líneas de selección resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS.

Breve Descripción de la Invención La presente invención provee moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) que comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad, la presente invención provee vectores de expresión que comprenden una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido (AHASL) de Brassica que comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad, la presente invención provee plantas de Brassica que comprenden una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica tolerante a herbicidas que comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

En una modalidad adicional, la presente invención provee semillas de Brassica capaces de producir una planta de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica tolerante a herbicidas que comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

En otra modalidad, la presente invención provee recipientes de semillas de Brassica en donde el recipiente comprende por lo menos 10% de semillas capaces de producir plantas de Brassica que comprenden una molécula de ácido nucleico mutada que codifica una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23. En otra modalidad, la presente invención provee métodos para controlar malezas en la cercanía de una planta de Brassica, comprendiendo el método aplicar una cantidad efectiva de un herbicida que inhibe la AHAS a las malezas y a la planta de Brassica, en donde la planta de Brassica comprende en su genoma por Ib menos una copia de una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad grande de acetohidroxiácido (AHASL) mutagenizada que codifica una proteína de AHASL resistente a herbicidas que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

La presente invención provee también un método de selección de una planta de Brassica, en donde el método comprende: cruzar una primera línea de Brassica con una segunda línea de Brassica, en donde la primera línea de Brassica es una planta de Brassica obtenida de cultivar una semilla de una línea de Brassica mutante, y obtener semillas. Tales líneas de Brassica mutantes incluyen BnCL120C7, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso de ATCC PTA-9278; BnCL131Al, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso ATCC PTA-9279; BnCL140B3, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso ATCC PTA-9402; y BnCL140C7, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso ATCC PTA-9403.

También se proveen semillas de líneas de la planta Brassica mutante denominadas BnCL120C7, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso de ATCC PTA-9278; BnCL131Al, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso ATCC PTA-9279; BnCL140B3( una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso ATCC PTA-9402; BnCL140C7, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso ATCC PTA-9403; PMlPM2/BnCL131Al , una muestra de la semilla que fue depositada bajo el N. ° de acceso ATCC PTA-10321.

La presente invención también provee moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23.

La presente invención provee además plantas de Brassica que comprenden una molécula de ácido nucleico aisladas que codifica una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23.

Además, la presente invención provee semillas de Brassica capaces de producir una planta de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico mutada que codifica una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23.

La presente invención provee además métodos de selección de una planta de Brassica, en donde el método comprende: cruzar una primera línea de Brassica con una segunda línea de Brassica, en donde la primera línea de Brassica es una planta de Brassica obtenida de cultivar una semilla de una línea mutante BnCL131Al, una muestra de la semilla fue depositada bajo el N.° de acceso ATCC PTA-9279, y obtener semillas.

La presente invención también provee plantas de Brassica no transgénicas que comprenden una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica una proteína AHAS que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

También se proveen métodos para producir una planta de Brassica no transgénica que es tolerante de por lo menos un herbicida que inhibe AHAS, que comprende: (a) introducir en células de planta de Brassica una oligonucleobase de reparación de genes con una mutación direccionada en el gen de AHAS para producir células vegetales con un gen de AHAS mutante que expresa una proteína de AHAS que está mutada en una o más posiciones de aminoácidos, correspondiendo las posiciones a una posición seleccionada entre el grupo que consiste en A122, R199, T203, S653 y G654 de SEQ ID NO: 23; (b) identificar una célula de planta que tiene un crecimiento sustancialmente normal en comparación con una célula de planta de tipo salvaje correspondiente en presencia de un herbicida que inhibe la AHAS; y (c) regenerar una planta de Brassica tolerante a herbicidas, no transgénica, que tiene un gen de AHAS mutado de la célula de planta.

Se proveen además métodos para producir una semilla de Brassica híbrida Fx que comprende cruzar una primera planta de Brassica que tiene una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica tolerante a herbicidas que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23, con una segunda planta de Brassica; y obtener semillas .

También se proveen células vegetales que comprenden una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica una proteína de AHAS que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

También se proveen métodos para aumentar la resistencia a herbicidas de una planta que comprende cruzar una primera planta de Brassica con una segunda planta de Brassica, en donde la primera planta de Brassica comprende en su genoma por lo menos una copia de una molécula de ácido nucleico que codifica una subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) mutagenizada que codifica una proteína de AHASL resistente a herbicidas que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23; y obtener semillas resultantes de la cruza.

Además, se proveen las plantas de Brassica . que comprenden una molécula de ácido nucleico mutagenizado que codifica una proteína AHASL Brassica tolerante a herbicida que comprende una mutación en una posición correspondiente a la posición A122 de la SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición correspondiente a la posición S653 de la SEQ ID NO: 23 y al menos una molécula de ácido nucleico adicional que codifica una proteína de interés.

También se proveen métodos de control de malezas en la proximidad de una planta de Brassica, donde el método comprende la aplicación de una cantidad efectiva de al menos un herbicida inhibidor de AHAS a las malezas y a la planta de Brassica, en donde la planta de Brassica comprende en su genoma al menos una copia de una primera molécula de ácido nucleico AHASL que codifica una proteína AHASL resistente a herbicida que tiene una mutación en la posición de aminoácido correspondiente a A122 y S653 de la SEQ ID NO: 23, y al menos una segunda molécula de ácido nucleico AHASL que codifica una segunda proteína AHASL resistente a herbicida que tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste en A122T, P197S, A205V, 574L, S653N, y combinaciones de ellos.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 provee una representación esquemática de la actividad de AHAS en extractos de plantines de Brassica .

La Figura 2 provee los resultados de análisis de. aspersor de herbicida de plantas de Brassica de tipo salvaje y un ejemplo de una planta de Brassica que contiene una molécula de ácido nucleico mutada de la presente invención.

La Figura 3 provee un alineamiento de una secuencia de ácidos nucleicos entre moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención (SEQ ID NOS 11-16, respectivamente, en orden de aparición) .

La Figura 4 provee un alineamiento de una secuencia de aminoácidos entre proteínas de AHAS de la presente invención (SEQ ID NOS 17-21, respectivamente, en orden de aparición) .

La Figura 5 provee el ácido nucleico y la' secuencia de aminoácidos de la proteína . de AHASL de Arabidopsis thaliana que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 5. La secuencia de ADN descrita como SEQ ID NO: 22 y la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO: 23.

La Figura 6 muestra evaluaciones de lesiones en cultivos de campo de líneas de B. napus 15 días después del tratamiento con Imazamox.

Descripción Detallada de la Invención La presente descripción se refiere a nucleótidos aislados que codifican proteínas de acetohidroxiácido sintasa (AHAS) mutante de plantas resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS y a métodos relacionados con los mismos. En una modalidad, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas codifican proteínas de AHAS que tienen una o más sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de AHAS de Brassica napus de tipo salvaje (es decir, no mutada) . La descripción también provee vectores recombinantes que comprenden tales moléculas de ácidos nucleicos así como también plantas transgénicas que contienen tales vectores y moléculas de ácidos nucleicos.

La presente descripción también provee plantas no transgénicas que comprenden una secuencia que codifica la AHAS mutada, por ejemplo, una secuencia que codifica la AHAS III mutagenizada, que tiene dos o más sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de tipo salvaje. La secuencia que codifica la AHAS mutada puede tener una sustitución de aminoácidos en una posición que corresponde a la posición 122 y en una posición que corresponde a la posición 653 en la secuencia de la proteína de AHAS de Arabidopsis (Figura 5; SEQ ID NO: 23). También se proveen métodos para preparar tales plantas, y métodos de selección usando tales plantas.

En algunas modalidades, las plantas, semillas, métodos y composiciones de la presente invención emplean el uso de moléculas de ácidos nucleicos que codifican a las proteínas de AHAS que tienen mutaciones que resultan en la expresión de proteínas de AHAS que tienen una sustitución de alanina a treonina en una posición que corresponde a la posición 122 y una sustitución de serina a asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 (también mencionada a veces en la presente como CLB-1) . En otras modalidades, las plantas, semillas, métodos y composiciones de la presente invención emplean el uso de moléculas de ácidos nucleicos que codifican a las proteínas de AHAS que tienen mutaciones que resultan en la expresión de proteínas de AHAS que tienen un aminoácido seleccionado entre arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptófano, lisina, glicina, histidina, serina, prolina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, metionina, leucina, asparagina, isoleucina y valina, sustituido en una posición que corresponde a la posición 122 y un aminoácido seleccionado entre arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptófano, lisina, glicina, histidina, alanina, prolina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, metionina, leucina, treonina, isoleucina y valina sustituido en una posición que corresponde a la posición 653.

También se proveen métodos para controlar malezas usando las plantas transgénicas y no transgénicas que contienen las secuencias de AHAS mutadas como se provee en la presente .

Además, la solicitud provee líneas de Brassica resistentes a herbicidas mencionadas en la presente como BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3, BnCL140C7, así como también semillas, progenie y derivados de los mismos, que fueron producidos usando los métodos de mutagénesis como se describe en detalle más abajo.

La presente invención también provee una mayor tolerancia a los herbicidas y métodos para obtener la mayor tolerancia a los herbicidas, que se logra cuando se combinan las mutaciones de AHAS en una sola secuencia codificadora de AHAS. En un ejemplo, las plantas que combinan las mutaciones correspondientes a las posiciones A122 y S653 de la secuencia de proteínas de AHAS de Arabidopsis (Figura 5; SEQ ID NO: 23) demuestran tal mayor tolerancia a los herbicidas. La tolerancia a los herbicidas resultante está significativamente aumentada, por ejemplo, teniendo un efecto sinérgico, sobre el nivel de tolerancia que se observa cuando los niveles de tolerancia obtenidos en plantas que contienen cualquiera de las mutaciones correspondientes a las posiciones A122 o S653, individualmente, se agregan juntas.

Antes de describir la invención con mayores detalles, se definirán primero los siguientes términos.

Definiciones Una planta "tolerante a los herbicidas" o "resistente a los herbicidas" se refiere a una planta que es tolerante o resistente a por lo menos un herbicida que inhibe la AHAS a un nivel que normalmente mataría, o inhibiría el crecimiento de, una planta normal o de tipo salvaje que no tiene una molécula de ácido nucleico de AHAS mutada. Por molécula de ácido nucleico de AHAS resistente a herbicidas" se entiende una molécula de ácido nucleico que comprende una o más mutaciones que da por resultado una o más sustituciones de aminoácidos con relación a la proteína de AHAS no mutada, en donde las mutaciones resultan en la expresión de una proteína de AHAS resistente a herbicidas. Por "proteína de AHAS tolerante a herbicidas" o "proteína de AHAS resistente a herbicidas" , se entiende que una proteína de AHAS como esta desarrolla mayor actividad de AHAS con relación a la actividad de AHAS de una proteína de AHAS de tipo salvaje, cuando se encuentra en presencia de por lo menos un herbicida que se sabe que interfiere con la actividad de AHAS y a una concentración o nivel del herbicida que se sabe que inhibe la actividad de AHAS de la proteína de AHAS de tipo salvaje. Además, la actividad de AHAS de una proteína de AHAS tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas como ésta puede ser denominada en la presente actividad de AHAS "tolerante a herbicidas" o "resistente a herbicidas" .

Para la presente invención, los términos "tolerante a herbicidas" y "resistente a herbicidas" se usan en forma intercambiable y pretenden tener un significado equivalente y un alcance equivalente. Similarmente , el término "tolerancia a herbicidas" y "resistencia a herbicidas" se usan en forma intercambiable y pretenden tener un significado equivalente y un alcance equivalente. Igualmente, los términos "resistente a imidazolinona" y "resistencia a imidazolinona" se usan en forma intercambiable y pretenden tener un significado equivalente y un alcance equivalente a los términos "tolerante a imidazolinona" y "tolerancia a imidazolinona" , respectivamente. La "resistencia a herbicidas" o la "tolerancia a herbicidas" se puede medir por comparación de la actividad de AHAS obtenida de extractos de células vegetales que contienen la secuencia de AHAS mutagenizada y de plantas que no tienen la secuencia de AHAS mutagenizada en presencia de un inhibidor de AHAS, tal como imazamox, usando los métodos descritos en Singh, et al., Anal. Biochem. (1988), 171: 173-179. En una modalidad, las plantas resistentes o tolerantes demuestran más de 25% de no inhibición usando los métodos descritos en Singh et al. (1988) cuando se ensayan usando 100 µ? de imazamox.

Una proteína o una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada" , o una parte biológicamente activa de la misma, está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que acompañan normalmente o interactúan con la proteína o la molécula de ácido nucleico como se encuentra en su ambiente natural. Así, una proteína o molécula de ácido nucleico aislada o purificada está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando es producida por técnicas recombinantes , o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. En una modalidad, un ácido nucleico "aislado" está sustancialmente libre de secuencias (preferentemente secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente a la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada es flanqueada por sus secuencias genómicas nativas que controlan su expresión en la célula, por ejemplo, el promotor nativo o la región no traducida 3' nativa. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparados de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (por peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o la parte biológicamente activa de la misma es producida en forma recombinante, preferentemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (por peso seco) de precursores químicos o productos químicos que no son de proteínas de interés.

El término "tipo salvaje" se usa para referirse a una molécula de ácido nucleico o proteína que se puede hallar en la naturaleza a diferencia de la producida artificialmente o mutada por el hombre. En una modalidad, una secuencia de ácidos nucleicos de AHAS de "tipo salvaje" se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos de BN-02 en la Figura 3. Similarmente , una planta de Brassica de tipo salvaje se refiere a una planta de Brassica que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de BN-02 en la Figura 3. El término también se usa para referirse a plantas que contienen la secuencia de ácidos nucleicos de AHAS de BN-02 en la Figura 3. El uso del término "tipo salvaje" no pretende implicar necesariamente que una planta, tejido de planta, célula de planta u otra célula huésped no tiene ADN recombinante en su genoma, y/o no posee características resistentes a herbicidas que sean diferentes de las descritas en la presente.

Una molécula "mutada" o una "molécula mutante" o una molécula "mutagenizada" , tal como una molécula de ácido nucleico o una molécula de aminoácido, se refiere a una molécula de ácido nucleico o polipéptido que tiene una o más sustituciones, deleciones o transversiones de ácidos nucleicos o aminoácidos en comparación con el ácido nucleico o el aminoácido en una posición equivalente de una molécula no mutada o de tipo salvaje. Los términos se refieren a una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptidos que es modifica de su forma de tipo salvaje o nativa como resultado de la manipulación humana deliberada y no incluye secuencias naturales.

Como se usa en la presente, los términos "sinergia", sinérgico" y derivaciones de los mismos, tales como en un "efecto sinérgico" se refieren a circunstancias en las cuales la actividad biológica de una combinación de uno o varios polipéptidos de AHAS mutados y/o una combinación de mutaciones en una secuencia codificadora individual, tal como una molécula de ácido nucleico de AHAS que codifica y un polipéptido de AHAS que tiene mutaciones en posiciones correspondientes a las posiciones A122 y S653, es por lo menos 10% mayor que la suma de las actividades biológicas de polipéptidos de AHAS que tienen mutaciones individuales. La actividad biológica para los polipéptidos de AHAS puede ser medida comparando las tasas de lesiones de plantas que contienen las moléculas mutagenizadas de la presente invención con las tasas de lesiones combinadas de plantas que contienen las mutaciones respectivas 15 días después del tratamiento con un herbicida que inhibe la AHAS , tal como imazamox .

Una "posición equivalente" o "posición correspondiente" se refiere a una posición que está dentro de la misma región conservada como una posición de aminoácido de referencia. Por ejemplo, con respecto a una secuencia de la proteína de AHAS, las posiciones de aminoácidos descritas en la presente corresponden a las posiciones de aminoácidos en la proteína de AHASL de Arabidopsis thaliana, proteína que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 5 (Figura 5; SEQ ID NO; 23) . A menos que se indique de otra manera en la presente, las posiciones de aminoácidos particulares se refieren a la posición correspondiente de ese aminoácido en la secuencia de aminoácidos de AHASL de A. thaliana de longitud completa presentada en la Figura 5 (SEQ ID NO: 23). Además, las posiciones de aminoácidos actuales pueden variar dependiente de si los aminoácidos son agregados a, o removidos de, por ejemplo, el extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos, sin embargo, la posición equivalente podría ser determinada aún a través de un alineamiento con una secuencia de referencia, tal como la Figura 5 (SEQ ID NO: 23) . Así, la invención comprende las sustituciones amino en la posición mencionada o posición equivalente (por ejemplo, "posición de aminoácido 653 o posición equivalente").

Un "fragmento" se refiere a una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de AHASL o una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína de AHAS de la invención. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de AHASL de la invención puede codificar una parte biológicamente activa de una proteína de AHASL, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación o un cebador de PCR usando métodos descritos más abajo. Un fragmento de un polipéptido de AHAS puede comprender un fragmento biológicamente activo de la proteína de AHAS.

La expresión "variantes y fragmentos biológicamente activos" se refiere a variantes y fragmentos de los polipéptidos y moléculas de ácidos nucleicos ilustrados que comprenden o codifican la actividad de la AHAS.

La expresión "elemento regulador" , como se usa en la presente, se refiere a un ácido nucleico que es capaz de regular la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico ligado en forma operativa. Los elementos reguladores incluyen, pero no están limitados a, promotores, intensificadores , intrones, 5' UTRs y 3' UTRs . El término "ligado en forma operativa" se refiere a una unión funcional entre un elemento regulador y un segundo ácido nucleico, en donde la secuencia del elemento regulador está involucrada en el control de la expresión de la segunda secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, inicia y/o media en la transcripción y/o traducción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, ligado en forma operativa significa que las secuencias de ácidos nucleicos que son ligadas son contiguas y, en donde sea necesario para unir dos regiones codificadores de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Como se usa en la presente, el término "transgénico" se refiere a cualquier célula, tejido, planta, célula de planta, callo, tejido de planta o parte de planta que contiene toda o parte de por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante .

Moléculas de ácidos nucleicos La invención se refiere, en un aspecto, a moléculas de ácidos nucleicos aisladas relacionadas con las secuencias de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa (AHASL) que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que tienen mutaciones relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos de tipo salvaje (es decir, natural) de la cual se deriva, así como también a fragmentos de tales secuencias que comprenden tales mutaciones. Tales secuencias de ácidos nucleicos aisladas incluyen aquellas de las Figuras 3 y 4. En otro aspecto, la descripción se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican a las proteínas de AHASL que tienen mutaciones con relación a la proteína de tipo salvaje que son capaces de proveer tolerancia o niveles aumentados de resistencia, a los herbicidas que inhiben la AHAS y a tales proteínas de AHASL mutantes . En una modalidad, la secuencia codificadora de AHASL es una secuencia codificadora de AHASL de Brassica, por ejemplo, la secuencia codificadora de AHAS III de Brassica napus que contiene dos mutaciones relacionadas con la secuencia de tipo salvaje. En otra modalidad, la invención provee el aislamiento y la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de AHASL III de Brassica resistente a los herbicidas de una planta de Brassica resistente a los herbicidas que fue producida por mutagénesis de plantas de Brassica de tipo salvaje.

Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser derivadas de cualquier fuente, tal como de fuentes de plantas o bacterianas. En una modalidad, las moléculas de ácidos nucleicos son derivadas de una fuente de planta, tal como una planta de Brassica. Las moléculas de ácidos nucleicos derivadas de una fuente de planta pueden ser derivadas de cualquier especie de Brassica, incluyendo B. napus, B. rapa o B. júncea. Tales moléculas de ácidos nucleicos se pueden derivar de cualesquiera secuencias codificadoras de AHAS, tales como AHAS I, AHAS II, o AHAS III. En una modalidad, las moléculas de ácidos nucleicos comprenden mutaciones en la secuencia de ácidos nucleicos en las posiciones que corresponden a secuencias del codón en las posiciones de aminoácidos 122 (por ejemplo, GCT -> ACT) y/o 653 (por ejemplo, AGT -> AAT) del codón de partida ATG de la secuencia codificadora de AHASL. Sin embargo, se puede producir cualquier mutación en posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 122 y 653 dentro del alcance de la presente descripción.

Además, las mutaciones en las posiciones 122 y 653 de la secuencia de AHAS pueden resultar en la expresión de una proteína de AHAS con cualquier aminoácido distinto de alanina en una posición correspondiente a la posición 122 o cualquier aminoácido distinto de serina en una posición correspondiente a la posición 653. En una modalidad, las mutaciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 122 y 653 pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras, mientras que en otras modalidades, las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras de treonina o asparagina en las posiciones 122 y 653, respectivamente. En otra modalidad, las mutaciones en una posición correspondiente a la posición 122 resultan en la expresión de un aminoácido en esa posición seleccionado entre el grupo que consiste en treonina y valina. En otra modalidad, las mutaciones en una posición correspondiente a la posición 653 resulta en la expresión de un aminoácido de asparagina. En una modalidad, las proteínas de AHAS codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos de la invención comprenden una sustitución serina a asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 (por ejemplo, S653N) del gen de AHASL (basado en la numeración de la Arabidopsis thaliana) y una sustitución de alanina a treonina en una posición que corresponde a la posición 122 (por ejemplo, A122T) . Sin embargo, cualquier sustitución de aminoácidos, incluyendo las sustituciones de aminoácidos conservadoras, se puede realizar en estas posiciones dentro del alcance de la presente descripción. La invención describe además el aislamiento y la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de AHASL de Brassica de tipo salvaje.

En algunas modalidades, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención codifican proteínas de AHAS que tienen mutaciones que resultan en la expresión de proteínas de AHAS que tienen una sustitución de alanina a treonina en una posición que corresponde a la posición 122 y una sustitución de serina a asparagina en una posición que corresponde a la posición 653. En otras modalidades, las moléculas de ácidos nucleicos codifican a las proteínas de AHAS que tienen mutaciones que resultan en la expresión de proteínas de AHAS que tienen un aminoácido seleccionado entre Arginina, Glutamina, Fenilalanina , Tirosina, Triptófano, Lisina, Glicina, Histidina, Serina, Prolina, Ácido glutáraico, Ácido aspártico, Cisteína, Metionina, Leucina, Asparagina, Isoleucina y Valina sustituido en una posición que corresponde a la posición 122 y un aminoácido seleccionado entre Arginina, Glutamina, Fenilalanina, Tirosina, Triptófano, Lisina, Glicina, Histidina, Alanina, Prolina, Ácido Glutámico, Ácido aspártico, Cisteína, Metionina, Leucina, Treonina, Isoleucina y Valina sustituidos en una posición correspondiente a la posición 653. _ Las secuencias de polipéptidos de AHAS mutagenizadas de la presente invención pueden demostrar resistencia o tolerancia a cualquier herbicida que inhibe la AHAS. Tales secuencias de polipéptidos de AHAS mutagenizadas pueden ser resistentes o tolerantes a por lo menos un herbicida que inhibe la AHAS. En una modalidad, las secuencias de polipéptidos de AHAS mutagenizadas de la presente invención demuestran resistencia o tolerancia a un herbicida que inhibe la AHAS seleccionado entre el grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona y herbicidas de sulfonilurea . En otra modalidad, las secuencias de polipéptidos de AHAS mutagenizadas de la presente invención demuestran resistencia o tolerancia a los herbicidas de imidazolinona .

En algunas modalidades, las secuencias de AHAS mutagenizadas que tienen mutaciones en las posiciones correspondientes a las posiciones A122 y S653 proveen niveles de tolerancia a herbicidas sinérgicos . En una modalidad, los niveles de tolerancia a herbicidas obtenidos en plantas que contienen una secuencia de AHAS mutante doble de la presente invención son de por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o mayores, superiores a los niveles aditivos de tolerancia observados en plantas que contienen la secuencia de AHAS que tiene las mutaciones individuales respectivas. Estos niveles de tolerancia sinérgica a herbicidas también se pueden obtener en plantas que tienen las secuencias de AHAS mutagenizadas con mutaciones en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones A122 y S653 en combinación con una o varias secuencias de AHAS mutagenizadas o recombinantes adicionales que codifican una proteína de AHAS tolerante al inhibidor de AHAS.

También se describen las moléculas de ácidos nucleicos mutadas que codifican una proteína de AHAS III de B. napus que tiene una sustitución de alanina a treonina en una posición que corresponde a la posición 122 (A122T) . En una modalidad, tales moléculas de ácidos nucleicos también contienen una segunda mutación en la secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la molécula de ácido nucleico que codifica una sustitución de serina a asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 (S653N) .

La descripción también provee moléculas de ácidos nucleicos aisladas que tienen las secuencias de ácidos nucleicos de BN02-120 o BN02-131 como se presentan en las Figuras 3 y 4, así como también fragmentos y variantes de las mismas .

La descripción también provee moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican a las proteínas de AHASL de Brassica que tienen una o más sustituciones de ácidos nucleicos que resultan en la expresión de una proteína de AHAS que tiene uno o más sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, la invención provee moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden: la secuencia de nucleótidos de BN02-120 o BN02-131 como se presenta en las Figuras 3 y 4, las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de AHASL que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como BN02-102 o BN02-131 como se presenta en la Figura 4, las secuencias de nucleótidos como se presentan en la Figura 3, las secuencias de nucleótidos que codifican a la proteína de AHASL que comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la BN02-120 o BN02-131 en la Figura 4, y fragmentos y variantes de tales secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de AHASL funcionales.

Las secuencias de AHAS mutagenizadas de la presente invención incluyen aquellas que tienen cualquier número de mutaciones además de aquellas mutaciones que corresponden a las posiciones 122 y/o 653. Por ejemplo, la secuencia de AHAS mutagenizada puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones adicionales que pueden ser o bien mutaciones silenciosas o proveer resistencia o tolerancia a las mismas o a otras clases de herbicidas que inhiben la AHAS.

En otra modalidad, la presente invención provee moléculas de ácidos nucleicos aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 3 y 4, así como también fragmentos y variantes de las mismas que codifican polipéptidos que tienen actividad de AHAS. Se proveen además polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico descripta en la presente, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos presentadas en las Figuras 3 y 4 (identificadas como BN02-120 o BN02-131) y fragmentos y variantes de las mismas que codifican polipéptidos que comprenden la actividad de AHAS.

La presente invención también provee proteínas de AHASL con sustituciones de aminoácidos en posiciones de aminoácidos identificadas dentro de regiones conservadas de las proteínas de AHASL de Brassica descritas en la presente.

La invención comprende composiciones de proteínas o ácidos nucleicos aisladas o sustancialmente purificadas.

La presente invención provee polipéptidos aislados que comprenden proteínas de AHAS imitadas . Los polipéptidos aislados comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de BN02-120 o BN02-131 como se presenta en la Figura 4, la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos BN02-120 o BN02-131 como se presenta en la Figura 3, la secuencia de aminoácidos, y los fragmentos funcionales y variantes de las secuencias de aminoácidos que codifican un polipéptido de AHAS que comprende la actividad de AHAS .

