KR102530342B1 - 홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법 - Google Patents
홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 홍해삼의 집단간의 유전적 차이와 분자생물학적 유연관계를 분석하여 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 홍해삼의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사, 선발육종 등 유전학적 연구에 과학적이고 정확한 기초자료로 이용할 수 있는 홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법을 제공한다.
Description
본 발명은 홍해삼에 대한 유전적다양성 및 집단구조분석, 혈연 관계 확인, 가계 선발, 육종 등에 대해 과학적으로 빠르고 쉽게 알 수 있도록 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 NGS(Next-Generation Sequencing)를 수행하여 대량의 염기서열정보를 확보하고 microsatellite region(초위성체 부위)를 발굴하여 시간과 비용절감이 가능한 동시 증폭 마커(multiplex PCR set)를 개발하여 홍해삼에 대한 정확한 유전형분석으로 방류효과조사, 선발육종, 교배지침 등 전반적인 분자유전학적연구를 과학적이고 체계적으로 수행 가능이 가능하도록 하는 홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법에 관한 것이다.
극피동물(Echinodermata)에 속하는 해삼은 우리나라 및 주변국 연안을 따라 100 종 이상이 분포하고 있고, 그중에서 20여종이 식용 가능하다. 그 중 제주도의 특산자원으로 자리 잡은 홍해삼(Stichopus japonicus)은 돌기해삼과의 한 종으로서 아시아 일대에서 주로 양식 되고 있다. 홍해삼은 2006년부터 본격적으로 방류사업이 진행되어 현재는 연간 약 80톤을 생산하고 있다.
해삼은 산업적으로 색에 따라 홍해삼, 청해삼 및 흑해삼으로 구분되어 왔으나 분류학상으로는 동일 종으로 인식되어왔다. 그러나 최근 연구결과 세 종간의 유전적 다형성이 존재하는 것으로 보고되었고, 그 중에서도 홍해삼은 다른 해삼에 비해 맛과 향이 뛰어나 고가에 판매되고 있다.
해삼의 산업화가 정착된 중국은 세계 최대 해삼 생산국이나 생산량이 줄고 소비량이 증가하여 대량 수입국으로 전환되고 있으며, 중국 연안해역의 오염 확산으로 세계 최대 생산국인 중국의 해삼 생산량이 감소하고 있다. 따라서, 중국에서는 멸종위기종으로 정부차원의 보호 및 전 세계 해삼자원 유지를 위해 많은 지원을 하고 있다. 이러한 추세는 양식 해삼의 유전적 열성화 방지 및 우수 품종 생산을 위한 유전학적 연구의 발판이 되었고 해삼 육종을 위한 연관 유전자 지도가 작성되어 분자육종 기반을 구축하고 있을 뿐만 아니라 양식집단 열성화 추정을 위해 집단 다양성 분석으로 양식집단의 유전적 관리 및 자원관리가 이루어지고 있다.
현재 국내에서도 홍해삼의 수요가 점차 증가하고 있어 경제적인 가치가 높으나 홍해삼 양식은 아직 제한적으로 이루어지고 있는 실정이다. 우리나라는 해삼 인공종묘 대량 생산기술이 산업화 초기단계로 기술 산업화 정착을 위해서는 우량 인공종묘 생산 기술이 안정화가 되어야 한다.
유전자 표지자는 유전자 좌위에 있는 돌연변이나 변형에 의해 일어난 다양성을 보여줄 수 있다. 유전자 표지자는 짧은 DNA서열로, 예를 들어 하나의 염기의 변화로 생긴 단일 염기 다형성(SNP), RFLP(제한효소 절편길이 다형성, Restriction fragment length polymorphism), SSLP(단순 염기서열 길이 다형성, Simple sequence length polymorphism), AFLP(유전자 증폭산물 길이 다형성, Amplified fragment length polymorphism), RAPD(DNA 다형성 무작위 증폭, Random amplification of polymorphic DNA), VNTR(가변수 직렬반복, Variable number tandem repeat) SSR, 단순 서열 반복, Simple sequence repeat) 같은 것들이 있다.
SSR(simple sequence repeat, 또는 microsatellite)는 생물체 genome상에 존재하는 2~8 bp의 염기서열이 단순 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 부분이다. 이를 이용한 SSR 마커는 다형성 정도가 높아서 유전적 다양성과 유연관계를 평가하는데 많이 이용되고 있으며 수산분야 역시 SSR 마커를 이용한 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계 확인, 선발육종 등 많은 부분에 이용되고 있다.
일반적으로 사람 및 동물에서처럼 많은 유전체 연구가 진행된 경우는 데이터베이스상에서 SSR 정보를 확인 및 선발을 통해 마커 개발이 가능하나 수산분야에서는 현재 많은 유전체분석 연구가 진행되지 않아 직접 대량의 염기서열 데이터 정보를 확보하고 목적에 맞는 마커를 발굴해 나아가야 한다. 최근에는 수산전문기관에서 각 수산 종에 대한 NGS 분석(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱) 뿐만 아니라 다른 여러 유전체분석 방법을 이용하여 목적에 맞는 마커 발굴 및 개발을 진행하고 있다.
