CN107177665B - 功能连锁标记0707-1及其在玉米种质改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能连锁标记0707‑1及其在玉米种质改良中的应用。本发明中，首次在定位到1个27‑kDγ‑zein的主效修饰因子，其位于7号染色体120Mb附近的一个100kb范围内，该修饰因子为27‑kDγ‑zein基因的一个多拷贝。本发明还建立了鉴定该多拷贝基因的分子标记物以及鉴定方法，从而为鉴定优质蛋白玉米提供了有效的途径。

Description

功能连锁标记0707-1及其在玉米种质改良中的应用

技术领域

本发明属于植物学和分子生物学领域，更具体地，本发明涉及功能连锁标记0707-1及其在玉米种质改良中的应用。

背景技术

优质蛋白玉米(Quality Protein Maize，QPM)是高赖氨酸玉米，营养价值堪与牛奶媲美，产量接近甚至部分品种超过普通玉米，大大改善了南美、非洲和亚洲等一些以玉米为主食的发展中国家人群因缺乏赖氨酸、色氨酸引起的营养不良症。培育优质蛋白玉米，将极大的改善玉米籽粒的品质效益，综合提高农民的收益。然而优质蛋白玉米是以热带种质资源为背景进行的改良，在热带地区表现为良好的硬质胚乳籽粒。引进中国后，热带种质往往表现为生育期延迟、籽粒软质或半软质，不耐储藏和感病等较差农艺性状，需要将热带种质中的修饰因子转到温带种质的骨干自交系中，然而由于修饰基因及其互作的调控因子遗传调控机理复杂，导致这个转化过程很漫长，而且最后得到的很多转化系还不是全硬质胚乳，农艺表现不如全硬质胚乳。中国地域和气候差别很大，经过千辛万苦育成的优质蛋白玉米品种的适宜区域非常有限，很难大范围推广，大大制约了优质蛋白玉米的发展。因此，深入解析优质蛋白玉米胚乳发育过程中的调控因子及修饰机理，将大大加快其分子育种效率，为农民带来巨大的经济效益。

成熟的玉米粒中，胚和胚乳是基本的组成部分，分别占8％～10％(胚)和80％～85％(胚乳)，因此玉米籽粒中80％左右的蛋白质是由胚乳提供的。胚乳作为主要的营养储存器官，大部分储存物质是以淀粉粒和蛋白体的形式储藏在胚乳中，通常二者分别占胚乳干重的70％和10％。而玉米种子中的储存蛋白根据不同的溶解性分为清蛋白(albumin，水溶，3％)，球蛋白(globulin，盐溶，3％)，谷蛋白(glutelin，碱溶，34％)和醇溶蛋白(prolamin，醇溶，60％)。因此提高玉米籽粒所缺少的氨基酸含量，其关键核心在于提高胚乳中醇溶蛋白的含量。

玉米醇溶蛋白(zein)基因家族是一个大家族，分为α(19-和22-kD)、β(15-kD)、γ(50-，27-和16-kD)和δ(18-和10-kD)四个亚家族。自B73基因组序列公布以后，前人利用已有的序列信息进行基因组BAC序列比对后发现，在玉米醇溶蛋白基因家族中19-kDa和22-kDa的α-zein亚家族基因分别有26和16个拷贝(Copy Number)，其它分子量的zein基因均为单拷贝。进一步的研究发现，各亚家族的蛋白质之间在蛋白序列水平上并没有序列保守性，只是异源醇溶蛋白混合物的总称，但是它们翻译后都定位于胚乳细胞粗糙内质网的内腔，有序地包装形成蛋白体(protein body，PB)，是胚乳品质(软质或硬质)最主要的影响因素之一。与此同时，研究人员已发现醇溶(Zein)蛋白合成后储存于蛋白体中，不同zein亚家族蛋白在蛋白体中的空间排列高度有序：γ-和β-zein定位在蛋白体的外周区域，而α-和δ-zein定位在中央区域。任何破坏这种严格空间排列结构的突变体都会导致蛋白体变形形成软质胚乳。

优质蛋白玉米(Quality Protein Maize，QPM)到目前为止已经研究了半个多世纪，在基础研究领域发挥了极大的促进作用，但是由于o2突变体籽粒是软质胚乳，千粒重及抗病性较差，很难实现产业化。在QPM玉米中，zein蛋白含量下降了60％，而non-zein互补性地上升，实现了蛋白质组的平衡的同时，也极大的提高了赖氨酸含量。与此同时，前人的研究发现优质蛋白玉米中27-kDγ-zein的转录和蛋白水平是普通野生型和普通o2突变体玉米的2-3倍；在优质蛋白玉米和普通o2突变体的F₂群体中，胚乳的修饰程度和27-kDγ-zein的表达水平正相关。

