CN117089649B - 一种与菠萝果实柠檬酸含量相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记及其应用。该SNP分子标记为碱基G或A，位于1号染色体AcGAD5基因的9970871位点上。该SNP分子标记与菠萝种质资源有机酸聚类结果相似，能够较好区分柠檬酸含量差异较大的种质，实现菠萝的柠檬酸含量分型。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
菠萝（Ananas comosus L.）是重要的热带水果之一，其包含丰富的营养价值，富含钙、钾、维生素 C 和维生素 A，其中维生素Ａ有保护人体上皮组织、提高抵抗力、明目养肝的作用；维生素Ｃ能抗氧化、抗衰老、抗癌，而钙、钾是人体生命活动所需的重要微量元素，菠萝果肉还含有丰富的菠萝蛋白酶，有助于人们消化和吸收蛋白质，此外，相关研究表明菠萝蛋白酶在化工、食品、医疗等领域也有相关的应用。
菠萝属于柠檬酸积累型果实，柠檬酸含量是影响菠萝果实风味的重要因素，也是果实品质评价的重要指标，即柠檬酸含量的分型或含量检测对菠萝种质资源、品种鉴定、构建遗传图谱、基因定位和辅助选择育种均具有重大意义。
20世纪80年代，分子标记开发和应用开始登上历史舞台。在许多重要的园艺作物中，利用基于DNA的标记，已经设计出了多种用于检测遗传多样性的分子方法。这些标记通常独立于环境因素，展现更多的特征，为基因组潜在的变异提供更加清晰信息。此后，越来越多的分子标记应用被报道在植物分子育种和基因组学的各个方面。分子标记在园艺作物的种质资源、品种鉴定、构建遗传图谱、基因定位和辅助选择育种等各方面都得到了广泛的应用。其中，SNP分子标记以高通量、高准确性等优势，在揭示作物物种多样性的范围和分布方面非常有价值，实现植物育种中高度精确化，且可利用范围广泛。
因此，挖掘一种与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记是有必要的。
发明内容
针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记，该SNP为AcGAD5基因的单核苷酸多态性位点，G或A，位于1号染色体的9970871bp处，命名为SNP3，根据SNP3多态性位点可以有效区分不同菠萝材料果实的柠檬酸含量。
本发明可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记，其特征在于，该SNP分子标记为碱基G或A，位于1号染色体AcGAD5基因的9970871bp位点上。
本发明另一方面提供一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对，引物对用于检测上述的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记。
优选地，上述引物对包括序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物，其中SEQ ID NO.1-2为上游引物，SEQ ID NO.3为反向通用引物。
本发明再一方面提供一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂，其包括上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对。
本发明再一方面提供一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量或酸度的检测试剂盒，其包括上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对或上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂。
本发明再一方面提供一种用于鉴定菠萝果实柠檬酸含量或酸度的方法，包括：检测上述的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记的基因型，基因型为G/G时，菠萝果实为Ⅱ或Ⅲ等级酸度，基因型为G/A时，菠萝果实为I等级酸度。
本发明再一方面提供一种上述的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记或上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对或上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂或上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂或上述的检测试剂盒在以下（a）-（e）中的任意一种应用：（a）在检测或辅助检测菠萝果实柠檬酸含量高低中的应用；（b）在筛选或鉴定高或低菠萝果实柠檬酸含量中的应用；（c）在菠萝果实柠檬酸含量的早期预测中的应用；（d）在菠萝果实柠檬酸含量分子标记辅助育种中的应用；（e）在菠萝果实柠檬酸含量的种质资源改良中的应用。
