KR101286990B1 - 벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 ｐｃｒ 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국내외산 벼의 품종 구분이 가능한 벼 품종 식별용 마커 세트 및 실시간 다중 PCR을 이용한 벼 품종의 식별 방법에 관한 것으로, 국내에서 생산되는 주요 재배 품종 새추정벼, 태봉벼, 고시히카리, 수라벼, 동안벼, 주남벼, 추청벼, 중화벼, 대안벼, 새계화벼, 오대벼, 운두벼, 화영벼, 남평벼, 동진 1호 벼, 화봉벼, 일품벼, 상미벼, 화성벼, 신동진벼, 문장벼, 히토메보레, 동진벼, 일미며, 삼광벼, 새상주벼, 평안벼, 상주벼, 호평벼, 운광벼, 온누리벼, 대평벼, 만추벼, 고품벼, 간척벼, 서간벼, 미향벼, 눈보라벼, 금오벼, 소비벼, 소백벼, 삼백벼, 삼덕벼, 운봉벼, 영안벼, 상옥벼, 적진주벼, 진부벼, 오대 1호 벼, 향남벼, 향미 1호벼, 향미 2호 벼, 흑진주벼, 흑향벼, 한마음벼, 풍미벼, 화랑벼, 호품벼, 화랑벼, 호품벼, 청호벼, 황금누리벼, 오래벼, 새누리벼, 말그미벼, 원황벼, 칠보벼 및 풍미 1호벼 67종을 식별할 수 있다.

Description

벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 ＰＣＲ 방법{MULTIPLEX REAL TIME PCR METHOD FOR DISCRIMINATION OF RICE CULTIVAR}
본 발명은 벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 PCR 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 67종의 벼(또는 쌀)를 신속, 정확하게 식별할 수 있는 자동화된 다중 실시간 PCR 방법에 관한 것이다.
벼는 화본(Gramineae)과 벼속(genus Oryza) 식물로서, 국제 미작연구소(IRRI, Int'l Rice Research Institute)에 의하면 60,000여종이 있는 것으로 알려져 있다. 2004년 농림부의 보고에 따르면, 국내에는 정부에서 공급한 113개 품종과 195개 육종 품종이 있다. 재배벼에는 아시아벼(O. sativa)와 아프리카벼(O. glaberrima)의 두 종이 있으며, 이중에 아시아벼(O. sativa)가 세계적으로 더 널리 경작되고 있다.
벼는, 최근 10여개국이 참여하는 국제 벼 게놈 염기해석 프로젝트(IRGSP: International Rice Genome Sequencing Project)를 통하여 니폰바레(Nipponbare) 품종에 대한 게놈 염기서열 분석이 이루어지고 있으며(Japan, America, China, France, India, Taiwan, Korea, Brazil, Thailand and England), 2002년도를 기준으로 니폰바레 게놈의 약 4억여 개의 염기서열 중 92％의 염기서열이 밝혀진 상태이다.
한편, 우리나라에서는 쌀시장 개방에 대한 '도하 개발 아젠다'에 앞서, 고품질의 쌀 생산을 장려하기 위하여 2004년도부터 정부가 정부 품종제한 수매제를 시행하여, 지역별 3개의 품종을 선정하여 28개 품종에 대한 수매를 실시하고 있으며, 또한, 벼의 품종에 대한 정보를 포장지에 표시하도록 하는 포장양곡 표시제를 2004년도 1월부터 실시하여, 브랜드쌀 평가제의 실시를 통하여 농림부는 쌀의 고품질화와 유통질서 확립을 추진하고 있다.(Announcement of MAF: Law of rice management Subsection 1 of Article 20). 이러한 제도는 쌀의 품질에 대한 알권리 충족을 위한 것이며, 생산과 소비, 투명한 유통과정의 확립을 목적으로 하고 있다.
따라서, 벼의 품종을 식별하는 기술에 대한 관심이 집중되고 있으며, 최근들어 여러가지 DNA 마커를 이용하여 벼 품종을 식별하기 위한 많은 연구들이 진행되었다. 그중에서도, RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism)와 마이크로세틀라이트(microsatellite)가 품종 식별에 사용되고 있다. 예로, Wang 등의 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 마커를 이용한 품종을 식별 방법(Wang, Z.Y., Tanksley, S.D. 1989 L. Genome. 32, 1113-1118), Ryu의 단백질 모세관 전기영동 방법을 이용한 품종 식별 방법(Ryu, D.J. 1998 J. food science and nutrition. 3, 43-347), 6개의 마이크로세틀라이트 마커를 이용한 유전자 지도에서의 위치 확인으로 자포니카 벼 51개 품종의 식별 방법(Ji, H.S. et al., 1998 Korean J. Breed. 30, 350-360)이 보고되었으며, RAPD, 마이크로세틀라이트, STS(sequence tagged site), 및 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 이용한 국내산 40개의 품종 식별 방법과 각 방법의 장단점이 비교되기도 하였다(Jeong O.Y. et al., Korean 1998 J. Breed. 30, 136-137). 아울러, RAPD와 마이크로세틀라이트를 이용한 31개 벼 품종의 식별 방법(Kwon, S.J. et al., 1999 Korean J Crop Science 44, 112-116), 화상분석기술을 이용한 벼 품종의 식별 방법Kwon, S.J. et al., 1998 Korean J Crop Science 43, 33-34)들도 보고되었다.
그러나 이러한 식별 방법들과 이미지 기술은 특이적인 단일 밴드를 형성할 수 없으므로, 혼합된 품종들로부터 각각의 품종을 식별하기가 어렵고, 분석 결과를 논의하기가 어려운 단점이 있다.
또한, 국내 출원번호 제2005-69858호에서도 프라이머를 이용한 PCR 방법에 의한 벼 품종 식별방법이 개시되어 있으며, 이는 현재 국내 표준검사법으로 고시되어 있다. 그러나, 상기한 방법은 1개의 벼 시료를 검사하였을 경우, 무작위적으로 선별된 24립의 벼(또는 쌀)로부터 각각 추출된 24개의 DNA를 주형으로 하여 9가지의 SNP 분석용 프라이머로 쌀 내재유전자를 포함하여, 총 240번 이상의 PCR 반응을 수행하여야 한다. 아울러, PCR 종료 후, 240개의 PCR 산물에 대하여 27 웰 아가로스 젤 10장의 전기영동이 요구된다. 또한, 이러한 과정은 1인의 검사원이 3일간 수행해야 하는 노동력 집약적이며, 결과를 얻기까지 장기간이 소요되는 문제가 있다.
