CN113215325A - 二维pcr单管闭管检测多种hpv亚型的反应体系、方法及试剂盒 - Google Patents
二维pcr单管闭管检测多种hpv亚型的反应体系、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系、方法及试剂盒，该二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，二维PCR反应体系内包括所有待测HPV亚型的上游引物，每种待测HPV亚型的上游引物上均设置有标签，每种待测HPV亚型的标签上均形成有单核苷酸多态性位点，以使每种待测HPV亚型具有不同的熔解温度。其优点在于：建立高通量二维PCR单管闭管检测5种HPV基因型用于尖锐湿疣的早期筛查和预防，基于碱基猝灭探针基础上的二维PCR技术，根据一个靶基因同时对应熔解温度以及荧光检测通道的原理，实现一种荧光通道检测多个基因。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系、方法及试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种小型环状双链DNA病毒，其基因组分为3个区域，包括早期转录区(E区，包含基因E1－E7)、晚期转录区(L区，包含基因L1和L2)和非编码区(也称长控制区，位于L1和E6开放阅读框架之间)。根据编码衣壳蛋白L1区基因序列差异，可将HPV分为不同亚型。根据HPV介导的致癌作用，HPV分为高危型HPV(致癌)和低危型HPV(引起疣)。高危型HPV有HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68，共13种；低危型HPV有HPV-6、-11、-42、-43、-44，共5种。宫颈癌前病变又称为宫颈上皮内瘤变(CINs)，和宫颈癌与经性传播的高危HPV感染密切相关，持续的高危型HPV感染导致99％以上的宫颈癌。其中HPV16型和18型是导致70％宫颈癌的高危亚型。尖锐湿疣(CA)，又称生殖器疣(AGWs)，是由HPV感染引起的最常见的性传播疾病。虽然至少有40余种HPV基因型与CA有关，例如HPV6、11、16、42、43等，但是大多数CA是由低危型HPV-6和HPV-11的持续感染引起。持续的低风险基因型HPV-6和HPV-11可致大多数的生殖器疣和呼吸道乳头状瘤病，但很少与癌症相关。高风险HPV基因型还可导致肛门癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌和口咽癌。因此HPV检测有利于生殖器疣、呼吸道乳头状瘤病以及包括宫颈癌在内的多种肿瘤的早期筛查和预防。
聚合酶链反应(PCR)技术是目前检测HPV感染和分型的最常用技术，包括常规PCR、嵌套PCR、实时PCR、多重PCR检测等。虽然巢式PCR和实时PCR较传统PCR相比具有许多优点，如灵敏度高、准确度提高等，但这些方法同样存在检测通量低、大规模和多基因试验耗时长的缺点。多重PCR具有成本低、省时、检测通量高等优点。而根据检测PCR产物方法的不同，可分为开管检测和闭管检测两种。开管检测通过电泳、质谱、液体芯片、测序和点印迹杂交等方法鉴定PCR产物，这些检测方法存在设备要求高、操作复杂、成本高、开管检测产物导致实验室污染假阳性高等缺点。闭管检测包括高分辨熔融曲线分析、荧光熔融曲线分析、荧光PCR(TaqMan)检测，这些方法均存在单管检测通量低的缺点。
综上可知，如果能在单管闭管条件下通过PCR反应实现批量基因得检测及分型，将会大大提升临床疾病的诊治速度。
前面的叙述在于提供一般的背景信息，并不一定构成现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系、方法及试剂盒，该反应体系能够在单管闭管的反应条件下，结合PCR以及熔解曲线分析方法实现多种HPV亚型的高通量检测及分型，操作简单且无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，可推广运用于大规模人群筛查。
本发明提供一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，所述二维PCR反应体系内包括所有待测HPV亚型的上游引物，每种所述待测HPV亚型的上游引物上均设置有标签，每种所述待测HPV亚型的标签上均形成有单核苷酸多态性位点，以使每种所述待测HPV亚型具有不同的熔解温度。
进一步地，该反应体系用于同时检测HPV-6，HPV-11，HPV-42，HPV-16和HPV-43五种HPV亚型中的至少两种。
进一步地，25μL的二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×buffer缓冲液；1.0μL-2.5μL 25mM镁离子熔液；0.7μL的4×2.5mM dNTPs；0.5μL的5U/μL hot taq DNA聚合酶；0.05μL-0.2μL浓度为10μM的每种所述待测HPV亚型对应的所述标签的上游引物；0.2μL-0.8μL浓度为10μM的每种所述待测HPV亚型对应的下游引物及0.2μL-0.5μL浓度为10μM的探针，补足去离子水至23μL，并加入2μL待测样品。
