KR102331200B1

KR102331200B1 - 감 품종식별을 위한 kasp 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102331200B1
Application number: KR1020200141247A
Authority: KR
Inventors: 마경복; 양상진; 조예슬; 강삼석
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2021-12-07

Abstract

본 발명은 감 품종식별을 위한 KASP 프라이머 세트 및 이를 이용한 감 품종 식별 방법에 관한 것이다.

Description

감 품종식별을 위한 KASP 프라이머 세트 및 이의 용도 {Kompetitive allele specific PCR primer set for distinguishing persimmon cultivars and and use thereof}

본 발명은 감 품종식별을 위한 KASP 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

감(Diospyroskaki Thunb.)은 신성한 과일이라는 의미를 가지는 'Diospyros' 속에 속하는 과일이다. 감은 식품학적으로도 가치 있으며, 항산화성물질인 폴리페놀과 카로테노이드를 포함하여 많은 양의 Vitamin A와 C를 포함하고 있다.

최근 감 농가에서 이종(異種) 품종의 혼입으로 인한 분쟁이 종종 발생하고 있다. 또한 국내에서 개발된 단감 품종의 보급이 활발히 이뤄짐에 따라, 품종 인식의 중요성이 커지고 있다. 따라서 품종 판별 마커의 개발로 이종 품종을 조기에 진단하고, 육묘 단계에서 이종 품종의 혼입을 원천 차단할 수 있는 분자표지 개발이 필요한 실정이다.

국내에서 품종판별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황의 다른 예를 살펴보면, 시판 고추 F1 품종식별을 위한 SNP 마커 (등록특허 10-0974821), 국내외산 벼 품종식별 SNP 마커 (등록특허 10-0713669), 벼 품종식별을 위한 프라이머 조합 및 이를 이용한 식별방법 (등록특허 10-0974264) 등 유전자 마커를 이용한 다양한 분석법이 농업적으로 활용되고 있으나, 아직 여러 종류의 감 품종을 빠르고 간편하게 식별할 수 있는 분자표지의 개발은 미비한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 감 유전자원을 대상으로 품종 판별이 가능한 15개의 single nucleotide polymorphism (SNP)를 선발하였으며, 이들 마커의 genotyping이 가능한 프라이머 세트를 개발하여 KASP 분석을 수행한 결과 품종을 정확하고 빠르게 판별할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 45로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 감 품종 판별을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 감 품종 판별을 위한 KASP 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 감 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 감 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 상기 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 감 품종의 판별 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 45로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 감 품종 판별을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR(polymerase chain reaction) 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하며 competitive allele-specific PCR의 원리를 이용한다.

본 발명에서 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 적절히 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 당업계에 공지된 방법을 적절히 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않는 범위에서 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 다른 예로, 본 발명의 프라이머는 FRET(Fluorescence resonant energy transfer) 카세트와 상보적인 서열을 가지는 oligo tail이 연결된 것일 수 있다.

본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.

본 발명에서, "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 2개 이상의 PCR 프라이머의 조합을 의미한다. 상기 프라이머 세트는 각각의 영역에 상응하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 감의 유전자 좌에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커의 유전자형을 확인할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에서 용어, "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명에서 검출하고자 하는 SNP 마커는, 단독으로 혹은 1 이상의 다른 SNP 마커와의 조합에 의해 감 품종을 판별하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 15개의 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 하나의 SNP에 대해 3개의 프라이머 서열이 사용되는 것일 수 있다.

상기 프라이머 세트는 2개의 정방향 프라이머 및 1개의 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 2개의 정방향 프라이머는 각각이 FRET 카세트에 연결된 2종류의 형광 물질에 대응하는 oligo tail이 연결되어, 검출하고자 하는 SNP가 동형접합(homozygous)이면 두 종류 중 하나의 형광 시그널만이, 이형접합(heterozygous)이면 두 종류의 형광 시그널이 함께 검출되는 것일 수 있다. 그러나 이는 일 예시로, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 SNP 마커 각각에 대한 프라이머 세트는 (i) 서열번호 3n의 역방향 프라이머; (ii) 서열번호 3n-1의 대립 형질 특이 정방향 프라이머; 및 (iii) 서열번호 3n-2의 정방향 프라이머의 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 상기 n은 1 내지 15의 자연수로 (i) 내지 (iii)의 n은 동일한 값을 갖는 것일 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 하기 표 1에 표시된 것일 수 있다.

[표 1]

본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 Goseongchambansi, Changpyeongpasi, Noansubunsu, Chuyeon, Zenzimaru, Gimhaedanseongsi, Daimaban, Jangseongsetogari, Jeongupbansi, Gwangjubaesi, Jowan, Gimhaechalgam, Gangneungjangsi, Goseongdongcheolsi, Hamyangbansi, Goesangolgam, Gwangjupasi, Wangchu, 05-14-64, Gampung, Jangseongsusi, Sancheongkurigam, Parter, Uljinwonsi, Wonmi, Yeonginjangjunsi, Bonghwagolgam, Jinyangmulbansi, Emon, Sangjuhgdongsi, Taishu 및 Sancheongdanseongsi 중 선택되는 1 이상의 품종을 판별하는 것일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 구현예에서는 95종의 유전자원을 토대로 GBS library를 구축하고 유전체 mapping을 토대로 SNP를 탐색하여 감 품종을 판별할 수 있는 15개의 SNP 마커를 선발하였으며, 이를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 내지 45의 KASP 분석용 프라이머 세트를 개발하여 32개의 감 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다(실시예 4).

한편, 전술한 서열번호에 나타낸 염기 서열과 상보적인 염기 서열에 중간 엄격도, 또는 높은 엄격도 조건에서 혼성화할 수 있는 염기 서열을 갖고, 유사하게 프라이머로서의 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 포함하는, 감 품종 판별을 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR) 분석용 조성물을 제공한다.

상기 프라이머 세트, 감 품종 및 KASP 분석에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서는, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 효과적으로 감 품종 판별이 가능한 것을 확인하였다(도 6a-6c).

본 발명에서 제공하는 감 품종 판별을 위한 KASP 분석용 조성물은 유전자를 증폭, 검출하기 위해 필요한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 조성물은 dNTP 및 중합효소를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물이 포함할 수 있는 임의의 구성요소의 예로, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, FRET 카세트, 반응 완충액, DNA 중합효소 조인자(예를 들어, 마그네슘이온 등), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 중합효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수, MgCl2, 버퍼 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물이 포함할 수 있는 FRET 카세트는 5'에 형광물질이, 3'에 상기 형광물질을 비활성화 시킬 수 있는 소광제가 연결된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 FRET 카세트는 정방향 프라이머 2종류에 각각 대응하는 서로 다른 종류의 형광 물질 2종류가 연결되어, 검출하고자 하는 SNP가 동형접합이면 두 종류 중 하나의 형광 시그널만이, 이형접합이면 두 종류의 형광 시그널이 함께 검출되도록 한 것일 수 있다. 그러나 이는 일 예시로, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 포함하는, 감 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 키트는 유전자를 증폭, 검출하기 위해 필요한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 키트는 dNTP, 중합효소 및 완충액을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 키트가 포함할 수 있는 임의의 구성요소의 예로, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, FRET 카세트, 반응 완충액, DNA 중합효소 조인자(예를 들어, 마그네슘이온 등), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 중합효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수, MgCl2, 버퍼 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트가 포함할 수 있는 FRET 카세트는 5'에 형광물질이, 3'에 상기 형광물질을 비활성화 시킬 수 있는 소광제가 연결된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 FRET 카세트는 정방향 프라이머 2종류에 각각 대응하는 서로 다른 종류의 형광 물질 2종류가 연결되어, 검출하고자 하는 SNP가 동형접합이면 두 종류 중 하나의 형광 시그널만이, 이형접합이면 두 종류의 형광 시그널이 함께 검출되도록 한 것일 수 있다. 그러나 이는 일 예시로, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) 감 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 감 품종의 판별 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예컨대 에탄올 분리법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB(CetylTrimethylAmmonium Bromide) 추출법 등을 이용 및 응용하여 할 수 있으며, DNeasy plant mini kit (Qiagen 사), Wizard prep 키트(Promega 사) 와 같이 생명공학 회사에서 제작 및 판매하는 DNA 추출용 키트를 이용 할 수 있다.

상기 (b) 단계는 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행함으로써 게놈 DNA 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 감 품종 판별 방법은 증폭된 산물을 분석하여 유전형을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트에 포함된 2개의 정방향 프라이머에 각각 대응하는 서로 다른 종류의 형광 물질 2종류 중, 하나의 형광 시그널만 검출되면 유전형이 동형접합인 것으로, 두 종류의 형광 시그널이 함께 검출되면 유전형이 이형접합인 것으로 판별할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 형광은 각각 FAM 및 HEX일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 감 품종 판별 방법은 증폭된 산물을 분석하여 유전형을 확인한 결과를 디지털 신호로 변환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 변환 단계는 동형접합 또는 이형접합으로 확인된 정보를 각각 0 또는 1의 디지털 신호로 변환하는 단계일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 유전형 분석 결과 동형접합을 "a", 이형접합을 "h"로 표시하였고, 이 정보를 다시 "0" 과 과 "1"의 디지털 신호로 전환하고(도 7) "0"은 흰색, "1"은 검은색으로 나타냄으로써 바코드 시스템을 구축하였다(도 8).

