CN113564159A

CN113564159A - 一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用

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Publication number: CN113564159A
Application number: CN202110830250.8A
Authority: CN
Inventors: 谷立川; 张冯瑜; 王晓萌; 张坤迪; 王宏伟; 许素娟
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2021-10-29

Abstract

本发明提供一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用，属于分子生物学和核酸检测技术领域。本发明通过设计一种新型分子信标探针，分子信标探针至少包括两条分子信标探针，分子信标探针均为单链DNA且均能与体外转录产物RNA互补配对结合；其中第一分子信标探针近5’端或5’端标记有荧光基团，第二分子信标探针近3’端或3’端标记有猝灭基团。利用该分子信标探针进行体外转录活性检测，可实现单启动子或多启动子转录活性的实时定量示踪检测。该方法无需进行产物RNA的纯化，无需每次单独设计合成探针，具有易操作、经济快速、环境友好、结果稳定性好且易于分析的优势，应用前景良好。

Description

一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域，具体涉及一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

体外转录是指在体外无细胞体系中，以包含启动子区域的线性DNA为模板，添加RNA聚合酶和NTP等条件，模仿体内转录生成RNA的过程。体外转录系统可以方便准确的检测目的基因启动子的转录活性，特异性检测转录调控蛋白、配体分子或金属离子对启动子转录的影响，广泛应用于分子生物学领域中转录机制、转录元件及转录因子的研究。

体外转录活性的检测聚焦于转录体系中产物RNA的定量。由于微体积体外转录系统中RNA的产量极低，如何特异且灵敏地检测生成的转录产物是分子生物学的一个重要问题。目前检测产物RNA的方法有Northern印迹杂交法、荧光实时逆转录PCR定量法和α-³²P标记的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。然而这些方法的应用存在着许多局限。Northern印迹杂交法是指在变性条件下将RNA样品进行凝胶电泳，再将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，最后使用标记探针进行杂交，经放射自显影或酶反应显色的过程。此过程大约需要两天的周期，且实验误差较大、对显影仪器要求较高。荧光实时逆转录PCR定量法即在体外转录反应后，使用DNase I将DNA模板完全降解，生成的RNA经反转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行荧光定量PCR的过程。此过程灵敏度高且无需同位素标记，然而检测过程繁琐且易受体系残留DNA模板的干扰。α-³²P标记的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法是指在体外转录体系中添加α-³²P标记的NTP混合物，使合成的RNA 带有同位素标记，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离靶标RNA，经磷屏扫描仪扫描定量的过程。此过程操作相对简单且灵敏度高，是目前微量体外转录活性检测的常用方法。然而α-³²P标记试剂的高成本性和贯穿全实验周期的放射性防护操作，为本方法的应用带来许多不便。且以上所有方法均是体外转录反应的转录后终点法检测，无法实现启动子活性的实时示踪。

分子信标(Molecular beacon，MB)技术是一种基于荧光共振能量转移现象和碱基互补配对原则建立起来的分析技术。分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和灵敏度，且无毒无害，对环境无污染。传统分子信标含有25～35个核苷酸，包括环状区、颈环区、荧光基团和猝灭基团，可应用于RNA提纯后的含量测定。其原理为：自由状态时，分子信标呈发卡式结构，荧光基团和淬灭基团相距较近。由于荧光共振能量转移，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全淬灭，荧光本底极低。当分子信标与RNA结合时，分子信标的颈环区打开，此时荧光基团和淬灭基团之间距离增加，至使分子信标荧光恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶标RNA量成正比。然而，发明人发现，在体外转录体系中，RNA 聚合酶和转录调控因子等DNA结合蛋白可与分子信标DNA结合并干扰信标荧光恢复，限制了传统分子信标在体外转录检测中的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用。本发明通过设计一种新型分子信标探针，利用该新型分子信标探针进行体外转录活性检测，可以实现单启动子或多启动子转录活性的实时定量示踪检测。该方法无需进行产物RNA的纯化，无需每次单独设计合成探针，具有易于操作、经济快速、环境友好、结果稳定性好且易于分析的优势。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种分子信标探针，所述分子信标探针至少包括两条分子信标探针，所述分子信标探针均为单链DNA且均能与体外转录产物RNA互补配对结合；其中第一分子信标探针近5’端或5’端标记有荧光基团，第二分子信标探针的近3’端或3’端标记有猝灭基团。

