CN109182557B - 一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO:1核苷酸序列的第68位，其碱基为G或A，通过本发明公开的该SNP分子标记和KASP引物组，鉴定或辅助鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度大小，本发明公开的SNP标记能够有效应用于瓦氏黄颡鱼的亲本选育和分子标记辅助育种。

Description

一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的SNP分子标记 及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于KASP技术鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的SNP分子标记及其应用，属于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域。

背景技术

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)是黄颡鱼属鱼类中个体最大的一个物种(体质量达1850g以上)，与黄颡鱼(P.fulvidraco)并为该属最具经济价值的两个物种，目前养殖热度很高的水产新品种杂交黄颡鱼“黄优1号”是采用瓦氏黄颡鱼作为父本、黄颡鱼作为母本杂交得来，具生长快、体色诱人、抗病力强等优势。在水产新品种培育中，重中之重的环节便是亲本选育，而目前水产新品种杂交黄颡鱼“黄优1号”中作为父本的瓦氏黄颡鱼相比母本黄颡鱼，在种质改良方面的研究明显滞后，鲜有报道。在瓦氏黄颡鱼繁养殖规模迅速扩大的同时，存在着诸多育种问题，如耐低氧能力较黄颡鱼差，密度过高、连续阴雨或高温天气等带来的水体低氧会导致其翻塘死亡，致使瓦氏黄颡鱼池塘高密度养殖较少；肥满度是鱼体重量与鱼体体长立方数的比值，是反映鱼类肥瘦程度和生长情况的指标，而原有的捕捞野生亲本繁殖制种或多代近亲遗传方式导致了瓦氏黄颡鱼经济性状退化，肥满度变小。当务之急需对瓦氏黄颡鱼进行遗传改良，最有效的方法之一就是开发DNA分子标记，找到与耐低氧、肥满度性状连锁的标记，从而为该鱼的分子辅助育种提供遗传依据，这也是瓦氏黄颡鱼及杂交黄颡鱼“黄优1号”繁养殖业可持续发展的必备前提。

相比传统的分子标记(SSR、AFLP或RAPD等)，SNP作为第三代分子标记技术的代表，具有多态性好、广泛分布于全基因组的特点。如今，SNP分子标记技术已应用于水产动物耐低氧性状SNP标记开发中，如团头鲂(Megalobrama amblycephala)低氧诱导因子抑制因子研究中，在cDNA和启动子序列上3个SNP多态性位点与耐低氧能力显著相关；再如凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)筛选出过氧化氢酶基因上一个低溶氧耐受性相关的SNP标记(A/G)，以上这些SNPs位点对水产动物基因功能探究和分子辅助育种提供了重要的理论依据和实践经验。

但目前尚未见到有关瓦氏黄颡鱼与耐低氧能力、肥满度性状相关的SNPs研究报道。

发明内容

发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供一种基于KASP技术鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的SNP分子标记及其应用。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的SNP分子标记，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO:1核苷酸序列的第68位，其碱基为G或A。

利用上述SNP分子标记进行检测，即检测待测瓦氏黄颡鱼12连锁群141cM位置的基因68bp处的SNP位点基因型是GG还是GA还是AA，根据所述待测瓦氏黄颡鱼的基因型确定其低溶氧耐受性和肥满度大小。待测三种基因型的瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性能力为GA>GG>AA，肥满度大小为AA>GG>GA。

所述瓦氏黄颡鱼12连锁群141cM位置基因的核苷酸序列如序列SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1：

CATGATATATAGAGGAACCTCATTACAGTACATCACTATCTTCACCCGGAGAAACTGAGCAACATCTAGAAAGTTTTTTAACAGCAACTTAAATATCTGAAAGAGCAATGTTTTTAAAAGTTGTCAGAATTAAGACGTTTGCGCCATTTG。

一种用于检测所述的SNP分子标记的KASP引物组，所述KASP引物组由FAM正向引物、VIC正向引物、COM反向引物组成；所述FAM正向引物如SEQ ID NO:2所示；所述VIC正向引物如SEQ ID NO:3所示；所述COM反向引物如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:2：FAM正向引物：CCGGAGAAACTGAGCAACATCTA

SEQ ID NO:3：VIC正向引物：CGGAGAAACTGAGCAACATCTG

SEQ ID NO:4：COM反向引物AAATGGCGCAAACGTCTTAATTCTGACAA。

一种用于检测所述的SNP分子标记的试剂盒，包含所述的KASP引物组。

所述SNP分子标记、所述KASP引物组或所述试剂盒在鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度中的应用。

一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的方法，包括通过对待测瓦氏黄颡鱼进行所述的SNP分子标记的检测，鉴定所述待测瓦氏黄颡鱼的低溶氧耐受性和肥满度大小。

优选，包括以下步骤：

(1)取瓦氏黄颡鱼尾鳍，提取其基因组DNA；

(2)采用所述KASP引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描；

(3)根据所述荧光信号判断瓦氏黄颡鱼的SNP位点基因型是GA还是GG还是AA；

(4)不同基因型与瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的相关性分析。

通过对结果进行分析，所述GA、GG和AA三种基因型的瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性能力为GA>GG>AA，肥满度大小为AA>GG>GA。

