KR102111238B1 - 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 마이크로새틀라이트 마커 조성물과 이를 검출 또는 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 자바리 분석용 조성물 및 마커 조성물을 이용한 자바리 유전자 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물과 이를 검출 또는 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 자바리 분석용 조성물 및 마커 조성물을 이용한 자바리 유전자 분석방법을 제공함으로써, 마커의 자바리 분석효율과 자바리 유전자의 분석효율이 증대하는 효과가 있으며, 자바리의 수산자원조성사업 환경을 개선하고 자원량을 회복하여 경제성이 향상될 수 있고, 이로 인한 어민 소득에 대한 신뢰도 높은 경제적 기초자료를 획득할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물과 이를 검출 또는 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 자바리 분석용 조성물 및 마커 조성물을 이용한 자바리 유전자 분석방법을 제공함으로써, 마커의 자바리 분석효율과 자바리 유전자의 분석효율이 증대하는 효과가 있으며, 자바리의 수산자원조성사업 환경을 개선하고 자원량을 회복하여 경제성이 향상될 수 있고, 이로 인한 어민 소득에 대한 신뢰도 높은 경제적 기초자료를 획득할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 마이크로새틀라이트 마커 조성물과 이를 검출 또는 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 자바리 분석용 조성물 및 마커 조성물을 이용한 자바리 유전자 분석방법에 관한 것이다.
바리과(family Serranidae) 어류는 대표적인 북태평양 서식 아열대성 어종으로 우리나라에서는 생산규모가 그리 높지 않아 세계 수산시장의 변화에 대응한 수산분야 10대 전략 품목 육성 어종으로 포함되어 대량생산기반의 구축을 목표로 연구 중인 핵심어종이다. 특히 중화권을 중심으로 고가 거래되는 고부가가치 품목으로 대만 양식산이 중국, 홍콩 등 주요 시장을 장악하였으며, 중국 시장 점유율이 더욱 상승될 것으로 전망된다. 우리나라는 2003년 인공 종묘생산에 성공하였으나, 열대성 어종으로 국내 양산이 어려워 산업화가 미흡한 실정이고, 제주도에서 방언으로 "다금바리"라 불리는 바리과 어종인 자바리는 일간 10여수 이내의 소량으로 잡혀 시장수요에 미치지 못해 고가에 판매되고 있다. 따라서 자바리의 유통이나 소비과정 뿐만 아니라 나아가 자원을 보호하고 이를 관리하기 위한 경제적 손실을 줄이기 위하여 신속하고 정확하게 자바리를 분석할 수 있는 유전자 기반의 종분석 기술의 개발이 시급한 실정이다.
유전자 기반의 분석 기술의 핵심인 DNA 마커는 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 초기의 DNA 마커는 다수의 유전자좌를 용이하게 확인할 수 있는 RAPD (randomly amplified polymorphic DNA), ISSR (inter-simple sequence repeat) 등의 우성 마커(dominant marker)가 주로 이용되었다. 그러나 RAPD와 ISSR의 경우 재현성이 떨어질 뿐만 아니라 우성 마커의 특성상 2배체에서 우성 동형접합체와 이형접합체 유전자형의 구분이 불가능한 단점이 있다.
최근에는 이러한 단점을 극복할 수 있으며 생물체 genome상에 존재하는 2 ~ 8 bp의 염기서열이 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성 (polymorphism)이 나타나는 SSR(simple sequence repeat) 부분을 이용한 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커를 활용하여 생물종의 유전적 다양성과 유연관계를 평가하고 있다.
SSR 마커를 개발하기 위하여 최근 다양한 연구가 수행되고 있으며 특히, NGS(Next Generation Sequencing, 차세대염기서열분석법)를 이용한 SSR마커 개발이 가장 활발하게 이루어지고 있다. NGS는 기존에 알려진 염기서열 정보가 없거나 불충분할 경우 대량의 염기서열 정보를 분석하고 SSR 영역을 직접 탐색함으로써 SSR 마커를 개발하는 방법으로 초기의 대규모 시퀀싱과 비교하여 보다 빠르고 저렴한 비용으로 분석할 수 있어 많은 생물종의 유전체 정보를 밝히고 다양한 유전자 마커를 개발하는데 이용되고 있다.
이에 따라 '대한민국 등록특허 제 10-1796306호'는 말전복 탐지용 마이크로새틀라이트 마커와 마커를 포함하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 말전복 탐지 방법을 개시하고 있으나, 대립유전자 외의 다른 유전적 정보를 분석하거나 확인한 내용에 대하여 개시하고 있지 않아 생물종의 유전적 다양성 분석 또는 정밀한 친자 확인 등에 마커를 활용하기 어렵다는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 자바리 유전자 분석용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 자바리 유전자 분석방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명은,
서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 해결하기 위하여 본 발명은,
자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 자바리 유전자 분석용 조성물을 제공한다.
이러한 프라이머는 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34, 서열번호 35와 36, 서열번호 37과 38, 서열번호 39와 40, 서열변호 41과 42, 서열번호 43과 44, 서열번호 45와 46, 서열번호 47과 48, 서열번호 49와 50, 서열번호 51과 52, 서열번호 53과 54, 서열번호 55와 56, 서열번호 57과 58, 서열번호 59과 60, 서열번호 61과 62, 서열번호 63과 64, 서열번호 65와 66, 서열번호 67과 68, 서열번호 69와 70, 및 서열번호 71과 72로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열 쌍으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 또 다른 목적을 해결하기 위하여 본 발명은,
서열번호 1 내지 24로 이루어진 군으로부터 하나 이상의 마이크로새틀라이트 마커를 선택하는 제 1단계;
서열번호 25 내지 72로 이루어진 군으로부터 상기 제 1단계에서 선택된 마이크로새틀라이트 마커에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머를 선택하는 제 2단계;
상기 선택된 마이크로새틀라이트 마커 및 프라이머를 이용하여 분석하고자 하는 자바리 시료를 멀티플렉스 PCR 증폭하여 PCR 산물을 형성하는 제 3단계; 및
상기 PCR 산물을 이용하여 분석하고자 하는 자바리 시료의 유전적 다양성을 분석하는 제 4단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자바리 유전자 분석방법을 제공한다.
본 발명은 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물과 이를 검출 또는 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 자바리 분석용 조성물 및 마커 조성물을 이용한 자바리 유전자 분석방법을 제공함으로써, 마커의 자바리 분석효율과 자바리 유전자의 분석효율이 증대하는 효과가 있으며, 자바리의 수산자원조성사업 환경을 개선하고 자원량을 회복하여 경제성이 향상될 수 있고, 이로 인한 어민 소득에 대한 신뢰도 높은 경제적 기초자료를 획득할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자바리 4개체에 대한 DNA gel loading 결과를 나타낸 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 선별 마커 중 PCR 증폭 및 다양성이 확보된 마커의 전기영동 결과 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 선별 마커 중 PCR 증폭되지 않은 마커의 전기영동 결과 사진이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 선별 마커 중 다양성이 확보되지 않은 마커의 전기영동 결과 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_1 내지 EpBr_24)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_25 내지 EpBr_48)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_49 내지 EpBr_72)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_73 내지 EpBr_104)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_105 내지 EpBr_128)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_129 내지 EpBr_150)의 전기영동 결과 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 EpBr_40 마커의 NCBI database blast를 통한 중복성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Multiple align 통한 di-마커 중복성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_143, EpBr_21, EpBr_66, EpBr_40/서열번호 1 내지 4)의 염기서열이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_145, EpBr_27, EpBr_81, EpBr_98/서열번호 5 내지 8)의 염기서열이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_82, EpBr_01, EpBr_104, EpBr_125/서열번호 9 내지 12)의 염기서열이다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_65, EpBr_35, EpBr_130, EpBr_05/서열번호 13 내지 16)의 염기서열이다.
