WO2013162109A1 - B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 - Google Patents

B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2013162109A1
WO2013162109A1 PCT/KR2012/003449 KR2012003449W WO2013162109A1 WO 2013162109 A1 WO2013162109 A1 WO 2013162109A1 KR 2012003449 W KR2012003449 W KR 2012003449W WO 2013162109 A1 WO2013162109 A1 WO 2013162109A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
virus
hbv
hepatitis
primer
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/003449
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
윤현규
Original Assignee
(주)바이오니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)바이오니아 filed Critical (주)바이오니아
Publication of WO2013162109A1 publication Critical patent/WO2013162109A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus

Definitions

  • the present invention relates to primers, probes, and detection kits and methods of the polymerase chain reaction for detecting hepatitis B virus, and more particularly to the detection of hepatitis B virus as well as genotype of hepatitis B virus.
  • the present invention relates to primers, probes, and detection kits and methods using the same, which can be simultaneously identified.
  • Hepatitis B virus (abbreviated as ⁇ HBV '') is estimated to have 350 million people worldwide. Of these, about 5% of the adult population in Korea is known to be carriers of HBV infection. It is classified as a rampant area. HBV infection causes acute and chronic hepatitis and is known as a major cause of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Therefore, an accurate diagnosis is necessary (Cha Chung-hwan et al. Korean J Lab Med 2003; 23: 352-6).
  • HBV diagnostic methods have been developed and commercialized according to these requirements.
  • Representative methods include immunological diagnostic methods using antigen-antibody reactions and nucleic acid amplification methods for amplifying and diagnosing specific sequences of the HBV genome.
  • Immunological diagnostics have the advantages of simple experiments and rapid results, but are difficult to identify in biological samples in the incubation phase (serum transduction incubation period) after antigen or antibody emergence after infection.
  • the polymerase chain reaction (hereinafter, abbreviated as 'PCR') that amplifies a specific portion of the HBV genome and confirms the amplification product by electrophoresis cannot exclude the contamination that may occur during the experiment process.
  • the result value cannot be quantified, and in the case of a diagnostic method for confirming genotype and infection through hybridization with an amplification product by integrating probes capable of confirming each genotype on a strip, quantitative analysis is difficult as well.
  • the experiment is complicated because additional experiments and visual confirmation of the results may be complicated and the results may differ depending on the skill of the experimenter.
  • the diagnosis method using the real-time polymerase chain reaction method is mainly used.
  • the genotypes of HBV can be divided into 8 types, such as A, B, C, D, E, F, G, H. In Korea, most of the HBV genotypes are occupied by B and C. (Kim BJ and Song BC., Korean J. Gastroenterol., 42 (6): 496-501, 2003).
  • D type predominates in Mongolia
  • a type predominates in Southeast Asia
  • interest in how to effectively detect HBV by genotype is increasing. to be.
  • the present inventors overcome the disadvantages of the conventional HBV diagnostic methods, and design a HBV detection primers and probes capable of quantitative analysis and high sensitivity, and at the same time can be diagnosed HBV genotype, by using the HBV PCR, in particular real-time PCR It was confirmed that each genotype can be detected quickly and with high sensitivity, and completed the present invention.
  • HBV hepatitis B virus
  • PCR polymerase chain reaction
  • Another object of the present invention is to provide a probe that can be used to detect hepatitis B virus (HBV) using a polymerase chain reaction (PCR).
  • HBV hepatitis B virus
  • PCR polymerase chain reaction
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting hepatitis B virus (HBV) comprising at least one of the primers and probes.
  • HBV hepatitis B virus
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting hepatitis B virus (HBV) by performing real-time PCR.
  • HBV hepatitis B virus
  • the present invention provides a primer for detecting hepatitis B virus (HBV) having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 7, in order to achieve the above object.
  • HBV hepatitis B virus
  • the present invention also provides a probe for detecting hepatitis B virus (HBV) having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 8 to 16.
  • HBV hepatitis B virus
  • the present invention also provides a kit for detecting hepatitis B virus (HBV), comprising the primer and probe.
  • HBV hepatitis B virus
  • the present invention provides a method for detecting hepatitis B virus (HBV) that can diagnose the HBV genotype using the hepatitis B virus (HBV) detection kit.
