KR20090035312A - 벼 품종 식별용 프라이머 조합 및 이를 이용한 식별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 벼 품종 식별용 10쌍의 프라이머 조합 및 이를 이용한 벼 품종 식별 방법에 관한 것으로, 단일 PCR 반응물에 10쌍의 프라이머를 동시에 사용하여 벼 품종 특이적인 SNP를 각 프라이머 쌍에 대한 PCR 증폭 여부로 확인함으로써 벼 품종을 특이적이고, 신속, 정확하게 식별할 수 있다.
벼, 품종 식별, 프라이머
Description
본 발명은 벼 품종 식별용 프라이머 조합 및 이를 이용한 식별 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 30종의 벼(또는 쌀) 품종을 신속, 정확하게 식별할 수 있는 10쌍의 프라이머 조합 및 상기 프라이머 조합을 이용한 벼 품종 특이적인 PCR 증폭 특징을 자동 유전자 분석기(automatic genetic analyzer)로 분석함으로써, 각 벼 품종에 특이적인 SNP 특징에 따라 벼 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다.
벼는 화본(Gramineae)과 벼속(genus Oryza) 식물로서, 국제 미작연구소(IRRI, Int'l Rice Research Institute)에 의하면 60,000여종이 있는 것으로 알려져 있다. 2004년 농림부의 보고에 따르면, 국내에는 정부에서 공급한 113개 품종과 195개 육종 품종이 있다. 재배벼에는 아시아벼(O. sativa)와 아프리카벼(O. glaberrima)의 두 종이 있으며, 이중에 아시아벼(O. sativa)가 세계적으로 더 널리 경작되고 있다.
벼는, 최근 10여개국이 참여하는 국제 벼 게놈 염기해석 프로젝트(IRGSP: International Rice Genome Sequencing Project)를 통하여 니폰바레(Nipponbare) 품종에 대한 게놈 염기서열 분석이 이루어지고 있으며(Japan, America, China, France, India, Taiwan, Korea, Brazil, Thailand and England), 2002년도를 기준으로 니폰바레 게놈의 약 4억여 개의 염기서열 중 92％의 염기서열이 밝혀진 상태이다.
한편, 우리나라에서는 쌀시장 개방에 대한 '도하 개발 아젠다'에 앞서, 고품질의 쌀 생산을 장려하기 위하여 2004년도부터 정부가 정부 품종제한 수매제를 시행하여, 지역별 3개의 품종을 선정하여 28개 품종에 대한 수매를 실시하고 있으며, 또한, 벼의 품종에 대한 정보를 포장지에 표시하도록 하는 포장양곡 표시제를 2004년도 1월부터 실시하여, 브랜드쌀 평가제의 실시를 통하여 농림부는 쌀의 고품질화와 유통질서 확립을 추진하고 있다.(Announcement of MAF: Law of rice management Subsection 1 of Article 20). 이러한 제도는 쌀의 품질에 대한 알권리 충족을 위한 것이며, 생산과 소비, 투명한 유통과정의 확립을 목적으로 하고 있다.
따라서, 벼의 품종을 식별하는 기술에 대한 관심이 집중되고 있으며, 최근들어 여러가지 DNA 마커를 이용하여 벼 품종을 식별하기 위한 많은 연구들이 진행되었다. 그중에서도, RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism)와 마이크로세틀라이트(microsatellite)가 품종 식별에 사용되고 있다. 예로, Wang 등의 RFLP(restricted fragment length polymorphism) 마커를 이용한 품종을 식별 방법(Wang, Z.Y., Tanksley, S.D. 1989 L. Genome. 32, 1113-1118), Ryu의 단백질 모세관 전기영동 방법을 이용한 품종 식별 방법(Ryu, D.J. 1998 J. food science and nutrition. 3, 43-347), 6개의 마이크로세틀라이트 마커를 이용한 유전자 지도에서의 위치 확인으로 자포니카 벼 51개 품종의 식별 방법(Ji, H.S. et al., 1998 Korean J. Breed. 30, 350-360)이 보고되었으며, RAPD, 마이크로세틀라이트, STS(sequence tagged site), 및 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 이용한 국내산 40개의 품종 식별 방법과 각 방법의 장단점이 비교되기도 하였다(Jeong O.Y. et al., Korean 1998 J. Breed. 30, 136-137). 아울러, RAPD와 마이크로세틀라이트를 이용한 31개 벼 품종의 식별 방법(Kwon, S.J. et al., 1999 Korean J Crop Science 44, 112-116), 화상분석기술을 이용한 벼 품종의 식별 방법Kwon, S.J. et al., 1998 Korean J Crop Science 43, 33-34)들도 보고되었다. 그러나 이러한 식별 방법들과 이미지 기술은 특이적인 단일 밴드를 형성할 수 없으므로, 혼합된 품종들로부터 각각의 품종을 식별하기가 어렵고, 분석 결과를 논의하기가 어려운 단점이 있다.