본 발명의 프라이머 세트는 감 품종을 정확하고 빠르게 판별할 수 있어 품종 관련 분쟁을 해소하고, 육묘 단계에서 의심 품종을 조속히 진단함으로써 이종 품종 혼입을 원천 차단할 수 있으며, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 Barcode system은 교배친의 유전형 판별도 가능하므로 교배육종에도 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 GBS 라이브러리를 구축하고 SNP를 선발하는 과정을 도식한 것이다.
도 2는 전체적인 GBS 라이브러리 구축 과정을 간략히 나타낸 것이다.
도 3은 GBS 라이브러리 구축을 위해 95종의 유전자원 샘플로부터 분리된 gDNA를 추출하여 전기영동한 결과이다.
도 4는 GBS 라이브러리를 구축 하고 정제(purification)한 것이다.
도 5는 GBS 라이브러리의 QC 결과이다.
도 6a-6c는 본 발명에서 개발한 프라이머를 이용해 유전자형 분석을 한 결과이다. 붉은색과 파란색 점은 동형접합을, 초록색 점은 이형접합을 나타낸다.
도 7은 유전자형 분석 결과를 디지털 신호로 전환하여 바코드 시스템을 제작하는 방법을 나타낸 것이다.
도 8은 유전자형 분석 결과에 따라 변환된, 바코드 시스템을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. DNA 추출 및 GBS library 구축

GBS 기술은 NGS 기반 기술로서, 제한효소를 사용하여 특정 부위의 염기서열을 분석하고, 바코드를 이용하기 때문에 대량의 시료를 한 번에 분석할 수 있으며, NGS 분석에 비해 비용이 저렴하고, 빠르게 분석할 수 있어 높은 수준의 SNP marker들을 탐색하는데 매우 용이하다. 또한 이렇게 탐색된 SNP marker들은 표준 유전체와 비교 후 염색체 상에 mapping 할 수 있다. 이에, SNP marker를 탐색하기 위한 GBS library를 구축하였다.

구체적으로 국립원예특작과학원 배연구소에 식재된 유전자원(단감 17품종, 떫은감 62품종) 및 교배실생(단감 11계통, 떫은감 5계통) 등, 표 2의 총 95개의 감 품종 및 교배실생을 대상으로, DNeasy plant mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 각 샘플의 gDNA를 추출하였다.

GBS 분석에 사용된 작물

No.	Cultivars and accessions	Type	No.	Cultivars and accessions	Type
1	Jowan	PCNA	49	Jinyangmulbansi	non-PCNA
2	Romang	PCNA	50	Hamanbansi	non-PCNA
3	Yeonsu	PCNA	51	Habcheonbansi	non-PCNA
4	Gampung	PCNA	52	Daegutungturi	non-PCNA
5	Wonmi	PCNA	53	Andongsusigam	non-PCNA
6	Wonchu	PCNA	54	Goseongchambansi	non-PCNA
7	Fuyu	PCNA	55	Gimhaedanseongsi	non-PCNA
8	Noansubunsu	PCNA	56	Gimhaechalgam	non-PCNA
9	FJ117	PCNA	57	Sacheonchalgam	non-PCNA
10	Taishu	PCNA	58	Sancheonggojongsi	non-PCNA
11	Changwon	PCNA	59	Sancheongkurigam	non-PCNA
12	Wakagijiro	PCNA	60	Bonghwagolgam	non-PCNA
13	Daeandangam	PCNA	61	Sangjuhagdongsi	non-PCNA
14	Ro-19	PCNA	62	Uljinwonsi	non-PCNA
15	Gosho	PCNA	63	Gwangjubaesi	non-PCNA
16	Shinsyuu	PCNA	64	Guryekurigam	non-PCNA
17	Jiro	PCNA	65	Mujudaesi	non-PCNA
18	05-9-26	PCNA	66	Saburouza	non-PCNA
19	05-11-10	PCNA	67	Saizyou	non-PCNA
20	05-10-16	PCNA	68	Aitsmisiraji	non-PCNA
21	05-11-49	PCNA	69	Daimaban	non-PCNA
22	05-14-64	PCNA	70	Goryengsusi	non-PCNA
23	05-16-65	PCNA	71	Sangjudungsi	non-PCNA
24	05-17-68	PCNA	72	Sangjuwonsi	non-PCNA
25	08-7-62	PCNA	73	Mujudaesi	non-PCNA
26	05-8-62	PCNA	74	Hamanmulgam	non-PCNA
27	08-9-58	PCNA	75	Myongjudolgam	non-PCNA
28	08-7-87	PCNA	76	Yecheonsusi	non-PCNA
29	Mino	non-PCNA	77	Uiseongsagogsi	non-PCNA
30	Emon	non-PCNA	78	Daidanemasi	non-PCNA
31	Zenzimaru	non-PCNA	79	Gwangjupasi	non-PCNA
32	Nishimurwase	non-PCNA	80	Damyangbaegjeongsi	non-PCNA
33	Inayama	non-PCNA	81	Jangseongsetogari	non-PCNA
34	Monbei	non-PCNA	82	Jangseongsusi	non-PCNA
35	Parter	non-PCNA	83	Hwasunpasi	non-PCNA
36	Honeymon	non-PCNA	84	Okcheonbansi	non-PCNA
37	Wangchu	non-PCNA	85	Okcheonbyonggam	non-PCNA
38	Chuyeon	non-PCNA	86	Yeonginbansi	non-PCNA
39	Guryejangdungi	non-PCNA	87	Yeonginjangjunsi	non-PCNA
40	Najupasi	non-PCNA	88	Gangneungjangsi	non-PCNA
41	Damyangkurigam	non-PCNA	89	Goseongdongcheolsi	non-PCNA
42	Jangseongsangchugam	non-PCNA	90	Siheungsangsi	non-PCNA
43	Changpyeongpasi	non-PCNA	91	05-8-29	non-PCNA
44	Hwasunbuduki	non-PCNA	92	05-9-42	non-PCNA
45	Jeongupbansi	non-PCNA	93	05-10-63	non-PCNA
46	Yesanwolhasi	non-PCNA	94	05-11-61	non-PCNA
47	Goesangolgam	non-PCNA	95	05-10-18	non-PCNA
48	Uiryeongbansi	non-PCNA

추출된 DNA는 Thermo Scientific NanoDrop 8000 spectrophotometer (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA)를 이용하여 정제하여 GBS library를 위해 이용되었으며, GBS 분석은 Seeders Inc. (Daejeon, Republic of Korea)에서 수행되었다. GBS library는 표준분석법 (Elshire et at., 2011)에 따라 수행하였다 (도 1). 전체적인 GBS 라이브러리 구축 과정은 도 2에 도시하였다.

GBS library를 위해 95개 샘플의 gDNA에 3.6 U Ape KI 제한효소 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)를 처리하고 75℃에서 2.5 h (20uL reaction volume)반응시켰다. 200 U T4 DNA ligase를 이용하여 barcode adapter와 common adapter를 제한효소 처리된 fragment에 부착하여 pooling하였다. 이 후 95개 샘플들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)를 이용하여 정제하였다.

Barcode adapter는 F-5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCTxxxx-3’와 R- 5′-CWGyyyyAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGA AAGAGTGT-3’ 두 가닥으로 구성하였으며, CWG는 Ape KI 인식 자리로써 공통 어댑터-F와 상보적인 서열을 가지도록 제작하였다 (Elshire et at., 2011) (표 3).

Common adapter는 F-5′-CWGAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGA ATGCCGAG-3’와 R-5′-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT- 3’로 구성하였다.

PCR 증폭에 사용된 primer는 F-5′-AATGATACG GCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCGATCT-3’ (58mer)와 R-5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCC TGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’(61mer)이다 (Elshire et al., 2011). Primer- F의 3’ 말단은 barcode adapter와 상보적으로 결합할 33개 염기서열을 포함하고 있고, primer-R의 3’말단은 common adapter와 상보적으로 결합할 33개 염기 서열을 포함하고 있다.

PCR은 95℃ 2 m (1 cycle), 95℃ 30 s, 62℃ 30 s, 68℃ 30 s (16 cycle), 그리고 68℃ 5 m의 조건으로 수행하였다.

완료된 샘플은 겔 전기영동과 Quality control (QC) 분석을 통해 최종적으로 GBS 분석을 위한 적합 여부를 판단하였다.

