CN116516036A - 一种lamp法检测菠萝泛菌的引物和探针组合及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种LAMP法检测菠萝泛菌的引物和探针组合及应用。本发明引物和探针组合是在对泛菌属细菌及水稻常见病原菌基因组序列进行生物信息学分析的基础上，筛选了菠萝泛菌的物种特异性基因并设计、验证得到，具有高度的物种特异性。本方法采用环介导恒温扩增技术进行靶标基因的LAMP恒温扩增，采用分子信标探针只有与互补序列结合才打开二级结构产生荧光信号的特点，实现扩增产物的可视化检测，降低了对仪器设备的要求，降低了操作难度。综上所述，本发明的菠萝泛菌快速检测和鉴定方法具有准确、操作简便、快速，对操作人员要求不高等优点，较传统的分离培养鉴定方法具有更高的可重复性，可行性和时效性。

Description

一种LAMP法检测菠萝泛菌的引物和探针组合及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LAMP法检测菠萝泛菌的引物和探针组合及应用。
背景技术
近年来，一种病症与传统白叶枯病极其相似的新型细菌性病害在多省份爆发流行。该病在水稻分蘖后期开始发病，从叶片顶端沿叶缘一边或两边向下扩展，病健交界明显；病斑呈黄褐色，后期叶片顶端病斑变灰色且卷缩。病原菌的分离和鉴定表明，该新型白叶枯病的致病菌为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，属于泛菌属。菠萝泛菌引起的新型白叶枯病症与黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的白叶枯病症非常相似，肉眼难以区分。传统的病原分离方法耗时费力，且专业技能要求高。因此，亟需开发一种快速简便的病原菌快速诊断技术。
LAMP法是一种恒温扩增技术，因其扩增操作简便、快速、不需要专业精密仪器等优点，成为近年来动植物疾病检测的主要手段。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃左右可以大量合成目标DNA。扩增产物的检测一般可采用琼脂糖凝胶电泳法、浊度观察法、实时荧光扩增曲线检测法、终点荧光染料目测法、染料变色法等。其中浊度观察法及实时荧光扩增曲线检测法所需仪器较为精密，不易在田间地头应用；琼脂糖凝胶电泳法和终点荧光染料目测法因需反应后开盖，容易造成气溶胶污染产生假阳性。因此，不影响聚合酶活性的羟基萘酚蓝(HNB)染料变色法成为了近年来LAMP扩增产物的主要检测方法。HNB是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为紫色，阳性时为天蓝色，不需要开盖就可以通过裸眼观察并判断。但笔者多年的试验表明，LAMP-HNB法对反应液的PH值要求比较高，不同纯度的DNA模板会影响颜色变化，因此不适用于对粗组织液的检测。
分子信标是具有发夹结构的荧光探针，长约17-30bp，两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，在特定靶DNA存在的情况下，MB的空间构象发生变化产生荧光；在没有特异性靶DNA的情况下，荧光基团和淬灭基团靠的很近，荧光被淬灭。LAMP的反应条件为60-65℃，在此温度下，双链DNA在半解离状态下保持动态平衡。这使MB有机会直接与扩增的特异性LAMP产物杂交，从而打开发夹结构并发射可检测的荧光信号，而没有目标扩增产物就无法产生荧光信号。将MB发光原理与LAMP扩增技术相结合，通过蓝光仪进行终点法荧光检测，即可解决开盖引起气溶胶污染及非特异扩增造成假阳性的问题。
发明内容
本发明目的是针对目前水稻白叶枯病病原菌传统分离培养技术周期长、专业技能要求高、仪器设备要求高等问题，提供了一种新型叶枯病原菌的快速检测方法，达到特异性强、灵敏度高、快速简便，现场即时检测的目的。
一种LAMP法检测菠萝泛菌的引物和探针组合，包括：
上游外引物F3：5’-CGAAACCGTAACGGAAAACG-3’；
下游外引物B3：5’-AACTCACCGGCTTCCTCC-3’；
上游内引物FIP：5’-CCGAATGTAGGGCTCAAACCGGGGCGTGAGCGACTCTTCT-3’；
下游内引物BIP：5’-AGATCCTGGCAGGACGCGATGGTTTCCTGCTGCCACATC-3’；
分子信标探针MB：5’-NED-CCATGCATCATCGCTACCCAGCATGG-BHQ2-3’。
本发明又提供了所述引物和探针组合在制备LAMP法检测菠萝泛菌的试剂盒中的应用。
本发明又提供了一种LAMP法检测菠萝泛菌的试剂盒，包括所述引物和探针组合。
优选的，所述的试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为包含SEQ ID No.1所示序列的质粒。
优选的，所述的试剂盒还包括LAMP检测的酶、缓冲液、dNTP、甜菜碱和MgSO4。
本发明还提供了一种LAMP法检测菠萝泛菌的方法，包括以下步骤：