도 6e는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_13, EpBr_26, EpBr_11, EpBr_10/서열번호 17 내지 20)의 염기서열이다.
도 6f는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_39, EpBr_22, EpBr_138, EpBr_108/서열번호 21 내지 24)의 염기서열이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 마커 중 PCR 증폭이 잘 되지 않거나 peak 선별이 어려운 마커의 예시를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 마커 중 PCR이 안정적이며 peak의 형태가 정확한 마커의 예시를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자바리 multiplex PCR set 마커의 비대립유전자 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 24개의 마커를 통해 친자로 확인된 어미와 방류종자의 유전정보를 비교하여 나타낸 것이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 친자로 확인된 어미와 방류종자의 친자확인 정보를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 선별 마커 중 PCR 증폭 및 다양성이 확보된 마커의 전기영동 결과 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 선별 마커 중 PCR 증폭되지 않은 마커의 전기영동 결과 사진이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 선별 마커 중 다양성이 확보되지 않은 마커의 전기영동 결과 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_1 내지 EpBr_24)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_25 내지 EpBr_48)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_49 내지 EpBr_72)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_73 내지 EpBr_104)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_105 내지 EpBr_128)의 전기영동 결과 사진이다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따라 1차 선별된 마커(EpBr_129 내지 EpBr_150)의 전기영동 결과 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 EpBr_40 마커의 NCBI database blast를 통한 중복성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Multiple align 통한 di-마커 중복성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_143, EpBr_21, EpBr_66, EpBr_40/서열번호 1 내지 4)의 염기서열이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_145, EpBr_27, EpBr_81, EpBr_98/서열번호 5 내지 8)의 염기서열이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_82, EpBr_01, EpBr_104, EpBr_125/서열번호 9 내지 12)의 염기서열이다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_65, EpBr_35, EpBr_130, EpBr_05/서열번호 13 내지 16)의 염기서열이다.
도 6e는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_13, EpBr_26, EpBr_11, EpBr_10/서열번호 17 내지 20)의 염기서열이다.
도 6f는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커(EpBr_39, EpBr_22, EpBr_138, EpBr_108/서열번호 21 내지 24)의 염기서열이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 마커 중 PCR 증폭이 잘 되지 않거나 peak 선별이 어려운 마커의 예시를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 마커 중 PCR이 안정적이며 peak의 형태가 정확한 마커의 예시를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자바리 multiplex PCR set 마커의 비대립유전자 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 24개의 마커를 통해 친자로 확인된 어미와 방류종자의 유전정보를 비교하여 나타낸 것이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 친자로 확인된 어미와 방류종자의 친자확인 정보를 나타낸 것이다.
본 명세서에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 그리고 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 명세서에서 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는한 복수형도 포함한다.
이하 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 마커에 따른 유전자 분석 대상인 자바리와 같은 수산종의 경우 다량의 개체에 대하여 정확하게 유전자 분석을 시행하고, 경제성 분석의 기초자료를 획득하기 위하여 품종별로 방류효과 조사를 가장 과학적인 친자확인 방법으로 연속적으로 데이터를 축적해 나가는 것이 필수적이다. 수산자원 회복을 위하여 유전자 분석을 통한 과학적 조사는 반드시 필요한 부분이며 사업에 대해 연속성을 가지고 유전자 분석이 이루어져야 한다.
일측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공한다.
유전자를 분석할 수 있는 마커는 변별력 (다형성, polymorphism) 또는 재현성(reproductivity)이 높아야 분석 마커로서 효율이 우수하다.
마이크로새틀라이트(microcetellite) DNA는 1 내지 6개의 염기쌍(base pair, bp) 또는 최대 10개의 염기쌍인 특정 DNA 모티프가 반복되어 나타나는 반복적인 DNA로, 다른 DNA에 비해 돌연변이율 및 유전적 다양성이 높으며, 특정 DNA 모티프가 5 내지 50회 정도 반복되는 것이 특징이므로 (short tandem repeat; STR) 또는 (simple sequence repeat ; SSR)이라고도 한다. 이러한 마이크로새틀라이트 DNA는 이를 활용한 마이크로새틀라이트 마커 즉, SSR 마커는 진핵 생물의 유전체에 다수 존재하는 2~10 bp의 짧은 염기서열의 반복에 기반을 두어 개발되는 마커로, 변별력 (다형성, polymorphism) 및 재현성(reproductivity)이 높아 생물종의 유전자 다양성을 분석하거나 질병을 진단하고 친자를 확인하는 등의 DNA 프로파일링에 많이 사용되고 있다.
본 발명의 마커 조성물에서 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열은 2 내지 4개의 염기쌍이 반복되는 반복서열을 포함할 수 있으며, 이러한 반복서열은 마이크로새틀라이트(microcetellite) 영역 또는 SSR(simple sequence repeat) 영역이라 할 수 있다. 이러한 반복서열을 포함하는 본 발명의 마커는 바람직하게 2개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 디마이크로새틀라이트 마커(di-microcetellite marker, di-마커), 3개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 마커를 트리마이크로새틀라이트 마커(tri-microcetellite marker, tri-마커), 4개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 마커를 테트라마이크로새틀라이트 마커(tetra-microcetellite marker, tetra-마커)일 수 있다. 더욱 바람직하게 본 발명의 마커 조성물은 8 내지 16개의 디마이크로새틀라이트 마커, 3 내지 11개의 트리마이크로새틀라이트 마커 및 1 내지 9개의 테트라마이크로새틀라이트 마커를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 마이크로새틀라이트 마커 즉, 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열은 ACCA, AC, AAT, GT, TATC, GGA, TGT, ATCC, ATA, CA, CATC, TG, GT, AG, TCAA, 및 TGAT 중에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 마커(서열번호 1 내지 24) 내에서 5 내지 50회 반복되어 나타날 수 있고, 특정 서열을 반복하는 모티프(repaet motif)라 할 수 있으며, 바람직하게는 마커 내에서 7 내지 30회 반복되어 나타날 수 있다.
본 발명의 마커 조성물은 바람직하게 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 8 내지 24개의 염기서열(마커)을 포함할 수 있다. 본 발명의 마커는 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 안정적으로 증폭될 수 있고, 마커의 식별력이 우수하며, 대립유전자의 다양성이 확보되어 있고, 비대립유전자가 존재하지 않을 수 있다. 이러한 마커의 서열 길이는 90 내지 400(bp)일 수 있으며, 더 바람직하게는 100 내지 350(bp)일 수 있다.
또한, 본 발명의 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물은 자바리의 친자확인 및 유전적 다양성을 분석할 수 있으며, 유전적 다양성은 구체적으로 자바리의 대립유전자 수, 대립유전자 빈도(Allele frequency), 다형성정보지수(PIC;Polymorphic Information Content), 이형접합체율 관찰치(Ho) , 이형접합체율 관찰치(Ho), 대립유전자 수를 보정하는 allelic richness, 유전자 다양성(gene diversity), 근친교배계수(FIS), Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)에 대한 유의성 검증 등의 분석을 의미할 수 있다.
보다 상세하게 유전자 정보를 이용하여 수행하는 친자확인은 Exclusion 방법 및 Maximum Likelihood 방법을 이용할 수 있다. Exclusion 방법은 멘델의 유전법칙에 기초하여 2배체인 척추동물인 경우, 부의 유전형이 A/B이고 모의 유전형이 A/B인 경우 어떤 경우에도 다음 세대 자손은 A/C가 나올 수 없으며 A/C가 나오는 경우는 친자확인에서 제외하는 방법이다. 인간을 상대로 하는 친자확인은 대부분 Exclusion 방법을 사용할 수 있으며, 법적인 문제와 연결되어 있어서 법정에서 거의 100% 확실한 증거로 이용될 수 있어야하기 때문에 어떤 경우에도 Fasle positive 또는 negative assignment가 있어서는 안된다는 것을 전제조건으로 한다. Exclusion 방법을 사용할 경우에는 부모의 수가 한정되어야 하며 보다 많은 강력한 유전자 마커가 있어야 하고 어떠한 경우에도 Genotyping error나 mutation 등이 없어야 하며, 이러한 조건을 만족시킬 경우 가장 강력하고 확실한 친자확인 방법이 될 수 있다.