进一步地，25μL的二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×buffer缓冲液；1.5μL 25mM镁离子熔液；0.7μL的4×2.5mM dNTPs；0.5μL的5U/μL hot taq DNA聚合酶；0.4μL的浓度为10μM的探针；浓度为10μM的HPV-6，HPV-11，HPV-42及HPV-43对应的带所述标签的上游引物每种0.1μL，0.2μL浓度为10μM的HPV-16对应的带所述标签的上游引物；浓度为10μM的HPV-6，HPV-11，HPV-16及HPV-42对应的下游引物每种0.6μL，0.7μL浓度为10μM的HPV-43对应的下游引物；补足去离子水至23μL，并加入2μL待测样品。
进一步地，用于检测HPV-6亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-6的上游引物：
CCATTACCTAGCTTATACATTTCCACAGACGTGCTAATTCGGTGCT
HPV-6的下游引物：
TTGTCCAGCAGTGTAGGCAG；
用于检测HPV-11亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-11的上游引物：
CCATTACGAACCTTAAGCACTTCCACTTGCAGGAATGCACTGACCA
HPV-11的下游引物：
ACGGCTTGTGACACAGGTAA；
用于检测HPV-42亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-42的上游引物：
CCATTACCTTGCTTATACACTTCCACGATGTAGGGTTTGGGGCACT
HPV-42的下游引物：
GCGCCAGCCCTATTAAACAA；
用于检测HPV-43亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-43的上游引物：
CCATTACCAACCTTATACACTTCCACAGCGTTTAGTCTGGGGATGC
HPV-43的下游引物：
TATCTTGTCCCGGCGATGTG；
用于检测HPV-16亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-16的上游引物：
CCCTAACTTTCAATCTCCATTCCTTTCACTAATTCACAGGCAAAAATTGTAAAGG
HPV-16的下游引物：
ATTTTATCCATTGACTCATACTCATTTGT；
针对FAM荧光检测通道的探针为：
FAM-CCATTACCAACCTTATACACTTCCAC-P。
一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的检测方法，该方法包括如下步骤：
S1：建立二维PCR反应体系，所述二维PCR反应体系为权利要求1至5中任意一项所述的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系；
S2：对待测样品进行PCR反应，以及对PCR反应后的产物进行升温并持续采集荧光信号；
S3：对熔解谷的熔解温度进行分析，每一所述熔解谷温度对应一种所述HPV亚型。
进一步地，在S2步骤中，PCR的反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后由30℃连续升温至80℃并持续收集荧光信号；40℃冷却30秒。
一种用于二维PCR单管闭关检测多种HPV亚型的试剂盒，所述试剂盒内包含有上述的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系。
本发明的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系、方法及试剂盒，该反应体系能够在单管闭管的反应条件下，结合PCR以及熔解曲线分析方法实现多种HPV亚型的高通量检测及分型，操作简单且无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，可推广运用于大规模人群筛查。
附图说明
图1为本发明实施例提供的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系的优化实验流程示意图。
图2为5个前标签序列在FAM通道中的熔解曲线汇总示意图。
图3为二维PCR反应体系对于HPV-6及HPV-43的优化实验结果汇总示意图。
图4为高通量二维PCR体系特异性实验结果汇总示意图。
图5为高通量二维PCR体系模拟混合感染实验的五重感染熔解曲线示意图。
图6为高通量二维PCR体系灵敏度实验结果汇总示意图。
图7为部分临床样本二维PCR检测结果汇总图。
图8是二维PCR的方法原理图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。