Las moléculas de ácidos nucleicos descritas se pueden usar en constructos de ácidos nucleicos para la transformación de plantas, por ejemplo, plantas de cultivo, tales como plantas de Brassica . En una modalidad, tales constructos de ácidos nucleicos que contienen las moléculas de ácidos nucleicos de la presente descripción se pueden usar para producir plantas transgénicas para proveer resistencia a herbicidas, tales como los herbicidas que se sabe que inhiben la actividad de AHAS, tales como los herbicidas de imidazolinona . Los constructos de ácidos nucleicos se pueden usar en casetes de expresión, vectores de expresión, vectores de transformación, plásmidos y similares. Las plantas transgénicas obtenidas después de la transformación con tales constructos demuestran una resistencia aumentada a los herbicidas que inhiben la AHAS tales como, por ejemplo, los herbicidas imidazolinona y sulfonilurea .

Así, la presente invención comprende moléculas de ácidos nucleicos de AHASL y fragmentos y variantes de las mismas. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos también están comprendidas por la presente invención. En una modalidad, el fragmento comprende por lo menos una secuencia mutada en comparación con la secuencia correspondiente de la secuencia de tipo salvaje. Una parte biológicamente activa de una proteína de AHAS puede ser preparada aislando una parte de una de las secuencias de nucleótidos de AHAS de la invención, que expresa la parte codificada de la proteína de AHAS (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evalúa la actividad de la parte codificada de la proteína de AHAS. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de AHAS comprenden por lo menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 o 900 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia de nucleótidos de longitud completa descrita en la presente dependiendo del uso previsto.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos de AHAS que codifica una parte biológicamente activa de una proteína de AHAS de la invención codificará por lo menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o 250 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presente en una proteína de AHAS de longitud completa de la invención. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos de AHAS que son útiles como sondas de hibridación para cebadores de PCR generalmente no necesitan codificar una parte biológicamente activa de una proteína de AHAS. En una modalidad, los fragmentos de una secuencia de AHAS comprenden una o más mutaciones descritas en la presente.

Las moléculas de ácidos nucleicos que son variantes de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente también están comprendidas por la presente invención. "Variantes" de las secuencias de nucleótidos de AHAS de la invención incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas de AHAS descritas en la presente pero que difieren conservadoramente debido a la degeneración del código genético. Estas variantes alélicas que ocurren naturalmente pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se mencionan más abajo. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente que han sido generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a un sitio, pero que aún codifican a la proteína de AHAS descrita en la presente invención como se comenta más abajo. Generalmente, las variantes de secuencias de nucleótidos de la invención tendrán por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con una secuencia de nucleótidos particular descrita en la presente. Una secuencia de nucleótidos de AHAS variante codificará una proteína de AHAS, respectivamente, que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con una secuencia de nucleótidos particular descrita en la presente.

Además, los expertos en el arte apreciarán también que se podrán realizar cambios por mutación en las secuencias de nucleótidos de la invención llevando de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas de AHAS codificadas sin alterar la actividad biológica de las proteínas de AHAS. Así, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de AHAS que tiene una secuencia que difiere de la de BN02-120 o BN02-131 como se presenta en la Figura 3 puede ser creada introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos correspondiente descrita en la presente, de tal modo que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden ser introducidas por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida a un sitio y mutagénesis mediada por PCR y aquellas descriptas en la presente. Tales secuencias de nucleótidos variantes también están comprendidas por la presente invención.

Por ejemplo, en una modalidad, las sustituciones de aminoácidos conservadoras se pueden realizar en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales, predichos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de la secuencia de tipo salvaje de una proteína de AHAS (por ejemplo, la secuencia de la Figura 5 (SEQ ID NO: 23)) sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es requerido para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en donde el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Tales sustituciones no se realizarían para residuos de aminoácidos conservados o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado .

Las proteínas de la invención pueden ser alteradas de diversas maneras incluyen sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en el arte. Por ejemplo, las variantes de secuencias de aminoácidos de las proteínas de AHAS pueden ser preparadas por mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol . 154: 367-382; patente U.S. N.° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias allí mencionadas. Una guía para las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se puede hallar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found. , Washington, D.C.), incorporado en la presente por referencia. Son preferibles las sustituciones conservadoras, tales como intercambiar un aminoácido por otro que tienen propiedades similares .

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos de AHAS variantes se pueden realizar introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificadora de AHAS, tal como por mutagénesis de saturación y las mutantes resultantes pueden ser exploradas con respecto a actividad de AHAS para identificar mutantes que retienen la actividad de AHAS, incluyendo la actividad de AHAS resistente a herbicidas. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada en forma recombinante , y la actividad de la proteína puede ser determinada usando técnicas de ensayo estándar.

Así, las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen las secuencias descritas en la presente así como también fragmentos y variantes de las mismas. Las secuencias de nucleótidos de AHASL de la invención, y fragmentos y variantes de las mismas, se pueden usar como sondas y/o cebadores. Tales sondas se pueden usar para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican a las mismas o idénticas proteínas.

De esta manera, se pueden usar métodos tales como PCR, hibridación, y similares, para identificar tales secuencias que tienen una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2da. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocole: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY) . Las secuencias de nucleótidos de AHASL aisladas en base a su identidad de secuencias con las secuencias de nucleótidos de AHAS presentadas en la presente o a fragmentos y variantes de las mismas están comprendidas por la presente invención.

En métodos de hibridación, se puede usar toda o parte de una secuencia de nucleótidos de AHAS conocida para rastrear las bibliotecas genómicas o de ADNc . Los métodos para la construcción de tales bibliotecas genómicas o de ADNc son generalmente conocidos en el arte y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2da. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) . Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómicos, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos , y pueden ser marcados con un grupo detectable, tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de una enzima. Las sondas para hibridación pueden ser preparadas marcando oligonucleótidos sintéticos en base a la secuencia de nucleótidos de AHAS conocida descrita en la presente. Se pueden usar adicionalmente los cebadores degenerados diseñados en base a los residuos de aminoácidos o nucleótidos conservados en una secuencia de nucleótidos de AHAS conocida o una secuencia de aminoácidos codificada. La sonda comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que híbrida bajo condiciones severas a por lo menos aproximadamente 12, preferentemente aproximadamente 25, más preferentemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de AHAS de la invención o un fragmento o variante del mismo. La preparación de sondas para hibridación es conocida en general en el arte y se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2da. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) , incorporado a la presente por referencia.

Por ejemplo, se puede usar toda la secuencia de ácidos nucleicos de AHAS mutada descrita en la presente, o una o más partes de la misma, como una sonda capaz de hibridarse específicamente a las secuencias de AHAS correspondientes y a los AR s mensajeros. Las técnicas de hibridación incluyen exploración de hibridación o bibliotecas de ADN colocadas en placas (ya sea placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2da. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) .

La hibridación de tales secuencias se puede realizar bajo condiciones estrictas. Por "condiciones estrictas" o "condiciones de hibridación estrictas" se entienden condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará a su secuencia objetivo en un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces con respecto a la de base) . Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes .

En una modalidad, las condiciones estrictas serán aquellas en donde la concentración de sal es menor que aproximadamente el ión de Na 1,5 M, típicamente una concentración de ión Na (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores que 50 nucleótidos) . Las condiciones estrictas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones menos estrictas ilustrativas incluyen hibridación con una solución búfer de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato de sodio 0,3 M) a 50 a 55 °C. Condiciones moderadamente estrictas ilustrativas incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, NaCl 1 M, 1% SDS a 37 °C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60 °C. Condiciones muy estrictas ilustrativas incluyen hibridación en 50% de formamida, NaCl 1 M, 1% SDS a 37°C, y un lavado en O . IX SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente , los búferes de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1% de SDS . La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, usualmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas .

La especificidad es típicamente la función de los lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y ahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm 81.5°C + 16.6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0.61 (% form) + 500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en los pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo la concentración iónica y el pH definidos) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se híbrida a una sonda que concuerda perfectamente. La Tm es reducida en aproximadamente 1°C por cada 1% de mal apareamiento; así, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ser ajustadas para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm se puede disminuir 10 °C. En general, las condiciones estrictas son seleccionadas para ser aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una concentración iónica y un pH definidos. Sin embargo, condiciones muy estrictas pueden usar una hibridación y/o un lavado a l, 2, 3 o 4°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones moderadamente estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que el punto de fusión término (Tm) ; las condiciones menos estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menos que el punto de fusión térmico (Tm) . Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en el arte entenderán que las variaciones en las condiciones más o menos estrictas se han descrito en forma inherente. Si el grado deseado de mal apareamiento da por resultado una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) , se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que se pueda usar una temperatura más alta. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Lajboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds . (1995) Current Protocole in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley- Interscience , Nueva York) . Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2da. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) .

Las moléculas de ácidos nucleicos y proteínas de la invención comprenden moléculas de ácidos nucleicos y proteínas que comprenden una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que es suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de BN02-120 o BN02-131 presentada en las Figuras 3 y 4. La expresión "suficientemente idéntica" se usa en la presente para referirse a una primera secuencia de nucleótidos o aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos de tal modo que las primeras y segundas secuencias de aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que contienen un dominio estructural común que tiene por lo menos 45%, 55%, o 65% de identidad, preferentemente 75% de identidad, más preferentemente 85%, 95% o 98% de identidad, se definen en la presente como suficientemente idénticas.

Para determinar la identidad por ciento de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptimos. La identidad por ciento entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad por ciento = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones que se superponen) x 100) . En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud. La identidad por ciento entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descriptas más abajo, con o sin espacios admitidos. Para calcular la identidad por ciento, se cuentan típicamente las concordancias exactas.

La determinación de la identidad por ciento entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo, preferido, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Un algoritmo como éste es incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990) J". Mol. Biol . 215: 403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, resultado = 100, longitud de palabra = 12, para obtener las secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, resultado = 50, longitud de palabra = 3, para obtener las secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con espacios para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nuciere Acid Res. 25: 3389. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda repetida que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) . Otro ejemplo no limitativo, preferido, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Un algoritmo como éste es incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar las secuencias de aminoácidos, se pueden usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12, y una penalidad de espacio de 4. El alineamiento también se puede realizar manualmente por inspección.

A menos que se indique de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencias provistos en la presente se refieren al valor obtenido usando las secuencias de longitud completa de la invención y usando alineamiento múltiple por medio del algoritmo Clustal {Nucleic Acid Research, 22 (22) : 4673-4680, 1994) usando el programa AlignX incluido en el paquete de software Vector NTI Advance 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) usando los parámetros por defecto; o cualquier programa equivalente del mismo. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genera un alineamiento que tiene idénticas concordancias de residuos de aminoácidos o nucleótidos y una identidad de secuencia por ciento idéntica cuando se compara con el alineamiento correspondiente generado por AlignX en el paquete de software Vector NTI Advance 10.

Las proteínas de AHASL mutantes de la invención comprenden las proteínas descritas así como también variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán poseyendo la actividad mutante de AHAS deseada. En una modalidad tales mutaciones en la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína variante no coloca la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no creará regiones complementarias que podrían producir una estructura de mARN secundaria. Ver solicitud de patente EP publicación N.° 75,444.

En una modalidad, las secuencias de la presente invención codifican proteínas que tienen actividad de AHAS. Tal actividad puede ser evaluada por exploraciones del actividad de AHAS, tales como las descritas en Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179, incorporada a la presente por referencia.

Las proteínas y secuencias de nucleótidos variantes comprenden también proteínas y secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como transposición de genes. Con un procedimiento como éste, se pueden manipular una. o más secuencias codificadoras de AHASL diferentes para crear una nueva proteína de AHASL que posee las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de ácidos nucleicos recombinantes a partir de una población de ácidos nucleicos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden ser recombinadas en forma homologa in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando esta propuesta, motivos de secuencias que codifican un dominio de interés pueden ser transpuestos entre el gen de AHASL de la invención y otros genes AHASL conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una K„, aumentada en el caso de una enzima. Las estrategias para tal transposición de ADN son conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J". Mol. Biol . 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291; y patentes U.S. Nros . 5,605,793 y 5,837,458.

Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden usar para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas, más particularmente otras dicotiledóneas. De esta manera, se pueden usar métodos tales como PCR, hibridación y similares para identificar tales secuencias basadas en su homología de secuencia con las secuencias presentadas en la presente. Las secuencias aisladas en base a su identidad de secuencia con todas las secuencias de AHASL presentadas en la presente o con los fragmentos de las mismas están comprendidas en la presente invención. De esta manera, secuencias aisladas que codifican para una proteína AHASL y el cual hibridiza bajo condiciones estrictas a la secuencia descrita aquí, o fragmentos de la misma, abarcan la presente invención.

En una propuesta de PCR, los cebadores de oligonucleótidos pueden ser diseñados para ser usados en las reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN del ADNc o el ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar los cebadores de PCR y la clonación de PCR son generalmente conocidos en el arte y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2da. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) . Ver también, Innis, et al. eds . (1990) PCR Protocols : ? Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY) ; Innis y Gelfand, eds . (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York) ; e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no están limitados a, métodos que usan cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente mal apareados, y similares.

Constructos Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden usar en la producción de constructos de ácidos nucleicos recombinantes . En una modalidad, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se pueden usar en la preparación de constructos de ácidos nucleicos, por ejemplo, casetes de expresión para la expresión en la planta de interés.

Los casetes de expresión pueden incluir secuencias reguladoras ligadas en forma operativa a la secuencia de ácidos nucleicos de AHASL de la invención. El cásete puede contener adicionalmente por lo menos un gen adicional a ser co-transformado en el organismo. Alternativamente, el o los genes adicionales pueden ser provistos en múltiples casetes de expresión.

Los constructos de ácidos nucleicos pueden ser provistos de una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos AHASL esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. Los constructos de ácidos nucleicos pueden contener adicionalmente moléculas de ácidos nucleicos que codifican para genes marcadores selecciónateles .

En una modalidad, el cásete de expresión incluye en la dirección 5' -3' de transcripción, una región de iniciación de transcripción y traducción (por ejemplo, un promotor) , una secuencia de ácidos nucleicos de AHASL de la invención y una región de terminación de transcripción y traducción (por ejemplo, una región de terminación) funcional en plantas.

Se puede usar cualquier promotor en la producción de los constructos de ácidos nucleicos. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, con respecto al huésped de planta y/o a la secuencia de ácidos nucleicos de AHASL de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. En donde el promotor es "extraño" o "heterólogo" con respecto al huésped de planta, se entiende que el promotor no se encuentra en la planta nativa "en la cual se introduce el promotor. En donde el promotor es "extraño" o "heterólogo" con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de AHASL de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o que existe naturalmente para la secuencia de ácidos nucleicos de AHASL ligadas en forma operativa de la invención. Como se usa en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia codificadora ligada en forma operativa a una región de iniciación de transcripción que es heterologa con respecto a la secuencia codificadora.

Si bien puede ser preferible expresar las moléculas de ácidos nucleicos de AHASL de la invención usando promotores heterólogos, las secuencias de promotores nativas se pueden usar en la preparación de los constructos. Tales constructos cambiarían los niveles de expresión de la proteína de AHASL en la planta o célula de planta. Así, el fenotipo de la planta o célula de planta está alterado.

Se puede usar cualquier promotor en la preparación de constructos para controlar la expresión de la secuencia codificadora de AHAS, tal como promotores que proveen promotores constitutivos, preferidos por los tejidos, inducibles, u otros, para la expresión en plantas. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la WO 99/43 838 y la patente U.S. N.° 6.072.050; el promotor de CaMV 35S núcleo (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina del arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol.

Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al . (1991) Theor. Appl . Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al . (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotor ALS (patente U.S. N. ° 5,659,026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes U.S. Nros . 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,453; 5, 608, 142 y 6 , 177, 611.

Los promotores preferidos de los tejidos pueden ser utilizados para dirigir la expresión de AHASL dentro de un tejido de planta particular. Tales promotores preferidos de los tejidos incluyen, pero no están limitados a, promotores preferidos de las hojas, promotores preferidos de las raíces, promotores preferidos de las semillas y promotores preferidos de los tallos. Los promotores preferidos de los tejidos incluyen Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol . 38 (7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778; Lam (1994) Results Probl . Cell Differ. 20: 181-196 ; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90(20): 9586-9590; y Guevara-García et al. (1993) Plant Physiol. 1 12(2): 525-535; Plant J. 4(3): 495-505.

Los constructos de ácidos nucleicos también pueden comprender regiones de terminación de la transcripción. Cuando se usan regiones de terminación de la transcripción, se puede usar cualquier región de terminación en la preparación de los constructos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la región de terminación puede ser nativa a la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa a la secuencia de interés AHASL ligada operativamente, puede ser nativa al huésped de la planta, o se puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga con respecto al promotor, la molécula de ácido nucleico AHASL de interés, el huésped de planta, o cualquier combinación de los mismos) . Ejemplos de regiones de terminación que están disponibles para el uso en los constructos de la presente invención incluyen aquellos del plásmido Ti de A. turnefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Ver también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos pueden ser optimizados para expresión aumentada en la planta transformada. Es decir, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de AHASL mutantes pueden ser sintetizados usando codones preferidos de las plantas para una mejor expresión. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para un comentario sobre el uso del codón preferido del huésped. Se encuentran disponibles en el arte métodos para sintetizar genes preferidos de las plantas. Ver, por ejemplo, patentes U.S. Nros . 5,380,831 y 5,436,391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporados a la presente por referencia.

Además, se pueden realizar otras modificaciones de las secuencias en las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente. Por ejemplo, las modificaciones de secuencias adicionales se sabe que aumentan la expresión de los genes en un huésped celular. Estas incluyen eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de corte y empalme de exón/intrón, repeticiones tipo transposón, y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo que pueden ser deletéreas para la expresión del gen. El contenido de G-C de la secuencia también puede ser ajustado a niveles promedio para un huésped celular objetivo, como se calcula por referencia a los genes conocidos expresados en la célula huésped. Además, la secuencia puede ser modificada para evitar las estructuras de mAR secundarias de horquilla predichas .

También se pueden usar otras secuencias de ácidos nucleicos en la preparación de los constructos de la presente invención, por ejemplo, para aumentar la expresión de la secuencia codificadora de AHAS . Tales secuencias de ácidos nucleicos incluyen los intrones del Adhl del maíz, del gen del intronL (Callis et al. (1987) Genes and Development 1: 1183-1200) y secuencias líder, (secuencia W) del virus del mosaico del tabaco (TMV) , del virus de la mancha clorótica y del virus del mosaico de la alfalfa (Gallie et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 8693-8711, y Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol . , 15: 65-79, 1990). Se ha demostrado que el primer intrón del locus 1 encogido del maíz aumenta la expresión de genes en constructos de genes quiméricos. Las patentes U.S. Nros . 5,424,412 y 5,593,874 describen el uso de intrones específicos en los constructos de expresión de genes y Gallie et al. ((1994) Plant Physiol. 106: 929-939) también han demostrado que los intrones son útiles para regular la expresión de genes sobre una base específica de tejido. Para aumentar adicionalmente o para optimizar la expresión de genes de subunidad grande de AHAS, los vectores de expresión de plantas de la invención también pueden contener secuencias de ADN que contienen regiones de unión a la matriz (MARs) . Las células vegetales transformadas con tales sistemas de expresión modificados, entonces, pueden exhibir sobreexpresión o expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos de la invención.

Los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención pueden contener adicionalmente secuencias líder 5' en el constructo del cásete de expresión. Tales secuencias líderes pueden actuar para aumentar la traducción. Los líderes de la traducción son conocidos en el arte e incluyen: los líderes del picornavirus , por ejemplo, el líder de EMCV (región 5' no codificadora de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86: 6121-6130) ; líderes del potivirus, por ejemplo el líder de TEV (Virus del grabado del tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), el líder de MDMV (virus del mosaico enano del maíz) (Virology 154: 9-20), y la proteína de ligadura de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); el líder no traducido del mARN de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625) ; el líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs . 237-256); y el líder del virus de la mancha clorótica del maíz (MCMV) (Lomrael et al. (1991) Virology 81: 382-385). Ver también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol . 84: 965-968. También se pueden utilizar otros métodos que se sabe que aumentan la traducción, por ejemplo, intrones, y similares.

Al preparar los constructos de ácidos nucleicos, los diversos fragmentos de ADN pueden ser manipulados, de modo de proveer las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Para este fin, se pueden emplear adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones pueden estar involucradas para proveer sitios de restricción convenientes, remoción de ADN superfluo, remoción de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, se puede usar mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, reasociación, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Los constructos de expresión de la presente invención también pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos capaces de dirigir la expresión de la secuencia de AHAS al cloroplasto. Tales secuencias de ácidos nucleicos incluyen secuencias de direccionamiento al cloroplasto que codifica un péptido de tránsito del cloroplasto para dirigir el producto del gen de interés a los cloroplastos de las células vegetales. Tales péptidos de tránsito son conocidos en el arte. Con respecto a las secuencias de direccionamiento de cloroplastos, "ligados en forma operativa" significa que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de tránsito (es decir, la secuencia direccionada al cloroplasto) está unida a la molécula de ácido nucleico de AHASL de la invención de tal modo que las dos secuencias son contiguas y están en el mismo marco de lectura. Ver, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol . Chem. 164: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol . 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys . Res. Commun. 196: 1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Si bien las proteínas de AHASL de la invención pueden incluir un péptido de tránsito del cloroplasto nativo, cualquier péptido de transito del cloroplasto conocido en el arte puede ser fusionado a la secuencia de aminoácidos de una proteína de AHASL madura de la invención ligando en forma operativa una secuencia direccionada al cloroplasto al extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de AHASL madura de la invención.

Las secuencias direccionadas al cloroplasto son conocidas en el arte e incluyen la subunidad pequeña del cloroplasto de la ribulosa-1 , 5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 335-3342); 5- (enolpiruvi1 ) shikimato-3 - fosfato sintasa (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810); triptófano sintasa (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (11: 6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33) 20357-20363); clorismato sintasa (Schmidt et al . (1993) J. Biol . Chem. 268(36): 27447-27457) ; y la proteína que liga la clorofila a/b de cosecha liviana (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Ver también Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 254: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys . Res. Commun. 196: 1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.

En otra modalidad, los constructos de ácidos nucleicos pueden ser preparados para dirigir la expresión de la secuencia codificadora de AHAS mutante del cloroplasto de la célula de planta. Métodos para la transformación de cloroplastos con conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. El método se basa en el suministro por cañón de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma del plástido a través de recombinación homologa. Adicionalmente , la transformación del plástico puede lograrse por transactivación de un transgén silencioso portado por el plástido por la expresión preferida del tejido de una ARN polimerasa dirigida al plástido y codificada nuclear. Un sistema como éste ha sido informado en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.

Los ácidos nucleicos de interés a ser direccionados al cloroplasto pueden ser optimizados para la expresión en el cloroplasto para explicar las diferencias en el uso del codón entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden ser sintetizados usando codones preferidos de los cloroplastos . Ver, por ejemplo, patente U.S. N.° 5,380,831, incorporada a la presente por referencia.

Los constructos de ácidos nucleicos se pueden usar para transformar células vegetales y regenerar plantas transgénicas que comprenden las secuencias codificadoras de AHAS mutantes . Numerosos vectores de transformación de plantas y métodos para transformar plantas se encuentran disponibles. Ver, por ejemplo, patente U.S. N.° 6.753.458, An, G. et al. (1986) Plant Physiol. 81: 301-305; Fry, J. et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl . Genet . 76: 767-774; Hinchee et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. Symp. 203212.203-212; Cousins et al. C1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. y Slightom, J. L. (1992) Gene.118 : 255-260 ; Christou et al. C1992) Trends. Biotechnol . 10:239-246; D'Halluin et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-3 14; Dhir et al. (?992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (?993) Proc. Wat. Acad Sci.

USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993j In Vitro Cell. Dev.

Biol.-Plant; 29P:1 19-124; Davies, et al. (1993 Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J.. A. y Me Hughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, C. I. y Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. y Park, . D. (1994) Crit . Rev.

Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5:17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman et al. (1994) Bio-Technology 12:919923; Rítala et al. (1994) Plant.

Mol. Biol. 24:317-325; y an, Y. C. y Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748. Los constructos también pueden ser transformados en células vegetales usando recombinación homologa .

Los constructos descritos que comprenden las secuencias de AHASL de la presente invención se pueden usar en varios métodos para producir células de huéspedes transgénicos , tales como bacterias, levaduras, y para transformar células vegetales y en algunos casos regenerar plantas transgénicas . Por ejemplo, métodos para producir una planta de cultivo transgénica que contiene el ácido nucleico que codifica la mutante de AHASL de la presente invención, en donde la expresión del o de los ácidos nucleicos en la planta da pro resultado tolerancia a herbicidas en comparación con plantas de tipo salvaje o plantas de tipo mutante de AHAS conocidas: (a) introduciendo en una célula de planta un vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica una AHASL mutante de la presente invención y (b) generando a partir de la célula de planta una planta transgénica que es tolerante a herbicidas.

Las células vegetales para usar en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, protoplastos , células que producen gametas, y células que se regeneran en una planta completa. En muchos casos, toda o parte de la molécula de ácido nucleico recombinante está integrada en forma estable en un cromosoma o un elemento extra-cromosómico estable, de modo que se pasa a generaciones sucesivas .

La presente invención se puede usar para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maíz {Zea mays) , Brassica sp . (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), incluyendo aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeno (Sécale cereale) , sorgo [Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , (por ejemplo, mijo perla {Pennisetum glaucum) , mijo proso {Panicum miliaceum) , mijo de Italia (Setaria itálica) , mijo africano {Eleusine coracana)^r, girasol [Helianthus annuus) cártamo (Carthamus tictorius) , trigo (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum) soya {Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanum tuberosum) , maní (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , batata (Impomoea batatus) , cassava (Manihot esculetna) , café (Coffea sp . ) , coco (Cocos nucífera) , ananás (Ananas comosus) , árboles cítricos (Citrus spo . ) , cacao (Theobroma cacao) , té (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), palta (Persea americana), higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica) , olivo (Olea europaea) , papaya (Carica papaya), castaña de cajú (Anacardium occidentale) , nuez macadamia (Macadamia integrifolia) , almendra (Prunus amygdalus) , remolacha azucarera (Beta vulgaris) , caña de azúcar (Saccarum spp.), avena (Avena sativa) , cebada (Hordeum vulgare) , verduras, plantas ornamentales y coniferas. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, girasol, Brassica sp., algodón, azúcar, remolacha, soya, maní, alfalfa, cártamo, tabaco, maíz, arroz, trigo, centeno, cebada, triticale, sorgo, mijo, etc.).