Maximum Likelihood 방법은 통계적인 처리를 통하여 가장 높은 통계적 확률을 가지는 부모에게로 친자확인이 되는 방법이다. 가축이나 어류에서 육종프로그램 등 근친교배를 방지하기 위한 수단으로 사용되기 때문에 반드시 사람의 경우처럼 100% 확실한 친자확인이 필요하지 않으므로 많은 데이터를 분석해야 하는 자연집단의 경우에 적용하기 유리하며 약간의 Genotyping error와 mutation 가능성도 수용하기 때문에 수산생물과 같이 부모의 수가 많거나 많은 자손을 가지는 집단의 친자확인 분석에는 더 바람직한 방법이 될 수 있다. 본 발명에서는 수산생물인 자바리를 친자감별하고자 하며, 친자감별 대상인 자바리의 부모와 종자의 개체수가 많으므로 보다 적합한 Maximum likelihood 방법을 이용하여 친자확인을 수행하였다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 자바리 유전자 분석용 조성물을 제공한다.
자바리와 같은 수산종의 유전자 분석을 위해서는 다량의 개체를 분석해야하므로 바람직하게 multiplex PCR 기법을 이용하여 짧은 시간에 다량의 샘플을 정확하게 분석하는 것이 효과적일 수 있다. 이러한 multiplex PCR을 통한 자바리 유전자 분석을 위하여 본 발명의 자바리 유전자 분석용 조성물은 마커 조성물을 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 하나의 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커에 대한 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)를 모두 포함할 수 있다. 또한, DNA를 중합하기 위한 DNA 중합효소(DNA polymerase), 10X 버퍼, dNTP(DNA 복제에 필요한 A, C, G, T 염기들), 물(3차증류수)을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34, 서열번호 35와 36, 서열번호 37과 38, 서열번호 39와 40, 서열변호 41과 42, 서열번호 43과 44, 서열번호 45와 46, 서열번호 47과 48, 서열번호 49와 50, 서열번호 51과 52, 서열번호 53과 54, 서열번호 55와 56, 서열번호 57과 58, 서열번호 59과 60, 서열번호 61과 62, 서열번호 63과 64, 서열번호 65와 66, 서열번호 67과 68, 서열번호 69와 70, 및 서열번호 71과 72로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열 쌍으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게 홀수의 서열번호 프라이머는 정방향 프라이머, 짝수의 서열번호 프라이는 역방향 프라이머일 수 있다. 이러한 프라이머는 FAM, VIC, NED 및 PET 중에서 선택된 하나 이상의 형광물질로 표지될 수 있으며, 형광물질은 프라이머의 5' 쪽에 부착하여 PCR 시 증폭산물의 크기가 중복될 경우 색으로 이를 구별하게 할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머의 길이는 15 내지 30 bp일 수 있으며, 바람직하게는 18 내지 25 bp일 수 있다. 프라이머의 염기서열을 나타내는 서열번호 25와 26은 서열번호 1에 대한 프라이머, 서열번호 27과 28은 서열번호 2에 대한 프라이머, 서열번호 29와 30은 서열번호 3에 대한 프라이머, 서열번호 31과 32는 서열번호 4에 대한 프라이머, 서열번호 33과 34는 서열번호 5에 대한 프라이머, 서열번호 35와 36은 서열번호 6에 대한 프라이머, 서열번호 37과 38은 서열번호 7에 대한 프라이머, 서열번호 39와 40은 서열번호 8에 대한 프라이머, 서열변호 41과 42는 서열번호 9에 대한 프라이머, 서열번호 43과 44은 서열번호 10에 대한 프라이머, 서열번호 45와 46은 서열번호 11에 대한 프라이머, 서열번호 47과 48은 서열번호 12에 대한 프라이머, 서열번호 49와 50은 서열번호 13에 대한 프라이머, 서열번호 51과 52는 서열번호 14에 대한 프라이머, 서열번호 53과 54는 서열번호 15에 대한 프라이머, 서열번호 55와 56은 서열번호 16에 대한 프라이머, 서열번호 57과 58은 서열번호 17에 대한 프라이머, 서열번호 59과 60은 서열번호 18에 대한 프라이머, 서열번호 61과 62는 서열번호 19에 대한 프라이머, 서열번호 63과 64는 서열번호 20에 대한 프라이머, 서열번호 65와 66은 서열번호 21에 대한 프라이머, 서열번호 67과 68은 서열번호 22에 대한 프라이머, 서열번호 69와 70은 서열번호 23에 대한 프라이머, 서열번호 71과 72는 서열번호 24에 대한 프라이머일 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 24로 이루어진 군으로부터 하나 이상의 마이크로새틀라이트 마커를 선택하는 제 1단계; 서열번호 25 내지 72로 이루어진 군으로부터 상기 제 1단계에서 선택된 마이크로새틀라이트 마커에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머를 선택하는 제 2단계; 상기 선택된 마이크로새틀라이트 마커 및 프라이머를 이용하여 분석하고자 하는 자바리 시료를 멀티플렉스 PCR 증폭하여 PCR 산물을 형성하는 제 3단계; 및 상기 PCR 산물을 이용하여 분석하고자 하는 자바리 시료의 유전적 다양성을 분석하는 제 4단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자바리 유전자 분석방법을 제공한다.
제 1단계의 서열번호 1 내지 24의 마이크로새틀라이트 마커는 2 내지 4개의 염기쌍이 반복되는 반복서열을 포함할 수 있으며, 이러한 반복서열은 마이크로새틀라이트(microcetellite) 영역 또는 SSR(simple sequence repeat) 영역이라 할 수 있다. 이러한 반복서열을 포함하는 마이크로새틀라이트 마커는 바람직하게 2개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 디마이크로새틀라이트 마커(di-microcetellite marker, di-마커), 3개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 마커를 트리마이크로새틀라이트 마커(tri-microcetellite marker, tri-마커), 4개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 마커를 테트라마이크로새틀라이트 마커(tetra-microcetellite marker, tetra-마커)일 수 있다. 더욱 바람직하게 서열번호 1 내지 24의 마이크로새틀라이트 마커는 8 내지 16개의 디마이크로새틀라이트 마커, 3 내지 11개의 트리마이크로새틀라이트 마커 및 1 내지 9개의 테트라마이크로새틀라이트 마커를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 자바리 유전자 분석방법 제 1단계의 마이크로새틀라이트 마커 즉, 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열은 ACCA, AC, AAT, GT, TATC, GGA, TGT, ATCC, ATA, CA, CATC, TG, GT, AG, TCAA, 및 TGAT 중에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 마커(서열번호 1 내지 24) 내에서 5 내지 50회 반복되어 나타날 수 있고, 바람직하게는 마커 내에서 7 내지 30회 반복되어 나타날 수 있다.
제 1단계에서는 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 안정적으로 증폭될 수 있고, 마커의 식별력이 우수하며, 대립유전자의 다양성이 확보되어 있고, 비대립유전자가 존재하지 않으며, 서열 길이가 90 내지 400(bp)인 마이크로새틀라이트 마커를 선택할 수 있다.