本发明有益效果至少包括：本发明提供的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记与菠萝种质资源有机酸聚类结果相似，能够较好区分柠檬酸含量差异较大的种质，实现菠萝的柠檬酸含量分型。
附图说明
图1a为SNP3位点基因型鉴定结果；
图1b为SNP7位点基因型鉴定结果；
图1c为SNP8位点基因型鉴定结果；
图2a为菠萝果实草酸含量频率分布直方图；
图2b为菠萝果实苹果酸含量频率分布直方图；
图2c为菠萝果实乙酸含量频率分布直方图；
图2d为菠萝果实柠檬酸酸含量频率分布直方图；
图2e为菠萝果实富马酸含量频率分布直方图；
图2f为菠萝果实总酸含量频率分布直方图；
图3为 40份菠萝种质资源皮尔逊相关系数图；
图4a为菠萝种质果实草酸组分分布散点图；
图4b为菠萝种质果实苹果酸组分分布散点图；
图4c为菠萝种质果实乙酸组分分布散点图；
图4d为菠萝种质果实富马酸组分分布散点图；
图4e为菠萝种质果实柠檬酸组分分布散点图；
图5为菠萝种质柠檬酸含量分类图，图中，Ⅰ~Ⅲ：低、中、高柠檬酸菠萝品种；
图6为SNP1基因型与柠檬酸含量关联分析，图中，Ⅰ~Ⅲ：低、中、高柠檬酸菠萝品种。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明实施例提供一种与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记，其特征在于，该SNP分子标记为碱基G或A，位于菠萝1号染色体AcGAD5基因的9970871位。
需要说明的是，乌头酸酶（Aconitase，ACO）和谷氨酸脱羧酶(Glutamic aciddecarboxylase，GAD)是果实柠檬酸降谢的关键酶。本发明系统鉴定了菠萝ACO和GAD家族基因，并进行详细的生物信息学分析，确定菠萝ACO和GAD家族成员；通过RT-qPCR分析高酸品种‘巴厘’和低酸品种‘Josapine’果实中ACO和GAD家族的时空表达特性，筛选表达量差异较大的ACO1和GAD5；设计特异性引物，克隆菠萝ACO1和GAD5的cDNA，并分别构建过表达载体，转化菠萝愈伤进行功能验证，明确ACO1和GAD5在柠檬酸分解反应中的作用；利用145份菠萝种质重测序数据，分析ACO1和GAD5的SNP位点的分布特征，并利用PARMS-SNP分型技术鉴定SNP位点的基因型；再利用40份来源不同、柠檬酸含量存在明显差异的菠萝种质材料的表型数据，与分型较好的SNP进行关联分析，筛选能较好区分不同柠檬酸含量种质材料的SNP并开发成分子标记。具体研究结果如下：
（1）在菠萝中，分别鉴定到6个ACO和6个GAD家族成员，分别命名为AcACO1~6和AcGAD1~6。生物信息学分析结果显示，AcACOs均具有保守的IPMI结构域；AcACO1、AcACO2均包含15个内含子和14个外显子，AcACO3~6均包含20个内含子和19个外显子；根据motif可以分成两类，AcACO1、AcACO2属于一类，AcACO3~6属于另一类，推测可能具有不同的功能；AcACO1和AcACO2位于20号染色体，AcACO3~6分别位于9、14、19、8号染色体上；AcGADs均具有保守的GAD结构域，AcGAD1、AcGAD3~5均含有7个内含子和6个外显子，AcGAD2含有15个内含子和14个外显子，AcGAD6含有5个内含子和4个外显子；根据motif可以分为3类，AcGAD1属于一类，AcGAD3~5属于一类，而AcGAD6属于一类，其中AcGAD3、AcGAD4为串联重复。
（2）通过qRT-PCR分析高酸品种‘巴厘’和低酸品种‘Josapine’果实中ACOs和GADs在不同发育时期和不同部位的表达特性，结果发现，AcACO1在不同时期‘Josapine’果心、果肉达到表达高峰，而AcACO2、AcACO3、AcACO4、AcACO6在各个时期‘巴厘’均有不同程度的高表达，AcACO5在‘巴厘’成熟期各个部位均有较高的表达；AcGAD1在‘Josapine’的后熟期果心中高表达，AcGAD2在‘巴厘’、‘Josapine’成熟期表达量没有较大差异，AcGAD3~4在‘巴厘’后熟期果肉中高表达，AcGAD5在‘Josapine’的不同时期中高表达，而AcGAD6表达量的最大值在‘巴厘’后熟期果心中。并筛选表达量差异较大的AcACO1和AcGAD5基因作为主要研究对象；克隆AcACO1和AcGAD5的cDNA，并分别连接到pCAMBIA2300-35S-GFP构建超表达载体，转化‘巴厘’愈伤，结果发现转AcACO1和AcGAD5的愈伤组织中，AcACO1和AcGAD5的表达量显著高于对照，柠檬酸含量显著低于对照。可见，AcACO1和AcGAD5在柠檬酸分解反应中发挥重要作用。
