CN111118118B - 一种比率型ctDNA定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种比率型ctDNA定量检测方法，其设计了一段与目标ctDNA互补的模板序列，其可与目标序列互补配对进而在聚合酶和内切酶的联合作用下发生链置换聚合反应，产生可以使荧光信号变化的辅助DNA序列；为了构建基于ctDNA的荧光比率传感器，特殊设计了三种具有不同修饰的颈环结构DNA序列，在辅助DNA序列的协助下，成功实现两种荧光信号强度的反向转变，通过对荧光光谱进行分析处理，得出比率信号，从而实现对ctDNA的超灵敏定量检测。本案的检测方法灵敏度高、特异性好、对人员和设备要求低，检测方便快捷。

Description

一种比率型ctDNA定量检测方法
技术领域
本发明涉及循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)定量检测领域，特别涉及一种比率型ctDNA定量检测方法。
背景技术
循环肿瘤DNA是体液中全部游离循环DNA(cell-free DNA，cfDNA)的一种，是由肿瘤细胞释放并且携带有肿瘤特征性遗传学改变的自由基因组片段，而这些遗传学的改变与肿瘤的发生发展以及复发转移等密切相关，是癌症散落在血液中的信息密码，对于肿瘤的诊断、治疗以及预后评估具有重要价值。传统的ctDNA检测手段包括Northern印迹杂交法、微阵列分析法、流式细胞术和聚合酶链式反应(PCR)等。尽管这些方法具有较好的准确性，但是在实际应该中还存在对待测样本需求量大、灵敏度低、特异性差、对人员和设备要求高等缺点，因此发展高灵敏度且方便快捷的ctDNA分析方法是非常迫切的。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种比率型ctDNA定量检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种比率型ctDNA定量检测方法，包括：
1)设计一段与待测的目标ctDNA互补的模板序列，其中，该模板序列能够与目标ctDNA互补配对，并进而能够在聚合酶和内切酶的联合作用下发生链置换聚合反应，产生辅助DNA序列；
2)设计三段颈环结构DNA序列：FWJ1、FWJ2和FWJ3；其中，FWJ1末端修饰有第一荧光基团，FWJ2末端修饰有第一淬灭基团，FWJ3末端同时修饰有第二荧光基团和第二淬灭基团；
3)将三段颈环结构DNA序列与辅助DNA序列混合，在辅助DNA序列的协助下，能够实现两种荧光信号强度的反向转变，通过对荧光光谱进行分析处理，得出比率信号，从而实现对目标ctDNA的定量检测。
优选的是，所述的比率型ctDNA定量检测方法，其中，所述目标ctDNA的序列为：GTTGGAGCTAGTGGCGTAG。
优选的是，所述的比率型ctDNA定量检测方法，其中，所述模板序列为：TCAAGTATCGGAAGACTCGGACTACAAGACGAGTTCATCTCTAGGCTACCTCAGCTACGCCACTAGCTCCAAC。
优选的是，所述的比率型ctDNA定量检测方法，其中，所述FWJ1的序列为：Cy5-CAAGACGAGTTCATCTCTAGGCTAAGAGATGAACTC。
优选的是，所述的比率型ctDNA定量检测方法，其中，所述FWJ2的序列为：GAGTCTTCCGATTCAAGTATCGGAAGACTCGGACTA-Dabcyl。
优选的是，所述的比率型ctDNA定量检测方法，其中，所述FWJ3的序列为：FAM-TACTAGAGTTCATCTCTATCGGAAGACTCTAGTA-Dabcyl。
本发明的有益效果是：本案首先特殊设计了一段与目标ctDNA互补的模板序列，目标序列可以与其互补配对进而在聚合酶和内切酶的联合作用下发生链置换聚合反应，产生可以使荧光信号变化的辅助DNA序列；为了成功构建基于ctDNA的荧光比率传感器，特殊设计了三种具有不同修饰的颈环结构DNA序列，在辅助DNA的协助下，成功实现两种荧光信号的反方向转变，通过对荧光光谱进行分析处理，得出比率信号，从而实现对ctDNA的超灵敏检测；本案的检测方法灵敏度高、特异性好、对人员和设备要求低，检测方便快捷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本案的比率型ctDNA定量检测方法的原理示意图。
图2为目标ctDNA存在与不存在条件下检测体系的荧光光谱图。
图3为不同浓度ctDNA触发反应后检测体系的荧光光谱及标准曲线分析图。
图4为目标ctDNA在不同血清样本中的分析结果图。
图5为特异性实验的分析结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例：以GTTGGAGCTAGTGGCGTAG作为目标ctDNA为例，本实施例涉及的DNA序列如表1：
表1DNA序列
Figure BDA0002343418230000031
Figure BDA0002343418230000041
本案的检测原理如图1所示：目标ctDNA与模板序列(template)互补配对后，可以作为引物在DNA聚合酶催化下延伸形成完整双链，由于该双链存在切刻内切酶的酶切位点，在被切割形成nick(缺口)后，DNA聚合酶可以从该位点进一步催化聚合反应，从而替换出一条单链DNA，即辅助DNA序列(FWJ4)。三段颈环结构DNA中，FWJ1末端修饰有Cy5基团，其可发射红色荧光，FWJ2末端修饰有淬灭基团(Dabcyl基团)，FWJ3因其末端同时修饰有FAM基团(绿色荧光基团)与淬灭基团(Dabcyl基团)，因此FWJ3无法发射绿色荧光。当体系中存在FWJ4时，颈环结构会被相继打开，从而形成DNA结的结构(如图1所示)，该结构中FWJ1的Cy5基团与FWJ2的淬灭基团靠近，从而使得红色荧光被淬灭，而FWJ3颈环结构的打开会分离FAM基团与淬灭基团，从而使得绿色荧光得以恢复；通过分析绿色荧光的增强和红色荧光的减弱，可以计算出目标ctDNA的浓度。