제 2단계에서는 제 1단계에서 선택된 마커에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머를 선택할 수 있으며, 바람직하게 서열번호 25와 26은 서열번호 1에 대한 프라이머, 서열번호 27과 28은 서열번호 2에 대한 프라이머, 서열번호 29와 30은 서열번호 3에 대한 프라이머, 서열번호 31과 32는 서열번호 4에 대한 프라이머, 서열번호 33과 34는 서열번호 5에 대한 프라이머, 서열번호 35와 36은 서열번호 6에 대한 프라이머, 서열번호 37과 38은 서열번호 7에 대한 프라이머, 서열번호 39와 40은 서열번호 8에 대한 프라이머, 서열변호 41과 42는 서열번호 9에 대한 프라이머, 서열번호 43과 44은 서열번호 10에 대한 프라이머, 서열번호 45와 46은 서열번호 11에 대한 프라이머, 서열번호 47과 48은 서열번호 12에 대한 프라이머, 서열번호 49와 50은 서열번호 13에 대한 프라이머, 서열번호 51과 52는 서열번호 14에 대한 프라이머, 서열번호 53과 54는 서열번호 15에 대한 프라이머, 서열번호 55와 56은 서열번호 16에 대한 프라이머, 서열번호 57과 58은 서열번호 17에 대한 프라이머, 서열번호 59과 60은 서열번호 18에 대한 프라이머, 서열번호 61과 62는 서열번호 19에 대한 프라이머, 서열번호 63과 64는 서열번호 20에 대한 프라이머, 서열번호 65와 66은 서열번호 21에 대한 프라이머, 서열번호 67과 68은 서열번호 22에 대한 프라이머, 서열번호 69와 70은 서열번호 23에 대한 프라이머, 서열번호 71과 72는 서열번호 24에 대한 프라이머일 수 있다.
제 3단계에서 PCR 산물을 형성하는 과정은 바람직하게 Multiplex PCR을 이용할 수 있으며, PCR을 실시하기 위해 필요한 구성은 본 발명의 자바리 분석용 조성물의 구성와 그에 대해 상술한 설명과 동일 또는 유사하므로, 생략하기로 한다.
자바리 유전자 분석을 위한 Multiplex PCR set를 구성하기 위해서 자바리 유전자 분석방법의 제 1단계에서는 바람직하게 서열번호 1 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 8 내지 24개의 마이크로새틀라이트 마커를 Multiplex PCR set에 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 서열번호 1 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 8개의 마이크로새틀라이트 마커를 Multiplex PCR 1 set 당 포함할 수 있다.
이에 근거하여 자바리의 유전자 분석을 실시할 수 있는 PCR 키트를 조합할 수 있다. 이러한 PCR 키트는 서열번호 1 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함할 수 있으며, 마커에 상보적인 염기서열은 갖는 서열번호 25 내지 72로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 자바리 분석용 조성물의 구성과 동일한 구성요소를 포함할 수 있다.
제 4단계는 자바리 시료의 유전자좌당 대립유전자 빈도, 대립유전자 수, 다형성정보지수, 이형접합체율, 유전자 다양성, 및 근친교배계수 중에서 선택된 하나 이상을 분석할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 자바리 유전자 분석방법에서의 유전적 다양성 분석은 자바리의 대립유전자 수, 대립유전자 빈도(Allele frequency), 다형성정보지수(PIC;Polymorphic Information Content), 이형접합체율 관찰치(Ho) , 이형접합체율 관찰치(Ho), 대립유전자 수를 보정하는 allelic richness, 유전자 다양성(gene diversity), 근친교배계수(FIS), Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)에 대한 유의성 검증 등의 분석을 의미할 수 있다. PCR 산물을 이이용하여 자바리 시료의 유전적 다양성을 분석하는 과정은 하기 실시예에 더욱 상세히 설명되어 있다.
하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
<실시예>
실시예 1 - 자바리 분석용 마이크로새틀라이트 마커 제작 & 프라이머 합성
자바리의 유전자 분석을 위한 마이크로새틀라이트 마커를 제작하고, 마커의 증폭효율과 유전변이 검증을 위해 마이크로새틀라이트 마커 증폭용 프라이머를 합성하였다. 마커 제작 및 프라이머 합성 과정은 하기의 실시예에 따라 실시하였다.
실시예 1-1 - DNA 추출 방법
자비리 분석용 마커를 제작하기 위하여 자바리 DNA를 NGS(Next Generation Sequencing) 분석하였으며, 이를 위해 자바리 4개체의 DNA를 추출하였다. 우선, 30 mg의 자바리 샘플 조직을 증류수로 세척하고 분쇄한 후 ML1 buffer 350 ㎕와 Proteinase K 25 ㎕을 넣고 60℃에서 4시간 이상 반응시켰다. 350 ㎕의chloroform : isoamyl alcohol를 넣어 잘 섞고, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 1.5 ml tube로 옮겼다. 이후 동일 양의 BL buffer와 10 ㎕의 RNase A 넣고 섞어 70℃에서 10분간, 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응물에 동일 양의 100% EtOH을 넣고 잘 섞어서 HiBind Column으로 옮기고 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 통과액을 제거하고 HBC buffer 500 ㎕를 넣었으며, 다시 한번 원심분리하고 통과액을 제거하여DNA wash buffer 700 ㎕를 넣었다. 동일한 rpm에서 2분간 원심분리하여 column에 남은 시약을 완전히 제거한 후, column을 1.5 ml tube에 옮겨 Elution buffer 30 ㎕를 넣고 실온에서 1분간 반응하였으며, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 최종적으로 DNA를 추출하였다.
실시예 1-2 - NGS(Next Generation Sequencing) 분석
실시예 1-2-1 - QC (Quality control) check
실시예 1-1에 따라 추출한 DNA의 library를 제작하기 전 DNA의 농도와 순도를 확인하기 위하여 QC(Quality control) 체크를 수행하였다. 이를 위해 DNA gel loading을 실시하고, spectrophoto meter 장비인 Nanodrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 통해 DNA의 순도와 농도를 측정하였다. DNA의 순도를 나타내는 지표인 A260/A280 값이 1.6 ~ 2.0 사이가 나오는지 확인하였으며, 제작된 library의 사이즈와 농도 및 순도를 2100 BioAnalyzer(Agilent)를 이용하여 확인하였다.
실시예 1-2-2 Raw data 생성
실시예 1-2-1의 품질검사를 통과한 자바리 DNA에 대한 raw data를 생성하기 위하여 NGS기기인 HiSeq system (HS4000, llumina)를 이용하였으며, 500 bp의 insert size를 가지는 read를 genome size의 15배 이상인 15 Gb이상 생산을 목표로 data를 생성하도록 하였다. FLASH tool을 이용해 read 1과 2를 병합하였으며 assembly를 진행하여 contig graph를 얻은 후 최종의 untangled assembly를 진행하였다. 생산된 Total base reads를 확인한 후 Q20 에 해당하는 data의 생산량을 확인하였다. Q-score는 염기를 호출할 때 발생할수 있는 오류 가능성에 대한 대수적인 수치라 볼 수 있으며 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘못 불러올 확률로 99%의 정확성을 나타낼 확률을 의미한다.
실시예 1-3 - 마이크로새틀라이트 마커 제작 및 프라이머 합성
실시예 1-3-1 - 마커 및 프라이머 디자인
생산된 data는 Q20이 90%이상인 reads만 남기고 필터링을 실시하고 De novo assembly 후, SSR region만 선별하며 반복되는 sequence를 찾는 MISA tool을 이용 하여 PCR product가 100 ~ 350 bp의 크기를 가지는 SSR 마커 프라이머를 디자인하고 합성하였으며, Annealing temperature는 58 ~ 60℃, GC contents는 40 ~ 60%으로 하여 진행하였다. NGS 분석진행 후 SSR region의 마커 디자인이 완료되면 프라이머 서열 내에 반복된 서열이 없고 증폭부위의 SSR repeat region이 2 bp인 경우, 3 bp인 경우, 4 bp인 경우를 모두 포함하여 1차적으로 마커를 선별하였다. 또한 다른 마커와의 중복성 검사를 통해 서로 같은 부위를 증폭하지 않도록 하고 해당 마커의 개체 염기서열을 Mega(ver.7) 프로그램을 통해 multiple alignment를 하여 확인하였다.