따라서, 각각의 벼 품종에 특이적인 식별 마커를 동시에 신속 정확하게 분석하여, 자동화된 방식으로 그 결과를 산출할 수 있는 보다 효율적인 방법이 필요한 실정이다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 국내산 벼 상호간에 품종을 복수개의 마커로 동시에 분석할 수 있는, 신속하고, 간단하며, 자동화된 식별 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 내지 (l)로 이루어진 군으로부터 선택된 벼 품종 식별용 마커 세트 2종 이상을 포함하는, 벼 품종을 식별하기 위한 마커 조합 조성물을 제공한다:
(a) 서열번호 1을 포함하는 프라이머, 서열번호 2를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 3을 포함하는 프로브;
(b) 서열번호 4를 포함하는 프라이머, 서열번호 5를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 6을 포함하는 프로브;
(c) 서열번호 7을 포함하는 프라이머, 서열번호 8을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 9를 포함하는 프로브;
(d) 서열번호 10을 포함하는 프라이머, 서열번호 11을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 12를 포함하는 프로브;
(e) 서열번호 13을 포함하는 프라이머, 서열번호 14를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 15를 포함하는 프로브;
(f) 서열번호 16을 포함하는 프라이머, 서열번호 17을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 18을 포함하는 프로브;
(g) 서열번호 19를 포함하는 프라이머, 서열번호 20을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 21을 포함하는 프로브;
(h) 서열번호 22를 포함하는 프라이머, 서열번호 23을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 24를 포함하는 프로브;
(i) 서열번호 25를 포함하는 프라이머, 서열번호 26을 포함하는 프라이머, 및 서열번호 27을 포함하는 프로브.
(j) 서열번호 28을 포함하는 프라이머, 서열번호 29를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 30을 포함하는 프로브.
(k) 서열번호 31을 포함하는 프라이머, 서열번호 32를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 33을 포함하는 프로브.
(l) 서열번호 34를 포함하는 프라이머, 서열번호 35를 포함하는 프라이머, 및 서열번호 36을 포함하는 프로브.
또한, 본 발명은 상기 벼 품종을 식별하기 위한 마커 조합 조성물을 이용하여 벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 실시하는 단계; 상기 실시간 PCR 결과로 구현된 형광물질 피크를 감지하여, 각 벼 품종 식별용 마커 세트에 의한 PCR 증폭 여부를 확인하는 단계; 및 상기 PCR 증폭 여부에 따라 벼의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 복수개의 벼 품종용 식별 마커 세트를 이용한 벼 품종 식별 방법을 제공한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 벼 품종 식별 방법은 벼 품종 식별용 마커 세트 2종, 3종, 4종 또는 5종 이상을 동시에 사용한 실시간 PCR 방법을 확립한 것으로, 기존의 벼 품종을 식별하기 위해 각 마커별로 실시하여야 하는 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다. 따라서, 현재 정부 품종제한 수매제, 포장양곡 표시제, 브랜드쌀 평가제 등의 다양한 정책을 과학적으로 뒷받침해 줄 수 있으며, 유통중인 쌀의 원산지 관리를 위한 품종 식별에도 유용하게 이용될 수 있다.
도 1 내지 67은 각각 남평벼, 대안벼, 동안벼, 동진 1호 벼, 상미벼, 새계화벼, 새추청벼, 수라벼, 신동진벼, 오대벼, 일미벼, 일품벼, 주남벼, 중화벼, 추청벼, 화봉벼, 화성벼, 화영벼, 동진벼, 운두벼, 태봉벼, 문장벼, 고시히카리, 히토메보레, 대평벼, 만주벼, 미향벼, 서간벼, 소백벼, 소비벼, 영안벼, 운봉벼, 적진주벼, 진부벼, 향남벼, 향미 1호벼, 향미 2호벼, 호평벼, 흑향벼, 간척벼, 고품벼, 금오벼, 눈보라벼, 다미벼, 삼광벼, 삼덕벼, 삼백벼, 상옥벼, 상주벼, 새상주벼, 오대 1호벼, 온누리벼, 운광벼, 평안벼, 풍미 1호벼, 풍미벼, 한마음벼, 호품벼, 화랑벼, 황금누리벼, 청호벼, 원황벼, 말그미벼, 오래벼, 칠보벼 및 새누리벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 하나의 SNP만을 검출할 수 있는 현재 국내 검사법은 시간, 비용, 노동력 측면에서 비효율적임을 인식하여, 다수종의 SNP를 한꺼번에 검출할 수 있는 프라이머 쌍과 프로브의 조합, PCR 조건 및 PCR 증폭 결과를 확인하는 방법에 대해 연구하던 중, 서로 다른 SNP를 타겟으로 하더라도 하나의 PCR 반응물에서 그 각각의 고유 PCR 증폭을 효율적으로 수행할 수 있는 프라이머 쌍과 프로브의 조합, 상기 프라이머 쌍과 프로브의 조합이 동시에 작용할 수 있는 PCR 조건 및 PCR 증폭 결과를 한꺼번에 파악할 수 있는 방법을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 각 벼 품종에 특이적인 SNP를 PCR을 통해 증폭시키고, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 반응시킴으로써, 실시간 PCR 방법을 통해 테스트한 벼의 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 각 벼 품종에 특이적인 SNP를 증폭시키는 프라이머 세트와 프로브를 한 세트로 하여, 2세트 이상의 벼 품종 식별용 마커 세트를 동시에 이용한 벼 품종 식별 방법에 관한 것으로, 벼 품종 식별에 필요한 과정을 현저하게 단축시킨 경제 효용성이 높은 방법이다.
하기 표 1에 본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트를 나타낸다.
