KR101796260B1 - 딸기 품종 식별용 snp 마커 세트 및 이를 이용한 딸기 품종 식별 방법 - Google Patents

딸기 품종 식별용 snp 마커 세트 및 이를 이용한 딸기 품종 식별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머 세트 및 이를 이용한 딸기 품종 식별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내외 딸기 품종에 대해 다형성을 나타내는 딸기 품종 식별용 24 SNP 프라이머 세트, 이를 포함하는 딸기 품종 식별용 키트, 및 이들을 이용한 딸기 품종의 식별방법에 관한 것이다.
본 발명의 딸기 품종 식별용 SNP 마커 세트, 이를 포함하는 딸기 품종 식별용 키트 및 이들을 이용한 식별 방법에 의하면, 종래 품종의 식별이 어려웠던 딸기 품종을 특이적으로 재현가능하고 간단하고 정확하게 효율적으로 확인할 수 있다.

Description

딸기 품종 식별용 SNP 마커 세트 및 이를 이용한 딸기 품종 식별 방법{SNP marker set for identifying strawberry cultivars and method for identifying strawberry cultivars using the same}
본 발명은 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머 세트 및 이를 이용한 딸기 품종 식별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 국내외 딸기 품종에 대해 다형성을 나타내는 딸기 품종 식별용 24 SNP 프라이머 세트, 이를 포함하는 딸기 품종 식별용 키트, 및 이들을 이용한 딸기 품종의 식별방법에 관한 것이다.
딸기(Fragaria × ananassa Duch.)는 세계적으로 가장 널리 재배되는 베리류 작물이다. 품종 딸기는 팔배체 조상인 F. virginiana (Mill.) 및 F. chiloensis (Mill.) 사이에서의 교배로부터 기원하는 이질팔배체(2n = 8x = 56) 종들이다. 한국에서의 딸기 생산량은 농림축산식품부의 통계에 따르면 2010년에 십억 달러 이상이다. 과일의 품질, 강도, 향, 기온적응성 및 병충해 저항성(탄저병, 백분병, 시들음병)은 딸기 육종 프로그램에서 중요한 특징들이다. 새로운 딸기 품종을 육종하는 것은 계통의 선택, 우수한 유전형질의 선택 등 다양한 것들이 요구되며, 이러한 형질을 선택하였다 하더라도 유전자형이 팔배체의 이형접합형이라 육종이 까다롭다. 딸기는 주로 러너를 통해 클론적으로 증식하고 있으므로 특허된 품종의 잘못된 또는 불법적인 증식이 문제가 되고있다. 따라서, 품종의 동정 및 구별은 육종가의 권리를 보호할 뿐 아니라 육종 프로그램에서 품종을 선택하는데 있어 매우 중요하다.
딸기 품종의 동정은 최초로 아이소자임과 같은 생화학적 마커들을 사용하여 이루어졌다. 최근에는 무작위 증폭 다형 DNA(RAPD), 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP) 및 내부 단순 반복 염기 서열(inter-simple sequence repeat, ISSR) 마커들과 같은 DNA 마커들이 유전자형을 구별하기 위해 개발되었다. Fragaria sequence 정보의 축적은 단순 서열 반복(SSR) 및 cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)과 같은 더욱 정확한 공동우성(co-dominant) 마커들을 개발하는데 크게 기여하였다. 이러한 분자적 마커들은 유전적 유사성을 축적하고, 유전적 다양성을 모니터링하고, 연결매핑(linkage mapping), 품종을 식별하는데 사용된다. 최근 몇몇 그룹에서 SSR 마커를 딸기 품종 식별에 많이 사용하고 있다. SSR 마커들은 품종내에 다형성이 다수 존재하고, 전체 게놈에 걸쳐서 분포되어있다. 그러나 이러한 유형의 마커를 사용하는 데에는 딸기의 팔배체 특성, allele binning 및 automation과 관련된 단점들이 있다. 또한 SSR 마커들은 DNA 단편의 다양한 다형성으로 인해 구분이 쉽지 않은 경우가 다수 존재한다.
최근 몇 년간 선호되는 DNA 마커 유형은 단일 염기 다형성(SNP)에 기초한 것이다. 최근 F. vesca 'Hawaii 4' 의 이배체 게놈 서열이 완성되었으며, 이러한 게놈 정보는 SNP를 포함한 마커 개발에 유용한 정보로 이용할 수 있다. SNP는 bi-allelic 이고, 게놈에서 매우 자주 나타나고, 가장 중요하게는 멀티플렉스하고 자동화할 수 있다는 점에서 다른 분자 마커에 비해 유리하다.
SNP를 사용한 품종의 동정은 딸기, 멜론, 와인포도에서 최근 보고되고 있다. 딸기와 같은 팔배체 종에서의 고밀도 SNP 마커 플랫폼의 개발은 부분상동염색체 서열 변이(HSVs)의 존재 때문에 매우 복잡하고 어렵다.