  • HBV hepatitis B virus
  • the forward primer consists of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, and 6, and the reverse primer consists of any one of SEQ ID NOs: 3, 5, and 7, hepatitis B virus (HBV ) Provides a primer for detection.
  • HBV hepatitis B virus
  • Hepatitis B virus (HBV) detection primer comprises a combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 It is characterized by consisting of a primer set.
  • primer refers to a single stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product.
  • the length and sequence of the primer should allow to start the synthesis of the extension product.
  • the specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
  • oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogs, such as phosphorothioate, alkylphosphothioate or peptide nucleic acid, or It may comprise an intercalating agent.
  • DNA intercalating may further include a material that emits fluorescence, phosphorescence or radioactivity.
  • the present invention also provides a probe for detecting hepatitis B virus (HBV) having a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 8 to 16.
  • HBV hepatitis B virus
  • the probe may further include, but is not limited to, DNA intercalating fluorescent, phosphorescent or radioactive material.
  • the labeling substance is VIC, NED, FAM or PET.
  • PCR is performed by labeling VIC, NED, FAM, or PET at the 5'-end of the primer, so that the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent labeling substance.
  • the label using the radioactive material may add radioactive isotopes such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution when PCR is performed, and the amplification product may be incorporated into the amplification product while the amplification product is synthesized.
  • the present invention provides a kit for detecting hepatitis B virus (HBV), which comprises the following i).
  • HBV hepatitis B virus
  • a primer for performing PCR oligonucleotide consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-7
  • the present invention also provides a kit for detecting hepatitis B virus (HBV) comprising the following i) and ii).
  • HBV hepatitis B virus
  • a primer for performing PCR oligonucleotide consisting of the base sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 7;
  • a probe for quantifying the DNA of the virus the oligonucleotide consisting of any one of SEQ ID NOs: 8 to 16
  • the primer of i) is a forward primer consists of any one of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 4 and 6, the reverse primer to any one of SEQ ID NO: 3, 5 and 7 Can be done.
  • the kit according to the present invention is a primer combination comprising a combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 It is characterized in that the configuration.
  • hepatitis B virus can be detected using PCR or real-time PCR.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR encompasses general (non-quantitative) PCR and quantitative PCR, and includes, for example, both general PCR and real-time PCR. It can be used to refer to 'general PCR or real-time PCR' or 'real-time PCR'.
  • the kit of the present invention may further include a reagent required for polymerase chain reaction (PCR) or real-time polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR real-time polymerase chain reaction
  • Reagents necessary for the PCR include, but are not limited to, a PCR buffer containing forward and reverse primers, an appropriate amount of Taq polymerase, a dNTP mixture, KCl, Tris-HCl, and MgCl 2 . ) And water.
  • the kit may also include instructions.
  • the guide is a printed document that explains how to use the kit, such as how to prepare a PCR buffer, and the reaction conditions presented.
  • the instructions include brochures in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit.
  • the guide includes information that is disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
  • hepatitis B virus in the detection of hepatitis B virus comprising the step of detecting and quantifying the virus by adding a primer and probe specific to the DNA of hepatitis B virus to a sample to perform real-time PCR,
  • Oligonucleotide consisting of any one of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 as a primer specific for the DNA of the hepatitis B virus
  • Hepatitis B using an oligonucleotide consisting of any one of SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, and 16 as a probe specific for the DNA of the hepatitis B virus
  • a method for detecting a virus (HBV) is provided.
  • the detection method according to the present invention has the advantage of simultaneously detecting, quantifying, and determining the genotype for hepatitis B virus according to the genotype.
  • hepatitis B virus (HBV) C genotype is performed by adding a primer set of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and a probe of SEQ ID NO: 10 specific to the DNA of hepatitis B virus (HBV) to a sample, and performing real-time PCR. Can be detected.
  • hepatitis B virus (HBV) E genotype is performed by adding a primer set of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and a probe of SEQ ID NO: 12 specific to the DNA of hepatitis B virus (HBV) to a sample and performing real-time PCR. Can be detected.
  • hepatitis B virus (HBV) H genotype is performed by adding a primer set of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and a probe of SEQ ID NO: 13 specific to the DNA of hepatitis B virus (HBV) to a sample, and performing real-time PCR. Can be detected.
