CN113957155B - 与草鱼性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请是201811648716.7的分案申请。本申请属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，公开了与草鱼生长状况有关的SNP位点位于基因SNP35第410位碱基；当基因SNP35第410位碱基为CC基因型，体重显然优于TT基因型个体。本发明能够有效用于草鱼的分子标记辅助育种，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼鱼苗，加快草鱼育种进程。

Description

与草鱼性状相关的SNP分子标记及其应用

本申请是申请号为201811648716.7、申请日为2018年12月30日、发明名称为“与草鱼性状相关的SNP分子标记及其应用”的中国申请的分案申请。

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及与草鱼性状相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodon idella)属雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、草鱼属(Ctenopharyngodon)，具有生长速度快，肉质鲜美，营养价值高等优点，目前是我国淡水养殖鱼类中年产量最大的养殖对象，从2007年到2016年草鱼产量从356万吨逐年增加到590万吨，十年产量增加了65.73％。由此可见，草鱼养殖业的健康良性发展，不仅为我国乃至发展中国家人民提供了大量优质动物蛋白，同时带动了相关产业如饲料加工、运输和销售行业的发展壮大，解决了大批人员的就业问题。至今，虽然水产工作者已经付出了很多的努力，但草鱼仍未有通过国家良种审定委员会鉴定的人工选育的良种，实际生产上多为野生种直接驯化而成，缺少定向选育，生产上经常出现因亲本质量差，造成后代生长速度慢、规格不齐、抗病力差等问题，养殖户常常面临重大的经济损失，因此，选育高产优质的草鱼良种一直是草鱼育种工作的中心目标。

选育出生长速度更快的草鱼新品种可以节约饲料成本，缩短养殖周期进而大幅度降低草鱼养殖成本，因此，开发快速可靠的育种技术，进行草鱼快长品种(系)的培育十分必要。在开展常规选育研究的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可加快草鱼良种选育进程。SNP是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸变异而产生的多态性，位于基因编码区的非同义SNP可导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SNP尤其重要，最终引起生物表型的变化。

全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)旨在从全基因组范围内筛选与性状关联的SNPs。GWAS分析的成本主要有2个：第一，用于分析的样本数量；第二，基因分型的费用。数量越多,其分型成本、测定性状的成本也越高。为减少成本，只测序极端样品的GWAS方法被开发出来了,如BSR-seq(RNA-seq based BSA)、XP-GWAS(Extreme-phenotype genome-wide association study)等。研究证明XP-GWAS可有效降低基因分型的工作量,能够进行低成本高效益的SNP筛选。SNP分型技术也逐渐由早期阶段的中、低通量,发展到高通量的基因芯片、重测序技术。其中RAD-seq(Restriction Association siteDNA sequencing)就是一种便宜、高效的SNP发掘与分型高通量方法。综合考虑实验成本和效率，可以采用RAD-seq技术结合XP-GWAS策略在全基因组范围内寻找与草鱼生长性状相关的SNP位点，旨在寻找新的遗传标记，为分子标记辅助选育快长草鱼新品种选育提供基础资料。

发明内容

本发明的首要目的在于提供与草鱼体重相关的4个SNPs标记及应用。

本发明所采取的技术方案是：

草鱼生长相关的基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

上述基因序列，SEQ ID NO.1的第159位Y为碱基T或C，SEQ ID NO.2的第410位Y为碱基C或T，SEQ ID NO.3的第370位Y为碱基C或T，SEQ ID NO.4的第374位Y为碱基C或T。

上述所述的基因序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4在判断草鱼生长快慢的应用。

草鱼生长快慢相关的SNP位点，其为SEQ ID NO.1第159位碱基、SEQ ID NO.2第410位碱基、SEQ ID NO.3第370位碱基和SEQ ID NO.4第374位碱基。

