KR101930710B1 - 국내산 및 외국산 벼 판별용 snp 프라이머 세트, 이를 이용한 벼 품종 및 원산지 판별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 국내산 및 외국산 벼 410개의 품종에 대해 다형성을 나타내는, 벼 품종 및 원산지 판별용 단일염기다형성 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)을 이용하여 판별하는 방법에 관한 것으로, 기존 방법으로는 구별이 불가능한 다양한 종류의 국내산, 외국산 벼 품종 및 원산지를 높은 검출 특이도 및 정확도를 가지고 효과적으로 판별할 수 있어, 양곡 관리와 원산지 관리업무 뿐만 아니라 우수한 국내 벼 유전자원의 보존과 개량에 활용할 수 있다.

Description

국내산 및 외국산 벼 판별용 SNP 프라이머 세트, 이를 이용한 벼 품종 및 원산지 판별방법{SNP primer set for cultivar and origin identification of rice, method for cultivar and origin identification of rice using the same}

본 발명은 국내산 또는 외국산 벼의 품종 및 원산지를 손쉽게 판별할 수 있는 SNP 프라이머, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 벼 품종 및 원산지 판별방법에 관한 것이다.

일반적으로 농산물의 원산지판별은 생물체 내 환경에 따라 변화되지 않고 전달되는 유전물질인 핵산(DNA)의 분석이 품종 또는 원산지 등을 구별하는 좋은 도구로 활용될 수 있다.

또한 DNA 등 유전자를 대상으로 한 PCR (polymerase chain reaction)기술을 이용하는 RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSCP (single strand conformation polymorphisms) 기법 및 microsatellite (MS 또는 simple sequence repeat이라 함) 등 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 품종 및 원산지, 개체식별 등 다양한 산업 전반에 걸쳐 본 기술이 활용되고 있다.

최근 분자유전학 및 유전자 분석기술은 단일염기다형성(SNP)과 단순염기반복다형성(Simple Sequence Repaet; SSR)을 이용하여 유전자 마커(genetic marker)의 개발이 활발하게 진행되고 있다.

그러나, SSR의 경우, 고가의 분석 장비를 필요로 하며, 분석기법이 복잡하고, 비용이 비싸 SNP를 활용한 판별법에 비해 현장적용에 어려움이 많다. 따라서 보다 쉽고 빠른 방법을 통해 품종 또는 원산지를 구별할 수 있는 유전자 마커(SNP marker)의 개발이 절실히 요구되고 있다.

유전자 마커의 분석방법으로 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Allele-Specific PCR, AS-PCR)은 단일염기다형성(SNP)을 효과적으로 분석 가능한 방법으로 최근에도 유전자 마커 분석에 활발하게 활용되는 기술이다. AS-PCR법은 단일염기다형성 부위 말단에 결합되는 프라이머의 결합 여부에 따라 반응 산물(PCR Product)이 생기거나 생기지 않는 원리를 이용하는 것이다.

최근 쌀 관세화 유예 종료와 FTA 체결 등 농수산물 시장개방에 따라 농산물의 원산지 관리를 통한 국내 농산물에 대한 보호 및 육성에 대한 관심이 높아지고 있으며, 벼(쌀)의 경우 고품질 기능성 벼(쌀)의 개발과 지속적인 저관세 의무 수입 쌀(TRQ)의 수입으로 국내산 벼(쌀) 품종 간, 국내산과 외국산 벼(쌀) 품종 간 높은 가격차이가 발생되어 원산지 부정유통 사례가 끊이지 않아 과학적인 원산지 판별법 개발이 시급한 실정이다.

관련된 선행기술로는 단일염기다형성(SNP) 및 DNA 분석기술을 활용한 벼 품종 식별 방법(특허문헌 0001, 0002, 0003, 0004), 품종판별을 위한 마이크로새틀라이트(MS) 마커조합(특허문헌 0005), 국내 및 일본 자포니카 벼 품종판별용 마이크로새틀라이트 마커 조합 및 이의 코드(특허문헌 0006), 향미 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도(특허문헌 007) 등이 개시되어 있다.

그러나, 상기 종래기술의 경우 서로 다른 벼(쌀) 품종에서 동일한 식별 마커의 증폭으로 품종을 명확히 구별하지 못하거나, 국내산 벼(쌀) 품종과 외국산 벼(쌀) 품종 간 동일한 식별 마커의 증폭으로 품종 및 원산지를 구별하는 명확한 판별 방법을 제시하고 있지는 못한 실정이다. 구체적으로 특허문헌 0001, 0002, 0004, 0005 및 0007의 경우 국내산 일부 품종이나 향미 계열 품종에 대한 판별법을 제시하고 있으며, 0006의 경우는 국내산과 일본산 품종에 대한 판별법을 제시하고 있다. 또한 특허문헌 0003의 경우는 국내산과 외국산 벼(쌀) 품종에 대한 판별법을 제시하고 있으나, 운봉, 삼천 품종이나 운두, 신운봉 품종 등과 같이 다수의 벼(쌀) 품종에서 동일한 마커가 증폭되어 품종을 구별할 수 없다.