실시예 1-3-2 - PCR screening
1차 선별된 마커 후보군을 이용하여 PCR screening을 실시하였다. PCR의 경우 효율이 좋은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하였으며 PCR machine은 Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 사용하였다. 이를 통해 4개체를 빠르게 PCR screening test를 실시하여 동일한 온도에서 디자인 된 마커를 통해 해당 사이즈의 증폭 유무를 확인하였으며, PCR 진행 시 사용되었던 시약 농도 및 PCR 조건은 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 1-3-3 - 전기영동 및 NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST
PCR screening test를 실시한 1차 선별된 마커 후보군의 DNA fragment 전기영동 결과를 통해 2차로 마커를 선별하였다. 전기영동은 1.5% agarose gel을 이용하였으며, 120 V, 30분간 loading 하여 결과를 확인하였다. 이 후 2차 선별된 마커는 NCBI BLAST를 이용하여 기존에 등록된 Fragment의 SSR(simple sequence repeats) region과 현재 개발되는 마커들 사이에 SSR region이 중복 여부를 검증하였으며, Cluster W multiple align을 통해 개발하고자 하는 마커 간의 sequence가 중복 여부를 확인하였다. 이후, 2차 선별된 마커를 이용하여 Multiplex PCR set를 제조한 후 최적의 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커를 선별, 제작하였다.
실시예 2 - 자바리 분석용 Multiplex PCR set 제작
실시예 2-1 - Multiplex PCR set 조합
상기 실시예 1에 따라 선별된 마커를 포함하는 Multiplex PCR set 제작하기 위하여 Dye labeled 프라이머 합성을 진행하였다. Dye labeled 프라이머는 정방향 올리고 (forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지의 형광물질을 부착하고 증폭물의 크기가 서로 중복될 경우 형광물질 색으로 구분할 수 있도록 다른 색의 형광물질로 표지시켰으며, 이러한 Dye labeled 프라이머를 이용하여 마커의 PCR을 실시하였다. 이때, PCR 증폭 효율을 높이기 위해서 GeNet Bio사의 HS Prime Taq DNA Polymerase(2.5 units/μl)를 사용하였으며, Multiplex PCR 증폭 유무, 해당 범위의 peak의 높이 정도와 모양 등을 확인하고, scoring을 실시하여 genotyping 시 null allele가 없는지 확인하였다. null allele test는 micro-checker program (ver 2.2)을 이용하였으며 null allele 발생 시 해당 마커를 Multiplex PCR set 선별에서 제외하였다.
실시예 2-2 - Multiplex PCR set 제작
Null allele가 포함되지 않으며 8개의 마커를 포함한 Multiplex PCR set을 이용하여 PCR을 실시하고 이를 통해 Multiplex PCR set의 조건을 확립하였다. 증폭이 완료된 PCR 산물은 30X dilution 시킨 후, 희석된 증폭산물과 Strandard size standard GeneScan LIZ500(Applied Biosystems, USA)및 Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA)의 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료는 자동염기서열 분석 장치를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동 하였으며, 각 마커에 대한 표준 allele ladder를 제작하여 GeneMapper version 4.0 (Applied Biosystems, USA)등의 분석프로그램을 통해 모든 개체를 scoring하고 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 자료를 취합하고 분석하였다. 또한, Multiplex PCR 시 재현성을 위하여 PCR 조성 및 조건 등을 확립하여 가장 적합한 PCR 조건을 갖춘 Multiplex PCR set를 제작하였다.
<실험예>
실험예 1 - 유전적 다양성 평가
상기 실시예에 따라 개발된 24개 마커 multiplex PCR 3 set를 이용한 자바리 200개체의 유전적 다양성 분석을 위하여 유전자좌당 대립유전자 빈도(Allele frequency), 다형성정보지수(PIC;Polymorphic Information Content), 대립유전자수, 관찰치 및 기대치 이형접합체율 (Ho, He), 동일개체 출현율을 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)을 통하여 구하였으며, 최소 샘플수를 기준으로 대립유전자 수를 보정하는 allelic richness와 gene diversity, Fis 값을 FSTAT ver2.93 software (Goudet, 1995)를 통해 구하였다. Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)에 대한 유의성 검증은 adjusted p값인 Bonferroni correction을 적용하도록 하였으며, Cervus 3.07 software에서 분석된 P 값을 도출해내었다. 하기 표 2는 유전적 다양성 정보 분석 항목 및 분석에 사용한 장치를 나타낸 것이다.
실험예 2 - 마커의 식별력 확인
상기 실시예에 따른 마이크로새틀라이트 마커와 multiplex PCR set의 exclusion power를 계산 및 분석하였다.
n이라는 대립유전자에 대한 일반적인 exclusion 공식(Jamieson 1965, 1966)은 하기 수학식 1이며, 유전자 마커의 exclusion power는 하기 수학식 2에 적용하여 나타내었다.
[수학식 1]
P=
pi(1-p)2-
(PiPj)2[4-3(pi+pj)]
[수학식 2]
Pmax=n-4(n-1)(n3-n2-2n+3)
실험예 3 - 친자확인 시험
자바리 종자생산용 보유어미 127개체와 자연산 자바리 어미 후보군 103개체 및 방류종자 97제체의 유전 정보를 Maximum Likelihood 방법을 통해 비교분석하여친자여부를 확인하였다.
<평가 및 결과>
결과 1 - 자바리 DNA의 NGS 분석
상기 실시예 1-1 내지 1-2에 따라 자바리 4개체에 대한 DNA를 추출하고 NGS 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 3 내지 표 5 및 도 1에 도시하였다.
자바리 4개체에 대한 DNA를 추출하고 DNA gel loading을 실시한 결과, 모든 자바리 개체에서 genomic DNA의 main band가 확인되었으며, A260/A280의 값이 1.6-2.0 범위 내의 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 자바리 4개체의 DNA가 모두 고품질로 추출된 것알 알 수 있었으며, NGS 분석에 사용할 수 있음을 확인하였다.
상기 4개체의 자바리 DNA 중 main band가 가장 정확히 나오고 순도 및 농도가 적당한 EpBr02 개체를 이용하여 실시예에 따라 library를 제작하고, de novo assembly를 진행하였으며, assembly 결과 및 DNA의 길이 정보를 하기 표 4에 나타내었다.
또한, 생성된 NGS data를 이용하여 Total read bases, Total reads 수, GC(%), Q20(%), Q30(%) 값을 도출해냈으며 해당 값들은 표 5에 나타내었다.
자바리의 Total read bases의 경우 15G bases 이상 생성을 완료하였다. 상기 표 5의 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘못 불러올 확률로 99% 정확성을 나타낼 확률을 의미하며, Q30은 염기 1000개를 불러올 때 1개의 염기를 잘못 불러올 확률로 99.9% 정확성을 나타낼 확률을 의미한다. 상기 표 5에 따르면, 99%의 신뢰도를 기준으로 생산된 데이터는 전체의 96.91%로 나타났으며, 99.9%의 신뢰도를 기준으로 생산된 데이터는 전체의 93.05%로 매우 높은 결과 값을 나타났다. 이로써 본 발명의 자바리 DNA가 매우 높은 신뢰도를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
결과 2 - 마커 및 프라이머 디자인, 제작 (PCR & 전기영동 & NCBI BLAST)
상기 실시예 1-3에 따라 자바리 분석용 마이크로새틀라이트 마커 및 그 프라 이머를 제작하였으며, 그 결과를 도 2a 내지 도 6f에 도시하였다.