上述所述的SNP位点在判断或鉴别草鱼生长快慢中的应用。

上述所述的SNP位点在选育生长优异草鱼品种的应用。

一种筛选草鱼生长快慢的方法，包括以下步骤：

检测草鱼基因序列SEQ ID NO.1的第159位碱基处的SNP位点是否为基因型CC，若是，则为体重优异，生长快的草鱼；

或/和，检测草鱼基因SEQ ID NO.2的第410位碱基处的SNP位点是否为基因型CC，若是，则为体重优异，生长快的草鱼；

或/和，检测草鱼基因SEQ ID NO.3的第370位碱基处的SNP位点是否为基因型CC，若是，则为体重优异，生长快的草鱼；

或/和，检测草鱼基因SEQ ID NO.4的第374位碱基处的SNP位点是否为基因型TT，若是，则为体重优异，生长快的草鱼。

进一步的，包括以下步骤：

(1)提取草鱼的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，进行PCR扩增实验，获取含有SNP位点的目标片段，检测草鱼基因SEQ ID NO.1第159位碱基、基因SEQ ID NO.2第410位碱基、基因SEQ ID NO.3第370位碱基的基因型是否为CC，或基因SEQ ID NO.4第374位碱基处的基因型是否为TT。

进一步的，所述的步骤(2)PCR扩增：使用SNP24-F、SNP24-R、SNP35-F、SNP35-R、SNP36-F、SNP36-R、SNP37-F以及SNP37-R引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，所述引物的核苷酸序列如下：

SNP24-F：5'-CGTAGTCACGACAGGACACGT-3'(SEQ ID NO.5)；

SNP24-R：5'-CAGTGATTCTTCTGTTAATTCT-3'(SEQ ID NO.6)；

SNP35-F：5'-GATATGGATGACTGTCTCTCC-3'(SEQ ID NO.7)；

SNP35-R：5'-CAATCCAGGTCAGATAGTACA-3'(SEQ ID NO.8)；

SNP36-F：5'-TCAGGGTTCAAAGTTTGAGTG-3'(SEQ ID NO.9)；

SNP36-R：5'-GTGCGAGGTGATTGGTATCTG-3'(SEQ ID NO.10)；

SNP37-F：5'-GACAATGAGTTCACTATTCT-3'(SEQ ID NO.11)；

SNP37-R：5'-CAAGGTTCTGGAATCATTCCT-3'(SEQ ID NO.12)；

再将PCR产物使用延伸引物SNP24-P、SNP35-P、SNP36-P和SNP37-P进行PCR延伸扩增，确定草鱼基因SEQ ID NO.1第159位碱基、基因SEQ ID NO.2第410位碱基、基因SEQ IDNO.3第370位碱基以及基因SEQ ID NO.4第374位碱基处的基因型；所述延伸引物核苷酸序列如下：

SNP24-P：5'-TACGCTGTGAGAAACTGTGAGG-3'(SEQ ID NO.13)；

SNP35-P：5'-GTGAAAGGGGGAATACTATAAC-3'(SEQ ID NO.14)；

SNP36-P：5'-TTTTTTTTTTCGGACTCGGAGGTTGAGAGCTA-3'(SEQ ID NO.15)；

SNP37-P：5'-AGATCTCAATCCAAGCGAGCAC-3'(SEQ ID NO.16)。

进一步的，所述的PCR扩增体系为：

所述的PCR扩增反应条件为：94℃变性15s；54℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所获得的基因型是依据基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。

(2)本发明通过检测草鱼的四个SNP标记，SNP24、SNP35、SNP36以及SNP37，能够在相同养殖条件下有效的挑选体重更大的草鱼，能够有效用于草鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对草鱼亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼后代(鱼苗)，节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快草鱼育种进程。

附图说明

图1为SNP延伸反应后的检测峰图：其中，A是基因型为TC的检测峰图，B是基因型为TT的检测峰图，C是基因型为CC的检测峰图，峰图的颜色及对应核苷酸为：绿色—A，红色—T，黑色—C，蓝色—G。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1SNP标记的获得

1.本发明测序获得的草鱼基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4，在SEQ IDNO.1第159位碱基、SEQ ID NO.2第410位碱基、SEQ ID NO.3第370位碱基和SEQ ID NO.4第374位碱基处各发现一个SNP位点，SEQ ID NO.1第159位碱基、SEQ ID NO.2第410位碱基、SEQ ID NO.3第370位碱基和SEQ ID NO.4第374位碱基处有等位基因C和T，组成CC、TC、TT基因型。

本发明用于生长性状(体重)分析的样本为同批繁殖且同塘饲养的25月龄草鱼群体，随机挑选298尾草鱼用于生长性状(体重)关联分析，选取体重极大的个体20尾(平均体重为2659±126.40g)，体重极小的个体20尾(平均体重为744.76±73.35g)，分别抽取亲本和后代尾静脉血液各2ml(添加ACD抗凝剂抗凝)用于后续实验。