Las moléculas de ácidos nucleicos de AHASL imitantes que codifican a los polipéptidos de AHASL de la invención también se pueden usar como marcadores seleccionabl.es , por ejemplo, para identificar células transgénicas que contienen moléculas de ácidos nucleicos introducidas que codifican a los polipéptidos de AHASL mutantes . En una modalidad, la invención provee un método para identificar o seleccionar una célula de planta, un tejido de planta, una planta o parte de la misma, transformada, que com rende: a) proveer una célula de planta, tejido de planta, planta o parte de la misma, trans ormada, en donde la célula de planta, tejido de planta, planta o parte de la misma, transformada, comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido mutante de AHASL de la invención como se describió más arriba, en donde el polipéptido se usa como un marcador de selección, y en donde la célula de planta, tejido de planta, planta o parte de la misma, transformada, puede comprender opcionalmente un ácido nucleico aislado de interés adicional; b) poner en contacto la célula de planta, tejido de planta, planta o parte .de la misma, transformada, con por lo menos un inhibidor de AHAS o compuesto inhibidor de AHAS; c) determinar si la célula de planta, tejido de planta, planta o parte de la misma, transformada, es afectada por el inhibidor o compuesto inhibidor; y d) identificar o seleccionar la célula de planta, tejido de planta, planta o parte de la misma, transformada.

La invención también se pone en práctica en proteínas de AHASL purificadas que contienen las mutaciones descriptas en la presente, que son útiles en estudios de modelación molecular para diseñar mejoras adicionales a la tolerancia a herbicidas. Métodos de purificación de proteínas son bien conocidos y pueden realizarse fácilmente usando productos disponibles comercialmente o métodos diseñados especialmente, como se indica, por ejemplo, en Protein Biotechnology, Walsh y Headon (Wiley, 1994) .

La presente invención provee plantas, tejidos de plantas, células vegetales y células de huéspedes que son resistentes o tolerantes de por lo menos un herbicida que inhibe la AHAS, tal como los herbicidas imidazolinona o sulfonilurea . En algunas modalidades, las plantas, tejidos de plantas, células vegetales y células huésped demuestran resistencia aumentada o tolerancia aumentada a por lo menos un herbicida que inhibe la AHAS. El término "aumentada" se refiere a un aumento en la cantidad de resistencia o tolerancia por encima del cual se espera. La cantidad o concentración preferida del herbicida es una "cantidad efectiva" o una "concentración efectiva" . Por "cantidad efectiva" o una "concentración efectiva" se entiende una cantidad y una concentración, respectivamente, que es suficiente para detener o inhibir el crecimiento de una planta, tejido de planta, célula de planta, microespora, o célula huésped, de tipo salvaje, similar, pero que la cantidad no detiene o inhibe tan fuertemente el crecimiento de las plantas, tejidos de plantas, células vegetales, microesporas y células huésped de plantas resistentes a herbicidas de la presente invención. Típicamente, la cantidad efectiva de un herbicida es una cantidad que se usa rutinariamente en sistemas de producción agrícola para eliminar malezas de interés. Una cantidad tal es conocida por los expertos en el arte, o puede ser determinada fácilmente usando métodos conocidos en el arte. Además, se reconoce que la cantidad efectiva de un herbicida en un sistema de producción agrícola puede ser sustancialmente diferente que una cantidad efectiva de un herbicida para un sistema de cultivo de planta tal como, por ejemplo, el sistema de cultivo de microesporas.

Los herbicidas de la presente invención son aquellos que interfieren con la actividad de la enzima de AHAS de tal modo que la actividad de AHAS es reducida en la presencia del herbicida. Tales herbicidas también pueden ser denominados en la presente "herbicidas inhibidores de AHAS" o simplemente "inhibidores de AHAS" . Como se usa en la presente, un "herbicida inhibidor de AHAS" o un "inhibidor de AHAS" no está limitado a un solo herbicida que interfiere con la actividad de la enzima AHAS. Así, a menos que se indique otra cosa o resulte evidente del contexto, un "herbicida que inhibe AHAS" o un "inhibidor de AHAS" puede ser uno o una mezcla de dos, tres, cuatro, o más herbicidas, cada uno de los cuales interfiere con la actividad de la enzima AHAS .

Como se usa en la presente, a menos que se indique claramente de otra manera, el término "planta" significa una planta en cualquier estado de desarrollo, así como también cualquier parte o partes de una planta que puede ser unida a, o separada de, órganos, tejidos y células de una planta que incluye callos de plantas, trozos de plantas, protoplastos de plantas y cultivos de tejidos de células vegetales a partir de las cuales se pueden generar plantas. Ejemplos de partes de plantas particulares incluyen un tallo, una hoja, una raíz, una inflorescencia, una flor, un florete, una fruta, un pedículo, un pedúnculo, un estambre, una antera, un estigma, un estilo, un ovario, un pétalo, un sépalo, un carpelo, una punta de raíz, una caperuza de raíz, un pelo radicular, un pelo de hoja, un pelo de semilla, un grano de polen, una microespora, un embrión, un óvulo, un cotiledón, un hipocotilo, un epicotilo, un xilema, un floema, un parénquima, un endosperma, una célula acompañante, una célula guardia, y cualquier otro órgano, tejido y células de una planta conocidos. Además se reconoce que una semilla es una parte de una planta. .

Las plantas de la presente invención incluyen plantas no transgénicas y plantas transgénicas . Por "planta no transgénica" se entiende una planta que no tiene ADN recombinante en su genoma, pero que contiene la molécula de ácido nucleico mutante en el genoma de la célula de planta que ha sido mutado usando técnicas mutagénicas, tal como mutagénesis química o por aquellos métodos provistos en la presente. Las plantas no transgénicas no comprenden aquellas plantas que tienen secuencias mutantes como un resultado de procesos naturales. Por "planta transgénica" se entiende una planta que comprende ADN recombinante en su genoma . Una planta transgénica como ésta puede ser producida introduciendo ADN recombinante en el genoma de la planta transgénica, la progenie de la planta también puede comprender el ADN recombinante. La planta de la progenie que comprende por lo menos una parte del ADN recombinante de por lo menos una planta transgénica progenitora también es una planta transgénica.

La presente invención provee también plantas resistentes a herbicidas que inhiben AHAS que contienen las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la presente. Las plantas resistentes a herbicidas que inhiben AHAS pueden ser plantas tolerantes a herbicidas no transgénicas o transgénicas que comprende una molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido mutante de AHASL como se describe en la presente. Las plantas resistentes a herbicidas que inhiben AHAS pueden ser producidas por polinización cruzada de una primera planta con una segunda planta y permitiendo que la planta aceptora del polen (puede ser la primera o la segunda planta) produzca semillas de esta polinización cruzada. Las semillas y las plantas de la progenie generadas a partir de las mismas pueden tener la mutación cruzada en el genoma de la semilla y/o las plantas de la progenie. La planta aceptora del polen puede ser la primera o la segunda planta. La primera planta comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un polipéptido mutante de AHASL como se describe en la presente. La segunda planta puede ser cualquier planta compatible y puede comprender una segunda molécula de ácido nucleico que codifica el mismo o diferente polipéptido mutante de AHASL. Los primeros y segundos polipéptidos mutantes de AHASL pueden comprender las mismas o diferentes sustituciones de aminoácidos con relación a un polipéptido de AHASL de tipo salvaje. Se pueden seleccionar las semillas o las plantas de la progenie provenientes de la cruza que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido mutante de AHASL o dos moléculas de ácidos nucleicos que codifican los dos polipéptidos mutantes de AHASL.

Cuando la primera y la segunda plantas son homocigotas para la primera y la segunda moléculas de ácidos nucleicos, respectivamente, cada una de las plantas de la progenie resultantes comprende una copia de cada una de la primera y la segunda moléculas de ácidos nucleicos y se puede omitir el paso de selección. Cuando por lo menos una de la primera y la segunda plantas es heterocigota, se pueden seleccionar las plantas de la progenie que comprenden ambas moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, analizando el ADN de las plantas de la progenie para identificar las plantas de la progenie que comprenden la primera y la segunda moléculas de ácidos nucleicos o testeando las plantas de la progenie con respecto a la tolerancia aumentada a los herbicidas.

En algunas modalidades, las plantas que contienen las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser producidas usando métodos no transgénicos , tales como los métodos de mutagénesis dirigida a un sitio que incluyen aquellos métodos descritos, por ejemplo, en la solicitud internacional PCT/US00/23457 , o las patentes U.S. Nros. 6,271,360, 6,479,292 y 7,094,606. En una modalidad, tales métodos pueden comprender el uso de una reparación de genes dirigida a oligonucleótidos para introducir mutaciones puntuales en el genoma de la célula huésped y pueden comprender el uso de oligonucleótidos de hebra simple, tales como las oligonucleobases de reparación de genes (Ver, patentes U.S. Nros. 6,870,075 y 5,565,350). Una oligonucleobase es un polímero que comprende nucleobases, polímero que puede hibridar por apareamiento de bases de atson-Crick a un ADN que tiene la secuencia complementaria. Las nucleobases comprenden una base, que es una purina, pirimidina, o un derivado o análogo de las mismas. Las nucleobases incluyen nucleobases de péptidos, las subunidades de ácidos nucleicos de péptidos, y nucleobases de morfolina, así como también nucleósidos y nucleótidos. Los nucleósidos son nucleobases que contienen una parte de pentosafuranosilo, por ejemplo, un ribósido o 2 ' -desoxirribósido opcionalmente sustituido. Los nucleósidos pueden ser unidos por una o varias partes de unión, que pueden o no contener un fósforo. Los nucleósidos que están unidos por uniones fosfodiéster no sustituidas son denominados nucleótidos. Una cadena de oligonucleobase tiene un solo término 5' o 3', que son las nucleobases últimas del polímero. Una cadena de oligonucleobase particular puede contener nucleobases de todos los tipos. Un compuesto de oligonucleobase es un compuesto que comprende una o más cadenas de oligonucleobases que son complementarias e hibridadas por apareamiento de bases de Watson-Crick. Las nucleobases son o bien del tipo desoxirribo o del tipo ribo. Las nucleobses tipo ribo son nucleobases que contienen pentosafuranosilo en donde el 2' carbono es un metileno sustituido con un hidroxilo, alquiloxi o halógeno. Las nucleobases tipo desoxirribo son nucleobases distintas de las nucleobases tipo ribo e incluyen todas las nucleobases que no contienen una parte pentosafuranosilo.

Los vectores mutacionales de oligonucleótidos de hebra simple (SSMOVs) pueden ser preparados para introducir mutaciones en la secuencia codificadora de AHAS. Los SS OVs pueden ser preparados de acuerdo con la solicitud de patente internacional PCT/USOO/23457 y las patentes U.S. Nros . 6,271,360; 6,479,292; y 7,094,606. La secuencia del SSOMV puede estar basada en los mismos principios que los vectores de mutaciones descriptos en las patentes U.S. Nros. 5,565,350; 5,731,181, 5,756,325; 5,871,984; 5,760,012; 5,888,983; 5,795,972; 5,780,296; 5,945,339; 6,004,804; y 6,010,907 y en las publicaciones internacionales Nros. "WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 y WO 99/40789. En una modalidad, la secuencia del SSOMV contiene dos regiones que son homologas con la secuencia objetivo separada por una región que contiene la alteración genética deseada, denominada la región mutadora. La región mutadora puede tener una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa las regiones homologas en la secuencia objetivo, pero tiene una secuencia diferente. Una región mutadora de este tipo puede causar una sustitución. Alternativamente, las regiones homologas en el SSOMV pueden ser contiguas entre sí, mientras que las regiones en el gen objetivo que tiene la misma secuencia están separadas por uno, dos o más nucleótidos. Un SSOMV como éste causa una deleción del gen objetivo de los nucleótidos que están ausentes del SSOMV. Finalmente, la secuencia del gen objetivo que es idéntica a las regiones homologas puede ser adyacente en el gen objetivo pero separada por uno, dos o más nucleótidos en la secuencia del SSMOV. Un SSOMV como éste causa una inserción en la secuencia del gen objetivo.

En algunas modalidades, los nucleótidos del SSOMV son desoxirribonucleótidos que están unidos por uniones fosfodiéster no modificadas excepto que la unión internucleótidos 5' terminal y/o 3' terminal o alternativamente las dos uniones internucleótidos 5' terminal y 3' terminal pueden ser un fosforotioato o un fosfoamidato . Como se usa en la presente, una unión internucleótidos es la unión entre nucleótidos del SSOMV y no incluye la unión entre el nucleótido del extremo 5' o el nucleótido del extremo 3' y un sustituyente bloqueador. En una modalidad específica, la longitud del SSOMV es de entre 21 y 60 desoxinucleótidos y las longitudes de las regiones de homología son, por consiguiente, una longitud total de por lo menos 20 desoxinucleótidos y por lo menos dos regiones de homología deberían tener cada una longitudes de por lo menos 8 desoxinucleótidos .

Los SSOMVs pueden ser diseñados para ser complementarios o bien a la hebra codificadora o a la hebra no codificadora del gen objetivo. Cuando la mutación deseada es una sustitución de una sola base, se prefiere que ambos nucleótidos mutadores sean una pirimidina. En la medida que sea consistente con alcanzar el resultado funcional deseado, se prefiere que ambos, el nucleótido mutador y el nucleótido objetivo en la hebra complementaria sean pirimidinas . En una modalidad, los SSOMVs que codifican las mutaciones de transversión, es decir, un nucleótido mutador C o T está mal apareado, respectivamente, con un nucleótido C o T en la hebra complementaria.

Además de los oligodesoxinucleótidos , el SSOMV puede contener un sustituyente bloqueador 5' que está unido a los carbonos 5' terminales a través de un ligador. La química del ligador puede ser cualquier química y tiene por lo menos 6 átomos de longitud, y el ligador es preferentemente flexible. Se pueden usar una variedad de sustituyentes no tóxicos, tales como biotina, colesterol u otros esteroides o un colorante fluorescente catiónico no intercalador . Ejemplos de reactivos para preparar SSOMV incluyen los reactivos vendidos como Cy3™ y Cy5™ de Glen Research, Sterling Va. (ahora GE Healthcare), que son fosforoamiditas bloqueadas, las que después de la incorporación en un oligonucleótido, dan colorantes de indodicarbocianina e indomonocarbocianina sustituidas con 3 , 3 , 3 ' , 3 ' -tetrametil N, ' - isopropilo . En una modalidad, el reactivo es Cy3. Cuando la indocarbocianina está sustituida con N-oxialquilo, puede ser unida convenientemente al 5' terminal del oligodesoxinucleótido a través de una unión fosfodiéster con un fosfato 5' terminal. La química del ligador del colorante entre el colorante y el oligodesoxinucleótido no es crítica y se elige por conveniencia de síntesis. Cuando la Cy3 fosforoamidita coraercialmente disponible se usa como se dirigió, la modificación 5' resultante consiste en un sustituyente bloqueador y un ligador juntos que son una N-hidroxipropil , N' -fosfatidilpropil 3,3,3' , 3 ' -tetrametil indomonocarbocianina .

En una modalidad, el colorante de indocarbocianina es tetra-sustituido en las posiciones 3 y 3' de los anillos indol . Sin limitaciones en cuanto a la teoría, estas sustituciones evitan que el colorante sea un colorante intercalador . La identidad de los sustituyentes en estas posiciones no es crítica. El SSOMV puede, además, tener un sustituyen bloqueador 3'. Nuevamente la química del sustituyente bloqueador 3' no es crítica.

El cambio a ser introducido en el gen de AHAS puede estar en cualquier región de la secuencia de ácidos nucleicos, incluyendo las regiones codificadoras y no codificadoras. En una modalidad, el cambio a ser introducido en el gen objetivo (AHAS) es codificado por la región heteróloga. El cambio a ser introducido en el gen puede ser un cambio en una o más bases de la secuencia de genes (es decir, una sustitución) o la adición o deleción de una o más bases.

La presente invención también provee la línea de Brassica resistente a herbicidas que es denominada en la presente BnCL120C7. Se realizó un depósito de por lo menos 2500 semillas de la línea BnCll20C7 de Brassica en el Depósito de Patentes de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110 EE.UU. el 23 de junio de 2008 y se le asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-9278. La presente invención también provee la línea de Brassica resistente a herbicidas que es denominada en la presente BnCL131Al. Se realizó un depósito de por lo menos 2500 semillas de la línea de Brassica BnCL131Al el 23 de junio de 2008 y se le asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-9279. La presente invención también provee la línea de Brassica resistente a herbicidas que es denominada en la presente BnCL140B3. Se realizó un depósito de por lo menos 2500 semillas de la línea de Brassica BnCL140B3 en el Depósito de Patentes de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110 EE.UU. el 27 de agosto de 2008 y se le asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-9402. La presente invención también provee la línea de Brassica resistente a herbicidas que es denominada en la presente BnCL140C7. Se realizó un depósito de por lo menos 2500 semillas de la línea de Brassica BnCL140C7 en el Depósito de Patentes de la American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA 20110 EE.UU. el 27 de agosto de 2008 y se le asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-9403. La presente invención también provee la línea de Brassica resistente a herbicida que se menciona en la presente como PMlPM2/BnCL131Al . Un depósito de al menos 2500 semillas de la línea de Brassica PMlPM2/BnCL131Al con el depositante de patente de la American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA 20110 USA se realizó el 9 de septiembre de 2009 y se asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-10321. Los depósitos se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patentes. El depósito de las líneas de Brassica BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3, BnCL140C y PMlPM2/BnCL131Al se realizó por un término de por lo menos 30 años y por lo menos 5 años después que se realizó el pedido más reciente para el suministro de una muestra del depósito a la ATCC. Adicionalmente , los solicitantes han satisfecho todos los requerimientos de 27 C.F.R. §§ 1.801-1.809, incluyendo proveer una indicación de la viabilidad de la muestra.

Las líneas mutantes resistentes a herbicidas BnCL120C7,, BnCL131Al, BnCL140B3 y BnCL140C7 ilustradas en la presente invención fueron producidas usando técnicas de mutagénesis dirigidas a un sitio como se describe en los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a plantas de Brassica resistentes a herbicidas que son producidas por tales métodos . Se puede usar cualquier método de mutagénesis conocido en el arte para producir las plantas de Brassica resistentes a herbicidas de la presente invención. Tales métodos de mutagénesis pueden comprender, por ejemplo, el uso de uno cualquier o más de los siguientes mutágenos: radiación, tal como rayos X, rayos gamma (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 137) , neutrones (por ejemplo, producto de fisión nuclear por uranio 235 en un reactor atómico) , radiación beta (por ejemplo, emitida por radioisótopos tales como fósforo 32 o carbono 14) , y radiación ultravioleta (preferentemente de 250 a 290 nm) y mutágenos químicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS) , análogos de bases (por ejemplo, 5 -bromo-uracilo) , compuestos relacionados (por ejemplo, 8-etoxi cafeína), antibióticos (por ejemplo, estreptonigrina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mostazas sulfuradas, mostazas nitrogenadas, epóxidos, etilenaminas , sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas) , azidas, hidroxilamina , ácido nitroso o acridinas. Las plantas resistentes a herbicidas también pueden ser producidas usando métodos de cultivo de tejidos para seleccionar células vegetales que comprenden mutaciones de resistencia a herbicidas y luego regenerando a las plantas resistentes a herbicidas de allí. Ver, por ejemplo, las patentes U.S. Nros . 5,773,702 y 5,859,348, las que se incorporan a la presente en su totalidad como referencia.

Mayores detalles de la selección de mutación se pueden hallar en "Principies of Cultivar Development" , Fehr, 1993, Macmillan-Publishing Company, cuya descripción se incorpora a la presente por referencia. Además, se puede usar mutagénesis dirigida a un sitio para producir las secuencias de AHASL mutadas en una célula de planta huésped como se describe en la presente.

Las plantas de Brassica de la invención incluyen además plantas que comprenden, con relación a la proteína de AHASL de tipo salvaje, una asparagina en la posición de aminoácido 653 (nomenclatura de A. thaliana) , una treonina en una posición de aminoácido 122 (nomenclatura de A. thaliana) y una o más sustituciones de aminoácidos adicionales en la proteína de AHASL con relación a la proteína de AHASL de tipo salvaje, en donde una planta de Brassica de este tipo tiene una resistencia aumentada a por lo menos un herbicida cuando se compara con una planta de Brassica de tipo salvaje.

Plantas y métodos de selección Las plantas resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS y la progenie de tales plantas de la presente invención, tal como las plantas resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS de Brassica, se pueden usar en métodos para preparar plantas resistentes, plantas que tienen tolerancia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS y semillas de tales plantas. Así, por ejemplo, las plantas de Brassica ilustradas en la presente se pueden usar en programas de selección para desarrollar plantas resistentes a herbicidas adicionales, tales como las variedades comerciales de B. napus (por ejemplo, cañóla) . De acuerdo con tales métodos, se puede usar una primera planta progenitora en cruzas con una segunda planta progenitora, en donde por lo menos una de la primera o la segunda plantas progenitoras contiene por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos de AHASL de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de AHASL que tiene una mutación A122T y una mutación S653N. Una aplicación del procedimiento es en la producción de plantas híbridas Fi . Otro aspecto importante de este procedimiento es que el procedimiento se puede usar para el desarrollo de nuevas líneas progenitoras, dihaploides o consanguíneas. Por ejemplo, una línea de plantas como se describe en la presente se podría cruzar con cualquier segunda planta, y la progenie híbrida resultante puede ser autofecundada y/o de plantas hermanas por alrededor de 5 a 7 o más generaciones, proporcionando de este modo un gran número de líneas progenitoras distintas. Estas líneas progenitoras podrían ser cruzadas luego con otras líneas y la progenie híbrida resultante ser analizada con respecto a características beneficiosas. De esta manera se podrían identificar nuevas líneas que confieren las características deseables. Se pueden usar varios métodos de selección en los métodos, incluyendo haploidía, selección por pedigrí, descendientes de una sola semilla, descendientes de una sola semilla modificada, selección recurrente y retrocruzamiento .

En algunas modalidades, las plantas y la progenie de las mismas desarrollan un efecto sinérgico más que un efecto aditivo de tolerancia a herbicidas, por lo que el nivel de tolerancia a herbicidas en las plantas y la progenie de las mismas que comprende múltiples mutaciones es mayor que la tolerancia a herbicidas combinada de plantas que comprenden una sola proteína mutante de AHASL.

Las líneas de plantas que contienen las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser cruzadas por técnicas naturales o mecánicas. La polinización mecánica puede ser realizada controlando los tipos de polen que pueden ser transferidos sobre el estigma o por polinización manual.

Las plantas descendientes y/o de la progenie pueden ser evaluadas con respecto a las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención por cualquier método para determinar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico de AHASL mutado. Tales métodos incluyen evaluaciones fenotípicas, evaluaciones genotípicas, o combinaciones de las mismas. Las plantas de la progenie pueden ser evaluadas en generaciones subsiguientes con respecto a resistencia a herbicidas, y otros rasgos deseables. La resistencia a herbicidas inhibidores de AHAS puede ser evaluada exponiendo las plantas a uno o más herbicidas inhibidores de AHAS apropiados y evaluando el daño producido por los herbicidas. Algunos rasgos, tales como la resistencia al encamado y la altura de la planta pueden ser evaluados mediante inspección visual de las plantas, mientras que la madurez prematura puede ser evaluada mediante una inspección visual de las semillas dentro de las vainas (silicuas). Otros rasgos, tales como porcentaje de aceite, porcentaje de proteína y glucosinolatos totales de las semillas pueden ser evaluados usando técnicas tales como espectroscopia casi infrarroja y/o cromatografía líquida y/o cromatografía gaseosa.

Las plantas de la presente invención también pueden ser identificadas usando cualquier método de análisis genotípico. La evaluación genotípica de las plantas incluye usar técnicas tales como electroforesis de isozimas, polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLPs) , ADNs polimórficos amplificados aleatoriamente (RAPDs) , reacción en cadena de polimerasa cebada arbitrariamente (AP-PCR) , PCR específica de alelos (AS-PCR) , ampliación de huellas de ADN (DAF) , regiones amplificadas caracterizadas por secuencias (SCARs) , polimorfismos de longitud de fragmento amplificados (AFLPs) , repeticiones de secuencias simples (SSRs) que también son denominadas "microsatélites" . Las composiciones adicionales y los métodos para analizar el genotipo de las plantas provistos en la presente incluyen aquellos métodos descritos en la publicación U.S. N.° 2004/0171027, la publicación U.S. N.0 2005/02080506 y la publicación U.S. N.° 2005/0283858, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad por referencia .

La evaluación y manipulación (a través de la exposición a uno o más herbicidas inhibidores de AHAS apropiados) puede ocurrir en varias generaciones. La performance las nuevas líneas puede ser evaluada usando criterios objetivos en comparación para chequear variedades. Las líneas que muestran las combinaciones deseadas de rasgos son o bien cruzadas con otra línea o auto-polinizadas para producir semillas. La auto-polinización se refiere a la transferencia de polen de una flor a la misma flor o a otra flor de la misma planta. Las plantas que fueron auto-polinizadas y seleccionadas con respecto al tipo para muchas generaciones se tornan homocigotas en casi todos los loci de los genes y producen una población uniforme de progenie de cultivo verdadera.

Se puede usar cualquier método de selección en los métodos de la presente invención. En un ejemplo, las plantas resistentes a herbicidas de la presente invención pueden ser seleccionadas usando un método haploide. En tales métodos, los progenitores que tienen la base genética para el complemento de características deseado son cruzadas en un cruzamiento simple o complejo. El cruzamiento (o polinización cruzada) se refiere a la transferencia de polen de una planta a una planta diferente. La progenie del cruzamiento es cultivada y se separan microesporas (granos de polen inmaduros) y se filtran, usando técnicas conocidas por los expertos en el arte [(por ejemplo, Swanson, E.B. et al., (1987) Plant Cell Reports, 6: 94-97, "Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus" , L. y Swanson, E. B., (1990), "Microspore culture in Brassica" , págs . 159-169 en Methods in Molecular Biology, vol . 6, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press] . Estas microesporas exhiben segregación de genes. Las microesporas son cultivadas en presencia de un herbicida inhibidor de AHAS apropiado, tal como imazetapir (por ejemplo, PURSUIT™) o imazamox (por ejemplo, SOLO™, BEYOND™ y RAPTOR™) o una mezcla 50/50 de imazetapir e imazamox (por ejemplo, ODYSSEY™) , que elimina las microesporas que no tienen las mutaciones responsables de la resistencia al herbicida. Las microesporas que portan los genes responsables de la resistencia al herbicida sobreviven y producen embriones, que forman plantas haploides. Sus cromosomas son duplicados luego para producir haploides duplicados .