Bassil 등(2015)은 'Holiday' × 'Korona' 품종 사이의 교배에 기초한 6593 마커를 이용하여 유전자형 분석 플랫폼인 90 K Axiom® SNP array를 성공적으로 개발하였다. 이러한 마커들의 상당수는 다중 고해상도(PHR) 마커에 속한다. 또한 Sargent 등은 'Darselect' × 'Monterey' 로부터 Bassil 등이 개발한 것보다 더욱 많은 수의 마커(8407)를 제시하였다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 더욱 정확하고 효율적인 딸기 품종 식별을 위하여 예의 연구한 결과와, 'Reikou'에서 분리한 164 개체에서 분석된 자료를 바탕으로 선발한 공통된 SNP 마커들을 사용하여 팔배체인 딸기 품종을 구별하기에 유용하고 더욱 정확한 24종의 SNP 다이나믹 어레이를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
이상과 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 딸기 품종 식별용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또 다른 본 발명의 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 딸기 품종식별용 어레이를 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 딸기의 품종을 식별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 SNP 프라이머 세트를 포함하는, 딸기 품종식별을 위한 SNP 프라이머 세트에 관한 것이다:
서열번호 1 내지 4의 프라이머로 이루어지는 Affx-88822649 프라이머 세트;
서열번호 5 내지 8의 프라이머로 이루어지는 Affx-88823721 프라이머 세트;
서열번호 9 내지 12의 프라이머로 이루어지는 Affx-88835180 프라이머 세트;
서열번호 13 내지 16의 프라이머로 이루어지는 Affx-88835180 프라이머 세트;
서열번호 17 내지 20의 프라이머로 이루어지는 Affx-88850078 프라이머 세트;
서열번호 21 내지 24의 프라이머로 이루어지는 Affx-88858859 프라이머 세트;
서열번호 25 내지 28의 프라이머로 이루어지는 Affx-88881444 프라이머 세트;
서열번호 29 내지 32의 프라이머로 이루어지는 Affx-88886086 프라이머 세트;
서열번호 33 내지 36의 프라이머로 이루어지는 Affx-88811555 프라이머 세트;
서열번호 37 내지 40의 프라이머로 이루어지는 Affx-88838581 프라이머 세트;
서열번호 41 내지 44의 프라이머로 이루어지는 Affx-88842129 프라이머 세트;
서열번호 45 내지 48의 프라이머로 이루어지는 Affx-88857372 프라이머 세트;
서열번호 49 내지 52의 프라이머로 이루어지는 Affx-88862418 프라이머 세트;
서열번호 53 내지 56의 프라이머로 이루어지는 Affx-88831370 프라이머 세트;
서열번호 57 내지 60의 프라이머로 이루어지는 Affx-88856935 프라이머 세트;
서열번호 61 내지 64의 프라이머로 이루어지는 Affx-88857423 프라이머 세트;
서열번호 65 내지 68의 프라이머로 이루어지는 Affx-88863509 프라이머 세트;
서열번호 69 내지 72의 프라이머로 이루어지는 Affx-88864643 프라이머 세트;
서열번호 73 내지 76의 프라이머로 이루어지는 Affx-88865351 프라이머 세트;
서열번호 77 내지 80의 프라이머로 이루어지는 Affx-88865369 프라이머 세트;
서열번호 81 내지 84의 프라이머로 이루어지는 Affx-88869578 프라이머 세트;
서열번호 85 내지 88의 프라이머로 이루어지는 Affx-88871758 프라이머 세트;
서열번호 89 내지 92의 프라이머로 이루어지는 Affx-88881253 프라이머 세트; 및
서열번호 93 내지 96의 프라이머로 이루어지는 Affx-88881450 프라이머 세트.
상기 SNP 프라이머 세트는 국내에서 유통되는 딸기 품종에 대해 높은 다형성을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 프라이머 세트는 딸기 품종을 식별하기 위해 이용될 수 있다. 상기 프라이머 세트는 예를 들면, 하기 표 1에 기재된 딸기 품종을 식별하기 위해 이용되는 것일 수 있다.
품종 품종기원국가* 연구소* 품종 품종기원국가* 연구소*
Jukhyang KOR DATC Dunlap USA NIHHS
Damhyang KOR DATC Guards man CAN NIHHS
Josaenghongsim KOR NIHHS Columbia USA NIHHS
Suhong KOR NIHHS Aromas USA NIHHS
Myhong KOR NIHHS Florida belle USA NIHHS
Maehyang KOR CARE Cascade USA NIHHS
Johong KOR NIHHS Erie USA NIHHS
Seolhyang KOR CARE Elista NLD NIHHS
Geumhyang KOR NIHHS Mildland USA NIHHS
Sunhong KOR NIHHS Huxley USA NIHHS
Dahong KOR NIHHS Sparkle USA NIHHS
Wongyo 3111 KOR NIHHS Honeoye USA NIHHS
Gamhong KOR NIHHS Dover USA NIHHS
Daeun KOR NIHHS Selva USA NIHHS
Santa KOR NIHHS Rosa Linda USA NIHHS
Daewang KOR NIHHS Camarosa USA NIHHS
Wongyo 3114 KOR NIHHS Oso Grande USA NIHHS
Okmae KOR NIHHS Seascape USA NIHHS
Sinseolmae - NIHHS Pink paened USA NIHHS
Bogyojosaeng JPN NIHHS Dahoe USA NIHHS
Morioka 16 JPN NIHHS Cambridge Favorite GBR NIHHS
Morioka 18 JPN NIHHS Cambridge Late Pine GBR NIHHS
Takane - NIHHS Doutch - NIHHS
Sagahonoka JPN NIHHS Jonson & quotes early - NIHHS
Kurume 38 JPN NIHHS Jursey early - NIHHS
Kurume 39 JPN NIHHS Anapolis CAN NIHHS
Kurume 49 JPN NIHHS Malah ISR NIHHS
Kurume 103 JPN NIHHS Yael ISR NIHHS
Sikisecheu JPN NIHHS Zeangana RUS NIHHS
Haruyoi JPN NIHHS Belrubi - NIHHS
Himeiku JPN NIHHS Sebila - NIHHS
Koufuku JPN NIHHS Camiroreal USA NIHHS