以下序列中的Y代表的是突变的碱基。

SNP24的基因序列片段如SEQ ID NO.1，RAD库标签(Ctg294657.0)，突变位置为T159C：

ATCGGTCCACGTAACTCTCCCGAAAGCCTTTCCGCACCGCGCGGGCCATACTGACCACCGTAGTCACGACAGGACACGTGCTGAAACCCAAGAGGACGGGATGATGGTCTTTAATTCATTAACATGACGAGTGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTGTTYCCTCACAGTTTCTCACAGCGTATGCCGCTCGTCCCCGTCGGACACACACAGGTGTTCAGAGGGCCGCAGGCAGCACCATGTTGGCAGGGAGGAACACACGGTGTAGTGACAGCTGCACACACACACACAATTACATGATCACACACTACATCAAAACACCACAGAATTAACAGAAGAATCACTGCAAATGAAACTGAAACTGAAAAAATGAATGTCATATGAATGATTCAATGATTAATGATGTCATAATGAAAGGATTATAAT(SEQ ID NO.1)；

SNP35序列片段，RAD库标签(Ctg355219.0)，突变位置为C410T：

ATTACAACACACCAGTGGTGAGGTCAGCTGGTGGTAGCATGTGTTTCCTGATGTTGATTAGTTTGATTTTGTCTAGTATAAGTGCATTCTTTTTCTTTGGAGAACCCACATCTGCACTTTGCCTCCTGCGAAATGCCATATTTGCATTTTTCTTCACTGTCTGTATTTCCTGTTTGACTGTCCGTTCCTTTCAAATTGTTTGTGTTTTTAAAATGGCTGCTCAGTTCCCTAAGGTGCACAGCCTTTGGGTAAAGCACAATGGCCAGTGGCTCTTCATTGCATTTACTTCTGTCATTCATTTAATTTCTTGTGTGATATGGATGACTGTCTCTCCTGTCAAAGTCACGGCTGACTGGTGGACTTATACAGATCAAATTATGCTCGTCTGTGAAAGGGGGAATACTATAACYTTAACCATAGTTGTGTTCATAGGTTGGTTTCTTGGTTTCCTGTGTCTCCTGTTTTCCTACATGGGAAGAGATCTGCCGAAAAATTACAATGAGGCCAAATCAATAACCTTCAGTCTAACTTTGTACTATCTGACCTGGATTGGATATTTCACAGCATACCTCTCTTTCAAAAGCAAATACATCATCCTTTTGAATGCACTGGCTCAAATATCCAGTATAAATGGAATt(SEQ ID NO.2)；

SNP36序列片段，RAD库标签(Ctg36503.0)，突变位置为C370T：

AGTGTTCCGTGAGGAAATGGTGCGTTGACCACAGGGCTTTGATTACAGAAGCGGCTGGTGTAATGGAGACGGAGGACTCTCTGTTCTCCTGAGGCCCCCAGACGCTTCCCGCATGTGTTTACTTAACGCAGTTAGGGCTTACGCCATGCATGTGATTACCAAGTGGCTGACACTTCATATCGCAAATAGACAAACTAAACAGAGAGGCCACACAACTTCACCCTAATTTTTTTTTGGAGGGAAATTCTGTGGTTTGGATGTGAAATTCTGTGAATGGTCCCTGTAGAGTTTAAAATCTTCTTTTTTTTAATATCTTCCCCCATGTATCAGGGTTCAAAGTTTGAGTGCGGACTCGGAGGTTGAGAGCTAYGCGTCCTTCATAGCCCAGGCTCTAGAAAAGACGCGTGGCCGTGAGTGTGTGCCCTCTTGGGAGGAGATCCAGGGGCTGATGGGAAGGCAGGAGATACTGTGTGCTGTGCACTACCCTGGACCGGGCTGCTGCCAGATACCAATCACCTCGCACACTACGGCTAATGAGGTATTGCATCAGTCGTTTCCTCTACAGCAGGGATTGGGAAc(SEQ ID NO.3)；