（3）根据145份菠萝种质材料的重测序数据，共获得AcACO1 SNP位点8个，AcGAD5 SNP位点10个，按照在染色体上的位置分布，将AcGAD5的SNP位点命名为SNP1-10，AcACO1的SNP位点命名为SNP11-18。将40份柠檬酸含量不同的菠萝种质资源进行分型，结果表明，只有1个SNP（位于菠萝1号染色体AcGAD5基因的9980781位）分型结果较好，种质资源的基因型G/A与柠檬酸酸含量低的菠萝材料数量一致。
另外，菠萝基因组AcGAD5基因及注释数据下载于菠萝基因组数据库（http://pineapple.zhangjisenlab.cn/pineapple/html/index.html）。
本发明另一实施例提供一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对，引物对用于检测上述的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记。
需要说明的是，可以设计引物对检测上述的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记，然后通过检测出的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记基因型，检测菠萝果实柠檬酸含量；该引物对可以通过本领域所已知的方法进行设计得到。
在一些具体实施例中，上述引物对可以优选包括序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物，其中SEQ ID NO.1-2为上游引物，SEQ ID NO.3为反向通用引物。
具体地，SEQ ID NO.1的序列为：
“GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGGCAGGTCCTCCTTGC”，
SEQ ID NO.2的序列为：
“GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGGCAGGTCCTCCTTGT”，
SEQ ID NO.3的序列为：
“CTCGTGAAGAGCATCAACGTGAG”。
本发明再一实施例提供一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂，其包括上述的用于检测菠萝柠檬酸含量的引物对。
需要说明的是，可以将上述的引物对与其他检测辅助试剂混合使用对与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记基因型进行检测，从而检测菠萝果实柠檬酸含量。其中，检测辅助试剂为本领域所已知的，比如缓冲液等试剂。
本发明再一实施例提供一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量或酸度的检测试剂盒，其包括上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对或上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂。
需要说明的是，可以将上述用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对或检测试剂制备成检测试剂盒进行使用，检测试剂盒的形式可以是本领域所已知的，比如除了上述的引物对或检测试剂，还可以包括试剂盒常规的实际瓶、说明书或试剂卡等部件。
本发明再一实施例提供一种用于鉴定菠萝果实柠檬酸含量或酸度的方法，包括：检测上述的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记的基因型，基因型为GG时，菠萝果实为Ⅱ或Ⅲ等级酸度，基因型为G/A时，菠萝果实为I等级酸度。
本发明再一实施例提供一种上述的与菠萝果实柠檬酸相关的SNP分子标记或上述的用于检测菠萝柠檬酸含量的引物对或上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂或上述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂或上述的检测试剂盒在以下（a）-（e）中的任意一种应用：（a）在检测或辅助检测菠萝果实柠檬酸含量高低中的应用；（b）在筛选或鉴定高或低菠萝果实柠檬酸含量中的应用；（c）在菠萝果实柠檬酸含量的早期预测中的应用；（d）在菠萝果实柠檬酸含量分子标记辅助育种中的应用；（e）在菠萝果实柠檬酸含量的种质资源改良中的应用。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