이러한 상황에서 국내산과 외국산 벼(쌀)를 정확히 구별하여 국내 생산 농가의 소득 보전과 부정유통 방지를 위한 판별법 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0956323호 대한민국 등록특허 제10-0974264호 대한민국 등록특허 제10-1286989호 대한민국 등록특허 제10-1286990호 대한민국 등록특허 제10-0453568호 대한민국 등록특허 제10-0844468호 대한민국 공개특허 제10-2017-0002202호

본 발명자들은 모든 국내산 벼 품종과 다양한 외국산 벼 품종을 효과적으로 구별할 수 있는 분자 마커를 개발하고자 연구노력 한 결과, 국내산 및 외국산 벼 품종 간의 차이가 명확한 단일염기다형성(SNP) 마커들을 선발하였고, 이들 단일염기다형성 마커들을 이용하면 국내산 또는 외국산 벼의 품종 및 원산지를 정확하게 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 단일염기다형성 마커로 구별이 불가능한 국내산 벼 품종 또는 외국산 벼 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성(SNP) 마커 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 국내산 또는 외국산 벼 품종을 판별하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 국내산 또는 외국산 벼 품종을 판별하기 위한 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 33 및 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 35 및 36의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 37 및 38의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 39 및 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

프라이머는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서, 상기 “단일염기다형성 마커(SNP marker)”는 종간 또는 성별 간, 염색체가 갖고 있는 염기서열 중 개인편차를 나타내는 염기변이를 말하며, 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성 중에서 가장 많이 존재한다.

본 발명에서, 상기 “프라이머 세트(SNP 마커)”는 이러한 특징 때문에 종 및 개체의 분류에 많이 이용되고 있는 SNP를 이용하여 개체 식별을 위한 유전자 마커를 선별하고, 상기 선별된 마커들 중에서 변별력이 있고 특이도 및 민감도에서 우수한 결과를 나타내는 SNP 마커들을 사용하여 다중 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Multiplex AS-PCR) 검사 시스템을 확립할 수 있다.

본 발명의 상기 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트는 서열번호 41의 정방향 프라이머 및 서열번호 42의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 더 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 쌍은 RNA 폴리머라아제 베타 사슬(RNA polymerase beta chain) 내재 유전자(rpoC2)를 구별하여 벼에서만 특이적으로 증폭될 수 있다.

본 발명의 상기 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 43의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 구아닌(G)과 아데닌(A)을 구별하고(도 3a),

서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 44의 211번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 티민(T)과 시토신(C)을 구별하고(도 3b),

서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 45의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 구아닌(G)과 시토신(C)을 구별하고(도 3c),

서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 46의 263번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 시토신(C)과 구아닌(G)을 구별하고(도 3d),

서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 47의 128번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 아데닌(A)과 구아닌(G)을 구별하고(도 3e),

서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 48의 25번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 시토신(C)과 아데닌(A)을 구별하고(도 3f),

서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 49의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 시토신(C)과 아데닌(A)을 구별하고(도 3g),

서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 50의 21번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고(도 3h),

서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 51의 21번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 구아닌(G)과 아데닌(A)을 구별하고(도 3i),

서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 52의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 티민(T)과 시토신(C)을 구별하고(도 3j),

서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 53의 22번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 티민(T)과 구아닌(G)을 구별하고(도 3k),

서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 54의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 티민(T)과 아데닌(A)을 구별하고(도 3l),

서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 55의 21번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고(도 3m),

서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 56의 23번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고(도 3n),

서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 57의 19번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 구아닌(G)과 아데닌(A)을 구별하고(도 3o),

서열번호 31의 정방향 프라이머 및 서열번호 32의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 58의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 티민(T)과 아데닌(A)을 구별하고(도 3p),

서열번호 33의 정방향 프라이머 및 서열번호 34의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 59의 236번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 구아닌(G)과 시토신(C)을 구별하고(도 3q),

서열번호 35의 정방향 프라이머 및 서열번호 36의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 60의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 아데닌(A)과 구아닌(G)을 구별하고(도 3r),

서열번호 37의 정방향 프라이머 및 서열번호 38의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 61의 25번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고(도 3s),

서열번호 39의 정방향 프라이머 및 서열번호 40의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 62의 20번째 염기인 단일염기다형성(SNP) 구아닌(G)과 시토신(C)을 구별하고(도 3t),

서열번호 41의 정방향 프라이머 및 서열번호 42의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍은 서열번호 63의 5번째부터 23번째 염기인 ‘AAATTTTTGGGGCTCTTTC’을 구별할 수 있다(도 3u).

다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 벼 품종 및 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.

(a) 벼 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 (b)의 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분리 및 분석하여 벼의 품종 및 원산지를 판별하는 단계.

상기 게놈 DNA는 상기 벼의 낟알 또는 도정된 쌀로 부터 유래된 것일 수 있다. 상기 게놈 DNA는 식물체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득될 수 있다.

상기 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)은 AS-PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 반응액은 분석하고자 하는 벼 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, DNA 중합효소, dNTP, 완충용액 등을 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법에서, 증폭산물을 분리 및 분석하여 벼의 품종 및 원산지를 판별하는 단계는, 얻어진 증폭산물을 도 5에 도시된 벼 품종의 증폭 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종 및 원산지 판별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있으며, 상기 시약은 본 발명의 기술분야에서 널리 공지된 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP, 완충용액 및 증폭 산물의 확인에 필요한 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 단일염기다형성 마커에 의하면, 기존 방법으로는 구별이 불가능한 다양한 종류의 국내산, 외국산 벼 품종 및 원산지를 높은 검출 특이도 및 정확도를 가지고 효과적으로 판별할 수 있다.