구분 마커 명칭 타입 명명 서열 서열번호
a DK17-1 SNP P1(정방향) atc ccc ata att ctt gac aa 1
P2(역방향) gga atc cgt ctt gat ttg tg 2
프로브1 tgt cgc gga gaa cata 3
b DK2708 SNP P3(정방향) gat aat gga ata gtc atc ccg gcc ttt gct 4
P4(역방향) att ttt tct atc att tct gaa cta cac tcg 5
프로브2 att aca att tag cac tct a 6
c DK50 SNP P5(정방향) cgc gaa cta aac aag ccc ga 7
P6(역방향) aac cct tcc gat atc ctg tc 8
프로브3 ttg gtg tta cat cag atg 9
d DK63 SNP P7(정방향) aca cgc aat gag tgt ggc agt gtg 10
P8(역방향) cgg cca tgt gtt tac cta ctg 11
프로브4 tgt atg gct ttt gta cc 12
e DK560 SNP P9(정방향) gcc acg tct tct tta aag att 13
P10(역방향) att agg ctg cat aca tta gtc atc c 14
프로브5 tag aat ccc gac ccc ct 15
f DK1412 SNP P11(정방향) tat tgg gcc gaa tct gat tcg t 16
P12(역방향) tct ccg aca gtt tag ggc tta ggg 17
프로브6 tcg cag tac cgg ata tct 18
g DK2171 SNP P13(정방향) aca caa aat aat gtc cat att a 19
P14(역방향) aac tag caa att gcc tat gcg ttg 20
프로브7 ctt tac aag tat gta gtg aag ga 21
h DK2394 SNP P15(정방향) tga tat ctt gga tta gaa gtt aac 22
P16(역방향) ctg ata cag aaa ctt tcc aac cat tgg 23
프로브8 gaa cca caa cat ttt gcc gc 24
i DK2401 SNP P17(정방향) cac atc atc ttc aat ttc aac caa aat 25
P18(역방향) tat aca cca ttg att tct cta aat gg 26
프로브9 taa act ttg cgc tga ac 27
j DK1854 In/Del P19(정방향) agc atg gtc cca gac aaa tg 28
P20(역방향) tgg atg att tct gtt agt ggt tca ag 29
프로브10 ttc ttg atg ata aat tgc tct ca 30
k DK6 SNP P21(정방향) aac ttt agt gca ggg ttt tca tca c 31
P22(역방향) gaa cta caa gct caa gtc aag ccc 32
프로브11 agc ctc tag gta tta ttg 33
l DK721 SNP P23(정방향) acg ggt ttt ctt ttt cat ttc g 34
P27(역방향) tag gga gca cct act ata gaa ggt atg 35
프로브12


 tt tgc gat ctt tc 36
상기 표 1의 마커는 서열번호 1 내지 36으로 염기 서열을 기재한 것이다. 상기 표 1에서, 마커 명칭은 임의로 설정한 것이며, 타입은 SNP 및 In/Del 마커 타입이다. SNP 마커는 어느 하나의 대립형질의 염기부가 정확하게 매치되어지지만, 이와는 다른 특정 대립형질에는 미스매치되어지는 염기로 치환되어져 있는 마커를 말하며, In/Del 마커는 어느 하나의 대립형질에는 정확하게 매치되는 염기를 가지지만, 이와는 다른 특정 대립형질에는 염기가 삽입(insertion) 또는 삭제(deletion)되어 미스매치되어지는 마커를 의미한다.
상기 본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커에 따른 프라이머는 모든 벼 품종의 염기서열과 일치하나, 프로브는 SNP를 나타내는 특정 대립유전자(the specific allele)와 일치한다. 따라서 상보적으로 일치하는 대립유전자형에 대해서는 프로브가 특이적으로 주형 DNA에 혼성화(hybridization) 하나, 비 특이 대립유전자에 대해서는 프로브가 혼성화 하지 않는다. 이때 프로브는 검출가능한 수단으로 표지되므로 PCR로 증폭된 산물의 SNP 타입을 확인할 수 있다. 이러한 프라이머 쌍과 각 벼 품종에 특이적인 프로브 세트를 2 세트 이상으로 벼 품종을 쉽게 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커 세트는 자포니카 재배 벼(쌀)에 대한 품종 식별을 위해 고안되었다. 자포니카 벼 품종은 Oryza sativa L.의 학명을 가진 아종의 국내산 및 외국산 품종이다. 상기 본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커는 벼 게놈상의 DNA의 단일 염기차이를 이용한 것으로 벼의 12개 염색체 내에 산재하여 존재한다. 본 발명에 따른 상기 각각의 마커는 벼의 12개 염색체중 일본 니폰바레 품종에 대한 CAPS 사이트를 참고하여 일정 부위를 PCR을 이용하여 증폭한 후 이 부위의 염기서열을 분석하여 개별 벼 품종 중에 존재하는 SNP 또는 InDel 위치를 찾아내고, 이 위치를 이용하여 품종별 식별이 가능한 대립유전자 특이 프로브로서 고안한 것이다.
본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커 세트의 특징은 구체적으로 다음과 같다.
DK17-1: 8번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP003886 클론
DK2708: 12번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AL731784 클론
DK50: 11번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AC145367 클론
DK63: 3번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AC135495 클론
DK560: 12번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 BX000560 클론
DK1412: 7번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP005198 클론
DK2394: 7번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP003866 클론
DK2401: 7번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP004010 클론
DK1854: 4번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AL606616 클론
DK6: 11번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AC119073 클론
DK721: 3번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AC119747 클론
아울러, 본 발명의 벼 품종 식별 방법의 양성 대조군으로, 벼 내재 유전자, 예컨대 내재 유전자로서 벼에 존재하는 곡물중심체 염기서열(Cereal Centromeric Sequence)과 유사한 CCS1으로 AB013614 클론 위치에 존재하는 게놈 DNA를 이용할 수 있다.