우선적으로는 확보되는 전장유전체염기서열을 이용하여 SSR 영역을 탐색하고 변별력, 효율성, 정확성 등을 검증함으로써 SSR 마커를 개발하고 있는 추세이다. 또한 많은 종에 대한 판별 및 집단, 계통분석, 친자확인 등에 과학적인 조사 방법으로 이용이 되고 있어 마커 개발의 당위성이 높아지고 있다.
본 연구에서는 NGS를 이용하여 홍해삼의 염기서열을 밝혀내고 SSR 부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 대한 마커를 개발하고자 하였다. 국내 등록특허번호 제10-2301324호에는 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있고, 국내 등록특허번호 제10-2077917호에는 넙치 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있으나, 상기 선행문헌은 본 발명과 대상 어종이 상이한 차이점이 있다.
본 발명은 홍해삼의 집단간의 유전적 차이와 분자생물학적 유연관계를 분석하여 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 홍해삼의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사, 선발육종 등 유전학적 연구에 과학적이고 정확한 기초자료로 이용할 수 있는 홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 홍해삼의 친자 식별용 프라이머 세트는 R_StJa(4)_053, R_StJa(3)_027, R_StJa(3)_086, R_StJa(3)_144, R_StJa(3)_023, R_StJa(4)_066, R_StJa(4)_141, R_StJa(4)_058의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 1 및 2, 3 및 4, 5 및 6, 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 14, 15 및 16의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 홍해삼의 친자 식별용 프라이머 세트는 R_StJa(3)_091, R_StJa(3)_150, R_StJa(3)_075, R_StJa(3)_129, R_StJa(3)_017, R_StJa(4)_081, R_StJa(3)_167, R_StJa(3)_070의 8개로 이루어진 군으로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며 서열번호 17 및 18, 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24, 25 및 26, 27 및 28, 29 및 30, 31 및 32의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면 상기 프라이머 쌍을 포함하는 홍해삼 친자 식별용 마커 조성물을 제공하는 것일 수 있다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면 상기 프라이머 쌍을 포함하는 홍해삼 친자 식별용 키트를 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 홍해삼 친자 확인 방법은 분석하고자 하는 홍해삼의 핵산 시료를 청구항 제1항 또는 제2항의 홍해삼 친자 식별용 키트를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 단계, 상기 증폭 단계에서 증폭된 산물을 이용하여 유전적 다양성을 분석하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 홍해삼 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자확인방법은 높은 정확도로 친자관계 판별이 가능하여 신뢰성이 높은 결과의 도출이 가능한 효과가 있어 홍해삼의 집단, 계통분석, 친자 확인 등에 적용하여 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발할 수 있도록 기본 데이터 베이스를 제공이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 마커별 대립유전자 크기 범위 및 형광염료 표지를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 A-set의 마커별 대립 유전자 빈도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 B-set의 마커별 대립 유전자 빈도를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 홍해삼 부모개체 유전자형 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 홍해삼 자식개체 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실험예에 따른 친자확인 결과를 나타낸다.
도 7은 실험예에 따른 친자관계지수를 이용한 정규분포를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 False positive & False negative 분석결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 A-set의 마커별 대립 유전자 빈도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 B-set의 마커별 대립 유전자 빈도를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 홍해삼 부모개체 유전자형 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 홍해삼 자식개체 유전자형 분석결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실험예에 따른 친자확인 결과를 나타낸다.
도 7은 실험예에 따른 친자관계지수를 이용한 정규분포를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 False positive & False negative 분석결과이다.
본 발명의 용어 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 Simple sequence repeats (SSR)라 불리는 microsatellite는 non-coding 부위에 존재하는 1-6 bp의 단순 염기서열이 반복되는 부분으로 유전체상의 빈번한 분포, 높은 변별력 및 검출이 간편한 마커로써 집단유전학, 유연관계 분석, 친자확인 및 개체식별에 있어 유용한 DNA 마커를 지칭한다.
본 발명에서 용어, "멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자을 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 멀티플렉스 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는 데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
멀티플레스 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제 (inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 PCR 적용 시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
본 발명에서 "프라이머(Primer)"는 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 여기에 정의된 프라이머들이라는 용어는 DNA의 합성을 준비할 수 있는 DNA 가닥들을 말한다. DNA 중합효소(polymerase)는 프라이머 없이 처음부터 DNA를 합성할 수 없다. DNA 중합효소는 오직 상보적인 가닥이 조립되는 뉴클레오티드들의 순서를 지시하기 위한 주형으로서 사용되는 반응에서 존재하는 DNA가닥을 연장할 수 있다. 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일가닥이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형된 뉴클레오타이드 또는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱"은 많은 양의 리드들(reads), 전형적으로 동시에 몇 백보다 많은 수천 또는 수많은 서열 리드들의 순서를 발생시킬 수 있는 시퀀싱 기술이다. 차세대 시퀀싱은 고식적생거 또는 모세관 시퀀싱(capillary sequencing)으로부터 구별되고 그리고 분명하다. 전형적으로, 서열화된 산물들은 전형적으로 대략 600~30 염기쌍 사이에서, 상대적으로 짧은 리드들을 가진다. 상기 기술들은 전형적으로 추가적으로 광범위하고 정교한 데이터 저장 및 리드 조립(read assembly) 등을 위한 데이터처리 작업 흐름을 구성한다.