所述分子信标探针的序列长度均控制为15～50bp；

所述分子信标探针中的G和C碱基含量控制为30～80％；

分子信标探针的Tm值控制为30～90℃。

所述第一分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的3’端，与第二分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的5’端相临。

本发明对荧光基团和猝灭基团不做具体限定，本领域技术人员可通过现有知识选择。在本发明的一个具体实施方式中，所述荧光基团包括但不限于FAM、ROX或VIC；所述猝灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2或TAMRA。

需要说明的是，当本发明中分子信标探针使用部分荧光基团和猝灭基团时(如FAM和TAMRA)，当近距离接触时，猝灭基团(如TAMRA)不仅可以导致荧光基团(如FAM)荧光猝灭，还可以通过能量共振转移吸收部分能量，导致自身荧光激发。因此，在体外转录体系中不仅可以检测荧光基团信号的猝灭，还可以检测猝灭基团信号的增强。

本发明的新型分子信标探针的工作原理具体为：在体外转录初期，第一分子信标探针和第二分子信标探针在溶液中游离，荧光基团和猝灭基团距离较远，体系中检测到的荧光信号较高；随着体外转录的进行，第一分子信标探针和第二分子信标探针均与产物RNA互补配对结合，荧光基团和淬灭基团相距较近，此时荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭，体系中荧光信号下降，且荧光信号的下降值与体系中产物RNA的含量成正比。(图1)

本发明的第二个方面，提供一种体外转录检测试剂盒，所述试剂盒包括上述分子信标探针。

所述试剂盒还可以包括用于对体外转录进行荧光检测的其他组分，包括但不限于缓冲液(如5×Transcription Buffer)、DNA模板、RNA聚合酶全酶、NTPs和RNAse free H₂O。

本发明的第三个方面，提供上述分子信标探针和/或体外转录检测试剂盒在体外转录活性检测中的应用。从而可以实现体外转录反应的无污染、高时效、高灵敏度和高特异性实时示踪检测。

具体的，所述应用包括：对转录体系中产物RNA的定量检测。

所述定量检测可以是相对定量检测或绝对定量检测。

当进行绝对定量检测时，可通过对探针标准曲线的测定完成。

同时，需要说明的是，通过同时使用两组或两组以上分子信标探针，本发明显然可以实现多启动子体外转录反应的多通道相对和/或绝对定量实时示踪检测。

本发明的第四个方面，提供一种体外转录活性检测的方法，所述方法包括使用分子信标探针和/或体外转录检测试剂盒对转录体系中产物RNA的定量检测。

具体的，所述定量检测可通过酶标仪或荧光定量PCR仪进行持续荧光信号检测获得。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

1、上述技术方案提供了一种新型分子信标探针，可以排除体外转录反应体系中RNA聚合酶等DNA结合蛋白及DNA模板的干扰，无需提纯RNA产物，即可实现RNA含量的高灵敏度、高特异性定量检测。

2、上述技术方案提供了一种新型分子信标探针在体外转录反应活性检测中的应用。该方法无需使用放射性同位素标记、成本低、无环境污染，可以在酶标仪或荧光定量PCR仪上同时进行多个样品的检测，整个过程可在1～2个小时内完成。

3、上述技术方案提供的体外转录检测方法可实现启动子转录活性的实时示踪定量检测。

4、上述技术方案提供的体外转录检测方法可实现同一体外转录体系中多启动子的同时实时示踪定量检测。

综上，上述技术方案通过设计一种新型分子信标探针，利用该新型分子信标探针进行体外转录活性检测，可以实现单启动子或多启动子转录活性的实时定量示踪检测。该方法无需进行产物RNA的纯化，无需每次单独设计合成探针，具有易于操作、经济快速、环境友好、结果稳定性好且易于分析的优势，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明新型分子信标探针在体外转录产物RNA定量检测中的应用原理图。其中：MBa-荧光基团代表第一分子信标探针，MBb-猝灭基团代表第二分子信标探针。

图2为本发明实施例1中T7启动子和Trc启动子的体外转录活性实时示踪检测结果。其中：A为荧光定量PCR仪检测曲线；B为数据处理后的相对定量检测曲线。结果显示，此新型检测方法可对不同启动子的体外转录活性实现实时示踪相对定量检测。

图3为本发明实施例2中分别使用FAM和TAMRA标记探针实施的T7启动子体外转录活性实时示踪检测结果。其中:A为FAM和TAMRA通道的荧光定量PCR仪检测曲线；B为数据处理后的FAM信号相对定量检测曲线；C为数据处理后的TAMRA信号相对定量检测曲线。结果显示，当使用FAM和TAMRA标记新型分子信标探针时，FAM猝灭信号的灵敏度远远高于TAMRA激发信号的灵敏度。