Syunsou JPN NIHHS Diamante USA NIHHS
Aiberry (busan) JPN NIHHS Ventana USA NIHHS
Toyonoka JPN NIHHS Darselect FRA NIHHS
Jeongbo (Sizutakara) JPN NIHHS Beaver Ruby - NIHHS
Yeohong (Reiko) JPN NIHHS Benizuru - NIHHS
Yeobong JPN NIHHS Jucunda USA NIHHS
Asukaruby JPN NIHHS Kaoling - NIHHS
Akihime JPN NIHHS Marsyalakaya - NIHHS
Tochiotome JPN NIHHS Primella - NIHHS
Akanekko JPN NIHHS Red Cross - NIHHS
Redpearl JPN NIHHS Sunrise - NIHHS
Sachinoka JPN NIHHS Tago USA NIHHS
Asuka wave JPN NIHHS The Sun - NIHHS
Raihou - NIHHS Gigana - NIHHS
kitaekubo JPN NIHHS ArKing - NIHHS
Chodaerip super jambo JPN NIHHS British Sovereign - NIHHS
Alps NLD NIHHS Empire - NIHHS
Jambo pure berry JPN NIHHS Freja - NIHHS
AC1466 USA NIHHS Fresno - NIHHS
Blake more USA NIHHS Garnet - NIHHS
Jasan - NIHHS Governor Simcoe - NIHHS
Jaspa - NIHHS Grenadier - NIHHS
Puget beauty USA NIHHS - - -
*CAN: 캐나다, FRA: 프랑스, GBR: 영국, ISR: 이스라엘, JPN: 일본, KOR:한국, NLD:네덜란드, RUS:러시아, USA:미국, DATC:담양농업기술센터, NIHHS:국립원예특장과학원, CARE: 충남농업기술원
본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 96의 프라이머를 포함하는 24 SNP 프라이머 세트를 하기 표 2에 나타내었다.
Affy SNP ID* STAa LSPb ASP1c ASP2d
Affx-88822649 GATGGCTATGATTTCCCTCGAATC (서열 1) AACCACTGATCTTCATCTAATTAATTAT (서열 2) TTCCCTCGAATCCCTGGGTCACCA (서열 3) TTCCCTCGAATCCCTGGGTCACCT (서열 4)
Affx-88823721 TAATCTAGAGAGACTCATTCTTGAAG (서열 5) GCAGGACTCTGATGGATTCATGGA (서열 6) ACTCATTCTTGAAGACTGTACACA (서열 7) ACTCATTCTTGAAGACTGTACACG (서열 8)
Affx-88831247 TGCTTTGCAGGAAAATACTATTACTTG (서열 9) GCGTCCTTTGTTGCAGCTGAGATTACA (서열 10) AAATACTATTACTTGCCCAATGCA (서열 11) AAATACTATTACTTGCCCAATGCC (서열 12)
Affx-88835180 GCTGTGTCGCAGCATTGCAAGCAAG (서열 13) AACTATATATACAACACAGCTCCCA (서열 14) CATTGCAAGCAAGTTTACCTCTTC (서열 15) CATTGCAAGCAAGTTTACCTCTTG (서열 16)
Affx-88850078 CGCCCAACCCGCCCATTTGCCAGGT (서열 17) GTTCTCTCGCACAATTATTCTTCATG (서열 18) CCATTTGCCAGGTTTGCTGTAACA (서열 19) CCATTTGCCAGGTTTGCTGTAACC (서열 20)
Affx-88858859 TGGTGATGTTGATGATGCATTACT (서열 21) GAGACACCTCTGTCATCCCAATAAG (서열 22) TGATGCATTACTTAAGATTGAGAA (서열 23) TGATGCATTACTTAAGATTGAGAC (서열 24)
Affx-88881444 ACGGGATGTTATGTACGTAGTGAT (서열 25) GCGAGGATGCTTACTAAACGGAGCCC (서열 26) GTACGTAGTGATCGATAGTCTCTA (서열 27) GTACGTAGTGATCGATAGTCTCTG (서열 28)
Affx-88886086 AAGACTGGCAAAATACAATGGAAGA (서열 29) TGATTGATTATCTCAAGGCCTGTGA (서열 30) AAATACAATGGAAGATTATCATCGTA (서열 31) AAATACAATGGAAGATTATCATCGTC (서열 32)
Affx-88811555 CCTAAATCAATTAGAAACTATGATTGC (서열 33) AGAGCGTTCTCTTAACCATAAGG (서열 34) TAGAAACTATGATTGCATGCGCAG (서열 35) TAGAAACTATGATTGCATGCGCAT (서열 36)
Affx-88838581 ACTATTGCTTTAAGAAACAGTTGAGTC (서열 37) AGCAATGTTAAAGATAGGAGAAAGAG (서열 38) TAAGAAACAGTTGAGTCAGCTCCTTA (서열 39) TAAGAAACAGTTGAGTCAGCTCCTTT (서열 40)
Affx-88842129 TGAGAGTAATATGATGGTTCTTGATCAA (서열 41) GGTCGTGAACAGATATTTCAGATATAC (서열 42) TGATGGTTCTTGATCAAGTTTCAGC (서열 43) TGATGGTTCTTGATCAAGTTTCAGT (서열 44)
Affx-88857372 CAAGCTAACTTTCCAATCTTTTGAGAT (서열 45) ACGTTTTGAGATGGATATTTAGCAAGT (서열 46) TCCAATCTTTTGAGATTCACAATGC (서열 47) TCCAATCTTTTGAGATTCACAATGG (서열 48)
Affx-88862418 TAACAAACCTCATCATGAATCTCATC (서열 49) AGCTTCTTTAGCTGGTTTGGTGATA (서열 50) ATCATGAATCTCATCCATAAGATCC (서열 51) ATCATGAATCTCATCCATAAGATCT (서열 52)
Affx-88831370 GGTCGTGCCAAGCTTGTTAATGAGT (서열 53) CTATTTCTCAAATTGATCATAAACTGGG (서열 54) GCTTGTTAATGAGTACGTCGATATA (서열 55) GCTTGTTAATGAGTACGTCGATATG (서열 56)
Affx-88856935 ACTCTCAAGAATAAGAAGAGGAAAG (서열 57) TGTTCTGGAATACAAAGCTTTCAGC (서열 58) ATAAGAAGAGGAAAGAAAATGGCTTC (서열 59) ATAAGAAGAGGAAAGAAAATGGCTTT (서열 60)
Affx-88857423 CACATAAACGTTGGTTGCTCCATTAT (서열 61) GAAGTATCATGAACACAACAATGGTTG (서열 62) TGGTTGCTCCATTATAAAACGACTA (서열 63) TGGTTGCTCCATTATAAAACGACTG (서열 64)