SNP37序列片段，RAD库标签(Ctg378190.0)，突变位置为C374T：

AATCGACTCTAAAGTCTGGATCGGATGGACGTGTTCGAATGCACACCTGTGACCACATATAACTATAATAATAAAAAAATAAAAAAATAATTTAGGGCAAGTATTATGTTTTTTTTTTTGTTTTTTTGGCTGTTGGCAATTCAGCTTTGCAGTTTTAAATTGCAATATTTCACAATATGTCTGCTTTTACTGTATTTTTGATCAAATAAATGCAGCATTGGTGAGACTTTACCAACCCTAAACTTTTGGCCCTAAACCAGCAGGATAACGCCACAAAGCTTAAATCATCTCAAACTGGTTTTTTAAACAAGACAATGAGTTCACTATTCTCAAATGGCCTCCACAGTCTCCAGATCTCAATCCAAGCGAGCACYTTTGGGATGTGGTGCAACAGGAGATTTGCATAATGGATGTGCAGCTGACAAATCTGCAGCAACTGTGTGATGCCATCATGATAATATGGACCAAACTCTCTGAGGAATGATTCCAGAACCTTGTTGAATTTATGCCACTATGAATTAAGGCAGTTCTGAAATCAACTTGGTACTAGAAAGATGTACAGTACCTAATAAAGTGGCCGGTTAGTgtatgtatacacacacacacacacacacacacacacac(SEQ ID NO.4)。

实施例2 生长差异标记的筛选

利用构建的极端大个体20尾和极端小个体20尾样品对筛选出来的84个差异SNPs标记进行初步验证。在所选择的84个SNPs位点中，其中40个未检测到SNP突变，44个检测到SNP突变。将检测到突变型的44个SNPs在极端大个体组和极端小个体组的差异趋近分析表明，SNP24，SNP36差异显著(P<0.05)，SNP37，SNP38差异极显著(P<0.01)(见表1)。

表1 在极端群体分型的标记

/>

/>

注：“_”表示此位点P<0.05。

实施例3 草鱼体重关联的SNP标记与体重相关的验证

1.样品DNA提取

(1)取待测鱼的血液100ul或剪碎后鳍条组织3mg，加入0.5mL的裂解液(10mmol/LTris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。

(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。

(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。

(4)用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。

2.引物设计和合成

根据草鱼基因片段(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4)设计合成了引物对，以及与体重相关的4个SNP位点的Snapshot引物，引物序列如下：

SNP24-F：5'-CGTAGTCACGACAGGACACGT-3'(SEQ ID NO.5)；

SNP24-R：5'-CAGTGATTCTTCTGTTAATTCT-3'(SEQ ID NO.6)；

SNP35-F：5'-GATATGGGATGACTGTCTCTCC-3'(SEQ ID NO.7)；

SNP35-R：5'-CAATCCAGGTCAGATAGTACA-3'(SEQ ID NO.8)；

SNP36-F：5'-TCAGGGTTCAAAGTTTGAGTG-3'(SEQ ID NO.9)；

SNP36-R：5'-GTGCGAGGTGATTGGTATCTG-3'(SEQ ID NO.10)；

SNP37-F：5'-GACAATGAGTTCACTATTCT-3'(SEQ ID NO.11)；

SNP37-R：5'-CAAGGTTCTGGAATCATTCCT-3'(SEQ ID NO.12)。

3.PCR扩增反应体系：

PCR扩增反应条件：

94℃变性15s；54℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。得到PCR扩增反应产物。扩增获得条带大小为423bp、638bp、579bp或624bp的条带。

4.取3ul PCR扩增反应的产物用ExoI和Sap纯化，去除PCR产物中的引物及dNTP。

纯化反应体系：

纯化反应条件：37℃45min，80℃15min，得到纯化的PCR产物。

5.对纯化的PCR产物进行单碱基延伸。

反应体系为：

延伸引物序列如下：

SNP24-P：5'-TACGCTGTGAGAAACTGTGAGG-3'(SEQ ID NO.13)；

SNP35-P：5'-GTGAAAGGGGGAATACTATAAC-3'(SEQ ID NO.14)；

SNP36-P：5'-TTTTTTTTTTCGGACTCGGAGGTTGAGAGCTA-3'(SEQ ID NO.15)；

SNP37-P：5'-AGATCTCAATCCAAGCGAGCAC-3'(SEQ ID NO.16)。

延伸反应条件：

5.取1μl延伸产物，加8μl上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴。

6.草鱼基因型分析

利用测序仪(测序仪型号为ABI 3730XL)对PCR产物进行SNaPshot分型，根据测序结果峰图的颜色可判断各个样品草鱼的基因型(图1)，草鱼基因SEQ ID NO.1第159位碱基处的SNP位点是否为CC基因型，如果是CC基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼；基因SEQID NO.2第410位碱基处的SNP位点是否为CC基因型，若为CC基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼；基因SEQ ID NO.3第370位碱基处的SNP位点是否为CC基因型，若为CC基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼；或/和基因SEQ ID NO.4第374位碱基处的SNP位点是否为TT基因型，若为TT基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼。