然而，优质蛋白玉米胚乳修饰因子究竟是什么？它的作用机理是怎样的？这些至今仍然是困扰玉米育种者和遗传学家的难题，给农业上筛选优质蛋白玉米造成阻碍。

发明内容

本发明的目的在于提供功能连锁标记0707-1及其在玉米种质改良中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定优质蛋白玉米的方法，所述方法包括：对待测玉米进行检测，确定该玉米中是否存在27-kDγ-zein的主效修饰因子，若是存在则表明该待测玉米是优质蛋白玉米；其中，所述的27-kDγ-zein的主效修饰因子与SEQ ID NO:1(464bp)所示的多核苷酸(或其互补链)完全连锁。

在本发明的一个优选例中，所述的方法还包括：确定该玉米中是否存在核苷酸序列如SEQ ID NO:2(2070bp)所示的多核苷酸(或其互补链)；若是同时存在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的多核苷酸(或它们的互补链)，则表明该待测玉米是优质蛋白玉米。

在本发明的另一优选例中，对待测玉米进行检测的方法包括：基因测序方法；或PCR扩增方法；或Southern杂交方法。

在本发明的另一优选例中，所述的方法是PCR扩增方法，包括：以待测玉米基因组为模板，以特异性扩增SEQ ID NO:1或其片段和SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或其片段(SEQID NO:2特有的片段)的引物来扩增，若同时获得针对该两条序列的扩增产物，则表明该待测玉米是优质蛋白玉米。

在本发明的另一优选例中，所述的特异性扩增SEQ ID NO:1或其特有片段和SEQID NO:2所示的多核苷酸或其特有片段的引物是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸包括：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；或

(2)与(1)的多核苷酸特异性互补(或结合)的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸还包括：

(3)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；或

(2)与(3)的多核苷酸特异性互补(或结合)的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，所述的与(1)的多核苷酸特异性互补的多核苷酸是引物对，所述引物对的扩增产物包括SEQ ID NO:1所示的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，所述的引物对是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于鉴定优质蛋白玉米。

在本发明的另一方面，提供一种用于鉴定优质蛋白玉米的试剂盒，所述的试剂盒中包含特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸的试剂。

在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒中还包含特异性识别SEQ ID NO:2所示的多核苷酸的试剂。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中包含：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物对。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、SDS-PAGE检测普通玉米自交系中27-kDγ-zein蛋白表达差异。

图1B、SDS-PAGE检测IBM Syn10群体单株27KD蛋白表达差异，B为B73，M为Mo17。

图2、SDS-PAGE检测27-kDγ-zein蛋白表达情况，其表达量表现为显著的剂量效应。

K0326Y：K0326Y纯合自交系；

K0326Y×B73：K0326Y为母本，B73为父本；

B73×K0326Y：B73为母本，K0326Y为父本；

B73：B73纯合自交系。

图3、不同自交系中27-kDaγ-zein gene表达计算。

A：SDS-PAGE分析B73及XF134自交系。

B：XF134和B73测序27kd基因。XF134中序列为：CCGCCGCCACCATGCCACTAC(SEQ IDNO:5)；B73中序列为：CCGCCGCCGGTTCATCTGCCGCCGCCACCATGCCACTAC(SEQ ID NO:6)。

C：XF134与B73、K0326Y和Mo17杂交cDNA测序单克隆片段统计。

图4A、SDS-PAGE分析自然群体自交系中27-kDγ-zein蛋白表达量。

图4B、SDS-PAGE分析IBM单倍体群体中27-kDγ-zein蛋白表达量。

图5、GWAS关联分析27-kDγ-zein蛋白修饰因子。

图6、QTL连锁分析27-kDγ-zein蛋白修饰因子。

图7A-F、27-kDγ-zein蛋白修饰因子染色体精细定位和克隆。

图8、Mo17和B73定位区间的基因组比对差异。

A：Mo17和B73测序基因组比对。

B：差异区间Mo17详细注释，其中复制区间表示为红色(且以虚线框标示)，1，2，3和4分别代表27-kDaγ-zein gene，GRMZM2G565441，GRMZM2G138976和GRMZM5G873335。位于基因2和3部分区域中的绿色箭头标线及黑色箭头标线代表复制区间设计的多态性功能连锁标记0707-1(464bp或2070bp)。

