CN108004236B - 玉米茎腐病抗病分子育种方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学，具体公开了一种玉米茎腐病抗病分子育种方法及其应用。本发明提供的与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记可用于茎腐病抗病分子育种和玉米种质资源分析，同时具有成本相对较低和应用灵活性高的特点，可实现高通量检测。所述分子标记为JFB‑3，JFB‑4，JFB‑5，JFB‑6，JFB‑7，JFB‑8或JFB‑9，可由SEQ ID NO.8～28所示的引物分组扩增得到。

Description

玉米茎腐病抗病分子育种方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记。

背景技术

玉米茎腐病，也叫茎基腐病，是世界玉米产区普遍发生的一种重要的真菌性土传病害。近年来茎腐病在我国部分地区发病较为严重，根据广西、浙江、湖北、陕西、河北、山东、辽宁等18个省区调查，发病率一般在10％-20％之间，严重年份可达50％-60％，减产约20％，重者甚至绝收。发病时期一般从玉米灌浆期开始，乳熟后期至蜡熟期为发病高峰期。发病时一般从根部开出现腐烂，然后病情往上蔓延出现明显病叶青枯至全株枯萎，节间变淡褐色，果穗苞叶青干，穗柄柔韧，果穗下垂，不易掰离，穗轴柔软，子粒干瘪，脱粒困难。玉米茎腐病在乳熟后期，常突然成片萎蔫死亡，因枯死植株呈青绿色，故也称青枯病。从最初出现病叶到全株出现发病症状一般在一周左右，历时时间短的仅1-3天，长的可达15天以上。

目前玉米茎腐病的抗病鉴定主要有田间自然发病鉴定和人工接种鉴定。田间自然发病鉴定主要是在茎腐病高发病区进行田间自然鉴定。人工接种鉴定利用茎腐病病原菌侵染玉米植株，将病原体均匀的接种于根部附近，在玉米乳熟末期、成熟期调查病株率与病级。

玉米茎腐病田间表型的鉴定主要是以发病率和病级两种方法，发病率是发病株占总株数的百分比，病级则是指植株个体的受害程度。如分别以1、3、5、7、9级分别代表抗性级别极弱、弱、中、强、极强5个抗性评价的标准，则1级的表型：全株枯死且倒伏，茎基部维管束破裂，籽粒干瘪；2级的表型：株叶片出现典型青枯症状，茎基部明显变软但不倒状，果穗下垂，籽粒不饱满；3级的表型：全株叶片出现典型青枯症状，茎基部变色且稍有水浸状，果穗基本正常；4级的表型：全株叶片出现青枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常；5级的表型：全株生长正常，中下部叶片出现青枯/青黄枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常。

实践证明，种植抗病品种是防治此病经济有效的根本措施，而且我国抗源丰富，为选育工作和利用抗病品种提供了保证。同一玉米自交系对茎腐病的抗性，只有不同地区和不同自然条件下都能保持一定的抗性水平，其抗病性才能稳定可靠，用其为亲本所配制的杂交种在生产上才能有较好的抗病性能。因此在常规育种中往往需要多年多点的鉴定才能确定育种材料对茎腐病的抗性级别，这大大增加了品种选育的时间和成本，而通过分子标记的手段直接筛选出抗茎腐病的育种材料可以在很大程度上提高育种效率。分子标记辅助选择利用与抗病QTL紧密连锁的分子标记对群体中含有抗病QTL的单株进行追踪，用标记的基因型来确定单株的抗病性。

SNP标记是在基因组中分布最为广泛的分子标记，其二等位基因的性质使SNP标记的检测容易实现高通量和自动化，目前在玉米研究领域，SNP标记也已经开始得到广泛应用，以SNP标记为基础的抗病辅助育种是玉米分子育种研究和应用的重要领域。KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。实验流程主要包括：

1、准备：1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的PrimerMix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2)带有不同荧光的两条检测引物Master Mix；3)DNA模板；

2、PCR反应：1)变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；2)等位基因特异性的末端序列的互补链合成；3)信号产生-特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。

