CN109097449B - 一种基于金属钌配合物的实时荧光lamp检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒，通过对金属钌配合物性质进行考察，优化LAMP扩增及荧光检测的条件，最终建立了一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法及相应的试剂盒。利用该检测方法，可以收集到实时荧光曲线，实现样品中特异核酸序列的定性检测，进一步建立标准工作曲线可以实现定量检测，并且通过熔解曲线的分析可以验证扩增反应的特异性和实现多重LAMP检测。本发明具有灵敏度高、操作简单、快速、准确、适用范围广等特点，可进行大面积推广及应用。

Description

一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学核酸检测领域，具体涉及将金属钌配合物用作环介导等温核酸扩增(LAMP)的实时荧光检测染料，实现对目标核酸的快速、闭管定性和定量分析。
背景技术
核酸是生命遗传物质的携带者和传递者，在食品安全、环境监测等领域，对核酸分子的检测具有至关重要的作用。环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermalamplification of DNA)简称LAMP，是2000年由Notomi等人发明的一种核酸扩增技术，该技术主要利用特异性识别靶基因的六个区域的两对引物和具有链置换活性的聚合酶，大大节省反复升降温的时间，实现在恒温条件下高效扩增，其灵敏度和扩增产物量比传统PCR高出1个数量级。由于环介导等温核酸扩增是由两对引物针对靶基因上六个区域进行识别，使其扩增反应具有极高的特异性；Bst DNA聚合酶在高温持续链置换扩增反应，大大节省扩增时间，具有高效快速的特点。
LAMP产物检测主要分为定性和定量两大类，定性检测较为直观且不需要大型仪器，但无法实现对核酸的定量以及扩增产物假阳性的判断。实时荧光LAMP的基本原理是随着反应不断进行，双链DNA的量随之增多，与DNA结合的荧光染料也越来越多，荧光强度随之增强，且信号强度与生成DNA量成正比。通过实时荧光检测系统对荧光信号的记录来实时监测整个反应的扩增情况，再通过对扩增产物进行熔解曲线分析得到产物的片段大小，同时对引物二聚体等非目标序列进行区分。常用的荧光染料如SYBR Green I和EvaGreen是受专利保护、成本较高的进口商品化试剂。且SYBR Green在使用的过程中对LAMP扩增反应存在较大的抑制和信噪比较低等问题。所以，有必要开发经济环保、光稳定性好、实用性强的新型荧光染料应用于LAMP核酸检测和便携试剂盒中。
Barton课题组在20世纪90年代初发现了[Ru(bpy)2(dppz)]2+对双链DNA的分子光开关效应(J.Am.Chem.Soc.1990,112,4960)，且钌多吡啶配合物具有丰富的光物理、光化学、以及电化学性质和优良的水溶性、稳定性、生物低毒性等特点(Dalton Trans.2016,45(34),13261)。配合物水溶液本身不发光，当加入双螺旋DNA后显示强发光现象，对扩增反应具有一定的灵敏度。
华南师范大学周小明课题组将[Ru(phen)2dppz]2+配合物用于LAMP扩增产物的荧光比色检测(ACS Appl.Mater.Interfaces 2018,10(5),4494)。但是该方法建立在纸芯片平台上，开放的环境极易造成污染，影响实验的可靠性甚至直接导致实验失败；并且只能在LAMP扩增终点定性的判断LAMP是否扩增，无法实现对扩增过程的实时监测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法及试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法，该检测方法包括以下步骤：
将核酸样品加入到包含有特异性引物(例如，多重LAMP反应的引物组)的实时荧光LAMP反应体系中，以金属钌配合物作为所述实时荧光LAMP反应体系中的染料组分；以核酸样品作为所述实时荧光LAMP反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序进行实时荧光LAMP的扩增反应和熔解反应，反应结束后分析扩增曲线和熔解曲线，根据循环阈值定性判别核酸样品中是否存在扩增的靶序列，并根据熔解温度识别非特异扩增产物及区分不同的扩增靶序列，从而实现定性特别是特异性地识别多重LAMP扩增产物的靶标来源的检测。
优选的，所述检测方法还包括以下步骤：以核酸样品拷贝数不同的多个标准品以及未知拷贝数的核酸样品分别作为所述实时荧光LAMP反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序分别进行针对标准品中特定靶序列片段的实时荧光LAMP的扩增反应，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的核酸拷贝数，实现定量检测。