图9、功能性标记0707-1标记验证36份QPM自交系。

A：SDS-PAGE分析各自交系中27-kDγ-zein蛋白表达情况。

B：PCR分析各自交系中多态性功能连锁标记0707-1的存在情况。

图10、功能性标记0707-1标记验证近等基因系CM105、CM105o2及CM105Mo2。

A：SDS-PAGE分析CM105、CM105o2及CM105Mo2中27-kDγ-zein蛋白表达情况。

B：PCR分析CM105、CM105o2及CM105Mo2中多态性功能连锁标记0707-1的存在情况。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次在定位到27-kDγ-zein的主效修饰因子1个，其位于7号染色体120Mb附近的一个100kb范围内，进一步研究确认这个修饰因子为27-kDγ-zein基因的一个多拷贝。在此基础上，本发明人确立了鉴定该多拷贝基因的分子标记物以及鉴定方法，从而为鉴定优质蛋白玉米提供了有效的途径。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“特有片段”是指仅存在于SEQ ID NO:1所示序列中的序列片段，或仅存在于SEQ ID NO:2所示序列中的序列片段，而在基因组的其它序列中不存在该“特有片段”。

27-kDγ-zein主效修饰因子

本领域已经证实，27-kDγ-zein表达上调是优质蛋白玉米胚乳修饰必需的，但是这个基因本身不是修饰因子，而是一个修饰因子的效应子，因为优质蛋白玉米和普通野生型及普通o2突变体的27-kDγ-zein基因序列并无差异，所以调控27-kDγ-zein表达上调的因子才应该是修饰因子。本发明人在研究中发现，Mo17的27-kDγ-zein表达比B73显著高出约1倍，因此本发明人预期Mo17可能含有部分调控27-kDγ-zein的修饰因子(图1)。

基于本发明人的新发现，所述的27-kDγ-zein主效修饰因子可被应用于作为玉米良种选择的分子标记。因此，本发明提供了所述的27-kDγ-zein的主效修饰因子的新用途，用于鉴定优质蛋白玉米。可以对待测玉米进行检测，确定该玉米中是否存在本发明新发现的27-kDγ-zein主效修饰因子；若是存在该修饰因子，则表明该待测玉米是优质蛋白玉米。

功能连锁标记及其用途

虽然确定了本发明所述的27-kDγ-zein主效修饰因子，但是本发明人发现，该27-kDγ-zein主效修饰因子为27-kDγ-zein基因的一个多拷贝。若是采用小区域内基因测序方法(非全基因组测序或大区段测序)，双拷贝的27-kDγ-zein在序列上不易于与单拷贝的27-kDγ-zein基因有效地区分；采用PCR方法也无法实现区分。

因此，还需进一步寻找可以鉴定所述的27-kDγ-zein主效修饰因子存在与否的简单、方便的方法。经过深入研究后，本发明人发现了所述27-kDγ-zein主效修饰因子附近存在一段与该因子完全连锁的区段，即SEQ ID NO:1(464bp)所示的多核苷酸。该区段仅在存在27-kDγ-zein主效修饰因子的玉米基因组中存在，因此可以作为27-kDγ-zein主效修饰因子的功能连锁标记，通过鉴定该区段的存在与否来准确地确定27-kDγ-zein主效修饰因子存在与否，若存在SEQ ID NO:1(464bp)所示的多核苷酸，表明27-kDγ-zein主效修饰因子存在。

此外，本发明还提供了另一段功能连锁标记，即SEQ ID NO:2(2070bp)所示的多核苷酸。该段功能连锁标记不存在于所述27-kDγ-zein主效修饰因子上，但存在于原27-kDγ-zein基因上(见图8)。通过鉴定该区段的存在与否来准确地确定27-kDγ-zein主效修饰因子存在与否，若同时存在SEQ ID NO:2(2070bp)所示的多核苷酸以及SEQ ID NO:1(464bp)所示的多核苷酸，表明27-kDγ-zein主效修饰因子存在。

基于本发明的上述新发现，提供一种分离的多核苷酸，包括：

(1)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(2)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸。

上述的两条多核苷酸来自于玉米基因组中，但是在玉米的不同品种中，其基因组中相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多核苷酸可能存在少数或极少数核苷酸位点上的变化。因此，本发明还涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多核苷酸的变异体，多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。具体地，本发明也包括以下多核苷酸：