然而，对于茎腐病的抗性鉴定，田间自然鉴定方法虽然方便快捷，但往往受年份、气候和地理位置等因素的制约，影响鉴定的准确性和抗病品种的筛选。不同年份和不同地区病害的发生情况有所不同，在不同环境条件下自然发病鉴定玉米种质资源抗病性时，相同材料通常得到不一致的鉴定结果。因此该方法进行病情预测和植株抗病性鉴定难度较大，常致使玉米茎腐病的研究工作不能顺利进行。相对于田间自然鉴定，人工接种鉴定的稳定性和重复性较好，但是存在接种过程比较复杂，病情鉴定标准不一，耗费人工等缺点。

不仅如此，传统的分子标记辅助选择存在一定的局限性，以SSR标记为例：1、与抗病QTL紧密连锁的SSR分子标记在后代群体中有可能发成重组，造成分子标记辅助选择的偏差；2、与抗病QTL紧密连锁的SSR标记并不是功能标记，只能对在该标记位点具有多态性的亲本的后代群体进行选择；3、SSR分子标记基因型检测往往采用聚丙烯酰胺凝胶技术进行检测，但是这种检测方法操作流程比较繁琐，而且检测过程中涉及有毒试剂的使用，会对人体健康造成有一定的危害；4、由于SSR分子标记的特点和其检测流程的复杂性，难以实现高通量检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记，所述分子标记为JFB-3，JFB-4，JFB-5，JFB-6，JFB-7，JFB-8或JFB-9；

其中：

所述分子标记JFB-3由SEQ ID NO.8～10所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-4由SEQ ID NO.11～13所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-5由SEQ ID NO.14～16所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-6由SEQ ID NO.17～19所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-7由SEQ ID NO.20～22所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-8由SEQ ID NO.23～25所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-9由SEQ ID NO.26～28所示的引物扩增得到。

进一步地，前述用于扩增所述分子标记的特异性引物也属于本发明的保护范围。

第二方面，基于前述研究成果，本发明提供了所述分子标记及其特异性引物在玉米茎腐病种质材料抗性鉴定或抗性基因检测中的应用。

以及所述分子标记及其特异性引物在玉米茎腐病抗性标记辅助育种中的应用。

具体表现为，一种玉米茎腐病抗性标记辅助育种方法，包括检测前述分子标记的步骤。

所述方法的具体步骤如下：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用所述特异性引物进行竞争性等位基因特异性PCR(KASP,Kompetitive Allele Specific PCR)反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而确定样品对茎腐病的抗性。

本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记，可用于茎腐病抗病分子育种和玉米种质资源分析，同时具有成本相对较低和应用灵活性高的特点，可实现高通量检测。

附图说明

图1为本发明采用的KASP引物设计的方法和原理。

图2为本发明利用KASP引物JFB-3对玉米材料的检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 SNP标记的开发路径

本发明通过比对已经克隆的茎腐病抗病基因(如SEQ ID NO.29所示)和感病基因的序列(如SEQ ID NO.30所示)，找到两条基因序列之间6个SNP位点、2个小片段插入/缺失位点和1个转座子插入/缺失位点，共计9个差异位点。

根据上述9个序列差异位点的特点和类型进行KASP引物设计，用于检测这9个序列差异位点的基因型。

提取上述9个差异位点及两侧各100bp的碱基序列，与玉米B73_AGPv3参考基因组进行比对，比对结果显示，这7条序列都只能比对到基因组上唯一的物理位置，是非重复序列，因此可以对这9条序列进行引物设计。引物设计采用KASP引物设计原理，方法如图1，设计完成后合成KASP引物，编号分别为JFB-1，JFB-2，JFB-3，JFB-4，JFB-5，JFB-6，JFB-7，JFB-8，JFB-9。引物列表见表1。

利用LGC生产的高通量实时荧光检测系统IntelliQube，水浴PCR仪Hydrocycler-16对设计的KASP标记引物进行验证。

实施例2 玉米材料分析结果以及KASP标记验证

选取384份玉米材料(其中两份材料为抗茎腐病材料，含有Seq No.29所示抗病基因序列)，对KASP引物JFB-1，JFB-2，JFB-3，JFB-4，JFB-5，JFB-6，JFB-7，JFB-8，JFB-9对这384份材料进行基因型检测，检测结果显示JFB-3，JFB-4，JFB-5，JFB-6，JFB-7，JFB-8，JFB-9可以在这些材料中进行扩增，说明这7个KASP引物组合可以对玉米材料在这7个多态性位点进行基因型分型。其中已知含有抗病基因的两份材料在这7个位点的检测出的基因型与其本身的基因型一致。