또한, 국내 출원번호 제2005-69858호에서도 프라이머를 이용한 PCR 방법에 의한 벼 품종 식별방법이 개시되어 있으며, 이는 현재 국내 표준검사법으로 고시되어 있다. 그러나, 상기한 방법은 1개의 벼 시료를 검사하였을 경우, 무작위적으로 선별된 24립의 벼(또는 쌀)로부터 각각 추출된 24개의 DNA를 주형으로 하여 9가지의 SNP 분석용 프라이머로 쌀 내재유전자를 포함하여, 총 240번 이상의 PCR 반응을 수행하여야 한다. 아울러, PCR 종료 후, 240개의 PCR 산물에 대하여 27 웰 아가로 스 젤 10장의 전기영동이 요구된다. 또한, 이러한 과정은 1인의 검사원이 3일간 수행해야 하는 노동력 집약적이며, 결과를 얻기까지 장기간이 소요되는 문제가 있다.
따라서, 하나의 PCR 반응물에서 각각의 벼 품종에 특이적인 다수종의 식별 마커를 동시에 신속 정확하게 분석하여, 자동화된 방식으로 그 결과를 산출할 수 있는 보다 효율적인 방법이 필요한 실정이다.
본 발명은 벼 품종 식별용 프라이머 조합을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 벼의 품종을 신속, 간단하게 식별할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 복수개의 프라이머 쌍을 하나의 PCR 반응물에 동시에 사용하여 각각의 프라이머 쌍을 사용하였을때와 동일한 결과를 얻을 수 있도록 고안된 벼 품종 식별용 프라이머 조합을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 벼 품종에 특이적인 2 이상의 SNP를 복수개의 프라이머 세트로 하나의 PCR 반응물에서 증폭시키고, 이를 자동화된 양상으로 벼 품종 특이적인 PCR 증폭 여부를 신속, 간단하게 확인할 수 있는 벼의 품종을 식별할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 벼 품종 식별용 프라이머 조합 및 이를 이용한 식별 방법은 기존의 벼 품종을 식별하기 위해 각 마커별로 실시하여야 하는 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정 이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다. 따라서, 현재 정부 품종제한 수매제, 포장양곡 표시제, 브랜드쌀 평가제 등의 다양한 정책을 과학적으로 뒷받침해 줄 수 있으며, 유통중인 쌀의 원산지 관리를 위한 품종 식별에도 유용하게 이용될 수 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 내지 서열번호 20으로 기재한 염기 서열을 포함하는 9쌍의 프라이머 세트를 포함하는 벼 품종 식별용 프라이머 조합을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벼 품종 식별용 프라이머 조합을 이용하여 벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 PCR을 실시하는 단계; 자동 유전자 분석기(Automatic Genetic Analyzer)로 상기 PCR 증폭 산물에 표지된 형광물질을 감지하여, 형광물질이 감지되는 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계; 및 상기 단계에서 확인한 PCR 산물의 크기에 따라 벼의 품종을 식별하는 단계를 포함하는, 벼 품종 식별용 프라이머 조합을 이용한 벼 품종 식별 방법을 제공한다.