Affx-88863509 TGGCATAGTTAAGCTTTACACACAAG (서열 65) CTCACTTTTGCATTTTCACAAATCAG (서열 66) GCTTTACACACAAGTAACGCACAC (서열 67) GCTTTACACACAAGTAACGCACAT (서열 68)
Affx-88864643 TCTGCGCGATATACGTTTAATGGCTT (서열 69) GATTGTAGAAATGTTCAAGTTACTTG (서열 70) ATACGTTTAATGGCTTATTTCAGTCA (서열 71) ATACGTTTAATGGCTTATTTCAGTCG (서열 72)
Affx-88865351 TGATCCAAAGGCTTCTATAACCTTTAC (서열 73) TGATGCAGATATATGAGTACTCTACA (서열 74) GCTTCTATAACCTTTACACAACATGC (서열 75) GCTTCTATAACCTTTACACAACATGT (서열 76)
Affx-88865369 AAAGTATAGCTAGAGATACATATGCA (서열 77) TGGACCAGCTGTTCCGTACTGTA (서열 78) TAGAGATACATATGCAGCTTTTGATC (서열 79) TAGAGATACATATGCAGCTTTTGATT (서열 80)
Affx-88869578 AGGGTTCTCACTAAACTAATCTACC (서열 81) TATCAGGACCATGGTCATTTTGAAG (서열 82) CTAAACTAATCTACCCATTTGTCGAC (서열 83) CTAAACTAATCTACCCATTTGTCGAG (서열 84)
Affx-88871758 TGTTGTATCTGAAATTAGGGTACAGT (서열 85) AAGACACGAACTGCAGGAGGAACT (서열 86) GAAATTAGGGTACAGTCATGAAGTTC (서열 87) GAAATTAGGGTACAGTCATGAAGTTG (서열 88)
Affx-88881253 TTACTGTAGAGAAGCTTTAAAGAAAAC (서열 89) TGTCAATTGCATAAGTACTTCTCAC (서열 90) AGCTTTAAAGAAAACAGTAGGCCA (서열 91) AGCTTTAAAGAAAACAGTAGGCCC (서열 92)
Affx-88881450 TTGTGAAGTTTCCAGTTGAGAGAGAT (서열 93) ACGAACGACGGAAAGAAACTCCAA (서열 94) CAGTTGAGAGAGATGGAGATAGGA (서열 95) CAGTTGAGAGAGATGGAGATAGGT (서열 96)
상기 SNP 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체(analogue), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 프라이머의 5' 말단에 표지될 수 있다. 또한, 방사성 표지 물질은, 32P 또는 35S 와 같은 방사성 동위원소가 첨가된 PCR 반응액을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭 산물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머 세트는 다양한 PCR 방법에 적용되어 딸기 품종을 구체적으로 식별가능하게 하며, PCR 법의 종류에 따라 본 발명의 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머를 적용하여 얻어지는 결과가 달라지지는 않는다. 구체적인 일 실시 양태에서, 본 발명에서는 경쟁적 대립유전자-특이적인 PCR(competitive allele-specific PCR)을 사용하였다.
또한, 본 발명은 상기 SNP 프라이머 세트를 포함하는, 딸기 품종식별용 키트를 제공한다.
상기 키트는 DNA 중합 효소, dNTP 및 PCR 완충용액을 더 포함할 수 있다. 또한, PCR 반응 또는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 딸기로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머 세트를 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물로부터 상기 딸기의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 딸기 품종을 식별하는 방법을 제공한다.
상기 게놈 DNA는 상기 딸기의 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적인 실시 양태에서 본 발명의 식별 방법을 위해 본 발명자들은 149종의 딸기 품종의 잎 조직에서부터 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 게놈 DNA는 식물체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 상기 게놈 DNA는 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
상기 방법에서, 핵산의 증폭은 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. PCR 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수 있다. PCR 반응은 당업계에 PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응액은 예를 들면, 분석하고자 하는 딸기로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 SNP 프라이머 세트, DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광 물질로 표지된 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 방사성 측정을 통해 검출할 경우, 방사성 물질을 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)와 같은 방사성 측정기를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
상기 방법에서, 얻어진 증폭 산물로부터 상기 딸기의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, 본 발명에 따른 SNP 프라이머 세트에 의해 공지된 딸기 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 증폭된 산물로부터 딸기 품종을 결정하는 단계는 자동 염기서열 분석기를 이용하여 증폭 산물(밴드)의 양을 컴퓨터 프로그램에 의해 확인함으로써 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에서는 24 SNP 세트가 작은 숫자의 마커들을 포함하기는 하나 이들은 SSR 마커 세트에 비해 더 많은 수의 품종들을 정확하고 효율적으로 특정할 수 있었다. 각각의 SNP들은 품종을 단독으로 구별할 수는 없으나, 24 마커 세트로 결합되는 경우 이들의 구별능이 높아진다.