Otros métodos de selección también se pueden usar de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la selección por pedigrí se puede usar para mejorar los cultivos que se auto-polinizan en gran parte, tales como Brassica y cañóla. La selección por pedigrí comienza con el cruzamiento de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o más características deseables, es decir, que falta en el otro o que complementa al otro. Si los dos progenitores originales no proveen todas las características deseadas, se pueden incluir progenitores adicionales en el plan de cruzamiento.

Estos progenitores pueden ser cruzados en una manera simple o compleja para producir una Fi simple o compleja. Una población F2 es producida a partir de F1 por autofecundación de una o varias plantas Fi, o por entrecruzamiento de dos Fx (es decir, apareamiento entre plantas hermanas) . La selección de los mejores individuos puede comenzar en la generación de F2, y comenzando en la F3 se seleccionan las mejores familias, y los mejores individuos dentro de las mejores familias. El testeo replicado de familias puede comenzar en la generación F4 para mejorar la efectividad de selección con respecto a los rasgos con baja capacidad hereditaria. En una etapa avanzada de consanguinidad (es decir, F6 y F7) , las mejores líneas o mezclas de líneas fenot ípicamente " similares pueden ser testeadas con respecto a la liberación potencial como nuevos cultivares. Sin embargo, el método de pedigrí requiere más tiempo que el método de haploidía para desarrollar plantas resistentes a herbicidas AHAS, debido a que las plantas exhiben segregación durante múltiples generaciones, y la recuperación de rasgos deseables es relativamente baja.

El procedimiento de descendiente de una sola semilla (SSD) también se puede usar para seleccionar variedades mejoradas. El procedimiento de SSD en el sentido estricto se refiere a plantar una población segregante, cosechar una muestra de una semilla por planta y usar la población de semillas únicas para plantar la generación siguiente. Cuando la población ha avanzado desde la F2 al nivel de consanguinidad deseado, las plantas a partir de las cuales se derivan las líneas se rastrearán a diferentes individuos de F2. El número de plantas en una población declina cada generación debido a que algunas semillas no germinan o algunas plantas no producen por lo menos una semilla. Como resultado no todas las plantas muestreadas originalmente en la población de F2 estarán representadas por una progenie cuando se ha completado el avance generacional .

En un procedimiento de múltiples semillas, los cultivadores de cañóla cosechan comúnmente una o más vainas de cada planta en una población y las trillan juntas para formar un conjunto a granel. Parte del conjunto a granel se usa para plantar la generación siguiente y parte se pone en reserva. El procedimiento ha sido denominado técnica de descendiente de una sola semilla modificada o técnica del conjunto de vainas a granel. El procedimiento de múltiples semillas ha sido usado para ahorrar trabajo en la cosecha. Es considerablemente más rápido trillar las vainas con una máquina que retirar una semilla de cada una manualmente para el procedimiento de una sola semilla. El procedimiento de múltiples semillas también hace posible plantar el mismo número de semillas de una población cada generación de consanguinidad. Se cosechan suficientes semillas para compensar por aquellas plantas que no germinaron o no produjeron semillas.

La selección por retrocruzamiento se puede usar para transferir un gen o genes para un rasgo muy hereditario, heredado en forma sencilla, de una variedad fuente o línea (el progenitor dador) en otro cultivar o línea consanguínea deseable (el progenitor recurrente) . Después del cruzamiento inicial, los individuos que poseen el fenotipo del progenitor dador son seleccionados y son cruzados repetidamente (retrocruzados) con el progenitor recurrente. Cuando se completó el retrocruzamiento, se espera que la planta resultante tenga los atributos del progenitor recurrente y que el rasgo deseable haya sido transferido del progenitor dador .

También se pueden desarrollar variedades mejoradas mediante la selección recurrente. En este método, una población genéticamente variable de individuos heterocigotas es o bien identificado o creado por entrecruzamiento de varios progenitores diferentes. Se seleccionan las mejores plantas en base a la superioridad individual, la mejor progenie, o excelente capacidad de combinación. Las plantas seleccionadas son entrecruzadas para producir una nueva población en donde se continúan ciclos de selección adicionales .

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una planta que tiene resistencia a herbicidas que inhiben la AHAS que comprende: (a) cruzar una primera línea de plantas con una segunda línea de plantas para formar una población segregadora, en donde la primera o la segunda línea de plantas es una planta resistente al herbicida que inhibe la AHAS que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención; (b) explorar la población con respecto a resistencia aumentada al herbicida que inhibe la AHAS, la presencia de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, o ambos; y (c) seleccionar uno o más miembros de la población que tienen resistencia aumentada AHAS con relación a una planta de tipo salvaje o contiene una molécula de ácido nucleico de la presente invención. La primera o segunda planta contiene una molécula de ácido nucleico AHSAL de la presente invención. En una modalidad, las plantas para usar en el método son plantas de Brassica .

En otro aspecto, la presente invención provee un método para introgresar un rasgo de resistencia a herbicidas que inhiben AHAS en una planta que comprende: (a) cruzar por lo menos una primera línea de plantas resistente a herbicidas que inhiben la AHAS con una segunda línea de plantas para formar un población segregadora; (b) explorar la población con respecto a resistencia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS; y (c) seleccionar por lo menos un miembro de la población que tiene resistencia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS. En una modalidad, las plantas para usar en el método son plantas de Brassica .

Alternativamente, en otro aspecto de la invención, ambas, la primera y la segunda plantas progenitoras de Brassica, pueden ser una planta de Brassica resistente a herbicidas que inhibe la AHAS, como se describe en la presente. Así, cualquier planta de Brassica producida usando una planta de Brassica que tiene resistencia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS como se describe en la presente forma una parte de la invención. Como se usa en la presente, el cruzamiento puede significar autofecundación, apareamiento entre plantas hermanas, retrocruzamiento, cruzamiento a otra o a la misma línea parental, cruzamiento a poblaciones, y similares.

La presente invención también provee métodos para producir una planta resistente a herbicidas, tal como una planta de Brassica resistente a herbicidas, mediante selección de plantas convencional que comprende la reproducción sexual. Los métodos comprenden el cruzamiento de una primera planta que es resistente a un herbicida con una segunda planta que no es resistente al herbicida. La primera planta puede ser cualquiera de las plantas resistentes a herbicidas de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, plantas de Brassica que comprenden por lo menos una de las moléculas de ácidos nucleicos mutantes de la presente invención que codifican una AHASL resistente a herbicidas y plantas de Brassica no transgénicas que comprenden las características de resistencia a herbicidas de la planta de Brassica de BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3 o BnCL140C7. La segunda planta puede ser cualquier planta que es capaz de producir plantas de progenie viables (es decir, semillas) cuando se cruza con la primera planta. Típicamente, pero no necesariamente, la primera y la segunda plantas son de la misma especie. Por ejemplo, la secuencia de AHASL mutante en el genoma A en una planta de B. napus puede ser seleccionada en otras plantas de Brassica que también tienen el genoma A cruzando una planta de B. napus, por ejemplo, con una planta de B. júncea. Los métodos de la invención pueden comprender además una o más generaciones de retrocruzamiento de plantas de la progenie del primer cruzamiento con una planta de la misma línea o genotipo que o bien la primera o la segunda planta. Alternativamente, la progenie del primer cruzamiento o cualquier cruzamiento subsiguiente puede ser cruzada con una tercera planta que es de una línea o genotipo diferente que o bien la primera o la segunda planta.

Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente seleccionar plantas que comprenden las características de resistencia a herbicidas de la primera planta .

La presente invención provee además métodos para aumentar la resistencia a herbicidas de una planta, particularmente una planta de Brassica resistente a herbicidas, mediante selección de plantas convencional que comprende reproducción sexual. Los métodos comprenden cruzar una primera planta que es resistente a un herbicida con una segunda planta que puede o no ser resistente al herbicida o puede ser resistente a uno o más herbicidas diferentes que la primera planta. La primera planta puede ser cualquier de las plantas resistentes a herbicidas de la presente invención que incluyen, por ejemplo, plantas transgénicas o no transgénicas que comprenden por lo menos una de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención que codifican una AHASL resistente a herbicidas y plantas de Brassica no transgénicas que comprenden las características de resistencia a herbicidas de la planta de Brassica de BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3 o BnCL140C7. La segunda planta puede ser cualquier planta que es capaz de producir plantas de progenie viable (es decir, semillas) cuando se cruza con la primera planta. Típicamente, pero no necesariamente, la primera y la segunda plantas son de la misma especie; igualmente, la primera y la segunda plantas pueden ser de diferentes especies pero dentro del mismo género (ejemplo: Brassica júncea x Brassica napus, Brassica júncea x Brassica rapa, Brassica napus x Brassica olerácea, Brassica júncea x Brassica nigra, etc.) y también, la primera y la segunda plantas son de diferentes géneros (ejemplos: Brassica x Sinapis) . Las plantas de la progenie producidas por este método de la presente invención tienen resistencia aumentada a un herbicida cuando se comparan con o bien la primera o la segunda planta, o ambas. Cuando la primera y la segunda plantas son resistentes a diferentes herbicidas, las plantas de la progenie tendrán las características de resistencia a herbicidas combinadas de la primera y la segunda plantas. Los métodos de la invención pueden comprender además una o más generaciones de retrocruzamiento de plantas de la progenie del primer cruzamiento con una planta de la misma línea o genotipo que o bien la primera o la segunda planta. Alternativamente, la progenie del primer cruzamiento o cualquier cruzamiento subsiguiente puede ser cruzada con una tercera planta que es de una línea o genotipo diferente que o bien la primera o la segunda planta. Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente seleccionar plantas que comprenden las características de resistencia a herbicidas de la primera planta, la segunda planta, o ambas, a primera y la segunda plantas .

Las plantas de la presente invención pueden ser transgénicas o no transgénicas . Un ejemplo de una planta de Brassica no transgénica que tiene resistencia aumentada a herbicidas de imidazolinona y/o sulfonilurea incluye la planta de Brassica de BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3, BnCL140C7 o PMlPM2/BnCL131Al ; o una mutante, una recombinante o un derivado generado por ingeniería genética de la planta de BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3, BnCL140C7 o PMlPM2/BnCL131Al ; o de cualquier progenie de la planta de BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3, BnCL140C7 o PMlPM2/BnCL131Al ; o una planta que es una progenie de cualquiera de estas plantas; o una planta que comprende las características de resistencia a herbicidas de la planta de BnCL120C7, BnCL131Al, BnCL140B3, BnCL140C7 o PMlPM2/BnCL131Al .

La presente invención provee también plantas, órganos de plantas, tejidos de plantas, células vegetales, semillas, y células huésped no humanas que son transformadas con por lo menos una molécula de ácido nucleico, un cásete de expresión, o un vector de transformación de la invención. Tales plantas transformadas, órganos de plantas, tejidos de plantas, células vegetales, semillas, y células huésped no humanas, tienen tolerancia o resistencia aumentada a por lo menos un herbicida, a niveles del herbicida que destruyen o inhiben el crecimiento de una planta, tejido de planta, célula de planta o célula huésped no humana, no transformados, respectivamente. En una modalidad, las plantas, tejidos de plantas, células vegetales y semillas transformadas de la invención, son plantas de cultivo y de Brassica .

La presente invención también provee una semilla de una planta tolerante a herbicidas que inhibe la AHAS capaz de producir una planta que tiene resistencia a herbicidas que inhibe la AHAS obtenida de plantas producidas por los métodos de la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención también provee una planta cultivada a partir de la semilla de una planta que tienen resistencia a herbicidas que inhiben la AHAS obtenida de plantas cultivadas a partir de la semilla que tiene el rasgo de resistencia a herbicidas, así como también partes de plantas y cultivos de tejidos de tales plantas .

También se provee en la presente un recipiente de semillas de plantas, en donde las semillas son capaces de producir una planta resistente a herbicidas que inhibe la AHAS . El recipiente de semillas puede contener cualquier número, peso o volumen de semillas. Por ejemplo, un recipiente puede contener por lo menos, o más de, aproximadamente 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más semillas. Alternativamente, el recipiente puede contener por lo menos, o más de, aproximadamente 1 onza, 5 onzas, 1 libra, 2 libras, 3 libras, 4 libras, 5 libras o más de semillas.

Los recipientes de semillas de plantas pueden ser cualquier recipiente disponible en el arte. A modo de ejemplo no limitativo, un recipiente puede ser una caja, una bolsa, un paquete, un pouch, un rollo de cinta, una paila, una lámina, o un tubo.

En otra modalidad, las semillas contenidas en los recipientes dé semillas pueden ser semillas tratadas o no tratadas. En un aspecto, las semillas pueden ser tratadas para mejorar la germinación, por ejemplo, por imprimación de las semillas o por desinfección para proteger contra patógenos que nacen con las semillas. En otro aspecto, las semillas pueden ser recubiertas con cualquier recubrimiento disponible para mejorar, por ejemplo, la capacidad de plantarlas, la emergencia de las semillas, y la protección contra patógenos que nacen con las semillas. El recubrimiento de las semillas puede ser cualquier forma de recubrimiento de semillas que incluye, pero no está limitado a peletizado, recubrimiento con película y recubrimiento con una capa .

Además, las plantas de Brassica se pueden usar en métodos de selección para producir plantas que tienen rasgos adicionales de interés combinado con la tolerancia al inhibidor de AHAS (también denominados "rasgos apilados" o "apilamiento de rasgos"), tales como combinaciones de resistencia a herbicidas adicionales, tales como glifosato, glufosinato, y/o dicamba. Además, las plantas de Brassica se pueden usar en métodos de selección para producir plantas de Brassica que tienen múltiples secuencias codificadoras de resistencia a herbicidas que inhiben la AHAS. Además, las plantas descritas se pueden usar en métodos de selección para producir plantas que tienen el rasgo de tolerancia a herbicidas que inhiben la AHAS combinados con otros rasgos agronómicamente importantes, tales como la resistencia a enfermedades y patógenos, tales como aquellas conferidas por el gen Bt , resistencia a necrosis del cuello.

Los métodos descritos de selección incluyen métodos de selección de plantas de Brassica resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS, en donde el método comprende los pasos de (a) cruzar una planta de Brassica que contiene una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica una proteína de AHAS tolerante a herbicidas que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de la SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de la SEQ ID NO: 23 con una segunda planta de Brassica; y (b) obtener semillas del cruzamiento. Las semillas obtenidas pueden ser exploradas para identificar las semillas que contienen una molécula de ácido nucleico mutagenizada. Tales métodos pueden comprender además obtener una muestra de ADN de la semilla del cruzamiento y ensayar la muestra con respecto a la presencia o ausencia de la molécula de ácido nucleico mutagenizada. Alternativamente, las semillas pueden ser exploradas con respecto a tolerancia a herbicidas que inhiben la AHAS para identificar las semillas o la progenie que expresa el ácido nucleico de AHAS tolerante a herbicidas.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir una planta de Brassica que tiene resistencia a herbicidas que inhiben la AHAS que comprende: (a) cruzar una primera línea de Brassica con una segunda línea de Brassica para formar una población segregadora, en donde la primera línea de Brassica es una planta de Brassica resistente a herbicidas que inhiben la AHAS que comprende la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada de la presente invención; (b) explorar la población con respecto a resistencia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS; y (c) seleccionar uno o más miembros de la población que tienen resistencia aumentada a la AHAS con relación a una planta de Brassica de tipo salvaje.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para introgresar un rasgo de resistencia a herbicidas que inhiben la AHAS en una planta de Brassica que comprende: (a) cruzar por lo menos una primera línea de Brassica resistente a herbicidas que inhiben la AHAS con una segunda línea de Brassica para formar un población segregadora; (b) explorar la población con respecto a resistencia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS; y (c) seleccionar por lo menos un miembro de la población que tiene resistencia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS.

Alternativamente, en otro aspecto de la invención, ambas, la primera y la segunda plantas progenitoras de Brassica, pueden ser una planta de Brassica resistente a herbicidas que inhiben la AHAS, como se describe en la presente. Así, cualquier planta de Brassica producida usando una planta de Brassica que tiene la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada como se describe en la presente forma una parte de la invención. Como se usa en la presente, el cruzamiento puede significar autofecundación, apareamiento entre plantas hermanas, retrocruzamiento, cruzamiento a otra o a la misma línea parental, cruzamiento a poblaciones, y similares .

En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada de la invención puede ser transformada por ingeniería genética en una pila molecular con una molécula de ácido nucleico que confiere resistencia a un segundo herbicida, tal como glifosato o glufosinato. En otras modalidades, la pila molecular comprende además por lo menos una molécula de ácido nucleico adicional que confiere tolerancia a un tercer herbicida. En una modalidad la secuencia confiere tolerancia a glufosinato y en una modalidad específica, la secuencia comprende pat.

En otras modalidades, la planta de Brassica de la invención comprende uno o más rasgos de interés, y en algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada es apilada con cualquier combinación de secuencias de moléculas de ácidos nucleicos de interés para crear plantas con una combinación de rasgos deseada. Un rasgo, como se usa en la presente, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o grupos de secuencias. Por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos de tolerancia a herbicidas pueden ser apilados con cualesquiera otras moléculas de ácidos nucleicos que codifican a polipéptidos que tienen actividad pesticida y/o insecticida, tal como las proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descriptas en las patentes U.S. Nros . 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser et al. (1986) Gene 48: 109-118; Lee et al. (2003) Acta Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 57: 1101-1109 (Cry3Bbl) ; y Hermán et al. (2004) J. Agrie. Food Chem. 52: 2726-2734 (CrylF) ) , lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 825-830, pentina (descripta en la pat . U.S. N.° 5,981,722), y similares. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de una cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos de interés.

En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada puede ser apilada con otros rasgos de tolerancia a herbicidas para crear una planta de Brassica de la invención con propiedades mejoradas adicionales. Otras moléculas de ácido nucleico de tolerancia a herbicidas que podrían usarse en tales modalidades incluyen aquellas que confieren tolerancia al glifosato o a inhibidores de AHAS por otros modos de acción, tales como, por ejemplo, un gen que codifica una enzima glifosato óxido-reductasa como se describe en forma más completa en las patentes U.S. Nros . 5,776,760 y 5,463,175. Otros rasgos que podrían ser combinados con la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada incluyen aquellos derivados de las moléculas de ácido nucleico que confieren a la planta la capacidad de producir un nivel más alto de 5-enolpiruvilshikimato-3 -fosfato sintasa (EPSPS) , por ejemplo, como se describe en forma más completa en las patentes U.S.

Nros. 6,248,876 Bl; 5,627,061; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,783; 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 4,940,835; 5,866,775; 6,225,114 Bl; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; Re . 36,449; RE 37,287 E; y 5,491,288; y las publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 00/66746; WO 01/66704; y WO 00/66747. Otros rasgos que podrían ser combinados con las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas incluyen aquellos que confieren tolerancia a sulfonilurea y/o imidazolinona, por ejemplo, como se describe en forma más completa en las patentes U.S. Nros. 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937; y 5,378,824; y la publicación internacional WO 96/33270.

En consecuencia, se proveen plantas Brassica que contienen las moléculas de mutagenizadas de ácido nucleico AHAS de la presente invención en combinación (es decir "apiladas") con otros ácidos nucleicos mutantes o recombinantes que codifican genes de interés, tales como las moléculas de ácidos nucleicos tolerantes al inhibidor AHAS. En un ejemplo, las moléculas adicionales de ácidos nucleicos de tolerancia a inhibidor AHAS que se pueden usar en las combinaciones pueden contener cualquier mutación en comparación con la secuencia de AHAS de tipo silvestre, tales como, por ejemplo, las proteínas AHAS que tienen mutaciones P197S, A205V, S653N, W574L, y/o A122T, y sus combinaciones (por ejemplo, una secuencia AHAS doble o triple mutante) . En un ejemplo, se proveen plantas de Brassica que combinan una proteína AHASL tolerante a herbicida que comprende mutaciones de aminoácidos en las posiciones A122 y S653 con otra proteína AHASL tolerante a herbicida que comprende una mutación de aminoácido en la posición 574 y una proteína AHASL tolerante a herbicida que comprende una mutación de aminoácido en la posición S653. También se proveen semillas de las líneas mutantes de plantas de Brassica designadas PMlPM2/BnCL131Al , y se ha depositado una muestra de la semilla bajo el número de acceso ATCC PTA-10321.

Además, Los ácidos nucleicos mutados o recombinantes que se combinan con los ácidos nucleicos tolerantes a inhibidor de AHAS pueden estar localizados en cualquiera de los genomas de Brassica y producir pilas heterocigotas o homocigotas. En consecuencia, los ácidos nucleicos de interés para el uso en el apilado se pueden encontrar en genomas iguales o diferentes que el ácido nucleico tolerante a inhibidor de AHAS con doble mutación de la presente invención. Por ejemplo, se proveen plantas de Brassica napus (que contienen el genoma AACC) que contienen el AHAS mutagenizado de la presente invención en combinación con moléculas de ácidos nucleicos de tolerancia a imidazolinona ubicados, por ejemplo, en el genoma "A" para producir una pila heterocigota o en el genoma "C" para producir una pila homocigota. En otro ejemplo, se proveen plantas de Brassica júncea (que contienen el genoma AABB) que contienen el AHAS mutagenizado de la presente invención en combinación con moléculas de ácidos nucleicos de tolerancia a imidazolinona ubicados, por ejemplo, en el genoma "A" para producir una pila heterocigota o en el genoma "B" para producir una pila homocigota. En aún otro ejemplo, se proveen plantas de Brassica rapa (que contienen el genoma AA) que contienen el AHAS mutagenizado de la presente invención en combinaciones con moléculas de ácidos nucleicos de tolerancia a imidazolinona ubicadas, por ejemplo, en el genoma "A" para producir una pila heterocigota.

Los ejemplos de las plantas de Brassica incluyen plantas de Brassica napus que contienen la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizado de la presente invención en combinación con PM2 , la cual es una molécula de ácido nucleico de AHASL proveniente del genoma A que contiene una única mutación, W574L (Ver, por ejemplo, el documento WO 2004/040011), y en algunas modalidades también en combinación con PM1, la cual es una molécula de ácido nucleico AHASL proveniente de la secuencia del genoma C que contiene una única mutación S653N (Ver, por ejemplo, el documento WO 2004/040011) . Otro ejemplo incluye plantas de Brassica júncea que contienen la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizado de la presente invención en combinación con bR, el cual es una molécula de ácido nucleico AHASL proveniente del genoma B que contiene una única mutación S653N (por ejemplo, publicaciones de las patentes de los Estados Unidos N.° 2005/0283858 y 2009/0013424). Otros ejemplos incluyen plantas de Brassica que contienen las moléculas de ácidos nucleicos de AHAS mutagenizado de la presente invención en combinación con PM1.

En algunas modalidades, las combinaciones de ácidos nucleicos tolerantes a inhibidor de AHAS pueden proveer cualquier nivel de tolerancia a un inhibidor de AHAS, tales como efectos aditivos o efectos sinérgicos.

En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas pueden ser apiladas con, por ejemplo, hidroxifenil-piruvatodioxigenasas que son enzimas que catalizan la reacción en donde el para-hidroxifenilpiruvato (HPP) es transformado en homogentisato . Las moléculas que inhiben esta enzima y que se ligan a la enzima para inhibir la transformación del HPP en homogentisato son útiles como herbicidas. Los rasgos que confieren tolerancia a tales herbicidas en plantas se describen en las patentes U.S. Nros . 6,245,968 Bl; 6,268,549; y 6,069,115; y la publicación internacional WO 99/23886. Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas adecuados que podrían ser apilados con las secuencias de AHAS mutagenizadas incluyen las moléculas de ácido nucleico de ariloxialcanoato dioxigenasa (que según se informa confieren tolerancia a los herbicidas 2,4-D y otros de fenoxi auxina así como también a herbicidas de ariloxifenoxipropionato como se describe, por ejemplo, en la WO 2005/107437) y las moléculas de ácido nucleico de tolerancia a dicamba como se describe, por ejemplo, en Hermán et al. (2005) J. Biol . Chem. 280: 24759-24767.

Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas que podrían combinarse con las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas de la presente invención incluyen aquellos conferidos por moléculas de ácido nucleico que codifican una fosfinotricina acetiltransferasa exógeno, como se describe en las patentes U.S. Nros . 5,969,213;. 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616; y 5,879,903. Las plantas que contienen una fosfinotricina ' acetiltransferasa exógena pueden exhibir tolerancia mejorada a los herbicidas de glufosinato, que inhiben la enzima glutamina sintasa. Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas que podrían combinarse con las secuencias de AHAS mutagenizadas incluyen aquellas conferidas por moléculas de ácido nucleico que confieren actividad alterada de protoporfirinógeno oxidasa (protox) , como se describe en las patentes U.S. Nros. 6,288,306 Bl; 6,282,837 Bl ; y 5,767,373; y la publicación internacional WO 01/12825. Las plantas que contienen tales moléculas de ácido nucleico pueden exhibir tolerancia mejorada a cualquiera de una variedad de herbicidas que están direccionadas a la enzima protox (también denominados "inhibidores de protox" ) .

Otros ejemplos adicionales de genes de tolerancia a herbicidas que pueden combinarse con las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas incluyen aquellos genes que confieren tolerancia a herbicidas dicamba. Tales genes son conocidos en el arte, y se describen, por ejemplo, en la patente U.S. N.° 7,022,896 y la publicación U.S. N.° 2008/0015110.

Otros ejemplos de rasgos de tolerancia a herbicidas que podrían ser combinados con las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas de la presente invención incluyen aquellas que confieren tolerancia a por lo menos un herbicida en una planta tal como, por ejemplo, una planta de Brassica. Las plantas de Brassica tolerantes a herbicidas son conocidas en el arte, ya que son plantas que varían en su tolerancia a herbicidas particulares. Ver, por ejemplo, la pat . U.S. N.° 5,627,061. El o los rasgos responsables de estas tolerancias pueden ser combinados por selección o a través de otros métodos, tales como transgénicos , con las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas para proveer una planta de la invención así como también métodos de uso de las mismas.

Las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas también pueden ser combinadas con por lo menos otro rasgo para producir plantas de la presente invención que comprenden además una variedad de combinaciones de rasgos deseados que incluyen, pero no están limitados a, rasgos deseables para forraje para animales tales como alto contenido oleico (por ejemplo, las patentes U.S. Nros . 7,238,856; 7,268,276); composición de aminoácidos, contenido de proteínas, digestibilidad mejorada, o composiciones de ácidos grasos alteradas.