상기 벼의 품종을 식별하는 단계는 하기 식별 기준에 따라 수행된다:
(1) 남평: 284 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(2) 대안: 205 bp, 284 bp, 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(3) 동안: 284 bp, 346 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(4) 동진1: 205 bp, 346 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(5) 상미: 473 bp, 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(6) 새계화: 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(7) 새추청: 284 bp, 473 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(8) 수라: 284 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(9) 신동진: 205 bp, 473 bp, 484 bp, 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(10) 오대: 177bp, 484 bp 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(11) 일미: 284 bp, 346 bp, 473 bp, 484 bp, 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(12) 일품: 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(13) 주남: 205 bp, 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(14) 중화: 177 bp, 284 bp, 473 bp 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(15) 추청: 284 bp, 473 bp 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(16) 화봉: 284 bp, 346 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(17) 화성: 484 bp, 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(18) 화영: 205 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(19) 대진: 284 bp, 346 bp, 473 bp 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(20) 동진: 205 bp, 284 bp, 484 bp, 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(21) 삼천: 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(22) 운두: 177 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(23) 태봉: 177 bp, 284 bp, 및 473 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(24) 화동: 473 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(25) 문장: 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(26) 고시히까리: 177 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(27) 히토메보레: 177 bp, 473 bp, 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(28) 삼광: 205 bp, 284 bp, 473 bp, 및 484 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(29) 새상주: 177 bp, 284 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;
(30) 운광: 205 bp, 346 bp, 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 하나의 SNP만을 검출할 수 있는 현재 국내 검사법은 시간, 비용, 노동력 측면에서 비효율적임을 인식하여, 다수종의 SNP를 한꺼번에 검출할 수 있는 프라이머 쌍의 조합, PCR 조건 및 PCR 증폭 결과를 확인하는 방법에 대해 연구하던 중, 서로다른 SNP를 타겟으로 하더라도 하나의 PCR 반응물에서 그 각각의 고유 PCR 증폭을 효율적으로 수행할 수 있는 프라이머 쌍의 조합, 상기 프라이머 쌍의 조합이 동시에 작용할 수 있는 PCR 조건 및 PCR 증폭 결과를 한꺼번에 파악할 수 있는 방법을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 30종의 벼(또는 쌀)를 신속, 정확하게 식별할 수 있는 10쌍의 프라이머 조합을 이용한 다중 PCR을 실시하고, 이를 자동 유전자 분석기(automatic genetic analyzer)로 PCR 산물의 크기를 분석함으로써, 각 벼 품종에 특이적인 SNP 특징에 따른 PCR 증폭 여부를 기준으로 벼 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다.
이에, 본 발명은 하기 표 1에 나타낸 10쌍의 프라이머 조합을 제공한다.
(표 1)
| 번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | 형광 표지 | PCR 산물 크기(bp) | 서열번호 |
| 1 | CCS-F | CAA CGC AAC GTC TTG TAT GG | FAM | 120 | 1 |
| CCS-R | TGA ACC CTG AGT TCC TCT CG | 2 | |||
| 2 | DK2394-F | ATA GAT CTT TGT AAC TCA GAA ACA CA | FAM | 177 | 3 |
| DK2394-R | AAA TGC TCA ACA AGT GCT TGG | 4 | |||
| 3 | DK560-F | CAA TGG AAT CCC GCC C | FAM | 193 | 5 |
| DK560-R | ATT AGG CTG CAT ACA TTA GTC ATC C | 6 | |||
| 4 | DK50-F | TTC AAT TCT TAC GAA CAC AAC G | FAM | 205 | 7 |
| DK50-R | AAC ACC TGT CAA ACA TCT GAT TTA | 8 | |||
| 5 | DK2401-F | CGC TGA ACT AAA CAC AAC CTA TCT A | FAM | 284 | 9 |
| DK2401-R | CCA ATT CCT GCG TTT TTC C | 10 | |||
| 6 | DK2171-F | AAA AGT GGA TGG CAC ATT GG | FAM | 298 | 11 |
| DK2171-R | ATA TTG ATT CCT TCA CTA CAT AC | 12 | |||
| 7 | DK1412-F | ATC CGG GGG AGG GAC GAG G | FAM | 346 | 13 |
| DK1412-R | TAA TAG TTG GAG AGT CGA GAT ATA CG | 14 | |||
| 8 | DK63-F | AAT GAG TGT GGC AGT GTG GAT T | FAM | 368 | 15 |
| DK63-R | ATG AGA CGA GAA GAC GAC CAG G | 16 | |||
| 9 | DK17-1-F | AGG TAG TCC CTT ATT TTT CCC TAT CC | FAM | 473 | 17 |
| DK17-1-R | AGA AGT CTT GGT CCT AAG ATA TGT GCT | 18 | |||
| 10 | DK34-F | ATG TCA TGT GGC TTG TCT GG | FAM | 484 | 19 |
| DK34-R | GCT GCC TAT CCA AGA GAA CG | 20 |
표 1의 프라이머들은 서열번호 1 내지 20으로 염기 서열을 기재하였다. 상 기 표 1에서, 마커 명칭은 임의로 설정한 것이다.
