CN113584218A - 与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记sv9和sv13及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13及其应用。本发明的分子标记SV9的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；所述分子标记SV13的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。本发明在目标基因的上游和下游分别开发出了分子标记，且上下游分子标记离目标基因物理距离小于150kb，本发明的分子标记与目标基因连锁关系更稳定，且上下游标记结合使用，进行分子标记筛选更准确。

Description

与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和 SV13及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13及其应用。
背景技术
谷子(拉丁名：Setaria italica)属禾本科的一种植物，古称稷、粟，亦称粱。在我国谷子是特色抗旱作物，种子萌发只需要占其重量26％的水分，而高粱、小麦和玉米的种子萌发分别需要其重量的40％、45％和48％的水分，同时谷子对低土壤肥力的耐力较高，但目前谷子种植面积不断缩减。谷子抗除草剂品种在生产上应用较少，谷子种植需要人工除草，这一直是阻碍谷子产业化发展的主要因素之一。
咪唑乙烟酸是一种重要的单子叶植物除草剂。咪唑乙烟酸是咪唑啉酮类除草剂的典型代表，是目前世界上最重要的除草剂品种之一，也是目前使用量最大的除草剂之一，广泛用于大豆和小麦等农作物的杂草控制。咪唑乙烟酸可以抑制乙酸乳酸合成酶(ALS)活性，以阻止支链氨基酸的生物合成，导致蛋白质的合成受到阻碍，从而使植物体生长停止，最终杀死生物个体。咪唑乙烟酸是广谱除草剂，能有效防除双色高粱、西风古、小觅、曼陀罗、稗草、黍、金狗尾、绿狗尾、筒麻、反枝苋和藜等杂草。
培育抗除草剂的谷子新品种是实现谷子规模化和机械化种植的重要基础。用分子标记进行基因定位和基因定向导入，是非常重要的育种手段。但分子标记的准确性、易用性对育种的成败至关重要。
专利“一种与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SIsv0163及应用”(申请号201711293540.3)中分子标记SIsv0163定位在抗咪唑乙烟酸基因的下游，与目标基因的遗传距离约为2-3cM(物理距离＞4Mb)。由于分子标记与目标基因之间可能发生重组交换，分子标记与目标基因的遗传距离越越远，重组交换的概率越高，若分子标记与目标基因不再连锁，却仍用该分子标记进行检测，则检测中易出现假阳性结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13。
本发明的再一目的在于提供上述分子标记的应用。
本发明的再一目的在于提供鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法。
根据本发明具体实施方式的与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13，所述分子标记SV9的特异性引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1:5'-CACCTGCGATGCTGTATT-3'；
SEQ ID NO.2:5'-CGCTTGATTTGGACTTTC-3'；
所述分子标记SV13的特异性引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.3:5'-GAAGTCCTATGGTGGAAGTAT-3'；
SEQ ID NO.4:5'-TTCAGCCCCTTGGAGA-3'。
本发明还提供与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13的应用，尤其是在鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因方面的应用、以及培育谷子新品种方面的应用。
根据本发明具体实施方式的鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，所述方法包括使用上述分子标记SV9和SV13对谷子DNA进行PCR扩增的步骤。
根据本发明具体实施方式的鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测谷子的DNA；
(2)以提取得到的待测谷子的DNA为模板，使用分子标记SV9和SV13的特异性进行PCR扩增；
(3)根据PCR扩增结果，判断待测谷子中是否存在抗咪唑乙烟酸除草剂基因；
若扩增产物的带型与豫谷18一致，则判断待测谷子不含抗咪唑乙烟酸除草剂基因；若扩增产物的带型与6492一致，则判断待测谷子含有抗咪唑乙烟酸除草剂基因，且基因座位为纯合位点；如果扩增产物的带型与杂合带型一致，则判断待测谷子含有抗咪唑乙烟酸除草剂基因，其基因座位为杂合位点。
根据本发明具体实施方式的鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为：DNA模板0.5μL、特异性引物各0.5μL、2X PCR mix 12.5μL、ddH2O11μL。
根据本发明具体实施方式的鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，步骤(2)中，PCR扩增的程序为：95℃、5min、1个循环；95℃、30s，51.4℃/55℃、30s，72℃、15s，30个循环；72℃、5min，1个循环。
本发明的有益效果：
本发明在目标基因的上游和下游分别开发出了分子标记，且分子标记与目标基因物理距离小于150kb，则在目标基因与上下游标记之间发生双交换的概率大大降低，从而有效降低检测结果假阳性率。本发明的分子标记与目标基因连锁关系更稳定，且上下游标记结合使用，进行分子标记筛选更准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是筛选出的7对分子标记在亲本和F1中进行测试的胶图；
图2是筛选出的2对分子标记在F1中进行测试的胶图；
图3是分子标记SV5与SV9中挑选出的引物在亲本和F1进行验证的胶图；
图4是从测试结果中挑选出分子标记SV9和SV13进行进一步验证的胶图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1 SV分子标记开发、筛选及验证
1.1材料与方法
作图群体获取：以豫谷18为母本，6492为父本，在深圳市大鹏新区华大农业研究院实验基地进行套袋杂交，采收杂交种子为F1代。将F1代播种，套袋自交采收获得400粒F2代种子，将收获的F2代播种并采取幼嫩叶片作为群体实验材料。
抗咪唑乙烟酸表型鉴定：将购买的咪唑乙烟酸除草剂商品(购自山东先达农化股份有限公司，有效成分含量5％的水剂型)按照133mL/亩的用量，加兑清水40kg，配制成除草剂喷洒液。在谷子出苗6天后，用除草剂喷洒液喷洒群体实验材料。在喷洒后3-5天观察群体实验材料的叶片变化，从而鉴定F2代群体材料的抗咪唑乙烟酸抗性。其中，叶片正常的为抗咪唑乙烟酸型，褪色的为部分抗咪唑乙烟酸型，枯死的为不抗咪唑乙烟酸型。
亲本和群体基因组DNA获取：利用CTAB法单管提取所有材料的DNA。
亲本和群体基因型数据获取：将提取获得的DNA进行二代测序建库，其中亲本进行10X的重测序，F2代群体进行RAD简化基因组测序，获得基因型数据。
咪唑乙烟酸抗性基因/QTL定位：通过生物信息分析，将获得的基因型数据和表型数据相关联，进行基因/QTL定位。通过采集群体中高密度的SNP分子标记进行的遗传定位，将抗咪唑乙烟酸除草剂基因准确定位在长度为1931bp的范围内(Chr1：24269962-24271893)。
1.2SV分子标记开发及筛选
在目标基因的上下游都开发出分子标记时，需要对目标基因上下游的序列进行准确测序，并筛选出可以用于分子筛选的合适标记，与分子标记密度、分子标记与目标基因的距离、分子标记是否便于检测等因素均有关，本发明基于上述多种因素的考量，进行如下实验：
根据QTL定位结果，抗咪唑乙烟酸抗性基因定位位点的物理位置为1号染色体的24269962～24271893，长度1931bp。