Las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas también pueden ser combinadas con otros rasgos deseables, tales como, por ejemplo, avirulencia y genes de resistencia a las enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266: 789-793; Martin et al. (1993) Science 262: 1432-1436; Mindrinos et al. (1994) Cell 78: 1089-1099), y rasgos deseables para el procesamiento o productos de procesamiento tales como aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (pat . U.S. N. ° 5,952,544; O 94/11516)); y políemros o bioplásticos (por ejemplo, pat. U.S. N. ° 5,602,321; beta ketotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol . 170: 5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs) ) . Se podrían combinar también moléculas de ácido nucleico tolerantes a herbicidas con moléculas de ácido nucleico que proveen rasgos agronómicos.

Las combinaciones apiladas pueden ser creadas por cualquier método que incluye, pero no está limitado a, seleccionar plantas por cualquier metodología conocida, o transformación genética, o combinaciones. Si las secuencias de interés pueden ser combinadas en cualquier tiempo y en cualquier orden. Los rasgos pueden ser introducidos simultáneamente en un protocolo de cotransformación con las moléculas de ácidos nucleicos de interés provistos por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introducirán dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidos en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias puede ser dirigida por el mismo promotor o por diferentes promotores. En algunos casos, puede ser conveniente introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión de la molécula de ácido graso de interés. Esto puede ser combinado con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación de rasgos deseada en la planta. Se reconoce además que las moléculas de ácido nucleico pueden ser apiladas en una ubicación genómica deseada usando un sistema de recombinación específica de un sitio. Ver, por ejemplo, O 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855, y WO 99/25853, las cuales se incorporan a la presente por referencia .

Métodos de detección También se proveen los métodos y las composiciones para identificar una planta que comprende los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico de AHAS mutagenizadas , incluyendo la progenie y los derivados. Tales métodos se usan para identificar y/o detectar plantas que contienen secuencias mutagenizadas en cualquier material biológico. Tales métodos incluyen, por ejemplo, métodos para confirmar la pureza de las semillas y métodos para explorar las semillas en un lote de semillas con respecto a las secuencias mutagenizadas de la presente invención. En una modalidad, se provee un método para identificar las secuencias de AHAS mutagenizadas en una muestra biológica y comprende formar una mezcla de una muestra biológica y un primer y un segundo ácido nucleico capaces de amplificar una molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada ; hacer reaccionar la mezcla bajo condiciones que permitan que los cebadores del primer y segundo ácido nucleico amplifiquen la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada; y, detectar la presencia o ausencia de una molécula de ácido nucleico de secuencia de AHAS mutagenizada amplificada.

La molécula de ácido nucleico amplificada (amplicón) puede tener cualquier longitud que permita la detección de una secuencia de AHAS mutagenizada. Por ejemplo, el amplicón puede ser de aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 100, 2000, 3000, 4000, 5000 nucleótidos de longitud o mayor.

También se proveen métodos para identificar o detectar una secuencia de AHAS mutagenizada en una muestra biológica que comprende formar una mezcla que contiene una muestra biológica que tiene AND de Brassica y una sonda de una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar a una molécula de ácido nucleico mutagenizada, haciendo reaccionar la mezcla bajo condiciones que permitan que la sonda de molécula de ácido nucleico se hibride a una molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada, y detectar si la sonda de la molécula de ácido nucleico se híbrida a una molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada en la muestra, en donde la presencia de hibridación indica la presencie de una molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada.

Transgénicas La presente invención también provee métodos para aumentar la actividad de AHAS en una planta que comprende transformar una planta con un constructo de ácido nucleico que comprende un promotor ligado en forma operativa a un nucleótido de AHASL de la invención. Los métodos comprenden introducir un constructo de ácido nucleico de la invención en por lo menos una célula de planta y regenerar una planta transformada desde allí. El constructo de ácido nucleico comprende por lo menos un nucleótido que codifica una proteína de AHASL resistente a herbicidas de la invención, particularmente las secuencias de nucleótidos de BN02-120 o BN02-131 como se presenta en las Figuras 3 y 4, y fragmentos y variantes de los mismos. Los métodos comprenden además el uso de un promotor que es capaz de dirigir la expresión del gen en una célula de planta. En una modalidad, un promotor como éste es un promotor constitutivo o un promotor preferido del tejido. Una planta producida por este método comprende actividad de AHAS aumentada, particularmente actividad de AHAS tolerante a herbicidas, cuando se compara con una planta no transformada. Así, los métodos se usan para aumentar o intensificar la resistencia de una planta a por lo menos un herbicida que interfiere con la actividad catalítica de la enzima AHAS, particularmente un herbicida de imidazolinona .

En una modalidad, los métodos para producir una planta resistente a herbicidas comprende transformar una células de planta con un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos ligada en forma operativa a un promotor que dirige la expresión en una célula de planta y regenerar una planta transformada a partir de la célula de planta transformada. La secuencia de nucleótidos es seleccionada entre aquellas secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de AHASL resistentes a herbicidas de la invención, particularmente las secuencias de nucleótidos de Bn02-120 o Bn02-131 como se presentan en las Figuras 3 y 4, y fragmentos y variantes de los mismos. Una planta resistente a herbicidas producida por este método comprende resistencia aumentada, en comparación con una planta no transformada, a por lo menos un herbicida, particularmente un herbicida que interfiere con la actividad de la enzima AHAS tal como, por ejemplo, un herbicida de imidazolinona o un herbicida de sulfonilurea .

Resistencia a herbicidas y control de malezas Las plantas resistentes a herbicidas que inhiben la AHAS de la invención se usan en métodos para controlar las malezas. Así, la presente invención provee además un método para controlar malezas en la cercanía de una planta resistente a herbicidas, tal como una planta de Brassica, que comprende una molécula de ácido nucleico de AHASL de la invención. El método comprende aplicar una cantidad efectiva de un herbicida que inhibe la AHAS a las malezas y a la planta resistente a herbicidas, en donde la planta tiene resistencia a por lo menos un herbicida que inhibe la AHAS, tal como un herbicida de imidazolinona o sulfonilurea, cuando se compara con una planta de tipo salvaje. Se puede usar cualquier planta que tenga las secuencias de ácido nucleico de la presente invención en tales métodos. En una modalidad, las plantas resistentes a herbicidas de la invención con plantas de cultivo de Brassica, incluyendo, pero no limitado a, Brassica napus, Brasssica rapa y Brassica júncea.

..Proporcionando plantas que tienen resistencia aumentada a herbicidas que inhiben la AHAS, tales como los herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea, se pueden emplear una amplia variedad de formulaciones para proteger plantas de las malezas, a modo de aumentar el crecimiento de las plantas y reducir la competencia por nutrientes. Se puede usar un herbicida por sí mismo para preemergencia, post-emergencia, preplantación y en el control de plantación de las malezas en áreas que rodean a las plantas descriptas en la presente o se puede usar una formulación de herbicida que inhibe la AHAS que contiene otros aditivos. El herbicida también se puede usar como un tratamiento de semillas. Una concentración efectiva o una cantidad efectiva del herbicida, o una composición que comprende una concentración efectiva o una cantidad efectiva del herbicida se puede aplicar directamente a las semillas antes de, o durante, la siembra de las semillas. Los aditivos que se encuentran en una formulación o composición de herbicida que inhibe la AHAS incluyen otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes de diseminación, agentes de adherencia, agentes estabilizantes, o similares. La formulación de herbicida puede ser una preparación húmeda o seca y puede incluir, pero no está limitada a, polvos que fluyen, concentrados emulsionables y concentrados líquidos. El herbicida y las formulaciones de herbicidas se pueden aplicar de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, por rociado, irrigación, espolvoreado, recubrimiento, y similares .

El herbicida que inhibe la AHAS para usar en los métodos provistos en la presente se puede aplicar por cualquier método conocido en el arte incluyendo, pero no limitado a, tratamiento de las semillas, tratamiento del suelo y tratamiento foliar.

La presente invención provee métodos para aumentar la tolerancia o la resistencia de una planta, tejido de planta, célula de planta u otra célula huésped a por lo menos un herbicida que interfiere con la actividad de la enzima AHAS. Preferentemente, tal herbicida que inhibe la AHAS es un herbicida de imidazolinona , un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazoloprimidina, un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, un herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona , o mezclas de los mismos. Más preferentemente, un herbicida de este tipo es un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, o mezclas de los mismos. Para la presente invención, los herbicidas de imidazolinona incluyen, pero no están limitados a PURSUIT (imazetapir) , CADRE® (imazapic) , RAPTOR® (imazamox) , SCEPTER® (imazaquin) , ASSERT® ( imazetabenz ) , ARSENAL® (imazapir) , un derivado de cualquiera de los herbicidas arriba mencionados, ® por ejemplo, imazapir/imazamox (ODYSSEY ) . Más específicamente, el herbicida de imidazolinona puede ser seleccionado entre, pero no está limitado a, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il) -nicotínico, ácido [2- (4-isopropil-4] - [metil-5-oxo-2- imidazolin-2 - il ) -3-quinolincarboxílico] , ácido [5-etil-2- (4-isopropil-] -4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il) -nicotínico, ácido 2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2 - imidazolin-2 - il) -5- (metoximetil ) -nicotínico, ácido [2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-] - imidazolin-2 - il ) -5-metil-nicotínico, y una mezcla de [6- ( - isopropil -4 - ] -metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il) -m-toluato de metilo y [2- (4-isopropil -4 -metil -5 - ] -oxo-2-imidazolin-2-il) -p-toluato de metilo. Se prefiere el uso de ácido 5-etil-2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il) -nicotínico y ácido [2- (4-isopropil -4 -metil -5 -oxo-2 - imidazolin-2- ] -il) - ( 5-metoximetil ) -nicotínico. Se prefiere particularmente el uso de ácido [2- (4-isopropil-4-] -metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il) -5- (metoximetil) -nicotínico.

Para la presente invención, los herbicidas de sulfonilurea incluyen, pero no están limitados a, clorsulfurón, metsulfurón metilo, sulfometurón metilo, clorimurón etilo, tifensulfurón metilo, tribenurón metilo, benzulfurón metilo, nicosulfurón, etametsulfurón metilo, rimsulfurón, triflusulfurón metilo, triasulfurón, primisulfurón metilo, cinosulfurón, amidosulfurón, fluzasulfurón, imazosulfurón, pirazosulfurón etilo, halosulfurón, azimsulfurón, ciclosulfurón, etoxisulfurón, flazasulfurón, flupirsulfurón metilo, foramsulfurón, yodosulfurón, oxasulfurón, mesosulfurón, prosulfurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, tritosulfurón, un derivado de cualquiera de los herbicidas arriba mencionados, y una mezcla de dos o más de los herbicidas arriba mencionados. Los herbicidas de triazolopirimidina de la invención incluyen, pero no están limitados a, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, y penoxsulam. Los herbicidas de pirimidiniloxibenzoato de la invención incluyen, pero no están limitados a, bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim y piriftálida. Los herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona incluyen, pero no están limitados a, flucarbazona y propoxicarbazona .

Se reconoce que los herbicidas de pirimidiniloxibenzoato están estrechamente relacionados con los herbicidas de pirimidiniltiobenzoato y son generalizados bajo el título del nombre de este último por la Weed Science Society of America. Por consiguiente, los herbicidas de la presente invención incluyen además herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluyendo, pero no limitado a, los herbicidas de pirimidiniloxibenzoato descriptos más arriba.

La presente invención también provee composiciones agrícolas para la aplicación a las plantas de Brassica descritas. Las composiciones pueden incluir herbicidas, fungicidas, bactericidas, fertilizantes, y similares. En una modalidad, las composiciones agrícolas are composiciones herbicidas que comprenden uno o más herbicidas o combinaciones de uno o más herbicidas con otra composición agrícola, tales como un fungicida, bactericida, fertilizante, y similares.

Cualquier herbicida puede ser aplicado a un cultivo, parte de cultivo, o la zona de cultivo que contiene una planta de Brassica que contiene una secuencia de ácidos nucleicos tolerantes a inhibidor de AHAS de la presente invención. La clasificación de herbicidas (es decir, el agrupamiento de los herbicidas en clases y subclases) es bien conocida en la técnica e incluye clasificaciones de HRAC (Herbicide Resistance Action Committee) y WSSA (the Weed Science Society of America) . La clasificación de HRAC está disponible, por ejemplo, mundialmente en el sitio web hracglobal . com/Publications/Classificationof HerbicideModeofAction/tabid/222/Default . aspx.

En algunas modalidades, la presente invención provee métodos que incluyen el uso de al menos un herbicida inhibidor de AHAS seleccionado del grupo que consiste de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas triazolopirimidina , herbicidas pirimidiniloxibenzoate , herbicidas sulfonilamino-carboniltriazolinona herbicidas, y sus mezclas. En estos métodos, el herbicida inhibidor de AHAS se puede aplicar por cualquier método conocido en la técnica incluso, sin limitaciones, tratamiento de semillas, tratamiento de suelo y tratamiento foliar.

En algunas modalidades, el herbicida inhibidor de AHAS se puede combinar con una o más composiciones agrícolas adicionales, tales como composiciones herbicidas, fungicidas, bactericidas, antiviral adicionales, o sus combinaciones. Los herbicidas adicionales para el uso en las combinaciones incluye cualquier herbicida, incluso herbicidas de sulfamida, herbicidas de organofosfato, y herbicidas de benzotiadiazinona . Los herbicidas de sulfamida incluyen sin limitaciones saflufenacilo . Los herbicidas de Organofosfato incluyen sin limitaciones glifosato y glifosinato. Los herbicidas de benzotiadiazinona incluyen sin limitaciones bentazona. Los fungicidas para usar en las combinaciones incluyen sin limitaciones piraclostrobina .

Los herbicidas inhibidores de protoporfirinógeno [IX] oxidasa (PPO) también se pueden usar en las composiciones de la presente invención. Los herbicidas inhibidores de PPO son conocidos en la técnica e incluyen sin limitaciones de herbicidas difeniléter (incluso herbicidas de éter nitrofenílico) , tales como acifluorfeno (ácido 5- [2-cloro-4- (trifluorometil) fenoxi] -2-nitrobenzoico) , bifenox (5- (2 , 4-diclorofenoxi) -2 -nitrobenzoato de metilo), DPEI (éster metílico de ácido acético de oxima-o-5- [2-cloro-4-(trifluorometil ) fenoxi] -2-nitroacetofenona) , DPEII (5- [2-cloro-4- (trifluorometil) fenoxi] -3-metoxiftalida) , etoxifeno (2-cloro-5- [2-cloro-4- (trifluorometil ) fenoxi] benzoato de (1S) -1-carboxietilo) , fomesafeno (5- [2-cloro-4- (trifluorometil) fenoxi] -N- (metilsulfonil ) -2-nitrobenzamida) , lactofeno (O- [5- (2 -cloro-a , , a-trifluoro-p-toliloxi ) -2-nitrobenzoil] -DL-lactato de elito) , y oxifluorfeno (2-cloro-1- (3 -etoxi-4 -nitrofenoxi ) -4 - (trifluorometil) benceno) . Los herbicidas inhibidores de PPO también incluyen herbicidas de dicaboximida tales como N- fenil - ftalimidas de flumiclorac (ácido [2 -cloro-5- (ciclohex-l-en-1 , 2 -dicarboximido) -4-fluororofenoxi] acético) , flumioxazina (N- (7-fluoro-3 , 4-dihidro-3-oxo-4-prop-2-inil-2H-l , 4-benzoxazin-6-il) ciclohex-1-en-l , 2 -dicarboxamida) . Los herbicidas inhibidores de PPO también incluyen herbicidas de triazolinona tales como carfentrazona (ácido a, 2-dicloro-5- [4- (difluorometil) -4 , 5-dihidro-3-metil-5-oxo-lH-l , 2 , 4 -triazol-l-il] -4-fluorobenzenepropanoico) , y sulfentrazona (N- [2 , 4 -dicloro- 5 - [4- (difluorometil) -4, 5-dihidro-3-metil-5-oxo-lH-l , 2,4-triazol-l-il] fenil] metanosulfonamida) . Los herbicidas inhibidores de PPO también incluyen herbicidas de fenilpirazol , incluso, sin limitaciones nipiraclofeno (1- [2 , 6 -dicloro-4- (trifluorometil ) fenil] -4-nitro-lH-pirazol-5-amina) y piraflufeno (ácido 2 -cloro-5 - (4 -cloro-5 - difluorometoxi-l-metilpirazol-3-il) -4-fluorofenoxiacético) . Los herbicidas inhibidores de PPO también incluyen herbicidas de oxadiazolona tales como oxadiazona (3 - [2 , 4 -dicloro-5 - ( 1-metiletoxi) fenil] -5- (1, 1-dimetiletil) -1, 3 , 4-oxadiazol-2 (3H) -ona) y oxadiargilo (5- tert-butil-3- [2, 4-dicloro-5- (prop-2-iniloxi) fenil] -1 , 3 , 4 -oxadiazol-2 (3H) -ona) . Los herbicidas inhibidores de PPO también incluyen herbicidas de tiadiazolona tales como flutiacet (ácido [ [2-cloro-4-fluoro-5- [ (tetrahidro-3-???-??, 3H- [1, 3,4] tiadiazolo [3 , 4-a] piridazin-1-iliden) amino] fenil] thio] acético) ; así como los descritos en la sección III.4) del documento US2008254985 de Zagar y Sievernich (que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad) .

Los herbicidas auxínicos también se usan en las composiciones de la presente invención. Los herbicidas aixínicos incluyen los que comprenden ingredientes con actividad herbicida cuyo modo de acción es un auxinamimético o inhibidor de auxina (antiauxinas) . Los ejemplos de herbicidas auxínicos incluyen sin limitaciones, picloram (ácido 4 -amino-3 , 5 , 6-tricloropicolínico) ; dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) ; ácido clofíbrico (ácido (p-clorofenoxi) isobutírico) ; ácido 2- (4 -clorofenoxi ) -2-metilpropanoico) ; benazolina (ácido 4-cloro-2-oxo-3-benzothiazoleacético; ácido 4-cloro-2-oxobenzotiazolin-3-il-acético); TIBA (ácido 2 , 3 , 5-triiodobenozico) ; ácido 2,3,6-TBA (2 , 3 , 6-triclorobenzoico) ; triclopir (ácido 3 , 5 , 6 -tricloro-2 -piridiloxiacético) ; quinclorac (ácido 3 , 7-dicloroquinoline-8-carboxílico) ; y los herbicidas auxinamiméticos o bloqueadores fenoxi de auxina, por ejemplo, fenoxiacético, fenoxipropiónico, y herbicidas fenoxibutírico, incluso: 2,4-D (ácido (2 , 4-diclorofenoxi) acético) , MCPA (ácido (4-cloro-2-metilfenoxi) acético) , 2,4-DB (ácido 4- (2,4-diclorofenoxi) butírico) , 2,4-DEP (tris [2- (2 , 4-diclorofenoxi) etil] fosfato), 4-CPA (ácido 4-clorofenoxiacético) , 2,4, 5-T (ácido (2,4,5-triclorofenoxi) acético) , diclorprop (ácido 2- (2,4-diclorofenoxi ) propanoico) , fenoprop (ácido 2-(2,4,5-triclorofenoxi) propanoico) , y mecoprop (ácido 2- (2-metil-4-cloro-fenoxi) ropionico) .

Los ejemplos de combinaciones de composiciones agrícolas de la presente invención incluyen: imazapir y imazapic; imazapir y bentazona; imazapir, imazapic, y bentazona; imazapir y piraclostrobina ; imazapir, imazapic, y piraclostrobina; imazapir y saflufenacilo; imazapir, imazapic, y saflufenacilo; imazapic, saflufenacilo, y glifosato; imazapir, imazapic, saflufenacilo, y glifosato; imazapic y glifosato; imazapir y glifosato; imazapir, saflufenacilo, y glifosato; y saflufenacilo y glifosato.

Antes de la aplicación, el herbicida que inhibe la AHAS puede ser convertido en las formulaciones acostumbradas, por ejemplo, soluciones, emulsiones, suspensiones, espolvoreados, polvos, pastas y gránulos . La forma de uso depende del propósito particular previsto; en cada caso debería asegurarse una distribución fina y uniforme del compuesto de acuerdo con la invención.

Las formulaciones pueden ser preparadas de una manera conocida (ver, por ejemplo, para un panorama la U.S. 3,060,084, EP-A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, "Agglomeration" , Chemical Engineering, Dic. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4ta. ed. , McGraw-Hill, Nueva York, 1963, páginas 8-57 y ss . O 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8va . ed. , Blackwell Scientific Publications , Oxford, 1989, y Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Alemania) , 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por ejemplo, extendiendo el compuesto activo con auxiliares adecuados para la formulación de agroquímicos , tales como solventes y/o vehículos, si se desea, emulsionantes, tensioactivos y dispersantes, conservantes, agentes antiespumantes , agentes anticongelantes, para la formulación de tratamiento de semillas también opcionalmente colorantes y/o ligantes y/o agentes gelificantes .

Los ejemplos de solventes apropiados para usar en las formulaciones incluyen agua, solventes aromáticos (por ejemplo, productos Solvesso, xileno) , parafinas (por ejemplo, fracciones de aceite mineral), alcoholes (por ejemplo, metanol, butanol , pentanol, alcohol bencílico), cetonas (por ejemplo, ciclohexanona, gamma-butirolactona) , pirrolidonas (NMP, NOP) , acetatos (glcoldiacetato) , glicoles, dimetilamidas de ácidos grasos, ácidos grasos y esteres de ácidos grasos. También se pueden usar mezclas de solventes.

Los ejemplos de portadores apropiados para usar en las formulaciones de la presente invención incluyen minerales naturales molidos (por ejemplo, caolín, arcillas, talco, tiza) y minerales sintéticos molidos (por ejemplo, sílice de alta dispersión, silicatos) .

Los emulsionantes apropiados para usar en las formulaciones de la presente invención incluyen emulsionantes no iónicos y aniónicos (por ejemplo, éteres de alcohol graso de polioxietileno, alquilsulfonatos y arilsulfonatos) .

Los ejemplos de dispersantes para usar en las formulaciones de la presente invención incluyen licores de desecho de lignin-sulfito y metilcelulosa .

Los tensioactivos apropiados para usar en las formulaciones de la presente invención incluyen sales de metales alcalinos, sales de metales alcalinotérreos y sales de amonio de ácido lignosulfónico, ácido naftalensulfónico, ácido fenolsulfónico, ácido dibutilnaftalensulfónico, alquilarilsulfonatos, alquilsulfatos , alquilsulfonatos , sulfatos de alcohol graso, ácidos grasos y glicoléteres de alcohol graso sulfatados, también condensados de naftaleno sulfonado y derivados de naftaleno con formaldehído, condensados de naftaleno o de ácido naftalensulfónico con fenol y formaldehído, éter de polioxietilenoctilfenol , isooctilfenol , octilfenol, nonilfenol etoxilados, poliglicoléteres de alquilfenol, poliglicoléter de tributilfenilo, poliglicoléter de triestearilfenilo, polieteralcoholes de alquilarilo, alcohol y condensados de óxido de etileno de alcohol graso, aceite de ricino etoxilado, alquiléteres de polioxietileno, polioxipropileno etoxilado, poliglicoléter acetal de alcohol láurico, ésteres de sorbitol, licores de desecho de lignosulfito y metilcelulosa .

Las sustancias que son apropiadas para preparar soluciones, emulsiones de pulverización directa, pastas o dispersiones en aceite son fracciones de aceite mineral de un punto de ebullición medio a alto, tales como querosén o aceite diesel, también aceites de hulla y aceites de origen vegetal o animal, hidrocarburos alifáticos, cíclicos y aromáticos, por ejemplo, tolueno, xileno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftálenos alquilados o sus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclohexanol , ciclohexanona, isoforona, solventes altamente polares, por ejemplo, dimetilsulfóxido, N-metilpirrolidona o agua.

También se pueden añadir anticongelantes tales como glicerina, etilenglicol , proplenglicol y bactericidas a la formulación .

Los agentes antiespumantes apropiados para usar en las formulaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, agentes antiespumantes a base de silicio o estearato de magnesio.

Los conservantes apropiados para usar en las formulaciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, diclorofenol y hemiformaldehído de alcohol bencílico.

Las formulaciones de tratamiento de semillas de la presente invención pueden incluir adicionalmente aglutinantes y opcionalmente colorantes .

Los aglutinantes se pueden añadir a las formulaciones de semilla descritas para mejorar la adhesión de los materiales activos sobre las semillas después del tratamiento. Los aglutinantes apropiados son copolímeros de bloque OE/OP tensioactivos , pero también alcoholes polivinílicos , polivinilpirrolidonas , poliacrilatos , polimetacrilatos , polibutenos, poliisobutilenos , poliestireno, polietilenaminas , polietilenamidas , polietileniminas (Lupasol®, Polymin8) , poliéteres, poliuretanos , polivinilacetato, tilosa y copolímeros derivados de estos polímeros.

Opcionalmente , también pueden estar incluiros colorantes en la formulación. Los colorantes o las tinturas apropiados para formulaciones de tratamiento de semillas son Rhodamin B, C.I. Pigment Red 112, C.I. Solvent Red 1, pigment blue 15:4, pigment blue 15:3, pigment blue 15:2, pigment blue 15:1, pigment blue 80, pigment yellow 1, pigment yellow 13, pigment red 112, pigment red 48:2, pigment red 48:1, pigment red 57:1, pigment red 53:1, pigment orange 43, pigment orange 34, pigment orange 5, pigment green 36, pigment green 7, pigment white 6, pigment brown 25, basic violet 10, basic violet 49, acid red 51, acid red 52, acid red 14, acid blue 9, acid yellow 23, basic red 10, basic red 108.

Un ejemplo de un agente gelante apropiado es carragenano (Satiagel ) .

Los polvos, los materiales para dispersión y productos pulverizables se pueden preparar mezclando o triturando concomitantemente las sustancias activas con un portador sólido.

Los gránulos, por ejemplo, gránulos recubiertos, gránulos impregnados y gránulos homogéneos se pueden preparar triturando los compuestos activos en portadores sólidos. Los ejemplos de portadores sólidos son tierras minerales tales como geles de sílice, silicatos, talco, caolín, attaclay, piedra caliza, lime, tiza, bolo, loess, arcilla, dolomita, tierra de diatomeas, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, materiales sintéticos molidos, fertilizantes tales como, por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas y productos de origen vegetal, tales como harina de cereal, harina de corteza de árbol, harina de madera harina de cascara de nuez, polvos de celulosa y otros portadores sólidos.

En general, las formulaciones comprenden de 0.01 a 95% en peso, preferentemente de 0.1 a 90% en peso, del herbicida que inhibe la AHAS . En este caso, los herbicidas que inhiben la AHS se emplean en una pureza de desde 90% a 100% en peso, preferentemente 95% a 100% en peso (de acuerdo con el espectro de RM ) . Para propósitos de tratamiento de semillas, las formulaciones respectivas pueden ser diluidas 2 a 10 veces dando concentraciones en los preparados listos para usar de 0.01 a 60% en peso de compuesto activo en peso, preferentemente 0.1 a 40% en peso.