상기 본 발명에 따른 벼 품종 식별용 마커에 따른 각 프라이머(또는 프로브)는 하나의 대립유전자(the specific allele)와 완전하게 일치하고, 비 특이 대립유전자와는 3' 말단 염기가 일치하지 않는다. 일치하지 않는 3' 말단이 완전하게 일치하는 말단보다 매우 낮은 효율로 Tag 중합효소에 의해 신장되기 때문에 대립유전자 특이 프라이머는 특이 대립유전자를 선택적으로 증폭한다. 이러한 벼 품종 식별용 마커를 이용하여 PCR로 증폭된 산물의 유무는 벼 품종 식별용 마커에 따른 검출가능하게 표지된 프로브를 이용하여 쉽게 분석할 수 있다.
본 발명에 따른 9쌍의 프라이머 조합은 하나의 PCR 반응물에서, 즉 동일한 PCR 조건하에서 각 프라이머쌍을 별도의 PCR 반응물에서 PCR할 경우와 동일하게, 균일한 PCR 증폭 결과를 형성할 수 있도록 특별히 고안된 것이며, 각각의 프라이머 쌍은 서로 다른 크기로 PCR 산물을 증폭하도록 고안된 것이다. 따라서, 증폭된 PCR 산물 크기를 확인함으로써 증폭에 작용한 프라이머 쌍을 쉽게 알 수 있으며, 상기 프라이머가 타겟으로 하는 벼 품종 특이적인 SNP 부분을 파악하여, 벼 품종을 용이하게 식별할 수 있다.
본 발명에 따른 9쌍의 프라이머 조합의 특징은 구체적으로 다음과 같다.
DK2394: 7번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP003866 클론
DK560: 12번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 BX000560 클론
DK50: 11번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AC145367 클론
DK2401: 7번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP004010 클론
DK1412: 7번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP005198 클론
DK63: 3번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AC135495 클론
DK17-1: 8번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP003886 클론
DK34: 1번 염색체상에 존재하며, 염기서열 분석을 위하여 사용된 부위의 위치는 AP003209 클론
아울러, 본 발명의 벼 품종 식별 방법의 양성 대조군으로, 벼 내재 유전자, 예컨대 내재 유전자로서 벼에 존재하는 곡물중심체 염기서열(Cereal Centromeric Sequence)과 유사한 CCS1으로 AB013614 클론 위치에 존재하는 게놈 DNA를 이용할 수 있다. 상기 CCS1에 특이적인 프라이머 쌍은 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 따른 10쌍의 프라이머 조합은, PCR 증폭 산물의 크기를 자동화된 자동 유전자 분석기로 분석하기 위해, 검출가능한 수단으로 표지될 수 있다. 검출가능한 수단은 각 프라이머 쌍에 따라 동일한 또는 서로 다른 종류로 사용할 수 있 으며, 바람직하기로는 동일한 종류의 검출가능한 수단을 사용할 수 있다. 또한, 검출가능한 수단은 각 프라이머쌍의 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 또는 정방향 및 역방향 프라이머에 연결, 결합, 부착될 수 있으며, 프라이머의 5'말단, 3'말단 또는 PCR 증폭중에 PCR 산물에 삽입(interchelation)될 수 있다.