(3)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交的多核苷酸；

(4)与(1)限定的核苷酸序列有90％以上，优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上相同性的核苷酸序列；或(5)与(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互补(优选完全互补)的核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。

本发明还涉及与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2可杂交的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与所述的多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等。

鉴定植物基因组中是否存在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多核苷酸可以采用本领域已知的多种方法，包括但不限于：基因测序方法，聚合酶链反应(PCR)方法，Southern交方法，特定的限制性内切酶酶切方法等。在本发明揭示的内容的基础上，本领域技术人员能够方便地确定所应用的方法，实现鉴定玉米的目的。因此，这些方法均应被包含在本发明中。

功能连锁标记的检测方法及试剂

本发明还提供了特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸的试剂，以及特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸的试剂。所述的试剂可应用于鉴定为优质蛋白玉米。所述的试剂可以是引物。

作为本发明的优选方式，通过设计特异性扩增所述多核苷酸的引物，以待测玉米的基因组为模板，若能扩增获得所述的多核苷酸，则表明该植物是优质蛋白玉米品种。作为更优选的方式，所述的引物是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物。应理解，基于本发明提供的序列信息，可以设计更多的候选引物用于鉴定，这也应被包含在本发明中。

在本发明的具体实施例中，通过PCR扩增方法，以待测玉米的基因组为模板，以SEQID NO:3和SEQ ID NO:4为引物，进行扩增。并且，对扩增产物进行琼脂糖电泳检测，产生两条条带的表示待测玉米的基因组中同时存在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列，也即存在所述的27-kDγ-zein主效修饰因子，鉴定为优质蛋白玉米；仅存在对应于SEQ ID NO:2的序列的一个条带的，鉴定为非优质蛋白玉米。

特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸的试剂，以及特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸的试剂可被包含在包装中，制备成用于鉴定优质蛋白玉米的试剂盒。

所述的试剂盒中，除了包含本发明的用于识别多核苷酸的试剂，还可包含其他用于蛋白或基因鉴定的试剂，例如(但不限于)：PCR扩增试剂，免疫印迹试剂，电泳试剂等等。此外，还可包括：使用说明书，序列分析软件。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、植物材料

收集温带自交系、38份优质蛋白玉米自交系(QPM自交系)及280份IBM Syn10单倍体自交系，分别来源于中国农业大学、云南省农业科学院、四川农业大学和美国内布拉斯加大学林肯分校。

三份近等基因CM105、CM105o2和CM105Mo2及非洲优质蛋白玉米自交系K0326Y来源于美国内布拉斯加大学林肯分校。

全部遗传材料于2013年11月海南三亚播种自交繁殖。

2、醇溶蛋白提取及27-kDγ-zein表型鉴定

在提取每一份自交系醇溶蛋白时，为了提高样品的准确度和代表性，本发明人将收获晾晒后的玉米种子混合20粒，利用咖啡研磨机(Electric Grinder)研磨4-5次，3-5分钟后称重100mg的磨粉样品用作醇溶蛋白提取。称重后，将100mg粉末加入至1毫升醇溶蛋白提取液中(70％酒精，2％巯基乙醇，v/v，3.75Mm四硼酸钠(PH10)，0.3％SDS)，室温静置2小时后13000rpm离心20分钟(Eppendorf)，提取100微升上清液至一个新的1.5毫升离心管中，加入10微升10％SDS，混合均匀后在45℃，VAL模式下(Eppendorf)抽真空70分钟后用100微升双蒸水溶解备用。最后吸取2微升醇溶蛋白提取液混合8微升蛋白加样缓冲液至SDS-PAGE(15％)胶中检测，以B73和Mo17为标准样品，与B73表达相同的记为1，与Mo17表达相同的记为2构建表型数据库。

3、RNA提取和纯化

取50～100mg的不同时期胚乳组织，加入350μl去蛋白溶液和200μl氯仿。钢珠打碎。取上清，再加200μl氯仿重复一次。取200μl上清，加入1ml Trizol试剂，振荡混匀室温放置5min。加入200μl上清氯仿，混匀冰上5min。12000rpm，4℃离心15min。取400μl上清液小心转移到新的1.5ml离心管中，加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。再12000rpm，4℃离心15min。小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。再用DEPC水配制70％乙醇洗涤1次，12000rpm，4℃离心5min。尽量彻底地吸走上清，将RNA放在室温，待乙醇完全挥发掉。最后沉淀用20μl DEPC水溶解。