优选的，上述检测方法通过熔解温度区分特异性扩增产物和非特异性扩增产物，根据熔解温度差异特异性地识别多重LAMP扩增产物的靶标来源。
优选的，上述检测方法为闭管反应，所有样品和反应试剂加入后，后续任何的扩增和检测实验步骤均不需要开管操作。
优选的，所述金属钌配合物在实时荧光LAMP反应体系中的终浓度为0.5-5μM。所述反应体系的终体积为10-20μL。
优选的，所述金属钌配合物选自[Ru(bpy)2(dppz)]2+等钌多吡啶配合物中的一种；为了增强LAMP分析性能，或选自对钌多吡啶配合物的bpy、dppz等配体进行进一步结构修饰获得的其它具有核酸分子光开关行为的金属钌配合物中的一种。
优选的，所述实时荧光LAMP的扩增反应中，利用一定的荧光通道采集信号，荧光通道的荧光激发波长和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，根据该信号获得所述标准品或未知拷贝数的核酸样品的循环阈值。
优选的，若核酸样品为RNA，则扩增前将提取的RNA反转录为DNA。
优选的，所述扩增反应的反应程序为：于60-68℃恒温反应60-70分钟。
优选的，核酸样品利用试剂盒提取并纯化得到。
所述检测方法具体包括以下步骤：
1)引物的合成以及模板DNA的提取
根据选定的扩增靶序列进行至少一组内引物和至少一组外引物的设计及合成，用试剂盒法快速提取基因组DNA作为扩增模板；根据模板与引物可设置扩增反应的程序；
2)配制实时荧光LAMP反应体系
将LAMP扩增试剂、内引物、外引物、扩增模板及上述金属钌配合物加入PCR反应管中，用水补齐至终体积；LAMP扩增试剂包括终浓度为1.2-1.6mM的dNTP、0.6-0.8M的甜菜碱、镁离子(优选3-6mM的硫酸镁)和3-5U的Bst DNA聚合酶；反应体系中含有终浓度为1.5-1.7μM的内引物及0.15-0.25μM的外引物和1-200ngng扩增模板。
3)以已知初始浓度的DNA样品为模板进行环介导等温核酸扩增，在扩增反应中进行信号收集，荧光信号的收集通道为：激发波长400-500nm，发射波长550-750nm；然后根据收集的信号建立扩增曲线，由扩增曲线确定该DNA样品的循环阈值；
4)重复步骤3)，得到不同初始浓度的DNA样品各自的循环阈值，结合对应DNA样品的浓度建立标准曲线；
5)按照步骤3)，以未知初始浓度的DNA样品为模板进行环介导等温核酸扩增，获得相应的循环阈值并带入步骤4)建立的标准曲线中，从而计算得到该DNA样品的初始浓度；
6)有需要时对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。
一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括用于构建LAMP反应体系的扩增试剂及上述金属钌配合物，扩增试剂包括终浓度为1.2-1.6mM的dNTP、0.6-0.8M的甜菜碱、镁离子(优选3-6mM的硫酸镁)和3-5U的Bst DNA聚合酶。
本发明的有益效果体现在：
本发明将金属钌配合物与LAMP技术相结合，建立基于金属钌配合物(例如，[Ru(bpy)2(dppz)]2+)的实时荧光环介导等温核酸扩增的检测方法及试剂盒，具有检测灵敏度高、结果准确、便宜易得等特点，可应用于实时荧光LAMP定性、定量检测中，达到了真正意义上的实时荧光闭管扩增与检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1A为金属钌配合物([Ru(bpy)2(dppz)]2+)在70℃孵育时荧光信号的稳定性。
图1B为[Ru(bpy)2(dppz)]2+作为荧光染料时对LAMP扩增反应的抑制性电泳图。
图2A为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的实时荧光LAMP扩增曲线。
图2B为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的实时荧光LAMP熔解曲线。
图2C为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的实时荧光LAMP扩增产物凝胶电泳图；图中：+表示菌DNA，-表示无模板对照，M表示Marker。
图3A为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的模板浓度梯度扩增曲线。
图3B为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的模板浓度梯度熔解曲线。
图3C为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的金黄色葡萄球菌模板浓度与Ct值线性拟合示意图。
图4A为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的金黄色葡萄球菌与阪崎肠杆菌实时荧光多重LAMP检测扩增曲线。