  • hepatitis B virus (HBV) detection kit When the hepatitis B virus (HBV) detection kit according to the present invention is used, accurate detection of hepatitis B virus is possible, not only has a high sensitivity to HBV, but also can determine the genotype of HBV, and thus more effective B There is an advantage that can be widely used for the early diagnosis of hepatitis.
  • HBV hepatitis B virus
  • 1 is a view showing a binding site of SEQ ID NO: 1,
  • FIG. 3 is a view showing a binding site of SEQ ID NO: 10,
  • Figure 4 is a view showing the results confirmed by the real-time polymerase chain reaction of all genotype HBV by the combination of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 16,
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of confirming all genotypes of HBV by a real time polymerase chain reaction using a combination of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 16,
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of confirming the HBV F genotype by a real-time polymerase chain reaction method using a combination of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 13,
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of confirming the HBV H genotype by the real-time polymerase chain reaction in combination of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 15.
  • the representative nucleotide sequence information of each genotype was confirmed, and a primer sequence capable of amplifying each genotype was designed.
  • the primers of Table 1 can be used as primer sets of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7 in each amplification combination.
  • hepatitis B virus By using the primer set, all of the hepatitis B virus can be amplified regardless of the genotype.
  • a probe for distinguishing the HBV genotype was designed to detect the HBV genotype by real-time PCR.
  • Probe for distinguishing the HBV genotype is a primer set of Example 1, that is, in the common region of the DNA amplified by performing a PCR in combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3
  • Tm values were similarly selected to allow reaction under the same temperature conditions.
  • the probes of SEQ ID NOs: 8 to 15 can be obtained by PCR using the same primers, as well as to obtain amplification products of the same size, and are mixed in the amplification products according to the respective genotype-specific probes. Only genotypes can be identified.
  • SEQ ID NO: 8 only the HBV having the A, B, D, E genotype can be confirmed by fluorescence because it is cut during the reaction, and in the case of SEQ ID NO: 9 B, SEQ ID NO: 10
  • C type D type for SEQ ID NO: 11
  • E type for SEQ ID NO: 12 F type for SEQ ID NO: 13, G type for SEQ ID NO: 14, and H type for SEQ ID NO: 15
  • SEQ ID NO: 16 all genotypes were selected so that they could bind to each other.
  • Example 1 The primer of Example 1 and the probe of Example 2 were confirmed that all genotypes can be detected using Worldwide HBV DNA Performance Panel-WWHD301 (SeraCare, USA).
  • the amplification process was performed by real-time PCR with the selected primer and probe combination using the ExiCyclerTM Real-Time PCR System (Bioneer, Korea). Specifically, 5 ⁇ l of 10 ⁇ Buffer, 2.5 ⁇ l of Taq DNA polymerase, 5 ⁇ l of dNTP, Thermostable Pyrophosphatase, PPi, stabilizer, etc., were put in a tube, and the template DNA of the prepared hepatitis B virus was prepared in Table 1 and the above table. Primer for HBV detection of 3 and a probe and distilled water were added and mixed to a total volume of 50 ⁇ l and then dispensed into 96-well plates.
  • the forward primer, the reverse primer concentration was 25 pmole and the probe concentration was 12.5 pmole, respectively, contained in a total dose of 50 ⁇ l mixture.
  • the amplified fluorescence value was continuously measured once after 60 ° C. 30 second reaction as each PCR cycle proceeded.
  • genotype detection from A to H was confirmed by applying SEQ ID NO: 16 to the product amplified by the combination of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, shown in Figure 4, it was confirmed that all genotypes were detected.
  • the template DNA of the hepatitis B virus was synthesized by referring to a previous study (NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203) using a combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO. It was cloned into T-Easy Vector (Cat: A1360, manufactured by Promega, USA). The cloning method was carried out according to the experimental method provided by Promega, E. coli pluripotent cells were used as the product of HIT-DH5a (Real Biotech Corporation, Taiwan), and the prepared vector was used in the experimental method provided by Real Biotech Corporation. The transformation was carried out accordingly. The prepared pluripotent cells were plated on LB plate medium coated with ampicillin, IPTG, and X-Gal, and then cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • HBV hepatitis B virus
  • Tables 1 and 2 accurately detect hepatitis B virus, have a high sensitivity to HBV, and can also determine the genotype of HBV. Also confirmed.
  • SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 shows a primer sequence capable of all HBV genotype amplification
  • SEQ ID Nos: 8 to 16 show probe sequences for HBV genotype determination.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트를 사용할 경우 B형 간염바이러스의 정확한 검출이 가능하며, HBV에 대한 높은 민감도를 가지고 있을 뿐 아니라 HBV의 유전자형까지 확정할 수 있어, 보다 효과적인 B형 간염의 조기진단에 널리 활용될 수 있는 장점이 있다.

Description

B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법
본 발명은 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 B형 간염 바이러스의 검출 뿐 아니라 B형 간염 바이러스의 유전자형을 동시에 판별 할 수 있는 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, 이하 ‘HBV’라고 약칭함)는 전 세계적으로 3억 5천만명이 감염되어 있는 것으로 추정되며, 그 중 우리나라는 성인 인구의 약 5%가 보유자로 알려져 HBV 감염의 만연지역으로 분류되고 있다. HBV 감염은 급성, 만성 간염을 유발하고 간경변증, 간세포암의 주요한 원인으로 알려져 있어 정확한 진단이 무엇보다도 필요한 실정이다(차충환 외. Korean J Lab Med 2003; 23: 352-6).
최근 이러한 요구에 따라 다양한 HBV 진단법이 개발되어 상용화 되었는데 대표적인 진단법은 항원-항체 반응을 이용한 면역학적 진단법과 HBV 유전체의 특정 서열을 증폭하여 진단하는 핵산증폭법이 있다. 면역학적 진단법은 간단한 실험법과 빠른 결과가 장점이지만 감염 후 항원 또는 항체가 출현하기 이전의 잠복기(혈청전환잠복기)에 있는 생물학적 검체에서의 확인이 어려운 단점이 있다.
또한, HBV 유전체의 특정 부분을 증폭하여 전기영동으로 증폭산물을 확인하는 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, 이하: ‘PCR’이라고 약칭함)은 실험과정 중 발생할 수 있는 오염을 배제할 수 없고, 결과 값을 정량화 할 수 없다는 단점이 있으며, 각 유전자형을 확인할 수 있는 프로브를 스트립에 집적하여 증폭산물과의 교잡반응을 통하여 유전자형과 감염을 확인하는 진단법의 경우 마찬가지로 정량적 분석이 어렵고, 증폭 후 교잡실험을 추가로 진행하고 결과를 육안으로 확인해야 하기 때문에 실험이 복잡하고 실험자의 숙련도에 따라 결과 분석에 차이가 있을 수 있다. 뿐만 아니라 중합효소연쇄반응법과 동일하게 오염에 매우 취약한 단점이 있어 최근 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용한 진단법이 주로 사용되고 있는 실정이다.
그러나 최근 HBV 유전자형(genotype)에 따라 감염 후 자연경과의 차이가 있음이 밝혀지고, 특정 유전자형의 경우 심한 간질환, 간암으로 이행될 확률이 높다는 결과가 알려져 HBV 감염 여부만을 확인하는 기존의 진단법 뿐만 아니라 정확한 유전자형을 확인하는 것 또한 중요도가 높아지고 있다.
HBV의 유전자형은 A, B, C, D, E, F, G, H 등 8가지 형으로 구분할 수 있으며, 우리나라의 경우 대부분 B 및 C형이 차지하고 특히, 국내 환자에서 분리되는 HBV 대부분이 유전자형 C라고 보고되고 있다(참조: Kim BJ and Song BC., Korean J. Gastroenterol., 42(6):496-501, 2003). 하지만 같은 아시아 지역에서도 몽골은 D형이 우세하며, 동남아 특정 지역에서는 A형이 우세하게 감염되어 있는 지역적인 차이가 나타나는 것으로, 유전자형별 HBV를 효과적으로 검출할 수 있는 방법에 대한 관심이 증폭되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 종래의 HBV 진단법들이 가지는 단점을 극복하고, 정량분석과 높은 민감도를 가지며 동시에 HBV 유전자형의 진단이 가능한 HBV 검출형 프라이머 및 프로브를 설계하고, 이를 이용하여 PCR, 특히 실시간 PCR로 HBV 각각의 유전자형을 신속하고 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 B형 간염 바이러스(HBV)를 검출하는 데 사용할 수 있는 프라이머를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 B형 간염 바이러스(HBV)를 검출하는 데 사용할 수 있는 프로브를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 실시간 PCR을 수행하여 B형 간염 바이러스(HBV)를 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 염기서열을 가지는, B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 8 내지 16 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프로브를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는, B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트를 이용하여 HBV 유전자형을 진단할 수 있는, B형 간염 바이러스(HBV)의 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 정방향 프라이머가 서열번호 1, 2, 4 및 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지고, 역방향 프라이머가 서열번호 3, 5 및 7중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프라이머를 제공한다.