利用最小二乘法对筛选到的差异显著的SNPs与草鱼体重进行关联性分析，在随机群体中与在极端群体验证的结果相同，即这4个SNPs与生长性状均显著相关(P<0.05)。标记SNP24，SNP35和SNP36标记CC型体重均值均显著高于TT型，而SNP37标记TT型体重均值显著高于CC和TC基因型(见表2)。

表2 4个SNPs标记与体重性状关联分析

注：相同字母表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，不同字母表示两种基因型差异显著(P<0.05)。

从表2中可知，草鱼基因SEQ ID NO.1第159位碱基、基因SEQ ID NO.2第410位碱基、基因SEQ ID NO.3第370位碱基，或/和基因SEQ ID NO.4第374位碱基处的SNP位点，与草鱼的体重密切相关。本发明通过检测草鱼的四个SNP标记，SNP24、SNP35、SNP36以及SNP37，能够在相同养殖条件下有效的挑选体重更大的草鱼。本发明发现SNP标记与草鱼的体重能紧密相关，能够有效用于草鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对草鱼亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼后代(鱼苗)，对快长草鱼苗种生产有积极意义，并可以大大节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快草鱼育种进程。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 与草鱼性状相关的SNP分子标记及其应用

<130>

<150> 201811648716.7

<151> 2018-12-30

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 423

<212> DNA

<213> Ctenopharyngodon idella

<400> 1

atcggtccac gtaactctcc cgaaagcctt tccgcaccgc gcgggccata ctgaccaccg 60

tagtcacgac aggacacgtg ctgaaaccca agaggacggg atgatggtct ttaattcatt 120

aacatgacga gtgctgtgtg tgtgtgtgtg tgtttgttyc ctcacagttt ctcacagcgt 180

atgccgctcg tccccgtcgg acacacacag gtgttcagag ggccgcaggc agcaccatgt 240

tggcagggag gaacacacgg tgtagtgaca gctgcacaca cacacacaat tacatgatca 300

cacactacat caaaacacca cagaattaac agaagaatca ctgcaaatga aactgaaact 360

gaaaaaatga atgtcatatg aatgattcaa tgattaatga tgtcataatg aaaggattat 420

aat 423

<210> 2

<211> 638

<212> DNA

<213> Ctenopharyngodon idella

<400> 2

attacaacac accagtggtg aggtcagctg gtggtagcat gtgtttcctg atgttgatta 60

gtttgatttt gtctagtata agtgcattct ttttctttgg agaacccaca tctgcacttt 120

gcctcctgcg aaatgccata tttgcatttt tcttcactgt ctgtatttcc tgtttgactg 180

tccgttcctt tcaaattgtt tgtgttttta aaatggctgc tcagttccct aaggtgcaca 240

gcctttgggt aaagcacaat ggccagtggc tcttcattgc atttacttct gtcattcatt 300

taatttcttg tgtgatatgg atgactgtct ctcctgtcaa agtcacggct gactggtgga 360

cttatacaga tcaaattatg ctcgtctgtg aaagggggaa tactataacy ttaaccatag 420

ttgtgttcat aggttggttt cttggtttcc tgtgtctcct gttttcctac atgggaagag 480

atctgccgaa aaattacaat gaggccaaat caataacctt cagtctaact ttgtactatc 540

tgacctggat tggatatttc acagcatacc tctctttcaa aagcaaatac atcatccttt 600

tgaatgcact ggctcaaata tccagtataa atggaatt 638

<210> 3

<211> 579

<212> DNA

<213> Ctenopharyngodon idella

<400> 3

agtgttccgt gaggaaatgg tgcgttgacc acagggcttt gattacagaa gcggctggtg 60

taatggagac ggaggactct ctgttctcct gaggccccca gacgcttccc gcatgtgttt 120

acttaacgca gttagggctt acgccatgca tgtgattacc aagtggctga cacttcatat 180

cgcaaataga caaactaaac agagaggcca cacaacttca ccctaatttt tttttggagg 240

gaaattctgt ggtttggatg tgaaattctg tgaatggtcc ctgtagagtt taaaatcttc 300

ttttttttaa tatcttcccc catgtatcag ggttcaaagt ttgagtgcgg actcggaggt 360

tgagagctay gcgtccttca tagcccaggc tctagaaaag acgcgtggcc gtgagtgtgt 420

gccctcttgg gaggagatcc aggggctgat gggaaggcag gagatactgt gtgctgtgca 480

ctaccctgga ccgggctgct gccagatacc aatcacctcg cacactacgg ctaatgaggt 540