具体操作为：
1)将确定浓度的三条颈环结构DNA(FWJ1,FWJ2,FWJ3)，放置在95℃孵育5分钟后，缓慢降温到25℃并且在该温度下保持60分钟；
2)配制不同浓度的目标ctDNA标准液：1,10,20,40,60,80,100,150,200nM；
3)将配制好的标准液与确定浓度的模板序列(500nM)、klenow片段(0.02U/μL)、Nb.BbvCI限制性内切酶(0.1U/μL)和dNTPs(250μM)混合，在确定温度下孵育120分钟后，在85℃保持20分钟终止反应；
4)将上述混合物与三种的颈环结构探针(500nM)混合在室温下孵育一定时间(10min以上)，随后用瞬态荧光光谱仪FLS 1000在494nm以及643nm激发下分别获得荧光光谱，并对荧光光谱进行分析比较，得出ctDNA定量检测的标准曲线图；
5)将待测样品与模板序列(500nM)、klenow片段(0.02U/μL)、Nb.BbvCI限制性内切酶(0.1U/μL)和dNTPs(250μM)混合，在30℃下孵育120分钟后，在85℃保持20分钟终止反应，待上述反应液冷却至室温后与三种确定浓度的颈环结构探针混合，并在室温下孵育一定时间(10min以上)，随后用瞬态荧光光谱仪FLS 1000在494nm以及643nm激发波长激发下分别获得其荧光光谱；对荧光光谱进行处理分析后，与标准曲线对比，从而计算出待测样品中的ctDNA含量。
如图2所示，在没有目标ctDNA存在条件下，荧光光谱图中不存在绿色荧光的峰，且红色荧光的峰强度非常高。而在目标ctDNA存在情况下，绿色荧光峰得以大大增强，而红色荧光峰减弱，与实验原理相符。
如图3所示，随着体系中加入越来越高浓度的ctDNA，绿色荧光峰越来越高而红色荧光峰越来越弱，分析峰强度可知，两个荧光峰强度的比值与ctDNA浓度呈正相关。
将确定浓度的ctDNA加入到不同的血清样本中，重复上述步骤，在不同的激发波长下得到荧光光谱图，与相同浓度的标准液的光谱图进行比较分析；如图4所示，在两种血清样本中加入不同浓度的ctDNA后，进行荧光检测，得出的比率荧光峰数据与标准缓冲液(将已知浓度的ctDNA加入到缓冲液体系后，检测比率荧光响应)数据进行比较，得到的结果基本一致，说明本案的检测方法适用于复杂生物样本中的应用。
将确定浓度的错配DNA序列(mismatch 1、mismatch 2、mismatch 3和mismatch 4)替代目标序列，重复上述步骤，得到的荧光光谱图与目标序列的荧光光谱图进行比较分析，即可得到特异性实验的分析结果。如图5所示，在荧光检测体系中使用碱基错配的DNA序列代替目标ctDNA进行反应，得到的荧光光谱图与目标ctDNA结果相比较，发现绿色荧光峰与红色荧光峰没有发生预期改变，比率荧光峰强度这一指标可以很明显地区分出目标ctDNA与错配的DNA序列，因此该方法具有很好的选择性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
序列表
<110> 济南国科医工科技发展有限公司
天津国科医工科技发展有限公司
<120> 一种比率型ctDNA定量检测方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttggagcta gtggcgtag 19
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaagtatcg gaagactcgg actacaagac gagttcatct ctaggctacc tcagctacgc 60
cactagctcc aac 73
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cycaagacga gttcatctct aggctaagag atgaactc 38
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagtcttccg attcaagtat cggaagactc ggactadabc y 41
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagtcttccg attcaagtat cggaagactc ggacta 36
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tactagagtt catctctatc ggaagactct agta 34
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tagcctagag atgaactcgt cttgtagtcc gagtcttccg atacttga 48
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttggagctg atggcgtag 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttggagctg ctggcgtag 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttggagctg ttgacgtag 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttggagctg gtgacgtag 19