本发明的目的在于提供一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系、方法及试剂盒，该反应体系能够在单管闭管的反应条件下，结合PCR以及熔解曲线分析方法实现多种HPV亚型的高通量检测及分型，操作简单且无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，可推广运用于大规模人群筛查。
本发明提供的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，二维PCR反应体系内包括所有待测HPV亚型的上游引物，每种所述待测HPV亚型的上游引物上均设置有标签，每种所述待测HPV亚型的标签上均形成有单核苷酸多态性位点，以使每种所述待测HPV亚型具有不同的熔解温度。
该反应体系可以用于同时检测HPV-6，HPV-11，HPV-42，HPV-16和HPV-43五种HPV亚型中的至少两种。
25μL的二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×buffer缓冲液；1.0μL-2.5μL25mM镁离子熔液；0.7μL的4×2.5mM dNTPs；0.5μL的5U/μL hot taq DNA聚合酶；0.05μL-0.2μL浓度为10μM的每种所述待测HPV亚型对应的所述标签的上游引物；0.2μL-0.8μL浓度为10μM的每种所述待测HPV亚型对应的下游引物及0.2μL-0.5μL浓度为10μM的探针，补足去离子水至23μL，并加入2μL待测样品。
进一步地，25μL的二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×buffer缓冲液；1.5μL 25mM镁离子熔液；0.7μL的4×2.5mM dNTPs；0.5μL的5U/μL hot taq DNA聚合酶；0.4μL的浓度为10μM的探针；浓度为10μM的HPV-6，HPV-11，HPV-42及HPV-43对应的带所述标签的上游引物每种0.1μL，0.2μL浓度为10μM的HPV-16对应的带所述标签的上游引物；浓度为10μM的HPV-6，HPV-11，HPV-16及HPV-42对应的下游引物每种0.6μL，0.7μL浓度为10μM的HPV-43对应的下游引物；补足去离子水至23μL，并加入2μL待测样品。
用于检测HPV-6亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-6的上游引物：
CCATTACCTAGCTTATACATTTCCACAGACGTGCTAATTCGGTGCT
HPV-6的下游引物：
TTGTCCAGCAGTGTAGGCAG；
用于检测HPV-11亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-11的上游引物：
CCATTACGAACCTTAAGCACTTCCACTTGCAGGAATGCACTGACCA
HPV-11的下游引物：
ACGGCTTGTGACACAGGTAA；
用于检测HPV-42亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-42的上游引物：
CCATTACCTTGCTTATACACTTCCACGATGTAGGGTTTGGGGCACT
HPV-42的下游引物：
GCGCCAGCCCTATTAAACAA；
用于检测HPV-43亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-43的上游引物：
CCATTACCAACCTTATACACTTCCACAGCGTTTAGTCTGGGGATGC
HPV-43的下游引物：
TATCTTGTCCCGGCGATGTG；
用于检测HPV-16亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-16的上游引物：
CCCTAACTTTCAATCTCCATTCCTTTCACTAATTCACAGGCAAAAATTGTAAAGG
HPV-16的下游引物：
ATTTTATCCATTGACTCATACTCATTTGT；
针对FAM荧光检测通道的探针为：
FAM-CCATTACCAACCTTATACACTTCCAC-P。
本发明还提供了一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的检测方法，该方法包括如下步骤：
S1：建立二维PCR反应体系，二维PCR反应体系为上述的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系；
S2：对待测样品进行PCR反应，以及对PCR反应后的产物进行升温并持续采集荧光信号；具体地，PCR的反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后由30℃连续升温至80℃并持续收集荧光信号；40℃冷却30秒。
S3：对熔解谷的熔解温度进行分析，每一熔解谷温度对应一种所述HPV亚型。