4、cDNA合成

cDNA合成使用SuperScript III First-Stand synthesis试剂盒(LifeScience)。在RNase-free的无菌离心管中将2μg RNA与1μl Oligo(dT)和1μl dNTP Mixture混匀，用水补齐到10μL，置于65℃水浴5分钟。迅速取出，冰浴1分钟。加入以下组分并混匀：10×Reaction Buffer 2μL；25mM MgCl₂ 4μL；0.1M DTT 2μL；RNaseOUT 1μL和1μLSuperScriptIII RT。将离心管轻轻混匀，快离后放置于50℃水浴锅中50分钟，最后置于85℃5分钟使反转录酶失活后备用。

5、关联分析

本发明人使用GAPIT软件(版本：2.22)中的压缩混合线性模型(PCA群体结构+Kinship亲缘关系)来进行GWAS的分析。Kinship矩阵通过软件emmax-kin(版本：beta-07Mar2010)来计算，参数为-v -h -s -d 10。PCA的计算使用GCTA软件(版本：gcta64)，分为两步：

第一，估计遗传关系矩阵，参数为--autosome-num 10--autosome--make-grm。

第二，将遗传关系矩阵放到PCA计算模块，输出特征值和特征向量，参数为：--grm-pca 20。特征值最大的3个特征向量用于GWAS的分析。

6、IBM Syn10群体基因分型和Bin map的构建

对于每一个群体的自交系而言，测序方法和SNP检测方法与亲本方法相同，首先将去除标签序列(7bp)的83bp的群体重测序read利用SOAPaligner，version 2.21(SOAP2)比对到亲本参考基因组上，结合已经检测到的亲本间的SNP物理坐标信息，得到群体测序片段的SNP基因分型信息。其中检测过程中，短序列比对只允许存在1bp的不匹配(mismatch)且质量值≥5。基于亲本间和群体间的SNP信息，即可得到此位点群体SNP的基因分型数据(Laiet al.2010)。

Bin map的构建过程中，本发明人使用一个15SNP滑动窗口步移的策略来检测玉米自交系间的重组断点，首先定义在一个子代连续的15个SNP中，当遗传自双亲的SNP比值接近7:8(或8:7)时，这个位点即为一个重组断点。在IBM syn10群体中，由于采用染色体加倍的单倍体技术，本发明人检测到的重组断点都是纯合基因型。检测280份自交系的全部重组断点后，本发明人以100kb为一个区间进行全基因组基因型划分，同一基因型的SNP标记利用Perl脚本整合为一个拟合的染色体区段标记(Bin marker)，最后，将全部280份群体自交系的bin标记整合为一个综合的bin map遗传图谱。

最终，本发明人在280份群体自交系中利用Perl脚本整合6618个bin标记，并利用JoinMap 4.1和MSTMap组合构建高密度的遗传图谱。首先利用JoinMap 4.1进行6,618个标记的两点最大似然遗传距离分析，得到全部标记的遗传分群信息；然后利用MSTMap软件中的Kosambi map功能进行每个分群内的标记初步排序，最后利用JoinMap 4.1进行排序后的标记的遗传重组率和遗传距离的精细计算，进而构建280份群体自交系的6,618个标记的高密度遗传连锁图谱。

7、QTL作图及分析

由于自交系表型数据的限制，本发明人选取194株IBM Syn10子代进行QTL分析，重新构建了194份自交系材料的bin map遗传图谱，利用QTL Cartographer Unix version1.17f软件进行QTL分析(Wang et al.2005)。利用复合区间作图法(Composite intervalmapping)，对IBM Syn4和IBM Syn10群体进行玉米株高和开花期的QTL分析。运行参数均为默认值，QTL检测LOD阈值设置为2.5，QTL置信区间为LOD值从峰值下降2对应的区间，同时计算每个QTL对表型的贡献率和加性效应。其中IBM Syn4的1,339个标记的基因型数据由http://www.maizegdb.org/ancillary/qtl/ibm302cross.inp.获取。

8、精细定位和克隆27-kDγ-zein调控因子

通过连锁和关联分析，本发明人首先将27-kDγ-zein调控因子定位于7号染色体129Mb附近1Mb左右的区间内，然后构建(Mo17x B73)x B73回交群体收获6912个籽粒。每个籽粒首先被切出2份，一个用来提取DNA，一份用来提取醇溶蛋白，结合染色体步移的方法将调控因子定位在标记0916-2和Ch7-120.35间100kb左右的范围。