实施例3 利用KASP标记进行分子标记辅助选择

利用开发的茎腐病KASP标记对6个回交改良抗茎腐病群体进行分子标记辅助前景选择。

提取1个供体亲本和6个受体亲本的基因组DNA，利用7个KASP标记对亲本进行标记多态性筛选。经过筛选，KASP标记JFB-3在每个受体亲本和供体亲本之间都具有多态性。

利用hotshot法提取6个回交群体的1123份叶片以及亲本叶片的DNA。

利用LGC高通量SNP基因型分型平台对这1123份DNA进行KASP标记基因型分型，部分分型结果见图2，图中右下角红色的点表示这些样品的基因型为纯合感病基因型，中间紫色的点表示这些样品的基因型为杂合抗病基因型，左上角的点为供体亲本，基因型为纯合抗病基因型。

筛选出515份具有杂合基因型的DNA样品。该DNA样品对应的单株携带有抗茎腐病基因。

将这515份DNA样品用普通PCR的功能标记进行验证，结果显示KASP标记JFB-3检测出的抗病基因型和功能标记检测出的基因型一致，这也再次说明开发出的KASP标记的准确性。

所述普通PCR的功能标记如下：

抗病标记：

JFB-F：ATTCTCAATCCAAGGTGCAG；

JFB-R：GCACAAGAGAGATGGAGCATT；

感病标记：

JFBS-F：AAACGCTGACACTTCCGACT；

JFBS-R：TGCTTCCTACACGTGTCGAC。

实施例4 高通量的分子育种方法

利用开发的抗茎腐病KASP分子标记，结合高通量的DNA提取方法，LGC高通量分子标记基因型分型平台，实现了玉米抗茎腐病的高通量分子育种。主要流程如下：

样品准备。对玉米籽粒单粒进行取样，剪取玉米籽粒的部分胚乳，在不伤害胚的情况下，该籽粒可以继续种植。

DNA快速提取。采用Hotshot法对玉米籽粒单粒进行快速DNA提取。Hotshot提取DNA的方法不仅在试剂耗材成本上低廉，而且整个流程的耗时非常短，在大规模提取DNA时可以节省大量的人力物力和时间。

高通量分子标记检测。利用LGC生产的高通量实时荧光检测系统和水浴PCR仪，对DNA样品进行高通量的分子标记检测

优良样品追踪。根据对DNA的分子标记检测的结果，追踪到相应的玉米籽粒，在育种时只对优良的玉米籽粒进行播种，可以节省50％-75％的播种面积。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司

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aatctaatca aatatgagaa attttgactg acatgtatga ccatactatc aattatttta 4260