图4为本发明实施例3中不同离子含量Fur蛋白调控fhuF基因转录的实时示踪检测结果。其中：A为酶标仪检测曲线；B为数据处理后的相对定量检测曲线。结果显示，结合一个金属离子的Zn₁Fur和结合两个金属离子的Zn₁Mn₁Fur分别导致fhuF启动子的转录速率下降了8.7％和24.8％。即，金属离子的结合可显著增强Fur的转录抑制活性。此结果证明，该新型检测方法可实现转录调控蛋白活性的实时示踪定量检测。

图5为本发明实施例4中T7启动子体外转录活性的三通道绝对定量示踪检测结果。其中：A为探针MBa-1、MBb-1，MBa-2、MBb-2和MBa-3、MBb-3的检测标准曲线；B为荧光定量PCR仪三通道检测曲线；C为数据处理后的三通道相对定量检测曲线；D为经标准曲线校正后的三通道绝对定量检测曲线。结果显示，此新型检测方法可实现同体系多启动子转录的多通道实时示踪绝对定量检测。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，体外转录活性的检测聚焦于转录体系中产物RNA的定量。而目前检测产物RNA的方法普遍存在诸多局限。

有鉴于此，本发明提供一种新型分子信标探针，可以排除RNA聚合酶等DNA结合蛋白及DNA模板的干扰，无需RNA纯化步骤即可实现溶液中RNA的含量测定，将其应用于体外转录活性检测中，从而实现体外转录反应的无污染、高时效、高灵敏度和高特异性实时示踪检测。

具体技术方案如下：

第一步，合成包含目的启动子序列的双链线性模板DNA片段，所述模板DNA中启动子区域后序列长度大于80bp。

第二步，合成两条新型分子信标探针MBa和MBb，探针MBa和MBb为两条单链DNA且均与体外转录产物RNA互补配对结合。MBa和MBb的序列长度为15～50bp、G和C碱基含量为30～80％、Tm值为30～90℃。MBa与产物RNA互补区域的3’端，恰与MBb与产物RNA互补区域的5’端相临。MBa的5’端标记荧光基团，MBb的3’端标记猝灭基团。所述荧光基团包括但不限于FAM、ROX或VIC，所述猝灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2或TAMRA。

所合成的新型分子信标探针的工作原理为：在体外转录初期，探针MBa和MBb在溶液中游离，荧光基团和猝灭基团距离较远，体系中检测到的荧光信号较高；随着体外转录的进行，MBa和MBb均与产物RNA互补配对结合，荧光基团和淬灭基团相距较近，此时荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭，体系中荧光信号下降，且荧光信号的下降值与体系中产物RNA的含量成正比。(图1)

第三步，新型分子信标探针对应单链DNA的合成及探针标准曲线的测定，合成同时与探针MBa和MBb互补配对的DNA单链，并配置5×Transcription Buffer(200nM Tris-HClpH 8.0，165mM MgCl₂，375mM NaCl，12.5mM DTT，250μg/mL BSA)。根据表1配置探针标准曲线检测体系。配制完成后，使用酶标仪或荧光定量PCR仪于37℃检测样品荧光信号，读取稳定后的样品荧光值。计算每组样品与0nM DNA单链组的荧光差值的绝对值(信号值)。以DNA单链浓度为横坐标，以信号值为纵坐标，绘制产物浓度-信号值标准曲线。

若需产物RNA的绝对定量检测，则进行此步骤；若仅需产物RNA的相对定量检测，则跳过此步骤。

表1探针标准曲线检测体系

成分	添加量
		5×Transcription Buffer	4μL
MBa	50～800nM
		MBb	50～800nM
DNA单链	0～800nM
		RNAse free H<sub>2</sub>O	补足20μL

第四步，配制体外转录反应体系，根据表2于冰上配置体外转录反应检测体系，其中新型分子信标探针的添加量为50～800nM。阴性对照组使用相同体积的RNAse free H₂O替代NTPs混合物。

表2体外转录反应检测体系

成分	添加量
		5×Transcription Buffer	4μL
DNA模板	1～100nM
		RNA聚合酶全酶	3～300nM
MBa	50～800nM
		MBb	50～800nM
NTPs	各500μM，最后添加，添加后立即检测
		RNAse free H<sub>2</sub>O	补足20μL