분석 대상종의 염기서열 정보가 충분히 밝혀진 경우에는 SSR 정보를 직접 탐색하여 마커를 개발할 수 있으나, 염기서열 정보가 불충분한 경우 새로운 영역을 개발해야만 한다. 이를 개발하기 위해 최근에는 NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱)를 이용하여 마커 개발 대상종으로부터 대량의 염기서열 정보를 분석하고, SSR 영역을 직접 탐색함으로써 SSR 마커를 개발하는 방법이 이용하고 있다. 초기의 대규모 시퀀싱의 경우, 고비용으로 시간도 오래 걸렸으나 기술의 발전으로 더욱 빠르고 저렴하게 분석되어 많은 종의 유전자를 밝히는 데 이용되고 있으며 SSR 마커가 개발되지 않은 수산종에 대하여 NGS를 이용한 염기서열 확보와 microsatellite마커 개발의 당위성이 높아지고 있다.
본 발명은 NGS를 이용하여 홍해삼의 염기서열을 밝혀내고 SSR부위를 이용한 친자확인, 집단구조분석, 선발, 가계분석 등에 적용할 수 있는 마커를 제공하고자 한다.
본 발명은 홍해삼의 유전자형을 과학적으로 빠르고 쉽게 알 수 있도록 분석하는 방법을 제공한다. 상기 분석은 NGS(Next-Generation Sequencing)를 수행하여 대량의 염기서열정보를 확보하고 microsatellite region(초위성체 부위)를 발굴하여 동시 증폭 마커(multiplex PCR ) 2set을 제공함으로써 홍해삼에 대한 유전형 분석시간과 비용절감이 가능하다.
본 발명의 조성물을 이용한 유전자 분석 및 이를 이용한 친자 확인방법은 홍해삼의 방류효과조사, 선발육종, 교배지침, 유전적 다양성 및 집단구조분석 등 전반적인 분자유전학적연구 포함하는 것일 수 있다. 이하, 본 발명의 실험예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
<실험예 1> DNA 추출과정
NGS 분석하기 위해서는 High quality DNA를 추출하며, 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법 또는 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 이용하여 수행하였다.
NGS(Next-Generation Sequencing, 차세대염기서열분석법) 수행 시 정확한 데이터 생산을 위해 High quality DNA 추출을 진행하였다. High quality DNA를 추출하기 위해서는 샘플 수령 후 다음 날 즉시 채취된 조직의 약 1 cm2 내외로 절단하고 멸균 3차 증류수로 세정 후 BIONEER/OMEGA사의 DNA 추출키트를 이용하여 진행하였다.
<실험예 2> Library 제작
DNA library 제작은 Quality 높은 Raw data를 생산하기 위하여 Library QC(Quality control) test를 실시하였으며 Agilent 사의 2100 BioAnalyzer를 사용하여 확인하였다. Library QC를 통과하는 농도 기준인 Total volume이 10ug일 때 최소 5nM 이상 되도록 하였으며 Library QC가 통과 후 de novo assembly를 진행하였다.
Illumina sequencer인 Hiseq4000을 이용하여 넙치의 NGS raw data를 생산하였으며 총 데이터 생산량은 genome size의 15배 이상인 15Gb이상 생산하였다. 생산된 Total base reads를 확인한 후 Q20에 해당하는 data를 filter 하여 정렬하였다.
<실험예 3> 프라이머 제작
3-1 NGS 분석진행 후 SSR 영역 marker design
Q-score는 염기를 호출할 때 발생할 수 있는 오류 가능성에 대한 대수적인 수치라 볼 수 있으며 Q20은 염기 100개를 불러올 때 1개의 염기를 잘못 불러올 확률로 99%의 정확성을 나타낼 확률이다.
생산된 data는 Q20이 90%이상인 reads만 남기고 필터링을 실시하고 De novo assembly 후 SSR region만 선별하며 Primer3(version 0.4.0) program을 이용하며 해당 지역의 marker를 design하였다. 동시 증폭을 위해서 Annealing temperature은 58~60℃로 맞추며 GC contents은 40~60%, product size는 100~350bp 마커를 디자인하였다.
3-2 동시 증폭 위한 marker 제작
최종선발되는 마커는 모든 분석을 마친 후에 되므로 사이즈별 구간을 나누어 random 하게 형광 Dye를 부착하였다. labeled primer는 정방향 올리고 (forward primer)의 5′쪽에 FAM, VIC, NED, PET 등 네 가지의 형광물질을 부착하고 증폭물의 크기가 서로 중복될 경우 형광물질 색으로 구분할 수 있도록 다른 색의 형광물질로 표지시켰다. 또한 PCR 조합은 각 마커 간에 사이즈가 오버랩 되지 않으며 형광dye가 겹치지 않도록 임의조합을 구성하고 진행하였다.