ggacagaggc atggagtgcg catttgtatg gtcgaaatcg atcaattgta accatatatg 4320

catgtacgtt tggtacgccc actgatgtat ctacctggtt aattaattag atgacctagc 4380

ttgtcgtctg attgttatga ttaaagaacc aaaaagtcta ctcagctcaa aacccaaata 4440

tatatgtgtc aaacaactcc catgcacatg tccagctgtg tctaaatcta tcccgaagga 4500

ttgtccatgc caaagtttga tgaaatagat aataagttgt ctcattttat gtggttcgtt 4560

tttgcagatt tgctgcttac tctttcgtat acttggattt tatagggaac taatatatac 4620

atatgattat aattaatgca ctttattccg tgccacatgt agatgaataa cgcaatcaca 4680

tggcttaaga tctaatattc taccccaaaa caaatcgagc taccaaggcg atatctgatg 4740

ttcatcaggc atgcatgtag gcccattcag catatcaagc aaagtacaga ttcttatcca 4800

aaccatgcat atacatatga ccaaagtact aattaattag ttgcctgcag ttattagctg 4860

tccaaaattt gctttgatca tcatgcaata atatacacat gcagaaacta aaatgaataa 4920

catatataaa tccatgcatg cacatgcagc atactaatta ttgctattaa ttaattgcag 4980

atgtcattct ctgggagcac attcacggac gctgcaagca aggagccagc actgatcgac 5040

gacggcaatg agctgcaaat gccggtagat cagtcgtcga cggagaggga ggttaagttg 5100

atgaggtaca aggagaagag gatgaggagg tgctttgaga agcagataag atatgcatcc 5160

aggaaagcct atgcgcaggt gagacccagg gtgaaaggcc gctttgccaa ggtaaccgaa 5220

tga 5223

<210> 30

<211> 10193

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tggccactgt atcccatctt tatttccttg ctatattaat atacggattc tcaatccaag 60

gtgcaggcgt acccgaatca aatcaaatat gaggctatct atctatctgt ctatctattc 120

ctgcagcacg aaccacaagc atgacgaccc aatggcaatg gaggtcgaga tagatggata 180

tctccgtagc tcactacagg aaaacgacca gtttccgacg gcctacactg tttccgacgg 240

ttcttagggt accgtcggaa atagccttat ttccgacggc cttcggccag ccgtcggaaa 300

taagtctatt tccgacggcc caccaccttg gccgtcggaa ataattcaat ttccctaacg 360

tcgtccgtta ccccgcgcac ggacgcacac aacgcacaca cgcccgcaca gccgcgcgcc 420

cgcacaccca ccgcgccgcc gccgcccgtc cgccgccgtc gcccgcacag cgcgcccacg 480

tccctcgtcg acgtccgcgc cgccgcccgc acacccacgt ccgcgccgcc gcccgcgtcc 540

gcgctgccgc ccgcgtccgt gccgccgccc gcacagcgcg ccgccgccgc cccggaggct 600

cgccggagac gccagagacg ccacacgagc cccgacagcg cctcgaaggt ggtgcagcgg 660

ccgagggcgc cgtcggcaag cgtcagcccg cggacgcgct ccagccggtc cgggtcgaag 720

cagaaggagc ggtactgcag ctcctgcgcg ccgtagagcg ccgacgtgtc ggagacgtcg 780

gggatctcgg cgaactcgtg gtgcgggaag gtgtgcaccn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 900

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc cgcggcctcc ccgcccctgg ccagcgccgc ccgtggccgc 960