图4B为基于荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+的金黄色葡萄球菌与阪崎肠杆菌实时荧光多重LAMP检测熔解曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而不是对本发明的限定。
本发明对众多的金属钌配合物核酸分子“光开关”进行了筛选。首先对金属钌配合物在70℃、光源持续激发的光稳定性以及热稳定性进行研究。在此基础上对金属钌配合物在扩增反应体系中的抑制性进行研究，确定最佳浓度(在不抑制扩增反应的前提下保证检测的稳定性与灵敏度)。本发明发现由于[Ru(phen)2dppz]2+对LAMP反应具有非常强的抑制作用，以至于无论如何改变实验条件都无法实现对LAMP扩增反应的实时监测。而[Ru(bpy)2(dppz)]2+对LAMP扩增反应有着较弱的抑制性，并且在0.5-5μM浓度范围内可以用于实时监测LAMP扩增反应。以此为基础本发明将LAMP扩增体系与金属钌配合物(例如，[Ru(bpy)2dppz]2+)在扩增前同时加入管中，建立了将金属钌配合物作为荧光染料应用于环介导等温核酸扩增的定性、定量检测方法，结合金属钌配合物，如[Ru(bpy)2(dppz)]2+进行核酸定量，且采用闭管扩增检测，防止扩增子气溶胶污染，并利用熔解曲线验证扩增反应的特异性和实现多重LAMP检测。该方法具有灵敏度高、操作简单、快速、准确等优点。
(一)金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+结合DNA应用于实时荧光LAMP中的可行性
采用金黄色葡萄球菌fem基因保守序列为扩增的靶序列，在2017年8月完成扩增引物的设计，扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化，所用的引物具体序列如下：
F3(5’-3’)：TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT
B3(5’-3’)：TTTCATAATCRATCACTGGAC
FIP(5’-3’)：CCTTCAGCAAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGCCATACAGTC
BIP(5’-3’)：ACAATAATAACGAGGTYATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTTCATAACAGGTAC
1、金属钌配合物在高温孵育时荧光信号的稳定性
实时荧光检测需要对扩增反应体系进行长时间高温环境以及高强度激发光源照射，从而达到实时收集荧光信号的目的，此外，核酸扩增反应液在室温以及4℃储藏通常为碱性条件。因此荧光染料必须具有一定的光热稳定性与水解稳定性。将金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+在pH 8.0的Tirs缓冲溶液中于70℃高温孵育并持续激发，隔一定时间(例如10min)取荧光强度信号点绘图，验证其对高温的耐受性以及荧光检测时(激发光源照射)的稳定性。结果如图1A所示，在1.5小时的检测时长内荧光信号无明显下降，说明金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+在碱性条件下对光热具有较强的稳定性。
2、染料浓度对LAMP反应的抑制效应
在反应体系中[Ru(bpy)2(dppz)]2+终浓度为0、0.5、1、5、10、20μM(图1B)时，从不同[Ru(bpy)2(dppz)]2+浓度下LAMP扩增反应凝胶电泳结果可以看出，在>5μM浓度时观察不到扩增产物条带，而在0.5-5μM浓度范围内则有明显的LAMP特征条带出现。表明金属钌配合物在一定浓度范围(0.5-5μM)内对LAMP扩增几乎没有抑制作用，可适用于实时荧光LAMP监测，而超出这个范围则会发生明显的抑制。
3、实时荧光LAMP扩增
(1)待检样品中细菌DNA的提取：无菌操作下，利用LB培养基进行增菌处理后用试剂盒进行DNA的提取。
(2)无菌操作下，进行LAMP扩增的反应体系的配制：采用10μL反应体系进行扩增，包括10×Isothermal Amplification Buffer 1μL、内引物FIP和BIP终浓度各1.6μM、外引物F3和B3终浓度各0.2μM、dNTP终浓度1.4mM、甜菜碱终浓度0.8M、硫酸镁终浓度5mM、Bst 2.0
Figure BDA0001771118150000051
DNA聚合酶3.2U、上步提取的DNA模板1μL(200ng/μL)及10μM金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+1μL，剩余用水补齐。无模板对照(空白组)为NTC。