실시예 1-1 내지 1-2에 따라 생산된 데이터의 SSR region이며, product size가 100 ~ 350 bp의 크기를 가지는 마커를 선별하였다. 우선적으로, 상기 실시예에 따라 생산된 자바리 데이터의 SSR region을 바탕으로 dinucleotide(2 bp)는 288,442개, trinucleotide(3 bp) 는 137,356개 tetranucleotide(4 bp)는 69,552개가 나오는 것을 확인할 수 있었다. 이후 SSR region에서 나온 repeat motif를 기준으로 Tm 값(annealing Temperature)을 58 ~ 60℃, 증폭 fragment size가 100 ~ 350 bp 범위로 두고 프라이머 디자인을 진행하였으며, 증폭효율을 높이기 위해 primer sequence 중 반복서열이 없으며 GC값이 60% 이상 되지 않으며 예상 fragment size를 100 ~ 350 bp가 되도록 한 결과, 프라이머 150 set를 1차 선별할 수 있었다.
1차 선별된 마커 후보군을 이용하여 PCR screening을 실시하고 전기영동을 한 결과, 도 2a와 같이 gel 상에서 밴드가 명확히 나타나며 다양성이 확보되는 마커 후보군을 80개를 2차적으로 선별할 수 있었으며, 도 2b 내지 도 2c와 같이 증폭이 되지 않거나 다양성이 확보되지 않는 마커 후보군은 2차 선별에서 제외하였다. 2차 선별된 마커는 1차 선별된 마커 후보군의 전기영동 결과를 도시한 도 3a 내지 도 3f에서 빨간색으로 표시하였다.
일반적으로 마커 후보군 선발 및 개발에서 동일한 SSR region에 대한 여러 마커가 제작되는 경우가 있어 본 발명에서는 이러한 부분의 오류를 방지하기 위해 모든 마커에 대한 증폭 부위 fragment sequence를 이용하여 중복 여부를 확인하였다. NCBI BLAST를 이용하여 중복여부를 확인한 결과, 2차 선별된 80개 마커와 기존에 등록된 Fragment의 SSR region 사이에 SSR region이 중복되지 않는 것을 확인할 수 있었으며, Cluster W multiple align을 통해 개발하고자 하는 마커 간의 sequence가 중복되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 도 4는 EpBr_40 마커에 NCBI database blast 통한 중복성 검사 결과를, 도 5는 Multiple align 통한 개발하고자하는 di-마커 중복성 검사 결과를 도시하고 있다.
2차 선별된 마커를 이용하여 상기 실시예 2에 따라 자바리 분석용 Multiplex PCR set를 제작하고 상기 실시예 및 실험예에 따라 그에 대한 비대립유전자 유무, 식별력을 확인하여 증폭효율이 우수하고 마커의 식별력이 우수하며, 대립유전자 다양성을 확보하고 있고, 비대립유전자가 없는 24개의 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커를 최종적으로 선별, 제작하였으며 이러한 마커의 서열을 도 6a 내지 도 6f에 도시하였다.
결과 3 - 자바리 분석용 Multiplex PCR set 제작
상기 실시예 2에 따라 자바리 분석용 Multiplex PCR set를 제작하였으며, 그 결과를 하기 표 6 내지 표 12 및 도 7a 내지 도 8에 도시하였다.
우선, 상기 실시예 1에 따라 선별된 마커의 di-, tri-, tetra 비율을 고려하여 형광물질이 표지된 프라이머를 제작한 결과, 50개의 dye labeled 프라이머를 제작할 수 있었다. dye labeled 프라이머는 다른 색의 형광물질을 프라이머에 부착하여 표지함으로써 사이즈가 겹치는 프라이머를 구분할 수 있도록 한다.
제작된 dye labeled 프라이머를 이용하여 2차 선별된 마커의 PCR 증폭 유무를 확인한 결과, 도 7b와 같이 증폭이 잘 되지 않거나 peak 선별이 어려운 마커를 제외하고 도 7a와 같이 PCR이 안정적이며 peak의 형태가 정확한 총 35개의 마커를 선별하였다.
Dye에 따른 range가 고려된 마커의 유전자형 분석 및 다양성 분석 결과, 대립유전자 수가 최소 7개 이상 나타나고, PCR 증폭 효율이 안정적인 것을 선별기준으로 하여 최종적으로 8개의 마커로 구성된 multiplex PCR set 3개를 제작하였으며, 하기 표 6 내지 표 8에 최종 선별된 24개의 마커와 마커에 대한 프라이머 정보를 나타내었다.
제작된 Multiplex PCR을 시행하기 위한 PCR 조건을 확립하기 위해 annealing temperature에 따른 영향 및 multiplex PCR 시 넣게 되는 시약 농도의 영향을 고려하여 touch-down PCR 방식으로 온도를 낮춰주며 annealing temperature에 따른 영향을 최소화하하고 시약의 조성 및 조건을 보정하여 최적화한 결과를 하기 표 9 내지 표 12에 나타내었다. 표 9 내지 표 11은 자바리 Multiplex PCR set 별 PCR 조성을 나타내며, 표 11은 자바리 Multiplex PCR 조건을 나타낸다.
Scoring이 완료된 자바리의 genotyping data를 기초로 micro-checker 프로그램을 통해 24개의 마커에 대한 null allele의 유무를 확인한 결과, 24개 마커 모두 null allele 가능성이 없는 것으로 나타났으며, 그 결과를 도 8에 도시하였다.
결과 4 - 자바리 유전적 다양성 평가
상기 실시예 1 내지 2에 따른 자바리의 multiplex PCR set를 이용하여 자연 어미집단 103개체, 치어 집단 97개체로 총 200개체의 유전적 다양성 및 집단유전학적 분석을 실시하였으며, 그 결과를 표 13 내지 표 15에 도시하였다.
그 결과, 전체 200개체에 대한 대립유전자의 수는 7 ~ 32개로 평균 12.6개가 나왔으며 그 중 자연 어미 집단 103개체에서는 7 ~ 31개로 평균 12.5개, 치어 집단 97개체에서는 4 ~ 11개로 평균 6.9개가 나타났다. 24개의 마이크로새틀라이트 마커 중 EpBr_66, EpBr_26 에서 allele 수가 7개로 가장 적게 나타났으며, EpBr_40 마커에서는 32개로 가장 많이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 개체수의 편차에 따른 대립유전자 수 보정치(allele richness)를 적용하여 분석한 결과, 자바리 전체 200개체에서는 6.94 ~ 31.97개로 평균 12.6개, 자연 어미 집단 103개체에서는 6.90 ~ 30.93개로 평균 12.47개, 치어 집단 97개체 에서 4.00 ~ 11.00개로 평균 6.87개가 나타났으며, 대립유전자 수 보정치(Ar)는 대립유전자의 수(K)와 유사하게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
한 개체의 마커에서 두 개의 대립유전자가 서로 다르게 나타나는 비율인 이형접 합체율 기대치(He)는 전체 200개체에 대해서는 평균 0.769가 나왔으며, 자연 어미 103개체에서 평균 0.744, 치어 97개체에서 평균 0.720으로 치어 집단보다 자연 어미 집단에서 다소 높은 수준으로 나타났다. 또한, 이형접합체율 관찰치(Ho)는 전체 200개체에 대해서는 평균 0.785가 나왔으며, 자연 어미 103개체에서 평균 0.763, 치어 97개체에서 평균 0.809로 치어 집단에서 다소 높은 수준으로 나타난 것을 확인하였다.
다형성정보지수(PIC; Polymorphic Information Content)는 전체 200개체에 대해서는 평균 0.739가 나왔으며, 자연 어미 103개체에서 평균 0.744, 치어 97개체에서 평균 0.675으로 자연 어미 집단에서 높은 수준으로 나타났다.