본 발명의 단일염기다형성 마커를 이용한 판별방법은 단순하고 비용이 저렴하기 때문에, 다양한 시료의 감정에 유용하게 이용될 수 있고 현장에 용이하게 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 단일염기다형성 마커와 이를 이용한 판별방법은 양곡 표시 및 원산지 부정유통 방지 등의 양곡 관리와 원산지 관리업무 뿐만 아니라 우수한 국내 벼 유전자원의 보존과 개량에 활용할 수 있다.

도 1은 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법의 원리를 나타낸 것이다.
도 2는 국내산과 외국산 벼의 품종 및 원산지 판별을 위한 20쌍의 프라이머 세트와 벼 특이 내재 유전자(rpoC2) 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR(multiplex PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 벼 품종 및 원산지 판별을 위한 20쌍의 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물을 확인한 것으로, 도 3a는 RM1 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3b는 RM2 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3c는 RM3 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3d는 RM4 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3e는 RM5 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3f는 RM6 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3g는 RM7 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3h는 RM8 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3i는 RM9 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3j는 RM10 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3k는 RM11 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3l는 RM12 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3m는 RM13 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3n는 RM14 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3o는 RM15 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3p는 RM16 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3q는 RM17프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3r는 RM18 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3s는 RM19 프라이머 세트를 이용한 증폭산물, 도 3t는 RM20 프라이머 세트를 이용한 증폭산물 및 도 3u는 rpoC2 프라이머 세트를 이용한 증폭산물의 염기서열을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 벼 특이 내재 유전자(rpoC2)의 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 a 내지 g는 국내산 및 외국산 벼 품종의 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)의 증폭 결과를 나타낸 것이다.

이하, 구체적인 실시 예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시 예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.

실시예 1. 국내산 및 외국산 벼 시료

국내산과 외국산 벼(쌀)의 차세대염기서열 분석, 유전자변이 발굴 및 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법 개발에 사용된 시료는 표 1a와 1b에 나타내었으며, 이중 국내산(278 품종)은 국립식량과학원 등에서 분양받아 사용하였고, 외국산(132 품종)은 중국, 일본, 미국, 호주, 베트남 시료로서 수입항구와 해외 현지에서 직접 시료를 수집하여 사용하였다.

[표 1a]

[표 1b]

실시예 2. 벼 게놈 DNA의 추출

벼(쌀) 게놈 DNA는 NucleoSpin Plant Ⅱ Kit(Macherey-Nagel, Germany)를 사용하여 다음과 같이 추출하였다. 곱게 마쇄한 시료에 PL1 Buffer (CTAB-based lysis buffer) 400 μRNase A 10 μ를 첨가한 후 교반기를 이용하여 65℃, 1,000 x rpm에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 용액을 12,000 x rmp에서 2분간 원심분리 한 후 상등액을 NucleoSpin Filter로 옮겨 11,000 x g에서 2분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 NucleoSpin Filter를 통과한 여과액에 PC Buffer 450 μ를 첨가한 후 피펫으로 잘 혼합 한 후 NucleoSpin Plant Ⅱ Column에 넣어 준 후 11,000 x g에서 1분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 NucleoSpin Plant Ⅱ Column에 PW1 Buffer 400 μ를 넣고 11,000 x g에서 1분간 원심분리하고, 다시 NucleoSpin Plant Ⅱ Column에 에탄올이 첨가된 PW2 Buffer 600 μ를 넣고 11,000 x g에서 2분간 원심분리를 하였다. 원심분리가 끝난 NucleoSpin Plant Ⅱ Column은 실온에서 5분간 건조한 후 PE Buffer 50 μ를 첨가하고 11,000 x g에서 2분간 원심분리하여 게놈 DNA를 획득하였다.

추출된 게놈 DNA는 ND-2000 UV-Vis Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, USA)을 이용하여 농도와 순도를 확인 한 후 차세대염기서열분석 및 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR) 분석에 활용하였다.

실시예 3. 벼의 염기서열 분석 및 유전자 변이 탐색

국내산과 외국산 벼(쌀)의 차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS)은 HiSeq^TM 2500 (Illumina, USA) platform을 활용하였다. 차세대염기서열분석을 통해 얻어진 게놈 염기서열은 유전체 특성 분석과 유전자 변이 탐색을 위해 linux 프로그램을 활용하여 분석하였다.

FastQC 및 SolexaQA 프로그램을 이용하여 사용된 adaptor의 염기서열과 낮은 품질의(low quality) 염기서열을 제거한 후 bwa와 samtools, bedtools, GATK 프로그램 등을 이용하여 기준염기서열(reference sequence)과 비교 분석하였다. 비교 분석을 위해 사용된 기준염기서열은 Phytozome의 Oryza_sativa_204_v7.0의 게놈 염기서열을 이용하였다.

차세대염기서열분석을 통해 얻어진 염기서열 정보 중 Q-value값이 최소 20이상인 경우를 대상으로 samtools, bedtools, GATK 프로그램 등을 활용하여 벼(쌀)의 유전자변이를 탐색하여 평균 100만개 이상의 유전자변이를 확인하였다. 이중 염기서열의 중복도(depth), 국내산과 외국산 벼(쌀) 품종 구별에 용이한 단일염기다형(SNP)을 선발하였다.

실시예 4. 탐색된 유전자 변이에 대한 확인 및 유전자마커 선발

단일염기다형(SNP) 변이 중 유전자형의 빈도, 중복도 등을 종합하여 192종을 1차 선발하였다. 선발된 192종의 유전자변이를 대상으로 대용량 유전자형 분석 시스템(Fluidigm TaqMan SNP Genotyping System)을 활용하여 유전자형을 확인하였다. 대용량 유전자형 분석 시스템을 통해 얻어진 유전자형의 정확도 및 빈도(Genotype frequency) 등을 기준으로 가장 효율적으로 벼(쌀) 품종 및 원산지를 구별할 수 있는 20종의 유전자 단일염기다형(SNP) 변이를 최종 선발하였다.