本发明实施例中，通过现有研究中对145份菠萝种质材料重测序数据以及已建立的菠萝种质PARMS 反应体系（高云飞, 林文秋, 吴青松, 等. 菠萝PARMS反应体系的建立[J]. 热带作物学报, 2022, 44(02): 225-232），选取有代表性的总酸含量差异较大的种质资源，测定其成熟果实酸组分和含量，综合分析有机酸数据结果；利用重测序数据获取AcACO1、AcGAD5的SNP位点，设计特异性引物对（见表1）进行扩增，验证能够将这40份菠萝种质区分的位点，开发符合预期的SNP标记。
本发明实施例中，供试的菠萝种质采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所国家热带果树种质资源圃（110°17‘6.18”E, 21°13’40.55”N），选取无病虫害、无机械损伤、果实大小一致的六至八成熟果实用于实时荧光定量实验。取样部位为菠萝果实果皮、果心、果肉和果柄，取样后立即用液氮速冻，置于-80 °C 超低温冰箱中备用。有机酸组分和含量测定的试验材料包括40份菠萝种质，于2021年成熟期采集，每份种质采3个大小一致的果实，取果肉混合均匀后，用液氮冷冻，置于-80 ℃保存。
一、AcACO1和AcGAD5SNP位点分布特征
对AcACO1和AcGAD5进行重测序，根据重测序结果获得AcACO1和AcGAD5基因重测序SNP位点信息（表1），其中，AcACO1有8个SNP，AcGAD5有10个，按照其在染色体上的位置进行命名，详细信息见下表1；拟利用已构建的PARMS-SNP技术验证其在菠萝种质中的分型效果，对应的引物对见表2。
表1 SNP位点信息
| 基因名称 | SNP命名 | 染色体 | 定位 | 碱基 | 碱基 | 密码子 |
| AcGAD5 | SNP1 | contig1 | 9964475 | C | T | Ala/Val |
| AcGAD5 | SNP2 | contig1 | 9964900 | C | T | Ala/Val |
| AcGAD5 | SNP3 | contig1 | 9970871 | G | A | Ser/Asn |
| AcGAD5 | SNP4 | contig1 | 9973404 | G | A | Asp/Asn |
| AcGAD5 | SNP5 | contig1 | 9973488 | G | A | Asp/Asn |
| AcGAD5 | SNP6 | contig1 | 9973492 | T | A | Phe/Tyr |
| AcGAD5 | SNP7 | contig1 | 9973551 | A | G | Ile/Val |
| AcGAD5 | SNP8 | contig1 | 9973623 | G | A | Glu/Lys |
| AcGAD5 | SNP9 | contig1 | 9973680 | G | C | Gly/Arg |
| AcGAD5 | SNP10 | contig1 | 9973692 | A | G | Thr/Ala |
| AcACO1 | SNP11 | contig22 | 8110319 | G | C | Asp/His |
| AcACO1 | SNP12 | contig22 | 8110322 | A | G | Ile/Val |
| AcACO1 | SNP13 | contig22 | 8110323 | T | C | Ile/Thr |
| AcACO1 | SNP14 | contig22 | 8110391 | G | T | Ala/Ser |
| AcACO1 | SNP15 | contig22 | 8110410 | C | T | Ala/Val |
| AcACO1 | SNP16 | contig22 | 8110416 | C | G | Ser/Trp |
| AcACO1 | SNP17 | contig22 | 8112540 | G | T | Ser/Ile |
| AcACO1 | SNP18 | contig22 | 8114771 | T | C | Phe/Ser |
表2 各SNP标记检测引物对
| 8110323-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtctgttttgaagaaggaattcgatAT |
| 8110323-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtctgttttgaagaaggaattcgatAC |
| 8110323-PC | CGACATCTGTGAGCACTAATTGAG |
| 8114771-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCCCTGCGGATGAAACTACATT |
| 8114771-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCCCTGCGGATGAAACTACATC |
| 8114771-PC | ACTACAGCTATATCTCTTAGGCGC |
| 8110931-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTGCAATGAGAAAGGTCCTTG |
| 8110931-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGTGCAATGAGAAAGGTCCTTT |
| 8110931-PC | CGCAGAACAGACCATAGATCAAGT |
| 8110322-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTatctgttttgaagaaggaattcgatA |
| 8110322-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTatctgttttgaagaaggaattcgatG |
| 8110322-PC | CGACATCTGTGAGCACTAATTGAG |
| 8110416-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGCTGGAGAACGCGGCG |
| 8110416-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGCTGGAGAACGCGGCC |
| 8110416-PC | gaaggaattcgatATTGGCTCGTC |
| 8112540-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGGATATCTTGAGGGACTTCTGTAG |
| 8112540-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGATATCTTGAGGGACTTCTGTAT |
| 8112540-PC | ATTACAACTTTTTGGGAGGGCAAG |
| 8110319-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTtgatatctgttttgaagaaggaattcG |
| 8110319-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTtgatatctgttttgaagaaggaattcC |
| 8110319-PC | CGACATCTGTGAGCACTAATTGAG |
| 9973488-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACGAGTTCGAGGTCTCCG |
| 9973488-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACGAGTTCGAGGTCTCCA |
| 9973488-PC | CTGAAGTCCTCGCGGATGAC |
| 9964475-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATCTAAAACGGAAGCAAAAATGGC |
| 9964475-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTAAAACGGAAGCAAAAATGGT |
| 9964475-PC | TGCCATAAATTGATCATCACCTAGG |
| 9973623-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCCTCGTCTACGACATCG |
| 9973623-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGCCTCGTCTACGACATCA |
| 9973623-PC | GCCGTTCTGCAGCAGCTG |
| 9973551-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACGCGGAGGACGGTGAT |
| 9973551-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACGCGGAGGACGGTGAC |
| 9973551-PC | GAGTTCGAGGTCTCCGACTTC |
| 9973492-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAGTTCGAGGTCTCCGACTT |
| 9973492-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAGTTCGAGGTCTCCGACTA |
| 9973492-PC | CTGAAGTCCTCGCGGATGAC |
| 9970871-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCGGCAGGTCCTCCTTGC |
| 9970871-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCGGCAGGTCCTCCTTGT |
| 9970871-PC | CTCGTGAAGAGCATCAACGTGAG |
| 9973404-P1 | GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCGTCCTTGGAGACGATGTC |
| 9973404-P2 | GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCGTCCTTGGAGACGATGTT |
| 9973404-PC | ATCTTTCTTGTGTTTGCACTGGAC |
二、AcACO1和AcGAD5 SNP位点基因型的鉴定
通过已建立的PARMS-SNP分型技术，从保存的酸度不同的40份种质资源中提取DNA，利用开发的 PARMS-SNP标记对这些菠萝种质材料进行分型，虽然AcACO1和AcGAD5一共有18个SNP位点可供筛选，但只有AcGAD的3个SNP分型结果较好（见图1a、图1b和图1c）。
按照在染色体上的定位分布命名为SNP3、SNP7、SNP8，SNP3区分的GG基因型种质材料有36份，杂合基因型G/A有4份，分别为野生种（法）、Giant Kew、印度引不知名2和Josapine；SNP7能够区分3种基因型，AA、GG和A/G，大多数种质材料为AA基因型，GG和A/G基因型只有2份种质材料，野生种（法）为GG基因型，Phetchaburi#2为A/G基因型；SNP8也能够区分3种基因型，分别为GG、AA、G/A，其中GG基因型种质材料有22份，G/A有9份，AA有2份，AA基因型包括台农23号和Tradsrithong。
三、综合分析菠萝种质资源果实有机酸
（1）菠萝果实中有机酸组分及含量分析
所检测的40份菠萝种质资源中可知，不同酸组成的变异系数为25.92%~133%，遗传多样性指数为 3.91~5.32，菠萝种质之间有机酸组分的差异明显（见表3）。
表3 40份菠萝种质资源果实有机酸组分含量分析
| 参数 | W（草酸）(mg·g-1) | W(苹果酸) (mg·g-1) | W（柠檬酸） (mg·g-1) | W（乙酸）(mg·g-1) | W（富马酸）(mg·g-1) | W（总酸）(mg·g-1) |
| 最大值 | 0.48 | 3.65 | 8.66 | 2.31 | 0.16 | 9.45 |
| 最小值 | 0.01 | 0.99 | 1.52 | 0.23 | 0.002 | 2.54 |
| 平均值 | 0.11 | 1.91 | 5.36 | 0.74 | 0.03 | 8.1 |
| 标准差SD | 0.08 | 0.5 | 1.46 | 0.51 | 0.04 | 1.8 |
| 变异系数CV/% | 79.45 | 26.19 | 27.35 | 70.24 | 153 | 22.26 |
| 多样性指数 | 4.61 | 5.32 | 5.26 | 5.03 | 3.91 | 5.29 |
其中，有机酸含量最多的品种是 Fresh Premium，总酸含量为 14.37 mg·g-1，含量最少的是野生种（法），仅为4.91 mg·g-1，本次试验的菠萝种质总酸含量平均值为6.18mg·g-1，遗传多样性指数为5.29，变异系数为27.99%。菠萝果实酸含量最高的组分是柠檬酸，其次为苹果酸和乙酸，分别占总酸的86.73%、30.58%和11.97%，而草酸和富马酸的含量较低。