Claims (1)

1.一种用于非疾病诊断的比率型ctDNA定量检测方法，其特征在于，包括：
1)设计一段与待测的目标ctDNA互补的模板序列，其中，该模板序列能够与目标ctDNA互补配对，并进而能够在聚合酶和内切酶的联合作用下发生链置换聚合反应，产生辅助DNA序列；
2)设计三段颈环结构DNA序列：FWJ1、FWJ2和FWJ3；其中，FWJ1末端修饰有第一荧光基团，FWJ2末端修饰有第一淬灭基团，FWJ3末端同时修饰有第二荧光基团和第二淬灭基团；
3)将三段颈环结构DNA序列与辅助DNA序列混合，在辅助DNA序列的协助下，能够实现两种荧光信号强度的反向转变，通过对荧光光谱进行分析处理，得出比率信号，从而实现对目标ctDNA的定量检测；
所述目标ctDNA的序列为：GTTGGAGCTAGTGGCGTAG；
所述模板序列为：TCAAGTATCGGAAGACTCGGACTACAAGACGAGTTCATCTCTAGGCTACCTCAGCTACGCCACTAGCTCCAAC；
所述FWJ1的序列为：Cy5-CAAGACGAGTTCATCTCTAGGCTAAGAGATGAACTC；
所述FWJ2的序列为：GAGTCTTCCGATTCAAGTATCGGAAGACTCGGACTA-Dabcyl；
所述FWJ3的序列为：FAM-TACTAGAGTTCATCTCTATCGGAAGACTCTAGTA-Dabcyl。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146826A (zh) * 2013-03-07 2013-06-12 宋现让 一种定量测定血液循环dna的方法
CN105219862A (zh) * 2015-10-16 2016-01-06 宋现让 一种快速准确的定量测定血液循环dna的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146826A (zh) * 2013-03-07 2013-06-12 宋现让 一种定量测定血液循环dna的方法
CN105219862A (zh) * 2015-10-16 2016-01-06 宋现让 一种快速准确的定量测定血液循环dna的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rapid and Selective Determination of Zika Virus RNA using a Universal DNA-Hairpin probe;Charles A.Lynch III et al;《Analytical Chemistry》;第91卷(第21期);第13458-13464页 *
Rationmetric fluorescence method for ctDNA analysis based on the construction of a DNA four-way junction;Guangxing Liu et al;《Analyst》;第145卷;第1174-117页 *
硫堇与DNA相互作用及DNA光散射/荧光比率测定方法;李原芳等;《分析化学》(第04期) *

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