No.	Barcode	No.	Barcode	No.	Barcode
1	CTCC	33	TCGTT	65	AATATGC
2	TGCA	34	GGTTGT	66	ACGTGTT
3	ACTA	35	CCAGCT	67	ATTAATT
4	CAGA	36	TTCAGA	68	ATTGGAT
5	AACT	37	TAGGAA	69	CATAAGT
6	GCGT	38	GCTCTA	70	CGCTGAT
7	CGAT	39	CCACAA	71	CGGTAGA
8	GTAA	40	CTTCCA	72	CTACGGA
9	AGGC	41	GAGATA	73	GCGGAAT
10	GATC	42	ATGCCT	74	TAGCGGA
11	TCAC	43	AGTGGA	75	TCGAAGA
12	TGCGA	44	ACCTAA	76	TCTGTGA
13	CGCTT	45	ATATGT	77	TGCTGGA
14	TCACC	46	ATCGTA	78	ACGACTAC
15	CTAGC	47	CATCGT	79	TAGCATGC
16	ACAAA	48	CGCGGT	80	TAGGCCAT
17	TTCTC	49	CTATTA	81	TGCAAGGA
18	AGCCC	50	GCCAGT	82	TGGTACGT
19	GTATT	51	GGAAGA	83	TCTCAGTC
20	CTGTA	52	GTACTT	84	CCGGATAT
21	ACCGT	53	GTTGAA	85	CGCCTTAT
22	GCTTA	54	TAACGA	86	AACCGAGA
23	GGTGT	55	TGGCTA	87	ACAGGGAA
24	AGGAT	56	TATTTTT	88	ACGTGGTA
25	ATTGA	57	CTTGCTT	89	CCATGGGT
26	CATCT	58	ATGAAAC	90	CGCGGAGA
27	CCTAC	59	AAAAGTT	91	CGTGTGGT
28	GAGGA	60	GAATTCA	92	GCTGTGGA
29	GGAAC	61	GAACTTC	93	GGATTGGT
30	GTCAA	62	GGACCTA	94	GTGAGGGT
31	TAATA	63	GTCGATT	95	TATCGGGA
32	TACAT	64	AACGCCT	96	TTCCTGGA

높은 순도의 GBS library는 어댑터 서열을 가지고 있는 DNA 단편(128 bp dimer 밴드)이 없고 증폭된 DNA 단편이 170-350 bp일 경우에 GBS 분석에 매우 적합할 것으로 알려져 있다 (Elshire et al., 2011; Jang and Oh, 2017). 또한 현재 보편적으로 유전체 분석에 사용되는 플렛폼의 예로 Illumina사의 HiSeq2000은 100-400 bp 크기의 library 산물이 분석을 수행하기에 가장 적합하며, paried-end reads일 경우에는 가장 이상적인 크기를 250-500 bp로 권장하고 있다 (Hamblin and Rabbi, 2014; Schroder et al., 2016; Jang and Oh 2017).

GBS library의 전기영동 결과(도 3), 200-500 bp에서 smear하게 library가 잘 형성되고, 200-300 bp에서 농도가 높게 나타났다. 최종 library 산물이 GBS 분석에 적합한지 여부를 확인하기 위해 QC 분석을 수행하여, 결과를 도 4 및 도 5에 도시하였다.

실시예 2. 서열 전처리

실시예 1로부터 수득한 데이터를 barcode sequence를 이용하여 샘플 별로 분리하는 demultiplexing을 수행하였다.

GBS data의 demultiplexing 과정을 통해 생산된 샘플 별 파일은 barcode 및 adapter sequence를 제거하고, sequence quality trimming을 수행하였다.

Adapter trimming은 cutadapt (version 1.8.3) 프로그램을 사용하였고 (Martin, 2011), sequence quality trimming은 SolexaQA (v.1.13) package의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하였다 (Cox et al., 2010). DynamicTrim은 phred score에 따라 short read의 양쪽 끝의 bad quality base를 잘라내고 양질의 cleaned read로 정제하는 과정을 수행하고, LengthSort는 DynamicTrim에서 너무 많은 base가 잘린 read를 제거하는 과정을 수행하였다. DynamicTrim의 phred score ≥ 20을, LengthSort 과정은 short read length ≥ 25pb를 사용하였다.

Illumina HiSeq 2500 platform을 이용하여 paired-end read GBS sequencing을 수행한 결과, 총 reads의 수는 529.4백만, 총 read length는 53.5 Gbp이었다. 평균 length는 101 bp이었다. 각 샘플 별 raw reads의 합은 499.2백만, 평균은 5.3백만이었고, 전체 raw reads의 length는 50.4 Gbp, 평균 0.5 Gbp이었다. Trimmed read number의 합은 447.5백만, 평균 4.7백만이었고, 전체 trimmed reads의 length는 37.3 Gbp, 평균 0.4 Gbp이었다. 평균 trimmed reads의 length는 83.2 bp이었고, trimmed reads number는 전체 raw reads number의 89.7%이었다.

barcode sequence를 이용하여 demultiplexing 과정을 거쳐 얻은 raw data 통계치 정보를 표 4 및 표 5에 정리하였으며 각 샘플 별 raw data 및 trimmed read 관련 데이터는 표 6 및 표 7에 정리하였다.

No. of barcode	No. of samples	No. of reads	Avg. length (bp)	Total length (bp)
95	95	264,713,012	101	26,736,014,212
95	95	264,713,012	101	26,736,014,212
	Total	529,426,024	Total	53,472,028,424

	Total	Average/plant
Total raw reads	499,171,496	5,254,437
Trimmed reads	447,495,724	4,710,481
Total length of raw reads (bp)	50,416,321,096	530,698,117
Total length of trimmed reads (bp)	37,284,300,999	392,466,326
No. of mapped reads	108,876,644	1,146,070
Total length of mapped regions (bp)	285,777,869	3,008,188

Barcode	Samples	Sum of raw reads	Total length of raw reads
CTCC	Hwasunpasi	6,042,566	610,299,166
TGCA	Jeongupbansi	9,950,112	1,004,961,312
ACTA	Yesanwolhasi	4,131,724	417,304,124
CAGA	Goesangolgam	6,030,814	609,112,214
AACT	Okcheonbansi	5,201,822	525,384,022
GCGT	Okcheonbyonggam	11,679,550	1,179,634,550
CGAT	Yeonginbansi	18,245,890	1,842,834,890
GTAA	Yeonginjangjunsi	10,363,800	1,046,743,800
AGGC	Gangneungjangsi	7,475,958	755,071,758
GATC	Goseongdongcheolsi	12,960,088	1,308,968,888
TCAC	Andongsusigam	3,784,074	382,191,474
TGCGA	Sangjuwonsi	2,106,622	212,768,822
CGCTT	Changpyeongpasi	7,976,584	805,634,984
TCACC	Jinyangmulbansi	8,540,828	862,623,628
CTAGC	Daimaban	9,322,928	941,615,728
ACAAA	Guryejangdungi	4,521,596	456,681,196
TTCTC	Mujudaesi	3,233,514	326,584,914
AGCCC	Hamanmulgam	5,720,276	577,747,876
GTATT	Hamanbansi	6,005,514	606,556,914
CTGTA	Siheungsangsi	2,510,864	253,597,264
ACCGT	Gwangjupasi	3,006,124	303,618,524
GCTTA	Daegutungturi	1,703,436	172,047,036
GGTGT	Sangjuhgdongsi	5,541,140	559,655,140
AGGAT	Myongjudolgam	7,043,688	711,412,488
ATTGA	Saizyou	1,732,980	175,030,980
CATCT	Sacheonchalgam	5,220,992	527,320,192
CCTAC	Jangseongsusi	2,906,748	293,581,548
GAGGA	Hwasunbuduki	2,821,382	284,959,582
GGAAC	Gimhaechalgam	11,340,866	1,145,427,466
GTCAA	Aitsmisiraji	1,754,068	177,160,868
TAATA	Habcheonbansi	12,487,330	1,261,220,330
TACAT	Uiryeongbansi	6,488,492	655,337,692
TCGTT	Saburouza	3,417,394	345,156,794
GGTTGT	Damyangbaegjeongsi	4,892,848	494,177,648
CCAGCT	Gimhaedanseongsi	5,782,818	584,064,618
TTCAGA	Goryengsusi	3,602,474	363,849,874
TAGGAA	Goseongchambansi	2,998,538	302,852,338
GCTCTA	Daidanemasi	885,652	89,450,852
CCACAA	Uiseongsagogsi	6,462,594	652,721,994
CTTCCA	Yecheonsusi	2,749,900	277,739,900
GAGATA	Damyangkurigam	2,663,630	269,026,630
ATGCCT	Najupasi	3,628,158	366,443,958
AGTGGA	Inayama	2,832,522	286,084,722
ACCTAA	Jangseongsangchugam	3,010,882	304,099,082
ATATGT	Jangseongsetogari	6,442,982	650,741,182
ATCGTA	Monbei	1,317,152	133,032,352
CATCGT	Mino	8,128,548	820,983,348
CGCGGT	Emon	5,798,374	585,635,774
CTATTA	Sancheonggojongsi	1,739,758	175,715,558
GCCAGT	Sancheongkurigam	14,585,998	1,473,185,798
GGAAGA	Bonghwagolgam	2,249,318	227,181,118
GTACTT	Sangjuhakdongsi	8,846,838	893,530,638
GTTGAA	Uljinwonsi	4,546,372	459,183,572
TAACGA	Gwangjubaesi	3,035,984	306,634,384
TGGCTA	Guryekurigam	2,799,770	282,776,770
TATTTTT	Mujudaesi	4,658,360	470,494,360
CTTGCTT	Zenzimaru	8,944,268	903,371,068
ATGAAAC	Partner	12,176,030	1,229,779,030
AAAAGTT	Honeymon	4,689,214	473,610,614
GAATTCA	Wangchu	2,975,214	300,496,614
GAACTTC	Chuyeon	5,038,574	508,895,974
GGACCTA	05-8-29	1,795,490	181,344,490
GTCGATT	05-9-42	5,264,732	531,737,932
AACGCCT	05-10-63	5,459,856	551,445,456
AATATGC	05-11-61	15,052,792	1,520,331,992
ACGTGTT	05-10-18	5,643,448	569,988,248
ATTAATT	Gamppung	14,183,978	1,432,581,778
ATTGGAT	Noansubunsu	6,401,286	646,529,886
CATAAGT	FJ119	3,160,938	319,254,738
CGCTGAT	Nishimurwase	1,569,166	158,485,766
CGGTAGA	Taishu	645,936	65,239,536
CTACGGA	Changwon	3,999,272	403,926,472
GCGGAAT	Wonmi	7,223,710	729,594,710
TAGCGGA	Daeandangam	2,565,868	259,152,668
TCGAAGA	Wonchu	3,769,062	380,675,262
TCTGTGA	05-10-16	2,294,922	231,787,122
TGCTGGA	05-11-49	2,305,940	232,899,940
ACGACTAC	05-8-62	5,854,360	591,290,360
TAGCATGC	Gosho	5,923,102	598,233,302
TAGGCCAT	Jowan	7,081,016	715,182,616
TGCAAGGA	Romang	1,972,374	199,209,774
TGGTACGT	Fuyu	10,460,160	1,056,476,160
TCTCAGTC	Yeonsu	5,799,386	585,737,986
CCGGATAT	Ro-19	915,166	92,431,766
CGCCTTAT	Wakagijiro	6,645,496	671,195,096
AACCGAGA	05-9-26	1,049,300	105,979,300
ACAGGGAA	05-11-10	2,452,932	247,746,132
ACGTGGTA	05-14-64	3,420,870	345,507,870
CCATGGGT	05-16-65	2,191,260	221,317,260
CGCGGAGA	05-17-68	2,795,642	282,359,842
CGTGTGGT	08-7-62	1,820,466	183,867,066
GCTGTGGA	08-9-58	1,443,016	145,744,616
GGATTGGT	08-7-87	2,049,716	207,021,316
GTGAGGGT	Shinsyuu	5,259,216	531,180,816
TATCGGGA	Jiro	1,949,088	196,857,888