본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트 총 12종, DK17-1, DK34, DK50, DK63, DK560, DK1412, DK2171, DK2394, DK2401, DK1854, DK6 및 DK721 중 이들의 2종 이상의 조합, 바람직하기로는, 3종 이상, 가장 바람직하기로는 4종의 조합을 동시에 사용하여 실시간 PCR을 수행할 수 있다. 이들 총 12종의 벼 품종 식별용 마커 세트의 조합은 프로브 표지에 이용할 수 있는 검출가능한 수단의 종류 및 개수에 따라 결정할 수 있다.
즉, 상기 검출가능한 수단은 실시하는 하나의 실시간 PCR 반응물에 동시에 사용할 수 있으며, 사용한 각각의 검출가능한 수단은 각각 검출할 수 있어야 한다. 예컨대, 단일 PCR 반응물에 동시에 사용가능하며 종류별로 특이적으로 검출할 수 있는 검출가능한 수단의 종류가 2종이라면, 본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트는 총 2종을 조합하여 실시간 PCR을 동시 실시할 수 있다. 다른 예로, 특이적인 검출가능한 수단의 종류가 3종, 4종, 5종, 6종 또는 7종 이상인 경우, 본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트는 각각 3종, 4종, 5종, 6종 또는 7종 이상의 조합으로 사용할 수 있다. 상기에서, 특이적인 검출가능한 수단에 사용된 "특이적인"은 단일 PCR 반응물에 2종 이상을 동시에 사용가능할 뿐만 아니라 검출가능한 조건에서 사용한 각각의 것을 별도로 검출할 수 있는 특성을 의미한다.
상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광물질, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 형광물질이 가장 바람직하다. 형광물질은 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 용이하게 입수가능하다. 형광물질의 예로는, FAM™(6-카르복시플루오레세인), SYBR　 Green, VIC(2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), JOE(카르복시-4', 5'-디클로로-2', 7'-디메톡시플루오레세인), NED™(2'-클로로-5'-플루오로-7' 8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인), TAMRA™(카르복시테트라메틸로다민), Cy3™, ROX™(카르복시-X-로다민), HEX(2', 4', 5', 7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), TET(2', 7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인), Texas Red, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광물질은 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광물질은 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 한다. 대표적인 형광물질의 특징은 아래 표 2에 간략하게 나타내었다.
Filter 여기 파장 방사 파장 형광물질
1 490 520 FAM, SYBR Green
2 520 550 JOE, VIC, HEX, TET
3 550 580 NED, TAMRA, CY3
4 580 610 Taxas Red, ROX, RED610
5 640 670 CY5, RED670
본 발명의 일 예로, 형광물질은 통상의 방법으로 본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커 세트에 포함된 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR　 Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5말단을 형광물질(FAM 등)로 3말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5→ 3엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광물질(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광물질과 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광물질과 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
이러한 방법을 본 발명의 벼 품종을 식별하기 위한 다중 실시간 PCR 법에 적용할 수 있다. 상기한 방법들은 당업계에 공지된 것이므로, 반응 효율, 시간, 형광물질 타입 등을 적절히 고려하여, 특정 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서는 일 예로, TaqMan™ 프로브 방법을 사용할 수 있다. 예로, TaqMan™ 프로브 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트의 형광물질 표지 예를 하기 표 3에 나타내었다.
마커 세트 타입 명명 서열
DK17-1 SNP P1(정방향) atc ccc ata att ctt gac aa
P2(역방향) gga atc cgt ctt gat ttg tg
프로브1 FAM-tgt cgc gga gaa cata-MGBNFQ
DK2708 SNP P3(정방향) gat aat gga ata gtc atc ccg gcc ttt gct
P4(역방향) att ttt tct atc att tct gaa cta cac tcg
프로브2 Cy5-att aca att tag cac tct a-MGBNFQ
DK50 SNP P5(정방향) cgc gaa cta aac aag ccc ga
P6(역방향) aac cct tcc gat atc ctg tc
프로브3 VIC-ttg gtg tta cat cag atg-MGBNFQ
DK63 SNP P7(정방향) aca cgc aat gag tgt ggc agt gtg
P8(역방향) cgg cca tgt gtt tac cta ctg
프로브4 NED-tgt atg gct ttt gta cc-MGBNFQ
DK560 SNP P9(정방향) gcc acg tct tct tta aag att
P10(역방향) att agg ctg cat aca tta gtc atc c
프로브5 FAM-tag aat ccc gac ccc ct-MGBNFQ
DK1412 SNP P11(정방향) tat tgg gcc gaa tct gat tcg t
P12(역방향) tct ccg aca gtt tag ggc tta ggg
프로브6 VIC-tcg cag tac cgg ata tct-MGBNFQ
DK2171 SNP P13(정방향) aca caa aat aat gtc cat att a
P14(역방향) aac tag caa att gcc tat gcg ttg
프로브7 NED-ctt tac aag tat gta gtg aag ga-MGBNFQ
DK2394 SNP P15(정방향) tga tat ctt gga tta gaa gtt aac
P16(역방향) ctg ata cag aaa ctt tcc aac cat tgg
프로브8 VIC-gaa cca caa cat ttt gcc gc-MGBNFQ
DK2401 SNP P17(정방향) cac atc atc ttc aat ttc aac caa aat
P18(역방향) tat aca cca ttg att tct cta aat gg
프로브9 FAM-taa act ttg cgc tga ac-MGBNFQ
DK1854 In/Del P19(정방향) agc atg gtc cca gac aaa tg
P20(역방향) tgg atg att tct gtt agt ggt tca ag
프로브10 Cy5-ttc ttg atg ata aat tgc tct ca-MGBNFQ
DK6 SNP P21(정방향) aac ttt agt gca ggg ttt tca tca c
P22(역방향) gaa cta caa gct caa gtc aag ccc
프로브11 Cy5-agc ctc tag gta tta ttg-MGBNFQ
DK721 SNP P23(정방향) acg ggt ttt ctt ttt cat ttg g
P27(역방향) tag gga gca cct act ata gaa ggt atg
프로브12 NED-tt tgc gat ctt tc-MGBNFQ
상기 표 3은 본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커 세트 3종을 포플렉스 실시간 PCR에 사용할 경우를 고려한 것으로, 형광물질로 FAM, VIC, Cy5 및 NEDTM 4종을 각각 사용하여 프로브 5' 말단에 표지하며, 프로브 3' 말단은 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)를 부착시킨다. 일예로, 포플렉스 실시간 PCR에 사용가능한 벼 품종 식별용 마커 세트의 조합은, 다음과 같을 수 있다:
DK2401, DK50, DK2171 및 DK2708로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 세트 1종;
DK17-1, DK1412, DK721 및 DK1854로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 세트 1종; 및
DK560, DK2394, DK63 및 DK6로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 세트 1종.