第五步，体外转录体系荧光信号的实时示踪检测，体外转录反应体系配制完成后，立即置于酶标仪或荧光定量PCR仪进行持续荧光信号检测。检测仪器参数设定为：37℃恒温检测、每1～5分钟检测一次、持续时长1小时。

第六步，相对定量检测数据处理与分析，导出检测数据，计算每个监测点阴性对照组与实验组的信号差值(信号值)。以检测时间为横坐标，以信号值为纵坐标，绘制体外转录反应相对定量检测曲线。以检测曲线前期线性区斜率的大小分析启动子的体外转录效率。

第七步，绝对定量检测数据处理与分析，导出检测数据，计算每个监测点阴性对照组与实验组的信号差值(信号值)。根据步骤三绘制的产物浓度-信号值标准曲线，读取以上每个信号值对应的产物浓度。以检测时间为横坐标，以产物浓度为纵坐标，绘制体外转录反应绝对定量检测曲线。以检测曲线前期线性区斜率的大小分析启动子的体外转录效率。

本发明的又一具体实施方式中，当本发明中分子信标探针使用部分荧光基团和猝灭基团时(如FAM和TAMRA)，当近距离接触时，猝灭基团(如TAMRA)不仅可以导致荧光基团(如FAM)荧光猝灭，还可以通过能量共振转移吸收部分能量，导致自身荧光激发。因此，在体外转录体系中不仅可以检测荧光基团信号的猝灭，还可以检测猝灭基团信号的增强。

本发明的又一具体实施方式中，本发明还包括新型分子信标探针在多启动子体外转录体系中的多通道实时示踪检测应用。根据实验需要，设计两组以上不同荧光基团标记的新型分子信标探针，使用多通道荧光定量PCR仪实现多种检测对象的同时实时示踪检测。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。如未特殊说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：荧光定量实时示踪法比较T7启动子和Trc启动子的转录活性

本实施例以噬菌体T7启动子和大肠杆菌Trc启动子为例，验证以上荧光定量实时示踪检测方法在启动子体外转录活性相对定量检测中的可行性及可靠性。

1、T7启动子和Trc启动子模板DNA的合成

分别合成含有T7启动子序列的DNA模板(T7 template)和含有Trc启动子序列的DNA模板(Trc template)。T7 template和Trc template序列如下所示，启动子区域使用下划线标注，探针结合区域使用小写字母标注。

T7 template：

5′-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccaGCCGGCGATGGCCATGGATATCGGA-3′(SEQID NO.1)

Trc template：

5′-AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAatacctgctgccgaccgctgctgctgGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATGGATATCGGA-3′(SEQ ID NO.2)

2、新型分子信标探针的合成

本实施例使用的新型分子信标探针包括MBa-1和MBb-1两条单链DNA序列，其中MBa-1使用FAM荧光基团标记，MBb-1使用BHQ1猝灭基团标记。使用的探针序列如下所示。

MBa-1：5′-FAM-CAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTAT-3′(SEQ ID NO.3)

(长度26bp，GC％＝65.4，Tm＝77.5℃)

MBb-1：5′-TGGGCAGCGAGGAGCAGCAGAC-BHQ1-3′(SEQ ID NO.4)

(长度22bp，GC％＝68.2，Tm＝71.5℃)

3、体外转录反应的荧光定量实时示踪检测

(1)体外转录体系配置

配置5×Transcription Buffer:200nM Tris-HCl pH 8.0，165mM MgCl₂，375mMNaCl，12.5mM DTT，250μg/mL BSA。

根据表3分别配置4组体外转录反应体系。每组设置2个重复。

(2)体外转录反应荧光定量实时示踪检测

体外转录体系配置后，立即置于荧光定量PCR仪进行荧光检测。仪器设定为：37℃恒温检测、检测通道FAM、每2分钟检测一次、持续时间1小时。

表3T7启动子和Trc启动子体外转录反应体系

(3)数据处理

导出检测数据(图2A)，计算每个监测点阴性对照组与实验组的荧光信号差值(信号值)。以检测时间为横坐标，以信号值为纵坐标，绘制T7启动子和Trc启动子的体外转录反应相对定量检测曲线(图2B)。以检测曲线前期线性区斜率的大小比较T7启动子和Trc启动子的转录效率。