果实中草酸含量变化范围在0.01~0.48 mg·g-1，变异系数为100%，遗传多样性指数为4.61，含量较高的菠萝种质资源有上海2号、印度不知名2、Josapine、New Puket等；苹果酸含量变化范围在0.99~3.65 mg·g-1，变异系数为25.92%，遗传多样性指数为5.32，含量较高的菠萝种质有Fresh Premium、上海2号、Ripley、马来西亚引未知名2号、印度不知名2等；富马酸含量变化范围在0.002~0.16 mg·g-1，变异系数为 153%，变化幅度最大，遗传多样性指数为 3.91，含量较高的菠萝种质资源有马来西亚引未知名2、上海2号、New Puket、FreshPremium等；柠檬酸含量变化范围在1.52~8.66 mg·g-1，变异系数为27.24%，遗传多样性指数为5.26，含量高的菠萝种质资源有Fresh Premium、DN1、杂233、无刺卡因、QueenslandCayenne等；乙酸含量变化范围在0.23~2.31mg·g-1，变异系数为 68.91%，含量较高的菠萝种质资源有MacGregor有刺、巴厘、Pulae、杂233。此外，台农21号、Phetchaburi#1、Puket、印度皇后、James Queen、台农17号等8份菠萝种质资源不含富马酸，而巴厘、QueenslandCayenne、Phetchaburi#1、DN5、Tradsrithong 等6份菠萝种质不含草酸。
（2）菠萝果实酸组分的频率分布情况
由图2a、图2b、图2c、图2d、图2e和图2f可知，菠萝苹果酸和柠檬酸是呈连续变异，频率分布呈正态分布，菠萝苹果酸和柠檬酸属于微效多基因控制的数量性状遗传；草酸、乙酸和富马酸含量都呈不连续变异，频率分布没有呈现正态分布，推测菠萝草酸、乙酸和富马酸的遗传有可能是由主效基因和多个微效基因共同控制的复杂遗传。
所检测的菠萝种质资源中，由表3和图图2a、图2b、图2c、图2d、图2e和图2f可知，柠檬酸和苹果酸的含量呈正态分布，其他酸组分呈非正态分布，此次检测的40个凤梨种质资源中，未检出富马酸的凤梨种质占52.2%，因此样本数量不足以进行正态分布检测。
如表4所示，正态分布检验表明除柠檬酸以外的其他组分的偏度均大于0，表明右侧高酸的离散程度较左侧的低酸的离散程度更大，而正态分布检验也表明所有的峰度均大于0，且草酸的峰度为10.32，表明草酸含量分布较为集中，而其他组分含量分布较为离散。菠萝种质中草酸含量主要分布在0.65~0.15 mg·g-1，苹果酸含量主要集中在1.91 mg·g-1，各个频率分布差距不大；乙酸含量主要集中在0.49，约占总体样本的35.8%；富马酸含量最低，集中分布在0.01 mg·g-1，约占总体的84.2%；柠檬酸含量最高，主要分布在6.09 mg·g-1，约占总体的66.17%。从总体上看，这些菠萝种质的柠檬酸含量比较高，从而大大改善菠萝的风味。柠檬酸是一种能增加食物风味的高效抗氧化剂，同时可以清除体内的一些活性氧基团和自由基，在增强免疫功能和预防癌症的同时，能很好地保护细胞免受氧化损害，而苹果酸口感圆润，略带涩味和苦味，缓慢但刺激持久，对褐变有一定的抵御效果。
表4 酸组分含量正态分布检验的偏度和峰度
| 性状 | 偏度 | 峰度 |
| 草酸Oxalic acid | 2.58 | 10.32 |
| 苹果酸Malic acid | 1.28 | 2.96 |
| 柠檬酸Citric acid | -0.26 | 0.67 |
| 乙酸Acetic acid | 1.27 | 0.88 |
| 富马酸Fumaric acid | 1.31 | 0.63 |
（3）菠萝果实中有机酸组分相关性分析
从表5和图3中可以看出，菠萝种质资源有机酸组分之间存在复杂的相关性。与柠檬酸含量关联度最大的是有机酸含量，相关系数为0.941。另外，富马酸含量与草酸含量和苹果酸含量呈显著正相关，而与乙酸含量呈显著负相关；总酸含量与柠檬酸含量、乙酸含量、苹果酸含量呈显著正相关。由结果显示的相关关系可知，菠萝种质中柠檬酸和苹果酸含量高的品种，其总酸含量也高；而乙酸含量高的品种，其总酸普遍不高；由于柠檬酸含量和总酸含量之间的相关系数最大，说明总酸的含量很大程度上是由柠檬酸的含量决定。
表5 40 份菠萝种质酸组分相关性
| 性状 | 草酸OA | 苹果酸MA | 乙酸AA | 柠檬酸CA | 富马酸FA | 总酸TAC |
| 草酸OA | 1 | |||||
| 苹果酸MA | 0.315 | 1 | ||||
| 乙酸AA | -0.122 | -0.233 | 1 | |||
| 柠檬酸CA | -0.159 | 0.146 | 0.079 | 1 | ||
| 富马酸FA | 0.580** | 0.496*** | -0.429* | 0.197 | 1 | |
| 总酸TAC | -0.029 | 0.354* | 0.437** | 0.941** | 0.233 | 1 |
表中，**在p≤0.01级别（双尾），相关性显著；*在p≤0.05级别（双尾），相关性显著。
（4）菠萝果实酸组分与总酸的回归分析