(1)以待检测样品中的DNA作为扩增模板，使用所述引物和探针组合进行LAMP扩增检测，
(2)检测产物的荧光信号，如果有荧光信号，说明待检测样品中含有菠萝泛菌。
优选的，待检测样品为水稻叶片。取水稻叶片后，加水研磨后即可用于LAMP扩增检测。当然也可以先提取检测样品中的DNA，再用于扩增检测，但这样会增加提取DNA的步骤。
优选的，步骤(2)检测产物的荧光信号时，使用蓝光仪检测并肉眼观察鉴定，所述蓝光仪激发波长设置为450-488nm，发射波长为510-530nm。
LAMP扩增反应的检测体系成分组成：
优选的，LAMP扩增反应程序为65℃保温40～60min。
本发明的有益效果：
本发明是在对泛菌属细菌及水稻常见病原菌基因组序列进行生物信息学分析的基础上，筛选了菠萝泛菌的物种特异性基因并设计引物开发的试剂盒，具有高度的物种特异性。本方法采用环介导恒温扩增技术进行靶标基因的LAMP恒温扩增，采用分子信标探针只有与互补序列结合才打开二级结构产生荧光信号的特点，实现扩增产物的可视化检测，降低了对仪器设备的要求，降低了操作难度。综上所述，本发明的菠萝泛菌快速检测和鉴定方法具有准确、操作简便、快速，对操作人员要求不高等优点，较传统的分离培养鉴定方法具有更高的可重复性，可行性和时效性。
附图说明
图1为菠萝泛菌检测分子信标探针二级结构示意图。
图2为LAMP-MB方法灵敏性分析结果图，其中BL为空白对照。
图3为特异性分析时终点法荧光检测结果图，其中“-”管：ddH2O，“+”管：菠萝泛菌基因组DNA，其余管为对应病原菌样本。
图4为特异性分析时实时荧光检测结果图，其中，以检测终点看，上方的11条曲线为阳性对照和10个菠萝泛菌株系样本，下方的4条曲线为阴性对照、黄单胞杆菌、细条病菌及分散泛菌样本。
图5为特异性分析时电泳检测结果图，其中，泳道“-”：ddH2O；泳道“+”：菠萝泛菌基因组DNA，泳道“M”为标准分子量Marker，其余泳道为对应病原菌样本。
图6为水稻叶片样本检测结果图，其中(A)：水稻叶片样本S1～S6；(B)：荧光检测结果，其中，“-”管：ddH2O；“+”管：菠萝泛菌基因组DNA。
具体实施方式
实施例1
物种特异性基因筛选。
在GenBank下载19种菠萝泛菌同属病原菌及水稻常见病原菌的Refseq序列(表1)，并建立本地数据库。以菠萝泛菌(Pantoea ananatis)为search序列，其他18种病原菌为subject序列，利用本地blast程序筛选菠萝泛菌物种特异性基因。
表1用于菠萝泛菌物种特异性基因筛选的本地病原菌数据库
在GenBank下载菠萝泛菌不同株系的Refseq序列(截至2022年4月17日，共144个)(https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/bacteria/Pantoea_ananatis)，并建立本地数据库。利用本地blast程序提取上一步中筛选出的物种特异性基因，然后再利用multiple alignment程序分析所选择物种特异性基因在不同株系中的保守性，分析其SNP位点。选择SNP较少的基因作为靶标基因。比对结果表明，TetR family transcriptionalregulat or(WP_176017911.1)基因仅存在于菠萝泛菌中，且在144个株系中都存在，SNP位点少，因此被选为靶标基因。
实施例2
引物及探针的设计。
选择WP_176017911.1基因保守性高的片段，利用LAMP引物在线设计软件进行LAMP内外引物及环引物设计(https：//primerexplorer.jp/e/)。根据分子信标探针设计原则，以环引物为基础序列，设计分子信标。设计2对特异性引物和1条分子信标探针。图1为菠萝泛菌检测分子信标探针二级结构示意图。序列如下：
靶标序列：CGAAACCGTAACGGAAAACGCCAGCTGGCGTGAGCGACTCTTCTCCATGCTGGGTAGCGATGATGGCCGGTTTGAGCCCTACATTCGGTTGTGGCGCGAAGCCCAGATCCTGGCAGGACGCGATGCAGAAATGCGCGGCGCCTATATCGTTGCAATGGAGATGTGGCAGCAGGAAACCGTCGCCGTCATCAAGGCGGGGGAGGAAGCCGGTGAGTT；
上游外引物(F3)：5’-CGAAACCGTAACGGAAAACG-3’；
下游外引物(B3)：5’-AACTCACCGGCTTCCTCC-3’；
上游内引物(FIP)：5’-CCGAATGTAGGGCTCAAACCGGGGCGTGAGCGACTCTTCT-3’；
下游内引物(BIP)：5’-AGATCCTGGCAGGACGCGATGGTTTCCTGCTGCCACATC-3’；
分子信标探针(MB)：5’-NED-CCATGCATCATCGCTACCCAGCATGG-BHQ2-3’。
进行LAMP扩增，根据反应产物的荧光有无判断水稻有无被菠萝泛菌侵染，包括以下步骤：
(1)水稻叶片组织DNA的获取：将水稻叶片剪碎放入1.5mL离心管中，加入200～500μL无菌水，用研磨棒碾碎，其水溶液即可作为检测模板。