4、结果与分析

图2B为T7启动子和Trc启动子的体外转录活性实时示踪检测结果。结果显示，T7RNA聚合酶对T7启动子的转录效率(k＝227892)是E.coli RNA聚合酶全酶对Trc启动子的转录效率(k＝34859)的6.5倍。

该检测方法操作简单无污染，检测过程可在1.5小时内完成，且检测曲线整体平行性好，表明各组样品转录效率及探针结合效率稳定。该方法可实现转录过程的相对定量实时示踪检测。

实施例2：FAM与TAMRA标记探针荧光定量实时示踪法检测T7启动子体外转录活性

本实施例分别使用FAM荧光基团和TAMRA猝灭基团(猝灭同时自身激发)标记的新型分子信标探针用于噬菌体T7启动子体外转录活性检测，比较荧光猝灭与荧光激发信号在此新型荧光定量实时示踪检测方法中的检测效率。

1、T7启动子模板DNA的合成

合成含有T7启动子序列的DNA模板(T7 template，同实施例1)。T7 template序列如下所示，启动子区域使用下划线标注，探针结合区域使用小写字母标注。

T7 template：

5′-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccaGCCGGCGATGGCCATGGATATCGGA-3′(SEQ ID NO.1)

2、新型分子信标探针的合成

本实施例使用的新型分子信标探针包括MBa-1和MBb-1T两条单链DNA序列，其中MBa-1使用FAM荧光基团标记(同实施例1)，MBb-1 T使用TAMRA猝灭(激发)基团标记。使用的探针序列如下所示。

MBa-1：5′-FAM-CAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTAT-3′(SEQ ID NO.3)

(长度26bp，GC％＝65.4，Tm＝77.5℃)

MBb-1T：5′-TGGGCAGCGAGGAGCAGCAGAC-TAMRA-3′(SEQ ID NO.4)

(长度22bp，GC％＝68.2，Tm＝71.5℃)

3、体外转录反应的荧光定量实时示踪检测

(1)体外转录体系配置

根据表4分别配置2组体外转录反应体系。每组设置2个重复。

(2)体外转录反应荧光定量实时示踪检测

体外转录体系配置后，立即置于荧光定量PCR仪进行荧光检测。仪器设定为：37℃恒温检测、检测通道FAM和TAMRA、每2分钟检测一次、持续时间1小时。

表4T7启动子体外转录反应体系

(3)数据处理

导出检测数据(图3A)。针对FAM通道检测数据，计算每个监测点阴性对照组与实验组的荧光信号差值(信号值)。针对TAMRA通道检测数据，计算每个监测点实验组与阴性对照组的荧光信号差值(信号值)。以检测时间为横坐标，以信号值为纵坐标，绘制T7启动子的体外转录反应相对定量检测曲线(图3B-C)。以检测曲线前期线性区斜率的大小分析T7启动子的转录效率。

4、结果与分析

图3为T7启动子的体外转录活性实时示踪检测结果。结果显示，当使用FAM和TAMRA标记新型分子信标探针时，该新型荧光定量实时示踪法检测即可检测FAM信号的荧光降低，又可检测TAMRA信号的荧光增强，但FAM猝灭信号的灵敏度远远高于TAMRA激发信号的灵敏度。

实施例3：荧光定量实时示踪法检测大肠杆菌转录因子Fur对fhuF基因启动子转录的影响

大肠杆菌铁稳态维持系统依赖于转录因子Fur。Fur可以与铁代谢基因启动子结合，抑制靶基因的转录。铁吸收系统基因fhuF启动子中含有多个重叠的Fur蛋白结合位点。本实施例以fhuF启动子为例，验证以上荧光定量实时示踪检测方法在转录因子Fur活性检测中的可行性及可靠性。

1、fhuF启动子模板DNA的合成

合成含有大肠杆菌fhuF启动子序列的DNA模板(fhuFp template)。其序列如下所示，启动子区域使用下划线标注，探针结合区域使用小写字母标注。

fhuFp template：

5′-AATCCGCCACTGATCTGACGATAAATCCGCATACATCAGCCCTGCAATCAGCAATCCCGGCAGCAACACTCCCCAGCCACTGCCCAGCGTACGTTGCAACATGATTTCATCTCTTTCATTGATAATGATAACCAATATCATATGATAATTTTTATCATTTGCAAGCCAGATAAATCCCTTGCTATCGGGTAAACCTATCGCTATGATTAGCAATCAT TATCATTTAGATTACTATCCCGATTcgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCA-3′(SEQ ID NO.5)