9、Mo17自交系BAC测序PacBio文库构建及测序

取5μg样本DNA，利用

(Covaris，美国)将DNA打断至10kb。片段化后的DNA，用

SMRTbell^TMTemplate Prep Kit(PacBio，美国)构建文库：加入0.45倍体积

Beads(Beckman，美国)进行纯化，得到37ul溶解于Elution Buffer的sheared DNA；随后依次加入DNA Damage Repair Buffer、NAD+、ATP high、dNTP和DNADamage Repair Mix，37℃反应20min，快速回到4℃，加入End Repair Mix，25℃反应5min，回到4℃；加入0.45倍体积

Beads进行纯化，得到30ul End-Repaired DNA；随后加入Annealed Blunt Adapter(20μM)、Template Prep Buffer、ATP low和Ligase，25℃反应15min，65℃反应10min，回到4℃；随后加入ExoIII和ExoVII，37℃反应1hour，用0.45倍体积

Beads进行两次纯化，即可得到供测序的SMRTbell templates。构建好的SMRTbell templates利用PacBio DNA/Polymerase Kit，退火测序引物并将Polymerase结合到SMRTbell templates上，随后在PacBio RS II平台上进行测序反应。

10、Southern blotting杂交

用CTAB法提取玉米植株的叶片基因组DNA。用限制性内切酶(EcoRI)对40μg基因组DNA进行酶切，在0.7％的琼脂糖凝胶中进行条带分离并转印于尼龙膜(GE Healthcare)。最终用North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit(Thermo)对目标片段的杂交信号进行分析。杂交所用标记探针片段为用27kd基因片段。

实施例1、27-kDγ-zein蛋白修饰因子的剂量效应

玉米胚乳在受精过程中，其胚乳的基因型中有2份来源于母本，1份来源于父本，因此本发明利用K0326Y(一份来源于非洲的优质蛋白玉米，含有27-kDγ-zein修饰因子)与常规玉米自交系B73(不含有27-kDγ-zein修饰因子)设计正反交实验，来检测其27-kDγ-zein修饰因子的遗传表达模式。

结果发现，纯合自交系K0326Y胚乳中27-kDγ-zein修饰因子为3份剂量表达量最高，随后K0326Y为母本(2份剂量)B73为父本(0份剂量)表达降低，然后以B73为母本(0份剂量)K0326Y为父本(1份剂量)依次降低，最后B73纯合自交系(0份剂量)表达量最低，如图2。

实施例2、27-kDγ-zein蛋白修饰因子为顺式作用元件

修饰因子包括顺式或者反式作用元件，其中顺式作用元件指同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列。包括启动子、增强子等。反式作用因子指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质，多为转录因子。

为了验证27-kDγ-zein修饰因子的作用模式，本发明人在数百份普通玉米自交系中发现了一份特殊的自交系XF134，其27kd基因编码序列与大多数普通自交系存在18bp的差异(图3B)，因此其编码的蛋白序列与普通自交系存在长度的多态性(图3A)。因此利用XF134与B73和K0327Y进行杂交后提取授粉18天的籽粒胚乳，反转录CDNA测序27kd基因，通过统计方法计算属于XF134和B73、K0327Y的27kd序列，可以计算出其表达量，进而证明其顺式或者反式作用元件(图3C)。

统计结果最后证明，27-kDγ-zein蛋白修饰因子为顺式作用元件(图3C)。

实施例3、27-kDγ-zein蛋白修饰因子关联和连锁群体构建

通过收集来源于热带和温带的多态性种质资源，可以通过GWAS和QTL定位的方法进行27-kDγ-zein修饰因子的定位分析。最终，本发明人收集了492份玉米自交系及280份IBM Syn10单倍体群体进行分析，其27-kDγ-zein基因表达量存在显著的差异，部分结果如图4A，4B。

实施例4、27-kDγ-zein蛋白修饰因子关联和连锁分析

利用构建好的GWAS关联群体和IBM Syn10单倍体群体，结合二代测序技术和binmap基因分型技术，进行GWAS和QTL定位分析。

最终，在7号染色体120Mb坐标定位到27-kDγ-zein主效修饰因子1个，如图5和图6。

实施例5、克隆27-kDγ-zein蛋白修饰因子

在GWAS和QTL定位的基础上，本发明人构建(B73xMo17)x B73BC1F1回交群体，获得的每一个籽粒分为2份，1份用来提取DNA，另外一份用来提取醇溶蛋白，进而利用染色体步移的方法进行基因精细定位和克隆。