<실험예 4> 유전자형 분석
4-1 개발한 동시증폭 중합효소 연쇄 반응(Multiplex PCR 증폭)
하기의 표 1은 홍해삼에 대해 개발된 동시 증폭(Multiplex) 유전자 마커 정보를 나타내고 도 1은 본 발명의 마커별 대립유전자 크기 범위 및 형광염료 표지를 나타낸다.
| Dye | Name | No. | Sequence(5' to 3') | Repeat Motif | Size range |
| FAM | R_StJa(4)_053_F | 1 | GCCACCATGTTATGTGTTGGT | CTTC | 127~251 |
| R_StJa(4)_053_R | 2 | ACAGCGACAATGCCGTATCT | |||
| R_StJa(3)_027_F | 3 | GCAATTTATAGTGGCTACTGCCG | TTC | 122~173 | |
| R_StJa(3)_027_R | 4 | TAATTGCTCCCGTGTGCCTT | |||
| NED | R_StJa(3)_086_F | 5 | ACCAACTGTGTAACTTTGTTGCA | TCT | 183~207 |
| R_StJa(3)_086_R | 6 | GCTAGAGCAGTATAGAATCACAGTG | |||
| R_StJa(3)_144_F | 7 | GGTTATGAAATCGATGACCGGGA | AGG | 284~314 | |
| R_StJa(3)_144_R | 8 | GCCTAGCAAGTCGGCATTCT | |||
| VIC | R_StJa(3)_023_F | 9 | TTTACGCCTGAGGTGGTTGC | GAG | 88~112 |
| R_StJa(3)_023_R | 10 | TCAGAGGGTCTGTCAACAGG | |||
| R_StJa(4)_066_F | 11 | CGATTCAGCTCACAGTCGGA | CTGT | 161~197 | |
| R_StJa(4)_066_R | 12 | GTGCAAACTTGATGACGCCA | |||
| PET | R_StJa(4)_141_F | 13 | GTCCTTTCCCTGGATCCACC | AAAG | 267~295 |
| R_StJa(4)_141_R | 14 | AGTCTGCTATTACATGTAGCATGTCTG | |||
| R_StJa(4)_058_F | 15 | TCCCAGCTATACGGCTCTGT | TGTA | 159~303 | |
| R_StJa(4)_058_R | 16 | TGCATGGATGAAGTCAACAAGA |
| Dye | Name | No. | Sequence(5' to 3') | Repeat Motif | Size range |
| FAM | R_StJa(3)_091_F | 17 | GGTGATAGTGATGTCCAACTCTGC | AGA | 133~154 |
| R_StJa(3)_091_R | 18 | GGTTGATTCCAAGTCATTGCGAGT | |||
| R_StJa(3)_150_F | 19 | ACTTCCTCCTGTTATTCGCCT | AAT | 225~300 | |
| R_StJa(3)_150_R | 20 | CCACCAGAGGCTGATGACTT | |||
| NED | R_StJa(3)_075_F | 21 | AGTGTTCATACATATCTGAAGTGCA | ATC | 168~201 |
| R_StJa(3)_075_R | 22 | TCACACCACCATCACATCATT | |||
| R_StJa(3)_129_F | 23 | CCACAACTCAACTCGCCTCT | CAT | 236~269 | |
| R_StJa(3)_129_R | 24 | GAGGGTATGGGCAAGGGAA | |||
| VIC | R_StJa(3)_017_F | 25 | TACTGTAGCCATGGCAACCC | ATC | 113~134 |
| R_StJa(3)_017_R | 26 | ACAAATCTTCCCACGTTGTGACG | |||
| R_StJa(4)_081_F | 27 | CCGGGCAAATTTCTAGATGTATAGCT | TGTC | 171~223 | |
| R_StJa(4)_081_R | 28 | GCTGCTGCATTACCCTTAGG | |||
| PET | R_StJa(3)_167_F | 29 | GATTGCCCATATGATGCCGC | AAC | 288~324 |
| R_StJa(3)_167_R | 30 | ACTCTGGTTGTCAAGTAACTTGC | |||
| R_StJa(3)_070_F | 31 | TCCCATGATTTGATCCCTGCA | AAG | 94~115 | |
| R_StJa(3)_070_R | 32 | CCATTGCATAGCTCATTCTCTTCCA |
16개의 marker를 포함한 Multiplex PCR 2set을 구성하여 홍해삼의 유전형분석을 실시하였다. 다중 동시 증폭 시스템(multiplex PCR)의 경우, annealing temperature(마커 결합온도), 혼합 시약 조성 및 농도, 조건 등에 대한 최적화 과정이 매우 중요하다.
따라서 홍해삼의 유전형분석을 최적화하였으며 이에 대한 시약 조성은DNA template 1ul(100ng/ul), 10X buffer 1.5ul, dNTP(10mM) 1.5ul, Hot-taq polymerase(2.5U/ul) 0.6ul를 혼합하였다.