2、新型分子信标探针的合成

本实施例使用的新型分子信标探针包括MBa-2和MBb-2两条单链DNA序列，其中MBa-2使用VIC荧光基团标记，MBb-2使用BHQ2猝灭基团标记。使用的探针序列如下所示。

MBa-2：5′-VIC-CTGTTTGATGGTGGTTGACGGCG-3′(SEQ ID NO.6)

(长度23bp，GC％＝56.5，Tm＝69.1℃)

MBb-2：5′-TTGCCCCAGCAGGCGAAAATC-BHQ2-3′(SEQ ID NO.7)

(长度21bp，GC％＝57.1，Tm＝68.9℃)

3、不同离子结合状态Fur蛋白的纯化

大肠杆菌Fur蛋白的表达与纯化可参考常规蛋白质纯化步骤进行。

Fur蛋白质含有两个金属离子结合位点，一个结合Zn²⁺，另一个可以结合Fe²⁺、Mn²⁺或Zn²⁺。金属离子的结合可有效提高Fur与启动子DNA的亲和力，促进Fur对启动子转录的抑制作用。经常规步骤纯化所得的Fur蛋白为Zn₁Fur和Zn₁Fe₁Fur的混合物，使用金属离子螯合剂EDTA透析以上混合物，可得均一的Zn₁Fur蛋白质。向Zn₁Fur蛋白质中添加足量MnCl₂，可得均一的Zn₁Mn₁Fur蛋白质。

4、体外转录反应的荧光定量实时示踪检测

(1)体外转录体系配置

根据表5分别配置4组体外转录反应体系。每组设置2个重复。

表5fhuF启动子体外转录反应体系

(2)体外转录反应荧光定量实时示踪检测

体外转录体系配置后，立即置于37℃预热后的酶标仪中进行荧光检测。仪器设定为：37℃恒温检测、激发波长538nm、发射波长554nm、每2分钟检测一次、持续时间30分钟。

(3)数据处理

导出检测数据(图4A)，计算每个监测点阴性对照组与实验组的荧光信号差值(信号值)。以检测时间为横坐标，以信号值为纵坐标，绘制体外转录反应相对定量检测曲线(图4B)。以不同实验组检测曲线前期线性区斜率的大小分析转录因子Fur对fhuF启动子转录的影响。

4、结果与分析

图4B为以上各实验组的体外转录活性相对定量实时示踪检测结果。结果显示，结合一个金属离子的Zn₁Fur和结合两个金属离子的Zn₁Mn₁Fur分别导致fhuF启动子的转录速率下降了8.7％和24.8％。即，金属离子的结合可显著增强Fur的转录抑制活性。

该检测方法操作简单无污染，检测过程可在1小时内完成，且检测曲线整体平行性好，表明各组样品转录效率及探针结合效率稳定。该方法可检测转录调控蛋白活性，可实现转录过程的实时定量示踪检测。

实施例4：T7启动子体外转录活性的三通道绝对定量示踪检测

本实施例在转录体系中同时添加含有T7启动子的三种不同模板DNA，验证以上荧光定量实时示踪检测方法在三通道绝对定量检测中的可行性及可靠性。

1、三种T7启动子模板DNA的合成

合成含有T7启动子序列的三种DNA模板(T7 template 1、T7 template 2和T7template 3)。其序列分别如下所示，启动子区域使用下划线标注，探针结合区域使用小写字母标注，终止子区域使用小写斜体字母标注。

T7 template 1：

T7 template 2：

T7 template 3：

2、新型分子信标探针的合成

本实施例使用的新型分子信标探针包括MBa-1、MBb-1，MBa-2、MBb-2和MBa-3、MBb-3六条单链DNA序列。其中MBa-1和MBb-1与实施例1中使用探针完全相同，分别使用FAM和BHQ1基团标记；MBa-2和MBb-2与实施例3中使用探针完全相同，分别使用VIC和BHQ2基团标记；MBa-3和MBb-3为本实施例新增探针，分别使用ROX荧光基团和BHQ2猝灭基团标记。探针序列如下所示。

MBa-1：5′-FAM-CAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTAT-3′(SEQ ID NO.3)

(长度26bp，GC％＝65.4，Tm＝77.5℃)

MBb-1：5′-TGGGCAGCGAGGAGCAGCAGAC-BHQ1-3′(SEQ ID NO.4)

(长度22bp，GC％＝68.2，Tm＝71.5℃)