如图4a、图4b、图4c、图4d和图4e所示，为进一步直观显示菠萝种质各酸组分和总酸之间的关系，绘制了回归图像，柠檬酸含量分布和总酸的关系呈直线性，而苹果酸、草酸、乙酸和富马酸的分布都比较离散。
（5）菠萝果实柠檬酸含量统计分类图
对收集的 40份菠萝种质资源的柠檬酸含量进行统计分析，发现可将种质分为3个等级，第Ⅰ等级柠檬酸含量在4 mg·g-1以下，第Ⅱ等级柠檬酸含量在4~6 mg·g-1，第Ⅲ等级柠檬酸含量6 mg·g-1以上。由图5可知第一等级所包含的菠萝种质最少，其柠檬酸含量范围是1.52~3.21 mg·g-1，分别是野生种（法）Jasopine、Giant Kew和印度引不知名2。第Ⅱ等级包含22份种质资源，这一类的菠萝种质主要包括巴厘、MD-2和台农17号等品种，其柠檬酸含量范围是4.04~5.96 mg·g-1，是3个等级中最多的一类种质材料；第Ⅲ等级的菠萝材料有14份，包括上海2号、无刺卡因、印度皇后等，其柠檬酸含量在6~9 mg·g-1之间。
四、AcGAD5的SNP位点基因型与柠檬酸含量关联分析
SNP位点的变异导致编码氨基酸的变化，在比较AcACO1和AcGAD5的SNP位点基因型鉴定结果中发现，AcGAD5位点为9970871的SNP，能够较好区分40份柠檬酸含量差异较大的种质，按照不同酸度区分为两大类（图6），基因型为GG的菠萝种质材料有36份，均为Ⅱ、Ⅲ等级酸度；而基因型G/A的材料有4份，均为第Ⅰ等级酸度。基因型G/A的种质材料包括野生种（法）、Josapine、Giant Kew、印度不知名2共4份种质，它们的柠檬酸含量在1.52~3.21 mg·g-1之间，总酸含量范围是4.91~6.361 mg·g-1，属于40份种质中的低酸品种，基因型GG的种质材料属于中高酸品种。因此，可以得知，基因型G/A的种质材料，其柠檬酸和总酸含量比基因型GG的低。
综上所述，菠萝种质材料酸度差异较大，酸度是影响口感最主要的因素之一，在本研究中，一共测定了40份菠萝种质资源酸组分和含量，数据分析结果表明，菠萝有机酸主要成分是柠檬酸，柠檬酸含量分布在1.52~8.66 mg·g-1范围，柠檬酸和总酸呈显著正相关关系。利用已建立的菠萝PARMS-SNP技术体系，在18个位点中得到1个SNP位点与菠萝种质资源有机酸聚类结果相似，说明SNP3导致AcGAD5在菠萝种质间的表达差异，从而导致种质间柠檬酸含量的差异。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (5)
1.一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对，其特征在于，引物对用于检测与菠萝柠檬酸相关的SNP分子标记；引物对包括序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物，其中SEQ IDNO.1-2为上游引物，SEQ ID NO.3为反向通用引物。
2.一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的用于检测菠萝柠檬酸含量的引物对。
3.一种用于检测菠萝果实柠檬酸含量或酸度的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对或权利要求2所述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂。
4.一种用于鉴定菠萝果实柠檬酸含量或酸度的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的引物对检测与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记的基因型，基因型为GG时，菠萝果实为Ⅱ或Ⅲ等级酸度，基因型为GA时，菠萝果实为I等级酸度。
5.权利要求1所述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的引物对或权利要求2所述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂或权利要求3所述的用于检测菠萝果实柠檬酸含量的检测试剂盒在以下（a）-（d）中的任意一种应用；引物对或检测试剂或检测试剂盒用于检测与菠萝果实柠檬酸含量相关的SNP分子标记基因型，基因型为GG时，菠萝果实为Ⅱ或Ⅲ等级酸度，基因型为GA时，菠萝果实为I等级酸度；
（a）在检测或辅助检测菠萝果实柠檬酸含量高低中的应用；
（b）在筛选或鉴定高或低菠萝果实柠檬酸含量中的应用；
（c）在菠萝果实柠檬酸含量的早期预测中的应用；
（d）在菠萝果实柠檬酸含量分子标记辅助育种中的应用。
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