Barcode	Samples	Sum of trimmed reads	Total length of trimmed reads (bp)	Avg. length of trimmed reads (bp)	Trimmed/ Raw (%)
CTCC	Hwasunpasi	5,375,286	451,732,479	84.0	88.9
TGCA	Jeongupbansi	8,875,908	747,597,454	84.3	89.2
ACTA	Yesanwolhasi	3,681,614	310,300,581	84.3	89.1
CAGA	Goesangolgam	5,424,620	457,216,068	84.3	89.9
AACT	Okcheonbansi	4,675,724	393,759,842	84.2	89.8
GCGT	Okcheonbyonggam	10,481,580	881,306,449	84.1	89.7
CGAT	Yeonginbansi	16,384,448	1,388,161,145	84.7	89.8
GTAA	Yeonginjangjunsi	9,309,540	787,423,637	84.6	89.8
AGGC	Gangneungjangsi	6,767,478	570,142,852	84.3	90.5
GATC	Goseongdongcheolsi	11,678,308	985,372,107	84.4	90.1
TCAC	Andongsusigam	3,376,522	283,794,125	84.1	89.2
TGCGA	Sangjuwonsi	1,895,720	158,727,838	83.7	90.0
CGCTT	Changpyeongpasi	7,119,042	594,345,905	83.5	89.3
TCACC	Jinyangmulbansi	7,601,110	636,427,346	83.7	89.0
CTAGC	Daimaban	8,350,532	698,699,809	83.7	89.6
ACAAA	Guryejangdungi	4,071,658	342,561,537	84.2	90.1
TTCTC	Mujudaesi	2,864,254	237,869,014	83.1	88.6
AGCCC	Hamanmulgam	5,128,734	426,385,046	83.1	89.7
GTATT	Hamanbansi	5,392,564	451,035,662	83.6	89.8
CTGTA	Siheungsangsi	2,243,542	187,817,993	83.7	89.4
ACCGT	Gwangjupasi	2,690,828	225,614,931	83.9	89.5
GCTTA	Daegutungturi	1,523,646	127,817,376	83.9	89.5
GGTGT	Sangjuhgdongsi	4,994,530	419,287,045	84.0	90.1
AGGAT	Myongjudolgam	6,411,604	538,876,194	84.1	90.0
ATTGA	Saizyou	1,567,182	130,819,568	83.5	90.4
CATCT	Sacheonchalgam	4,681,644	392,693,019	83.9	89.7
CCTAC	Jangseongsusi	2,574,978	215,533,394	83.7	88.6
GAGGA	Hwasunbuduki	2,574,488	215,681,417	83.8	91.3
GGAAC	Gimhaechalgam	10,227,254	859,418,506	84.0	90.2
GTCAA	Aitsmisiraji	1,581,596	132,813,299	84.0	90.2
TAATA	Habcheonbansi	11,180,738	935,519,561	83.7	89.5
TACAT	Uiryeongbansi	5,797,900	486,825,326	84.0	89.4
TCGTT	Saburouza	3,058,250	255,903,894	83.7	89.5
GGTTGT	Damyangbaegjeongsi	4,402,674	367,340,393	83.4	90.0
CCAGCT	Gimhaedanseongsi	5,178,166	431,279,204	83.3	89.5
TTCAGA	Goryengsusi	3,222,846	267,589,045	83.0	89.5
TAGGAA	Goseongchambansi	2,720,178	226,476,968	83.3	90.7
GCTCTA	Daidanemasi	789,170	65,630,081	83.2	89.1
CCACAA	Uiseongsagogsi	5,763,840	478,838,829	83.1	89.2
CTTCCA	Yecheonsusi	2,444,646	202,794,129	83.0	88.9
GAGATA	Damyangkurigam	2,411,640	201,742,878	83.7	90.5
ATGCCT	Najupasi	3,254,356	270,089,514	83.0	89.7
AGTGGA	Inayama	2,567,534	213,875,156	83.3	90.6
ACCTAA	Jangseongsangchugam	2,697,178	224,892,219	83.4	89.6
ATATGT	Jangseongsetogari	5,813,948	482,274,357	83.0	90.2
ATCGTA	Monbei	1,182,706	98,372,591	83.2	89.8
CATCGT	Mino	7,299,206	609,226,921	83.5	89.8
CGCGGT	Emon	5,178,796	432,446,494	83.5	89.3
CTATTA	Sancheonggojongsi	1,554,370	129,163,090	83.1	89.3
GCCAGT	Sancheongkurigam	13,071,234	1,092,751,610	83.6	89.6
GGAAGA	Bonghwagolgam	2,049,806	171,373,501	83.6	91.1
GTACTT	Sangjuhakdongsi	7,947,922	663,057,725	83.4	89.8
GTTGAA	Uljinwonsi	4,098,098	340,833,261	83.2	90.1
TAACGA	Gwangjubaesi	2,726,756	227,038,587	83.3	89.8
TGGCTA	Guryekurigam	2,507,282	209,085,247	83.4	89.6
TATTTTT	Mujudaesi	3,992,566	320,021,950	80.2	85.7
CTTGCTT	Zenzimaru	7,937,072	656,701,454	82.7	88.7
ATGAAAC	Partner	10,964,940	910,049,924	83.0	90.1
AAAAGTT	Honeymon	4,257,228	352,169,137	82.7	90.8
GAATTCA	Wangchu	2,679,326	222,083,250	82.9	90.1
GAACTTC	Chuyeon	4,538,044	376,555,478	83.0	90.1
GGACCTA	05-8-29	1,622,612	134,777,497	83.1	90.5
GTCGATT	05-9-42	4,766,610	395,427,652	83.0	90.5
AACGCCT	05-10-63	4,882,392	402,642,169	82.5	89.4
AATATGC	05-11-61	13,467,016	1,113,828,882	82.7	89.5
ACGTGTT	05-10-18	5,071,088	421,222,847	83.1	89.9
ATTAATT	Gamppung	12,577,802	1,028,507,152	81.8	88.7
ATTGGAT	Noansubunsu	5,775,952	474,611,921	82.2	90.2
CATAAGT	FJ119	2,831,830	235,028,686	83.0	89.6
CGCTGAT	Nishimurwase	1,400,222	115,593,521	82.6	89.2
CGGTAGA	Taishu	576,986	47,777,774	82.8	89.3
CTACGGA	Changwon	3,569,028	293,753,653	82.3	89.2
GCGGAAT	Wonmi	6,486,816	537,627,299	82.9	89.8
TAGCGGA	Daeandangam	2,303,290	189,811,535	82.4	89.8
TCGAAGA	Wonchu	3,375,452	279,619,250	82.8	89.6
TCTGTGA	05-10-16	2,036,116	167,636,569	82.3	88.7
TGCTGGA	05-11-49	2,053,096	169,297,970	82.5	89.0
ACGACTAC	05-8-62	5,234,718	432,896,174	82.7	89.4
TAGCATGC	Gosho	5,301,346	435,810,440	82.2	89.5
TAGGCCAT	Jowan	6,356,788	523,581,006	82.4	89.8
TGCAAGGA	Romang	1,765,750	145,729,710	82.5	89.5
TGGTACGT	Fuyu	9,358,178	773,687,132	82.7	89.5
TCTCAGTC	Yeonsu	5,160,938	424,392,707	82.2	89.0
CCGGATAT	Ro-19	821,348	67,656,418	82.4	89.8
CGCCTTAT	Wakagijiro	5,917,232	487,720,053	82.4	89.0
AACCGAGA	05-9-26	943,078	77,715,030	82.4	89.9
ACAGGGAA	05-11-10	2,214,206	183,128,545	82.7	90.3
ACGTGGTA	05-14-64	3,073,544	255,165,964	83.0	89.9
CCATGGGT	05-16-65	1,963,106	162,257,470	82.7	89.6
CGCGGAGA	05-17-68	2,495,580	205,599,996	82.4	89.3
CGTGTGGT	08-7-62	1,618,688	133,688,601	82.6	88.9
GCTGTGGA	08-9-58	1,287,908	106,150,227	82.4	89.3
GGATTGGT	08-7-87	1,858,720	153,983,536	82.8	90.7
GTGAGGGT	Shinsyuu	4,763,968	392,960,124	82.5	90.6
TATCGGGA	Jiro	1,749,970	143,780,077	82.2	89.8