HWEp (HWE; Hardy-Weinberg equilibrium)는 adjusted p 값인 Bonferroni correction을 적용하였으며 자연 어미 103개체에 대해서는 평균값이 0.4044, 치어 97개체는 0.1204로각 마커에서의 유의성검정에서의 차이는 없는 것으로 나타났다. 하지만 치어 집단에서는 각 마커 유의성검정 결과를 보면 일부 마커에서 (EpBr_01, 11, 26, 27, 40, 81, 82, 98, 125, 130, 145) 차이가 있는 것으로 확인되었으며, 이는 분석된 집단이 소수개체에 대한 분석, 인위적인 교배 등의 원인들 중 하나로 유전적 평형을 유지하지 못할 가능성이 높은 것을 의미한다.
추가적으로 근교계수(FIS)는 자연 어미 103개체에 대해서는 0.013, 치어 97개 체는 -0.127로 매우 낮은 값을 나타내었으며, 이는 유전적으로 안정된 상태에 있어 특징이 급변할 가능성은 대단히 낮다고 볼 수 있다. Gene diversity (Ge.Di) 는 전체 평균 0.769로 높은 값을 나타내었으며, 자연 어미 103개체는 0.774, 치어 97 개체에 대해서는 0.719로 모두 높은 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
결과 5 - 마이크로새틀라이트 마커 식별력 분석
상기 실시에 및 실험예에 따른 자바리 200개체 분석 결과에 대한 각 마이크로새틀라이트 마커의 exclusion power를 계산하여 multiplex PCR set의 exclusion power를 계산 및 분석한 결과, 마커 전체의 exclusion power는 1.14638X10 -11 으로 높은 변별력을 나타내었으며, 추가 개체에 대한 분석이 이루어질 경우 큰 범위는 아니지만 어느 정도의 오차가 생길 가능성이 있을 수 있으나 전체적으로 특정 유전형에 편중된 것이 아닌 것으로 보아 마커의 식별력은 우수한 것으로 사료된다.
결과 6 - 자바리 친자확인 분석
상기 실시예 및 실험예 3에 따라 본 발명의 마커를 이용하여 자바리 종자생산용 보유어미 127개체와 자연산 자바리 어미 후보군 103개체 및 방류종자 97제체의 유전 정보를 비교분석하여 친자여부를 확인하여 그 결과를 도 9a 내지 도 9b에 도시하였다.
그 결과, 어미후보군 103개체에서 방류종자 97개체와 친자로 확인된 개체는 나타나지 않았으나, 보유어미와 방류종자의 친자확인 결과, 95개체가 친자로 확인되어 친자확인율이 97.9%로 나타났으며, 보유어미 중 친자로 확인된 개체는 11개체로 나타났다.
친자로 확인된 어미와 방류종자의 유전정보를 비교한 도 9a에서 24개의 마커를 통해 어미로부터 종자에게 마커별 대립유전자가 하나씩 유전된다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 24개의 모든 마커에서 방류종자와 어미가 친자확인이 되었다는 것을 의미한다.
또한, 친자로 확인된 어미와 방류종자의 친자확인 정보를 나타낸 도 9b에서 친자로 확인된 어미의 수와 번호, 각각의 어미에 대한 친자확인 빈도를 확인할 수 있었다.
부모 세대의 유전자 빈도와 자손 세대의 유전자 빈도는 동일하며, 표현형의 개체수를 이용하여 대립 유전자 빈도를 추정할 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 자바리의 친자확인이 가능하며, 이를 이용하여 수산자원 증대를 위한 방류종자 생산용 어미를 관리하고 나아가 생태 친화적 방류종자를 생산하고 방류하여 생태계 건강성을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
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bruneus genes and methods for distinguishing Epinephelus bruneus
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<213> Epinephelus bruneus
<400> 1
gataccctac acgcccatcc accactgcag ccttcacacc cttgtatccg tttacagtgc 60
agacaaacaa atagtaggct ggaggattca tcacgcaatc ttgcttcaac aagcatgaat 120
ttgcaatagt tgagaccttc aagtcaaatt taagcctcct tggggcaaaa gtgtggccgc 180
caaagggtgg aaaaattgat gactgaatga ccaaccaacc aaccaaccaa ccaaccaacc 240
aaccaacaaa acaagctgca gacctactgg 270
<210> 2
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agcgtcagat ccttcagcag cactgaggac acacacacac acacacacac acacacacac 60
acacacactc tgagctcaat gtgttgtgtt atcatgtgtt acctcggtaa ccagcaggtc 120
atggatgtag tcgagagcac agatgactcc tgtcctccca ca 162
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cagccctaaa ccaccattgc cagttttacc taactccatt ttaacaataa taataataat 60
aataataata ataatatact agtccatacc cattggtagc tttgtcacct tctacctatg 120
ccaatcctca atgcctatgt gcagt 145
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<212> DNA
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<400> 4
gcatcagcac tgtgagcatg ttagcatgcg gccgctatca tccacatatc aacctcctct 60
gagcctgtat acagtctcac agagctgcag gcatgactgg agtctggtta caataacttc 120
acccagtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtttgctta tatctccctg 180
tgcctgctgt attataacag acaggcagct gagctcatac tgtctcctcc ttctcgtctt 240
cacacttcac acccgtctg 259
<210> 5
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tgaaaccatt gggaggcagt gctagacggt ctgacattta gacacaatcc actgatacct 60
gattgatttc tgctgtagtg tttttatagt gttgttaagg caccaagtta tctatctatc 120
tatctatcta tctatctatt tcaacactta catattttat aaagtgtgcc aaacatgctc 180
agttatgaag agatcctcta agacagaggt ttcaaacata cggcccatgg tctagaaccg 240
gcccaccaaa gggtgctatc tggcccactt ga 272
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agaggtaaac acagcctggc aaaaaatagc gttcatctct gcatccatct ctgattctgg 60
gctcaaagat gagaatcctt tggcaggaat ttctctttct catgtgcgta cacacacaca 120
cacacacaca cacacacaca cacacactca ctctatctct ctgtttctat ctcgacacac 180
aaattgaatc tgtggtcttg acagggcaag a 211
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gagggactag ttgtagctct taccaacata gtcattccac attgctgttg ttgttgttgt 120
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<213> Epinephelus bruneus
<400> 15
tctggttagt cgccgagttg cagaattttg agtctctcag tggtgttttg tggtccatcc 60
atacatccat ccatccatcc atccatccat ccatccatcc atcacattac cattaataca 120
atactttagc ccacagacaa ctaatgtgta aatattcacc taccttagta tgtactcctg 180
aataggagtg accatgcggc catcttggaa ag 212
<210> 16
<211> 106
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 16
gaggattatg gttgcacgcg tttctgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60
tgtgaatgtc agccacagga agtgagggtc ggcatgggtg tcaaag 106
<210> 17
<211> 146
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 17
atgcagagta cacagggctg cgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60
taccggtgtg ggagggaggt ctgcttgtag ctgccaccgc tgtctgtccc actgcctgat 120
caaaattcag cagccagcca cattta 146
<210> 18
<211> 206
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 18
tgcagccaag gtagtgaagg ataatgaatc catttctatg ggcagtttga caatacatgt 60
agctgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtttctgttg ctttgtgcat ttttagccac 120
actagctgtg tggccccagg aatggctatg gcaaaatatc tcttggtcgg tccaacactg 180
tggctctgca gaccagcgtt tgagat 206
<210> 19
<211> 115
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 19
cagtgggttt gcttcacgtg catttgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg ggctggggtt 60
cagaatctca gtcataatca gctcagtcag cagggtgtca gtctgcgcag tgatt 115
<210> 20
<211> 114
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 20
tgcacagcta cggatctctg tacagagtca aaagttagag agagagagag agagagagag 60
agagagagag agagagagag agactaacaa acgcaaagac gaataccaga cagc 114
<210> 21
<211> 259
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 21
cctcaggcgc tcaggattag aacaggacac agcagggagc ctcatccatt caggcgagca 60
gctttgctat tggtgtggat tgtttcggtg accaaagtat tctacctccc tgtgcataca 120
cagcgttgaa acacaaaaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 180
ctgtgagcta cttataacca cacttcttca tttgctccct caaacatgta ttgctgtaaa 240
cagctagggg gaagtctgt 259
<210> 22
<211> 162
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 22
cgaggacatc aagtctcccg gtatcctgga ccaaagatga aaaggcttcc gcggaatgag 60
aacaagtcat acacacacac acacacacac acacacacac acactgtaca tacttccaat 120
tacaaacaag ctgtaacaca catactcaca cgtcttgcag ca 162
<210> 23
<211> 264
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 23
cgccatagct tgatgtgcac ctccccagaa atgtaactac acgtcacagt gacacagacc 60
tcctgtctgt ttctgtaagc tgaaaccatt tccctcaatc aatcaatcaa tcaatcaatc 120
aatcaatcaa tcaatcaatc aaccaatcaa tcaatcaatc aattttactt ataaagccca 180
atatcacaaa tcataatttg cctcacaggg ctttacaaca tacaacatcc ctctgtcctt 240
aggaccctca cagctgaaca ggaa 264
<210> 24
<211> 100
<212> DNA
<213> Epinephelus bruneus
<400> 24
aggcagcagc tcatgaatga tgtgtactga ttgattgatt gattgattga ttgattgatt 60