本发明还提供了一种用于二维PCR单管闭关检测多种HPV亚型的试剂盒，试剂盒内包含有上述的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系。
具体优化实验如下：
图1为本发明实施例提供的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系的优化实验流程示意图。请参照图1，优化实验包括以下步骤：
S1：建立二维PCR探针及标签库；
步骤S1包括：
针对FAM荧光检测通道设计探针序列，并在5’端添加相应的荧光基团，3’端由磷酸基团封闭；
应用前标签序列(标签的反向互补序列)来进行筛选实验，由于标签序列与前标签互补的性质，进而可以筛选合适的标签；为了保证前标签序列的稳定性使得探针能获得更佳的荧光猝灭效果，可以在前标签序列的5’端增加G碱基数量；
对原前标签序列进行除额外增加的G碱基以外的序列片段进行随机位置的不同碱基的突变，以设计九组与原前标签序列同源的序列；
将探针序列与九组突变前标签序列及一组原前标签序列，一共十组前标签序列交由上海生工进行合成；
将每组前标签序列与FAM探针进行熔解温度的探索。具体的，采用普通Taq酶体系。反应体系组成如下：2.5μL的10×buffer(Mg2+free)，1.5μL的25mM Mg2+，0.5μL的4×2.5mMdNTPs，0.25μL的5U/μLTaq DNA聚合酶，0.1μL10μM的前标签序列，0.1μL的10μM的探针，随后加入ddH2O补足反应体系至25μL。加入前标签序列时应当注意避免污染，以免造成后续实验的假阳性结果，影响实验进程。PCR反应程序如下：95℃10秒，30℃4分钟，随后温度持续上升至80℃并持续采集荧光信号。最终依据获得的熔解温度和熔解曲线的优劣对前标签序列进行筛选，建立合适的探针及标签库。由于当两个相邻的前标签序列之间的熔解温度差异很小时，非专业人员很难判断2D-PCR反应中是否存在双重感染。考虑到临床多重感染，基于熔解温度差异大于3℃的原则，选择了5个前标签序列包括F1、F2、F3、F7和F10，熔融温度分别为40.7℃、45.3℃、49.5C、53.5C和61.4℃，(如表1所示)。
表1：各前标签序列在FAM荧光检测通道中熔解温度的汇总表
图2为5个前标签序列在FAM通道中的熔解曲线汇总示意图，如图2所示，选择的5个前标签序列在FAM通道中的熔解曲线汇总图，F1、F2、F3、F7和F10的熔解温度分别为40.7℃、45.3℃、49.5℃、53.5℃和61.4。在FAM通道中得到的所有熔解曲线在一张图片中一起呈现时都是可清晰分辨的。
请再次参照图1，S2：设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化；
步骤包括：
选择了包括16、6、11、42、43型的5种HPV基因亚型通过FAM荧光通道进行检测；
制备FAM荧光检测通道探针及各基因型的带标签的上游引物与不带标签的下游引物(如表2所示)；各上游引物的标签可以由S1步骤得知。上游引物、下游引物及探针均按照要求用缓冲液稀释为10μM，由于二维PCR体系中所用引物探针较多，故稀释样本均注明浓度和名称。探针应注意避光保存。
表2：所有引物及探针序列汇总表
制备包含不同HPV扩增子的质粒样本；质粒样本原液进行稀释，稀释完成后，每个HPV亚型质粒样本选用七个稀释的样本，浓度在10^1拷贝/μL到10^7拷贝/μL进行后续实验，余质粒样本予以冻存。
进行单对引物单基因检测实验；以保证引物能成功扩增靶基因，探针能成功检测出待检靶基因，PCR反应体系如下：2.5μL的10×无镁离子缓冲液，1.5μL的25mM镁离子熔液，0.5μL的4×10mM dNTPs，0.25μL的5U/μL的Taq DNA聚合酶，0.1μL的10μM带标签引物，0.1μL的10μM的不带标签引物，0.1μL的10μM探针，然后加入去离子水补足反应体系至23μL。每个HPV样本做3个孔。PCR反应程序为：95℃2分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后温度由30℃持续上升至80℃持续收集荧光信号；最后40℃持续30秒。结果显示依据表2制得的五种型别的HPV引物均能扩增出相应的靶基因，探针能成功检出待检靶基因。
运用热启动Taq酶体系初步设计二维PCR反应体系；初步设计每管25μL二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×buffer缓冲液，1.0μL 25mM镁离子熔液，0.7μL的4×2.5mMdNTPs，0.5μL的5U/μL hot taq DNA聚合酶，0.4μL的浓度为10μM探针，0.1μL浓度为10μM的每个带标签靶基因特异性引物，0.1μL浓度为10μM的每个靶基因不带标签引物，而后加入去离子水使得PCR反应体系达到23μL，最后加入2μL样本。PCR反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后由30℃连续升温至80℃并持续收集荧光信号；40℃冷却30秒。