실시예 3. Raw SNP detection 및 consensus sequence 추출

실시예 2의 전처리 과정을 통과한 cleaned reads를 토대로 mapping을 수행하고 SNP를 탐색하였다.

Mapping은 representative transcript와 sequencing 샘플간의 raw SNP(In/Del)을 detection하기 위한 선행 과정으로서 BAM format의 파일을 생성한다.

실시예 2에서 Demultiplexing과 sequence quality trimming을 통해 확보된 각 샘플의 clean reads를 표준유전체에 mapping하고 통계치를 추출하였다. Clean reads는 BWA(0.6.1-r014)를 이용하여 mapping하였고, RNA sequence를 NCBI에서 다운로드하여 de novo assembly를 통해 representative transcript를 구축하여 reference로 활용하였다.

de novo assembly에 사용된 D. kaki transcript에 관한 데이터는 표 8과 같다 (NCBI accession number: SRX2212171, SRX2212170)

Representative transcript No.	Total length (bp)	Min. length (bp)	Max. length (bp)	Avg. length (bp)	N50 length (bp)
31,258	30,524,525	200	10,510	976	1,695

전체 trimmed reads number 447.5백만에서 mapped reads number는 108.9 백만이었고, 평균 mapped read number는 1.1백만으로 24.2%이었다 (표 9).

Barcode	Samples	Sum of trimmed reads	No. of mapped reads	Percent of mapped reads (%)
CTCC	Hwasunpasi	5,375,286	1,278,494	23.8
TGCA	Jeongupbansi	8,875,908	2,202,041	24.8
ACTA	Yesanwolhasi	3,681,614	832,805	22.6
CAGA	Goesangolgam	5,424,620	1,292,949	23.8
AACT	Okcheonbansi	4,675,724	1,131,025	24.2
GCGT	Okcheonbyonggam	10,481,580	2,545,338	24.3
CGAT	Yeonginbansi	16,384,448	4,031,479	24.6
GTAA	Yeonginjangjunsi	9,309,540	2,240,524	24.1
AGGC	Gangneungjangsi	6,767,478	1,577,283	23.3
GATC	Goseongdongcheolsi	11,678,308	2,942,266	25.2
TCAC	Andongsusigam	3,376,522	807,846	23.9
TGCGA	Sangjuwonsi	1,895,720	452,587	23.9
CGCTT	Changpyeongpasi	7,119,042	1,821,953	25.6
TCACC	Jinyangmulbansi	7,601,110	1,845,602	24.3
CTAGC	Daimaban	8,350,532	2,180,932	26.1
ACAAA	Guryejangdungi	4,071,658	891,287	21.9
TTCTC	Mujudaesi	2,864,254	656,538	22.9
AGCCC	Hamanmulgam	5,128,734	1,109,878	21.6
GTATT	Hamanbansi	5,392,564	1,246,335	23.1
CTGTA	Siheungsangsi	2,243,542	539,508	24.0
ACCGT	Gwangjupasi	2,690,828	629,504	23.4
GCTTA	Daegutungturi	1,523,646	339,953	22.3
GGTGT	Sangjuhgdongsi	4,994,530	1,199,201	24.0
AGGAT	Myongjudolgam	6,411,604	1,459,170	22.8
ATTGA	Saizyou	1,567,182	363,035	23.2
CATCT	Sacheonchalgam	4,681,644	1,086,719	23.2
CCTAC	Jangseongsusi	2,574,978	593,674	23.1
GAGGA	Hwasunbuduki	2,574,488	578,222	22.5
GGAAC	Gimhaechalgam	10,227,254	2,555,089	25.0
GTCAA	Aitsmisiraji	1,581,596	367,466	23.2
TAATA	Habcheonbansi	11,180,738	2,724,268	24.4
TACAT	Uiryeongbansi	5,797,900	1,347,404	23.2
TCGTT	Saburouza	3,058,250	690,091	22.6
GGTTGT	Damyangbaegjeongsi	4,402,674	879,505	20.0
CCAGCT	Gimhaedanseongsi	5,178,166	1,246,291	24.1
TTCAGA	Goryengsusi	3,222,846	768,666	23.9
TAGGAA	Goseongchambansi	2,720,178	599,181	22.0
GCTCTA	Daidanemasi	789,170	184,378	23.4
CCACAA	Uiseongsagogsi	5,763,840	1,233,836	21.4
CTTCCA	Yecheonsusi	2,444,646	588,008	24.1
GAGATA	Damyangkurigam	2,411,640	581,804	24.1
ATGCCT	Najupasi	3,254,356	770,381	23.7
AGTGGA	Inayama	2,567,534	632,909	24.7
ACCTAA	Jangseongsangchugam	2,697,178	633,984	23.5
ATATGT	Jangseongsetogari	5,813,948	1,386,320	23.8
ATCGTA	Monbei	1,182,706	272,068	23.0
CATCGT	Mino	7,299,206	1,789,617	24.5
CGCGGT	Emon	5,178,796	1,274,023	24.6
CTATTA	Sancheonggojongsi	1,554,370	364,599	23.5
GCCAGT	Sancheongkurigam	13,071,234	3,209,978	24.6
GGAAGA	Bonghwagolgam	2,049,806	498,140	24.3
GTACTT	Sangjuhakdongsi	7,947,922	1,937,292	24.4
GTTGAA	Uljinwonsi	4,098,098	1,003,065	24.5
TAACGA	Gwangjubaesi	2,726,756	645,662	23.7
TGGCTA	Guryekurigam	2,507,282	592,998	23.7
TATTTTT	Mujudaesi	3,992,566	934,865	23.4
CTTGCTT	Zenzimaru	7,937,072	1,870,563	23.6
ATGAAAC	Partner	10,964,940	2,628,474	24.0
AAAAGTT	Honeymon	4,257,228	1,086,759	25.5
GAATTCA	Wangchu	2,679,326	672,064	25.1
GAACTTC	Chuyeon	4,538,044	1,071,711	23.6
GGACCTA	05-8-29	1,622,612	391,582	24.1
GTCGATT	05-9-42	4,766,610	1,153,265	24.2
AACGCCT	05-10-63	4,882,392	1,336,015	27.4
AATATGC	05-11-61	13,467,016	3,294,927	24.5
ACGTGTT	05-10-18	5,071,088	1,316,139	26.0
ATTAATT	Gamppung	12,577,802	3,094,361	24.6
ATTGGAT	Noansubunsu	5,775,952	1,454,901	25.2
CATAAGT	FJ119	2,831,830	710,734	25.1
CGCTGAT	Nishimurwase	1,400,222	334,091	23.9
CGGTAGA	Taishu	576,986	135,398	23.5
CTACGGA	Changwon	3,569,028	944,461	26.5
GCGGAAT	Wonmi	6,486,816	169,7369	26.2
TAGCGGA	Daeandangam	2,303,290	609,200	26.4
TCGAAGA	Wonchu	3,375,452	872,366	25.8
TCTGTGA	05-10-16	2,036,116	522,084	25.6
TGCTGGA	05-11-49	2,053,096	515,030	25.1
ACGACTAC	05-8-62	5,234,718	1,351,081	25.8
TAGCATGC	Gosho	5,301,346	1,332,954	25.1
TAGGCCAT	Jowan	6,356,788	1,627,941	25.6
TGCAAGGA	Romang	1,765,750	443,082	25.1
TGGTACGT	Fuyu	9,358,178	2,318,262	24.8
TCTCAGTC	Yeonsu	5,160,938	1,298,908	25.2
CCGGATAT	Ro-19	821,348	194,816	23.7
CGCCTTAT	Wakagijiro	5,917,232	1,430,508	24.2
AACCGAGA	05-9-26	943,078	242,486	25.7
ACAGGGAA	05-11-10	2,214,206	569,323	25.7
ACGTGGTA	05-14-64	3,073,544	771,167	25.1
CCATGGGT	05-16-65	1,963,106	477,397	24.3
CGCGGAGA	05-17-68	2,495,580	644,829	25.8
CGTGTGGT	08-7-62	1,618,688	404,963	25.0
GCTGTGGA	08-9-58	1,287,908	335,446	26.0
GGATTGGT	08-7-87	1,858,720	430,949	23.2
GTGAGGGT	Shinsyuu	4,763,968	1,247,131	26.2
TATCGGGA	Jiro	1,749,970	455,871	26.1

Clean reads를 표준유전체에 mapping하여 생성된 BAM format의 파일을 SAMtools (0.1.16) 프로그램을 사용하여 raw SNP (In/Del)을 detection하고, consensus sequence를 추출하였다 (Li et al., 2009).