본 발명에 따른 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프라이머는 서열번호 1과 서열번호 3, 서열번호 2와 서열번호 3, 서열번호 4와 서열번호 5 및 서열번호 6과 서열번호 7의 조합을 이루는 프라이머 세트로 구성되어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 비록 한 가닥의 염기서열만을 기재하였지만, 표적 산물인 DNA 이중가닥 중 어느 가닥에 대해서도 프라이머 또는 프로브 디자인이 가능하므로, 본 발명의 권리범위는 상기 서열번호 1 내지 7의 프라이머에 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 8 내지 16 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프로브를 제공한다.
상기 프로브는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 VIC, NED, FAM 또는 PET 이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5‘-말단에 VIC, NED, FAM 또는 PET를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명은 하기 i)을 포함하는, B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트를 제공한다.
i) PCR을 수행하기 위한 프라이머로서, 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드
또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii)를 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트를 제공한다.
i) PCR을 수행하기 위한 프라이머로서, 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드; 및
ii) 상기 바이러스의 DNA를 정량하기 위한 프로브로서, 서열번호 8 내지 16 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드
본 발명에 있어서, 상기 i)의 프라이머는 정방향 프라이머가 서열번호 1, 2, 4 및 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지고, 역방향 프라이머가 서열번호 3, 5 및 7중 어느 하나의 염기서열로 이루어질 수 있다.
보다 상세하게는 본 발명에 따른 키트는 프라이머로 서열번호 1과 서열번호 3, 서열번호 2와 서열번호 3, 서열번호 4와 서열번호 5 및 서열번호 6과 서열번호 7의 조합을 이루는 프라이머 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 키트에서는 PCR, 또는 실시간 PCR을 이용하여 B형 간염 바이러스(HBV)를 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “중합효소연쇄반응” 또는 “PCR”은 일반(비정량) PCR과 정량 PCR을 포괄하는 것으로서, 예를 들어, 일반 PCR, 및 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이나, 문맥에 따라 '일반 PCR 또는 실시간 PCR'을 가리키거나 “실시간 PCR”을 가리키는 개념으로 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 PCR(Polymerase chain reaction) 또는 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction)에 필요한 시약를 더 포함할 수 있다.
상기 PCR에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 적당량의 DNA 중합 효소(Taq polymerase), dNTP 혼합물, KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유한 PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 시료에 B형 간염 바이러스의 DNA에 특이적인 프라이머 및 프로브를 가하여 실시간 PCR을 수행함으로써 상기 바이러스를 검출 및 정량하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스의 검출에 있어서,
상기 B형 간염 바이러스의 DNA에 특이적인 프라이머로서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7 중 어느 하나의 염기 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 사용하고,
상기 B형 간염 바이러스의 DNA에 특이적인 프로브로서 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 사용하는, B형 간염 바이러스(HBV)의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검출방법은 유전자형에 따른 B형 간염 바이러스에 대한 검출, 정량, 및 유전자형(genotype)의 판별을 동시에 할 수 있는 장점이 있다.
보다 상게하게는 시료에 B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA에 특이적인 서열번호 1과 서열번호 3의 프라이머 세트 및 서열번호 10의 프로브를 가하여 실시간 PCR을 수행함으로써 B형 간염 바이러스(HBV) C 유전자형을 검출할 수 있다.
보다 상게하게는 시료에 B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA에 특이적인 서열번호 1과 서열번호 3의 프라이머 세트 및 서열번호 12의 프로브를 가하여 실시간 PCR을 수행함으로써 B형 간염 바이러스(HBV) E 유전자형을 검출할 수 있다.
보다 상게하게는 시료에 B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA에 특이적인 서열번호 1과 서열번호 3의 프라이머 세트 및 서열번호 13의 프로브를 가하여 실시간 PCR을 수행함으로써 B형 간염 바이러스(HBV) H 유전자형을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트를 사용할 경우 B형 간염바이러스의 정확한 검출이 가능하며, HBV에 대한 높은 민감도를 가지고 있을 뿐 아니라 HBV의 유전자형까지 확정할 수 있어, 보다 효과적인 B형 간염의 조기진단에 널리 활용될 수 있는 장점이 있다.