不带标签引物用量比例优化实验；图3为二维PCR反应体系对于HPV-6及HPV-43的优化实验结果汇总示意图。请参照图3，将带标签引物固定在每反应体系0.04mM，而后调整不带标签引物的量从低到高为0.08mM，0.12mM，0.20mM，0.24mM和0.28mM，PCR反应体系中其余组分均保持一样，进行二维PCR反应寻找不带标签引物最佳用量。从图3的A中可以看出紫色的那条熔解曲线最佳，表明HPV-6的不带标签引物最优用量为0.24mM(紫色)，而从图3的B中可以看出橙色的那条熔解曲线最佳，表明HPV-43的不带标签引物最优用量为0.28mM(橙色)，此外HPV-11,HPV-16及HPV-42最佳不带标签用量均为0.24mM。
带标签引物用量比例优化实验；进一步参照图3，将不带标签引物固定在每反应体系HPV-6，HPV-11，HPV-16及HPV-42均为0.24mM，HPV-43不带标签用量为0.28mM，而后调整带标签引物的量从低到高为0.02mM，0.04mM，0.06mM和0.08mM，PCR反应体系中其余组分均保持一样，进行二维PCR反应寻找带标签引物最佳用量。图3的C和图3的D分别是HPV-6及HPV-43的带标签引物优化实验熔解曲线汇总图，从图3的C中可以看出橙色(0.04mM)的那条熔解曲线最佳，表明HPV-6的带标签引物最优用量为0.04mM(橙色)，而从图3的D中可以看出红色(0.08mM)的那条熔解曲线最佳，表明HPV-43的带标签引物最优用量为0.08mM(红色)，此外HPV-11,HPV-16及HPV-42最佳不带标签用量均为0.04mM。结果显示HPV-6，HPV-11，HPV-42及HPV-43最佳带标签用量均为0.04mM，HPV-16最佳带标签用量为0.08mM。
探针浓度优化实验；进一步参照图3，在带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验结果基础上设计探针的用量由低到高分别为0.08mM,，0.12mM，0.16mM和0.20mM共4个反应体系，除了探针的用量和相应的去离子水的用量不同外，其余反应体系的组成成分相同。进行二维PCR反应寻找最优探针浓度。图3的E和图3的F分别是HPV-6及HPV-43的FAM探针用量优化实验熔解曲线汇总图，从图3的E中可以看出灰色(0.16mM)的那条熔解曲线最佳，表明HPV-6的FAM探针最优用量为0.16mM(灰色)，而从图3的F中可以看出紫色(0.16mM)的那条熔解曲线最佳，表明HPV-43的带标签引物最优用量为0.16mM(紫色)，此外HPV-11,HPV-16及HPV-42最佳FAM探针用量均为0.16mM。结果发现最佳探针用量为0.16mM。
镁离子浓度优化实验；进一步参照图3，设计镁离子量由低到高分别为1.0mM，1.5mM，2.0mM和2.5mM共4个反应体系，其余反应体系与引物和探针优化后的相同。进行二维PCR反应寻找最佳镁离子浓度。实验结果表明图3的G和图3的H分别是HPV-6及HPV-43的Mg2+用量优化实验熔解曲线汇总图，从图3的G中可以看出棕红色(1.5mM)的那条熔解曲线最佳，表明HPV-6的Mg2+最优用量为1.5mM(棕红色)，而从图3的H中可以看出紫色(1.5mM)的那条熔解曲线最佳，表明HPV-43的带标签引物最优用量为1.5mM(紫色)，此外HPV-11,HPV-16及HPV-42最佳Mg2+探针用量均为1.5mM。结果发现最佳镁离子浓度为0.16mM。
请再次参照图1，S3：二维PCR技术应用及性能评估。
步骤包括：
采集280份宫颈刮取标本；包括HPV-6(n＝25)、HPV-11(n＝12)、HPV-16(n＝21)、HPV-42(n＝18)、HPV-43(n＝25)、HPV多重感染(n＝19)、HPV-其他类型阳性(n＝60)和HPV阴性样本(n＝100)。收集的样本置于-20℃存放。
通过核酸提取试剂盒抽提DNA；核酸置于-20℃保存。
图4为高通量二维PCR体系特异性实验结果汇总示意图。请参照图4，
高通量二维PCR体系特异性实验设计；优化后得二维PCR体系中加入探针以及相应的所有靶基因上下游引物，分别检测包括HPV16、6、11、42、43型在内的质粒样本。结果发现每次实验只能检测出相对于的质粒样本，实验特异性好无交叉反应(如图4所示)。
图5为高通量二维PCR体系模拟混合感染实验的五重感染熔解曲线示意图。请参照图5，
高通量二维PCR体系模拟混合感染实验设计；将各型的质粒样本以106/ul等体积混合后进行检测，结果发现五重感染均能检出(如图5所示)。
图6为高通量二维PCR体系灵敏度实验结果汇总示意图。请参照图6，
高通量二维PCR体系灵敏度实验设计；将各型的质粒样本原液予以十倍梯度稀释，10^8拷贝/μL以上浓度的样本予以封存，各型质粒选用浓度为10^7拷贝/μL到10^1拷贝/μL用于灵敏度实验，通过实验观察各型质粒的最低检出限。结果显示各型质粒的最低检出限分别为HPV-6(如图6中的A所示)，HPV-11(如图6中的B所示)，HPV-16(如图6中的C)，HPV-42(如图6中的D)和HPV-43(如图6中的E)分别为10^3、10^3、10^3、10^3和10^2拷贝/反应。
图7为部分临床样本二维PCR检测结果汇总图。请参照图7，