作为进一步优选：

上述方法中，所述PCR扩增的反应体系：总反应体系为6.5μL，包含DNA 3.2μL，KASP引物混合物0.1μL，2×KASP Master Mix 3.2μL；KASP引物混合物包括：FAM正向引物、VIC正向引物、COM反向引物和纯化水；所述FMA正向引物浓度为11.25μmol/ml，所述VIC正向引物浓度为11.25μmol/ml，所述反向引物浓度为28.5μmol/ml。

上述方法中，所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性14min；94℃变性25s，62-57℃梯度PCR，每循环降低0.5℃，共10个循环；复性25s，95℃变性15s，56℃复性及扩增65s，共28个循环；10℃保存；

针对瓦氏黄颡鱼种质改良方面(耐低氧能力、肥满度性状)重点所要解决的问题，本发明基于低溶氧耐受性和肥满度性状相关的SNP标记，运用目前国际上主流的基因分型方法KASP技术(即竞争性等位基因特异性PCR)开发可直接用于瓦氏黄颡鱼分子标记辅助育种的试剂盒，该技术准确率高，灵活性超强，无需昂贵的双色标记探针，最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增，快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。其顺利实施必将产生创新性的成果，并加快我国瓦氏黄颡鱼及水产新品种杂交黄颡鱼“黄优1号”良种选育的进程，促进我国黄颡鱼属鱼类良种产业的健康发展。

技术效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)现有技术仅仅通过表型数据检测获取低溶氧耐受性和肥满度，并且检测低溶氧耐受性时将伴有该鱼鱼体伤害(缺氧严重后该鱼无法恢复)，而利用本发明提供的KASP标记及其引物组合能够从分子水平上快速鉴定或辅助鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的方法，并且不伤害鱼体，操作简单，成本低。

(2)本发明方法能够实现瓦氏黄颡鱼育种材料低溶氧耐受性能力和肥满度大小检测，不受瓦氏黄颡鱼的年龄、性别等限制，可用于瓦氏黄颡鱼的早期选育，显著促进瓦氏黄颡鱼的育种进程，解决亲本选育中的盲目性，在不进行瓦氏黄颡鱼亲本缺氧胁迫致死的基础上，仅仅使用少量尾鳍即可进行低溶氧耐受性能力检测，为分子辅助育种提供科学工具。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的所有引物均由南京集思慧远生物科技有限公司合成。本发明实验所用鱼取自所有瓦氏黄颡鱼材料均来自南京师范大学海洋科学与工程学院鱼类遗传育种实验室。

本发明专利SNP分子标记来源于本实验室瓦氏黄颡鱼构建F1子代遗传图谱，后经过经济性状(低溶氧耐受性和肥满度)QTL定位得来：

(1)挖掘SNPs分子标记并构建高密度遗传连锁图谱，采用来自不同地理群体、性状分离的亲本，建立相同条件下养殖>3个月的瓦氏黄颡鱼F1代家系，运用微卫星标记筛选出杂合度较高的家系，随机挑选200条全同胞F1代及父母本作为作图群体，记录该群体经济性状(低溶氧耐受性和肥满度等)数据，然后剪取尾鳍提取DNA，基于ddRAD-seq技术挖掘SNPs分子标记，并构建瓦氏黄颡鱼高密度遗传连锁图谱(Joinmap)。

(2)生长性状(体重、体宽、全长)进行QTL定位，基于高密度遗传连锁图谱对200条瓦氏黄颡鱼F1代生长性状进行QTL定位(WinCart QTL 6.0)，发现部分LOD值>4与低溶氧耐受性和肥满度相关的QTL位点，从中筛选出能够有效区分性状、可直接用于瓦氏黄颡鱼分子辅助选择育种的SNP标记。

检测样本的SNP分子标记：自2017年7月下旬出膜后，在同一环境(温度、密度等)下养殖105天的450尾瓦氏黄颡鱼个体；将该450尾鱼置于水池(580L)适应2个星期，进行实验前停止投喂饲料2天。然后直接在该水池中进行缺氧处理，首先在水池冲入氮气，使溶解氧水平在2小时40分钟内由7.2mg/L降至1.2mg/L，然后加盖塑料膜1小时20分钟可致使第一条不耐低氧的瓦氏黄颡鱼达到窒息点(0.4mg/L，28℃)，从第一条鱼窒息到最后一条鱼窒息整个过程持续1小时45分钟；按照鱼体失去平衡的先后顺序记录时间，并作为数量性状判定低溶氧耐受性能力；使用游标卡尺测量其体长，电子天平测量其体重；随机挑选198条瓦氏黄颡鱼，剪取鱼体尾鳍于95％乙醇-20℃保存，用于基因组DNA提取进行检测(见表2)。