상기한 조합은 서로 다른 형광물질로 표지된 마커 세트를 함께 사용할 수 있다는 조건에 의한 것으로, 일 예에 불과하며, 상기 조합 외에도 형광물질을 변경하면서 다양한 조합을 만들 수 있다. 이는, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해 및 실시할 수 있을 것이다. 본 발명의 다른 예로, (1) DK2401(FAM), DK50(VIC), DK2171(NED), DK2708(Cy5); (2) DK17-1(FAM), DK1412(VIC), DK721(NED) 및 DK1854(Cy5); 및 (3) DK560(FAM), DK2394(VIC), DK63(NED), DK6(Cy5) 조합을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여, 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광물질을 감지하여 도 1과 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트 및 이를 이용한 벼 품종 식별 방법을 통해, 수종의 벼 품종을 식별할 수 있으며, 특히 남평벼, 대안벼, 동안벼, 동진 1호 벼, 상미벼, 새계화벼, 새추청벼, 수라벼, 신동진벼, 오대벼, 일미벼, 일품벼, 주남벼, 중화벼, 추청벼, 화봉벼, 화성벼, 화영벼, 동진벼, 운두벼, 태봉벼, 문장벼, 고시히카리, 히토메보레, 대평벼, 만주벼, 미향벼, 서간벼, 소백벼, 소비벼, 영안벼, 운봉벼, 적진주벼, 진부벼, 향남벼, 향미 1호 벼, 향미 2호 벼, 호평벼, 흑향벼, 간척벼, 고품벼, 금오벼, 눈보라벼, 다미벼, 삼광벼, 삼덕벼, 삼백벼, 상옥벼, 상주벼, 새상주벼, 오대 1호 벼, 온누리벼, 운광벼, 평안벼, 풍미 1호 벼, 풍미벼, 한마음벼, 호품벼, 화랑벼, 황금누리벼, 청호벼, 원황벼, 말그미벼, 오래벼, 칠보벼 및 새누리벼의 총 67종의 벼 품종을 각각 식별할 수 있다.
구체적인 식별 방법은 다음과 같다.
(1) 남평: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK17-1, DK560, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크(peak)가 나타날 경우 남평벼로 판정한다.
(2) 대안: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 대안벼로 판정한다.
(3) 동안: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK1412, DK560, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 동안벼로 판정한다.
(4) 동진1: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK1412, DK17-1, DK560, DK2708 그리고 DK721 위치에서 피크가 나타날 경우 동진1벼로 판정한다.
(5) 상미: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK17-1, DK63, DK560, DK2708, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 상미벼로 판정한다.
(6) 새계화: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK560 그리고 DK721 위치에서 피크가 나타날 경우 새계화벼로 판정한다.
(7) 새추청: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK17-1, DK721, DK1854 그리고 DK6위치에서 피크가 나타날 경우 새추청벼로 판정한다.
(8) 수라: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK560 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 수라벼로 판정한다.
(9) 신동진: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK63, DK560 그리고 DK721 위치에서 피크가 나타날 경우 신동진벼로 판정한다.
(10) 오대: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK560, DK2708, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 오대벼로 판정한다.
(11) 일미: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK2171, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 일미벼로 판정한다.
(12) 일품: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK63, DK560, DK2708 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 일품벼로 판정한다.
(13) 주남: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 동안벼로 판정한다.
(14) 중화: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK2401, DK17-1, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 중화벼로 판정한다.
(15) 추청: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK17-1, DK560, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 추청벼로 판정한다.
(16) 화봉: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 화봉벼로 판정한다.
(17) 화성: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK63, DK560, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 화성벼로 판정한다.
(18) 화영: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560 그리고 DK721 위치에서 피크가 나타날 경우 화영벼로 판정한다.
(19) 동진: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK560, DK2171 그리고 DK721 위치에서 피크가 나타날 경우 동진벼로 판정한다.
(20) 운두: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK17-1, DK560, DK2708, DK721 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 운두벼로 판정한다.
(21) 태봉: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK2401, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 태봉벼로 판정한다.
(22) 문장: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK560, DK2171, DK2708 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 문장벼로 판정한다.
(23) 고시히카리: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 고시히카리벼로 판정한다.
(24) 히토메보레: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK17-1, DK560, DK2171, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 히토메보레벼로 판정한다.
(25) 대평: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 대평로 판정한다.
(26) 만추: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK560, DK2171, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 만추벼로 판정한다.
(27) 미향: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK63, DK560, DK2708, DK721 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 미향벼로 판정한다.
(28) 서간: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK63, 그리고 DK560 위치에서 피크가 나타날 경우 서간벼로 판정한다.
(29) 소백: 벼 품종용 식별 마커 세트 DK560, DK2708, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 소백벼로 판정한다.
(30) 소비 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK1412, DK17-1, DK63 그리고 DK560 위치에서 피크가 나타날 경우 소비벼로 판정한다.
(31) 영안 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK1412, DK560, DK2171, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 영안벼로 판정한다.
(32) 운봉 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK560, DK2708, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 운봉벼로 판정한다.
(33) 적진주 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK17-1, DK2171, DK2708, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 적진주벼로 판정한다.
(34) 진부 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK63, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 진부벼로 판정한다.
(35) 향남 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2171, DK2708, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 향남벼로 판정한다.
(36) 향미 1호 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2708 그리고 DK721 위치에서 피크가 나타날 경우 향미 1호벼로 판정한다.
(37) 향미 2호 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2708 위치에서 피크가 나타날 경우 향미 2호벼로 판정한다.
(38) 호평 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK1412, DK17-1, DK63, DK560 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 호평벼로 판정한다.
(39) 흑향 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK2708, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 흑향벼로 판정한다.