临床标本检测。用2D-PCR技术和Luminex方法对280个样品进行了检测。并对2D-PCR检测的所有阳性样品进行Sanger测序验证。进一步分析了这两种方法的敏感性和特异性。Luminex检测280份临床样本，检测结果显示100个HPV阴性，29个HPV-6阳性样本，12个HPV-11阳性样本，20个HPV-42阳性样本，27个HPV-43阳性样本，21个HPV-16阳性样本，10个HPV多重感染样本以及60个HPV其他型别阳性样本。二维PCR检测280份临床样本，检测结果显示100个HPV阴性，25个HPV-6阳性样本，12个HPV-11阳性样本，18个HPV-42阳性样本，25个HPV-43阳性样本，22个HPV-16阳性样本，19个HPV多重感染样本以及58个HPV其他型别阳性样本。(如表3所示)图7为部分临床样本二维PCR检测结果汇总图。
表3：二维PCR和Luminex检测结果比较汇总表
表4：11个二维PCR和Luminex检测结果不同的结果汇总表
表5：两种方法灵敏度及特异性比较
所有经2D-PCR检测的阳性结果均经Sanger测序验证，所有结果保持一致。然而，通过Luminex，仅检测到10例HPV-多重感染，而通过2D-PCR检测的另外9例HPV-多重感染仅检测到HPV-单一感染(如表3、表4所示)。
从表5中可以看出，2D-PCR的敏感性和特异性分别为100％，Luminex的敏感性和特异性分别为91％和100％。
图8是二维PCR的方法原理图。如图8所示，运用在碱基淬灭探针技术的基础上开创的一种二维PCR(Two-dimensional PCR，2D PCR)技术实现单管闭管检测五种HPV亚型(HPV-6,HPV-11,HPV-42,HPV-16和HPV-43)用于尖锐湿疣得早期发现、早期诊断以及治疗疗效检测。
碱基猝灭探针技术是指人为设计并合成和靶基因不发生非特异性结合的一段序列，然后在该序列的5’端标记实验需要的荧光基团并且在序列的3’端添加磷酸基团进行封闭，构成碱基猝灭探针。待PCR反应结束后进行熔解曲线分析，由于碱基淬灭探针和PCR扩增的靶基因序列会在较低温度情况下(例如30℃)发生杂交，从而导致探针上的荧光基团所发出的荧光被邻近碱基(A，T，C或G)淬灭；而后温度逐渐升高使得探针逐渐发生熔解脱离靶基因，使得放出的荧光无法被猝灭，荧光迅速增加。碱基猝灭探针依据不同等位基因间熔解温度(Tm)值的明显差异，通过Tm值实现准确识别靶序列。
二维PCR(2D-PCR)是一种结合PCR和熔融曲线分析的单管闭管多重PCR检测方法。首先，本实验基于碱基猝灭探针技术原理设计荧光探针。然后，人工设计并合成与荧光探针反向互补的前标签序列。随后为了实现荧光探针能够通过不同的熔解温度(TM)值识别一系列同源前标签序列，我们在原始的前标签序列上通过改变一些碱基来创建几个单核苷酸多态性(SNP)位点。随后，在不同靶基因的上游引物中添加不同的与前标签互补的标签序列，并通过PCR扩增靶基因通过TM值检测靶基因。因此，可以实现一个荧光通道的单管闭管试验同时检测多个靶基因，且可以通过添加更多的标签和增加荧光通道数量来进一步增加检测通量，通过荧光发射波长和TM值对每个靶基因进行鉴定。从图8中的A表明在不同靶基因的上游引物5’端添加伴有不同位置以及数量的碱基突变的标签序列，这些标签序列与探针序列之间具有同源性。图8中的B表示经过PCR扩增之后形成了与靶基因相连的标签序列以及标签序列的反向互补序列。图8中的C表示经过熔解曲线分析，探针可识别结合靶基因相连接的标签序列的反向互补序列，然后通过荧光猝灭以及再现的过程形成熔解曲线峰，通过对应的熔解温度可以准备识别待检靶基因，从而做到靶基因的鉴定。
基于上文的描述可知，本发明优点在于：
1、检测通量高：高通量二维PCR区别于传统PCR单管单基因检测，与多重PCR相比具有更高通量检测的优点，通过碱基猝灭探针与标签序列反向互补结合的原理，通过在上游引物上增加标签，然后通过荧光发射波长和溶解温度对每个靶基因进行鉴定，这就可以运用一个探针可单管检测多种靶基因，操作简单，降低成本，有较高的科学技术应用价值。
2、结果判读简单：高通量二维PCR将PCR反应与熔解曲线分析相结合，通过熔解温度来检测靶基因，从而实现闭管检测，较开管检测而言避免额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，简略操作步骤，降低检测成本，避免因开管产物外溢造成实验室污染引起结果假阳性，提高结果的准确性。
3、可实现多通道检测：高通量二维PCR通过多个结合不同荧光基团的探针序列以及多个分别扩增不同HPV基因型的带标签的上游引物和不带标签的下游引物序列单管检测实现多通量检测，每一个靶基因检测结果都对应着相应的温度以及荧光通道，通过增加荧光通道可实现单管检测更多靶基因的目标，具有单管闭管检测实现高通量检测的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<120> 二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系、方法及试剂盒
<130> 28696SSY-CN25861