gattgattga ttgagcaacc agctgatcat tgaatcttca 100
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
gataccctac acgcccatcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
ccagtaggtc tgcagcttgt 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
agcgtcagat ccttcagcag 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
tgtgggagga caggagtcat 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
cagccctaaa ccaccattgc 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
actgcacata ggcattgagg a 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
gcatcagcac tgtgagcatg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
cagacgggtg tgaagtgtga 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
tgaaaccatt gggaggcagt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
tcaagtgggc cagatagcac 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 35
agaggtaaac acagcctggc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
tcttgccctg tcaagaccac 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 37
tgacgtcacc atggtctgtg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 38
gagtctggac aggaaacgca 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 39
actggactca ttgagctgca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 40
tgtcacaaag ctggtgtcca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 41
ttcccgcgga actgattgaa 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 42
aggcagaaca ggtgtgacaa 20
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 43
tagaatgcta cccgccgtg 19
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 44
aactgtgaag ctactaggtc act 23
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 45
agggaactgc acactaatga 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 46
ctctacgagg ataagcagtt 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 47
acagccggca ttaactgtga 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 48
ctttcatgtc gaagcagccg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 49
ctgcagaagg cctggaagat 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 50
ctggtccatg tgccttcact 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 51
cttcgctcat tggctgaagc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 52
tgactgcagg cattggtgat 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 53
tctggttagt cgccgagttg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 54
ctttccaaga tggccgcatg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 55
gaggattatg gttgcacgcg 20
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 56
ctttgacacc catgccgac 19
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 57
atgcagagta cacagggctg 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 58
taaatgtggc tggctgctga 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 59
tgcagccaag gtagtgaagg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 60
atctcaaacg ctggtctgca 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 61
cagtgggttt gcttcacgtg 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 62
aatcactgcg cagactgaca 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 63
tgcacagcta cggatctctg 20
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 64
gctgtctggt attcgtcttt gc 22
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 65
cctcaggcgc tcaggattag 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 66
acagacttcc ccctagctgt 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 67
cgaggacatc aagtctcccg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 68
tgctgcaaga cgtgtgagta 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 69
cgccatagct tgatgtgcac 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 70
ttcctgttca gctgtgaggg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 71
aggcagcagc tcatgaatga 20
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 72
tgaagattca atgatcagct ggt 23
Claims (6)
- 서열번호 1 내지 24로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 자바리 친자확인용 마이크로새틀라이트 마커 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 염기서열은 2 내지 4개의 염기쌍이 반복되는 반복서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 자바리 친자확인용 마이크로새틀라이트 마커 조성물.
- 제 1 항에 따른 자바리 친자확인용 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 자바리 친자확인용 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 25와 26, 서열번호 27과 28, 서열번호 29와 30, 서열번호 31과 32, 서열번호 33과 34, 서열번호 35와 36, 서열번호 37과 38, 서열번호 39와 40, 서열변호 41과 42, 서열번호 43과 44, 서열번호 45와 46, 서열번호 47과 48, 서열번호 49와 50, 서열번호 51과 52, 서열번호 53과 54, 서열번호 55와 56, 서열번호 57과 58, 서열번호 59과 60, 서열번호 61과 62, 서열번호 63과 64, 서열번호 65와 66, 서열번호 67과 68, 서열번호 69와 70, 및 서열번호 71과 72의 염기서열 쌍으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자바리 친자확인용 조성물.
- 서열번호 25 내지 72로 이루어진 군으로부터 서열번호 1 내지 24로 표시되는 마이크로새틀라이트 마커에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머를 선택하는 제 1단계;
상기 마이크로새틀라이트 마커 및 프라이머를 이용하여 분석하고자 하는 자바리 시료를 멀티플렉스 PCR 증폭하여 PCR 산물을 형성하는 제 2단계; 및
상기 PCR 산물을 이용하여 분석하고자 하는 자바리 시료의 유전적 다양성을 분석하는 제 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자바리 친자 확인 방법.
- 제 5 항에 있어서,
상기 제 3단계는 자바리 시료의 유전자좌당 대립유전자 빈도, 대립유전자 수, 다형성정보지수, 이형접합체율, 유전자 다양성, 및 근친교배계수 중에서 선택된 하나 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 자바리 친자 확인 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190123590A KR102111238B1 (ko) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190123590A KR102111238B1 (ko) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102111238B1 true KR102111238B1 (ko) | 2020-05-14 |
Family
ID=70736984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190123590A KR102111238B1 (ko) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | 자바리 유전자 분석용 마이크로새틀라이트 마커 조성물 및 이를 이용한 자바리 분석방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102111238B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102193649B1 (ko) * | 2020-09-01 | 2020-12-21 | 전라남도 | 차세대 염기서열분석법을 이용한 돌돔(Oplegnathus fasciatus) 개체 식별용 마이크로세틀라이트 마커 |
Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| KR101499695B1 (ko) * | 2014-09-18 | 2015-03-16 | 대한민국 | 바리과 어류 중 능성어 및 붉바리 신속 판별 유전자 마커 및 판별방법 |
| KR20160138857A (ko) | 2015-05-26 | 2016-12-06 | 대한민국(농촌진흥청장) | 연산 오계 닭 품종 판단용 snp 마커 및 이의 용도 |
| KR101796306B1 (ko) | 2016-04-27 | 2017-11-10 | 제주대학교 산학협력단 | 말전복 탐지용 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 말전복 탐지 방법 |
| JP2018000116A (ja) * | 2016-07-04 | 2018-01-11 | 国立大学法人東京海洋大学 | 成長性遺伝形質を有するアカマダラハタの識別方法 |
-
2019
- 2019-10-07 KR KR1020190123590A patent/KR102111238B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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| Title |
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| Qi Liu et al., Aquaculture, 414-415, p.63-81, 2013.* * |
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| KR102193649B1 (ko) * | 2020-09-01 | 2020-12-21 | 전라남도 | 차세대 염기서열분석법을 이용한 돌돔(Oplegnathus fasciatus) 개체 식별용 마이크로세틀라이트 마커 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| R401 | Registration of restoration |