(40) 흑진주 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK17-1, DK63, DK560, DK2171, DK2708 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 흑진주벼로 판정한다.
(41) 간척 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK1412, DK560, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 간척벼로 판정한다.
(42) 고품 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK17-1, DK63, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 고품벼로 판정한다.
(43) 금오 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 금오벼로 판정한다.
(44) 눈보라 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK2401, DK560, DK2171, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 눈보라벼로 판정한다.
(45) 다미 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK63 그리고 DK560 위치에서 피크가 나타날 경우 다미벼로 판정한다.
(46) 삼광 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK2708, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 삼광벼로 판정한다.
(47) 삼덕 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 삼덕벼로 판정한다.
(48) 삼백 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK560, DK1708, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 삼백벼로 판정한다.
(49) 상옥 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560, DK721 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 상옥벼로 판정한다.
(50) 상주 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK17-1, DK2708, DK1854 그리고 DK6위치에서 피크가 나타날 경우 상주벼로 판정한다.
(51) 새상주 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK2401, DK560, DK2708, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 새상주벼로 판정한다.
(52) 오대 1호 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK63, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 오대 1호벼로 판정한다.
(53) 온누리 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 중산벼로 판정한다.
(54) 운광 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK1412, DK17-1, DK560, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 중산벼로 판정한다.
(55) 평안 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1 그리고 DK560위치에서 피크가 나타날 경우 평안벼로 판정한다.
(56) 풍미 1호 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK560, DK2171, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 풍미 1호벼로 판정한다.
(57) 풍미 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 풍미벼로 판정한다.
(58) 한마음 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560 그리고 DK2708 위치에서 피크가 나타날 경우 한마음벼로 판정한다.
(59) 호품 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1 그리고 DK560위치에서 피크가 나타날 경우 호품벼로 판정한다.
(60) 화랑 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK560, DK721, DK1854 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 화랑벼로 판정한다.
(61) 황금누리 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK560, DK2708 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 황금누리벼로 판정한다.
(62) 청호 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK1412, DK560 그리고 DK6 위치에서 피크가 나타날 경우 청호벼로 판정한다.
(63) 원황 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2401, DK1412, DK560, DK721 그리고 DK6위치에서 피크가 나타날 경우 원황벼로 판정한다.
(64) 말그미 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2708 그리고 DK721 위치에서 피크가 나타날 경우 말그미벼로 판정한다.
(65) 오래 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK63, DK560 그리고 DK2708 위치에서 피크가 나타날 경우 오래벼로 판정한다.
(66) 칠보 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK2394, DK17-1, DK560 그리고 DK2708 위치에서 피크가 나타날 경우 칠보벼로 판정한다.
(67) 새누리 : 벼 품종용 식별 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2708, DK721 그리고 DK1854 위치에서 피크가 나타날 경우 새누리벼로 판정한다.
상기한 본 발명의 벼 품종 식별용 마커 세트 2종, 3종, 4종 또는 5종 이상을 동시에 사용한 실시간 PCR 방법에 의해, 기존의 벼 품종을 식별하기 위해 각 마커별로 실시하여야 하는 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 남평벼 품종 식별
1-1. 주형 DNA 추출
특허 출원 제2005-69858호의 방법에 따라, 시료 벼로부터 DNA를 추출하였다. 간략하게는, 식물에서 DNA를 추출할 때 일반적으로 사용되는 CTAB 방법을 변형하여 본 발명에 사용하였다.
시료의 오염을 방지하기 위해, 기름종이에 올려놓고 남평벼 쌀 시료를 망치를 이용하여 아주 작은 조각으로 분쇄한다. 분쇄한 시료(약 30 ㎎)를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고, CTBA 용액 500 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후, 65 ℃ 항온 수조에 30분간 담가 둔다. CTAB 용액의 조성은 다음과 같다: DNA 추출 완충액(Sorbitol 63.75 g, Tris-base 12.1 g, EDTA-Na2 1.68 g/1ℓ)와 핵 융해 완충액(CTAB 20 g, 1M Tris(pH 8.0) 200 ㎖, 0.25M EDTA 200 ㎖, 5M NaCl 400 ㎖/1ℓ)를 1:1로 섞고, 0.2 부피 10％ 사르코실, 0.2 부피 식염수, 1％ 2-머르캅토에탄올을 65 ℃ 항온 수조에서 혼합한다. 14,240 xg(15,000rpm)에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액에 3.8 g/ℓ 소디움 바이설파이트 1 부피와 페놀: 클로로포름: 이소아밀알콜(25:24:1) 1 부피를 섞어서 상온에서 5분 동안 방치한 후, 14,240 xg에서 5분 동안 원심분리 한다. 상등액을 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고 클로로포름: 이소아밀알콜(24:1) 1 부피를 섞어서 상온에서 5분 동안 회전시켜 섞어준다. 14,240 xg에서 5분 동안 원심분리를 하여, 상등액을 1.5 ㎖ 튜브로 옮긴다. 상기의 절차를 경계면이 투명해질 때까지 반복한다. 동량의 이소프로판올을 넣고 5분 동안 잘 섞어주고, -20 ℃에 20분간 넣어두었다가 4 ℃에서 15분 동안 원심분리를 실시한다. 상등액을 버리고 DNA 펠렛을 70％ 에탄올 200 ㎕를 넣어서 4 ℃에서 5분 동안 원심분리를 실시한다. 상등액을 버리고 남은 에탄올을 바람이나 진공 건조기로 건조시킨다. 여기에 멸균 증류수 65㎕와 RNase A(1㎎/ ㎖) 15 ㎕를 넣어 37 ℃ 수조에 15분 동안 넣어둔다.
1-2. 실시간 PCR 반응
2x Master mix 12.5 ㎕, 10-20 ng 주형 DNA, 벼 품종 식별용 마커 세트 4 ㎕, 최종적으로 ddH2O를 포함하여 총 25 ㎕ 부피로 반응액을 혼합한다. 프라이머와 프로브의 적정 농도는 각각 900 nM 과 300 nM이다. 이때 벼 품족 식별용 마커세트는 (1) DK2401(FAM), DK50(VIC), DK2171(NED), DK2708(Cy5); (2) DK17-1(FAM), DK1412(VIC), DK721(NED), DK1854(Cy5); 및 (3) DK560(FAM), DK2394(VIC), DK63(NED), DK6(Cy5)의 조합을 사용하여 3번의 4-플렉스 실시간 PCR을 수행하였다.