最终，本发明人将27-kDγ-zein修饰因子锁定在7号染色体120Mb附近的一个100kb范围内，如图7。

实施例6、候选27-kDγ-zein蛋白修饰因子区间BAC库测序

三代测序技术具有较长的读长，GC偏好性较低的优点，可以很好的对质粒BAC测序，在保障高覆盖率(500x)的前提下，可以高效的降低测序过程中产生的随机误差，对基因组组装和基因组变异进行检测。据此，本发明利用三代单碱基测序技术对玉米自交系S-Mo17^RF3RF3(在Mo17自交系中转入一个雄性不育基因)测序，挑选到候选区间2个阳性单克隆BAC432和BAC378，每一个序列覆盖率5000x以上，同时结合二代测序数据获得的Mo17Scaffold 4130数据，分析Mo17与B73在这100kb区间内的基因组差异(图8)，最终确认这个修饰因子为27-kDγ-zein基因的一个多拷贝。其中BAC432、BAC378和Scaffold 4130提交NCBI序列号为KU593569和KU593570。

实施例7、功能性标记0707-1的建立

如图8B所示，红色复制区间(虚线框标示处)为Mo17相对B73基因组多余的拷贝，经过测定发现1号基因(27-kDaγ-zein gene)序列间无任何差异。

由于基因拷贝数较难通过PCR等手段测得，因此，虽然确定了修饰因子为27-kDγ-zein基因的一个多拷贝，仍然难以对玉米进行有效地测定以确定玉米中存在27-kDγ-zein基因的拷贝数、进而确定玉米的品质。

为了区分出多余的拷贝(红色区间)与普通自交系的差异，本发明人深入研究后发现，2，3号基因间存在序列多态性。在此基础上，本发明人确定了功能性多态性标记0707-1，该标记扩增产物SEQ ID NO:1(464bp)和SEQ ID NO:2(2070bp)，该标记与所发现的多一个拷贝的27-kDγ-zein基因完全连锁，而在不具有多拷贝27-kDγ-zein基因的玉米的基因组中则只有SEQ ID NO:2(2070bp)扩增产物。因此，该多态性标记0707-1可应用于进行27-kDaγ-zein基因单拷贝还是多拷贝的区分。

以0707-1F和0707-1R为引物，如果存在这一复制区间，则0707-1多态性标记PCR产物为2070bp和464bp两个片段，如果不存在复制区间，则0707-1多态性标记PCR产物只有2070bp这一条片段。

>0707-1(464bp)

taaaggccagccatattctaaaaaattaaaaaaataaaaaatataatttgtagcctttaaacggttaaaaactagctaacatgatatatgtatatagattagaatatgtcatgtcgctaaagtcagcaactatcgacctaaccgaccgtctaacacgttggctccaacaattaccagcgatcggtatctaattatatgtcatacagtcattctgtttgttgcggtatggttacgcatctttgaaaaaacttgacccttccagtttatgccattacccacataaaatccacctcgagacaccacctaaaagtaaagaaaacatttatcaggaaacagattgataatacatgtcactagaccttagttctcgtaagtaaactagtgcaaagaattacctctttgtacaggttataaagatcaaggcgcttggcgttaaggattgcatcaggaaattcagctagtcc(SEQ ID NO:1)

>0707-1(2070bp)