SEEDERS in-house script (Kim et al., 2014)를 사용하여 SNP validation을 거친 후, raw SNP (In/Del) detection을 수행하였다.

각 샘플의 raw SNP를 이용하여 감 GBS 95개 샘플간의 통합 SNP matrix를 작성하고, 필터기준을 통과한 SNP를 'homozygous/heterozygous/Etc.' 유형으로 구분하였다.

SNP read depth ≥ 90%이면 homozygous, 40% ≤ SNP read depth ≤ 60%이면 heterozygous, 그리고 유형을 구분할 수 있으면 기타로 분류하였다.

전체 샘플에서 확인된 총 SNP의 수는 1.7백만이었다. 이중 homozygous type의 SNP 수는 43.7만개, heterozygous type의 SNP 수는 38.5만개 이었다. 그리고 가장 많은 SNP가 확인된 품종은 'Yeongjinbansi'이고 총 6,834개 이었고, 가장 적은 SNP가 확인된 품종은 'Taishu'이고 총 846개이었다. Homozygous type의 SNP 수는 1,933개에서 6,834개의 범위이었고 평균 4,608개이었으며, heterozygous type의 SNP는 846개에서 5,927개의 범위이었고, 평균 4,047개이었다 (표 10).

Cultivars	Total	Homozygous type (read depth≥90%)	Heterozygous type (40%≤read depth≤60%)	Etc. (neither home/hetero type)
Hwasunpasi	20915	5328	4603	10984
Jeongupbansi	25443	5847	5117	14479
Yesanwolhasi	18396	5078	4291	9027
Goesangolgam	21116	5237	4458	11421
Okcheonbansi	20197	5631	4362	10204
Okcheonbyonggam	27412	6250	5520	15642
Yeonginbansi	31111	6834	5927	18350
Yeonginjangjunsi	26109	5517	5193	15399
Gangneungjangsi	23833	6038	4972	12823
Goseongdongcheolsi	28225	6396	5491	16338
Andongsusigam	19010	5479	4213	9318
Sangjuwonsi	13639	4398	3202	6039
Changpyeongpasi	24002	5813	5083	13106
Jinyangmulbansi	24568	5262	5314	13992
Daimaban	25896	6544	5232	14120
Guryejangdungi	19921	5997	4399	9525
Mujudaesi	17938	5699	4002	8237
Hamanmulgam	22340	6006	4979	11355
Hamanbansi	23685	6433	5113	12139
Siheungsangsi	14489	4440	3429	6620
Gwangjupasi	15817	4717	3502	7598
Daegutungturi	11638	4657	2462	4519
Sangjudungsi	21186	5453	4619	11114
Myeongjudongam	23239	5954	4900	12385
Saizyou	11744	4030	2644	5070
Sacheonchalgam	22128	6198	4894	11036
Jangseongsusi	16355	5275	3655	7425
Hwasunbuduki	15509	4807	3576	7126
Gimhaechalgam	26550	6000	5446	15104
Aitsmisiraji	11954	3897	2806	5251
Habcheonbansi	26813	5090	5493	16230
Uiryeongbansi	23090	5940	4942	12208
Saburouza	16786	4910	3915	7961
Damyangbaegjeongsi	18263	5166	4056	9041
Gimhaedanseongsi	21678	5511	4757	11410
Goryengsusi	16920	4482	3989	8449
Goseongchambansi	15588	4684	3500	7404
Daidanemasi	6808	2814	1509	2485
Uiseongsagogsi	20066	5239	4425	10402
Yecheonsusi	15572	4538	3611	7423
Damyangkurigam	15804	4879	3662	7263
Najupasi	19010	5737	4263	9010
Inayama	15903	4326	3781	7796
Jangseongsangchugam	16535	5065	3686	7784
Jangseongsetogari	22919	5726	4819	12374
Monbei	9347	3594	1965	3788
Mino	23097	5319	4862	12916
Emon	21097	5690	4575	10832
Sancheonggojongsi	11232	3868	2487	4877
Sancheongkurigam	27678	5851	5611	16216
Bonghwagolgam	13479	3947	3130	6402
Sangjuhgdongsi	25658	6290	5212	14156
Uljinwonsi	18083	4825	4110	9148
Gwangjubaesi	14773	4178	3379	7216
Guryekurigam	15215	4869	3429	6917
Mujudaesi	19233	5454	4346	9433
Zenzimaru	24332	5851	5076	13405
partner	27135	5714	5534	15887
Honeymon	19075	4467	4443	10165
Wangchu	15887	3954	3878	8055
Chuyeon	20342	4898	4886	10558
05-08-29	10900	3155	2657	5088
05-9-42	19383	4352	4401	10630
05-10-63	19133	4074	4601	10458
05-11-61	27790	5390	5514	16886
05-10-18	19416	4014	4513	10889
Gampung	25288	4459	5629	15200
Noansubunsu	20430	3894	4810	11726
FJ119	14295	3086	3713	7496
Nishimurawase	10098	3265	2441	4392
Taishu	4222	1933	846	1443
Changwon	15792	3365	3859	8568
Wonmi	20339	4116	4713	11510
Daeandangam	13332	3349	3386	6597
Wonchu	15392	3454	3792	8146
05-10-16	11768	3188	2801	5779
05-11-49	11952	2932	3092	5928
05-8-62	19633	4055	4708	10870
Gosho	19709	4737	4462	10510
Jowan	20462	3783	4776	11903
Romang	12055	3353	2953	5749
Fuyu	24447	3595	5128	15724
Yeonsu	19061	4239	4600	10222
Ro-19	6878	2632	1521	2725
Wakagijiro	21462	4946	4740	11776
05-9-26	7157	2363	1766	3028
05-11-10	12659	3054	3219	6386
05-14-64	15153	2930	3879	8344
05-16-65	11857	3113	2965	5779
05-17-68	13485	3095	3397	6993
08-7-62	10289	3234	2432	4623
08-9-58	9032	2466	2314	4252
08-7-87	11385	3408	2822	5155
Shinsyuu	18051	3811	4360	9880
Jiro	11313	2849	2924	5540

실시예 4. 대량 SNP 탐색 및 KASP probe와 primer 제작

감은 진화과정에서 염색체의 수가 배가되어 6배체(2n=6X, n=15) 게놈으로 구성되었다. 감은 이형접합(heterozygous)의 유전적 특성을 가지고 있으며, 6배체(hexaploidy) 식물이기 때문에 품종간의 구분이 명확한 SNP 좌를 선발하는 것은 매우 어렵다. 즉 heterozygous type의 SNP좌를 선발하여도 read depth가 적거나 heterozygous type의 조합(1:5, 2:4, 3:3, 4:2, 5:1)에 따라 read depth에서 어느 한쪽으로 SNP가 치우진다면 homozygous type과 사실상 구분이 어렵기 때문이다.

따라서 실시예 3의 감 95개 샘플의 통합 SNP matrix 133,819좌에서 집단 별 공통 SNP를 선발하고, 각 집단간의 공통 SNP를 비교하여 polymorphic SNP를 선발하였다.

선발된 polymorphic SNP좌 중에서 homozygous/heterozygous type의 구분이 가능한 SNP 좌를 1차로 선발하였고, 이들 SNP좌에서 read depth가 충분하고, heterozygous type에서 read depth의 비율을 조사하여 homozygous/heterozygous type의 구분이 명확한 49개의 SNP 좌를 최종 선발하였다.

이렇게 선발된 SNP marker 좌는 GBS 분석에 사용된 mapping data를 이용하여 IGV 프로그램을 통해 short read의 mapping 패턴을 이미지로 확인하였다. IGV 이미지를 통해 SNP 주변 시퀀스 중 conserved 영역에서 최종적으로 15개 SNP marker를 선별하여(표 11-14) KASP assay를 위한 분자표지로 사용하였다.