MBa-2：5′-VIC-CTGTTTGATGGTGGTTGACGGCG-3′(SEQ ID NO.6)

(长度23bp，GC％＝56.5，Tm＝69.1℃)

MBb-2：5′-TTGCCCCAGCAGGCGAAAATC-BHQ2-3′(SEQ ID NO.7)

(长度21bp，GC％＝57.1，Tm＝68.9℃)

MBa-3：5′-ROX-GCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGC-3′(SEQ ID NO.11)

(长度28bp，GC％＝57.1，Tm＝74.6℃)

MBb-3：5′-GGGAGACCCCACACTACCATCGGC-BHQ2-3′(SEQ ID NO.12)

(长度24bp，GC％＝66.7，Tm＝71.5℃)

3、新型分子信标探针对应单链DNA的合成及探针标准曲线的测定

合成同时与探针MBa-1和MBb-1互补配对的DNA单链(DNAab1)，同时与探针MBa-2和MBb-2互补配对的DNA单链(DNAab2)，以及同时与探针MBa-3和MBb-3互补配对的DNA单链(DNAab3)。DNAab1和DNAab3序列如下所示：

DNAab1：

5′-ATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCA-3′(SEQ ID NO.13)

DNAab2：

5′-CGCCGTCAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAA-3′(SEQ ID NO.14)

DNAab3：

5′-GCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCC-3′(SEQ IDNO.15)

配置5×Transcription Buffer:200nM Tris-HCl pH 8.0，165mM MgCl₂，12.5mMDTT。

根据表6配置三组探针的标准曲线检测体系。每组设置3个重复。

表6探针标准曲线检测体系

成分	添加量
		5×Transcription Buffer	4μL
MBa	250nM
		MBb	250nM
DNA单链	0、100、200、300、400、500nM
		RNAse free H<sub>2</sub>O	补足20μL

其中，MBa-1和MBb-1探针组对应添加DNAab1单链；MBa-2和MBb-2探针组对应添加DNAab2单链；MBa-3和MBb-3探针组对应添加DNAab3单链。

配制完成后，使用荧光定量PCR仪检测样品荧光信号，读取稳定后的样品荧光值。MBa-1和MBb-1探针组仪器设定为：37℃检测、检测通道FAM；MBa-2和MBb-2探针组仪器设定为：37℃检测、检测通道VIC；MBa-3和MBb-3探针组仪器设定为：37℃检测、检测通道ROX。

计算每组样品与0nM DNA单链组的荧光差值的绝对值(信号值)。

以DNA单链浓度为横坐标，以信号值为纵坐标，分别绘制三组探针的产物浓度-信号值标准曲线(图5A)。

4、体外转录反应的荧光定量实时示踪检测

(1)体外转录体系配置

根据表7分别配置2组体外转录反应体系。每组设置2个重复。

(2)体外转录反应实时荧光定量示踪检测

体外转录体系配置后，立即置于荧光定量PCR仪进行三通道荧光检测。仪器设定为：37℃恒温检测，通道一FAM，通道二VIC，通道三ROX，每2分钟检测一次，持续时间1小时。

(3)数据处理

导出检测数据(图5B)，分别计算FAM通道、VIC通道和ROX通道每个监测点阴性对照组与实验组的荧光信号差值(信号值)(图5C)。使用步骤3绘制的产物浓度-信号值标准曲线(图5A)，读取FAM、VIC和ROX通道每个信号值对应的产物浓度值。以检测时间为横坐标，以产物浓度值为纵坐标，绘制T7 template 1、T7 template 2和T7 template 3体外转录活性的绝对定量实时示踪检测曲线(图5D)。以检测曲线前期线性区斜率的大小分析三种模板DNA的体外转录活性。

表7 T7启动子三通道体外转录反应体系

5、结果与分析

图5C为T7 template 1、T7 template 2和T7 template 3体外转录反应的三通道相对定量实时示踪检测曲线；图5D为使用标准曲线校准后的T7 template 1、T7 template2和T7 template 3体外转录反应三通道绝对定量实时示踪检测结果。结果显示，本实施例使用T7启动子设计的三种DNA模板的体外转录速率非常相似(k_{T7 template 1}＝22.519nM/min，k_{T7 template 2}＝29.995nM/min，k_{T7 template 3}＝26.533nM/min)。