El herbicida que inhibe la AHAS se puede usar como tal, en forma de sus formulaciones o las formas de uso preparadas a partir de las mismas, por ejemplo, en la forma de soluciones directamente rociables, polvos, suspensiones o dispersiones, emulsiones, dispersiones de aceite, pastas, productos que se pueden espolvorear, materiales para la diseminación, o gránulos , por medios de rociado, atomizado, espolvoreado, diseminación o vertido. Las formas de uso dependen completamente de los propósitos previstos; pretenden asegurar en cada caso la distribución más fina posible del herbicida que inhibe la AHAS de acuerdo con la invención.

Las formas de uso acuosas pueden ser preparadas a partir de concentrados de emulsión, pastas o polvos humectables (polvos que se pueden rociar, dispersiones en aceite) agregando agua. Para preparar emulsiones, pastas o dispersiones en aceite, las sustancias, como tales o disueltas en un aceite o solvente, pueden ser homogeneizadas en agua por medio de un humectante, adhesivo, dispersante o emulsionante. Sin embargo, también es posible preparar concentrados compuestos por la sustancia activa, humectantes, adhesivos, dispersantes o emulsionantes y, si es apropiado, solventes o aceites, y tales concentrados son adecuados par dilución con agua.

Las concentraciones de compuesto activo en los preparados listos para usar pueden variarse dentro de rangos relativamente amplios. En general, son de 0.0001 a 10%, preferentemente de 0.01 a 1% en peso.

El herbicida que inhibe la AHAS también se puede usar exitosamente en el procedimiento de volumen ultra-bajo (UlV) , siendo posible aplicar formulaciones que comprende más de 95% en peso de compuesto activo, o incluso aplicar el compuesto activo sin aditivos.

Los siguientes son ejemplos de formulaciones: 1. Productos para dilución con agua para aplicaciones foliares. Para propósitos de tratamiento de semillas, tales productos pueden ser aplicados a las semillas diluidos o no diluidos.

A) Concentrados solubles en agua (SL, LS) Diez partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS se disuelven en 90 partes en peso de agua o un solvente soluble en agua. Como una alternativa se agregan humectantes u otros auxiliares. El herbicida que inhibe la AHAS se disuelve después de dilución con agua, por lo que se obtiene una formulación con 10% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS.

B) Concentrados dispersables (DC) Veinte partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS se disuelven en 70 partes en peso de ciclohexanona con adición de 10 partes en peso de un dispersante, por ejemplo polivinilpirrolidona. La dilución con agua da una dispersión, por lo que se obtiene una formulación con 20% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS.

C) Concentrados emulsionables (EC) Quince partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS se disuelven en 7 partes en peso de xileno con adición de dodecilbencenosulfonato de calcio y etoxilato de aceite de ricino (en cada caso 5 partes en peso) . La dilución con agua da una emulsión, por lo que se obtiene una formulación con 15% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS.

D) Emulsiones (EW, EO, ES) Veinticinco partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS se disuelven en 35 partes en peso de xileno con adición de dodecilbencenosulfonato de calcio y etoxilato de aceite de ricino (en cada caso 5 partes en peso) . Esta mezcla se introduce en 30 partes en peso de agua por medio de una máquina emulsionadora (por ejemplo, Ultraturrax) y se forma una emulsión homogénea. La dilución con agua da una emulsión, por lo que se obtiene una formulación con 25% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS.

E) Suspensiones (SC, OD, FS) En un molino de bolas agitado, se trituran 20 partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS con adición de 10 partes en peso de dispersantes, humectantes y 70 partes en peso de agua o de un solvente orgánico para dar una suspensión fina de herbicida que inhibe la AHAS. La dilución con agua da una suspensión estable del herbicida que inhibe la AHAS, por lo que se obtiene una formulación con 20% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS.

F) Gránulos dispersables en agua y gránulos solubles en agua (WG, SG) Cincuenta partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS se muelen finamente con adición de 50 partes en peso de dispersantes y humectantes y se preparan como gránulos dispersables en agua y solubles en agua por medio de instalaciones técnicas (por ejemplo, extrusión, torre de rociado, lecho fluido) . La dilución con agua da una dispersión estable o una solución del herbicida que inhibe la AHAS, por lo que se obtiene una formulación con 50% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS.

G) Polvos dispersables en agua y polvos solubles en agua (WP, SP, SS, WS) Setenta y cinco partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS se muelen en un molino de rotor-estator con adición de 25 partes en peso de dispersantes, humectantes y gel de sílice. La dilución con agua da una dispersión estable o una solución del herbicida que inhibe la AHAS, por lo que se obtiene una formulación con 75% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS .

I) Formulación en gel (GF) En un molino de bolas agitado, se trituran 20 partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS con adición de 10 partes en peso de dispersantes, 1 parte en peso de un agente gelificante, humectantes y 70 partes en peso de agua o de un solvente orgánico para dar una suspensión fina de herbicida que inhibe la AHAS. La dilución con agua da una suspensión estable del herbicida que inhibe la AHAS , por lo que se obtiene una formulación con 20% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS. Esta formulación en gel es adecuada para usar como un tratamiento de semillas. 2. Productos a ser aplicados no diluidos para aplicaciones foliares. Para propósitos de tratamiento de semillas, tales productos se pueden aplicar a las semillas diluidos .

A) Polvos para espolvorear (DP, DS) Cinco partes en peso del herbicida que inhibe la AHAS se muelen finamente y se mezclan íntimamente con 95 partes en peso de caolín finamente dividido. Esto da un producto que se puede espolvorear que tiene 5% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS.

B) Gránulos (GR, FG, GG, MG) Media parte en peso del herbicida que inhibe la AHAS se muele finamente y se asocia con 95,5 partes en peso de vehículos, por lo que se obtiene una formulación con 0.5% (p/p) de herbicida que inhibe la AHAS. Los métodos corrientes son extrusión, secado por rociado o el lecho fluido. Esto da gránulos a ser aplicados no diluidos para uso foliar.

Las formulaciones para el tratamiento convencional de las semillas incluyen, por ejemplo, concentrados que pueden fluir FS, soluciones LS , polvos para el tratamiento seco DS, polvos dispersables en agua para tratamiento con lechada S, polvos solubles en agua SS y emulsiones ES y EC y formulación en gel GF. Estas formulaciones se pueden aplicar a las semillas diluidas o no diluidas. La aplicación a las semillas se realiza antes de la siembra, o bien directamente sobre las semillas.

En una modalidad, se usa una formulación FS para el tratamiento de las semillas. Típicamente una formulación FS puede comprender 1-800 g/1 de ingrediente activo, 1-200 g/1 de tensioactivo, 0 a 200 g/1 de agente anticongelante, 0 a 400 g/1 de ligante, 0 a 200 g/1 de un pigmento y hasta 1 litro de un solvente, preferentemente agua.

La presente invención provee semillas no transgénicas y transgénicas de las plantas de Brassica resistentes a herbicidas de la presente invención. Tales semillas incluyen, por ejemplo, semillas de Brassica no transgénicas que comprenden las características de resistencia a herbicidas de la planta de BnCL120C7 o BnCL131Al, y semillas transgénicas que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica una proteína de AHASL resistente a herbicidas.

Para el tratamiento de las semillas, las semillas de las plantas resistentes a herbicidas de acuerdo con la presente invención son tratadas con herbicidas, preferentemente herbicidas seleccionados entre el grupo que consiste en herbicidas que inhiben la AHAS tales como amidosulfurón, azimsulfurón, bensulfurón, clorimurón, clorsulfurón, cinosulfurón, ciclosulfamurón, etametsulfurón, etoxisulfurón, flazasulfurón, flupirsulfurón, foramsulfurón, halosulfurón, imazosulfurón, yodosulfurón, mesosulfurón, metsulfurón, nicosulfurón, oxasulfurón, primisulfurón, prosulfurón, pirazosulfurón, rimsulfurón, sulfometurón, sulfosulfurón, tifensulfurón, triasulfurón, tribenurón, trifloxisulfurón, triflusulfurón, tritosulfurón, imazametabenz , imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona , piribenzoxima, piriftálida, piritiobac, y mezclas de los mismos, o con una formulación que comprende un herbicida que inhibe la AHAS.

El término tratamiento de las semillas comprende todas las técnicas de tratamiento de semillas adecuadas conocidas en el arte, tales como recubrimiento de las semillas, recubrimiento de las semillas, espolvoreado de las semillas, impregnación de las semillas y peletizado de las semillas .

De acuerdo con una variante de la presente invención, un objeto adicional de la invención es un método para tratar el suelo por la aplicación, en particular en el tratamiento de la semilla: o bien de una formulación granular que contiene el herbicida que inhibe la AHAS como una composición/formulación, por ejemplo, una formulación granular, opcionalmente con uno o más vehículos sólidos o líquidos, aceptables en agricultura y/u opcionalmente con uno o más tensioactivos aceptables en agricultura. Este método se emplea ventajosamente, por ejemplo, en lechos de semillas de cereales, maíz, algodón y girasol.

La presente invención también comprende semillas recubiertas con, o conteniendo, una formulación de tratamiento de las semillas que comprende por lo menos un inhibidor de la AHAS seleccionado entre el grupo que consiste en amidosulfurón, azimsulfurón, bensulfurón, clorimurón, clorsulfurón, cinosulfurón, ciclosulfamurón, etametsulfurón, etoxisulfurón, flazasulfurón, flupirsulfurón, foramsulfurón, halosulfurón, imazosulfurón, yodosulfurón, mesosulfurón, metsulfurón, nicosulfurón, oxasulfurón, primisulfurón, prosulfurón, pirazosulfurón, rimsulfurón, sulfometurón, sulfosulfurón, tifensulfurón, triasulfurón, tribenurón, trifloxisulfurón, triflusulfurón, tritosulfurón, imazametabenz , imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona , piribenzoxima , piriftálida, piritiobac .

El término "semilla"- comprende semillas y propágulos de plantas de todo tipo incluyendo, pero no limitado a, semillas verdaderas, trozos de semillas, brotes de raíz, bulbos, frutos, tubérculos, granos, recortes, brotes cortados y similares, y medios en semillas verdaderas de una modalidad preferida.

El término "recubierto con y/o conteniendo" significa en general que el ingrediente activo está en su mayor parte en la superficie del producto de propagación en el momento de la aplicación, aunque una mayor o menor parte del ingrediente puede penetrar en el producto de propagación, dependiendo del método de aplicación. Cuando el producto de propagación es plantado (nuevamente) , puede absorber el ingrediente activo.

La aplicación del tratamiento de las semillas con el herbicida que inhibe la AHAS o con una formulación que comprende el herbicida que inhibe la AHAS se lleva a cabo rociando o espolvoreando las semillas antes de la siembra de las plantas y antes de la emergencia de las plantas.

En el tratamiento de las semillas, las formulaciones correspondientes se aplican tratando las semillas con una cantidad efectiva del herbicida que inhibe la AHAS o una formulación que comprende el herbicida que inhibe la AHS . En la presente, los rangos de aplicación son generalmente de 0,1 g a 10 kg del a. i. (o de la mezcla de a. i. o de la formulación) por 100 kg de semilla, preferentemente de 1 g a 5 kg por 100 kg de semilla, en particular de 1 g a 2.5 kg por 100 kg de semilla. Para cultivos específicos tales como la lechuga, el valor puede ser mayor.

Cualquier formulación herbicida aplicada a las plantas de Brassica de la presente invención se puede preparar como composición "de mezcla en tanque" . En las modalidades, cada ingrediente o una combinación de ingredientes se pueden almacenar por separado entre sí. Los ingredientes luego se pueden mezclar entre sí antes de la aplicación. Generalmente, el mezclado ocurre poco antes de la aplicación. En un proceso de mezclado en tanque, cada ingrediente, antes del mezclado, generalmente está presente en agua o en un solvente orgánico adecuado. Los métodos y pautas para la preparación de las formulaciones son conocidos en la técnica.

Los métodos también permiten el desarrollo de combinaciones de herbicida para usar con las plantas de Brassica de la presente invención. En los métodos, se evalúan las condiciones ambientales en una zona de cultivo. Las condiciones ambientales que se pueden evaluar incluyen sin limitaciones, problemas de contaminación de agua en profundidad y en superficie, uso pretendido del cultivo, tolerancia del cultivo, residuos del suelo, malezas presentes en la zona de cultivo, textura del suelo, pH del suelo, cantidad de materia orgánica en el suelo, equipo de aplicación, y prácticas de trilla. Luego de la evaluación de las condiciones ambientales, se puede aplicar una cantidad efectiva de un combinación de herbicidas al cultivo, la parte del cultivo, la semilla del cultivo o la zona de cultivo.

En algunas modalidades, el herbicida aplicado a las plantas de Brassica de la presente invención sirve para prevenir el inicio del crecimiento de las malezas susceptibles o plantas indeseables y/o sirve para causar daño a las malezas o plantas indeseables que crecen en el área de interés. En algunas modalidades, el herbicida o la mezcla de herbicidas ejerce estos efectos sobre las malezas o plantas indeseables que afectan los cultivos que luego se plantan en el área de interés (es decir, el campo o área de cultivo) . En los métodos, la aplicación de la combinación de herbicidas no necesariamente debe hacerse al mismo tiempo. Siempre que el campo en el cual se planta el cultivo contenga cantidades detectables del primer herbicida y que el segundo herbicida se aplique en cierto tiempo durante el periodo en el cual el cultivo está en el área de cultivo, se considera que el cultivo fue tratado con una mezcla de herbicidas de acuerdo con la invención. En consecuencia, los métodos provistos abarcan aplicaciones de herbicida que son "preemergentes" , "posemergentes" , "incorporación previa a la siembra" y/o que incluyen el tratamiento de las semillas antes de la siembra.

Además, se proveen métodos para recubrir las semillas de Brassica de la presente invención. Los métodos comprenden recubrir una semilla con una cantidad efectiva de un herbicida o una combinación de herbicidas (tal como se describe en otra parte de la presente) . Las semillas luego se pueden sembrar en un área de cultivo. También se proveen semillas de Brassica que tienen una cubierta que comprende una cantidad efectiva de un herbicida o una combinación de herbicidas (tal como se describe en otra parte de la presente) .

"Preemergente" se refiere a un herbicida que se aplica a un área de interés (por ejemplo, un campo o área de cultivo) antes de la emergencia visible del suelo y/o antes de la germinación de la semilla. "Posemergente" se refiere a un herbicida que se aplica a un área después de la emergencia visible de una planta del suelo. En algunos casos, los términos "preemergente" y "posemergente" se usan con referencia a una maleza o planta indeseable en un área de interés, y en algunos casos se usan estos términos con referencia a una planta de cultivo en un área de interés. Cuando se usa en referencia a una maleza o planta no deseada, estos términos se pueden aplicar a sólo un tipo particular de maleza o especies de maleza o una planta indeseable que está presente o se cree que está presente en el área de interés. Mientras que se puede aplicar cualquier herbicida en un tratamiento preemergente y/o posemergente, es sabido que algunos herbicidas son más efectivos para el control de maleza o malezas o plantas indeseables cuando se aplicar en preemergencia o posemergencia. Por ejemplo, rimsulfurona tiene actividad preemergencia y posemergencia, mientras que otros herbicidas tienen predominatemente actividad preemergencia (metolaclor) o posemergencia (glifosato) . Estas propiedades de herbicidas particulares son conocidas en la técnica y son determinados fácilmente por los expertos en la técnica. Además, los expertos en la técnica pueden seleccionar rápidamente los herbicidas seleccionados y los tiempos de aplicación para el uso con las plantas transgénicas de la invención y/o en las áreas en las cuales se desea plantar las plantas transgénicas de la invención. Las "incorporación presiembra" implica la incorporación de compuestos en el suelo antes de la siembra.

En consecuencia, se proveen métodos mejorados de cultivo de un cultivo y/o del control de malezas o plantas indeseables tales como, por ejemplo, "quema presiembra" en la cual una zona se trata con uno o más herbicidas antes de plantar el cultivo de interés a fin de lograr un mejor control de malezas o plantas indeseables. También se proveen métodos para el cultivo de un cultivo y/o para el control de malezas o plantas indeseables que son "no arables" o "poco arables" (también referidas como de "arado reducido") . en los métodos, el suelo no está cultivado o se cultiva con menor frecuencia durante el ciclo de crecimiento en comparación con los métodos tradicionales; estos métodos pueden ahorrar costos en los cuales se habría incurrido de otro modo debido al cultivo adicional, incluso los costos de trabajo y combustible.

Los métodos comprenden el uso de aplicaciones simultáneas y/o aplicaciones secuenciales de múltiples clases de herbicidas. En algunas modalidades, los métodos incluyen el tratamiento de una planta de la invención y/o un área de interés (por ejemplo, un campo o área de cultivo) y/o maleza y/o planta indeseada con sólo un herbicida u otro agente químico tal como, por ejemplo, un herbicida de imidazolinona .

El tiempo en el que se aplica un herbicida a una superficie de interés (y cualquier planta de allí) puede ser importante en la optimización del control de la maleza o la planta indeseada. El tiempo en el que se aplica un herbicida se puede determinar con referencia al tamaño de las plantas y/o el estadio de crecimiento y/o desarrollo de plantas en el área de interés, por ejemplo, plantas de cultivo o malezas o plantas no deseadas que crecen en el área. Los estadios de crecimiento y/o desarrollo de las plantas se conocen en el arte. Así, por ejemplo, el tiempo en el que un herbicida u otro agente químico se aplica a un área de interés en la que las plantas crecen puede ser el tiempo en el que algunas o todas las plantas en un . área particular alcanzaron al menos un tamaño particular y/o estadio de crecimiento y/o desarrollo, o el tiempo en el que algunas o todas las plantas en un área particular todavía no alcanzaron un tamaño particular y/o estadio de crecimiento y/o desarrollo.

En algunas modalidades, las plantas de Brassica de la presente invención muestran una mayor tolerancia a los tratamientos con herbicidas de posemergencia. Por ejemplo, las plantas de Brassica de la presente invención pueden ser tolerantes a mayores dosis de herbicida, tolerantes a un rango más amplio de herbicidas (es decir, tolerancia a más químicas inhibidoras de AHAS) , y/o pueden ser tolerantes a dosis de herbicidas aplicadas en momentos anteriores o posteriores de desarrollo en comparación con una planta de control apropiada.

Diferentes productos químicos tales como herbicidas tienen diferentes efectos "residuales", es decir, diferentes cantidades de tiempo para las cuales el tratamiento con el producto químico o el herbicida continúa teniendo un efecto sobre plantas que crecen en el área tratada. Estos efectos pueden ser deseables o indeseables, según la finalidad futura deseada del área tratada (por ejemplo, campo o área de cultivo) . Así, se puede seleccionar un esquema de rotación de cultivos en base a los efectos residuales de tratamientos que se usarán para cada cultivo y su efecto sobre el cultivo que crecerá posteriormente en la misma área. Un experto en el arte es familiar con técnicas que se pueden usar para evaluar el efecto residual de un herbicida; por ejemplo, los herbicidas que actúan inhibiendo AHAS varían en sus niveles de actividad residual. Las actividades residuales para diversos herbicidas se conocen en el arte y también se conocen por variar con diversos factores ambientales tales como, por ejemplo, niveles de humedad del suelo, temperatura, pH y composición del suelo (textura y materia orgánica) . Las plantas de Brassica de la presente invención se usan en particular en métodos de crecimiento de un cultivo donde es beneficiosa la mayor tolerancia a la actividad residual de un herbicida .

Además, las plantas de Brassica de la presente invención proveen una mayor tolerancia al tratamiento con productos químicos adicionales usados en cultivos en combinación con tratamientos con herbicidas, tales como safeners, adyuvantes como sulfonato de amonio y concentrado de aceite de cultivo, y similares.

Además, los métodos revelados pueden comprender el uso de un herbicida inhibidor de AHAS o una mezcla de herbicidas, así como uno o varios otros insecticidas, fungicidas, nematicidas, bactericidas, acaricidas, reguladores del crecimiento, quimioesterilizantes , semioquímicos , repelentes, atractores, feromonas, estimulantes de la alimentación u otros compuestos biológicamente activos o bacterias, virus u hongos entomopatógenos para formar una mezcla de múltiples componentes para dar un espectro aún mayor de protección agrícola. Los ejemplos de tales protectores agrícolas que se pueden usar en métodos incluyen: insecticidas tales como abamectina, acefato, acetamiprid, amidoflumet (S-1955) , avermectina, azadiractina, azinfos-metilo, bifentrina, bifenazato, buprofezina, carbofurano, cartap, clorfenapir, clorfluazurona, clorpirifos, clorpirifos-metilo, cromafenozida, clotianidina, ciflumetofeno, ciflutrina, beta-ciflutrina, cihalotrina, lambda-cihalotrina, cipermetrina, ciromazina, deltametrina , diafentiurona , diazinona, dieldrina, diflubenzurona, dimeflutrina, dimetoato, dinotefurano, diofenolano, emamectina, endosulfano, esfenvalerato, etiprol, fenotiocarb, fenoxicarb, fenpropatrina, fenvalerato, fipronilo, flonicamida, flubendiamida , flucitrinato, tau-fluvalinato, flufenerim (UR-50701), flufenoxurona , fonofos, halofenozida, hexaflumurona, hidrametilnona, imidacloprida, indoxacarb, isofenfos, lufenurona, malationa, metaflumizona, metaldehído, metamidofos, metidationa, metomilo, metopreno, metoxicloro, metoflutrina , monocrotofos , metoxifenozida, nitenpiram, nitiazina, novalurona, noviflumurona (XDE-007) , oxamilo, parationa, parationa-metilo, permetrina, forato, fosalona, fosmet, fosfamidona, pirimicarb, profenofos, proflutrina, piraetrozina, pirafluprol, piretrina, piridalilo, piriprol, piriproxifeno, rotenona, rianodina, espinosad, espirodiclofeno, espiromesifeno (BSN 2060) , espirotetramato, sulprofos, tebufenozida, teflubenzurona, teflutrina, terbufos, tetraclorvinfos , tiacloprida, tiametoxam, tiodicarb, tiosultap-sodio, tralometrina, triazamato, triclorfona y triflumurona ; fungicidas tales como acibenzolar, aldimorf, amisulbromo , azaconazol, azoxistrobina, benalaxilo, benomilo, bentiavalicarb, bentiavalicarb-isopropilo, binomial, bifenilo, bitertanol, blasticidina-S , mezcla de Bordeaux (sulfato de cobre tribásico), boscalida/nicobifeno, bromuconazol , bupirimato, butiobato, carboxina, carpropamida, captafol, captano, carbendazim, cloroneb, clorotalonilo, clozolinato, clotrimazol, oxicloruro de cobre, sales de cobre tales como sulfato de cobre e hidróxido de cobre, ciazofamida, ciflunamida, . cimoxanilo, ciproconazol , ciprodinilo, diclofluanida, diclocimet, diclomezina, diclorano, dietofencarb, difenoconazol , dimetomorf, dimoxiestrobina, diniconazol, diniconazol-M, dinocap, discostrobina, ditianona, dodemorf, dodina, econazol, etaconazol, edifenfos, epoxiconazol , etaboxam, etirimol, etridiazol, famoxadona, fenamidona, fenarimol, fenbuconazol , fencaramida, fenfuram, fenhexamida, fenoxanilo, fenpiclonilo, fenpropidina, fenpropimorf , acetato de fentina, hidróxido de fentina, ferbam, ferfurazoato, ferimzona, fluazinam, fludioxonilo, flumetover, fluopicolida, fluoxastrobina, fluquinconazol , fluquinconazol , flusilazol, flusulfamida, flutolanilo, flutriafol, folpet, fosetil-aluminio, fuberidazol, furalaxilo, furametapir, hexaconazol, himexazol, guazatina, imazalilo, imibenconazol , iminoctadina, iodicarb, ipconazol, iprobenfos, iprodiona, iprovalicarb, isoconazol, isoprotiolano, casugamicina, cresoxim-metilo, mancozeb, mandipropamida, maneb, mapanipirina, mefenoxam, mepronilo, metalaxilo, metconazol, metasulfocarb, metiram, metominostrobina/fenominostrobina, mepanipirim, metrafenona, miconazol, miclobutanilo, neo-asozina (metanarsonato férrico), nuarimol, octilinona, ofurace, orisastrobina, oxadixilo, ácido oxolínico, oxpoconazol, oxicarboxina , paclobutrazol , penconazol, pencicurona, pentiopirad, perfurazoato, ácido fosfónico, ftalida, picobenzamida, picoxistrobina, polioxina, probenazol, procloraz, procimidona, propamocarb, clorhidrato de propamocarb, propiconazol , propineb, proquinazida, protioconazol , piraclostrobina, priazofos, pirifenox, pirimetanilo, pirifenox, pirolnitrina, piroquilona, quinconazol, quinoxifeno, quintoceno, siltiofam, simeconazol, espiroxamina , estreptomicina, azufre, tebúconazol, tecraceno, tecloftalam, tecnaceno, tetraconazol , tiabendazol, tifluzamida, tiofanato, tiofanato-metilo, tiram, tiadinilo, tolclofos-metilo, tolufluanida, triadimefona, triadimenol, triarimol, triazóxido, tridemorf, triraopramida triciclazol, trifloxistrobina, triforina, triticonazol , uniconazol, validamicina, vinclozolina, zineb, ziram y zoxamida; nematicidas tales como aldicarb, oxamilo y fenamifos; bactericidas tales como estreptomicina; acaricidas tales como amitraz, quinometionato, clorobencilato, cihexatina, dicofol, dienocloro, etoxazol, fenazaquina, óxido de fenbutatina, fenpropatrina, fenpiroximato, hexitiazox, propargita, piridabeno y tebufenpirad; y agentes biológicos que incluyen bacterias entomopatógenas tales como Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki, y las delta-endotoxinas encapsuladas de Bacillus thuringiensis (por ejemplo, Cellcap, MPV, MPVII) ; hongos entomopatógenos tales como hongo verde de muscardina; y virus entomopatógenos que incluyen baculovirus, virus nucleopolihedro (NPV) tales como HzNPV, Af PV; y virus de granulosis (GV) tal como CpGV. Las relaciones en peso de estos diversos pares de mezcla a otras composiciones (por ejemplo, herbicidas) usadas en los métodos típicamente son de entre 100:1 y 1:100, o de entre 30:1 y 1:30, de entre 10:1 y 1:10 o de entre 4:1 y 1:4.