상기 검출가능한 수단은 프라이머에 표지, 예컨대 연결, 결합, 또는 부착시키거나, 또는 PCR 산물에 삽입시켜, 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광물질, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 형광물질이 가장 바람직하다. 형광물질은 현재 시중에 다수 종이 시판되고 FAM, SYBR Green, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED있으므로, 용이하게 입수 가능하다. 형광물질의 예로는, 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광물질은 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 10쌍의 프라이머들은 각각 벼 품종에 따라 특이적인 PCR 증폭 결과를 보인다. 따라서, 10쌍의 프라이머 조합으로 10-plex PCR을 실시한 후, 특이적인 PCR 결과를 토대로 품종을 식별한다. 본 발명에서 사용하는 PCR 증폭 산물의 분석 방법은 PCR 증폭 산물에 표지된 검출가능한 수단, 예컨대 형광물질을 레이저 감광으로 검출함으로써, 검출된 형광 물질이 표지되어 있는 PCR 산물 크기를 확인하는 방법으로, 그 예로 자동 유전자 분석기를 사용할 수 있다. 상기 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물에 표지된 형광물질을 감지하여 PCR 증폭 여부 및 산물 크기를 도 1과 같은 피크로 구현한다. 즉, 전기영동과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동적으로 결과를 분석할 수 있다. 구체적인 방법 및 원리는 당업자라면 이해 또는 인지할 수 있을 것이다.
본 발명에 사용가능한 자동 유전자 분석기(Automatic Genetic Analyzer)는 AB 사의 377, 3100, 3130 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벼 품종 식별용 프라이머 조합 및 이를 이용한 식별 방법을 통해, 수종의 벼 품종을 식별할 수 있으며, 특히 남평, 대안, 동안, 동진1, 상미, 새계화, 새추청, 수라, 신동진, 오대, 일미, 일품, 주남, 중화, 추청, 화봉, 화성, 화영, 대진, 동진, 삼천, 운두, 태봉, 화봉, 문장, 고시히까리, 히토메보레, 삼광, 새상주 및 운광 등의 총 30종의 벼 품종을 각각 식별할 수 있다.
구체적인 식별 방법은 다음과 같다(표 2 참조).
(1) 남평: 프라이머 쌍 DK2401, DK17-1, DK34, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 남평벼로 판정한다.
(2) 대안: 프라이머 쌍 DK50, DK2401, DK17-1, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 대안벼로 판정한다.
(3) 동안: 프라이머 쌍 DK2401, DK1412, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 동안벼로 판정한다.
(4) 동진1: 프라이머 쌍 DK50, DK1412, DK17-1, DK34, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 동진1벼로 판정한다.
(5) 상미: 프라이머 쌍 DK17-1, DK63, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 상미벼로 판정한다.
(6) 새계화: 프라이머 쌍 DK34, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 새계화벼로 판정한다.
(7) 새추청: 프라이머 쌍 DK2401 및 DK17-1에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 새추청벼로 판정한다.
(8) 수라: 프라이머 쌍 DK2401, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 수라벼로 판정한다.
(9) 신동진: 프라이머 쌍 DK50, DK17-1, DK34, DK63, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 신동진벼로 판정한다.
(10) 오대: 프라이머 쌍 DK2394, DK34 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 오대벼로 판정한다.
(11) 일미: 프라이머 쌍 DK2401, DK1412, DK17-1, DK34, DK560, 및 DK2171에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 일미벼로 판정한다.
(12) 일품: 프라이머 쌍 DK63, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 일품벼로 판정한다.
(13) 주남: 프라이머 쌍 DK50, DK17-1, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 동안벼로 판정한다.
(14) 중화: 프라이머 쌍 DK2394, DK2401, DK17-1, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 중화벼로 판정한다.
(15) 추청: 프라이머 쌍 DK2401, DK17-1 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 추청벼로 판정한다.
(16) 화봉: 프라이머 쌍 DK2401, DK1412, DK17-1, DK34, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 화봉벼로 판정한다.
(17) 화성: 프라이머 쌍 DK34, DK63, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 화성벼로 판정한다.
(18) 화영: 프라이머 쌍 DK50, DK17-1, DK34, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 화영벼로 판정한다.
(19) 대진: 프라이머 쌍 DK2401, DK1412, DK17-1 및 DK2171에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 대진벼로 판정한다.
(20) 동진: 프라이머 쌍 DK50, DK2401, DK34, DK560, 및 DK2171에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 동진벼로 판정한다.
(21) 삼천: 프라이머 쌍 DK17-1, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 삼천벼로 판정한다.
(22) 운두: 프라이머 쌍 DK2394, DK17-1, DK34, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 운두벼로 판정한다.
(23) 태봉: 프라이머 쌍 DK2394, DK2401, 및 DK17-1에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 태봉벼로 판정한다.