cgggacctcc ccgccttggc cgccgcgtta cccgaggccg cagccgtccc caagcccgag 1020

gccgtcgtcg agtcttgtca cgtgagcgcg cgcacgtggc cgttcgcacg ggcccgaacg 1080

tggccgcacg tgagcgcgcg cacgcagctt cacaccggtc gccagtcgtc actcctgtgg 1140

gcaattcagg taatttttaa ctttattaat gtcatgttgt agtataatgt gatgctgtag 1200

tataatttga tgtgatgttg tagtataatg cgatactata ctaaaatagg tttaaactta 1260

tgcgtcaccc gtttcggtcc aacacattgc ttaataaagt agtgtgttgt accgaaattg 1320

tccctttttg gacagcctta gagtgaacga catatcaaat atgatttatg attagtcaat 1380

gagtttgagc gagatttcga cagcataacc ctcttgttct ccgttgcacc attacgggcg 1440

tgcaatggag aacaacaggg ttatgctgcc gaaatttcgt tcaaactcat tgacttatca 1500

taaatctgtg atatgtcgtt cacccttagg tgggtttagg acctatcctt tcctataatt 1560

gtaggaccac cggctcataa tatatctaga aattaatgaa cttgtcttga tctttaatta 1620

gtcgaacgat gggtgatagt cgtcgctgga tgtatgaagg ctggcgaaaa aatgatcctt 1680

cgcttgagtg gatacagaaa accgaagatt ttatcaatcg tgttttttct tcgtcaagaa 1740

atggtcgagt gtggtgccca tgcagtgttt gcaaaaatta tcaacgtcaa accaagaaag 1800

agatgtctgg tcatctttgc aaaaatggct acgtgccaaa ttatgaagtt tgggtgcatc 1860

atggtgagga gcttccccgt ggatatgctc cagaaggtca agacgatttt gacccggatt 1920

tagaccgaat ggaggagatg gttcaggatt taagagagga tcccgattta gtgtttccag 1980

ataatcctga ggatcctcaa ccgccggaag ttaaaaaatt ctttgaactt ctcaaggcag 2040

cagaagagcc gttgcacgaa cacacgagag taaccattct tgcttttgtg acgcgactta 2100

tggctatcaa gtctaagttc gcattctcca tcaactgctt aaatgaactt ttgaatttga 2160

ttagcgacgt attaccacca gatcacaaaa tgcccaaaga catataattt tcaatatgca 2220

ggatggcggc tcgaaagttg aagaattttg tgaagggcat gacgaagggc tcttcttctt 2280

cttcaggaag aagcaaagca caggagtgtc tgttccaggg taccgagtcg ctctcgagca 2340

acagacgaca ggctttgatg gaacatcttc cacctgatat gcatggacag gtgtgattac 2400

tctaaattat tattttattt caatatagta atgtttatat gaatctaatg attaaagtgt 2460

ttcatgtgca ggatgttaac gagactcgag aggaggaggc aaggggtgag gatgcggccg 2520

attacgatgc ggccgatgca gactatgagc aggaagatga tgctggaggt ggaggtggag 2580

atgggtggtc ttccggtggt ggtcagtttg agggtggatg gtcagcaggc ggatgggact 2640

catggcctag cagtgatgct ggagcttcta gtggtggagg gtcttctcgg gcacggaagt 2700

cgaggaaaac acattgggtg cctcctccta aagttcctgc tcgtgaggag gataagattt 2760

tgatcgtacc gtgtggcgac gagtgagttg attctaatgt taaatatttg ttcatgcatt 2820

atatgaaatt tgttaatgct tcttttgtac aatgtggttg caggtcttgg attgatgcat 2880

cttttcaagg tcaaggacgt cgcacacagg tgaataaagt tttgggaagt atatgcaaat 2940

atctctggcc tggtgtagtg atggagaaag gcgttgaggt gccttgtatg tcttgggatc 3000

agtacgggct cgcgtttaat gcggaacata ggaatgccca aggtgctgtg tggcatgagt 3060

tctgggtatg ttctctagcc caacttgaat tgattcaact atacaatgtg ctaaaaatct 3120

tgtttcttgt ttttttcaga aacgttacaa gttgcctgaa gatggaagta tgaacgatcg 3180

tgcacggatc gtttttaaca agagcgcgac taccttggtt agggatcaga tgtattatgc 3240

tcggatccag gtcacttctg attacatatt aaggcaggaa ggacgtcggc cacgttccaa 3300

aagtgaggca tcaaacaaat acttaaccga agaagaatat cttgaggtaa attgttttta 3360

tcctaattca tgtccaagtg ttagtactaa caatacattg gatcgaaata aagttttcag 3420

actcggtgcc atggatggca tcaaatgagg ctggttggcg ggctgtatgc aaatattggg 3480