attgcatcag tcgtttcctc tacagcaggg attgggaac 579

<210> 4

<211> 624

<212> DNA

<213> Ctenopharyngodon idella

<400> 4

aatcgactct aaagtctgga tcggatggac gtgttcgaat gcacacctgt gaccacatat 60

aactataata ataaaaaaat aaaaaaataa tttagggcaa gtattatgtt tttttttttg 120

tttttttggc tgttggcaat tcagctttgc agttttaaat tgcaatattt cacaatatgt 180

ctgcttttac tgtatttttg atcaaataaa tgcagcattg gtgagacttt accaacccta 240

aacttttggc cctaaaccag caggataacg ccacaaagct taaatcatct caaactggtt 300

ttttaaacaa gacaatgagt tcactattct caaatggcct ccacagtctc cagatctcaa 360

tccaagcgag cacytttggg atgtggtgca acaggagatt tgcataatgg atgtgcagct 420

gacaaatctg cagcaactgt gtgatgccat catgataata tggaccaaac tctctgagga 480

atgattccag aaccttgttg aatttatgcc actatgaatt aaggcagttc tgaaatcaac 540

ttggtactag aaagatgtac agtacctaat aaagtggccg gttagtgtat gtatacacac 600

acacacacac acacacacac acac 624

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgtagtcacg acaggacacg t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagtgattct tctgttaatt ct 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatatgggat gactgtctct cc 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caatccaggt cagatagtac a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcagggttca aagtttgagt g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtgcgaggtg attggtatct g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacaatgagt tcactattct 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caaggttctg gaatcattcc t 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tacgctgtga gaaactgtga gg 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtgaaagggg gaatactata ac 22

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tttttttttt cggactcgga ggttgagagc ta 32

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agatctcaat ccaagcgagc ac 22

Claims (5)

1.检测SNP分子标记的引物在选育体重优异的草鱼品种中的应用，

所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.2所示，SNP位点位于第410位，多态性为C/T；

若检测草鱼基因序列SEQ ID NO.2的第410位碱基处的SNP位点的基因型是CC，则挑选繁殖。

2.一种筛选体重优异的草鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：

检测草鱼基因序列SEQ ID NO.2的第410位碱基处的SNP位点是否为基因型CC，若是，则挑选繁殖。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取草鱼的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，进行PCR扩增实验，获取含有SNP位点的目标片段，检测草鱼基因SEQ ID NO.2第410位碱基的基因型是否为CC。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

所述的步骤(2)中PCR扩增：使用SNP35-F及SNP35-R引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，所述引物的核苷酸序列如下：

SNP35-F：5'-GATATGGATGACTGTCTCTCC -3'（SEQ ID NO.7）；

SNP35-R：5'-CAATCCAGGTCAGATAGTACA -3'（SEQ ID NO.8）；

再将PCR产物使用延伸引物SNP35-P进行PCR延伸扩增，确定草鱼基因SEQ ID NO.2第410位碱基处的基因型；所述延伸引物核苷酸序列如下：

SNP35-P：5'-GTGAAAGGGGGAATACTATAAC-3'（SEQ ID NO.14）。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系为：

DNA 1μl；

10×buffer 1.5μl；

25mM 的 MgCl₂ 1.5μl；

10mM 的 dNTP 0.3μl；

上游引物、下游引物各 0.15μl；

Taq 酶0.3μl；

H₂O补至 15μl；

所述的PCR扩增反应条件为：94℃变性15s；54℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环。

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