(3)在实时荧光PCR仪上进行扩增反应，条件为：64℃下恒温反应70分钟。扩增反应中每1min采集1次荧光信号，信号通道的激发和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，熔解曲线60-95℃，增量每0.5℃测量一次，增温速率5℃/s。
(4)实验结果：用提取的DNA作为模板，加入特异性内、外引物，进行实时荧光LAMP扩增实验，可得到扩增曲线(图2A)以及扩增序列的特征熔链峰图(图2B)。同时用琼脂糖凝胶电泳对产物进行验证，有LAMP扩增产物梯形条带产生(图2C)，证明金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+应用于荧光定量LAMP中的可行性，可用于定性检测。
(二)金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+结合DNA进行实时荧光LAMP的线性范围和灵敏度
(1)菌培养以及模板提取、引物合成同(一)。
(2)将模板DNA原液(1×107copies/μL)进行10倍梯度稀释为1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL。以NTC为无模板对照(空白组)。
(3)实时荧光LAMP反应体系的建立，无菌操作下采用10μL反应体系，添加10μM金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+1μL为荧光染料，并取上步梯度稀释DNA 1μL分别作为模板，进行扩增。反应体系配制及实时荧光LAMP反应程序同(一)，并设置无模板对照。
(4)实验结果：以不同浓度DNA作为模板，进行实时荧光LAMP的扩增反应，结合各扩增反应的扩增曲线对应的循环阈值Ct绘制标准曲线，标准曲线回归方程为：y＝-5.036x+73.387，R2＝0.998(R2为0.998表明基于[Ru(bpy)2(dppz)]2+建立的实时荧光LAMP标准曲线具有较好的线性关系)。其中x为模板DNA拷贝数的对数值，y为Ct值，R2为线性相关系数。根据图3A、图3B及图3C，表明基于[Ru(bpy)2(dppz)]2+建立的实时荧光LAMP检测方法具有较高的灵敏度和较宽的动态范围，可用于定量检测。
(三)基于金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+的实时荧光LAMP多重检测
金黄色葡萄球菌引物同(一)。
阪崎肠杆菌所用的引物序列为：
利用阪崎肠杆菌Esa16S基因保守序列为扩增的靶序列，在2017年11月完成扩增引物的设计，扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化，引物具体序列如下：
F3(5’-3’)：TCCGCAGGAGTTGAAGAGG
B3(5’-3’)：CAGCAGCGTGTCTGTTTCA
FIP(5’-3’)：TATGCGGGATCGAACCGCAGATTTTGGCTATAGCTCAGCTGGGA
BIP(5’-3’)：GCTCCACCATCACTTCGGAGTGTTTTTTCAGCTTGTTCCGGATTGT
(1)菌培养以及模板提取同(一)。
(2)LAMP扩增的反应体系：
无菌操作下采用10μL反应体系，添加10μM金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+1μL为荧光染料，设置金黄色葡萄球菌模板(金葡组)、阪崎肠杆菌模板(阪崎组)、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌模板(金葡+阪崎组)、无模板对照NTC(空白组)四组，四组同时添加金黄色葡萄球菌与阪崎肠杆菌的两组引物，其中内引物FIP和BIP终浓度各1.6μM，外引物F3和B3终浓度各0.2μM。
(3)实时荧光LAMP反应程序同(一)。
(4)实验结果：如图4A、图4B所示，进行实时荧光LAMP扩增并分析熔解曲线后发现：单一金黄色葡萄球菌DNA模板扩增产物的熔解曲线峰出现在81.8℃左右；单一阪崎肠杆菌DNA模板扩增产物的熔解曲线峰出现在89.3℃左右，当同时加入两种菌的DNA模板进行扩增时，其扩增产物在82℃和89℃分别出现一个熔解曲线峰。上述结果表明，本发明所用的金属钌配合物荧光染料([Ru(bpy)2(dppz)]2+)以及基于此染料建立的多重实时荧光LAMP检测方法，可准确分析体系中不同DNA序列，从而实现扩增产物的特异性定性检测。
(四)实时荧光LAMP检测试剂盒的制备
将10×Isothermal Amplification Buffer、dNTP、甜菜碱、硫酸镁、Bst DNA聚合酶及荧光染料[Ru(bpy)2(dppz)]2+共同包装，得到实时荧光LAMP检测试剂盒。使用时根据实验样品需要加入LAMP的内、外引物和模板即可。