将两个亲本的重测序数据分别与参考基因组比对，找出在1号染色体上23.9M～25M间存在SV变异的位点，在目标基因上游筛选出12组序列，编号为SV1～SV12，在目标基因下游筛选出6组序列，编号为SV13～SV18。
将上述序列(SV1～18)与参考基因组比对，以在Y6492中存在突变、另一个亲本不存在突变的SV，且俩亲本间SV序列长度差异≥50bp为标准，筛选得到SV序列，并在其前后各500bp序列。
筛选获得的SV序列如下：
SV1[chr1；START＝23941411；END＝23941674；3011；SVLEN＝-263]
GTGAGGCCATGGGGTATGCCTTCATCAAAGCTCTGATGTTGTCGTCAACTGTGTCTGGAGTTGTGTTGTATCTGTTTATTGACCACTTGGTTGAATTTGATGCTAGGGAATTGCCCCGGTGGTGTTTGTCTTGGTATAAGAAACCATCTGCAACTGGCCTACTGTATTTCTTCCTTTTGTCTACTCAAACCTCGCATCTTTTAAACTGATCGGCTGTGTCCTATTCTCCATTTTGCAAACTTGTTGGCGAAAAACTTCATTTTCGACAGCTAGAGCAAAACGGCCCTCTATCCGTCTATCATAAGGTACAAGAGAACCAGAAGTTGGTGGTGGCCTACAAGGGGGGCTGTTGTTCTACAGAGTATCTAAAACAGAAGCACTCAAATCATCCAAATTCCAAGAGGCGTTAATTAATGAAGCAAACATTAGGCTGTGGTTGGGCCATCTGGCGTTCATTCATTTGTACTCCCTCCAACGGCGCTTTGGTTTGTCAAACTAGG[GGCCTTGTTTAATTTCCCAACTTTGAGGTGCCAAAATTCGTGTAGCGATATTGTAGCGTTTCGTTTGTATTTGTGAATTATTGTTCAAATATTGACTAATTAGACTCAAAAGATTCGTCTCGCAAAATACAACAAAACTGTGCAATTAGTTTTTAATTTCGTCTACATTTAGTACTCCATGCATGTATCGCAAGTTTGATGTGATGGGAAATCTTCTTTTTGCATAGTGTCAAAGTTGGGATTTGGGGGTGAACGAGGCCCTGC/G]CTCTTGCGCAAAATGGCCGCCGGCAAACCCCAAATCAAGAGCAACTAATTTTCCGGACAGGAAGTCTTGTTTGTCTCATCGTCATCAAAATGATTTGGTCATCTCGATGGAGGGCTCGACACCGGCGGCGGAGGTCGACGGGTGCAAGAAGAGGCCGCTGGAGCTGGGCAGGCCGGCGTTCATGGCGAGGGAGGGCGGGGCCTACCACGTCTTGGAGATGCCCAAGAAGCACAGGTGCGGGTACCACATGGCGAACCCGAGCCGCGCGCGCTCGCACCTCCTGACTTGCGGCAACGCCGGCGGCGGCGACGGCACCAGCAGCACAGAGGAGAAGAAGGAGAGGGGGAGCTGGAGCTCGACGAGCCGGAGTTCGTGACGGAAGAAGAGAGCGGCGCCTACACCATCCTGGAGATGCCCAAGAAATACAAATGCGACCCGGCCCGCTCCAACTCGGCCTTTACGAACGCTCTCGACGCTGAGGACGCACGCTTGCTCGCCAT
>SV2[chr1；START＝23973198；END＝23973304；3067；SVLEN＝-106]
AACCGGGGAGCTGGCCTGCAGGAGATAGACATCCTCTTCGCCGTTGCAAATATATGATATACTATATTCTCTTGAGATTGCAACGGATGCAGTCAGATCAAGATTCCGCTTGTGATGCACTCGACTACCATAGTACTCGTCTACTCATCTCGTGGAAGATTCGGTTCAGCCTCTACCACATGCGCTTGTGGCTCCGATCATCGTCATGATAACGTCGCATTTTGCTTGTGCGGGTCAACTTCTGTTTTCTGGATTCAAGGTCATCGTTTCGACCAAACATTCACGATTTTGTTTGTGGTTAGAGTGAAGCAGGAGTGGGATTCCTGCGAGCCATTTCTTTCGATTGATGTATACATGCATGGAACGCCTGTCACTTTAATTCTTACTAGGTTGCACACAGCCATATCTAGCACCAAGTACCAAGTAAACATTGAATCATTTCATAGCACTGGGATTTATTGGTGTAGTACATTGCGAAAGAAGTTGGCTGATTAAATTCT[CTCGCTAAAGTGCTAAACTTTAGCAACTCAATTTTAGCAAATTTTAGCAAGGGTGTTTGACAGTTTAACAGCTAAAAGTTGCTAAACTTTAGCAACTAAAGTTCAGC/CAACTTGAGAGTAGTAGCAATGTACTGGATTTTAGT]CAGTAATTAAATATTTAAATCACATGAAAGTTGGAAGCACGTTTCCAAAAAAGTTGCTTACCTTTAATTTTGATCTGTTATGGGCAGCGTGTGTGGTTGGTGCGTGGAGGAAACCAAGTCAGCGGTAGCTGCGAGGGAGGAGGAACCAGGGGAGGCTTTGTGTGGTGTAGTTGTGTGTTGGATGTTGAATTTTTTGGAGCGAGACACACATGGAGCACGGCCGAAACGTCATGAGATTTGTTGACAGGATATGGTCACCACTTTGGGGGAGTGATATATATGACCACATATATGCATGGGACATAACTACGTATAAGGACTGCATCAAAAGAGATAAGCTAAATAACAAAAGAGTCACGGTATGTGATCTACGTTGCGTGCAAGGAGTTTCCTCGGAACAGAAAGGAAAATCCACATGAACTCCGGAGGTGTGCGGAAATTATTCTTGGGTCAAATAAATTGCATCTATATGCGGATAGGGAGGCAACTCGGTGGAAAGC
>SV3[chr1；START＝24015211；END＝24015462；3070；SVLEN＝-251]
GGGTCTCATGGCGTGAGAGATGCGCTGGAACTGAAGGAGTGGGACGACGGGTGCAGCGACGACGACACCAGGGACCTGGACGAGGACGCGGAGAGGTACGAGGCCATCAAGAACCTCCGGGAACAGATGCTGGCCGGCAACGGCTTCGTCTTCCTATCGCAAGGGGAGCCAGACGCCGACAGAGATCGGCATCGCCAGGGTTTGGTATCTCAGATTGAAGACGGGGGACTCTGGTGAGGCAAATGGATTGGTGTTGTTGAACGGCTGACGGTGACACCCGGCTCTGTTTCTTCAGAATTTGTGCATAGTTTTGATTTTGGTGTTCCATTTGCACAGTTGTAGTAGAGTTCTCTCTTTGATGTTTGGATCAATACTGCACCTCCATAGGAATCTTGTTTCAAAATTTTAAATGTTATTGCTGTGGCATTTTGCCTCAGTGTCAGATTAGAAACCACCAATGCCTTGTATTTGTATATACGGAGTTACATACTCAGGGTGTG[TGTTTGCTTACATGCACCACATGATGCATGCATGGATGATCCTGGATGGAGTGGTTCGACCAATTTACTTGTACCATATGGTTCACTCTAATTAGTAGGATAATGTATTAAGTGGGATGGTCTCATCCTAGATGAGCTGGTACAATTCACCCAACCAAACAAAAGGATCATTATTATTTCGAATCATTTCATACATGAATCAAATGATACAACCAACCAAACACGCCCTCAGAGTGTTCATATGGGGACTCC/TTCAT]CGGGACTTGGTAGGCTTTTGTGAAGGAAACCATTGCCGGTTGCAGACATGAACCACTCGACTTTTGAATGGATATATGATTTTCCATCACGTTGGTGGTTTTACATATAGCTACTTAATGATTTTGTGAGTGAATCGAACAACTTAGTGTGGATGGGTTCCCTTGTTTGTCTTCTTCACTGTATATACTGAGCCTGCTTGGGTGCCGGCCACAACCTGCCAAGCCACGGTGTGGTGCACCGAAGGCTTGGGGGTCGCACTTCATGGCGCAAATGCTGCTTTGTTTTCCCCTGTTGCTGCCTGTTTTTTTCTACCAAGCAAGCAGCAGCCAATTAATATGACGTGGCTGGTTGTAGCGTAGCTCGTTGCGGCGTCCAACCAAGCACGCCCATATACGACAAGTAGAGGCCAACTCCATTTGTGAGATTTTTAAGGTATGTTTAGTAGAGTTTCTTTATATTTGTGATTCACTATAAGAAGCGATTTTATGTATGAATGTGG