(2)LAMP反应体系如表2所示，使用Haigene(A3801-01)试剂盒(哈尔滨新海基因检测有限公司)，反应体系总共10μL。
表2
H2O 3.2
MgSO4(100mM) 0.4
10×Buffer(Mg2+6mM) 1
dNTP(10mM) 1.4
甜菜碱Betaine(5M) 0.4
F3/B3 Mix(5μM) 0.4
FIP/BIP Mix(10μM) 1.6
MB(10μM) 0.2
酶Bst 2.0(8U/μL) 0.4
DNA模板(10ng/μL) 1
(3)LAMP反应程序：65℃保温40～60min。
(4)扩增产物的终点荧光检测
可利用蓝光仪根据信号强度用肉眼观察鉴定。所述蓝光仪激发波长设置为450-488nm，发射波长为510-530nm。若反应单元能够观察到明显黄色荧光信号，说明水稻叶片样品已被菠萝泛菌侵染；若无明显黄色荧光信号，说明水稻叶片样品未被菠萝泛菌侵染。
实施例3
灵敏度分析。
将菠萝泛菌DNA进行10倍等比稀释，取终浓度为2pg/μL、20pg/μL、200pg/μL、2ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL的DNA作为模板，测试了本发明所建立检测体系的灵敏性。检测结果表明(图2)，随着DNA模板浓度的增加，荧光出现时间越早，且荧光越强。65℃恒温扩增40分钟的情况下，该体系对菠萝泛菌的最低检测限(Limit of detection，LOD)为2pg/μL。上述结果说明，本发明所建立的菠萝泛菌快速定性监测体系灵敏度较高。
实施例4
特异性分析。
以水为阴性对照，菠萝泛菌纯DNA(10ng/μL，由菠萝泛菌提取的总DNA)为阳性对照，以分离自不同地点的菠萝泛菌、其他泛菌属细菌及水稻白叶枯病菌及细条病菌等13个株系(如表3所示)的菌液为模板，测试了本发明所建立检测体系的特异性。
检测结果表明(图3～图5)，10个菠萝泛菌株系及阳性对照的反应管都可以观察到明显的黄色荧光，而阴性对照、黄单胞杆菌、细条病菌及分散泛菌都无明显黄色荧光。电泳结果也表明，只有10个菠萝泛菌株系样本有明显的梯形条带。与终点法荧光显色及电泳结果相同，实时荧光检测结果表明，只有10个菠萝泛菌株系样本有明显的扩增曲线，而阴性对照、黄单胞杆菌、细条病菌及分散泛菌样本在50分钟内都无明显黄色荧光。上述结果说明，本发明所建立的菠萝泛菌快速定性监测体系特异性强。
表3用于LAMP-MB方法特异性分析的病原菌信息
实施例5
实用性分析。
使用本发明所建立的LAMP-MB方法对取自温室的6个叶片进行检测，并与荧光定量分子检测结果进行比较，验证方法的准确度及实用价值。
检测结果表明(图6)，空白对照与三个未接菌稻叶样本(S1～S3)的反应管未显示明显黄色荧光，而阳性对照与三个接菌菠萝泛菌的稻叶样本(S4～S6)的反应管均有明显的黄色荧光，与荧光定量检测结果相符。

Claims (9)

1.一种LAMP法检测菠萝泛菌的引物和探针组合，其特征在于，包括：
上游外引物F3：5’-CGAAACCGTAACGGAAAACG-3’；
下游外引物B3：5’-AACTCACCGGCTTCCTCC-3’；
上游内引物FIP：5’-CCGAATGTAGGGCTCAAACCGGGGCGTGAGCGACTCTTCT-3’；
下游内引物BIP：5’-AGATCCTGGCAGGACGCGATGGTTTCCTGCTGCCACATC-3’；
分子信标探针MB：5’-NED-CCATGCATCATCGCTACCCAGCATGG-BHQ2-3’。
2.权利要求1所述引物和探针组合在制备LAMP法检测菠萝泛菌的试剂盒中的应用。
3.一种LAMP法检测菠萝泛菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照为包含SEQ ID No.1所示序列的质粒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括LAMP检测的酶、缓冲液、dNTP、甜菜碱和MgSO4。
6.一种LAMP法检测菠萝泛菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待检测样品中的DNA作为扩增模板，使用权利要求1所述引物和探针组合进行LAMP扩增检测，
(2)检测产物的荧光信号，如果有荧光信号，说明待检测样品中含有菠萝泛菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待检测样品为水稻叶片。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)检测产物的荧光信号时，使用蓝光仪检测并肉眼观察鉴定，所述蓝光仪激发波长设置为450-488nm，发射波长为510-530m。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，LAMP扩增反应程序为65℃保温40～60min。
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