所述检测待测瓦氏黄颡鱼12连锁群141cM位置的基因68bp处的SNP位点基因型是GA还是GG还是AA的方法包括如下步骤：

(1)取少量尾鳍提取瓦氏黄颡鱼的基因组DNA(DNA提取试剂盒(离心柱型)RP5511；北京百泰克生物技术有限公司)；

(2)采用KASP引物组反应体系和反应程序对瓦氏黄颡鱼基因组DNA进行KASP检测，使用ABI 7900HT real-time PCR仪器进行KASP标记的基因型鉴定工作，具体操作程序参考LGC公司的ABI 7900KASP基因分型操作指南(Guide to running KASP genotyping on theABI 7900instrument)。

(3)在KASP程序完成后，按照操作说明书上的指引编辑数据集、选择分析方式、确定X轴和Y轴(分别对应不同的荧光信号，即对应不同的等位基因)，最后点击确定按钮即可获得分型结果，判断瓦氏黄颡鱼12连锁群141cM位置的基因68bp处的SNP位点基因型是GA还是GG还是AA；

(4)不同基因型与瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的相关性分析。

上述方法中，所述KASP引物组由FAM正向引物、VIC正向引物、COM反向引物组成；序列如序列SEQ ID NO:2-4所示。

SEQ ID NO:2：FAM正向引物：CCGGAGAAACTGAGCAACATCTA

SEQ ID NO:3：VIC正向引物：CGGAGAAACTGAGCAACATCTG

SEQ ID NO:4：COM反向引物AAATGGCGCAAACGTCTTAATTCTGACAA

上述方法中，所述PCR扩增的反应体系：总反应体系为6.5μL，包含DNA 3.2μL，KASP引物混合物0.1μL，2×KASP Master Mix 3.2μL；KASP引物混合物包括：FAM正向引物、VIC正向引物、COM反向引物和纯化水；所述FMA正向引物浓度为11.25μmol/ml，所述VIC正向引物浓度为11.25μmol/ml，所述反向引物浓度为28.5μmol/ml。

上述方法中，所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性14min；94℃变性25s，62-57℃梯度PCR，每循环降低-0.5℃，共10个循环；复性25s，95℃变性15s，56℃复性及扩增65s，共28个循环；10℃保存；

将实施例中方法检测到的瓦氏黄颡鱼基因型与前期记录得到的低溶氧耐受性能力和肥满度进行Kruskal-Wallis test，得出如下结果(表1)，瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的Kruskal-Wallis检验统计量分别为6.569和8.595，该结果显示低溶氧耐受性和肥满度与瓦氏黄颡鱼12连锁群141cM位置的基因68bp处的SNP位点的基因型是GA还是GG还是AA显著相关。根据所述待测瓦氏黄颡鱼的基因型，并经过进一步平均数统计得到瓦氏黄颡鱼的低溶氧耐受性能力GA>GG>AA和肥满度AA>GG>GA。

表1瓦氏黄颡鱼基因型结合低溶氧耐受性和肥满度数据的Kruskal-Wallis test结果

K*：the Kruskal-Wallis检验统计量；Significance levels(显著性):**:0.05；LG ID：连锁群编号；Pos：位置

表2瓦氏黄颡鱼198尾个体SNP基因型及缺氧和肥满度数据

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的SNP分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> DNA

<213> 141cM(141cM)

<400> 1

catgatatat agaggaacct cattacagta catcactatc ttcacccgga gaaactgagc 60

aacatctaga aagtttttta acagcaactt aaatatctga aagagcaatg tttttaaaag 120

ttgtcagaat taagacgttt gcgccatttg 150

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggagaaac tgagcaacat cta 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggagaaact gagcaacatc tg 22

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaatggcgca aacgtcttaa ttctgacaa 29

Claims (5)

1.一种检测SNP分子标记的方法在鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的应用，其特征在于，通过对待测瓦氏黄颡鱼进行SNP分子标记的检测，鉴定所述待测瓦氏黄颡鱼的低溶氧耐受性和肥满度大小，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO:1所述 核苷酸序列的第68位，其碱基为G或A，SNP分子标记的位点基因型为GA、GG或AA的情况下，三种基因型的瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性能力为GA>GG>AA，肥满度大小为AA>GG>GA。

2.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组由FAM正向引物、VIC正向引物、COM反向引物组成；所述FAM正向引物如SEQ ID NO:2所示；所述VIC正向引物如SEQ ID NO:3所示；所述COM反向引物如SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测SNP分子标记的方法包括以下步骤：

（1）取瓦氏黄颡鱼尾鳍，提取其基因组DNA；

（2）采用权利要求2所述的KASP引物组进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描；

（3）根据所述荧光信号判断瓦氏黄颡鱼的SNP位点基因型是GA还是GG还是AA；

（4）不同基因型与瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的相关性分析；

所述GA、GG和AA三种基因型的瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性能力为GA>GG>AA，肥满度大小为AA>GG>GA。

4.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的KASP引物组。

5.权利要求2所述的KASP引物组或权利要求4所述的试剂盒在鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度中的应用。