실시예 5. 대립유전자 특이 PCR 프라이머 제작 및 중합효소연쇄반응(도 2, 도 3 및 도 4)

국내산과 외국산 벼(쌀) 판별을 위해 총 20개의 단일염기다형성(SNP) 마커에 대하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법을 이용하였고, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응은 하기 표 2와 같이 서열번호 1부터 42까지의 프라이머를 이용하였다.

여기서 서열번호 41와 42는 실험의 이상 유무를 확인(internal control)하기 위해 사용한 벼(쌀)의 내재 유전자(rpoC2)를 증폭하는 프라이머로, 벼(쌀)에서만 특이적으로 증폭되는 프라이머 세트를 활용하였다. 벼(쌀) 특이성에 대한 결과는 [도 4]와 같으며, 벼(쌀), 보리, 밀, 옥수수, 율무, 귀리, 메밀, 수수, 기장 과 조를 대상으로 증폭유무를 확인 한 결과 벼(쌀)에서만 특이적으로 증폭됨을 확인하였다.

[표 2]

각각의 유전자마커 분석을 위한 다중 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응은 프라이머 세트를 동시에 분석하기 위한 다중 PCR의 혼합 프라이머를 제조하였다. 각 유전자마커와 내재 유전자의 프라이머 세트 농도는 하기 표 3에 나타내었다. 다중 PCR 반응은 게놈 DNA 10 ng에 표 3에 나타낸 프라이머 세트의 농도를 동량 혼합한 혼합 프라이머(예를 들어 RM1마커 혼합 프라이머 20 μ를 조제하는 경우 RM1 마자(rpoC2)의 정방향과 역방향 프라이머를 3 pmole/μ로 조제한 후 각각 동량인 10 μ씩 혼합하여 조제) 0.8 μ와 중합효소 등이 포함된 Anti HS Taq Premix (2X) (TNT Research, Korea) 7.5 μ를 첨가한 후 멸균 증류수로 최종 15 μ가 되도록 증액하였다.

유전자의 증폭반응은 C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)를 이용하였으며, 94℃에서 5분간 변성 후 94℃ 30초, 57~60℃ 30초, 72℃ 60초 반응을 30회 반복 수행한 후 3% 아가로스젤 상에서 전기영동을 통해 확인하였다. 각 유전자마커의 유전자 증폭조건은 하기 표 3에 나타내었다. 각 유전자 마커의 다중 PCR 결과는 [도 2]와 같고 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과는 [도 3]에 나타내었다.

[표 3]

실시예 6. 다중대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)을 이용한 벼 품종 및 원산지 판별(도 5)

실험의 이상 유무를 확인(internal control)하기 위해 사용한 벼의 내재 유전자(rpoC2)를 증폭하는 프라이머 세트와 각각의 20종의 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트를 사용해 수행된 다중 PCR 결과에서 20종의 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트에서 유전자 증폭 산물이 확인되는 경우를 유전자 마커가 증폭된 것으로 판단한다.

각 벼(쌀)에서 20종의 증폭 유무를 확인하여 벼의 품종 및 원산지를 판정하며, 그 결과를 [도 5]에 나타내었으며, 20종의 유전자 마커(Rice Marker, RM)에서 각 마커 별로 증폭된 경우는 음영(■)으로 표시하였고, 증폭되지 않은 경우는 빈 영역(□)으로 표시하였다.

벼(쌀)의 품종 및 원산지 판정의 구체적인 예를 들면 다음과 같다.

(1) 간척: 유전자 마커 RM1, RM2, RM3, RM4, RM5, RM8, RM9, RM12, RM14, RM16, RM17, RM19 및 RM20에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 국내산 ‘간척’벼로 판정한다.

(2) 강백: 유전자 마커 RM1, RM2, RM4, RM5, RM7, RM9, RM10, RM13, RM17의 증폭 산물이 검출되는 경우 국내산 ‘강백’벼로 판정한다.

(3) Calhikara-201: 유전자 마커 RM2, RM3, RM4, RM6, RM7, RM9, RM15, RM17, RM20의 증폭 산물이 검출되는 경우 미국산 ‘Calhikara-201’ 벼로 판정한다.

(4) 상육397: 유전자 마커 RM1, RM2, RM3, RM4, RM5, RM6, RM11, RM15, RM17, RM18, RM20의 증폭 산물이 검출되는 경우 중국산 ‘상육397’벼로 판정하게 된다.

더욱 다양한 벼 품종 및 원산지 판정의 구체적인 예는 [도 5]에 도시하였으며 제시된 20종의 유전자 마커의 선택적인 증폭 여부에 따라 벼(쌀)의 품종 및 원산지를 판정한다.

본 발명에 의하면, 벼의 품종 및 원산지 판별을 위한 단일염기다형성(SNP) 마커, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(AS-PCR)법 및 키트를 활용하여 410 종 이상의 다양한 국내산 및 외국산 벼의 품종을 판별할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술 분야에 유용하게 적용될 수 있다.