본 발명의 딸기 품종 식별용 SNP 마커 세트, 이를 포함하는 딸기 품종 식별용 키트 및 이들을 이용한 식별 방법에 의하면, 종래 품종의 식별이 어려웠던 딸기 품종을 특이적으로 재현가능하고 간단하고 정확하게 효율적으로 확인할 수 있다.
도 1은 딸기 품종의 유전자 매핑을 나타낸 도면이다. Affy SNP ID*는 유전자의 오른쪽에 기재되어 있고, F. vesca genome v2.0.에서의 물리적 위치는 왼쪽에 기재되어 있다.
도 2는 Fluidigm genotyping software를 사용하여 대립염기 X를 X축으로 하고(SNPtype - FAM) 대립염기 Y를 Y축으로 하여(SNPtype - HEX) 각각의 SNP를 3종의 유전자형으로 카테고리화 한 클러스터 플롯을 나타낸 것이다.
도 3은 109종의 품종 각각에 대한 24 어세이로부터 얻어지는 유전자형들을 나타낸 도면이다.
도 4는 24 어세이를 사용하여 딸기 품종을 분석한 점수를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1) 식물 재료
본 연구에서 사용된 149종의 딸기 품종은 담양농업기술센터, 국립원예특작과학원 및 충남농업기술원으로부터 수득하였다.
2) 게놈성 DNA 추출
게놈성 DNA는 각각의 품종의 잎 조직(100 mg의 분쇄된 조직)으로부터 DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, USA)를 사용하여 제조사의 안내서에 따라 추출하였다. DNA 양 및 순도는 Nanodrop spectrophotometer(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 측정하였고, DNA는 사용시까지 -20°C에서 보관하였다.
3) SNP 어레이의 개발 및 매핑
기존의 연구의 2종의 F1 매핑 개체군 및 딸기 품종 'Reikou'의 164 S1 개체 내에서의 다중 고해상도(poly high resolution (PHR)) 마커로서 공통적으로 관찰된 414 SNP로부터 194 SNP를 임의적으로 선택하였다. 한국에서 가장 널리 재배되는 죽향, 담향, 설향과 같은 품종이 포함된 48 품종 선발하여 사용하였다. 어세이는 competitive allele-specific PCR에 기초하였고, 이에 의해 특정 좌위(KBioscience Ltd, Hoddesdon, UK)에서의 SNP에 대한 bi-allelic scoring이 가능하게 하였다. 유전자형 패널은, Zhou, L.; Matsumoto, T.; Tan, H.-W.; Meinhardt, L.W.; Mischke, S.; Wang, B.; Zhang, D. Developing single nucleotide polymorphism markers for the identification of pineapple (ananas comosus) germplasm. Horticulture research 2015, 2, 15056.에 개시된 방법에 따라 개발하였다. 간략하게, SNP 서열은 SNP 유전자형 패널을 위한 프라이머의 디자인 및 제조를 위해 제출되었다. Fluidigm SNP genotyping 시스템은 4종의 프라이머와 2종의 프로브들을 포함한다. 상기 프라이머는 특이적 타겟 증폭 프라이머(Specific Target Amplification primer, STA), 좌위 특이적 프라이머(Locus Specific Primer, LSP) 및 2종의 대립 유전자 특이적 프라이머(Allele Specific Primer, ASPs) (표 2 참조)였다. STA 및 LSP 프라이머를 사용하여, 분리된 DNA들은 관심이 있는 SNP 서열을 증폭 하기 위해 투입하였다. 이 ASP 및 LSP를 사용한 두 번째 PCR은 제조자의 설명에 따라 FAM 및 HEX 프로브로 구성된 Fluidigm SNPtype Genotyping Reagent Kit를 사용하여 수행되었다. 상기 FAM 및 HEX 프로브들은 ASP1 및 ASP2에 상보적인 서열로 태깅되었다. 증폭 중에, 상기 프로브는 퀀쳐로부터 분리되었고 앰플리콘에 결합하였다. 이러한 태깅된 앰플리콘들은 대립 유전자들을 구별하기 위해 형광발광을 한다. 유전자형 분석은 48.48 Dynamic Array IFC(Integrated Fluidic Circuit; Fluidigm Corp., USA)의 nanofluidic Endpoint fluorescence image 상에서 수행되었다. IFC 는 EP1 imager(Fluidigm Corp., USA)상에서 얻어졌다. 데이터는 Fluidigm Genotyping Analysis Software(Fluidigm Corp., USA)를 사용하여 분석하였다. 최초 유전자형 분석 이후, 유전자형의 구분이 어려운 SNP 마커 및 개체간 변이가 없는(monopmorphic) SNP들은 제외하였다. 최종적으로 유전자형을 잘 구분해 낼 수 있는 24 SNP 세트를 선발하여 149 종의 품종을 구분하기 위하여 사용하였다. SNP 마커들의 물리적 위치는 맵 차트 프로그램을 사용하여 F. vesca genome v2.0.a1. 상에서 그들에 인접한 서열들을 BLAST 하는 것에 의해 결정되었다.