Cultivars		Goseongchambansi		Changpyeongpasi		Noansubunsu		Sancheonggosongsi		Dosan
ID*	ref.**	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth
1	A***	C	76\|76	C	76\|76	M	65,57\|122	C	22\|22	M	11,88\|99
2	G	R	24,26\|50	A	103\|103	A	34\|34	A	10\|10	A	61\|61
3	A	C	26\|27	M	4,31\|35	C	46\|46	M	3,15\|18	C	9\|9
4	T	C	67\|67	Y	122,50\|172	C	90\|90	C	22\|22	Y	16,2\|18
5	G	A	29\|29	A	126\|126	R	83,12\|95	A	38\|38	R	24,6\|30
6	G	G	9\|9	G	33\|33	G	26\|26	G	18\|18	R	6,17\|23
7	A	G	24\|25	R	4,31\|35	G	44\|44	R	3,17\|20	G	9\|9
8	G	A	29\|29	A	79\|83	A	51\|56	A	23\|23	A	23\|25
9	T	C	2\|2	C	35\|36	C	19\|19	C	5\|5	C	9\|10
10	T	C	21\|21	C	46\|48	Y	23,4\|27	Y	8,2\|10	Y	15,9\|24
11	A	G	35\|35	G	157\|170	G	98\|101	G	32\|34	G	48\|48
12	C	T	2\|2	T	34\|34	Y	19,12\|31	T	16\|16	T	17\|17
13	T	T	10\|10	T	48\|48	T	53\|53	T	16\|16	T	9\|9
14	C	S	7,33\|40	C	90\|90	C	91\|91	S	8,4\|12	C	20\|20
15	G	A	25\|25	R	65,10\|75	A	38\|38	A	9\|9	A	27\|27

Cultivars		Damyangbaekjeongsi		Chuyeon		Sunsahwan		Gimhaedanseongsi		Uljinwonsi
ID	ref	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth
1	A	C	25\|25	C	81\|81	C	104\|104	C	56\|56	C	52\|52
2	G	A	62\|62	A	39\|39	A	113\|113	A	36\|38	R	13,7\|20
3	A	M	5,24\|29	M	4,27\|31	M	3,23\|26	C	22\|22	C	39\|39
4	T	C	59\|59	C	56\|56	Y	93,11\|104	C	79\|79	C	73\|73
5	G	R	61,12\|73	A	52\|55	R	99,24\|123	A	103\|103	A	63\|63
6	G	G	13\|13	R	2,10\|12	G	55\|55	G	45\|45	R	11,16\|27
7	A	R	4,22\|26	R	4,28\|32	R	3,20\|23	G	20\|20	G	36\|36
8	G	A	61\|61	A	40\|41	R	66,12\|78	A	64\|64	A	27\|29
9	T	C	15\|15	C	9\|10	C	18\|18	C	15\|15	Y	6,3\|9
10	T	C	19\|19	Y	22,16\|38	C	41\|41	C	28\|28	C	16\|16
11	A	G	71\|79	R	9,27\|36	G	140\|142	G	81\|81	G	57\|57
12	C	Y	4,33\|37	Y	23,14\|37	T	33\|33	Y	7,7\|14	T	34\|34
13	T	T	22\|22	Y	3,15\|18	T	53\|53	T	36\|36	T	19\|19
14	C	C	43\|43	C	69\|69	S	19,92\|111	C	73\|73	C	43\|45
15	G	A	31\|31	R	27,8\|35	A	64\|64	A	14\|14	A	29\|29

Cultivars		Jinyangmulbansi		Daemaban		Jangseongsoeddogari		Sangjuwons
ID	ref	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth
1	A	C	137\|137	C	172\|172	C	33\|33	C	5\|5
2	G	R	86,23\|109	A	87\|87	A	82\|82	R	6,14\|20
3	A	C	66\|66	C	84\|84	C	64\|64	C	8\|8
4	T	Y	95,15\|110	C	163\|163	Y	30,34\|64	C	21\|21
5	G	R	95,23\|118	A	148\|148	A	91\|91	A	20\|20
6	G	G	40\|40	G	38\|38	G	51\|54	G	26\|26
7	A	G	65\|65	G	82\|82	G	67\|67	G	9\|9
8	G	A	45\|46	A	98\|105	A	84\|84	R	12,2\|14
9	T	C	21\|21	C	29\|29	C	24\|24	C	13\|13
10	T	C	52\|52	Y	41,6\|47	C	41\|41	C	20\|20
11	A	G	123\|133	G	199\|199	G	54\|54	G	9\|9
12	C	T	27\|30	T	61\|61	T	39\|39	T	9\|9
13	T	T	43\|43	T	53\|53	T	28\|28	T	13\|13
14	C	C	86\|86	C	149\|149	C	61\|61	S	15,5\|20
15	G	R	39,14\|53	A	104\|104	A	53\|53	A	23\|23

Cultivars		Jeongeupbansi		05-09-26		Guryejangdunge		Gwangjubaesi		Hapcheonbansi
ID	ref	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth	SNP	Read depth
1	A	C	161\|161	M	6,19\|25	C	35\|35	C	21\|21	C	124\|124
2	G	A	84\|84	A	18\|18	A	65\|65	A	10\|10	R	109,22\|131
3	A	C	54\|54	C	5\|5	C	37\|39	M	4,31\|35	C	119\|119
4	T	Y	121,23\|144	C	21\|23	Y	57,8\|65	C	60\|60	Y	89,53\|142
5	G	A	144\|144	A	8\|8	A	54\|54	A	84\|84	R	205,68\|273
6	G	R	18,78\|96	G	9\|9	G	29\|29	G	12\|12	G	107\|107
7	A	G	52\|52	G	5\|5	G	39\|41	R	5,31\|36	G	121\|121
8	G	A	118\|118	R	6,3\|9	A	44\|44	R	13,3\|16	A	88\|92
9	T	C	51\|51	C	1\|1	Y	8,5\|13	C	20\|20	C	42\|46
10	T	C	39\|39	C	12\|12	C	38\|39	C	22\|22	C	36\|40
11	A	G	36\|36	R	10,25\|35	R	18,45\|63	R	23,18\|41	R	40,199\|239
12	C	Y	24,28\|52	T	4\|4	T	24\|24	T	13\|13	T	80\|83
13	T	T	66\|66	T	6\|6	T	20\|20	Y	3,10\|13	T	104\|104
14	C	G	106\|106	G	8\|8	G	33\|33	G	21\|21	G	95\|95
15	G	A	77\|77	A	7\|7	R	25,5\|30	A	18\|18	R	100,15\|115

*SNP marker ID, 1: Persimmon_C, 2: Persimmon_D, 3: Persimmon_E, 4: Persimmon_I, 5: Persimmon_J/Y, 6: Persimmon_K, 7: Persimmon_M, 8: Persimmon_O, 9: Persimmon_P, 10: Persimmon_Q, 11: Persimmon_S, 12: Persimmon_T, 13: Persimmon_V, 14: Persimmon_W, 15: Persimmon_AA

**Reference

***Nucleotide base, M: A or C, R: A or G, Y: C or T, S: G or C

다음으로 KASP primer와 probe는 LGC Biosearch Technologies 사에서 (KOD 분석) 맞춤 설계하였으며, 각각 후보 SNP 좌에서 Primer_Allele X, Primer_Allele Y 그리고 Primer_Common을 설계하였다. 각 마커에 대한 프라이머는 표 15에 기재하였다.

전술한 실시예로부터 도출한 표 15의 KASP primer를 이용해 감 유전자원 및 교배실생 등 32 품종을 대상으로 KASP assay를 수행하였다.

KASP assay는 real-time PCR 장비를 통해서 수행하였으며, end-point PCR 방법으로 PCR 반응 이후에 KASP probe의 형광 시그널을 통해 SNP 좌에서의 genotyping 정보를 확인할 수 있다.

KASP PCR 조건은 assay 마커별로 약간의 annealing 온도 조건을 달리하여 최적의 반응 조건을 탐색하였다. KASP assay를 진행하기 위한 PCR mixture는 10 ng/μL gDNA 5 μL, 2X PCR MasterMix 5 μL, DW 8.6 μL 및 AssayMix 0.14 μL로 진행하였으며 Total 10 μL에서 PCR 반응을 수행하였다. KASP PCR 온도 조건은 assay probe가 target 부위를 정확하게 찾아 반응할 수 있도록 touchdown PCR 조건을 삽입하였다. 기본 PCR 조건은 94℃에서 15 min, 94℃ 20 sec와 61℃ 1 min (1cycle 마다 0.6℃씩 낮춤)을 10 cycle 진행한 후, 94℃에서 20 sec, 55℃에서 1 min을 25cycle을 진행한 후 마지막으로 30℃에서 1 min 진행한 후 형광 scan을 진행하였다. 최종 유전자형 분석은 CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 두 개의 대립 유전자의 특이적 형광 검출을 통해 수행되었다.

실험 결과, 모든 품종에서 scatter spots cluster를 형성하여, homozygous와 heterozygous type의 구분을 명확하게 할 수 있었다 (표 16, 도 6a-6c).