<110> National Agricultural Products Quality Management Service(NAQS) <120> SNP primer set for cultivar and origin identification of rice, method for cultivar and origin identification of rice using the same <130> 17-10893 <160> 63 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM1 F-primer <400> 1 aagcagcctc atggaggtag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM1 R-primer <400> 2 caacttgatt tcctgctgct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM2 F-primer <400> 3 taggagatga gagttgcatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM2 R-primer <400> 4 tcctaagatg ccacatgtcg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM3 F-primer <400> 5 gcctgggatg ttgaacaagg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM3 R-primer <400> 6 tcaagtacat accgcttacc tac 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM4 F-primer 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ctgctgagac tg 212 <210> 62 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified product of RM20 <400> 62 tagaatatgg aacccttgag atgtattcta cctcctcatc tgtactagca tattgtaaag 60 ctgataattt aaaatgaggt gcaacaggag tactaacagg ctttgcatca tgcatgttga 120 aatgctgaag aaccttctta ttgttacttt gctgactaag aaatatcaaa caagaatgtc 180 ggccactagt aattttcata cttagaattt ttcttagcaa caccaagatc cttcatc 237 <210> 63 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified product of rpoC2 <400> 63 tccaaaattt ttggggctct ttcgaaattt ttcgggactc ttaggtacta ttgcacctag 60 tatatcgaat ttttcttcat cttactattt actaacgtat aatcagatcc tgtta 115

Claims (7)