>SV4[chr1；START＝24065677；END＝24065756；3089；SVLEN＝-79]
AAGGCCCGAGTAGTTTTCCATATACATACTTGACTAGTCCGAGTGGGATACGCCTATCCCTTGTTCTGATCGTGTCCGAGTACGCCTCTTAGTGGGCCGTCCAAGGTCTACTCGCGGGCCTGAGGTGCATGCCCGACAGGAGGGTCCCTGCCTCGCCTTATATTGCCGGGGGCAGGGTTACATGTCGGTTGTTTACAAGAATACTAGTCGGATTCGACTAGAGAGTCCTACTCTAATTGCTATGAGTAGTTTCCTAATCCTCGACTAGTTCTCATCCTCCATGTAGACCACGTCGTCCTGCACCGTAGTCTCCATGTCTAACACGTCTCGGTGTACAACCCTGGATTGTAGGACTGTCCAAACCTTCTGGTAGGCCCAAAGATGTATGGCTGACACTATCACCGTCAAGCATGTGGTGAAGAAGCCATCCACTGCTGATGAAGTCCCTCCTCCCATAATCACATACGAAGAAGGACAAGATCCTGAGGATCGAGTACTCG[CGTAAGTTTGTTTCCCTTATCACCATGCCTAACTGGATTCTGACATTGATGATTTGCAGGTAGTCGGAGAGGAGACAAAT/C]TGTAGAGAAGACAACTGCAGAAGTTGTGCAGCAGGGTCTGCCGGTGATCAAGGAGGTCATCGAGCTGGAAGATGACGAGGAGCCCCCTGTCACCAGGGCAACCCCGTCCTCACGCAGACTACTCAAATAGTGGAGACAACATCCAAGGCTGGCAAAGATCAAACTACGATCCAGCAAGCAGCGCCAAAGAAGGCGTCACCCATTGTGAAGTCCCTGTGCCTGGGGGGAGAGCCCTCCTTGAAGATAAGGCGATCCACAAAGTAAGTATTGGATTGTTATCCGAGTATTGATTATGACTTGATGTTATCTTGTAGTGTGTCTTGACACTTGTCTTATTTTAGGAAATCCACCAGCGTGGATATAAGAGGCTCGAGCCCGAAGTCTGCAGCTGATGGCAGTAGCCGCTCAGCCCAAGATCCTGTCCCGGCGCCTTCAATTCCACTGCTAGAGGAGCAGCCTGCACTAGAAGTATCTCCAGGTGCTATATCCCTTGTCGATGC
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CCTTGTATATAGGACTATCCAAACCTTTTGGTGGTCCTATAGATATATGGACGACACCTGCGTCCCAAATTATAAGTTATTTTAACTTTTTTAAATACATAGTTTTTACTATACACCTAAATATTACACTTATATCTATTATACACCTAAATATTACACTTATATCTATGTACATAGCATCTGTTTCTAGAAAAGTTAAAATTAAACGACAGCTCCCCTTGACGTCAGCACTGACATGCAACAAGGTTGTCAGCCATGCATGAACGCATCCTGCAGCTTCCTACGTAGCTAAAATCCAACAAACATCTTTCCGAATCTTCCTTATTATTCATTTAGTTATGTATGTGTTGGCATACATATGTGCATTTGACCTTCTGCACACTGCACTAGAAAAGATGAACATATATTGTGTTGTCCGAGAAAATTCAAACAAGAAACGGAGTTGCATCTTGCATAGCATTTGCATCAGTCGGCTGCCGGAGAGGTACGGCCTCCGACCT[C/CTGTACTGTGATAGGACTTGTAGATAACGATGCCCTAGAAATAAAGAAAAGAAAAAACAATGCCCCAGAAATTTAATAAATTGTAATCAATTTA]CTCTATTTGACTACATATTTCCGGACAGAAAACCTATCGAACTTTTGAGTTGTCGAAGCTGCATCCTATAATTTAGCTTCCTTACTTAATCACCCATTGTCCTCATCAAACCGGCGTTTCGCAATTAGTTGTCGTTGAATCCCCTTGCAAAGGATCAAGCTCCCGGTCATGTAGTTTCATTAATACTGGATAATACAAAGCACCATGGCTACTCTACAAAATCGGTTGGATGATCATCATGCAGACTTGCACACCGCTAATATACGTTCAATTGGTGCGCGGAAGCACCTTGGGTTGGTTTCTAACTCCACCTGACTCTAGCCTAATCCCCTAGCTATATGCGCTAAAAGGCCTGATCTAGCACTAACAAATTTTCTCTACTCGTGCGCGCAGTTCGCCGGTGGTTGTGATGAGCACAGAGACATCGCTCCTGCTTGGTTCGTTTAAAAAAAATATATAATGGTGGCAGTTAATTCAGTTATATATGCTGCAGTTGTCAT
>SV6[chr1；START＝24124724；END＝24125076；3124；SVLEN＝-352]
TCTATATTCTCATTACTTCCTCTATATATTTATAAATGGTGACACTGACCTTAATTATTATTTTCTATATCAATAGTGTAAGAAATAGACAATTTAAAATCATATTTTTAATGAAGGTGATTTGGATTCGAATTTTTAATAATAGCATATGTGAATATAATGTTAGTAGTGGGCAATTTAGATGCACATTTAAGGGGTTATTTGATATTATGGTATAGGTGGGTAATTTAGATGAAAATTAGGGGGTTCATTTAATTTATTTTATACGATGGCAGAGTGGGTAATTTAGATATAGATTTAGGGGGTTACTTTAGACTATTTTCATAATGGCATAGGTGGGTAAATTTTTTAGAAAATATAATAGATCCAATGGCTATAATGATTGAGCCTACCAAATTGATGGCTAGATGGTTTGCTTTTTTGAGAGAATTTCTAGGATTTCTCTTTTTTTTTAGAGTGTCCACTTAGGATTCCTAGATGGCTTCATATGGAGGAGCCTC[TCTAAAGGGGTGTTTGGATACTCGGTGCTAAACTTTAGCAGTGTCACATCAGATGTTCAAATGCTAATTAGGAGGACTAAACATAAGCTAATTATAAAACTAATTGCAGAACCCTGTGCTAATTCGCAAGACGAATCTATTAAGTCTAATTAATCCGTCATTAGCAAATAGTTACTGTAGCACCACATTGTCAAATCATGAACTAATTAGGCTTAATAGATTCGTCTTGCGAATTAGACTCCATCTGTGCAATTAGTTTTGTAATTAGCATATGTTTAATACTCCTAATTAGCATCCAAACATCCGATGTGATAGGTGCTAAATTTTAATGGGTGTATCCAAACACACCCCCA/TTCAAT]ATAGTAATAGTAAGATTAGTAAGAGCAAACTCAGGTGTAGACCCAGGGCCCGACGACCCTGGGTGCCTGCCCGGGTCAAATCAGTCATCTACGTTAGCAACCATATTCTCTGCCGGAGATAGGAAAGGCGGTAGCAGTTGTAGAGTTCGTCCAGGCTCGAACTCGATTTATTCGTTGGGTCCGCCGCTGAGCAAACTAGCTAGTGCCCACACATTTTGAGCTTATGGAGAGACGTAGGAGTGATCAAAGGAGAAGAGTTTAACGGTACACCCGGCTAAGGATTTTTTTGTTTTTGAAAACCGCCAACAGCTTTGCTGTCCGGCATATAAAGGAGAAGAGTTTAACGGTACACCCGGCTAAGGATTTTTTTGTTTTTGAAAACCGCCAACAGCTTTGCTGTCCGGCATATATTAATAGAGAGGATAATCAAAATTTTATAAATTACATGGAGAAGCAAAAAAAACAGAGAGAAAGGGAGAGTCCATAAGAACTACTCTCCG