실험예 2: 결과 및 논의
1) 24 SNP 어세이의 개발
2종의 Axiom® Istraw90® array 상에서 매핑 개체군 즉, 'Holiday' × 'Korona' 및 'Darselect' × 'Monterey', 와 'Reikou'의 164 S1 개체 사이에서 PHR을 나타낸 SNP 중 414종의 공통된 SNP을 선발하였다. Fluidigm EP-1 system을 위한 24 SNP 어세이를 개발하기 위해, 본 발명자들은 본 발명에서 사용된 구분된 개체군 사이에서의 편향을 줄이기 위해 주로 공통된 SNP상에서 초점을 맞추었다. 모든 414 SNP에 대해, SNP가 플랭킹 되는 70 bp 서열이 시퀀싱 정보에 기초하여 수득되었다. PHR SNP는 다형성이 높은 SNP이고, 이러한 마커들은 매우 정확하고 재현성이 높다. 414 SNP 들 중에서 192종의 SNP를 임의적으로 선택하여 Fluidigm EP-1 system 내의 48.48 다이나믹 SNP 어레이 4 set을 시험하였다. 본 발명자들은 어세이 스크리닝을 위해 죽향, 담향 및 설향과 같이 한국에서 가장 널리 재배되는 품종을 포함하는 48종의 품종을 사용하였다. 스크리닝 과정 중에 본 발명자들은 시험된 품종에서 개체간 변이가 없는 몇 종의 SNP 들을 발견하였다. 나아가, 몇몇 SNP들은 모든 시험된 품종들에서 이형접합성이거나 또는 증폭에 실패하였다. 이러한 SNP들은 폐기하였다. 이처럼 실패한 SNP들은 다배체 게놈을 가지고 있는 딸기의 특성이거나 시퀀싱 오류인 것으로 예측된다. 궁극적으로 24종의 SNP 세트를 4종의 프라이머를 사용하여 구축하였다(STA, LSP, ASP1 and ASP2). 상기 서열 정보는 표 2에 나타내었다. 알로-팔배체 딸기와 같은 복잡한 폴리플로이드 식물에 대한 분자 마커의 개발은 부분 상동 염색체(homoeologues) 서열의 존재 때문에 어렵다. SSR 마커는 높은 재현성 때문에 과거에 딸기의 분자마커개발에 이용되었다. 그러나 상기 마커 시스템은 딸기의 복잡한 게놈 때문에 사용하기 어려웠다(예를 들어 딸기는 근친 교배한 품종에서 단일 좌위에서의 동일한 대립유전자의 다양한 카피들이 존재한다). 본 발명에서는 24 SNP 세트가 작은 숫자의 마커들을 포함하기는 하나 이들은 SSR 마커 세트에 비해 더 많은 수의 품종들을 정확하고 효율적으로 구분할 수 있었다. 각각의 SNP들은 품종을 단독으로 구별할 수는 없으나, 24 마커 세트로 결합되는 경우 이들의 구별능이 높아진다.
2) 24 SNP 어레이를 사용한 품종 구분
24 SNP 어레이를 사용하여, 본 발명자들은 기원이 다양한 149 품종들의 유전자형을 분석하였다. 기원 및 연구 출처를 포함하는 품종 정보는 표 1에 기재되어 있다. 클러스터 플롯은 Fluidigm genotyping software를 사용하여 대립염기 X를 X축으로 하고(SNPtype - FAM) 대립염기 Y를 Y축으로 하여 (SNPtype - HEX) 생성되었다. 각각의 SNP는 모든 품종들에 대해 3가지 유전자형으로 카테고리화되었다(도 2) 109 종의 품종 각각에 대한 24 어세이로부터 얻어지는 유전자형들을 도 3에 요약하였다.
모든 24 어세이들은 대립염기 특이적인 PHR 클래스 마커로 확인되었다. 유전자형을 비교하기 위해 품종들에 대하여 대립염기가 매치되는 경우 1, 매치되지 않는 경우 0으로 점수를 매겼다. 예를 들어, 죽향의 경우 죽향과 비교시 동일 품종이므로 24 어세이에서의 점수는 24 이었다. 나아가 담향과 비교시 15로 15 어세이들은 같았으나, 9 어세이들은 달라 이들은 서로 다른 품종임을 확인하였다. 24 SNP에 대한 이들의 최종 점수는 도 4에 나타내었다. 점수가 24인 경우는 빨간색 음영으로 표기하였다. 모든 109 종의 품종들은 독특한 24 SNP 서열의 세트를 가지고 있었으며 따라서, 109 품종들을 분명하게 구별할 수 있었다.
149 종의 품종 중에서 109 품종은 성공적으로 구별되었으나, 40 종의 품종은 이 방법에 의해 신뢰도 있게 구별되지는 않았다. 이러한 40 종의 품종은 다른 시험된 품종과 함께 공유되는 동일한 유전자형을 가지고 있었기 때문에 구별에 실패하였다. 이러한 결과는 시험된 품종들이 동일한 부모의 F1 후손에서 근친교배한 것이기 때문일 수도 있다.
3) 염색체 매핑
염색체에서 마커들을 매핑하기 위해, SNP 주변의 서열들을 F. vesca v2.0.a1. 게놈성 서열 내에서 동정하였다. 연구된 모든 SNP들은 물리적으로 F. vesca 염색체상에 매핑되었다(도 1). 배치된 SNP는 크로모좀 7을 제외하고는 모든 크로모좀에 분포되었다. 딸기 품종들의 대부분은 딸기 재배에서 품종으로서 사용되는 F1 후손들을 이용하여 팔배체 품종의 근친교배로부터 유도된다. 따라서 딸기의 유전적 다양성에 대한 지식은 딸기 육종에 있어 필수적이다. 딸기는 주로 러너를 통해 영양번식되므로 육종 과정에서 품종의 오동정 또는 오레이블링 과정은 본의 아니게 일어난다. 또한 특허된 재배종들은 때로는 불법적으로 증식되고 분포된다. 따라서, 믿을 수 있는 유전자형 정보는 품종보호뿐 아니라 잘 구축된 육종 프로그램에 대한 선결요건이다. 본 발명에 따른 SNP 유전형 분석 시스템은 자동화되어 있어, 데이터 프로세싱이 용이하며 정확한 데이터를 얻을 수 있다.