1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 25 및 26의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 27 및 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 29 및 30의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 33 및 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 35 및 36의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 37 및 38의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 39 및 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트에 있어서 상기 벼 품종은,
   국내산은 간척, 강백, 건강홍미, 계화, 고아미, 고아미2, 고아미3, 고운, 고품, 골든퀸2, 골든퀸3, 광안, 그루, 금남, 금성, 금안, 금오, 금오1, 금오2, 금오3, 낙동, 남강, 남원, 남일, 남천, 남평, 내풍, 녹양, 농림나1, 농안, 농호, 다미, 다산, 다산1, 다산2, 다청, 단미, 대립1, 대보, 대산, 대야, 대진, 대찬, 대청, 대평, 도담쌀, 동보, 동안, 동진, 동진1, 동해, 둔내, 드래찬, 만금, 만나, 만미, 만안, 만월, 만종, 만추, 만풍, 만호, 말그미, 맛드림, 목우, 문장, 미광, 미면, 미품, 미향, 밀양95, 보라미, 보람찬, 보석, 봉광, 산들진미, 산호, 삼덕, 삼천, 삼평, 상미, 상산, 상옥, 상주, 새고아미, 새누리, 새상주, 새오대, 새일미, 새추청, 서간, 서농6, 서명, 서안, 서안1, 서진, 석정, 설갱, 설레미, 설백, 시계진미, 소다미, 소백, 소비, 수광, 수라, 수보, 수안, 수진, 신동진, 신백, 신보, 신운봉, 신운봉1, 신토흑미, 아름, 아세미, 안다, 안산, 안성, 안중, 양조, 영남, 영안, 영해, 영호진미, 오대, 오대1, 오래, 오륜, 오봉, 온누리, 온다미, 운광, 운두, 운미, 운봉, 운장, 원평, 원황, 월백, 인월, 일미, 일품, 장안, 적진주, 전남1, 조광, 조령, 조아미, 조안, 조운, 조은흑미, 조평, 종남, 주남, 주남조생, 주안, 주안1, 중모1003, 중모1009, 중모1020, 중산, 중생골드, 중안, 중화, 진미, 진백, 진보, 진봉, 진부, 진부올, 진상, 진상2, 진수미, 진품, 천지향1세, 청남, 청명, 청아, 청안, 청운, 청청진미, 청해진미, 청호, 추청, 친농, 친들, 칠보, 큰눈, 탐진, 태봉, 태성, 팔공, 평안, 평원, 풍미, 풍미1, 하남, 하성1, 하이아미, 한들, 한마음, 한아름, 한아름2, 해오르미, 해찬물결, 해평, 해품, 향남, 향미1, 향미2, 현품, 호농, 호반, 호안, 호진, 호평, 호품, 홍진주, 화남, 화동, 화랑, 화봉, 화삼, 화성, 화신, 화신1, 화안, 화영, 화왕, 화중, 황금, 황금노들, 황금누리, 황금보라, 효원5, 흑광, 흑남, 흑미, 흑설, 흑수정, 흑진주, 흑향, 노른자찰, 녹원찰, 눈보라, 동진찰, 백설찰, 백옥찰, 백진주1, 보석찰, 보석흑찰, 상남밭, 상주찰, 설향찰, 신농흑찰, 신명흑찰, 신선찰, 아랑향찰, 조생흑찰, 진부찰, 찰벼, 청담, 한강찰1, 해평찰, 화선찰, 황금찰, 흑선찰, 흑향찰1, 청풍흑찰, 고향찰, 눈큰흑찰, 청백찰, 청풍흑향찰, 향드림찰, 가와지찰 및 가향찰1 중에서 선택되고,
   베트남산은 Q5, Khang Dan, OM4218, Bac Huong, OM4900, OM5451, IR504 및 OM6976 중에서 선택되며,
   미국산은 Calrose(M-401), Calhikara-201, Calrose(M-205), Calrose(M-402), Calrose(S-101), Calrose(M-204), Calrose(M-206), Calrose(M-104) 및 Calrose(M-202) 중에서 선택되고,
   중국산은 상육397, 연갱25, 오우도3, 보우17, 길우518, 통육318, 통찰1, 송갱8, 공육131, 용도2, 심성4, 북풍6-7, 요성2102, 연갱23, 요갱912, 길리518, 송갱2, 용순104, 요우1052, 송갱9, 송갱3, 송갱10, 수갱4, 수갱7, 용갱19, 오우도1, 간감도7, 송갱6, 길갱94, 307(중), 복합70, 반금8, 간도10, 황해3, 간도9, 통88-7, 요성1, 9418(중), 길갱88, 송갱7, 염풍47, 연409, 화선98-8, 간감도8, 수갱6, 연갱24, 용갱13, 동농416, 용갱17, 용도6, 부토광, 용육03-1095, 용도5, 요우5218, 요우534, 연갱22, 요갱371, 수갱5, 농대18, 풍우307, 9_23(중), 설광, 용갱16, 용갱14, 동48, 체우418, 길갱91, 연인1, 용갱12, 연갱14, 용화, 길농대19, 농대19, 요갱9, 통35, 용갱18, 용육03-253, 길갱81, 품성1, 요갱294, 풍민2000, 연316, 연갱26, 장백9, 장백10, 요녕307, 목단강1, 목단강19, 싸싸니, 용도3 및 용도4 중에서 선택되며,
   일본산은 Koshihikari, Cheongmu, Dondokui, Yumetsukushi, Koshiibuki, Akitakomati, Hayenuki, Sadominori, 신의벼, Nihonbare, Miyagaori, Sasanishiki, Mineyudaka, Mazizbare, Himinori 및 Hitomebore 중에서 선택되고,
   호주산은 Doongara, Kyeema, Opus, Illabong, Amaroo, Quest, Reiziq 및 Jarrah 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 43의 20번째 염기인 단일염기다형성 구아닌(G)과 아데닌(A)을 구별하고,
   서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 44의 211번째 염기인 단일염기다형성 티민(T)과 시토신(C)을 구별하고,
   서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 45의 20번째 염기인 단일염기다형성 구아닌(G)과 시토신(C)을 구별하고,
   서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 46의 263번째 염기인 단일염기다형성 시토신(C)과 구아닌(G)을 구별하고,
   서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 47의 128번째 염기인 단일염기다형성 아데닌(A)과 구아닌(G)을 구별하고,
   서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 48의 25번째 염기인 단일염기다형성 시토신(C)과 아데닌(A)을 구별하고,
   서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 49의 20번째 염기인 단일염기다형성 시토신(C)과 아데닌(A)을 구별하고,