>SV7[chr1；START＝24125362；END＝24125446；3124；SVLEN＝-84]
TAAGTCTAATTAATCCGTCATTAGCAAATAGTTACTGTAGCACCACATTGTCAAATCATGAACTAATTAGGCTTAATAGATTCGTCTTGCGAATTAGACTCCATCTGTGCAATTAGTTTTGTAATTAGCATATGTTTAATACTCCTAATTAGCATCCAAACATCCGATGTGATAGGTGCTAAATTTTAATGGGTGTATCCAAACACACCCCCATAGTAATAGTAAGATTAGTAAGAGCAAACTCAGGTGTAGACCCAGGGCCCGACGACCCTGGGTGCCTGCCCGGGTCAAATCAGTCATCTACGTTAGCAACCATATTCTCTGCCGGAGATAGGAAAGGCGGTAGCAGTTGTAGAGTTCGTCCAGGCTCGAACTCGATTTATTCGTTGGGTCCGCCGCTGAGCAAACTAGCTAGTGCCCACACATTTTGAGCTTATGGAGAGACGTAGGAGTGATCAAAGGAGAAGAGTTTAACGGTACACCCGGCTAAGGATTTTTTT[TTGTTTTTGAAAACCGCCAACAGCTTTGCTGTCCGGCATATAAAGGAGAAGAGTTTAACGGTACACCCGGCTAAGGATTTTTTTG/TCTT]GTTTTTGAAAACCGCCAACAGCTTTGCTGTCCGGCATATATTAATAGAGAGGATAATCAAAATTTTATAAATTACATGGAGAAGCAAAAAAAACAGAGAGAAAGGGAGAGTCCATAAGAACTACTCTCCGGAATAATCTCCCTTAGATTTTTTGCGCCAGCTATACACTATGGCCTGTTCGCTTCAGCTTATAAACCGGCTGAAAAGTTGAAACGACTGATTTGTTGTGAGAGAAAAATACTGTTTGGTGGCTGATAAGCCGGCTGAATAAGCTGAAGCGAACAGGCTGTATATTCTCAACTTGATCTTTGATCTTCGCAATTCAAGAAGTTGCACGGGAGTATCTTCTCCTGAAAATTCTTGTGTTGCGCCAGCTATACACTATGGGCCTGTTCGCTTCAGCTTATAAACCGGCTGAAAAGTTGAAACGGCTGATTTGTTGTGAGAGAAAAATACTGTTTGGTGGCTGATAAGCCGGCTGAATAAGCTGAAGCGAACAG
>SV8[chr1；START＝24125613；END＝24125949；3157；SVLEN＝-336]
GACCCAGGGCCCGACGACCCTGGGTGCCTGCCCGGGTCAAATCAGTCATCTACGTTAGCAACCATATTCTCTGCCGGAGATAGGAAAGGCGGTAGCAGTTGTAGAGTTCGTCCAGGCTCGAACTCGATTTATTCGTTGGGTCCGCCGCTGAGCAAACTAGCTAGTGCCCACACATTTTGAGCTTATGGAGAGACGTAGGAGTGATCAAAGGAGAAGAGTTTAACGGTACACCCGGCTAAGGATTTTTTTGTTTTTGAAAACCGCCAACAGCTTTGCTGTCCGGCATATAAAGGAGAAGAGTTTAACGGTACACCCGGCTAAGGATTTTTTTGTTTTTGAAAACCGCCAACAGCTTTGCTGTCCGGCATATATTAATAGAGAGGATAATCAAAATTTTATAAATTACATGGAGAAGCAAAAAAAACAGAGAGAAAGGGAGAGTCCATAAGAACTACTCTCCGGAATAATCTCCCTTAGATTTTTTGCGCCAGCTATACACT[CTATGGCCTGTTCGCTTCAGCTTATAAACCGGCTGAAAAGTTGAAACGACTGATTTGTTGTGAGAGAAAAATACTGTTTGGTGGCTGATAAGCCGGCTGAATAAGCTGAAGCGAACAGGCTGTATATTCTCAACTTGATCTTTGATCTTCGCAATTCAAGAAGTTGCACGGGAGTATCTTCTCCTGAAAATTCTTGTGTTGCGCCAGCTATACACTATGGGCCTGTTCGCTTCAGCTTATAAACCGGCTGAAAAGTTGAAACGGCTGATTTGTTGTGAGAGAAAAATACTGTTTGGTGGCTGATAAGCCGGCTGAATAAGCTGAAGCGAACAGGCTG/C]GTATATTCTCAACTTGATCTTTGATCTTCGCAATTCAAGAAGTTGCACGGGAGTATCTTCTCCTGAAAATTCTTACGTTTCGCTCATTCCAAATCTCCCAAACCACAACCACAAGGAGTAACATCGAGTGAATTGCACGGGCTGGTTCTTCCGGTTTTCCCTACAGCTGTCCACCAATCTGAAACCGATTGAAATTGTACCCAGTTCGTCGATGCTGGGAAGTTCCCAGCTGTCCAATCTCTCATTGCAAACCAAATCCTCTTGCTGTAGGATGACCGTTATACAAGGGCAAAATGGTCCGACCACGTTCACTTCCACGCTCTAACGACAAGACCACTGCACTCGAGACGTGAGTTGTGTCATCAGATACACCTCCAAGAAGGTTTCAAACATTCCATGGCATGGCAGGACGACTCCACGCGCACACCAGCTACCATGAGCACTAGTACTCACAAGGGCTTTCTGGTAAAATCAACCGCCACGTTATCGTATAAAGATTC
>SV9[chr1；START＝24144441；END＝24144545；3138；SVLEN＝-104]
CGGGCGACCGGGCGGAGCCGCCCCAGGAGGCCGTTCTCAAGGCCATCTCTCGTGAGGAATCCTCTTGCTTCTTTTATTTTTCTTCCGGATAGTCGATGGATTATCCGCGGTACTCCTACTGACGCGTCCTAGTTCCGACGCGGCTTAGCCAACTCGGAATGGAAGGGGAAATTTAGCACTCGTTGCCTCTACTCTGAGATAGACATTCTCGATAGCTGCCGGAGAATCGGTCGAGTGTACAGGTGCTGATTAGTTGTTTCTAGCTTCTAAACTGCACAAATTGGCGTCGAGCCAACTGCAGTCGTCCCTGGAGTTTAGTACTGTGGTACTGTTCCATTGTGTTCTATACTGGGTTTTCATTGCACCTGCGATGCTGTATTCGAGTTTACACTCATAGGCAAGGCAGATAGGTATTGCCTCTTTTGCGGAGTTAGTTAATCTTCCAAATCCCCTCACTTGGTTAAACAATTAGGAAGACGTCAGCAAAATGTTTCTTATCC[CCCAGCCTGTTCGCTTCAGCTTATCAGCCACCGAACAGTGTTTTTCTCTCACAACAAATCAGCCGGTTCAGTTTTTCAGCCGGCTTATAAGTCCAGCCGAACAGG/CTGATTTTGGTGTCTATGTCAGAGTTACCCTGTCACAC]GCCATAAAATGACAGTCCATAACAAACTAATAACTTCTTTTGGACAAGTCTTGAAACCTTTCAACTATTGGCAAAAAGTTTGCCTTGCATGAAGTCCTGCTTGTTGAATTAGATCCTTAGTTTGCATAAGTAGGAGAATGTCGAGTTTGTTGAATAATATTTATTACACTGAAAGTCCAAATCAAGCGCATAGGATGGGTTACCGTGGATCCTATGTGTTGTGCTCTGCAAGATTCCATAATGGCTCGAGCTAATGGTATAGCACATTAGATGATCTTGCAACTAACTCCTCCCTCTGAAGTACCCAAACACCACTTTTCAACAATTCCTCTATTCTATTTTCTTGTCGGATTTTCCACTACCACTTCTATCAAAAAAAAATTCATAGTACTGTGTTTATCAATGCACAATTTTCAGACAGACCTTGGACTCAACTGTTACAGATAGATGCAGCTTGCTTAATTATAAGCATATTAATTACAAATGTTTTACATGCTATG