형광이 표지된 마커 A세트의 경우 R_StJa(4)_053은 0.15ul, R_StJa(3)_027은 0.1ul, R_StJa(3)_086은 0.2ul, R_StJa(3)_144는 0.25ul, R_StJa(3)_023은 0.1ul, R_StJa(4)_066은 0.15ul, R_StJa(4)_141는 0.3ul, R_StJa(4)_058은 0.35ul로 구성하여 primer mixture로 만들었다.
형광이 표지된 마커 B세트의 경우, R_StJa(3)_091은 0.15ul, R_StJa(3)_150 는 0.25ul, R_StJa(3)_075 는 0.15ul, R_StJa(3)_129는 0.25ul, R_StJa(3)_017은 0.1ul, R_StJa(4)_081은 0.15ul, R_StJa(3)_167은 0.3ul, R_StJa(3)_070은 0.15ul로 혼합하고 총량이 15ul가 되도록 증류수(distilled water)를 넣어주었다.
PCR 조건은 touch-down PCR 방식으로 온도를 낮춰주며 annealing temperature에 따른 영향을 최소화하였다. 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 첫번째 단계로 94℃에서 1분; 58℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 5 싸이클로 반복 수행하고, 두번째 단계로 94℃에서 1분; 57℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 5 싸이클, 세번째로 94℃에서 1분; 56℃에서 90sec 및 72℃에서 1분을 25 싸이클로 반복 수행하였다. 마지막으로 65℃에서 5분 간 최종신장반응을 시켜 준 후 8℃로 마무리하였다.
4-2 유전자형 분석(Genotyping analysis)
증폭이 완료된 PCR 산물은 30X dilution 시킨 후, 증폭산물 1㎕와 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA) 및 Hi-Di Formaide (Applied Biosystems, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료는 자동염기서열 분석장치 인 3730xl DNA Analyzer(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동하였다.
각 마커에 대한 표준 allele ladder를 제작하여 GeneMapper version 4.0(ThermoFisher Scientific, USA)등 분석프로그램을 이용하여 모든 개체를 scoring하고 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 자료를 취합하고 분석하였다.
도 2 내지 도 3은 본 발명에 따른 마커별 대립 유전지 빈도를 비교한 것이다. 각 마커 별로 사이즈가 오버랩되는 부위의 마커는 표지된 형광염료 색 차이로 구분될 수 있으며 파란색으로 나타나는 피크는 FAM, 초록색으로 나타나는 피크는 VIC, 노란색으로 나타나는 피크는 NED, 붉은색으로 나타나는 피크는 PET이며 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 각 마커에 대한 증폭 사이즈(bp)를 알 수 있었다. 각 마커에 대한 빈도를 확인한 결과 전체적으로 안정적인 빈도분포가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 5> 마커에 대한 다형성정보지수 및 유전적 다양성 분석
상기 실험예 1 내지 4에 따른 홍해삼의 multiplex PCR set를 이용하여 제주 종자 50개체, 동해 종자 109개체 및 울릉 어미 91개체 총 250개체의 유전적 다양성 및 집단유전학적 분석을 실시하였다.
대립유전자의 수(K)는 5~14개로 평균 9.19, 대립유전자 수 보정치(allele richness)를 적용하여 분석한 결과도 평균 9.00개로 대립유전자의 수(K)와 유사하게 나타나 증폭효율성면에서도 매우 우수한 것을 알 수 있다.
다형성정보지수(PIC)는 부모로부터 자손에 전달되는 대립유전자를 구별해 낼 수 있는 확률로 다시 말하면 부, 모, 자손의 유전자형을 가지고 측정하는 것으로 개체식별의 측면에서 보았을 때 다양성의 측도라고 할 수 있다. 개발된 16개의 마커에 대한 값은 평균 0.604로 식별력이 높은 마커라는 것이 확인되었다.
16 loci에 대해 개발된 홍해삼 multiplex PCR set를 이용하여 제주 종자 50개체, 동해 종자 109개체 및 울릉 어미 91개체 총 250개체의 유전적 다양성 및 집단유전학적 분석을 실시하였다.
하기의 표 3은 본 발명의 실험예에 따른 유전적 다양성 분석 결과를 나타낸다. 총 250개체에 대한 집단유전학적 분석의 결과를 확인하였을 때 이형접합률 관찰치(Ho)의 평균은 0.620로 나타났으며, 이형접합률 기대치(He)의 평균은 0.656으로 나타났다. 집단 내 근친도를 의미하는 Inbreeding coefficient(Fis)의 평균은 0.044로 나타났다.