(24) 화동: 프라이머 쌍 DK17-1, 및 DK2171에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 화봉벼로 판정한다.
(25) 문장: 프라이머 쌍 DK560, 및 DK2171에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 문장벼로 판정한다.
(26) 고시히까리: 프라이머 쌍 DK2394, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 고시히까리벼로 판정한다.
(27) 히토메보레: 프라이머 쌍 DK2394, DK17-1, DK560, 및 DK2171에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 히토메보레벼로 판정한다.
(28) 삼광: 프라이머 쌍 DK50, DK2401, DK17-1, 및 DK34에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 삼광벼로 판정한다.
(29) 새상주: 프라이머 쌍 DK2394, DK2401, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 새상주벼로 판정한다.
(30) 운광: 프라이머 쌍 DK50, DK1412, DK17-1, 및 DK560에 의한 PCR 증폭 산물이 검출되는 경우 운광벼로 판정한다.
(표 2)
상기한 본 발명의 벼 품종 식별용 10쌍의 프라이머 조합을 동시에 사용함으로써, 기존의 벼 품종을 식별하기 위해 각 마커별로 실시하여야 하는 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 자동화된 방식으로 신속하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
1: 벼 품종 식별용
복수개의
마커
세트를 이용한 다중 실시간
PCR
1-1. 주형 DNA 추출
특허 출원 제2005-69858호의 방법에 따라, 시료 벼로부터 DNA를 추출하였다. 간략하게는, 식물에서 DNA를 추출할 때 일반적으로 사용되는 CTAB 방법을 변형하여 본 발명에 사용하였다.
시료의 오염을 방지하기 위해, 기름종이에 올려놓고 쌀 시료를 망치를 이용하여 아주 작은 조각으로 분쇄한다. 분쇄한 시료(약 30 ㎎)를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고, CTBA 용액 500 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후, 65℃ 항온 수조에 30분간 담가 둔다. CTAB 용액의 조성은 다음과 같다: DNA 추출 완충액(Sorbitol 63.75 g, Tris-base 12.1 g, EDTA-Na2 1.68 g/1 )와 핵 융해 완충액(CTAB 20 g, 1M Tris(pH 8.0) 200 ㎖, 0.25M EDTA 200 ㎖, 5M NaCl 400 ㎖/1 )를 1:1로 섞고, 0.2 부피 10％ 사르코실, 0.2 부피 식염수, 1％ 2-머르캅토에탄올을 65℃ 항온 수조에서 혼합한다. 14,240×g(15,000rpm)에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액에 3.8 g/ℓ 소디움 바이설파이트 1 부피와 페놀: 클로로포름: 이소아밀알콜(25:24:1) 1 부피를 섞어서 상온에서 5분 동안 방치한 후, 14,240×g에서 5분 동안 원심분리 한다. 상등액을 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고 클로로포름: 이소아밀알콜(24:1) 1 부피를 섞어서 상온에서 5분 동안 회전시켜 섞어준다. 14,240×g에서 5분 동안 원심분리를 하여, 상등액을 1.5 ㎖ 튜브로 옮긴다. 상기의 절차를 경계면이 투명해질 때까지 반복한다. 동량의 이소프로판올을 넣고 5분 동안 잘 섞어주고, -20℃에 20분간 넣어두었다가 4 에서 15분 동안 원심분리를 실시한다. 상등액을 버리고 DNA 펠렛을 70％ 에탄올 200 ㎕를 넣어서 4℃에서 5분 동안 원심분리를 실시한다. 상등액을 버리고 남은 에탄올을 바람이나 진공 건조기로 건조시킨다. 여기에 멸균 증류수 65 ㎕와 RNase A(1 ㎎/㎖) 15 ㎕를 넣어 37℃ 수조에 15분 동안 넣어둔다.