이 반응액을 95 ℃에서 10분간 변성시킨 후, 95 ℃에서 15초, 60 ℃에서 1 분의 과정을 40회 반복하여 실시간 PCR을 수행한다. 실시간 PCR 기기는 ABI 7500 Real Time PCR을 사용한다.
1-3. 실시간 PCR을 이용한 PCR 산물의 분석
본 발명은 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, 그리고 BioRad 사의 Chromo 4 기기에 적용할 수 있다. PCR이 종료되면 기기의 레이저가 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광물질을 감지하여 도 1과 같은 피크로 구현된다. 즉, 전기영동과정없이도 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동적으로 결과를 분석할 수 있다.
1-4. 최종 판정
도 1은 남평벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 1을 참조하면, 벼 품종 식별용 마커세트 DK2401, DK17-1, DK560, DK721, DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 남평벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 2: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 대안벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 대안벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 대안벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 3: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 동안벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 동안벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK1412, DK560, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 동안벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 4: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 동진 1호벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 동진 1호벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK1412, DK17-1, DK560, DK2708 및 DK721에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 동진 1호벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 5: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 상미벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 상미벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK17-1, DK63, DK560, DK2708, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 상미벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 6: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 새계화벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 새계화벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK560 및 DK721에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 새계화벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 7: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 새추청벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 새추청벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK17-1, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 새추청벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 8: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 수라벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 수라벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK560 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 수라벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 9: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 신동진벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 신동진벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK63, DK560 및 DK721에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 신동진벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 10: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 오대벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 오대벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK560, DK2708, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 오대벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 11: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 일미벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 일미벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK2171, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 일미벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 12: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 일품벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 일품벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK63, DK560, DK2708 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 일품벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 13: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 주남벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 주남벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 주남벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 14: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 중화벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 중화벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK2401, DK17-1, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 중화벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 15: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 추청벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 추청벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK17-1, DK560, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 추청벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 16: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 화봉벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 화봉벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 16에 나타내었다.
도 16의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 화봉벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 17: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 화성벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 화성벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 17에 나타내었다.
도 17의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK63, DK560, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 화성벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 18: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 화영벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 화영벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 18에 나타내었다.
도 18의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560 및 DK721에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 화영벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 19: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 동진벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 동진벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 19에 나타내었다.
도 19의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK560, DK2171 및 DK721에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 동진벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 20: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 운두벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 운두벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 20에 나타내었다.
도 20의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK17-1, DK560, DK2708, DK721 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 운두벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 21: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 태봉벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 태봉벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK2401, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 태봉벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 22: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 문장벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 문장벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 22에 나타내었다.
도 22의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK560, DK2171, DK2708 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 문장벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 23: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 고시히카리벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 고시히카리벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 23에 나타내었다.
도 23의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 고시히카리벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 24: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 히토메보레벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 히토메보레벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 24에 나타내었다.
도 24의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK17-1, DK560, DK2171, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 히토메보레벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 25: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 대평벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 대평벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 대평벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 26: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 만추벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 만추벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 26에 나타내었다.
도 26의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK560, DK2171, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 만추벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 27: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 미향벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 미향벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 27에 나타내었다.
도 27의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK63, DK560, DK2708, DK721 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 미향벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 28: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 서간벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 서간벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 28에 나타내었다.
도 28의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK63 및 DK560에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 서간벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 29: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 소백 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 소백벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 29에 나타내었다.
도 29의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK560, DK2708, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 소백벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 30: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 소비 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 소비벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 30에 나타내었다.
도 30의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK1412, DK17-1, DK63 및 DK560에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 소비벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 31: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 영안벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 영안벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 31에 나타내었다.
도 31의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK1412, DK560, DK2171, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 영안벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 32: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 운봉벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 운봉벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 32에 나타내었다.
도 32의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK560, DK2708, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 운봉벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 33: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 적진주벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 적진주벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 33에 나타내었다.
도 33의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK17-1, DK2171, DK2708, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 적진주벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 34: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 진부 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 진부벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 34에 나타내었다.
도 34의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK63, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 진부벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 35: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 향남벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 향남벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 35에 나타내었다.
도 35의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2171, DK2708, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 동진 1호벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 36: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 향미 1호벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 향미 1호벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 36에 나타내었다.
도 36의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2708에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 향미 1호벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 37: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 향미 2 호벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 향미 2호벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 37에 나타내었다.
도 37의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK1412, DK17-1, DK63, DK560 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 동진 1호벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 38: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 호평벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 호평벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 38에 나타내었다.
도 38의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK1412, DK17-1, DK63, DK560 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 호평벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 39: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 흑향벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 흑향벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 39에 나타내었다.
도 39의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK2401, DK1412, DK17-1, DK560, DK2708, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 흑향벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 40: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 흑진주 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 흑진주벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 40에 나타내었다.
도 40의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK17-1, DK63, DK560, DK2171, DK2708 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 흑진주벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 41: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 간척 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 간척벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 41에 나타내었다.
도 41의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK1412, DK560, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 간척벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 42: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 고품벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 고품벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 42에 나타내었다.
도 42의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK17-1, DK63, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 고품벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 43: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 금오벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 금오벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 43에 나타내었다.
도 43의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 금오벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 44: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 눈보라 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 눈보라벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 44에 나타내었다.
도 44의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK2401, DK560, DK2171, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 눈보라벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 45: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 다미벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 다미벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 453에 나타내었다.
도 45의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK63 및 DK560에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 다미벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 46: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 삼광벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 삼광벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 46에 나타내었다.
도 46의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 K50, DK2401, DK17-1, DK2708, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 삼광벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 47: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 삼덕벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 삼덕벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 471에 나타내었다.
도 47의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 삼덕벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 48: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 삼백벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 삼백벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 48에 나타내었다.