caacagatgg atttaaaggt gtttcaatga gaaacagctc aaatcgtggg catgatgttc 3540

accacagata tggtggtgat ggccacgttc gtttggcaaa gcgcatggta agtgtaattt 3600

atggtcgtgc atatcatgaa tcttctatgt gtttatgtta ttttctcttg cctgtaggaa 3660

gctagttctg gtgttacgcc gagtgatgtt caggtttacc ttagaggtca cagggggtcg 3720

gatcctacaa atccagaaca gttgtgttct cagtcagctg ctgagcgtgt ggtgagactt 3780

tcgcaactag ttacaatgca cttctattct aagagtcgag aaaaatataa ctgcattgtt 3840

tattatttgt caggcctcat atggtgcttc catgatgtcg gagcatgggc aagactatga 3900

ttggatgaat catcctatcg atcctcaggt tgtgtatgct agtggaggcg gaaaacctca 3960

tggacggtga gtttgctatt attaattcgt cgatttgatc ttttctaaca tgatgtgttg 4020

cgtgtttaac ttctttctat tttttctagt taccccatgt ttggtagtgt tatcgactcg 4080

actcaggtga ggcctgaaag gtctcgtcca tcgaggtcgt ctagccgtgg tcctcgctct 4140

agtacccaag gaaacgccga gctgatccgg atgcaggaag ctttgaggcg gcaggaggag 4200

tataacaagc aacaacaaga gtactgggct gctcaatttg cacgacaaca ggagatgatg 4260

caggtaatta gatcctcgtg agcctctact ataattggag cacatatttt ctaatatatc 4320

ctcgtaacat agctttcaat ttctttcagc aaatagcact agggcaacgt ccagattttt 4380

cagcgatgac tatgccacct cctccaccta tcccgcagtt tgtaccgact ccacaattta 4440

gttgggccac acctgcacct caggttatat tacttgactt tttcttttga cgttgcataa 4500

caagaattta actactaaca tttttttgaa tgttgtaggt ccctccagga aacttgctaa 4560

ctccgggaaa tgaggactct gaagatgcgg tcgcttcttt tgtggacggt cttctaaaca 4620

gtggaggagc tagcagatca aatcaaccac atccatttga tcaacctcct ccattttgag 4680

tagcctgtct gcttgtgttt ttctcgtact atggacttgt gaacttgtgg tattgggaac 4740

ttgtgttatt gtgaacttct gaacatgtga acttgtgaac ttgtgaacat tgtgaatttg 4800

tgctttaact tgtgaacttg tgctttaact tgtgaacttg tgttattgtg tgtttcatgt 4860

ggtattgtat gtgattctgg atgaaaactg gatattgtgt acagattgaa tctgtgtgat 4920

tgtttgtaaa acaaaaagca gacaaattct gtttctctgt tttttaatta tttccgacgg 4980

ccgcttattt ccgacggccc cgtcggaact aagctgtgac ggcgtcaggc gccggcggcc 5040

ggccgtctgc ggggcccacc tcgctttatt tccgacggcg ctaccctggc cgtcggaaat 5100

aagtttactt ccgacggccc cgtcggaaac gctgacactt ccgactgggt atcccctacg 5160

gcattacttc cgacgggacc cgtcttaagc cgtcggaagt aactatttcc gacggttcag 5220

aacttatttc cgacggttta ggccgtcgga aactggtcat tttcctgtag tggctactag 5280

ctatagcttt gttaaaaggc agcagcaaaa ttcgaagctg gggccagcgg ccattgattc 5340

ctgatggatg cacatacgtg catccatatc gatgctgtcg ctgcctccgt cgtctcgtct 5400

cgccacaacc gcgctacacg caaaagctat gcggattctg tttctgtgta aacaaccaac 5460

actctcttta ttccaatgga caatgctcca tctctcttgt gccccccgca ggacagaatt 5520

ggctaggcgg cgattccacg tgccatcaca tttccaattc tgaagttagc ctatcccacc 5580

gttgcttcct acacgtgtcg accatccgga ccatatatag acagctatac cacacccgcg 5640

tggatgcatg catggctcat cccttacttg tgatgtatag acaattcaca ctatatatat 5700

atatatatat atatatatat atatatatat attgctttga tttttgatct ctgatatata 5760

tatatcgcca gcatattatc actggcacca cttatcctcg ctcgatctct cagaaacaat 5820

aataacatag agagtttata tagttcgaac attagtatcg ttttttattt gcaatagatt 5880

ctaatgtaac tctttagtac tggttgtaac aaaaaaaaac cagtactaca tactaagttt 5940

tcaacaacaa ctgatactaa aattatttta ttagttttct acaaacaata tgatattaac 6000