1-2. 10-plex PCR 반응
50 ng 주형 DNA, 5 내지 20 pmole 10쌍의 프라이머 조합 혼합물 2 ㎕, 5X PCR 반응 완충액 4 ㎕(50mM Tris-HCl, 250 mM KCl, 10mM MgCl2, 10 mM dNTP), Taq 중합효소 0.8 ㎕(1.25 U/ul), ddH2O를 포함하여 20 ㎕ 부피로 반응액을 혼합한다. PCR 반응은 94℃에서 10분간 변성시키고, 일련의 반응(94℃에서 20sec, 58℃에서 20sec, 72℃에서 20sec)를 32회 반복한 후, 60℃에서 45분간 연장하고 8℃에서 반응을 종료하였다. Biometra T-3000, MJ Research PTC-200, AB GeneAmp PCR system 9600, 9700, 2720 등의 PCR 기기들을 사용한다
1-3. 자동 유전자 분석기(Automatic Genetic Analyzer)을 이용한 PCR 산물의 분석
AB 사의 Automatic Genetic Analyzer 377, 3100, 3130 등의 유전자타이핑(genotyping) 기기를 사용할 수 있다. PCR 결과를 분석하기 위하여 PCR 산물 1㎕에 Hi-Di Formamide(Applied Biosystems) 9.3 ㎕와 GenScan-500LIZ Size standard(Applied Biosystems) 0.2 ㎕를 혼합하여 AB Automatic Genetic Analyzer 3130에 실행시킨다. 기기의 레이저가 증폭된 PCR 산물의 프라이머에 표지된 형광물질을 감지하여 결과를 분석한다. 최종적으로 기기에 내장된 GeneMapper ID 소프트웨어를 가동시켜 각 SNP 마커에 대한 PCR 산물의 크기에 따라 벼 품종을 자동적으로 식별한다.
실시예
2: 벼 품종 식별
서열번호 1 내지 20의 프라이머를 합성한 후, 정방향 프라이머에 FAM을 표지하였다. 각 프라이머 세트는 서로 다른 크기의 PCR 산물을 증폭시키도록 고안되어 있다.
벼 시료로, 남평, 대안, 동안, 동진1, 상미, 새계화, 새추청, 수라, 신동진, 오대, 일미, 일품, 주남, 중화, 추청, 화봉, 화성, 화영, 대진, 동진, 삼천, 운두, 태봉, 화동, 문장, 고시히까리, 히토메보레, 삼광, 새상주 및 운광의 총 30종의 벼 품종을 사용하였다. 각각의 벼 시료는 실시예 1의 방법에 따라, DNA를 추출하여, 10-plex PCR을 수행한 다음 AB 사의 Automatic Genetic Analyzer로 PCR 증폭 여부 및 증폭 산물의 크기를 분석하고, 프로그래밍된 벼 품종 특이적인 PCR 증폭 산물 크기 조합(표 2)에 비교하여 벼 품종을 분석하였다.
그 결과는 도 1a 내지 1e에 나타낸다. 도 1a 내지 1e에 따라, 각각의 시료 벼의 PCR 결과를 프로그래밍된 벼 품종 판단표에 기재된 결과와 비교한 결과, 사용한 시료 벼 품종과 PCR로 확인된 벼 품종이 100% 일치되었다.
도 1a 내지 1e는 벼 품종 식별용 10쌍의 프라이머 조합을 이용한 10-plex PCR을, 벼 품종 남평, 대안, 동안, 동진1, 상미, 새계화, 새추청, 수라, 신동진, 오대, 일미, 일품, 주남, 중화, 추청, 화봉, 화성, 화영, 대진, 동진, 삼천, 운두, 태봉, 화동, 문장, 고시히까리, 히토메보레, 삼광, 새상주 및 운광에 대해 실시한 결과를 나타낸 것으로, 벼 품종 특이적인 SNP 증폭을 보인다.
<110> NATIONAL AGRICULTURAL PRODUCTS MANAGEMENT SERVICE
<120> PRIMER COMBINATION FOR DISCRIMINATION OF RICE CULTIVAR AND METHOD
FOR DISCRIMINATION OF RICE CULTIVAR USING SAME
<160> 20
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 1
caacgcaacg tcttgtatgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 2
tgaaccctga gttcctctcg 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 3
atagatcttt gtaactcaga aacaca 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 4
aaatgctcaa caagtgcttg g 21
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 5
caatggaatc ccgccc 16
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 6
attaggctgc atacattagt catcc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 7
ttcaattctt acgaacacaa cg 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 8
aacacctgtc aaacatctga ttta 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 9
cgctgaacta aacacaacct atcta 25
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 10
ccaattcctg cgtttttcc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 11
aaaagtggat ggcacattgg 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 12
atattgattc cttcactaca tac 23
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 13
atccggggga gggacgagg 19
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 14
taatagttgg agagtcgaga tatacg 26
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 15
aatgagtgtg gcagtgtgga tt 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 16
atgagacgag aagacgacca gg 22
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 17
aggtagtccc ttatttttcc ctatcc 26
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 18
agaagtcttg gtcctaagat atgtgct 27
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 19
atgtcatgtg gcttgtctgg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 20
gctgcctatc caagagaacg 20
Claims (9)
- 서열번호 3 내지 서열번호 20으로 기재한 염기 서열을 포함하는 9쌍의 프라이머 세트를 포함하는, 단일 PCR 반응물에 동시에 사용가능한 벼 품종 식별용 프라이머 조합.