   서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 50의 21번째 염기인 단일염기다형성 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고,
   서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 51의 21번째 염기인 단일염기다형성 구아닌(G)과 아데닌(A)을 구별하고,
   서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 52의 20번째 염기인 단일염기다형성 티민(T)과 시토신(C)을 구별하고,
   서열번호 21 및 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 53의 22번째 염기인 단일염기다형성 티민(T)과 구아닌(G)을 구별하고,
   서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 54의 20번째 염기인 단일염기다형성 티민(T)과 아데닌(A)을 구별하고,
   서열번호 25 및 26의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 55의 21번째 염기인 단일염기다형성 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고,
   서열번호 27 및 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 56의 23번째 염기인 단일염기다형성 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고,
   서열번호 29 및 30의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 57의 19번째 염기인 단일염기다형성 구아닌(G)과 아데닌(A)을 구별하고,
   서열번호 31 및 32의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 58의 20번째 염기인 단일염기다형성 티민(T)과 아데닌(A)을 구별하고,
   서열번호 33 및 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 59의 236번째 염기인 단일염기다형성 구아닌(G)과 시토신(C)을 구별하고,
   서열번호 35 및 36의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 60의 20번째 염기인 단일염기다형성 아데닌(A)과 구아닌(G)을 구별하고,
   서열번호 37 및 38의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 61의 25번째 염기인 단일염기다형성 시토신(C)과 티민(T)을 구별하고,
   서열번호 39 및 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍은 서열번호 62의 20번째 염기인 단일염기다형성 구아닌(G)과 시토신(C)을 구별하는 것을 특징으로 하는 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 서열번호 41 및 42의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 더 포함하되,
   상기 서열번호 41 및 42로 이루어지는 프라이머 쌍은 RNA 폴리머라아제 베타 사슬(RNA polymerase beta chain) 내재 유전자(rpoC2)를 구별하는 것을 특징으로 하는, 벼 품종 및 원산지 판별용 프라이머 세트.
5. a) 벼 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
   b) 상기 a)단계에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
   c) 상기 b)의 단계에 의해 생성된 증폭산물을 분리 및 분석하여 벼의 품종 및 원산지를 판별하는 단계를 포함하는 벼 품종 및 원산지를 판별하는 방법에 있어서 상기 벼 품종은,
   국내산은 간척, 강백, 건강홍미, 계화, 고아미, 고아미2, 고아미3, 고운, 고품, 골든퀸2, 골든퀸3, 광안, 그루, 금남, 금성, 금안, 금오, 금오1, 금오2, 금오3, 낙동, 남강, 남원, 남일, 남천, 남평, 내풍, 녹양, 농림나1, 농안, 농호, 다미, 다산, 다산1, 다산2, 다청, 단미, 대립1, 대보, 대산, 대야, 대진, 대찬, 대청, 대평, 도담쌀, 동보, 동안, 동진, 동진1, 동해, 둔내, 드래찬, 만금, 만나, 만미, 만안, 만월, 만종, 만추, 만풍, 만호, 말그미, 맛드림, 목우, 문장, 미광, 미면, 미품, 미향, 밀양95, 보라미, 보람찬, 보석, 봉광, 산들진미, 산호, 삼덕, 삼천, 삼평, 상미, 상산, 상옥, 상주, 새고아미, 새누리, 새상주, 새오대, 새일미, 새추청, 서간, 서농6, 서명, 서안, 서안1, 서진, 석정, 설갱, 설레미, 설백, 시계진미, 소다미, 소백, 소비, 수광, 수라, 수보, 수안, 수진, 신동진, 신백, 신보, 신운봉, 신운봉1, 신토흑미, 아름, 아세미, 안다, 안산, 안성, 안중, 양조, 영남, 영안, 영해, 영호진미, 오대, 오대1, 오래, 오륜, 오봉, 온누리, 온다미, 운광, 운두, 운미, 운봉, 운장, 원평, 원황, 월백, 인월, 일미, 일품, 장안, 적진주, 전남1, 조광, 조령, 조아미, 조안, 조운, 조은흑미, 조평, 종남, 주남, 주남조생, 주안, 주안1, 중모1003, 중모1009, 중모1020, 중산, 중생골드, 중안, 중화, 진미, 진백, 진보, 진봉, 진부, 진부올, 진상, 진상2, 진수미, 진품, 천지향1세, 청남, 청명, 청아, 청안, 청운, 청청진미, 청해진미, 청호, 추청, 친농, 친들, 칠보, 큰눈, 탐진, 태봉, 태성, 팔공, 평안, 평원, 풍미, 풍미1, 하남, 하성1, 하이아미, 한들, 한마음, 한아름, 한아름2, 해오르미, 해찬물결, 해평, 해품, 향남, 향미1, 향미2, 현품, 호농, 호반, 호안, 호진, 호평, 호품, 홍진주, 화남, 화동, 화랑, 화봉, 화삼, 화성, 화신, 화신1, 화안, 화영, 화왕, 화중, 황금, 황금노들, 황금누리, 황금보라, 효원5, 흑광, 흑남, 흑미, 흑설, 흑수정, 흑진주, 흑향, 노른자찰, 녹원찰, 눈보라, 동진찰, 백설찰, 백옥찰, 백진주1, 보석찰, 보석흑찰, 상남밭, 상주찰, 설향찰, 신농흑찰, 신명흑찰, 신선찰, 아랑향찰, 조생흑찰, 진부찰, 찰벼, 청담, 한강찰1, 해평찰, 화선찰, 황금찰, 흑선찰, 흑향찰1, 청풍흑찰, 고향찰, 눈큰흑찰, 청백찰, 청풍흑향찰, 향드림찰, 가와지찰 및 가향찰1 중에서 선택되고,
   베트남산은 Q5, Khang Dan, OM4218, Bac Huong, OM4900, OM5451, IR504 및 OM6976 중에서 선택되며,
   미국산은 Calrose(M-401), Calhikara-201, Calrose(M-205), Calrose(M-402), Calrose(S-101), Calrose(M-204), Calrose(M-206), Calrose(M-104) 및 Calrose(M-202) 중에서 선택되고,