>SV10[chr1；START＝24156561；END＝24156807；3140；SVLEN＝-246]
GCCACGACGCCGTGGCGTGCCGGAGCACTGCACCGGAGAGCGCTTATCGGGCTGTGCTGTGCAGGCAGGACAGGAGCAGAGCCTCGCGGCAGGTCCACGTCGTACTGCAGCCGCTTACCCTCGCTGTCGCCGGTACGCGCGCGGGCTAGAAGAGAGGCGGTGGCGGGCGGTACGTGCTGGGCCTACAGCGTGTCGAGGCTGTCGCGATTTGGTTCGTGGAAGCGCGTCGCCGACCCGTCGCTGTACGCATTCACTCCTATATCTCATGTGGTGTGTGGAGCGCGGCAGCCGGCAGGGGGAGAGATGAAAGCTCCACCCGTCCTCCGCTCTATAAATGGATGGGGAGGTGGGGAGACCGATACCGGGGAGGCAGGTTGGTTTGTTCAGGAATCACAAGGAGATACAGCCATACAGGTGATCGCGACTGGGCACGGGCGGTGAGGACAGGACGGGTTTGCATGGATTCGGCTCTGTCCAGTGTCCCCTGCCCGGCTGCCCCC[CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGGTGCCCTCGCCGTCGTCGGCCCTGTTTGTATACGTTTTTCCTAGCCACGCTTAGATTATAATCTAAGCTATTTTCTCGCTTCTCGCTTTTCGCTTCTCGTAGTTTAAATCGTTGAAGCGGCTTACCATATAAGCGAGAATCGGTGGAAATAAGCAAAGCGTTTGGCGGGATTCTCGCTTATTTTCACCGATAAGCCGCTTATAAGCGGATACAAACGGGGC/CTCCGCGGTGCCCTCGCCGT]CCGTCGTGTAGCCTTAGCTCTGAAGGAACGGCAACAAGAGGAAGCTGCATTGCCTTCCAGTGCTATCACTCGCCAGGATCGCTCACGATCGCTTCAGCTGAGCTGAACCCAGCTCGCTCAGGTCGGGTGCAGGGCCGCACTTTTTACTGTGTACGGGCGCTGCGTGCAGCGTGCGTGCGTTCCACCGAGCGGCGCCCGGGGGCTGGGCTCACAGATGACGATGTGATGATCTCGCAAACTTCTCCCTACCACTGTATAGTTTACGACAAAGCAAAGCGCCACAAAAGACAAACTTGATCAGCTAAAATGCCATACAATTAGTTAGAATTGGCCGGCAACTCTGTACATGACGCTCAGTCTGTAGGCTACTTTGACCCAAACCCAGCAGAGGAGCTTGAAGGAAATGGTGAGTTGGACATATGCTTGTGTCAACCTCCTCCTTATTCCTTAGCCTAATCTCGGGCTTCTTCTTCTCTTTTGAGGGCCATCTCGGGCTTCTT
>SV11[chr1；START＝24164860；END＝24164862；3185；SVLEN＝76]
CATTTGTGTTTCCGGGCTAGGAAGTGAGGACGATAATACGCACCGTAACCAATCACACTTGAGTTATCTTCAACTCGAATTTAGGCAAATATTGAGTTATTTTAAACTCGAATTGAGGTAAATATTTTCTTCTTGATGGAAAACACCTAGTTTCTTCTAGTTAGCCTTTGTTCTGCAGGCTATCACATCAACTAGAAATAGGGTACCTATTTTCCTCTAAATGAAAAACTATTAGGCTTCGTTTGGATCCTTCATTTTTAAGGAATTGGAATCTACTTGATGGAGTAGGCTATTCGTCTTAGAATATGGCATTCCATAACTTTCCAAAGTTTAGATATAAGCCTATCTTAAAGTTACGGGGGTGGGAGATGAAAATTGATTCTACAGATCCTCATACTATATTTCTAATATACAACATATAGCACGCTCTTCGACTCGCTTCCCTATCGCAGAAGTGCAGTACATAAATATCTCTCCCATATGGCCAACAATAATATACA[CAA/CTCTTCGACTCGCTTCCCTATCGCATAAGTGCAGCACATAAATATCTCTCCCGTATGGTCAACAATAATATACAAAG]AATCTATTCCACATAGAACTATATTAGCTTAATTAATTTGGGTCTAAATTATGATTATTAGGATGGTTCAATTCCAAGGATCCTAACTGGCCTTAGTTTCTTCTGGTTGACATTTGTTGTGGTTAGCAATACACTACTCAAGGCTACCATAGCTTTGTACGTCATTCCATTCGGAGAATTTTTTTTTCCTATTCACTATGACCAACACTCGTAGCGAAAATATTTTTTATTCACTATGGCCAAGCAAGCAATGAGCTTAAAGTCAGACCATAAAAACCTCTTGCGTATCGCTAGGTAGCATAGTGCATATGTGCTGGACAAGGATACATTCGCTGCGTAAGATCAATTTTTTTTTAGCACACTGCCTGCCTTGGTCATCGGACGGTCAGTCAACTGCAATTTAGCATCTCTCACAGACATCAACAGATGAACAGAATGAAAGAAAACACAGCGAAAGTGCACAATAGAGAACAGTGCATTGCATTGCATTGGGTAAACAG
>SV12[chr1；START＝24181054；END＝24181310；3195；SVLEN＝-256]
GCTTCGGTAGACTACGACGGCGCCGTCTCACAGATTCCCTTTGTGTGCTTGTGAAGGAGGAGAAGCCCGGGAATCGTGAAGCTTGCACAACCATCAAGTTACATGCCCTCCCTTTCGGCTTTGGGTTGCTTGGTACGAACTACAAAGATACTAGATACATGTGGCTGGCGTCCAGCAACTATGAATTATTCTCACCTGCGAAATGAGGTCTCCGGAATATACTTGCATTGTATAGACAGACTAGGCCTCCTGAATCTCGCTCTGCTGCCACGCTCATCTCGCTGGTGTCAGATAGTATGCAGCGTTGCCCAACGTGGTGGCGACCGGCCAGCCAGCCGGAGTCAGCTGACGCAGATCGCCATTGCCACGGTCAGCTGATGAGGGGGAAGGAGCAAAACGTAACACGGAGCAGAGTTGCCTTTCTGCTGAACCGGGACGCACATCAGAATTCAGAAACCAAGACCGACCATCCCACCCCGCACGCTTCGCTCACGAGTCCG[CGGTCTTGTTTAGCTGCCCAACTTCGAGGTGTTAAAAATACTGTAGCAACACTGTAGCATTTCGTTTGTATTTATGAATTATTGTCCAAATGTTGACTAATTAGGCTCAAAAGATTCGTCTCGCAAAGTACAACAAAACTGTACAATTAGTTTTTGATTTCGTCTAGATTCAGTACTCCATGCATGTACCGTAAGTTTGATGTGATGGAGAATCTTCTTTTTGCATAATGCCAAAGTTAGAATTTTGAAGCGAGGCC/CATCCA]CTCCATCCATCCATCCATCCCCGTCGTATCCTTTGCTCGAGATCGGAATGGTTCGTAAGTAATCGCCATCGTCACGAGACCATTCCGGAAGCGACTACGAACCGTGAGACGAGAATGCGCAGGTTGATTTTGACTCTGCCCAAGTGGAGCTGGGGATCTGAGATTCCGTCGGAAATTCAGAGCTCACGGCGAGCAACCGATTGAGCATCCCCCGCACAAGACGAGCACAGCGCACGCAATAGAACATCGCGGATTCGACATTCAACAGCTACAGCTTGGATCATCCCATCGAGAAACATGACGAGAATACAGACGGATCGGAATGAACAGATGACAGGAAACACCACAACAAGTAGAGAACTGCTTCTTCAATGGATTAAAGAGCAAGCACTTGTTCCTGCGGATAGACTACTACAGAATCGGATTACAGATGACCTTGTCCATAGACGATCGAGCACGCAGCAGCAGCTAGCAGTACAACCAGTACACCACGCACTTGT