agagagtaca ttaataatta tgtgcatata caaatataca agttctttcc aatggatatg 6060

tgcacataca aaaatacaag tactttccaa tagatatgag cagatacaaa catacaaaca 6120

tccaaatata catatagctt ctttattgaa tatataaatt ttaggagagt acatattata 6180

tatttttagt acaaggaaag tgtgaaaaca cgtctgattc ccttctctat tttttcgtct 6240

cagttcctgc ttcttcccaa acctattact gcaaccctac ttcctcttgt gcggaggtta 6300

ggtcaaggga ttccaaacca actacgggtt taatgtgagg gacgaagatg ctcttacaac 6360

caactagccc ttgaagtagg aaatagaatg tattttctta tttcctgcca taggactagt 6420

tcatttttca agatcttctc catttcacta tgaccaatgc gaggatggtt tctatgaaaa 6480

aaatatacaa aacagaaaaa atagagttca aaacaaatgg tgtaatagtt atatatggac 6540

agtaaacaaa aaataaaaaa catggatgaa tatcattttg cgaatgtgta aaaaatactc 6600

gaggcacgtg acatttgtgt tgtattgata attaacacac tatgtgacat ttactcaaaa 6660

ctttcattgg tactcaacac gtccggtgct cacgaatgag aaaggcaggt tgcgcttata 6720

ggagacaccc ctagccaata acttgtacca aatccttcac ttttagtgtt ggttatttaa 6780

aagaatcggt gctaaactaa ttttggcggg aatttcaatt gctctggcag gattggaaaa 6840

tatctttcta tatcggttct ttataaaaaa cggttctaaa taaacacaat atttccaacc 6900

agtactaaag acttaaaatt tagtatcgat tctataaaag aaccgatact aaagatattg 6960

gagatgttct cttcgaataa tccatagaga aaaaacactg tggaagctta gtgcagatta 7020

aagtcaagcc taattagtgc tggttcttag gttgaactag cagtgctaga taacttaata 7080

ttaagtatta gttgcataca acaacccata ctgatatcat atcctctgca cggactatat 7140

tttaaaacgg tgctaaagct agtactaata ttggaacaaa taaaattgga cggaaacccc 7200

attctccggt agggaataat gatttgtttt tcttcttgca ctttaatttg tttagtttat 7260

attctcgcta gcttgacgac ataaatacat gtgtgtagat agaacattgc ctatataccc 7320

agagatggag tctcgtccat gcatatctat tcggcagcgg gcattggcta ccagattctg 7380

cgatatggaa catctgcttt tctttctgct gcttcgtctc tggcctttgc ttttccttca 7440

ctacgactta aataaaagta actagcccta gcagctagct atcaagcttt atttatctgc 7500

tccttcctcc atctccctgc tggcctgcct gatcagtata tataactctc aattccatca 7560

acaaatctcc ctcccaagct agtcgatcca tcttgtgcac acacagcgga tatacctctc 7620

tatcgatcaa cagcggccat gtcgtcgggg ccagcagcat gcggtgtgtg cggcgcggcc 7680

gcctgctgcc cgcacctctt gcacaccggt gacggcaacg acgacgacct catcagccgg 7740

gccttcttct ccgtcttccc tgtcgtcggt catcaccgtc gtcatgagtc caccagcagc 7800

cccgccatgc agcagccatc ggggtgcctg cacgagttcc agttctttgg ccatcaggac 7860

gaccaccacc accaagaaac catcgcctgg ctcttggacc acccaccgcc acctgcgccc 7920

gagcttggcg gcgacgacgg cccgtcccca gctggtgatg agaacgacga ccagcctgcg 7980

tttcacccgt ttgggacacc acagtaccac caccccggaa aagggaacgg gaacgggctc 8040

acctttgagc tggacgccac gctgggcctc ggcaccgcgc ggcaaaccac tgagacagca 8100

gaagcaagcg ccaccatcgt aagtattgct cccgaattat cttaagtaag ttcagataat 8160

tcacatgcat ggtttctaat tggaatttgg tcccaagctg gacacccttt ttttatcttc 8220

cgttttctca actctcttat cgatcacctg cataaaggac ctttgtatca agtaccaaga 8280

gatcttgcca tgagttgcac tttacgcaca tttttttttc tttttttttt tcaggaacgt 8340

actactcttc ctatatatca atatatgtaa acaagattaa catgcatgtt tctaaccttt 8400

ctcaaagaca aaagacactc tggtgcacga aatggatgga agaaaccaga tcattaatat 8460

atgcctcaca acctcttcat gaatttaatt tgatgtggaa agaataaaaa cgacggttcc 8520