Taaaggccagccatattctaaaaatttaaaaaaaataaaaaaattattttttagcctttaaacggttaaaaactagctaacatgatatatgtatatagattagaatatgtcatgtcgctaaagtcagcaattatcgacctaaccgaccgtctaacaattaccagcgatcggtatctaattacctcttgttcaaccatcgccggctccaacataatggataccgatccaccggtcagcaagcccaccaatcaacaagccaacgttgacaccggatcgccggtccgaccgcatcagtcggtatccggcaacgattactactatgcaaacagtctataggtacaactaggtaagcgtgtccattggtctcttagatagatctaaccgtagatgcaattgtcatttgttaggggaatttttataaagccatacgagatgacagtgaaagagtttaagtgctaaatatgatctacagtgaaccaaaaactcgcttacacgcttgcacctaatagttgtttgtatagtaattgttgccatcggtatctaccgaacaagtcttaggtctatttggttggaatgtgactataaaaaaaattactataaattgtgagttgttaaaaacataaaaattgtttagtggaaatcactaaaagttgctaaaaattcttccatatatatttttacatagttacatttaaaagccgctaaaaacatgttcagatgtgctttcagttttatactgcaagaaaatcggcttttagatgaagaaaaaaaatgcttactaattccaaccgtttggtttgacttttgatttttagagacaaaagccgataaaagcaggtttagaggtgctttcagttttacactgcgagtaagtcaacttctagggaaagttgtttcctatatacaactgtttggtttgactttttggagaaaaagtcaaagccaaaaatcaaaccaaacacacacttgacactgttagatatgatctcttaaaccatatccagcaattcactattgactgcactatttgtatagtggagttcgaatatgaagataagtacgatgacgaagatagtcatactcttagttcaattatatccaatgccccgatgcattacaatttggtccgcaagtcacatgaaaaagagaagcattattgcgccagcagcttcagggcctcacacttccgtgctgttgcatcaaatgtttgattgatccagacaagggaaactaaaaacacaattgagattaatataaacaagaagcttacaccagcatctaaccaactactgtaggagcttgtctgtgttatcagttgttacatgttatataagcctcataataaccactaaattaacgagatgatacattcgaagactactacatacctggaaggccttgcccatctttccatcagcctattatctactctaatgattcttcccataaacatgggaccaaaggaaaagaaaaaaaaaacaagaaaattaagcatttcgtggtacagatgctgtatttgaaaaaccgttagctgcttttggtggtggtggcttcttcttgtagtttgctaagctacagtgggggcagatgtattccaaaccatctgtcttagcgtaatcctgcaagtaaagcacatgatggcatcaagtaactgatttccggcaagggtgagatcaacacaacccatcttcttgtttaccttgaaagtgcctagtccttgtcgtctgtcgcaaccaaagtgagcccattcaccacataaaccgcagttcacccaatctccaggtgcgctactgaaattacataaaaggagctgttagatattaacatgatattagtatttaggcagagatttgaaggaagatgccctcaaacctgtgacaaagtaagcagcattcgccatccacgtcatcatgcgccaactcatattccaacaagtatgtctcgtaatgtcttttcaatgtgttacctacaccctaaatatatacagagaagtgcacagaattagaacatcgcatttagcaggaccagaaaatcaagtatcagaaaactgaaataaatgtcatacagtcattctgtttgttgcggtatggttacgcatctttgaaaaaacttgacccttccagtttatgccattacccacataaaatccacctctagacaccacctaaaagtaaagaaaacatttatcaggaaacagattgataatacatgtcactagaccttagttctcataagtaaactagtgcaaagaattacctctttgtacaggttataaagatcaaggcgcttggcgttaaggattgcatcaggaaattcagctagtcc(SEQ ID NO:2)

引物序列如下：

0707-1F：5’-TAAAGGCCAGCCATATTCTAAA-3’(SEQ ID NO:3)；

0707-1R：5’-GGACTAGCTGAATTTCCTGATG-3’(SEQ ID NO:4)。

实施例8、功能性标记0707-1的验证

为了验证前述确定的功能性多态性标记0707-1，本发明人以0707-1F和0707-1R为引物，利用PCR技术检验了36份QPM自交系。

结果显示，所有的QPM自交系都存在这一复制片段，如图9。

同时，本发明人还利用该标记对3份近等基因系CM105，CM105o2及CM105Mo2进行验证，结果显示CM105和CM105o2无拷贝序列，CM105Mo2存在拷贝序列，与27kd表达量显著相关，如图10。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种鉴定优质蛋白玉米的方法，其特征在于，所述方法包括：对待测玉米进行检测，确定该玉米中是否存在27-kD γ-zein的主效修饰因子，若是存在则表明该待测玉米是优质蛋白玉米；其中，所述的27-kD γ-zein的主效修饰因子与SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸或其互补链完全连锁；以及

确定该玉米中是否存在核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸和SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸；若是同时存在SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸，则表明该待测玉米是优质蛋白玉米。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对待测玉米进行检测的方法包括基因测序方法。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对待测玉米进行检测的方法包括：PCR扩增方法；或Southern杂交方法。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是PCR扩增方法，包括：以待测玉米基因组为模板，以特异性扩增SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸的引物来扩增，若同时获得针对该两条序列的扩增产物，则表明该待测玉米是优质蛋白玉米。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的特异性扩增SEQ ID NO: 1和SEQ IDNO: 2所示的多核苷酸的引物是SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示序列的引物。

6.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸包括：核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸。

7.如权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸还包括：核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸。

8.如权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸能由引物对扩增获得，所述引物对是SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示序列的引物对。

9.权利要求6-8任一所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于鉴定优质蛋白玉米。

10.一种用于鉴定优质蛋白玉米的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含特异性识别核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸的试剂和特异性识别SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸的试剂；所述试剂是SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示序列的引物对。

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