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccattaccta gcttatacat ttccacagac gtgctaattc ggtgct 46
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtccagca gtgtaggcag 20
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccattacgaa ccttaagcac ttccacttgc aggaatgcac tgacca 46
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acggcttgtg acacaggtaa 20
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccattacctt gcttatacac ttccacgatg tagggtttgg ggcact 46
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgccagccc tattaaacaa 20
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccattaccaa ccttatacac ttccacagcg tttagtctgg ggatgc 46
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatcttgtcc cggcgatgtg 20
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccctaacttt caatctccat tcctttcact aattcacagg caaaaattgt aaagg 55
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
attttatcca ttgactcata ctcatttgt 29
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccattaccaa ccttatacac ttccac 26
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggggggtgga aatgtataag ctaggtaatg g 31
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggggggtgga agtgcttaag gttcgtaatg g 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggggggtgga agtgtataag caaggtaatg g 31
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggggggtgga agtcattaag gttggtaatg g 31
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggggggtgga agtgtataag gcaggtaatg g 31
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggggggtgga agtgtataag gtaggtaatg g 31
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggggggtgga agtgtataaa gttggtaatg g 31
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggggggtgga aatgtataag gttggtaatg g 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggggggtgga agtgtataag gttggtattg g 31
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggggggtgga agtgtataag gttggtaatg g 31
Claims (8)
1.一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，其特征在于：所述二维PCR反应体系内包括所有待测HPV亚型的上游引物，每种所述待测HPV亚型的上游引物上均设置有标签，每种所述待测HPV亚型的标签上均形成有单核苷酸多态性位点，以使每种所述待测HPV亚型具有不同的熔解温度。
2.根据权利要求1所述二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，其特征在于：该反应体系用于单管闭管同时检测HPV-6，HPV-11，HPV-42，HPV-16和HPV-43五种HPV亚型。