| Loci | k | Ar | Ho | He | PIC | FIS |
| R_StJa(3)_017(G) | 7 | 6.85 | 0.573 | 0.519 | 0.419 | -0.103 |
| R_StJa(3)_023(G) | 7 | 6.87 | 0.5 | 0.484 | 0.444 | -0.034 |
| R_StJa(3)_027(Y) | 14 | 13.59 | 0.8 | 0.817 | 0.793 | 0.02 |
| R_StJa(3)_070(R) | 8 | 8 | 0.784 | 0.722 | 0.679 | -0.086 |
| R_StJa(3)_075(Y) | 11 | 10.87 | 0.75 | 0.716 | 0.661 | -0.048 |
| R_StJa(3)_086(Y) | 8 | 8 | 0.636 | 0.605 | 0.543 | -0.051 |
| R_StJa(3)_091(B) | 5 | 5 | 0.139 | 0.686 | 0.636 | 0.798 |
| R_StJa(3)_129(Y) | 10 | 9.97 | 0.5 | 0.51 | 0.465 | 0.02 |
| R_StJa(3)_144(Y) | 8 | 7.92 | 0.593 | 0.753 | 0.71 | 0.213 |
| R_StJa(3)_150(B) | 7 | 6.79 | 0.581 | 0.591 | 0.506 | 0.017 |
| R_StJa(3)_167(G) | 7 | 6.76 | 0.607 | 0.607 | 0.559 | 0.001 |
| R_StJa(4)_053(B) | 12 | 11.63 | 0.471 | 0.701 | 0.665 | 0.328 |
| R_StJa(4)_058(R) | 13 | 12.36 | 0.802 | 0.738 | 0.696 | -0.087 |
| R_StJa(4)_066(G) | 10 | 9.87 | 0.843 | 0.733 | 0.689 | -0.15 |
| R_StJa(4)_081(G) | 13 | 12.73 | 0.704 | 0.797 | 0.769 | 0.116 |
| R_StJa(4)_141(G) | 7 | 6.8 | 0.644 | 0.516 | 0.434 | -0.251 |
| Average | 9.19 | 9 | 0.620 | 0.656 | 0.604 | 0.044 |
※ 대립유전자수(k), 집단 크기를 보정한 대립유전자수(Ar; allelic richness), 이형접합체율 관찰치(Ho; observed heterozygosity), 이형접합체율 기대치(He; expected heterozygosity), 다형성 정보지수(PIC; polymorphism information contents), 근교계수(FIS; inbreeding coefficient)
<실험예 6> 친자확인 분석 및 혈연관계 분석위한 마커 식별력 검증
가축이나 어류에서 친자확인법은 주로 maximum likelihood 방법을 사용하게 되며, 이는 여러 유전형을 통해 통계적으로 분석하는 방법이다. 여기서 중요한 것은 사용되는 마커가 높은 식별력을 가지는 정확한 마커를 사용해야하며 식별력 계산은 하기의 공식에 따라 산정되었다.
<식별력 계산 공식>
하기의 표 4는 마커별 식별력 계산값을 나타낸다. 홍해삼 250개체 분석 결과에 대한 1개의 multiplex PCR set의 exclusion power를 계산 및 분석하였다. 마커 전체의 Exclusion power는 2.0X10-7으로 높은 변별력을 나타내었으며, 이는 개체식별 시 99.9999999% 이상으로 통계적 신뢰수준이 높다는 것을 말한다.
또한 대립유전자빈도에서도 각 마커들이 특정 유전형에 편중된 것이 아닌 것으로 보아 마커의 식별력은 우수하는 것을 뒷받침한다. 따라서 이후에는 본 개발 마커를 이용하여 방류효과조사, 유전적 다양성 분석, 가계검증, 개체식별, 선발육종 등 많은 부분에 사용 가능한 마커로 나타났다.
| Maker | Power of each marker |
| R_StJa(3)_017(G) | 0.6494 |
| R_StJa(3)_023(G) | 0.5674 |
| R_StJa(3)_027(Y) | 0.1735 |
| R_StJa(3)_070(R) | 0.3194 |
| R_StJa(3)_075(Y) | 0.3634 |
| R_StJa(3)_086(Y) | 0.4812 |
| R_StJa(3)_091(B) | 0.3800 |
| R_StJa(3)_129(Y) | 0.5429 |
| R_StJa(3)_144(Y) | 0.2993 |
| R_StJa(3)_150(B) | 0.5443 |
| R_StJa(3)_167(G) | 0.4528 |
| R_StJa(4)_053(B) | 0.3187 |
| R_StJa(4)_058(R) | 0.3027 |
| R_StJa(4)_066(G) | 0.3117 |
| R_StJa(4)_081(G) | 0.2001 |
| R_StJa(4)_141(G) | 0.6199 |
| Exclusion Power | 2.0X10 -7 |
그러나 추가적으로 마커의 고도화를 위해 실제 친자관계의 가계를 이용한 마커 검증과 친자식별력을 분석하고 최종적으로는 오류의 가능성을 고려한 통계적 친자관계 판정을 위해 LOD Score(log of likelihood ratio, 관계지수 로그 값)을 확립하는 과정이 필요할 것이다.
<실험예 7> 친자확인 분석(parentage analysis)
7-1. 부모개체(22_R_StJa_UR_P)
도 4는 본 발명의 실험예 7에 따른 홍해삼 부모개체 유전자형 분석 결과를 나타낸다. 부모집단은 22_R_StJa_UR_P로 명명하며 1번개체의 경우, 22_R_StJa_UR_P_001로 명명하고 상기의 개발된 16개 마커에 대한 친자관계검정 정확도를 분석하기 위해 부모집단 91미에 대한 유전자형 분석을 실시하였다. 분석 방법은 상기에 개발된 16개의 동시증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 유전자형 분석을 진행하였다.