尽管荧光DNA结合染料很多，但并不是所有荧光染料都适用于实时荧光LAMP的扩增反应监测，例如EB(溴化乙锭)等。最近有报道，通过实验比较了6种商品化DNA荧光染料对实时LAMP反应的抑制作用，包括SYTO-9、SYTO-13、SYTO-82、SYBR GreenI、SYBR Gold和Evagreen等(Biotechniques 2016,61(1),20)。研究发现仅有SYTO-9和SYTO-82适用于作为实时荧光LAMP的DNA荧光染料，而SYTO-13、SYBR Green I、SYBR Gold和Evagreen均对LAMP反应有较强的抑制作用，因此不适合用于实时监测LAMP反应(Biotechniques 2016,61(1),20)。而本发明通过实验发现，具有核酸分子“光开关”行为的金属钌配合物[Ru(bpy)2(dppz)]2+和LAMP扩增实验条件兼容；并且添加在LAMP反应体系中不抑制其扩增反应；有足够高的检测灵敏度，可以获得用于定量的实时扩增曲线等条件([Ru(bpy)2(dppz)]2+与LAMP扩增产物DNA双链结合后，荧光信号显著增强，并在本发明选定的信号通道的激发和发射波长下，可以通过实时监测染料的荧光信号变化，获得扩增曲线)。因此，可以作为一类新型的实时荧光LAMP结合染料，具有SYBR Green I和Eva Green等有机分子DNA结合染料所不具有的优异性质，具有广阔的应用前景。
本发明建立的实时荧光LAMP检测方法可对扩增产物实现定性和定量的检测，并通过熔解曲线可以对非特异性产物以及多重靶序列进行区分。全程闭管扩增检测还具有防止LAMP扩增产生核酸污染的作用。将金属钌配合物应用于实时荧光LAMP中，避免SYBR Green等染料浓度无法知晓、性质不明等问题。相对于商业染料来说金属钌配合物较为便宜易得、使用方便，具有优异的热稳定性、化学稳定性和光稳定性，并广泛适用于各类样品的核酸定量中，为食品安全、环境监测等领域提供一种新的实时荧光LAMP的定性、定量检测手段。

Claims (5)

1.一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：
将核酸样品加入到包含有特异性引物的实时荧光LAMP反应体系中，以金属钌配合物作为所述实时荧光LAMP反应体系中的染料组分；以核酸样品作为所述实时荧光LAM P反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序进行实时荧光LAMP的扩增反应和熔解反应，反应结束后分析扩增曲线和熔解曲线，根据循环阈值定性判别核酸样品中是否存在扩增的靶序列，并根据熔解温度识别非特异扩增产物及区分不同的扩增靶序列；
所述金属钌配合物在实时荧光LAMP反应体系中的浓度为0.5-5μM，扩增模板为1-200ng；所述反应体系的终体积为10-20μL；
所述扩增反应的程序为：于60-68℃反应60-70分钟；
所述检测方法还包括以下步骤：以核酸样品拷贝数不同的多个标准品以及未知拷贝数的核酸样品分别作为所述实时荧光LAMP反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序分别进行针对标准品中特定靶序列片段的扩增反应，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的核酸拷贝数；
所述金属钌配合物选自[Ru(bpy)2(dppz)]2+。
2.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于：所述扩增反应中，利用一定的荧光通道采集信号，荧光通道的荧光激发波长和发射波长范围分别为400-500nm和550-750nm，根据该信号获得所述标准品或未知拷贝数的核酸样品的循环阈值。
3.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于：若核酸样品为RNA，则扩增前将RNA反转录为DNA。
4.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于：核酸样品利用试剂盒提取得到。
5.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光LAMP检测方法，其特征在于：所述检测方法具体包括以下步骤：
1)根据扩增靶序列设计并合成内引物和外引物；
2)配制实时荧光LAMP反应体系，反应体系包括内引物、外引物、扩增模板及金属钌配合物；
3)以已知初始浓度的DNA样品为模板进行环介导等温核酸扩增，在扩增反应中进行信号收集，荧光信号的收集通道为：激发波长400-500nm，发射波长550-750nm；然后根据收集的信号建立扩增曲线，由扩增曲线确定该DNA样品的循环阈值；
4)重复步骤3)，得到不同初始浓度的DNA样品各自的循环阈值，结合对应DNA样品的浓度建立标准曲线；
5)按照步骤3)，以未知初始浓度的DNA样品为模板进行环介导等温核酸扩增，获得相应的循环阈值并带入步骤4)建立的标准曲线中，从而计算得到该DNA样品的初始浓度。
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