También se proveen composiciones que comprenden una cantidad biológicamente efectiva de un herbicida inhibidor de AHAS de interés o una mezcla de herbicidas y una cantidad efectiva de al menos un compuesto o agente adicional biológicamente activo y también pueden comprender al menos uno de un tensioactivo, un diluyente sólido o un diluyente líquido. Los ejemplos de tales compuestos o agentes biológicamente activos son: insecticidas tales como abamectina, acefato, acetamiprida, amidoflumet (S-1955) , avermectina, azadiractina , azinfos-metilo, bifentrina, binfenazato, buprofezina, carbofurano, clorfenapir, clorfluazurona, clorpirifos, clorpirifos-metilo, cromafenozida, clotianidina , ciflutrina, beta-ciflutrina, cihalotrina, lambda-cihalotrina, cipermetrina, ciromazina, deltametrina , diafentiurona, diazinona, diflubenzurona, dimetoato, diofenolano, emamectina, endosulfano, esfenvalerato, etiprol, fenoticarb, fenoxicarb, fenpropatrina, fenvalerato, fipronilo, flonicamida, flucitrinato, tau-fluvalinato, flufenerim (UR-50701) , flufenoxurona, fonofos, halofenozida, hexaflumurona, imidacloprida , indoxacarb, isofenfos, lufenurona, malationa, metaldehído, metamidofos , metidationa, metomilo, metopreno, metoxicloro, monocrotofos , metoxifenozida, nitiazina, novalurona, noviflumurona (XDE-007) , oxamilo, parationa, parationa-metilo, permetrina, forato, fosalona, fosmet, fosfamidona, pirimicarb, profenofos, pimetrozina, piridalilo, piriproxifeno, rotenona, espinosad, espiromesifina (BSN 2060), sulprofos, tebufenozida, teflubenzurona, teflutrina, terbufos, tetraclorvinfos , tiacloprida, tiametoxam, tiodicarb, tiosultap-sodio, tralometrina, triclorfona y triflumurona; fungicidas tales como acibenzolar, azoxistrobina, benomilo, blasticidina-S , mezcla de Bordeaux (sulfato de cobre tribásico), bromuconazol , carpropamida, captafol, captano, carbendazim, cloroneb, clorotalonilo, oxicloruro de cobre, sales de cobre, ciflufenamida , cimoxanilo, ciproconazol , ciprodinilo, (S) -3 , 5 -dicloro-N- (3-cloro-l-etil-l-metil-2-oxopropil) -4 -metilobenzamida (RH 7281) , diclocimet (S-2900) , diclomezina, diclorano, difenoconazol , (S) -3 , 5-dihidro-5-metil-2- (metiltio) -5-fenil-3- (fenil-amino) -4H-imidazol-4-ona (RP 407213), dimetomorf, dimoxistrobina, diniconazol, diniconazol-M, dodina, edifenfos, epoxiconazol , famoxadona, fenamidona, fenarimol, fenbuconazol , fencaramida (SZX0722), fenpiclonilo, fenpropidina , fenpropimorf , acetato de fentina, hidróxido de fentina, fluazinam, fludioxonilo, flumetover (RPA 403397) , flumorf/flumorlina (SYP-L190) , fluoxastrobina (HEC 5725) , fluquinconazol , flusilazol, flutolanilo, flutriafol, folpet, fosetil-aluminio, furalaxilo, furametapir (S-82658) , hexaconazol, ipconazol, iprobenfos, iprodiona, isoprotiolano, casugamicina , cresoxima-metilo, mancozeb, maneb, mefenoxam, mepronilo, metalaxilo, metconazol, metomino-estrobina/fenominostrobina (SSF-126), metrafenona (AC375839) , miclobutanilo, neo-asozina (metanarsonato férrico) , nicobifeno (BAS 510), orisastrobina, oxadixilo, penconazol, pencicurona, probenazol, procloraz, propamocarb, propiconazol , proquinazida (DPX-KQ926) , protioconazol (JAU 6476) , pirifenox, piraclostrobina , pirimetanilo, piroquilona, quinoxifeno, espiroxamina , azufre, tebuconazol, tetraconazol , tiabendazol, tifluzamida, tiofanato-metilo, tiram, tiadinilo, triadimefona , triadimenol, triciclazol, trifloxistrobina, triticonazol , validamicina y vinclozolina; nematicidas tales como aldicarb, oxamilo y fenamifos; bactericidas tales como estreptomicina; acaricidas tales como amitraz, quinometionato, clorobencilato, cihexatina, dicofol, dienocloro, etoxazol, fenazaquina, óxido de fenbutatina, fenpropatrina , fenpiroximato, hexitiazox, propargita, piridabeno y tebufenpirad; y agentes biológicos que incluyen bacterias entomopatógenas tales como Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai, Bacillus thuringiensis subsp . Kurstaki, y las delta-endotoxinas encapsuladas de Bacillus thuringiensis (por ejemplo, Cellcap, MPV, PVII) ; hongos entomopatógenos tales como hongo verde de muscardina; y virus entomopatógenos que incluyen baculovirus, virus nucleopolihedro (NPV) tales como HzNPV, AfNPV; y virus de granulosis (GV) tal como CpGV. Los métodos también pueden comprender el uso de plantas genéticamente transformadas para expresar proteínas tóxicas en plagas de invertebrados (tales como delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis) . En tales modalidades, el efecto de compuestos de control de plagas de invertebrados aplicados de modo exógeno puede ser sinérgico con las proteínas de toxinas expresadas .

Así, los métodos pueden emplear un herbicida inhibidor de AHAS o una combinación de herbicidas inhibidores de AHAS y también pueden comprender el uso de insecticidas y/o fungicidas, y/u otros productos químicos agrícolas tales como fertilizantes. El uso de tales tratamientos combinados puede ampliar el espectro de actividad contra especies de malezas adicionales y suprimir la proliferación de cualquier biotipo resistente.

La presente invención provee un método para combatir vegetación indeseada o controlar malezas que comprende poner en contacto las semillas de las plantas resistentes de acuerdo con la presente invención antes de la siembra y/o antes de la pregerminación con un herbicida que inhibe la AHAS. El método puede comprender además sembrar las semillas, por ejemplo, en el suelo en un campo o en un medio de maceta en un invernadero. El método se usa particularmente para combatir la vegetación indeseada o controlar las malezas en la cercanía inmediata de la semilla .

Por control de la vegetación indeseada se entiende destruir las malezas y/o de otro modo retardar o inhibir el crecimiento normal de las malezas. Por malezas, en el sentido más amplio, se entienden todas aquellas plantas que crecen en lugares en donde son indeseadas.

Las malezas de la presente invención incluyen, por ejemplo, malezas dicotiledóneas y monocotiledóneas . Las malezas dicotiledóneas incluyen, pero no están limitadas a, malezas de los géneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthe is, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Zanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonu , Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Verónica, Abutilón, Emex, Datura, Viola, Galoepsis, Papaver, Centaurea, Trifoliu , Ranunculus, y Taraxacum. Las malezas monocotiledóneas incluyen, pero no están limitadas a, malezas de los géneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemeum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus y Apera .

Además, las malezas de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, plantas de cultivo que crecen en un lugar indeseado. Por ejemplo, una planta de maíz que se encuentran en un campo que comprende predominantemente plantas de soya puede ser considerada una maleza, si la planta de maíz es indeseada en el campo de las plantas de soya.

Los artículos "un", "uno" y "una" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo "un elemento" significa uno o más elementos .

Como se usa en la presente, la palabra "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo" se entiende que implica la inclusión de un elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos, mencionados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1 Preparación de secuencias mutantes de AHAS Antes de crear las secuencias mutantes, las secuencias codificadoras completas para AHAS I y III de Brassica napus fueron amplificadas usando BnALS3 (5'-CTAACCATGGCGGCGGCAAC) (SEQ ID NO : 1) y BnALSOR2 (5'-AGTCTGGGAACAAACCAAAAGCAGTACA) (SEQ ID NO: 2) y BnALSOR3 (5 ' -CGTCTGGGAACAACCAAAAGTAGTACAA) (SEQ ID NO: 3), respectivamente, clonadas y secuenciadas de las líneas BN-02 (Figuras 3 y 4) , línea 97 (BN-02 con el S653N en AHAS III, Figuras 3 y 3) y BN-11 para servir como secuencias de referencia para propósitos comparativos. 1A. Diseño de oligonucleótidos de reparación de genes (GRON) En base a la secuencia de ácidos nucleicos de AHAS III obtenida, se diseñaron una serie de oligonucleótidos de reparación de genes (GRONs, mostrados en la Tabla 1) para introducir específicamente una mutación de ácido nucleico en la región codificadora de AHAS que resulta en una sustitución de aminoácidos de alanina a treonina que corresponde a la posición 122 en la proteína de AHAS III codificada, en base a la numeración de aminoácidos para la AHAS de Arabidopsis . Los GRONs fueron diseñados para introducir un cambio de nucleótidos GCT a ACT en AHAS III. Sólo la secuencia de ácidos nucleicos AHAS III es direccionada para este cambio usando estas secuencias de GRON.

Tabla 1 Secuencias de GRON La base que se convierte se muestra en negrita. V = CY3; H = 3 ' DMT dC CPG .

IB. Descripción del trabajo de cultivo de células 1B.1 Experimentos de introducción de oligonucleótidos de reparación de genes (GRON) direccionados a la mutación A122T en el gen de AHAS III de la línea de ca óla de primavera 97 La línea de cañóla 97 se derivó de experimentos del Sistema de Desarrollo Rápido de Rasgos ("Rapid Trait Development System™") (Cibus LLC, San Diego, CA, nRTDSm") usando protoplastos de hojas de plántulas haploides derivadas de microesporas del cultivar de Brassica conocido como BN-02. La línea 97 contiene una mutación en una posición que corresponde a la posición del aminoácido 653 en la proteína de AHAS III. La mutación es codificada por el cambio de codón AGT a AAT y da por resultado una sustitución de serina a asparagina, que provee tolerancia a imazetapir. La adición de la mutación A122T en el mismo gen dio por resultado una tolerancia a Imi muy aumentada en comparación con la mutación individual .

Los experimentos RTDS™ se realizaron con el objeto de introducir la mutación adicinal en el gen de AHAS III de la Línea 97. La línea 97 fue regenerada de callos derivados de protoplastos que habían sido seleccionados con 0.5 y 0.2 µ? de Imi. La doble mutación A122T; S653N fue seleccionada a la concentración de 10 µ? de Imi. El protocolo que se usó para los experimentos se describe en las Secciones IB.2 -IB.6.

IB.2 Propagación de material para aislamiento de protoplastos de hojas Brotes haploides derivados de embriones derivados de microesporas fueron propagados bajo condiciones estériles in vitro. Se subcultivaron recortes cada 2 a 4 semanas y se cultivaron en discos de Petri (90 mm x 20 mm) que contenían un volumen de 40 - 45 mi de medio RS (Dovzhenko, A. , 2001) . Los discos se sellaron con cinta Micropore (3M Company) . Se extirparon hojas jóvenes y se usaron para aislamiento de protoplastos.

IB.3 Aislamiento de protoplastos y purificación Aproximadamente 600 mg de tejido de hoja de 2 a 3 semanas de brotes in vítro se cortaron en bandas angostas con un escalpelo en un disco de Petri con 5 mi de medio B (Pelletier et al., 1983), se ajustó el pH a 5.8. Después de 1 h, se reemplazó el medio B con 12 mi de una solución de enzima esterilizada por filtro, que consistía en medio B en donde se disolvieron 0.5% de Celulasa YC y 0.75% de Macerozyme RIO (ambos de Karlan Research Products, Cottonwood, Arizona) , 1 g/1 de albúmina de suero bovino, y 1 g/ de ácido 2-morfolinoetanosulfónico . La solución de enzima se infiltró al vacío, y posteriormente se incubó durante 16 a 18 hs a 25°C en la oscuridad. Se realizó la purificación de los protoplastos usando un gradiente de densidad de iodixanol . Después de la centrifugación del gradiente de densidad, la banda con protoplastos purificados se retiró junto aproximadamente 5 mi de medio 5. El rendimiento de protoplastos f e determinado usando un hemocitómetro y los protoplastos se almacenaron durante 2 hs a 4°C.

IB.4 Introducción de oligonucleotidos de reparación de genes (GRON) La suspensión de protoplastos se mezcló con un volumen igual de medio frío W5 , se transfirió a un tubo de centrifugadora de 50 mi y se centrifugó durante 10 min al menor ajuste de una centrifugadora clínica (aproximadamente 50 x g) . Se retiró el sobrenadante y se reemplazó con medio TM (Klaus, S. 2003) , ajustando la densidad de los protoplastos a 5 x 106/ml. Alícuotas de 500 µ? que contenían 2.5 x 106 protoplastos cada una fueron distribuidas en tubos de centrifugadora de 50 mi. El GRON (por ejemplo, BnALS1122/C/4l/5 ' Cy3/3 ' idC; ver Tabla 1) fue suministrado a los protoplastos mezclándolo con pol i et i 1 engl i col (PEG) y mezclándolo en un rotador sobre hielo. Aproximadamente 12 - 300 ig de GRON se usa por 500 µ? de volumen de tratamiento. Los protoplastos fueron recogidos luego usando centrifugación y se almacenaron durante la noche a 4°C en la oscuridad.

IB.5 Incorporación de los protoplastos en alginato de calcio Los protoplastos fueron incorporados luego en un gel (por ejemplo, agarosa, alginato) en base al método descrito en Dovzhenko (2001) . La incorporación de los protoplastos en substratos de gel demostró aumentar la supervivencia de los protoplastos y aumentar las frecuencias de división de las células derivadas de los protoplastos. Un día después del tratamiento con PEG-GRON, los protoplastos derivados de una muestra tratada fueron transferidos a un tubo de centrifugadora de 50 mi y se dejó alcanzar la temperatura ambiente. El tubo se centrifugó durante 10 min al ajuste más bajo (aproximadamente 50 x g) con una centrifugadora clínica. El pellet se volvió a suspender en 2,75 mi de medio B (concentración de cloruro de calcio dihidrato reducida a 131 mg/1) y se mezcló con 2.75 mi de una solución al 2.8% (p/v) de alginato de sodio en el mismo medio B reducido en calcio en un recipiente de reacción de 60 mi en forma de V. La suspensión de protoplastos-alginato se tomó con una pipeta multi-canal (usando puntas precortadas para proveer una abertura más ancha) y alícuotas de 40 µ? se vertieron de a gotas en 50 mi de medio Ca-A.

IB .6 Cultivo de protoplastos y selección de callos tolerantes a Ind.

Se seleccionaron callos tolerantes a imidazolinona usando subcultivos secuenciales de las perlas de alginato en medios similares a los descriptos por Pelletier et al. (1983) Mol. Gen. Genet. 191: 244-250 (ver Tabla 2). La selección comenzó una semana después del tratamiento con PEG/GRON a una concentración de 10 µ? de Imi . La adición de herbicida al medio de cultivo no tuvo un efecto inmediato. Inicialmente, todas las microcolonias que se formaron durante la fase de cultivo temprana sin imidazolinona continuaron creciendo, pero más lentamente que los controles sin herbicida agregado. Una a dos semanas después del comienzo de la selección, el crecimiento de la mayoría de las colonias se hizo más lento o se detuvo.

Células y microcolonias fueron liberadas del alginato tres semanas después de la incorporación de los protoplastos tratándolas durante 30 a 45 min con medio de cultivo que contenía 50 mM de citrato de sodio. Después de la liberación, la mayoría de las colonias estaban destruidas, o consistían en un centro verdoso, cubierto con capas exteriores de células muertas. Después de la transferencia a medio E de selección solidificado, la mayoría de los microcallos que aún contenían células vivas detuvieron el crecimiento y se volvieron amarronadas . El crecimiento limitado de callos individuales continuó, pero todos los callos no tolerantes eventualmente se tornaron marrones. Dos a tres semanas después de la transferencia a medio de selección solidificado (ocasionalmente más temprano) , aparecieron callos que crecían activamente entre un fondo de células y microcallos amarronados .

Tabla 2 Protocolo para la selección de callos tolerantes a imazetapir, comenzando con una muestra de 2,5 x 106 protoplastos tratados con PEG/GRON.

Día Paso -1 Hojas a solución de enzima. 0 Purificación de los protoplastos y tratamiento con PEG/GRON, durante la noche en medio B a 4°C. 1 Incorporación de protoplastos en alginato,- cultivo de aproximadamente 5 mi de 40 µ? de perlas en 20 mi de medio B en discos de Petri de 20 mm x 150 mm. 8 Reemplazar la mitad del medio líquido con medio C; agregar Imi a 10 µ?. 15 Reemplazar el medio líquido con medio C fresco que contiene Imi a 10 µ . 22 Liberar células del alginato; cultivo en medio C fresco que contiene Imi a 10 µ?. 29 Reemplazar el medio líquido con medio C fresco, que contiene Imi a 10 µ . 36 Transferir células/microcallos a medio E solidificado con agar, Imi 10 uM, en un disco de Petri de 145 x 20 mm. 50-57 Identificar los callos que crecen, transferir nuevamente a medio E solidificado con agar, Imi 10 µ?. 3 a 4 Identificar los callos que crecen para subcultivo y sem. análisis; descartar los callos que no crecen. más tarde IB.7 Regeneración de plantas a partir de callos tolerantes a Imi, derivados de protoplastos que contienen la doble mutación A122T; S653N en el gen de AHAS III Los callos tolerantes a Imi que se habían desarrollado en medio de selección solidificado y que se había confirmado que tenían la mutación objetivo (ver Ejemplo 1C, más abajo) se transfirieron a medio E libre de herbicida para acelerar el desarrollo. Líneas de callos individuales variaron en sus valores de crecimiento y morfologías . En general, el desarrollo hacia la regeneración de brotes sigue los pasos de: Callo verde, no diferenciado -> callo con áreas verde oscuro -> desarrollo de raíces -> desarrollo de inicios de brotes -> desarrollo de brotes con hojas hiperhídricas (vitrificadas) .

El desarrollo de una línea de callo individual era variable, pero a través del subcultivo continuo y multiplicación en medio E o modificaciones del medio E con menores concentraciones de NAA aumentaron las posibilidades de obtener eventos de formación de brotes.

Una vez que se formaron los brotes en medio E y se formaron tres a cuatro hojas, fueron transferidos a medio RS (Dovzhenko, 2001) . En este medio, se desarrollaron en el tiempo brotes formados recientemente y tejido de hojas que era morfológicamente "normal" (es decir, no hiperhídrico) .

Subsiguientemente, se usaron protocolos estándar para endurecer las plántulas y para la transferencia al invernadero . 1C. Rastreo molecular ADN genómico de callos que mostraron tolerancia a imazetapir fue rastreado con respecto a la presencia de la mutación A122T introducida. Se extrajo ADN genómico usando el procedimiento de Edwards et al. (1991) Nucleic Acids Research 19(6): 1349. Como ARAS I y III no contienen intrones, era posible PCR a partir de ADN genómico. Se usaron cebadores específicos de genes (GS) BnALS3 (5'-CTAACCATGGCGGCGGCAAC) (SEQ ID NO: 1) y BnALS9 (5'-CCCATCAACGTACTCGCACCA) (SEQ ID NO: 6) para amplificar la región que contenía la posición A122 en AHAS III. Después de purificación del amplicón resultante y cuantificación, se usó el amplicón resultante como molde para una reacción de PCR específica de alelos (AS) . Se usó una mezcla de tres cebadores (BnALSOF5 ( 5 ' -GTCAATGTCGCACCTGAAAAACCGACA) (SEQ ID NO: 7), BnALSOR8 ( 5 '-GCTAACCCGCTGACGAGGTTGGTAGCT) (SEQ ID NO: 8) y BnALSIR2A ( 5 ' -AAGGCTTGGTGGATCTCCATGGACGT) (SEQ ID NO : 9) - Master-mix 40) para detectar la presencia de la mutación A122T. El cebador interior (BnALSlR2A) fue designado de tal modo que sólo se reasociará y formará un producto, apareándose con BnALSOF5 si está presente el codón ACT (treonina) .

La PCR específica de genes se repitió para todos los callos que mostraban el cambio A122T, usando el mismo molde de ADN genómico que se usó en el rastreo de AS-PCR. Esta vez el amplicón fue purificado en gel de una gel de 1% Tris-acetato EDTA y secuenciado sobre la región A122, para confirmar el cambio. Después de la confirmación, se preparó una muestra de ADN genómico independiente del tejido de callos y la región A122 se secuenció otra vez.

Una vez que se confirmaron dos muestras independientes de una línea de callos dada con respecto a la presencia de la mutación A122T, se secuenciaron los genes AHAS I y III en su totalidad para chequear con respecto a cualesquiera otros polimorfismos de nucleótidos solos (SNPs) no previstos. Los genes de longitud completa fueron amplificados usando BnALS3 (5' -CTAACCATGGCGGCGGCAAC) (SEQ ID NO: 1) con BnALS0R2 (5' -AGTCTGGGAACAAACCAAAAGCAGTACA) (SEQ ID NO: 2) (para el gen III) y BnALSOFG (5' -0T?0? 3???0?????????????????) (SEQ ID NO:. 3) (para el gen I) y se clonaron en TopoPCR2.1 (Invitrogen) . Cuatro clones de cada gen fueron secuenciados para distinguir error de PCR de los SNPs genuinos.

El ADN genómico se extrajo usando una máquina Bio-sprint (Qiagen) de tejido de planta regenerado de los callos rastreados y se rastreó nuevamente para confirmar la presencia de las mutaciones. Se realizó una PCR específica de genes (GS-PCR) usando cebadores para amplificar las regiones que contenían las secuencias de A122T (BnALS3 (5' -CTAACCATGC<X3CGGCAAC) (SEQ ID NO: 1) y BnALS9 (5'- CCCATCAACGTACTCGCACCA) (SEQ ID NO: 6) y de S653N (BnALSlO (5'-GAGGCrTTOGCTAGCAGGGCrCAA) (SEQ ID NO: 10) y BnALS0R2 (5'-AGTCrGGGAACAAACCAAAAGCAGTACA) ) (SEQ ID NO: 2) con las plantas de base de la línea 97, en el gen III, para, confirmar su presencia.

Se identificaron un total de 18 líneas de callos en donde se confirmó la presencia de la mutación A122T y la mutación S653N por secuenciación del gen de AHAS III. Doce de estas líneas de callos regeneraron brotes. Excepto una línea, las líneas de mutantes dobles eran homocigotas (es decir, haploides o diploides homocigotas) para las dos mutaciones A122T y S653N en AHAS III . La línea más avanzada, BnCL131Al, produjo varios gramos de semillas. El rendimiento por planta era comparable al de la planta diploide, lo que significa que en algún punto durante la selección/regeneración ocurrió la diploidización espontánea. Se usó polen de esta línea para fertilizar ovarios de dos cultivares de colza de semillas oleaginosas de invierno (WOSR) , BN-11 y Bn-19. Además, semillas de la línea BnCL131Al fueron depositadas en ATCC como Número de acceso PTA-9279. Dos líneas adicionales, BnCL140B3 y Bnl40C7, ambas conteniendo la molécula de ácido nucleico de AHAS mutagenizada que codifica las mutaciones A122T y S653N en AHAS III también fueron depositadas como Nros. de acceso: PTA-9402 y PIA-9403, respectivamente.

Otra línea de Brassica que contenía sólo la mutación A122T en la secuencia de AHAS III también fue identificada. Semillas de esta línea, BnCL120C7, también fueron depositadas en ATCC como N. ° de acceso PTA-9278.

Ejarpio 2 Actividad enzimática AHAS de extractos de plantas de B. ziapua y plantas enteras Plantas para las líneas B 02 (tipo salvaje) PM1/FM2 (dos genes imitantes, ver, por ejemplo, patente U.S. N.° 7.355.098), BnCL131Al (AHAS III A122T S653 mutante doble) y BnCL120C7 (AHAS III A122T mutante simple) fueron cultivadas de semillas hasta el estadio de 3 a 4 hojas antes de ser cosechadas. Se ensayaron extractos de células por triplicado con respecto a la actividad de AHAS de acuerdo con Singh et al. (1988, Assay of Acetohydroxiacid Synthase. Analytical Biochemistry, 171, 173-179) en ausencia o presencia de 8 diluciones seriadas de imazamox que oscilaban entre 100-0.78 uM. La actividad se expresó como el porcentaje de actividad (no imazamox) no inhibida (Figura 1) . El gráfico mostrado en la Figura 1 ilustra los resultados no inhibidos en porcentaje promedio para cada concentración de imazamox de tres fechas de plantación, cada una con 2 a 3 réplicas para un total de 7 ensayos extractivos independientes. Las barras de error representan ± dos errores estándar de la media.

Además, las plantas de B. napus (estadio de 3-4 hojas) que contenían la doble tnutante fueron analizadas con respecto a la respuesta al tratamiento con imazamox en comparación con las plantas de tipo salvaje. Las líneas BN02 (tipo salvaje) y BnCL131AL (AHAS III A122T:S653N, doble mutante) fueron tratadas con o bien 210 g ai/ha de imazamox suplementados con 0.5% v/v de Merge por aspersor foliar o se dejaran sin rociar como controles. Las plantas tratadas fueron evaluadas tres (3) semanas después del tratamiento, y los resultados se presentan en la Figura 2. La Figura 2 provee los resultados para plantas BN02 (fila superior) y BnCL131Al (fila inferior) . Como se puede ver en la Figura 2, las plantas BN-02 de tipo salvaje eran casi no tolerantes de los 210 g ai/ha de aplicación de imazamox, mientras que la línea BnCL131Al era casi completamente tolerante a tal aplicación.

Las plantas de B. napus que contenían la doble mutante también fueron testeadas con respecto a lesiones en las plantas debido a la aplicación del herbicida imidazolinona . Las plantas de B. napus para las líneas BN02 (tipo salvaje) , BnCL131Al (AHAS III A122T:S653N doble mutante) , BnCL120C7 (AHAS III A122T mutante simple) , BnCL97 (AHAS III S653N mutante simple) PM1/PM2 (control de dos genes comercial) fueron cultivadas de semillas hasta el estadio de 3-4 hojas, luego se dejaron sin rociar o se rociaron con 35, 70 o 210 g ai/ha de imazamox suplementados con 0.5% v/v de Merge . Se valuaron las lesiones por herbicidas 2 semanas después del tratamiento (DAT) en 8-24 plantas por línea usando una escala de 0 a 9 en donde 0 es sin lesiones y 9 es una planta muerta. Los resultados se presentan como lesión media ± un error estándar de la media en la Tabla 3 más abajo. Los resultados presentados cubren dos plantaciones independientes y aspersores para todas las líneas excepto BnCL97. La tabla también presenta valores para + un error estándar de la media.