>SV13[chr1；START＝24351314；END＝24351385；3212；SVLEN＝-71]
GCATCACCCATCACACTTACGGGGGAAGAAGAAGAAAAACTCACAGGATGTCGCTAGCCTACCACTGAGTCACCGCCGCTGAAGACTCCATGGACACATGAACAATCTGGAGGAGCACCAACTTGTCCCATCGCCGAGACATGGTAGTGCAGGTCTACAGGATGCAGAGCACCTATTCATGGTACCCTTATATTTTGTATAAAGATCCTTCATGTCCTTTCTCTCAGAATTCGAGTCTCTATATTTAGCTTCAAGTTCTTCAGTAGTGTTGTCCATTTCACAGCAAAATTCCCATTTGCAATTTTTTTCACTCATTACCTGTTGCATAAGAGATAATAATTAAATGTGATATTGTACATGAAGCTTATTCAATTTACAGGAAGTCCTATGGTGGAAGTATTATTATTGCAAAGCTTATGGCATAACCTATGAATTTTCTGCACACATGACTTGTGGACTAGGTGATGGATGCTGTAGGGCAATAAATGGGCTTAATGATT[TTTTTTTTTTCTGCACACATGACTTGTGGACTAGGTGATGGATGCTGTAGGGCAATAAATGGGCTTAATGAA/T]ATTTTTTTTCCATGTGCGTGGGACTTCTACCATCGAGGTTAGAAGTAGGAGTTTAGAATGGTAAACAAAGTTAAGAAGGAATGTGATTCTCTTTTTTTAATATATAAAGTAAAAAAGAAGCATTAAAAACTTCAAATTGAACTAAAAATCAGCAAAGATAAATATCATAAACAAGAAATGTATAGATGCTCGAGTTGCACTTACGAGCCATCAGGCAAGATCTCGACATGGCCGAAAAATCTGACTGGGAACACAACATCATGCCCGGGAATCTCCAAGGGGCTGAATTTCTGTAAGGGAAAAAAGAGATTTGATTATAGAGATTTATAGAAAAAATGTGTTAGCAGAATCATATGTGCATTTGTGGTTCGTACGTCAAGCTAGTCTTCGGCGATTTCTTCTTGGCCCTCCTTGGCAATGTGTTGTTTGAACAATCCATATCGGTATCGCAGGCCATAGCCCCAAGCAGGCCAATTCAATGTTGCCATTGAATCCAAAAG
>SV14[chr1；START＝24381034；END＝24381155；3222；SVLEN＝-121]
GACCGGCGGGCGGCGCAGGTGGTGGCGGTGGGGGCTCGGGCGGGCGCGGTGGTGGCGTTGGGGGCTCGGGCGGGCGCGGCCGCTAGCGCCGCGGTAGGGGACGCCGGCGGCGGGGCGGGGCCGGAGGCGGCAGGCGCAGGGGAGGGGCCGACGGGGCGGCCGGCAGCGCCGACGCCGACGTTGGCGCCGGGCACGGCGTGGACCGAGCAGGGGTGGGGCCGGAGGCGGCAGGCGCAGGAAAGGAGGAAGAAGGAAGGAGGAGGAAGGAGAAGAAGGAAGAAGGGGTATTTGGCTGCCATTGAGAGGAGTAATGAGGGGTAAAGTTGTCAATTACAACCTAAGGTGTTAAATTTTAACAGATCATCCAAACACCTCAAGATACTAAAGTTTAACACCTTTATTTGAGGGTGTTAAAGTTTAACACCCTGTTAAATTTTAACACGCCCTTCCCAAACAGGGCCTTAGCAAAATTGGATTTACGTGGTATTATACAGACAGCG[CGGCCTGTTCGCTTCAGCTTATAAGCCGGCTGAAAAGCTGAAACGGCTGATTTGTTGTGAGAGGAAAACACTGTTTGGTGGCTGATAAGCCGGCTAAATAAGCTGAAGCGAACAGGCTCTAG/CTCATTAATTTCTGTTGTAC]GATGTCCTAAGGCACGACGCCTCGACTTCTCGACTCTCTCTCTCTCTCTACGTATCCGGTTCGAAGACATCGTCTCATCGAGATCGACGAGACCTATAAGTCTTGAAGGCACGCGCACGGCCACCCATCATCAAGCCGCGCGCGTTCTCCATTGTCTCGGCGCGCCAATAGGGTTTGATCCGGCTCGGCTTTCCATGGCGGCGGCGGCGCTCCCAACAGCACGCAAGCGTCCGGCGCTGGATGAAGCCTGCCCCACGGAGGCCGGCAAGAAGCGGCCGCGCTACCAGCTCGCTGACACCGGCGACGATAACGCGATGCCCGAGAAGATCGGTGAGGGCACTTCCATCGCCACGGAGCTCACCGGCCCCAGCCTCCGGACCCGGCTCACGCGGCCCTTCTCCGAGTCCGAGGCGCGCGACTGCATGAGGCAGCTGCTGCGGGCGGCGGGGGAGCTGCACGCCACGGGCACGATCCACCGCGACATAAGCCCCGACAACATC
>SV15[chr1；START＝24650219；END＝24650484；3363；SVLEN＝-265]
AAGAAACTACTTGGGTCTCCCCAATGCAGATTCGCTGGTTTCTTGGCTCATTGGTGCGCGTGAGGATTTAGTTTCCTCTCTAAGAAATGGTTTCTCTCTCCATAATAAATCTACTGCCACATCAGCAAATTGTTTAGTTGGCATGATAATTAAGAGGGATAGAAACTATCATCAATGTTCCATTGGGACTGCCCTAAGCATGCTAAAAATTGGCTCGGACATGATTGATATACTGCGTGTGGCTCACTGGGCCCTAGACGAAAAATTGTGTCTTTGTTTTCCCTCCGACTACAGGATACGGATATCACAAACCCCCCCGGTCACTGGTTACTTGGTTAGTGATAGTATGCTACGCAGTCTCCATGTTATCACGAGGACTGCTTTGGACAAGGAAGGAAGTCAAGGATTGATAAAGTATACAGTTAATGAAACTTTGAGGATCAAAATGATAAAGAGTAGTCTAATAACTGTAAACGGTCAACTGGTACATATCAAATTGG[GGCCCTTGTTTACTTCACTCCCAACTCCTAACTTTGACACTATGCAAAAAGAAGATTCACCATCATATCAAACTTGCGGTACATGCCTGGAGTACTAAATGTAGATGAAATTAAAAACTAATTGCACAGTTTTGTTGTACTCTGCGAGACGAATCTTTTAAGCCTAATTAGTCAATGTTTGGATAATAATTCACAAGTACAAACGAAATACTACAGTGTGCTACAGTGCCACACAGTAATTTTGGCACTCCTAATTTTGGCAACTC/GATATAG]CTCCTTCCTGCGAAGCATGTGGCTCTAAGTTTGACCGAGCCTGTGTCTGTTTTGGGCTTTTGGCAGGACGGAAGGTCCAAATTTCATGCGATGAGATATCTCCATCCGGAATCTTCCTTGCTGGGTTGGCTAGATGCCTGGGCCGCACAGGGATAGCTTCTTGTTTATGTTGGGCTGGGTCACCAGCCAAAAAATTAGGTCGAAATTTGCACCGGGTCAAAATTTGCAGCCCAAGCTCGTCCGGCGTGCCGGCCAACCCCAACCAGGCTGCTGGGTTATTTTTGACCGGGAGTGACTACATATCAATCGATTTTTTCAACCAGTCGAATGATGCCACGTAGCTGTGTTAGGAGGGGAAAATTCGAGTGCCAACCAAACCAAATTCCAGTCGATTTTGAATAGAAAATGTGAGATGCGTAAAAACCGACTAGAAAGTGGACTTGCTTGCTAGGCGGTGCGCAAGATTAGCAGATTCACGAAGGTGGACCGAGACGTGGTGG