4) 결론
분자마커 기술은 많은 육종 프로그램 및 품종 보호에서 중요한 역할을 차지한다. 본 발명에서 본 발명자들은 분석된 딸기 품종의 대부분을 구별할 수 있는 24종의 SNP 세트를 개발하였다. 다른 전통적인 마커에 비교하여 본 발명에서 개발한 SNP 마커는 쉽고 용이하게 딸기 품종 식별이 가능하며, 마커의 정확도 및 효율을 증가시킨다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION OF SUNCHON NATIONAL UNIVERSITY <120> SNP marker set for identifying strawberry cultivars and method for identifying strawberry cultivars using the same <130> PA-16-0052 <160> 96 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88822649 STA primer <400> 1 gatggctatg atttccctcg aatc 24 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88822649 LSP primer <400> 2 aaccactgat cttcatctaa ttaattat 28 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88822649 ASP1 primer <400> 3 ttccctcgaa tccctgggtc acca 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88822649 ASP2 primer <400> 4 ttccctcgaa tccctgggtc acct 24 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88823721 STA primer <400> 5 taatctagag agactcattc ttgaag 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88823721 LSP primer <400> 6 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primer <400> 29 aagactggca aaatacaatg gaaga 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88886086 LSP primer <400> 30 tgattgatta tctcaaggcc tgtga 25 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88886086 ASP1 primer <400> 31 aaatacaatg gaagattatc atcgta 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88886086 ASP2 primer <400> 32 aaatacaatg gaagattatc atcgtc 26 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88811555 STA primer <400> 33 cctaaatcaa ttagaaacta tgattgc 27 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88811555 LSP primer <400> 34 agagcgttct cttaaccata agg 23 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88811555 ASP1 primer <400> 35 tagaaactat gattgcatgc gcag 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88811555 ASP2 primer <400> 36 tagaaactat gattgcatgc gcat 24 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88838581 STA primer <400> 37 actattgctt taagaaacag ttgagtc 27 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88838581 LSP primer <400> 38 agcaatgtta aagataggag aaagag 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88838581 ASP1 primer <400> 39 taagaaacag ttgagtcagc tcctta 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88838581 ASP2 primer <400> 40 taagaaacag ttgagtcagc tccttt 26 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88842129 STA primer <400> 41 tgagagtaat atgatggttc ttgatcaa 28 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88842129 LSP primer <400> 42 ggtcgtgaac agatatttca gatatac 27 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88842129 ASP1 primer <400> 43 tgatggttct tgatcaagtt tcagc 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88842129 ASP2 primer <400> 44 tgatggttct tgatcaagtt tcagt 25 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857372 STA primer <400> 45 caagctaact ttccaatctt ttgagat 27 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857372 LSP primer <400> 46 acgttttgag atggatattt agcaagt 27 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857372 ASP1 primer <400> 47 tccaatcttt tgagattcac aatgc 25 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857372 ASP2 primer <400> 48 tccaatcttt tgagattcac aatgg 25 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88862418 STA primer <400> 49 taacaaacct catcatgaat ctcatc 26 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88862418 LSP primer <400> 50 agcttcttta gctggtttgg tgata 25 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88862418 ASP1 primer <400> 51 atcatgaatc tcatccataa gatcc 25 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88862418 ASP2 primer <400> 52 atcatgaatc tcatccataa gatct 25 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88831370 STA primer <400> 53 ggtcgtgcca agcttgttaa tgagt 25 <210> 54 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88831370 LSP primer <400> 54 ctatttctca aattgatcat aaactggg 28 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88831370 ASP1 primer <400> 55 gcttgttaat gagtacgtcg atata 25 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88831370 ASP2 primer <400> 56 gcttgttaat gagtacgtcg atatg 25 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88856935 STA primer <400> 57 actctcaaga ataagaagag gaaag 25 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88856935 LSP primer <400> 58 tgttctggaa tacaaagctt tcagc 25 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88856935 ASP1 primer <400> 59 ataagaagag gaaagaaaat ggcttc 26 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88856935 ASP2 primer <400> 60 ataagaagag gaaagaaaat ggcttt 26 <210> 61 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857423 STA primer <400> 61 cacataaacg ttggttgctc cattat 26 <210> 62 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857423 LSP primer <400> 62 gaagtatcat gaacacaaca atggttg 27 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857423 ASP1 primer <400> 63 tggttgctcc attataaaac gacta 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88857423 ASP2 primer <400> 64 tggttgctcc attataaaac gactg 25 <210> 65 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88863509 STA primer <400> 65 tggcatagtt aagctttaca cacaag 26 <210> 66 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88863509 LSP primer <400> 66 ctcacttttg cattttcaca aatcag 26 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88863509 ASP1 primer <400> 67 gctttacaca caagtaacgc acac 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88863509 ASP2 primer <400> 68 gctttacaca caagtaacgc acat 24 <210> 69 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88864643 STA primer <400> 69 tctgcgcgat atacgtttaa tggctt 26 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88864643 LSP primer <400> 70 gattgtagaa atgttcaagt tacttg 26 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88864643 ASP1 primer <400> 71 atacgtttaa tggcttattt cagtca 26 <210> 72 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88864643 ASP2 primer <400> 72 atacgtttaa tggcttattt cagtcg 26 <210> 73 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865351 STA primer <400> 73 tgatccaaag gcttctataa cctttac 27 <210> 74 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865351 LSP primer <400> 74 tgatgcagat atatgagtac tctaca 26 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865351 ASP1 primer <400> 75 gcttctataa cctttacaca acatgc 26 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865351 ASP2 primer <400> 76 gcttctataa cctttacaca acatgt 26 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865369 STA primer <400> 77 aaagtatagc tagagataca tatgca 26 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865369 LSP primer <400> 78 tggaccagct gttccgtact gta 23 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865369 ASP1 primer <400> 79 tagagataca tatgcagctt ttgatc 26 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88865369 ASP2 primer <400> 80 tagagataca tatgcagctt ttgatt 26 <210> 81 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88869578 STA primer <400> 81 agggttctca ctaaactaat ctacc 25 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88869578 LSP primer <400> 82 tatcaggacc atggtcattt tgaag 25 <210> 83 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88869578 ASP1 primer <400> 83 ctaaactaat ctacccattt gtcgac 26 <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88869578 ASP2 primer <400> 84 ctaaactaat ctacccattt gtcgag 26 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88871758 STA primer <400> 85 tgttgtatct gaaattaggg tacagt 26 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88871758 LSP primer <400> 86 aagacacgaa ctgcaggagg aact 24 <210> 87 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88871758 ASP1 primer <400> 87 gaaattaggg tacagtcatg aagttc 26 <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88871758 ASP2 primer <400> 88 gaaattaggg tacagtcatg aagttg 26 <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881253 STA primer <400> 89 ttactgtaga gaagctttaa agaaaac 27 <210> 90 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881253 LSP primer <400> 90 tgtcaattgc ataagtactt ctcac 25 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881253 ASP1 primer <400> 91 agctttaaag aaaacagtag gcca 24 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881253 ASP2 primer <400> 92 agctttaaag aaaacagtag gccc 24 <210> 93 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881450 STA primer <400> 93 ttgtgaagtt tccagttgag agagat 26 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881450 LSP primer <400> 94 acgaacgacg gaaagaaact ccaa 24 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881450 ASP1 primer <400> 95 cagttgagag agatggagat agga 24 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Affx-88881450 ASP2 primer <400> 96 cagttgagag agatggagat aggt 24

Claims (5)

  1. 하기 프라이머 세트로 이루어진 것을 특징으로 하는, 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머 세트:
    서열번호 1 내지 4의 프라이머로 이루어지는 Affx-88822649 프라이머 세트;
    서열번호 5 내지 8의 프라이머로 이루어지는 Affx-88823721 프라이머 세트;
    서열번호 9 내지 12의 프라이머로 이루어지는 Affx-88835180 프라이머 세트;
    서열번호 13 내지 16의 프라이머로 이루어지는 Affx-88835180 프라이머 세트;
    서열번호 17 내지 20의 프라이머로 이루어지는 Affx-88850078 프라이머 세트;
    서열번호 21 내지 24의 프라이머로 이루어지는 Affx-88858859 프라이머 세트;
    서열번호 25 내지 28의 프라이머로 이루어지는 Affx-88881444 프라이머 세트;
    서열번호 29 내지 32의 프라이머로 이루어지는 Affx-88886086 프라이머 세트;
    서열번호 33 내지 36의 프라이머로 이루어지는 Affx-88811555 프라이머 세트;
    서열번호 37 내지 40의 프라이머로 이루어지는 Affx-88838581 프라이머 세트;
    서열번호 41 내지 44의 프라이머로 이루어지는 Affx-88842129 프라이머 세트;
    서열번호 45 내지 48의 프라이머로 이루어지는 Affx-88857372 프라이머 세트;
    서열번호 49 내지 52의 프라이머로 이루어지는 Affx-88862418 프라이머 세트;
    서열번호 53 내지 56의 프라이머로 이루어지는 Affx-88831370 프라이머 세트;
    서열번호 57 내지 60의 프라이머로 이루어지는 Affx-88856935 프라이머 세트;
    서열번호 61 내지 64의 프라이머로 이루어지는 Affx-88857423 프라이머 세트;
    서열번호 65 내지 68의 프라이머로 이루어지는 Affx-88863509 프라이머 세트;
    서열번호 69 내지 72의 프라이머로 이루어지는 Affx-88864643 프라이머 세트;
    서열번호 73 내지 76의 프라이머로 이루어지는 Affx-88865351 프라이머 세트;
    서열번호 77 내지 80의 프라이머로 이루어지는 Affx-88865369 프라이머 세트;
    서열번호 81 내지 84의 프라이머로 이루어지는 Affx-88869578 프라이머 세트;
    서열번호 85 내지 88의 프라이머로 이루어지는 Affx-88871758 프라이머 세트;
    서열번호 89 내지 92의 프라이머로 이루어지는 Affx-88881253 프라이머 세트; 및
    서열번호 93 내지 96의 프라이머로 이루어지는 Affx-88881450 프라이머 세트.
  2. 제1항에 따른 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머 세트를 포함하는, 딸기 품종식별용 키트.
  3. 딸기로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 딸기 품종 식별용 SNP 프라이머 세트를 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    얻어진 증폭 산물로부터 상기 딸기의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 딸기 품종을 식별하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 딸기 품종을 식별하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 얻어진 증폭 산물로부터 상기 딸기의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, 청구항 1의 딸기 품종식별용 프라이머 세트에 의해 공지된 딸기 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것인, 딸기 품종을 식별하는 방법.
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