7-2. 자식개체(22_R_StJa_DH_J)
도 5는 본 발명의 실험예에 따른 홍해삼 자식개체 유전자형 분석결과를 나타낸다. 부모 22_R_StJa_UR_P 집단의 개체 간 교배를 통해 생산된 종자 109미를 무작위로 채취하여 상기의 개발된 16개 마커에 대한 친자관계검정 정확도를 분석하기 위해 유전자형 분석을 실시하였다. 분석 방법은 상기에 개발된 16개의 동시증폭 중합효소 연쇄 반응을 통해 유전자형 분석을 진행하였다.
7-3 친자확인 분석 및 통계적 분석
일반적으로 통계분석 및 친자확인을 통해 방류 종자 생산에 참여한 어미와 시료간의 친자확인을 통해 혼획률을 산정하는 것을 parentage analysis (=친자확인) 라고 말한다. 통상적으로 친자확인 분석에서 사용되는 통계적인 친자확인 방법은 휴먼에러를 허용하여 통계적으로 접근하는 Maximum likelihood ratio (Log of likelihood ratio)방법과 1개의 allele 에서라도 상이한 경우, 친자관계에서 제외하는 exclusion 방법을 사용한다.
Exclusion method의 경우는 사람의 재난, 재해, 법의학적 증거자료 등으로서 활용이 되고 있어 휴먼에러를 허용하지 않고 있으며 통상적으로는 16개에 대한 분석 및 대조가 이루어진다. 그러나 Maximum Log of likelihood ratio를 이용하는 방법은 allele의 matching에 있어서 일부 휴먼에러 및 돌연변이로 인한 에러를 허용하고 통계적인 신뢰도 결과를 바탕으로 분석하는 것이다.
따라서, 가축, 식물, 수산생물 등에서는 법적 자료, 이산가족 확인 등과 같은 강력한 증거자료로 이용되기보다는 선발 육종, 방류효과조사, 개체선발, 세대생산 등을 위한 통계적인 평가 도구로서 사용되기 때문에 수산생물에서 주로 사용되는 방법이다.
이는 수산생물의 특성상(변온동물) 사람보다는 많은 variation과 돌연변이들이 존재하기 때문에 누적대립유전자빈도(allele frequency) 및 확률을 이용하여 통계적인 친자확인을 하는 것이 Maximum Likelihood 방법으로 이 방법은 통계적인 처리를 통하여 (대부분 LOD score = loge T/P, T= transmission probability, P= frequency of offspring genotypes in the population) 가장 높은 통계적 확률을 가진 부모에게로 친자확인이 되는 방법이다 (Jones and Adren, 2003).
이것은 많은 데이터를 분석해야 하는 자연집단의 경우에 유리하며 약간의 genotyping error와 mutation 가능성도 수용 가능하기 때문에 수산생물의 자연집단의 친자확인 등 분석에는 더 강력한 방법이 된다. 특히 부모 또는 offspring의 수가 많은 경우 친자확인에 더 좋은 방법이 된다.
따라서 본 발명의 실험예에 따르면 통상적으로 사용되고 있는 Cervus 3.07 software (Marshall et al., 1998)의 parentage analysis를 통해 친자관계 확인 시 mismatch 허용 기준을 도출하였으며 추가적으로는 보다 정확하고 과학적인 결과도출을 위해 친자관계가 성립되는 개체에 대한 likelihood ratio를 산정하고 성립되지 않는 개체들에 대한 simulation을 통한 likelihood ratio 결과 값에 대한 정규분포, false-positive & negative rate 도출 및 친자관계 판정을 위한 Threshold 기준 값도 설정하였다.
이러한 이유는 현재 수산 생물에서의 친자관계 분석 시 mismatch를 무작정 허용하는 것은 과학적인 근거를 설명하기에는 다소 부족한 부분이 있어 본 개발에서는 통계적 검증도 시행하였다. 도 6은 본 발명의 실험예에 따른 친자확인 결과를 나타내고, 표 5는 홍해삼 종자 109미, 부모 91미에 대한 실제 친자검출 정확도 결과를 나타낸다.
| 분석(%) | 분석 적용 기준 | |
| 분석 마리수 | 109(100%) | 부모, 자식개체 200미 분석 |
| 유전형 분석 수 | 109(100%) | 마커16개 중 12개 이상 분석 |
| 가계확인 수 | 109(100%) | 종자 109미 Mismatch 1미 |
개발된 유전자 마커에 대한 SSR 부위의 반복 수는 멘델의 유전 법칙에 의해 자손에게 전달되며, 부모 집단의 유전자형과 비교를 통해 친자 확인이 가능하다. 부모 91개체와 종자 109개체에 대한 친자확인 결과 mismatch '1'을 기준으로 하였을 때 모두 친자관계가 성립되었으며(종자 109개 중 1개체에서 Mismatch가 나타남) 추가적으로 친자관계 판정을 위한 통계적 기준설정을 위해 도 7에 도시된 바와 같이, 정규분포를 작성하고 False positive & False negative rate(%)를 검증하였다.