>SV16[chr1；START＝24696379；END＝24696475；3361；SVLEN＝-96]
GTCAAACTTTTGTTGCGGTCAATGTTCAGATGCCAGTGGTAATGGAATTGCAGGTCTGTGATGATGGCAAATGCAGATCCCAGAGCTATCGGCTGGTTCTATTGCTGGAGAAATGGACTTCTTTTATATAAATTCTTGTAGTCTAATTATATTATTTTGGTGTGCATGAGCCTATCACTTTCAATCTTAATCAATCCAAATCTTTTTTGTTTTTCTTCATATGTCATCACCGTATTCTGGTGGTCATTACGTTTTTCTGTGACTGTTTAAACTTTGATAGAGCATTTTTTAAGAGTGAGAAACCTGAAGGTATGTTGTGAAGCACATCGATGCTGGTGTTTCAGATGTGCAAGCTTCTACCTCGGTGTTTGCTCTTCCTCAATTTATGTCGAACTGTCTTATTGGCAGTGAGCTGCTCCTCTCAGACAATAATATACTCCCTCCGTTCCAAATTGTTAGATTATTTTGCTAGATATAGTGTATGTATAATATATATAAAC[ACTTAAAAAAAGTCAAAGCGACCTACAATTTGAAATGTACTCCCTCCGTTCCAAATTGTTAGATTATTTTGCTAGATATAGTGTATGTATAAACTTA/ATTT]AAAAAAAGTCAAAGCGACCTACAATTTGAAATGGAGTAGGTAGCATACATTTGAAGCGACAAGACCGTGTGACGTTACGAATTTCAACTGCTTGCATAGTAGCTAGATTCCATATATACAGAATAATAAGTCATGCGGTTACATATGGTTCTATATTTTCCTAATAGTTGAACATATGTGAAATTACCCAGCTACCACCTCTATTAACCTCTACGATTGAGTTGCAGACACAATGTCTCGCGAATAAACTTTGAATGTCTAAAATGAGAAAATAAGAAATTTGAAAGACGATGTATCTAAATGTACACACCTAACCTGTTTGTGTACTTTTTTTTTATATAATAACTCAATCAGACATCTAAATGGTAGACATGGTGAGACACACAATCTCAAATTTAAGCCGAACAAATTGCTTGTTCTCTTAATTAGTCTTGCTAGGCAAGGAAACAAACATCCTAAATTTCCGCTCCATTCCAAATAAATCCCTTTATACGAAATAA
>SV17[chr1；START＝24781606；END＝24781793；3435；SVLEN＝-187]
GGTCCAAGCCCGAAGTCTACGGCTGATGGCAGCAGCTGCGCATTCCAAAACCTCACCCCGGCACCTACAACTCCACCGCCAGAGGAGCAGCCTGCATCAGAAGTAGCTCCAGGTGTTGTATCCCTTATCGCTGTGCTTGTGCATGATGTTATTGCATCACTAAATGTTGTTGTAGTGCCAGCCCCCGAGCTGCCAGTAGTCGAGCCCATCACGGCGACTACTTCTGCTGTGGTGGCTACATTGGTAGTCCCCGAGCCGAAGGCGAAGATCAAGATGGAAGTAGCAAGTACTTCTGGAGCTGAGGCTACACTTGTAGCCCCCGAGCCAGAAGTGGAGGTTGAAGCTGCCGGGGCTCTGCAAGTGTTGGCTGTCATCCCACCGTCTGAGGCGGGATCGTCTACCAGCAGCGGCATGACTTCTCACTTATCTTCTGAAGCTGGTCCTTCAACTAGCCGAGCACTGGTTCCTCTTGGTGCCCCAATCGCCGAAGAGCACAAGGA[GAACCGTGGATAGCTGAAGGGGTGGATCTAGAGAAGATCCAGCTTCTTGCTGACCCTCTGACCACCGTGGAGATGGAGGCCACAGTCATGGAGATGCACCGCTACTCATGAAGTACGACGGCCAAGCTACCGAGTACTGTAACCTCGTCCAACAAGCCGCGAAGGGGAAGGACTGCCTCCGGTAGCAC/G]CAACAAGGCGTTGAAGAATCGATTGGATGGTATCTTGTCACCTCCCGCTGGTTTCTAAGTACCAATTTGCGCTTCAGTTTCCTCTCCTTCTACGTTAGAGGTGAGCTCATCCTGCGAGACGTCGTCTGGATGACGTTTGCGTCATGGATTTCTTTCTGGTAGTTCTTCACCGTCATTTTCTTATGCAGCAATGATAGCGAGGAGTTCCTGCTCTGGAGAAAAACTACCCAAACTTGATGTAATGATCTCTGTGGGGTCGTCTTCTTCGTAGATGGGCGACAGAGGAGTTCCCTCCTGGTATGGGAGAGTTTCAAGGTAGACGACAAGGCGTGACTCGTCGTCCTTGGTGAGAGCGGGTGGCTTCATGTTGGGCAATAGACGAATCTGCCTTGTGGAGTATATTTGATAACCAGACCCTGCTGTGGACCTGATAATGGAATCTCCTCGTCCGGATCCGAGTAATAGTCGGGGTCCTCGATCAAATCCGAGTTGGATTGCGA
>SV18[chr1；START＝24782077；END＝24782421；3373；SVLEN＝-344]
GGTGCCCCAATCGCCGAAGAGCACAAGGAACCGTGGATAGCTGAAGGGGTGGATCTAGAGAAGATCCAGCTTCTTGCTGACCCTCTGACCACCGTGGAGATGGAGGCCACAGTCATGGAGATGCACCGCTACTCATGAAGTACGACGGCCAAGCTACCGAGTACTGTAACCTCGTCCAACAAGCCGCGAAGGGGAAGGACTGCCTCCGGTAGCACAACAAGGCGTTGAAGAATCGATTGGATGGTATCTTGTCACCTCCCGCTGGTTTCTAAGTACCAATTTGCGCTTCAGTTTCCTCTCCTTCTACGTTAGAGGTGAGCTCATCCTGCGAGACGTCGTCTGGATGACGTTTGCGTCATGGATTTCTTTCTGGTAGTTCTTCACCGTCATTTTCTTATGCAGCAATGATAGCGAGGAGTTCCTGCTCTGGAGAAAAACTACCCAAACTTGATGTAATGATCTCTGTGGGGTCGTCTTCTTCGTAGATGGGCGACAGAGGA[GAGTTCCCTCCTGGTATGGGAGAGTTTCAAGGTAGACGACAAGGCGTGACTCGTCGTCCTTGGTGAGAGCGGGTGGCTTCATGTTGGGCAATAGACGAATCTGCCTTGTGGAGTATATTTGATAACCAGACCCTGCTGTGGACCTGATAATGGAATCTCCTCGTCCGGATCCGAGTAATAGTCGGGGTCCTCGATCAAATCCGAGTTGGATTGCGATTTGGATAGGGTAGCTTGGTAGGCAGCACCCGAGCTTCGAAGTTCGAACGGGAATCGACTTGTGTTGTAGATCGATTCACACGATGGCTTAAGCACCAGCTCGTGGGAACCAGTCCAACTGGTGAGAGA/G]AAGTCGAATTGTACTCGGACTCGTCCCTTGAGCCTTGGAAGAGGTTGAAAATTTCGTTGAATTTTTCAACGAAATCCTCCAAAGCTTGGCGATGAAGGTTGATGTCATACTGCTTCTCCTCCAGGGCCAGCGCGATGTGGCGGTGGAAATTTCCAGTGCCGCCTGTGATGCAAACCTAGGAACCGAAGATGAATGTCGCGCCCGCTCCTAACGCAACGGTGCGCTTGATGATGACTTCAGCCATCGAGTTCGCCAGCGGATCTTTAGCGAGACCCCTACCTGGCACACCAGTTGTTGGTGTTTAGACCCCGCAACCTACCGAGGGTGTACTCGAGGTAGTGTTATTATGCGTGGGGCTCGCTGCGATTAGAAACTCAAAGGTAAACTTGAACACACGATTTAGACAGGTTCGAGCCGCTTATATCGCGTAATACCTTACGTCCTGTGTGTTGGTTGTGTTGTATTGATTGAACTTGTTTGGAGGGGGTCCGTGTCTCGCC
以上序列中[]内序列是两个亲本豫谷18与6492间存在差异的序列，即[]中“/”前面部分的序列为6492的序列，而“/”后面部分的序列为豫谷18的序列。
1.3验证SV标记
采用琼脂糖凝胶电泳的方法对筛选出的SV标记进行验证，具体包含三步工作：引物设计与合成、PCR及琼脂糖凝胶电泳，具体方法如下：
对每个SV标记设计多组引物，引物序列如下：
Figure BDA0003254608140000111
引物干粉经过12000rpm离心1min后，使用0.1X TE Buffer(pH 8.0)稀释至浓度为10uM；PCR验证用DNA模板豫谷18、6492、杂合(由豫谷18和6492等量混合)稀释至浓度为25ng/μL。
按照表1配制PCR扩增体系，吹打混匀后瞬时离心
表1 PCR体系
Figure BDA0003254608140000121
将以上PCR体系放入PCR扩增仪里，按照表2程序进行PCR扩增反应。
表2 PCR程序
Figure BDA0003254608140000122
PCR结束后，取PCR产物2μL进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(1)按照上述PCR方法，对SV11、SV12、SV13进行PCR扩增
结果如图1所示，SV11、SV12未发现多态性，SV13的3个引物组合均扩增出多态性条带，条带明亮清晰的引物组合为CHR1SV13F1/CHR1SV13R3，确定目的基因下游标记SV13。
基因上游标记需重新挑选SV标记设计引物。
(2)按照上述PCR方法，对SV5、SV9进行PCR扩增
结果如图2所述，6个引物组合均扩增出了多态性条带，条带明亮清晰，特异性上也表现很好。
挑选PCR扩增效果较佳的引物组合CHR1SV5F3/CHR1SV5R2、CHR1SV9F2/CHR1SV9R2，以豫谷18、亲本6492、杂合体(豫谷18与6492等量混合而成)的基因组DNA(20ng/μL)为PCR模板，进行PCR扩增。
进一步选用不同的引物组合，对材料进行了检测鉴定
结果如图3所示，SV5F3/R2这对引物所跑出的条带在比较偏下(约280-400bp间)，而SV9F2/R2这对引物所跑出的条带更靠近500bp(约380-500bp)，而下游引物SV13F1/R3的条带也是在500bp(约400-500bp)。且SV9更靠近目标基因，故最终选择SV9F2/R2这对引物作为筛选出的标记。
对从测试结果中挑选出分子标记SV9和SV13进行进一步验证，结果如图4所示，与CHR1SV5F3/CHR1SV5R2相比，CHR1SV9F2/CHR1SV9R2扩增效果最优，且最为接近基因位点。
因此，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，目标基因上游的SV9和下游的SV13具有良好的稳定性，且用琼脂糖凝胶电泳可以清楚分辨亲本1、亲本2及杂合三种不同带型，故用SV9和SV13两组分子标记对育种群体进行前景选择。
表3经验证后的SV标记的引物序列
Primer名称 序列(5'to 3')
CHR1SV9F2 CACCTGCGATGCTGTATT
CHR1SV9R2 CGCTTGATTTGGACTTTC
CHR1SV13F1 GAAGTCCTATGGTGGAAGTAT
CHR1SV13R3 TTCAGCCCCTTGGAGA
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 重庆大学
阜阳华大生命科学研究院
<120> 与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctgcgat gctgtatt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcttgattt ggactttc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagtcctat ggtggaagta t 21
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcagcccct tggaga 16

Claims (8)

1.与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13，其特征在于，所述分子标记SV9的特异性引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1:5'-CACCTGCGATGCTGTATT-3'；
SEQ ID NO.2:5'-CGCTTGATTTGGACTTTC-3'；
所述分子标记SV13的特异性引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.3:5'-GAAGTCCTATGGTGGAAGTAT-3'；
SEQ ID NO.4:5'-TTCAGCCCCTTGGAGA-3'。
2.权利要求1所述的与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13的应用。
3.权利要求1所述的与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13在鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因方面的应用。
4.权利要求1所述的与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13在谷子育种的应用。
5.鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，其特征在于，所述方法包括用权利要求1所述的与谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因紧密连锁的分子标记SV9和SV13对谷子DNA进行PCR扩增的步骤。
6.根据权利要求5所述的鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测谷子的DNA；
(2)以提取得到的待测谷子的DNA为模板，使用分子标记SV9和SV13的特异性进行PCR扩增；
(3)根据PCR扩增结果，判断待测谷子中是否存在抗咪唑乙烟酸除草剂基因。
7.根据权利要求6所述的鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为：DNA模板0.5μL、特异性引物各0.5μL、2X PCR mix 12.5μL、ddH2O 11μL。
8.根据权利要求6所述的鉴定谷子抗咪唑乙烟酸除草剂基因的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的程序为：95℃、5min、1个循环；95℃、30s，51.4℃/55℃、30s，72℃、15s，30个循环；72℃、5min，1个循环。
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