ggttgttaac ccaatattca atgatatcct gaacaaaact agctatagat ctcaatcata 8580

gcatcaggca tcagcgcttc caaagttctc acctgacttt ttttttactc aatctccaga 8640

ttatatttcc ttcctacaaa gagtcggaga gaacatagcc atgagttaaa tcactgatgt 8700

tgtaaataca gaccagtagt caaaagcatt gactatacac taaaactatt gttcaaggtc 8760

actatttcac aaaaaaattc attgcctatt tgatagtttg attgagaggt agcaatattg 8820

ccaaatttat ttttcacgta cctagacaaa agtcggtagc aatattgcca attttattgc 8880

tccatcgtca tatgcatccc gaagtctatt attgctgtaa tgacaagata cagatctttt 8940

atattgtgat atacttactt aagttttata ttgaagataa aagggagaaa gcagcttgcc 9000

tccctttctt tttcttcacc actatatata ttggattgtt tcttcaccac tatatataca 9060

agaaaatatt aatatctgca gtacatattt agtgtcatta aatatgtctt ttgaaactat 9120

tttcataata aacatatttg aagatacatg tattgcaaat attttttacg aatctaatca 9180

aatatgagaa attttgactg acatgtatga ccatactatc aattatttta ggacagaggc 9240

atggagtgcg catttgtatg gtcgaaatcg atcaattgta accatatatg catgtacgtt 9300

tggtacgccc actgatgtat ctacctggtt aattaattag atgacctagc ttgtcgtctg 9360

attgttatga ttaaagaacc aaaaagtcta ctcagctcaa aacccaaata tatatgtgtc 9420

aaacaactcc catgcacatg tccagctgtg tctaaatcta tcccgaagga ttgtccatgc 9480

caaagtttga tgaaatagat aataagttgt ctcattttat gtggttcgtt tttgcagatt 9540

tgctgcttac tctttcgtat acttggattt tatagggaac taatatatac atatgattat 9600

aattaatgca ctttattccg tgccacatgt agatgaataa cgcaatcaca tggcttaaga 9660

tctaatattc taccccaaaa caaatcgagc taccaaggcg atatctgatg ttcatcaggc 9720

atgcatgtag gcccattcag catatcaagc aaagtacaga ttcttatcca aaccatgcat 9780

atacatatga ccaaagtact aattaattag ttgcctgcag ttattagctg tccaaaattt 9840

gctttgatca tcatgcaata atatacacat gcagaaacta aaatgaataa catatataaa 9900

tccatgcatg cacatgcagc atactaatta ttgctattaa ttaattgcag atgtcattct 9960

ctgggagcac attcacggac gctgcaagca aggagccagc actgatcgac gacggcaatg 10020

agctgcaaat gccggtagat cagtcgtcga cggagaggga ggttaagttg atgaggtaca 10080

aggagaagag gatgaggagg tgctttgaga agcagataag atatgcatcc aggaaagcct 10140

atgcgcaggt gagacccagg gtgaaaggcc gctttgccaa ggtaaccgaa tga 10193

Claims (8)

1.与玉米茎腐病抗性相关的KASP分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合包括JFB-3，JFB-4，JFB-5，JFB-6，JFB-7，JFB-8和JFB-9；

其中：

所述分子标记JFB-3由SEQ ID NO.8～10所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-4由SEQ ID NO.11～13所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-5由SEQ ID NO.14～16所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-6由SEQ ID NO.17～19所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-7由SEQ ID NO.20～22所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-8由SEQ ID NO.23～25所示的引物扩增得到；

所述分子标记JFB-9由SEQ ID NO.26～28所示的引物扩增得到。

2.用于扩增权利要求1所述分子标记组合的特异性引物。

3.权利要求1所述的分子标记组合在玉米茎腐病种质材料抗性鉴定或抗性基因检测中的应用。

4.权利要求1所述的分子标记组合在玉米茎腐病抗性标记辅助育种中的应用。

5.一种玉米茎腐病抗性标记辅助育种方法，其特征在于，包括检测权利要求1所述的分子标记组合的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用其扩增引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而确定玉米材料对茎腐病的抗性。

7.权利要求2所述的特异性引物在玉米茎腐病种质材料抗性鉴定或抗性基因检测中的应用。

8.权利要求2所述的特异性引物在玉米茎腐病抗性标记辅助育种中的应用。

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