친자확인 개체와 친자가 아닌 그룹에 대한 정규분포 분석 결과 'Log(LOD) =-3' 기준으로 위양성 및 위음성률이 1% 미만으로 나타나 높은 정확도로 친자관계 확인이 가능할 것으로 판단된다.
도 8은 실험예에 따른 False positive & False negative 분석 결과를 나타낸다. 도 8에 도시된 바와 같이, 친자관계 및 친자관계가 아닌 그룹에 대한 위양성(False positive) & 위음성(False negative)에 대한 값을 도출한 것으로 Log(LOD) 값이 '-3'일 경우 위양성 에러율 0.598% 이며 위음성 에러율의 경우 0.533%로 매우 낮게 나타났으며 이는 친자관계 판정 기준에 대한 신뢰도가 99% 이상이라고 말할 수 있다.
이에 따라 본 특허에서 개발된 홍해삼 16마커를 이용하여 향후 방류효과조사에서 높은 정확도로 친자관계 판별이 가능하여 신뢰성이 높은 결과 도출이 가능한 것으로 사료된다.
본 발명의 홍해삼 친자 식별 마커 및 식별방법은 홍해삼의 집단, 계통분석, 친자 확인 등에 적용하여 높은 계통이나 품종을 새롭게 개발할 수 있도록 기본 데이터 베이스를 제공함으로써, 고부가 가치의 홍해삼 생산에 기여함으로 산업상 이용가능성이 있다.
Claims (3)
- R_StJa(4)_053, R_StJa(3)_027, R_StJa(3)_086, R_StJa(3)_144, R_StJa(3)_023, R_StJa(4)_066, R_StJa(4)_141, R_StJa(4)_058의 8개로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며,
서열번호 1 및 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 15 및 16으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와
R_StJa(3)_091, R_StJa(3)_150, R_StJa(3)_075, R_StJa(3)_129, R_StJa(3)_017, R_StJa(4)_081, R_StJa(3)_167, R_StJa(3)_070의 8개로 이루어지는 마이크로새틀라이트 마커에 특이적이며
서열번호 17 및 18로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 23 및 24로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 27 및 28로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 29 및 30으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 31 및 32로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 홍해삼 친자식별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트. - 청구항 1의 멀티플렉스 PCR용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 홍해삼 친자 식별용 키트
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| 2010년도 국립수산과학원 사업보고서 <한국중국산 산지별 해삼 DNA 마커 개발> * |
| 국내 등록특허번호 제10-2064039호에는 붉바리 각 개체의 유전자형을 분석하기 위한 미세위성마커 및 이를 이용한 붉바리 개체 식별 및 친자확인 방법에 대한 것으로, 구체적으로 10개의 붉바리 미세위성마커(microsatellite marker) 및 이를 증폭하기 위한 각각의 프라이머 쌍 세트이며, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 감별하고자 하는 붉바리의 DNA 시료를 증폭하여 비교 분석하는 방법으로 개체 식별 및 친자 확인을 하는 방법을 포함한다. 본 발명의 상기 미세위성 마커는 붉바리의 친어 집단에 대한 개체 식별 및 친자 확인을 위하여 매우 효율성이 높은 마커를 제공할 수 있으며, 개체식별 및 친자 확인에 효과적으로 사용가능 한 붉바리 개체 식별 및 친자 확인 위한 미세위성 마커에 관하여 개시하고 있다. |
| 국내 등록특허번호 제10-2301324호에는 마이크로새틀라이트 마커 PlYo15, PlYo69, PlYo144, PlYo184, PlYo83, PlYo185, PlYo14, PlYo182의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제1세트와; 마이크로새틀라이트 마커 PlYo32, PlYo51, PlYo70, PlYo152, PlYo27,PlYo169, PlYo41, PlYo57의 8개로 이루어진 마이크로새틀라이트 마커 제2세트;를 포함하여 문치가자미(Limandayokohamae) 친자를 식별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공함으로써, 유전자원의 다양성확보, 개체의 동일성 검정에 가장 적합한 마커 선발 및 마커에 따른 개체 식별확률을 통계적으로 제시하여 다양성이 확보된 문치가자미의 생산 및 이력시스템, 방류효과조사 등에 적용할 수 있는 효과가 있는 문치가자미 친자 식별용 유전자 마커 및 이를 이용한 친자 확인방법에 관하여 개시하고 있다. |
| 이원세, 부경대학교 이학석사학위논문 <한국 해삼의 microsatellite marker의 개발 및 miltiplex PCR을 이용한 유전적 다양성확인> (2015.8.) * |
| 이태욱 등 <홍해삼 유전체 분석에 의한 microsatellite의 분포도 연구> 한국생명과학회 (2022) 32(9):690-697 * |
| 한지성, 부경대학교 수산학박사학위논문 <국내 해삼(Apostichopus japonicus)의 집단유전학분석과 혈연관계 조사 연구> (2022.2.) * |
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