   중국산은 상육397, 연갱25, 오우도3, 보우17, 길우518, 통육318, 통찰1, 송갱8, 공육131, 용도2, 심성4, 북풍6-7, 요성2102, 연갱23, 요갱912, 길리518, 송갱2, 용순104, 요우1052, 송갱9, 송갱3, 송갱10, 수갱4, 수갱7, 용갱19, 오우도1, 간감도7, 송갱6, 길갱94, 307(중), 복합70, 반금8, 간도10, 황해3, 간도9, 통88-7, 요성1, 9418(중), 길갱88, 송갱7, 염풍47, 연409, 화선98-8, 간감도8, 수갱6, 연갱24, 용갱13, 동농416, 용갱17, 용도6, 부토광, 용육03-1095, 용도5, 요우5218, 요우534, 연갱22, 요갱371, 수갱5, 농대18, 풍우307, 9_23(중), 설광, 용갱16, 용갱14, 동48, 체우418, 길갱91, 연인1, 용갱12, 연갱14, 용화, 길농대19, 농대19, 요갱9, 통35, 용갱18, 용육03-253, 길갱81, 품성1, 요갱294, 풍민2000, 연316, 연갱26, 장백9, 장백10, 요녕307, 목단강1, 목단강19, 싸싸니, 용도3 및 용도4 중에서 선택되며,
   일본산은 Koshihikari, Cheongmu, Dondokui, Yumetsukushi, Koshiibuki, Akitakomati, Hayenuki, Sadominori, 신의벼, Nihonbare, Miyagaori, Sasanishiki, Mineyudaka, Mazizbare, Himinori 및 Hitomebore 중에서 선택되고,
   호주산은 Doongara, Kyeema, Opus, Illabong, Amaroo, Quest, Reiziq 및 Jarrah 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벼 품종 및 원산지를 판별하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 증폭산물을 분리 및 분석하여 벼의 품종 및 원산지를 판별하는 단계는, 얻어진 증폭산물을 상기 벼 품종의 증폭 결과와 비교함으로써 수행되는 것인, 벼 품종 및 원산지를 판별하는 방법.
7. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종 및 원산지 판별용 키트에 있어서 상기 벼 품종은,
   국내산은 간척, 강백, 건강홍미, 계화, 고아미, 고아미2, 고아미3, 고운, 고품, 골든퀸2, 골든퀸3, 광안, 그루, 금남, 금성, 금안, 금오, 금오1, 금오2, 금오3, 낙동, 남강, 남원, 남일, 남천, 남평, 내풍, 녹양, 농림나1, 농안, 농호, 다미, 다산, 다산1, 다산2, 다청, 단미, 대립1, 대보, 대산, 대야, 대진, 대찬, 대청, 대평, 도담쌀, 동보, 동안, 동진, 동진1, 동해, 둔내, 드래찬, 만금, 만나, 만미, 만안, 만월, 만종, 만추, 만풍, 만호, 말그미, 맛드림, 목우, 문장, 미광, 미면, 미품, 미향, 밀양95, 보라미, 보람찬, 보석, 봉광, 산들진미, 산호, 삼덕, 삼천, 삼평, 상미, 상산, 상옥, 상주, 새고아미, 새누리, 새상주, 새오대, 새일미, 새추청, 서간, 서농6, 서명, 서안, 서안1, 서진, 석정, 설갱, 설레미, 설백, 시계진미, 소다미, 소백, 소비, 수광, 수라, 수보, 수안, 수진, 신동진, 신백, 신보, 신운봉, 신운봉1, 신토흑미, 아름, 아세미, 안다, 안산, 안성, 안중, 양조, 영남, 영안, 영해, 영호진미, 오대, 오대1, 오래, 오륜, 오봉, 온누리, 온다미, 운광, 운두, 운미, 운봉, 운장, 원평, 원황, 월백, 인월, 일미, 일품, 장안, 적진주, 전남1, 조광, 조령, 조아미, 조안, 조운, 조은흑미, 조평, 종남, 주남, 주남조생, 주안, 주안1, 중모1003, 중모1009, 중모1020, 중산, 중생골드, 중안, 중화, 진미, 진백, 진보, 진봉, 진부, 진부올, 진상, 진상2, 진수미, 진품, 천지향1세, 청남, 청명, 청아, 청안, 청운, 청청진미, 청해진미, 청호, 추청, 친농, 친들, 칠보, 큰눈, 탐진, 태봉, 태성, 팔공, 평안, 평원, 풍미, 풍미1, 하남, 하성1, 하이아미, 한들, 한마음, 한아름, 한아름2, 해오르미, 해찬물결, 해평, 해품, 향남, 향미1, 향미2, 현품, 호농, 호반, 호안, 호진, 호평, 호품, 홍진주, 화남, 화동, 화랑, 화봉, 화삼, 화성, 화신, 화신1, 화안, 화영, 화왕, 화중, 황금, 황금노들, 황금누리, 황금보라, 효원5, 흑광, 흑남, 흑미, 흑설, 흑수정, 흑진주, 흑향, 노른자찰, 녹원찰, 눈보라, 동진찰, 백설찰, 백옥찰, 백진주1, 보석찰, 보석흑찰, 상남밭, 상주찰, 설향찰, 신농흑찰, 신명흑찰, 신선찰, 아랑향찰, 조생흑찰, 진부찰, 찰벼, 청담, 한강찰1, 해평찰, 화선찰, 황금찰, 흑선찰, 흑향찰1, 청풍흑찰, 고향찰, 눈큰흑찰, 청백찰, 청풍흑향찰, 향드림찰, 가와지찰 및 가향찰1 중에서 선택되고,
   베트남산은 Q5, Khang Dan, OM4218, Bac Huong, OM4900, OM5451, IR504 및 OM6976 중에서 선택되며,
   미국산은 Calrose(M-401), Calhikara-201, Calrose(M-205), Calrose(M-402), Calrose(S-101), Calrose(M-204), Calrose(M-206), Calrose(M-104) 및 Calrose(M-202) 중에서 선택되고,
   중국산은 상육397, 연갱25, 오우도3, 보우17, 길우518, 통육318, 통찰1, 송갱8, 공육131, 용도2, 심성4, 북풍6-7, 요성2102, 연갱23, 요갱912, 길리518, 송갱2, 용순104, 요우1052, 송갱9, 송갱3, 송갱10, 수갱4, 수갱7, 용갱19, 오우도1, 간감도7, 송갱6, 길갱94, 307(중), 복합70, 반금8, 간도10, 황해3, 간도9, 통88-7, 요성1, 9418(중), 길갱88, 송갱7, 염풍47, 연409, 화선98-8, 간감도8, 수갱6, 연갱24, 용갱13, 동농416, 용갱17, 용도6, 부토광, 용육03-1095, 용도5, 요우5218, 요우534, 연갱22, 요갱371, 수갱5, 농대18, 풍우307, 9_23(중), 설광, 용갱16, 용갱14, 동48, 체우418, 길갱91, 연인1, 용갱12, 연갱14, 용화, 길농대19, 농대19, 요갱9, 통35, 용갱18, 용육03-253, 길갱81, 품성1, 요갱294, 풍민2000, 연316, 연갱26, 장백9, 장백10, 요녕307, 목단강1, 목단강19, 싸싸니, 용도3 및 용도4 중에서 선택되며,
   일본산은 Koshihikari, Cheongmu, Dondokui, Yumetsukushi, Koshiibuki, Akitakomati, Hayenuki, Sadominori, 신의벼, Nihonbare, Miyagaori, Sasanishiki, Mineyudaka, Mazizbare, Himinori 및 Hitomebore 중에서 선택되고,
   호주산은 Doongara, Kyeema, Opus, Illabong, Amaroo, Quest, Reiziq 및 Jarrah 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벼 품종 및 원산지 판별용 키트.

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