3.根据权利要求2所述二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，其特征在于：25μL的二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×buffer缓冲液；1.0μL-2.5μL 25mM镁离子熔液；0.7μL的4×2.5mM dNTPs；0.5μL的5U/μL hot taq DNA聚合酶；0.4μL的浓度为10μM探针；0.05μL-0.2μL浓度为10μM的每种所述待测HPV亚型对应的所述标签的上游引物；0.2μL-0.8μL浓度为10μM的每种所述待测HPV亚型对应的下游引物及0.2μL-0.5μL浓度为10μM的探针，补足去离子水至23μL，并加入2μL待测样品。
4.根据权利要求2所述二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，其特征在于：25μL的二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×buffer缓冲液；1.5μL 25mM镁离子熔液；0.7μL的4×2.5mM dNTPs；0.5μL的5U/μL hot taq DNA聚合酶；0.4μL的浓度为10μM的探针；浓度为10μM的HPV-6，HPV-11，HPV-42及HPV-43对应的带所述标签的上游引物每种0.1μL，0.2μL浓度为10μM的HPV-16对应的带所述标签的上游引物；浓度为10μM的HPV-6，HPV-11，HPV-16及HPV-42对应的下游引物每种0.6μL，0.7μL浓度为10μM的HPV-43对应的下游引物；补足去离子水至23μL，并加入2μL待测样品。
5.根据权利要求2所述二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系，其特征在于：
用于检测HPV-6亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-6的上游引物：
CCATTACCTAGCTTATACATTTCCACAGACGTGCTAATTCGGTGCT
HPV-6的下游引物：
TTGTCCAGCAGTGTAGGCAG；
用于检测HPV-11亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-11的上游引物：
CCATTACGAACCTTAAGCACTTCCACTTGCAGGAATGCACTGACCA
HPV-11的下游引物：
ACGGCTTGTGACACAGGTAA；
用于检测HPV-42亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-42的上游引物：
CCATTACCTTGCTTATACACTTCCACGATGTAGGGTTTGGGGCACT
HPV-42的下游引物：
GCGCCAGCCCTATTAAACAA；
用于检测HPV-43亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-43的上游引物：
CCATTACCAACCTTATACACTTCCACAGCGTTTAGTCTGGGGATGC
HPV-43的下游引物：
TATCTTGTCCCGGCGATGTG；
用于检测HPV-16亚型的引物的核苷酸序列为：
HPV-16的上游引物：
CCCTAACTTTCAATCTCCATTCCTTTCACTAATTCACAGGCAAAAATTGTAAAGG
HPV-16的下游引物：
ATTTTATCCATTGACTCATACTCATTTGT；
针对FAM荧光检测通道的探针为：
FAM-CCATTACCAACCTTATACACTTCCAC-P。
6.一种二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1：建立二维PCR反应体系，所述二维PCR反应体系为权利要求1至5中任意一项所述的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系；
S2：对待测样品进行PCR反应，以及对PCR反应后的产物进行升温并持续采集荧光信号；
S3：对熔解谷的熔解温度进行分析，每一所述熔解谷温度对应一种所述HPV亚型。
7.根据权利要求6所述的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的检测方法，其特征在于：在S2步骤中，PCR的反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后由30℃连续升温至80℃并持续收集荧光信号；40℃冷却30秒。
8.一种用于二维PCR单管闭关检测多种HPV亚型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包含有权利要求1至5中任意一项所述的二维PCR单管闭管检测多种HPV亚型的反应体系。
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