도 48의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK560, DK1708, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 삼백벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 49: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 상옥벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 상옥벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 49에 나타내었다.
도 49의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560, DK721 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 상옥벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 50: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 상주벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 상주벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK17-1, DK2708, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 상주벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 51: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 새상주 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 새상주벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK2401, DK560, DK2708, DK1854 및 DK6 에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 새상주벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 52: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 오대 1호벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 오대 1호벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK63, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 오대 1호벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 53: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 온누리벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 온누리벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1, DK560 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 온누리벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 54: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 운광 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 운광벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 22에 나타내었다.
도 22의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK1412, DK17-1, DK560, DK1854 및 DK60에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 운광벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 55: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 평안벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 평안벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 23에 나타내었다.
도 23의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK2401, DK17-1 및 DK560에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 평안벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 56: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 풍미 1호벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 풍미 1호벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 24에 나타내었다.
도 24의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK560, DK2171, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 풍미 1호벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 57: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 풍미벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 풍미벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 풍미벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 58: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 한마음벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 한마음벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 22에 나타내었다.
도 22의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560 및 DK2708에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 한마음벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 59: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 호품 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 호품벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 23에 나타내었다.
도 23의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1 및 DK560에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 호품벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 60: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 화랑벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 화랑벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 24에 나타내었다.
도 24의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK560, DK721, DK1854 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 화랑벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 61: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 황금누리벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 황금누리벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK560, DK2708 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 황금누리벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 62: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 청호벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 청호벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK1412, DK560 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 청호벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 63: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 원황벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 원황벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2401, DK1412, DK560, DK721 및 DK6에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 원황벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 64: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 말그미 벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 말그미벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2708 및 DK721에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 말그미벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 65: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 오래벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 오래벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK63, DK560 및 DK2708에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 오래벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 66: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 칠보벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 칠보벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK2394, DK17-1, DK560 및 DK2708에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 칠보벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
실시예 67: 벼 품종 식별용 복수개의 마커 세트를 이용한 새누리벼 품종 식별
상기 실시예 1의 방법에 따라, 시료로 새누리벼를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과에 따르면, 시료 벼로부터 추출한 DNA는 벼 품종 식별용 마커 세트 DK50, DK17-1, DK560, DK2708, DK721 및 DK1854에서 특이적으로 증폭되어, 시료 벼가 새누리벼로 바르게 판정되었음을 확인하였다.
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Claims (8)

  1. 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광물질로 표지되며 3' 말단이 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescencequencher)로 표지된, 하기 (b), (c) (g) 및 (i)로 이루어진 마커 조합 조성물을 이용하여 벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 실시하는 단계;
    프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX,
    RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광물질로 표지되며 3' 말단이 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 표지된, 하기 (a), (f) (j) 및 (l)로 이루어진 마커 조합 조성물을 이용하여 벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 실시하는 단계;
    프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광물질로 표지되며 3' 말단이 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 표지된, 하기 (d), (e) (h) 및 (k)로 이루어진 마커 조합 조성물을 이용하여 벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 실시하는 단계;
    상기 실시간 PCR 결과로 구현된 형광물질 피크를 감지하여, 각 벼 품종 식별
    용 마커 세트에 의한 PCR 증폭 여부를 확인하는 단계; 및
    상기 PCR 증폭 여부에 따라 벼의 품종을 식별하는 단계
    를 포함하는, 복수개의 벼 품종용 식별 마커 세트를 이용한 벼 품종 식별 방법:
    (a) 서열번호 1로 이루어진 프라이머, 서열번호 2로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 3으로 이루어진 프로브;
    (b) 서열번호 4로 이루어진 프라이머, 서열번호 5로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 6으로 이루어진 프로브;
    (c) 서열번호 7로 이루어진 프라이머, 서열번호 8로 이루어진 프라이머, 및
    서열번호 9로 이루어진 프로브;
    (d) 서열번호 10으로 이루어진 프라이머, 서열번호 11로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 12로 이루어진 프로브;
    (e) 서열번호 13으로 이루어진 프라이머, 서열번호 14로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 15로 이루어진 프로브;
    (f) 서열번호 16으로 이루어진 프라이머, 서열번호 17로 이루어진 프라이머,및 서열번호 18로 이루어진 프로브;
    (g) 서열번호 19로 이루어진 프라이머, 서열번호 20으로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 21로 이루어진 프로브;
    (h) 서열번호 22로 이루어진 프라이머, 서열번호 23으로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 24로 이루어진 프로브;
    (i) 서열번호 25로 이루어진 프라이머, 서열번호 26으로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 27로 이루어진 프로브.
    (j) 서열번호 28로 이루어진 프라이머, 서열번호 29로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 30으로 이루어진 프로브.
    (k) 서열번호 31로 이루어진 프라이머, 서열번호 32로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 33으로 이루어진 프로브.
    (l) 서열번호 34로 이루어진 프라이머, 서열번호 35로 이루어진 프라이머, 및 서열번호 36으로 이루어진 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식별 방법은 남평벼, 대안벼, 동안벼, 동진 1호 벼, 상미벼, 새계화벼, 새추청벼, 수라벼, 신동진벼, 오대벼, 일미벼, 일품벼, 주남벼, 중화벼, 추청벼, 화봉벼, 화성벼, 화영벼, 동진벼, 운두벼, 태봉벼, 문장벼, 고시히카리, 히토메보레, 대평벼, 만주벼, 미향벼, 서간벼, 소백벼, 소비벼, 영안벼, 운봉벼, 적진주벼, 진부벼, 향남벼, 향미 1호 벼, 향미 2호 벼, 호평벼, 흑향벼, 간척벼, 고품벼, 금오벼, 눈보라벼, 다미벼, 삼광벼, 삼덕벼, 삼백벼, 상옥벼, 상주벼, 새상주벼, 오대 1호 벼, 온누리벼, 운광벼, 평안벼, 풍미 1호 벼, 풍미벼, 한마음벼, 호품벼, 화랑벼, 황금누리벼, 청호벼, 원황벼, 말그미벼, 오래벼, 칠보벼 및 새누리벼로 이루어진 군으로부터 선택된 벼 품종을 식별하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
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