Tabla 3 Dosis de aspersor [g ai/ha] Línea 0 35 70 210 BN-02 (tipo A 0.06 ± 9.00 ± 9.00 ± 9.00 ± salvaje) 0.06 0.00 0.00 0.00 BnCL131Al B 0.00 ± 0.76 ± 2.53 ± 3.22 ± (BnAHAS III 0.00 0.33 0.24 0.33 A122T:S653) BnCL120C7 C 0.17 ± 4.19 ± 5.43 ± 6.65 ± (BnAHAS III 0.08 0.39 0.24 0.30 A122T) BnCL97 D 0.17 ± 4.08 ± 8.58 ± 8.00 ± (BnAHAS III 0.11 0.15 0.15 0.23 S653N) PM1/PM2 E 0.07 ± 1.21 ± 4.13 ± 4.93 ± 0.07 0.33 0.36 0.53 PM2 F 0.30 ± 1.81 ± 4.14 ± 6.17 + (BnAHAS III 0.15 0.25 0.23 0.22 W574L) PM1 (BnAHAS G 0.11 ± 7.22 ± 8.61 ± 9.00 ± I S653N) 0.07 0.18 0.12 0.00 Ejemplo 3; Evaluación de lesiones por herbicida para plantas de Brassica napus tratadas con Imazamox Evaluación de lesiones por herbicida para plantas de Brassica napus tratadas con Imazamox. Plantas para las líneas BN02 (tipo salvaje) , dos líneas de BnCL131Al (AHAS III A122T S653N doble mutante; BnCL131Al .0 y BnCL131Al .18 ) , PM1/PM2 (control de dos genes comercial: AHAS I S653N y AHAS III W574L) se cultivaron de semillas hasta el estadio de 3-4 hojas, luego o bien se dejaron sin rociar o se rociaron con 35, 70 o 210 g ai/ha de imazamox suplementados con 0,5% v/v de Merge . Se evaluaron las lesiones por herbicida 2 semanas después de aplicar el aspersor en 12 plantas por línea. Los resultados se presentan como lesión media ± un error estándar de la media en la Tabla 4 más abajo. Los resultados cubren una plantación y aspersor para todas las líneas y también se proveen los valores para ± dos errores estándar de la media.

Tabla 4 Ejemplo 4 Evaluación de lesiones por herbicida de Imazamox de plantas de Brassica napus testeadas en el campo Plantas de B . napus de las siguientes líneas de semillas oleaginosas de primavera: BN-02 (tipo salvaje) , BN-T (tipo salvaje) , BnCL131Al en un genotipo de base BN-02 (AHAS III A122T S653N doble mutante) , BnCL120C7 en un genotipo de base BN-02 ( BnAHAS III A122T) , BnCL97 en un genotipo de base BN-02 ( BnAHAS III S653N) , PM1/PM2 en una bse BN-T (control de dos genes: AHAS I S653N y AHAS III W574L) , PM1 en una base BN-T (control de un gen: AHAS I 653N) y PM2 en una base de BN-T (control de un gen: AHAS III W574L) fueron testeados en campo en un sitio cerca de Minot, North Dakota. Las líneas se plantaron en lotes de filas simples de 5 m de largo y se ordenaron en un diseño de lote dividido de dos factores con 3 repeticiones y 4 tratamientos (0 g ai/ha de imazamox, 50 g ai/ha de imazamox, 100 g ai/ha de imazamox y 200 g ai/ha de imazamox) . Las plantas se rociaron en el estadio de 2-4 hojas con los tratamientos de imazamox arriba mencionados. El producto imazamos (Beyond 120 g/1 LC + 0,25% (v/v) de tensioactivo no iónico) se diluyó en 20 galones por acre (o 200 litros/ha) y se aplicó usando una viga montada en un tractor.

Se evaluaron las lesiones por herbicida 15 días después del tratamiento (DAT) sobre una base por lote usando una escala de 0 a 100%, en donde 0 significaba sin lesiones y 100% significaba muerte de la planta. Las evaluaciones de las lesiones se analizaron estadísticamente usando un ANOVA y los resultados se presentan en la Tabla 6.

La línea de doble mutante, BnCL131Al (BN-02) (AHAS III A122T, S653N) , demostró una tolerancia a herbicida mucho mayor que la suma de las líneas mutantes individuales BnCL97 (BN-02) (AHASIII S653N) y BNCL120C7 (BN-02) (AHASIII A122T) . La cantidad de tolerancia demostrada por la línea de doble mutante (A122T + S653N) a 200 g ai/ha de imazamox es 62% (100%-38% de lesiones en el cultivo) . La cantidad de tolerancia demostrada por la mutante simple A122T a 200 g ai/ha es de 20% (100%-80% de lesiones en el cultivo) . La cantidad de tolerancia demostrada por la mutante simple S653N a 200 g al/ha es del 17% (100%-83% de lesiones en el cultivo) . Si la tolerancia fuera aditiva, entonces la tolerancia esperada de combinar la mutación A122T junto con la mutación S653N sería de 37%. En cambio, la tolerancia observada en la línea de doble mutante era 62%. El nivel de tolerancia al herbicida observado en la línea de doble mutante, BNCL131A1 (BN-02) es por lo tanto sinérgica con la observada en las dos líneas mutantes simples, BNCL97 (BN-02) y BNCL120C7 (BN-02) .

Ejemplo 5 Plantas de Brassica que contienen rasgos apilados de AHAS y calificaciones de daño por herbicida imazamox Se obtuvieron plantas de Brassica napus que contienen moléculas de ácido nucleico inhibidor de AHAS apilado por metodologías de cultivo convencionales, por cruzamiento de una línea resistente a inhibidor de AHAS homocigoto para CLB-1 (AHASL1A-A122 (At)T-S653 (At)N) con una línea resistente a inhibidor de AHAS homocigoto para AHASL1A-VI574 (At ) L (PM2) + AHASL1C- S653 (At)N (PM1) .

Se produjeron híbridos cruzados manualmente en el invernadero entre dos línea progenitoras de Brassica napus de primavera tolerantes a IMI : "BnCL131Al" (homocigoto para la mutación tolerante a IMI de genoma A AHASL1A-Al 22 ( t ) T - S653 (A ) N ) y "PM1PM2" (homocigoto para la mutación tolerante a inhibidor de AHAS de genoma A AHASL1A- 574 (At ) L (PM2) más la mutación tolerante a inhibidor de AHAS de genoma C AHASL1C- S653(At)N (PM1)) . La línea de híbrido de cruzamiento manual heteroc igoto , " PM1 PM2 /BnCLl 31A1 " ( het erozygous para las mutaciones apiladas: AHASL1A-Al 22 ( A ) T - S 653 ( ) N , AHASL1A- W574(At)L (PM2), AHASL1C- S653(At)N (PM1)) se analizó en campo junto con líneas que contenían sólo una mutación tolerante a inhibidor de AHAS (homocigoto o hete roe igoto ) y varios controles de Brassica napus de primavera.

Los tres estudios repetidos se condujeron en Simcoe, North Dakota, y usaron un diseño aleatorio de bloque dividido. El estudio fue diseñado para medir el porcentaje de fototoxic idad (% de daño del cultivo) de las diferentes entradas con 5 tasas diferentes de tratamiento con herbicida de imidazol inona . Las plantas se rociaron en la etapa de 2-4 hojas con un volumen de 100 litros/ha. Las tasas de herbicida imidazol inona usadas fueron las siguientes (Imazamox = BEYOND™ 120 g/I LC (BAS 72001H) ; NIS = INDUCE™ 90 (90% de agente tensioactivo no iónico; Helena Chemical Co . , Col 1 iervi 11 e , TN) : La línea híbrida de cruza PM1P 2 /BnCL131A1 contenía 3 alelos tolerantes a inhibidor de AHAS heterocigotos AHASL1A-A122 (_¾t)T-S653 (At)N AHASL1A- 574 (At ) L AHASL1C - S 653 (At ) La línea de comparación BnCL131Al (He) contenía 1 alelo mutante tolerante a inhibidor de AHAS het eroc igoto : AHASL1A-A122 (At) T-S653 (At) N La línea de comparación PM2 ( AHASL1A- PM2 ) contenía 1 alelo mutante tolerante a inhibidor de AHAS homoc igoto : AHAS LIA-W574 (At) L La línea de comparación PM1 ( AHASL1C- PM1 ) contenía 1 alelo mutante tolerante a inhibidor de AHAS homoc igoto : AHASL1 C- S 653 (At)N.

Se determinaron las calificaciones de daño de cultivos en el campo por evaluación de cada lote en el estudio para el nivel de f itotoxicidad (porcentaje de daño del cultivo) en una escala de 0 - 100% 18 días después del tratamiento. Los valores medios para cada entrada para las tres repeticiones, junto con su significancia estadística (ANOVA) se presentan en la Tabla 6 (Ho homocigoto; He = heterocigoto) . Cada valor presentado en la Tabla 6 es la media de tres repeticiones.

Tabla 6 La Fitotoxicidad de Cultivo Porcentual Media (% Lesión de Cultivo) Observada después de 18 Días de Tratamiento. 5 10 15 Resultados Los índices de fototoxicidad porcentual (% de lesión de cultivo) fueron transpuestos en índices de Tolerancia a Herbicidas al restar el índice de lesión de cultivo porcentual (Tabla 6) para cada línea de 100% para obtener la tolerancia a herbicidas porcentual (Tabla 7) (Ho = homocigótica ; He = heterocigótica) .

Tabla 7 La Tolerancia a Herbicidas Porcentual Media Observada 18 Días Después del Tratamiento (Transpuesta de la Tabla 1: Fitotoxicidad Porcentual, Tabla 1) . 5 10 15 Herbicidas % Aditiva = Tolerancia a Herbicidas % Aditiva Observada: ID-13257 PM1P 2/BnCL131A1 S653N (He),W574L (He)/A122T- Tolerancia a Herbicidas S653N (He) % Observada = 10 15 Para entender si apilar las tres mutaciones heterocigóticas en PM 1 PM2 / BNCL 131Al se traducía en un efecto de tolerancia a herbicidas aditivo o sinérgico, las tolerancias a herbicidas medias observadas para BnCL131Al (He) , PM1 (AHASL1C- PM1 ) y PM2 ( AHAS L 1 C - PM2 ) fueron sumadas para obtener una tolerancia a herbicidas porcentual esperada (Tabla 7) . Se hace notar que las líneas PM1 y PM2 usadas en este experimento fueron homoc i gót i c a s para la mutación tolerante a inhibidor AHAS. Otra línea de verificación hubiera sido una línea PM1 tolerante a IMI he t e roc i gó t i c a y una línea PM2 tolerante a IMI he t e o c i gót i c a , pero ya que este material no estuvo disponible, se usaron sus contrapartes homo c i gó t i c a s . A partir de estudios anteriores se ha demostrado que las líneas que contienen una mutación tolerante a IMI he t e roc i gót i c a siempre fueron menos tolerantes a tratamientos con herbicidas de imidazolinona que las líneas que contenían una mutación tolerante a inhibidor de AHAS homocigótica (datos no mostrados) . La tolerancia a herbicidas porcentual aditiva esperada para las tres líneas separadas (BnCL131Al (He) + PM1 ( AHAS L 1 C - PM 1 ) + PM2 ( AHAS L 1 C - PM2 ) ) a 140 g ai/ha de imazamox fue de 45%, mientras que la tolerancia a herbicidas porcentual observada de la línea PM1 PM 1 / BnCL 131A1 (que contenía las 3 mutaciones en el estado heterocigót ico) fue de 78.3%. Se observó un resultado similar para la cantidad de tratamiento más alta de 210 g ai/ha en donde la tolerancia a herbicidas porcentual aditiva esperada era del 55%, mientras que la tolerancia a herbicidas porcentual aditiva observada para PM 1 PM1 / BnCL 131Al fue del 85% (Tabla 7 ) .

En conclusión, la línea apilada, PM1 PM1 / BnCLl 31Al , con las mutaciones tolerantes a AHAS he t e roc i gót i c a s , demostró un efecto sinérgico de tolerancia a herbicidas que se traduce en un nivel inesperadamente alto de tolerancia a herbicidas de im i da z o 1 inona , lo que se traduce en una tolerancia significativamente más alta que la observada con las mutaciones tolerantes a inhibidores de AHAS homoc i gót i c a s .

Aunque la anterior descripción se ha dado en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo por motivos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la i nvenc i ón .

Claims (119)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, recombinante , mutagenizada o sintética que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica , caracterizada porque comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

2. La molécula de ácido nucleico aislada, recombinante, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

3. La molécula de ácido nucleico aislada, recombinante, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de serina a asparagina.

4. La molécula de ácido nucleico aislada, recombinante, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica para una proteína AHAS que es resistente a la inhibición por un herbicida inhibidor de AHAS.

5. La molécula de ácido nucleico aislada, recombinante , mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína AHAS codificada demuestra un nivel sinérgico de resistencia a la inhibición por un herbicida que inhibe AHAS en comparación con los niveles aditivos de proteínas AHAS codificadas por moléculas de ácido nucleico que contienen las mutaciones individuales respectivas.

6. La molécula de ácido nucleico aislada, recombinante, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica para una proteína AHAS que tiene la secuencia de aminoácidos de BN02-131 (SEQ ID NO: 21) .

7. La molécula de ácido nucleico aislada, recombinante, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico tiene la secuencia de ácido nucleico de BN02-131 (SEQ ID NO: 16) .

8. La molécula de ácido nucleico aislada, recombinante, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica para una proteína AHAS III de Brassica napus .

9. Un vector de expresión caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

10. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

11. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el aminoácido que no es serina en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una la sustitución de serina a asparagina.

12. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la AHASL mutagenizada comprende una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 de SEQ ID NO: 23.

13. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico codifica para la secuencia de aminoácidos de BN02-131 (SEQ ID NO: 21) .

14. Una planta de Brassica caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23, en donde la planta Brassica es resistente al menos a un herbicida inhibidor de AHAS .

15. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

16. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de serina a asparagina .

17. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína AHAS comprende una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 de SEQ ID NO: 23.

18. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es una especie de Brassica seleccionada del grupo que consiste en B. napus y B. júncea.

19. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la planta de Brassica comprende una segunda proteína AHASL mutada.

20. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico mutagenizada forma parte de un vector de expresión recombinante .

21. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es resistente a las aplicaciones de los herbicidas inhibidores de AHAS seleccionados del grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona , herbicidas de sulfonilurea , herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato , herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona, y sus mezclas .

22. Una semilla de Brassica capaz de producir una planta de Brassica caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

23. La semilla de Brassica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

24. La semilla de Brassica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de serina a asparagina.

25. La semilla Brassica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la proteína AHAS comprende una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 de SEQ ID NO: 23.

26. Un recipiente de semillas de Brassica caracterizado porque comprende por lo menos 10% de semillas capaces de producir plantas de Brassica que comprenden una molécula de ácido nucleico mutada que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

27. El recipiente de semillas de Brassica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

28. El recipiente de semillas de Brassica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de serina a asparagina.

29. El recipiente de semillas de Brassica de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la proteína AHAS comprende una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 de SEQ ID NO: 23.

30. El recipiente de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque comprende por lo menos 25 semillas.

31. Un método para controlar malezas en las inmediaciones de una planta de Brassica, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad eficaz de al menos un herbicida inhibidor de AHAS a las malezas y a la planta de Brassica, en donde la planta de Brassica comprende en su genoma al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) mutagenizada que codifica para una proteína AHASL resistente a herbicidas que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de serina a asparagina.

34. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la proteína AHAS comprende una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 de SEQ ID NO: 23.

35. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la planta de Brassica se selecciona del grupo que consiste en B . júncea, B. napus, B. rapa, B. carinata, B. olerácea y B. nigra.

36. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el herbicida inhibidor de AHAS se selecciona del grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, y una mezcla de los mismos.

37. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la planta de Brassica no es transgénica.

38. Un método para criar una planta de Brassica, caracterizado porque comprende: cruzar una primera línea de Brassica con una segunda línea de Brassica, en donde la primera línea de Brassica es una planta de Brassica que comprende una secuencia de codificación de AHAS mutagenizada que codifica para una proteína AHAS resistente a herbicidas que tiene una mutación en una posición de aminoácido que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23; y obtener semillas.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la secuencia de codificación de AHAS mutagenizada comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23, en donde la mutación es una sustitución de alanina a treonina.

40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la secuencia de codificación de AHAS mutagenizada comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23, en donde la mutación es una sustitución de serina a asparagina.

41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la primera línea de Brassica se obtiene a partir de una semilla de una línea de Brassica seleccionada del grupo que consiste en: BnCL131Al, una muestra de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9279; BnCL140B3, una muestra de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9402; BnCL140C7, una muestra de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9403; PMlPM2/BnCL131Al , una muestra de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-10321; y PMlPM2/BnCL140B3.

42. Una semilla de línea vegetal de Brassíca caracterizada porque es designada BnCL120C7, una muestra de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9278.

43. Una planta caracterizada porque crece de la semilla de conformidad con la reivindicación 42.

44. Una parte de planta caracterizada porque es de la planta de conformidad con la reivindicación 43.

45. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en polen, un protoplasto, un óvulo y una célula .

46. Una semilla de línea vegetal de Brassica caracterizada porque es designada BnCL131Al, una muestra representativz de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9279.

47. Una planta caracterizada porque crece de la semilla de conformidad con la reivindicación 46.

48. Uná parte de planta caracterizada porque es de la planta de conformidad con la reivindicación 47.

49. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en polen, un protoplasto, un óvulo y una célula .

50. Una semilla de la línea vegetal de Brassica, caracterizada porque es designada BnCL140B3, una muestra representativa de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9402.

51. Una planta caracterizada porque crece de la semilla de conformidad con la reivindicación 50.

52. Una parte de planta caracterizada porque es de la planta de conformidad con la reivindicación 51.

53. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en polen, un protoplasto, un óvulo y una célula .

54. Una semilla de la línea vegetal de Brassica, caracterizada porque es designada BnCL140C7, una muestra representativa de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9403.

55. Una planta caracterizada porque crece de la semilla de conformidad con la reivindicación 54.

56. Una parte de planta caracterizada porque es de la planta de conformidad con la reivindicación 55.

57. La parte de planta de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en polen, un protoplasto, un óvulo y una célula .

58. Una molécula de ácido nucleico mutada, que comprende una planta Brassica que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica, caracterizada porque tiene una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23.

59. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque es una planta de Brassica obtenida del cultivo de una semilla de la línea mutante BnCL131Al, una muestra representativa de la semilla habiendo sido depositada en la ATCC con el No. de registro PTA-9279

60. Una semilla de Brassica caracterizada porque es capaz de producir una planta de Brassica que comprende una molécula de ácido nucleico mutada que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de la SEQ ID NO: 5.

61. Una planta de Brassica no transgénica caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica para una proteína AHAS que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23, en donde la planta Brassica es resistente al menos a un herbicida inhibidor de AHAS .

62. La planta de Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

63. La planta de Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de serina a asparagina.

64. La planta de Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la proteína AHAS comprende una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y una asparagina en una posición que corresponde a la posición 653 de SEQ ID NO: 23.

65. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la planta de Brassica es una especie de Brassica seleccionada del grupo que consiste en B. napus y B. júncea.

66. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la planta de Brassica comprende una segunda proteína AHASL mútada.

67. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la planta de Brassica es resistente a las aplicaciones de herbicidas inhibidores de AHAS seleccionados del grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona, y sus mezclas .

68. Una planta de Brassica no transgénica que es tolerante al menos a un herbicida inhibidor de AHAS, caracterizada porque comprende un gen mutante AHAS que expresa una proteína AHAS que se muta en una o más posiciones de aminoácidos, que se seleccionan del grupo que consiste de A122 y P197 de SEQ ID NO: 23.

69. La planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína AHAS expresada por el gen mutante AHAS es muta adicionalmente en una o más posiciones de aminoácidos adicionales, que corresponden a la posición seleccionada del grupo que consiste de R199, T203, A205, S653 y G654 de SEQ ID NO: 23.

70. La planta de Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína AHAS se muta en dos posiciones que corresponden a la posición P197 y a la posición W574 de SEQ ID NO: 23.

71. La planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína AHAS se muta en dos posiciones que corresponden a la posición A122 y a la posición W574 de SEQ ID NO: 23.

72. La planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína AHAS se muta en tres posiciones que corresponden a la posición A122, posición P197 y a la posición 574 de SEQ ID NO: 23.

73. La planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína AHAS se muta en las posiciones que corresponden a la posición P197 y A122 de SEQ ID NO: 23.

74. La planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína AHAS se muta en la posición que corresponde a la posición P197 de SEQ ID NO: 23.

75. La planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la proteína AHAS se muta en la posición que corresponde a la posición A122.

76. La planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque la proteína AHAS comprende una treonina en la posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23 y adicionalmente comprende una asparagina en la posición que corresponde a la posición 653 de SEQ ID NO: 23.

77. La semilla caracterizada porque es de una planta Brassica no transgénica de conformidad con la reivindicación 68.

78. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las semillas son de Brassica híbrida Fi.

79. Una célula vegetal caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada que codifica para una proteína AHAS que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23, en donde la célula vegetal es tolerante al menos a un herbicidad inhibidor de AHAS.

80. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

81. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de serina a asparagina.

82. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque es una célula vegetal de Brassica .

83. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque es no transgénica.

8 . La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la por lo menos una molécula de ácido nucleico adicional que codifica para una proteína de interés proporciona un rasgo de interés seleccionado del grupo que consiste en tolerancia a AHAS, tolerancia a glifosato, tolerancia a dicamba, tolerancia a inhibidores de PPO, resistencia a insectos, tolerancia a glufosinato, tolerancia a inhibidores de HPPD, tolerancia a herbicidas auxínicos, y resistencia a enfermedades.

85. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 84, caracterizada porque la proteína de interés proporciona tolerancia a inhibidores de AHAS.

86. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la proteína de interés es una proteína AHAS que --comprende una molécula de aminoácido que tiene al menos una mutación en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en A122, P197, R199, T203, A205, 574, S653, G654, y sus combinaciones.

87. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la tolerancia a AHAS es codificada por un gen seleccionado del grupo que consiste en PM1 , PM2 y B 1, y sus combinaciones.

88. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la planta de Brassica comprende en su genoma al menos una segunda molécula de ácido nucleico AHASL que codifica para una segunda proteína AHASL resistente al segundo herbicida que tiene una mutación en una posición seleccionada del grupo que consiste de A122, P197, R199, T203, A205, W574, S653, G654, y sus combinaciones.

89. El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la planta Brassica comprende en su genoma al menos una tercer molécula de ácido nucleico AHASL que codifica para una tercer proteína AHASL resistente al segundo herbicida que tiene una mutación en una posición seleccionada del grupo que consiste de A122, P197, R199, T203, A205, 574, S653, G654, y sus combinaciones.

90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la tercera molécula de ácido nucleico AHASL codifica para una proteína AHASL que tiene un triptófano en una posición que corresponde a la posición 574 de SEQ ID NO: 23.

91. Una molécula aislada, recombinada, mutagenizada o sintética que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica napus caracterizada porque comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23.

92. Una molécula aislada, recombinada, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

93. Una molécula aislada, recombinada, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica para una proteína AHAS que es resistente a la inhibición por un herbicida inhibidor de AHAS.

94. Una molécula aislada, recombinada, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica para una proteína Brassica napus de AHAS III.

95. Una molécula aislada, recombinada, mutagenizada o sintética de conformidad con la reivindicación 92, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de ácido nucleico de BN02-120 (SEQ ID NO: 15) .

96. Un vector de expresión caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico asilada, mutagenizada de Brassica napus que codifica para una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23.

97. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

98. Una planta de Brassica caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada de Brassica napus que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica tolerante a una herbicida que comprende una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 y una mutación en una posición que corresponde a la posición S653 de SEQ ID NO: 23, en donde la planta Brassica es resistente al menos a un herbicida inhibidor de ARAS.

99. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque la mutación en la posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

100. La planta de Brassica de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque es una especie Brassica seleccionada del grupo que consiste de B. napus, B. rapa y B. júncea.

101. La planta Brassica de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque la planta Brassica comprende una segunda proteína AHASL mutada.

102. La planta Brassica de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico mutagenizada es parte de un vector de expresión recombinante .

103. La planta Brassica dé conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque es resistente a las aplicaciones de los herbicidas inhibidores de AHAS seleccionados del grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona, sulfonilurea, tiazolopirimidina y sus mezclas.

104. Una semilla de Brassica capaz de producir una planta de Brassica caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada de Brassica napus que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica napus que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID No: 23.

105. La semilla de Brassica de conformidad con la reivindicación 104, caracterizada porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

106. La semilla de Brassica de conformidad con la reivindicación 104, caracterizada porque la proteína AHAS comprende una treonina en una posición que corresponde a la posición 122 de SEQ ID NO: 23.

107. Un recipiente de semillas de Brassica caracterizado porque comprende al menos 10% de las semillas capaces de producir plantas Brassica que comprenden una molécula de ácido nucleico mutada de Brassica napus que codifica para una proteína de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) de Brassica que tiene una mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23.

108. El recipiente de semillas de Brassica de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO. 23 es una sustitución de alanina a treonina .

109. Un método para controlar malezas en las inmediaciones de una planta de Brassica, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad eficaz de al menos un herbicida inhibidor de AHAS a las malezas y a la planta de Brassica, en donde la planta de Brassica comprende en su genoma al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (AHASL) que codifica para una proteína AHASL resistente a herbicidas que tiene una mutación en una posición de aminoácido que corresponde a A122 de SEQ ID NO: 23.

110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la mutación en una posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

111. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el herbicida inhibidor de AHAS se selecciona del grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona, sulfonilurea, tiazolopirimidina pirimidiniloxibenzoato y sus mezclas.

112. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la planta Brassica es no transgénica .

113. La planta Brassica de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque la planta es no transgénica .

114. La célula vegetal caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico mutagenizada de Brassica napus que codifica para una proteína AHAS que tiene una mutación en la posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23, en donde la célula vegetal es tolerante al menos a un herbicida inhibidor de AHAS.

115. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 114, caracterizada porque la mutación en la posición que corresponde a la posición A122 de SEQ ID NO: 23 es una sustitución de alanina a treonina.

116. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 114, caracterizada porque es una célula vegetal de Brassica .

117. La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 114, caracterizada porque es no transgénica.

118. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la planta de Brassica comprende en su genoma al menos una segunda molécula de ácido nucleico AHASL que codifica para una segunda proteína AHASL resistente a herbicidas que tiene una mutación en una posición seleccionada del grupo que consiste en A122, P197, R199, T203, A205, 574, G654, y sus combinaciones.

119. El método de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado porque la planta de Brassica comprende en su genoma al menos una tercera molécula de ácido nucleico AHASL que codifica para una tercera proteína AHASL resistente a herbicidas que tiene una mutación en una posición seleccionada del grupo que consiste en A122, P197, R199, T203, A205, 574, G654, y sus combinaciones.