Cultivars

SNP markers for KASP assay

1*

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Goseongchambansi

C**

R

C

A

G

A

C

G

T

S

A

Changpyeongpasi

C

A

M

Y

A

G

R

A

C

G

T

C

R

Noansubunsu

M

A

C

R

G

A

C

Y

G

Y

T

C

A

Chuyeon

C

A

M

C

A

R

A

C

Y

R

Y

C

R

Zenzimaru

C

A

M

Y

R

G

R

C

G

T

S

A

Gimhaedanseongsi

C

A

C

A

G

A

C

G

Y

T

C

A

Daimaban

C

A

C

A

G

A

C

Y

G

T

C

A

Jangseongsetogari

C

A

C

Y

A

G

A

C

G

T

C

A

Jeongupbansi

C

A

C

Y

A

R

G

A

C

G

Y

T

G

A

Gwangjubaesi

C

A

M

C

A

G

R

C

R

T

Y

G

A

Jowan

M

A

C

R

G

R

C

Y

G

T

C

A

Gimhaechalgam

C

A

C

Y

A

G

A

Y

C

G

T

C

A

Gangneungjangsi

C

R

C

Y

A

G

R

A

Y

C

G

T

C

A

Goseongdongcheolsi

C

R

C

Y

A

G

R

A

Y

C

G

T

C

A

Hamyangbansi

C

A

M

Y

A

G

R

A

Y

C

G

T

C

A

Goesangolgam

C

A

M

C

A

R

A

C

G

T

S

A

Gwangjupasi

C

A

M

Y

A

G

R

A

Y

C

G

T

C

R

Wangchu

M

A

C

Y

A

G

R

C

G

T

Y

C

A

05-14-64

C

A

M

Y

A

G

R

Y

C

R

Y

C

R

Gampung

C

R

M

Y

R

G

R

C

Y

G

T

Y

C

A

Jangseongsusi

C

A

C

Y

R

G

A

C

G

T

C

A

Sancheongkurigam

M

A

C

Y

A

G

R

C

G

T

S

A

Parter

M

R

M

Y

R

A

Y

C

R

Y

C

A

Uljinwonsi

C

R

C

A

R

G

A

Y

C

G

T

C

A

Wonmi

C

R

C

R

G

R

C

Y

R

Y

C

A

Yeonginjangjunsi

C

A

M

C

A

G

A

C

R

T

Y

S

A

Bonghwagolgam

C

A

C

R

G

A

C

G

T

S

A

Jinyangmulbansi

C

R

C

Y

R

G

A

C

G

T

C

R

Emon

C

A

C

Y

R

G

A

C

R

T

C

A

Sangjuhgdongsi

C

A

C

Y

A

R

G

A

C

G

Y

T

C

A

Taishu

C

A

C

R

G

R

C

Y

G

T

C

A

Sancheongdanseongsi

C

A

M

C

A

G

R

A

C

Y

G

T

S

A

**Nucleotide base, M: A or C, R: A or G, Y: C or T, S: G or C

실시예 5. KASP marker의 barcode system 전환

실시예 4에서 확인한 결과를 이용하여 감 신품종 및 유전자원을 대상으로 바코드 시스템을 개발하였다. Genotyping 결과 homo type은 “a”, hetero type은 “h”로 표시하였고, 이 정보를 다시 “0”과 “1”의 디지털 신호로 전환하고 “0”은 흰색, “1”은 검은색으로 나타냄으로써 barcode system을 구축하였다 (도 7). 이를 이용하여 32개의 감 품종을 판별한 결과를 도 8에 표시하였다.

감 유전자원 및 교배실생 32 품종을 대상으로 품종인식 능력을 평가한 결과 모든 품종에 대해 정확한 품종 식별 능력을 보였다. 특히 교배부본이 같아서 유전적 유사도가 매우 높은 '조완(Jowan)', '원미(Wonmi)', '감풍(Gampung)' 그리고 교배부분인 'Taishu'를 대상으로도 4품종 모두에서 차이 나는 영역을 정확히 탐색할 수 있었다.

이를 통해 본 발명의 바코드 시스템을 이용하여 기존 품종을 정확히 식별할 수 있음을 확인하였는바, 새롭게 육성되는 품종에도 이를 적용함으로써 기존 품종과의 차이를 용이하게 비교할 수 있을 것으로 예상된다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Kompetitive allele specific PCR primer set for distinguishing persimmon cultivars and and use thereof <130> KPA200765-KR <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_C_Primer_AlleleX <400> 1 gacgagaagg aaataaggaa atgcg 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_C_Primer_AlleleY <400> 2 cgacgagaag gaaataagga aatgct 26 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_C_Primer_Common <400> 3 ggcacgctcc tcgtctcrac aa 22 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_D_Primer_AlleleX <400> 4 aagtacggtt gctaaaagtc ccgtt 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_D_Primer_AlleleY <400> 5 gtacggttgc taaaagtccc gtc 23 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_D_Primer_Common <400> 6 ccttcggaaa atctacaagt ttgcatgta 29 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_E_Primer_AlleleX <400> 7 caatggcaaa cyaacagcat gacta 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_E_Primer_AlleleY <400> 8 caatggcaaa cyaacagcat gactc 25 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_E_Primer_Common <400> 9 aaaygaatca tcttctttgc ttgtcttgtt 30 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_I_Primer_AlleleX <400> 10 gccctgagat tcgtgattcc ctt 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_I_Primer_AlleleY <400> 11 ccctgagatt cgtgattccc tc 22 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_I_Primer_Common <400> 12 ctctatcaat tgttgcacaa tagacaagat 30 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_J/Y_Primer_AlleleX <400> 13 cagcttatgc ttaagttcat tgaca 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_J/Y_Primer_AlleleY <400> 14 cagcttatgc ttaagttcat tgacg 25 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_J/Y_Primer_Common <400> 15 cgacaacaac tacrgctccc caa 23 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_K_Primer_AlleleX <400> 16 ggctgttaaa atacgatcct tcggt 25 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_K_Primer_AlleleY <400> 17 gctgttaaaa tacgatcctt cggc 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_K_Primer_Common <400> 18 cttcaaggcc tcmcgtgccg tt 22 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_M_Primer_AlleleX <400> 19 aagacaagca aagaagatga ttcrtttg 28 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_M_Primer_AlleleY <400> 20 caagacaagc aaagaagatg attcrttta 29 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_M_Primer_Common <400> 21 tagtagaact tgcaaaatca ttccacacat 30 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_O_Primer_AlleleX <400> 22 gtcacrtttg tctttctcac atccg 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_O_Primer_AlleleY <400> 23 gtcacrtttg tctttctcac atcca 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_O_Primer_Common <400> 24 agcagttgtt ggygactttg gcct 24 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_P_Primer_AlleleX <400> 25 ccaagttcat catctgtgca accat 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_P_Primer_AlleleY <400> 26 caagttcatc atctgtgcaa ccac 24 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_P_Primer_Common <400> 27 gagagaattg ccacttcctt cattatgtt 29 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_Q_Primer_AlleleX <400> 28 gccctgcagc tgcttgtcca t 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_Q_Primer_AlleleY <400> 29 ccctgcagct gcttgtccac 20 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_Q_Primer_Common <400> 30 gacagtgtgt gggatttgca ggaaa 25 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_S_Primer_AlleleX <400> 31 cgctgtgacg caggagatga c 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_S_Primer_AlleleY <400> 32 acgctgtgac gcaggagatg at 22 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_S_Primer_Common <400> 33 ctgcttcatc ttcctctctc cctt 24 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_T_Primer_AlleleX <400> 34 caggcttaca tggtcctgga gta 23 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_T_Primer_AlleleY <400> 35 aggcttacat ggtcctggag tg 22 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_T_Primer_Common <400> 36 ttaccatcag tgtaatgata aagcaccga 29 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<223> Persimmon_AA_Primer_AlleleY <400> 44 gacaaggcca tgtctacaca tgc 23 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Persimmon_AA_Primer_Common <400> 45 tcaccatggc caagctgtcc ct 22

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 45로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 감 품종 판별을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 15개의 SNP를 검출하는 것인, 프라이머 세트.
제2항에 있어서, 상기 SNP 마커 각각에 대한 프라이머 세트는 (i) 서열번호 3n의 역방향 프라이머; (ii) 서열번호 3n-1의 대립 형질 특이 정방향 프라이머; 및 (iii) 서열번호 3n-2의 정방향 프라이머의 올리고뉴클레오티드로 구성되고,
상기 n은 1 내지 15의 자연수로 (i) 내지 (iii)의 n은 동일한 값을 갖는 것인, 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 감 품종은 Goseongchambansi, Changpyeongpasi, Noansubunsu, Chuyeon, Zenzimaru, Gimhaedanseongsi, Daimaban, Jangseongsetogari, Jeongupbansi, Gwangjubaesi, Jowan, Gimhaechalgam, Gangneungjangsi, Goseongdongcheolsi, Hamyangbansi, Goesangolgam, Gwangjupasi, Wangchu, 05-14-64, Gampung, Jangseongsusi, Sancheongkurigam, Parter, Uljinwonsi, Wonmi, Yeonginjangjunsi, Bonghwagolgam, Jinyangmulbansi, Emon, Sangjuhgdongsi, Taishu 및 Sancheongdanseongsi 중 선택되는 것인, 프라이머 세트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 감 품종 판별을 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR) 분석용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 dNTP 및 중합효소를 포함하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 감 품종 판별용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 dNTP, 중합효소 및 완충액을 포함하는 것인, 감 품종 판별용 키트.
(a) 감 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는,
감 품종의 판별 방법.
제9항에 있어서, 상기 방법은 증폭된 산물을 분석하여 유전형을 확인한 결과를 디지털 신호로 변환하는 단계를 포함하는, 감 품종의 판별 방법.