- 제 1항에 있어서, 상기 9쌍의 프라이머 세트는 각각 서로 다른 크기의 PCR 산물을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 벼 품종 식별용 프라이머 조합.
- 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 동일한 또는 별개의 검출가능한 수단으로 표지된 것을 특징으로 하는 벼 품종 식별용 프라이머 조합.
- 제 3항에 있어서, 상기 검출가능한 수단이 형광물질인 것을 특징으로 하는 벼 품종 식별용 프라이머 조합.
- 제 3항에 있어서, 상기 형광물질은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벼 품종 식별용 프라이머 조합.
- 제 1항에 있어서, 상기 벼 품종 식별용 프라이머 조합은 남평, 대안, 동안, 동진1, 상미, 새계화, 새추청, 수라, 신동진, 오대, 일미, 일품, 주남, 중화, 추청, 화봉, 화성, 화영, 대진, 동진, 삼천, 운두, 태봉, 화동, 문장, 고시히까리, 히토메보레, 삼광, 새상주 및 운광으로 이루어진 군으로부터 선택된 벼 품종을 식별하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 벼 품종 식별용 프라이머 조합.
- 제 1항에 있어서, 벼 내재 유전자 검출용 양성 대조군 프라이머 세트로 서열번호 1을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2를 포함하는 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벼 품종 식별용 프라이머 조합.
- 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 벼 품종 식별용 프라이머 조합을 이용하여 벼로부터 추출한 DNA를 주형으로 PCR을 실시하는 단계;자동 유전자 분석기(Automatic Genetic Analyzer)로 상기 PCR 증폭 산물에 표지된 형광물질을 감지하여, 형광물질이 감지되는 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계; 및상기 단계에서 확인한 PCR 산물의 크기에 따라 벼의 품종을 식별하는 단계;를 포함하는, 벼 품종 식별용 프라이머 조합을 이용한 벼 품종의 식별 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 벼의 품종을 식별하는 단계는 하기 식별 기준에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는 벼 품종의 식별 방법:(1) 남평: 284 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(2) 대안: 205 bp, 284 bp, 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(3) 동안: 284 bp, 346 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(4) 동진1: 205 bp, 346 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(5) 상미: 473 bp, 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(6) 새계화: 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(7) 새추청: 284 bp, 473 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(8) 수라: 284 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(9) 신동진: 205 bp, 473 bp, 484 bp, 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(10) 오대: 177 bp, 484 bp 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(11) 일미: 284 bp, 346 bp, 473 bp, 484 bp, 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(12) 일품: 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(13) 주남: 205 bp, 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(14) 중화: 177 bp, 284 bp, 473 bp 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(15) 추청: 284 bp, 473 bp 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(16) 화봉: 284 bp, 346 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(17) 화성: 484 bp, 368 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(18) 화영: 205 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(19) 대진: 284 bp, 346 bp, 473 bp 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(20) 동진: 205 bp, 284 bp, 484 bp, 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(21) 삼천: 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(22) 운두: 177 bp, 473 bp, 484 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(23) 태봉: 177 bp, 284 bp, 및 473 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(24) 화동: 473 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(25) 문장: 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(26) 고시히까리: 177 bp, 그리고 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(27) 히토메보레: 177 bp, 473 bp, 193 bp, 및 298 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(28) 삼광: 205 bp, 284 bp, 473 bp, 및 484 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(29) 새상주: 177 bp, 284 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨;(30) 운광: 205 bp, 346 bp, 473 bp, 및 193 bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨.
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