该检测方法操作简单无污染，检测过程可在1.5小时内完成，且检测曲线整体平行性好，表明各样品转录效率及探针结合效率稳定。该方法可实现三个转录样本的绝对定量多通道实时示踪检测。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种分子信标探针、试剂盒及其体外转录荧光定量实时示踪检测方法和应用

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 180

<212> DNA

<213> T7 template

<400> 1

cgatcccgcg aaattaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc 60

tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatgaaata cctgctgccg 120

accgctgctg ctggtctgct gctcctcgct gcccagccgg cgatggccat ggatatcgga 180

<210> 2

<211> 181

<212> DNA

<213> Trc template

<400> 2

aatgagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtgagcggat aacaattccc 60

ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgaaat acctgctgcc 120

gaccgctgct gctggtctgc tgctcctcgc tgcccagccg gcgatggcca tggatatcgg 180

a 181

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cagcagcagc ggtcggcagc aggtat 26

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgggcagcga ggagcagcag ac 22

<210> 5

<211> 318

<212> DNA

<213> fhuFp template

<400> 5

aatccgccac tgatctgacg ataaatccgc atacatcagc cctgcaatca gcaatcccgg 60

cagcaacact ccccagccac tgcccagcgt acgttgcaac atgatttcat ctctttcatt 120

gataatgata accaatatca tatgataatt tttatcattt gcaagccaga taaatccctt 180

gctatcgggt aaacctatcg ctatgattag caatcattat catttagatt actatcccga 240

ttcgccgtca accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 300

cttgctgcaa ctctctca 318

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgtttgatg gtggttgacg gcg 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttgccccagc aggcgaaaat c 21

<210> 8

<211> 231

<212> DNA

<213> T7 template 1

<400> 8

cgatcccgcg aaattaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc 60

tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatgaaata cctgctgccg 120

accgctgctg ctggtctgct gctcctcgct gcccagccgg cgatggccat ggatatcgga 180

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct g 231

<210> 9

<211> 218

<212> DNA

<213> T7 template 2

<400> 9

cccgcgaaat taatacgact cactataggg gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac 60

gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgtcaa ccaccatcaa acaggatttt 120

cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcacta gcataacccc 180

ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctg 218

<210> 10

<211> 190

<212> DNA

<213> T7 template 3

<400> 10

cccgcgaaat taatacgact cactataggg ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc 60

atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg 120

agagtaggga actgccaggc tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 180

ttttttgctg 190

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctacggcgt ttcacttctg agttcggc 28

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gggagacccc acactaccat cggc 24

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> DNAab1

<400> 13

atacctgctg ccgaccgctg ctgctggtct gctgctcctc gctgccca 48

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> DNAab2

<400> 14

cgccgtcaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaa 44

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> DNAab3

<400> 15

gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cc 52

Claims

1.一种分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针至少包括两条分子信标探针，所述分子信标探针均为单链DNA且均能与体外转录产物RNA互补配对结合；其中第一分子信标探针近5’端或5’端标记有荧光基团，第二分子信标探针的近3’端或3’端标记有猝灭基团。

2.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的序列长度均控制为15～50bp；

所述分子信标探针中的G和C碱基含量控制为30～80％；

分子信标探针的Tm值控制为30～90℃。

3.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，第一分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的3’端，与第二分子信标探针与体外转录产物RNA互补区域的5’端相临。

4.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述荧光基团包括但不限于FAM、ROX或VIC；所述猝灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2或TAMRA。

5.一种体外转录检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述分子信标探针。

6.如权利要求5所述的体外转录检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于对体外转录进行荧光检测的其他组分，包括缓冲液、DNA模板、RNA聚合酶全酶、NTPs和RNAsefree H₂O。

7.权利要求1-4任一项所述分子信标探针和/或权利要求5或6所述体外转录检测试剂盒在体外转录活性检测中的应用。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用包括：对转录体系中产物RNA的定量检测；同时实现对体外转录反应实时示踪检测；

优选的，所述定量检测为相对定量检测或绝对定量检测；

优选的，当进行绝对定量检测时，通过对探针标准曲线的测定完成；

优选的，通过同时使用两组或两组以上分子信标探针，实现对多启动子体外转录反应的多通道相对和/或绝对定量实时示踪检测。

9.一种体外转录活性检测的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-4任一项所述分子信标探针和/或权利要求5或6所述体外转录检测试剂盒对转录体系中产物RNA的定量检测。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述定量检测可通过酶标仪或荧光定量PCR仪进行持续荧光信号检测获得，实现对体外转录反应实时示踪检测。