도 1은 서열번호 1의 결합부위를 보여주는 도면이고,
도 2는 서열번호 9의 결합부위를 보여주는 도면이며,
도 3은 서열번호 10의 결합부위를 보여주는 도면이고,
도 4는 서열번호 4와 서열번호 5 그리고 서열번호 16의 조합으로 HBV 모든 유전자형을 실시간 중합효소연쇄반응법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이며,
도 5는 서열번호 4와 서열번호 5 그리고 서열번호 16의 조합으로 HBV 모든 유전자형을 실시간 중합효소연쇄반응법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이고,
도 6은 서열번호 1과 서열번호 3, 그리고 서열번호 13의 조합으로 HBV F 유전자형을 실시간 중합효소연쇄반응법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이며,
도 7은 서열번호 1과 서열번호 3, 그리고 서열번호 15의 조합으로 HBV H 유전자형을 실시간 중합효소연쇄반응법으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 유전자형에 따른 B형 간염 바이러스 증폭을 위한 프라이머의 선정
본 발명에 따라 HBV 유전자형의 판별을 위해서 각 유전자형별로 대표적인 염기서열 정보를 확인하고, 각각의 유전자형을 모두 증폭할 수 있는 프라이머 서열을 설계하였다.
보다 상세하게 우선적으로 선택된 유전자형에 따른 HBV의 염기서열들에 대한 상동성을 분석한 후, 도 1과 같이 보존적인 서열을 확인하였다. 상기 결과를 기반으로 각각의 유전자형을 모두 증폭할 수 있는 프라이머의 조합을 동일한 온도 조건에서 증폭이 가능하도록 적절한 Tm 값을 조사하였고, 설계된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다. 하기 K(G,T), R(A,G), Y(C,T) 등의 표기는 하나 이상의 염기 혼합의 경우에 표기한 것이다.
Figure PCTKR2012003449-appb-I000001
상기 표 1의 프라이머는 각각의 증폭 조합으로 서열번호 1과 서열번호 3, 서열번호 2와 서열번호 3, 서열번호 4와 서열번호 5, 서열번호 6과 서열번호7의 프라이머 세트로 이용가능하다.
상기 프라이머 세트를 이용함으로써 B형 간염 바이러스를 유전형에 상관없이 모두 증폭할 수 있는 바, 본 발명에서는 real-time PCR법과 일반 PCR법에 의해서 정량, 정성되는 과정을 거쳐 HBV 유전자형을 판별할 수 있는 표적산물을 얻을 수 있고, HBV 유전자형을 판별, 정량할 수 있다.
[실시예 2] HBV 유전자형 선별을 위한 프로브의 선택
본 발명에 따라 HBV 유전자형을 구분하기 위해서는 실시간 PCR법에 의해 HBV 유전자형을 검출하기 위하여 HBV 유전자형을 구분하기 위한 프로브를 설계하였다.
본 발명에 따라 HBV 유전자형을 구분하기 위한 프로브는 상기 실시예 1의 프라이머 세트 즉, 서열번호 1과 서열번호 3, 서열번호 2와 서열번호 3의 조합으로 PCR을 수행하여 증폭된 DNA의 공통 영역에서 특이적인 염기서열을 선택하여 동일한 온도조건에서 반응이 가능하도록 유사하게 Tm 값을 선정하였다.
상기 설계된 프로브에서 형광값의 확인을 위하여, 프로브의 5‘말단에는 FAM, 3’말단에는 BHQ1을 표지하였으며, 형광물질의 표지는 합성의 과정 중 프로브의 분해로 인한 형광값을 변화를 측정하기 위함으로, 특별히 상기에 기술한 형광물질에 한정하지 않는다. 상기 설계된 프로브 각각의 서열정보는 하기 표 2에 상세히 기술하였으며, 한국인에 대표적인 HBV 유전자형인 B형(도 2), C형(도 3)의 결합이 예상되는 부분을 노란색으로 표기하였다.
Figure PCTKR2012003449-appb-I000002
상기 표 2에서 서열번호 8 내지 15의 프로브는 동일한 프라이머를 사용하여 PCR을 할 경우, 동일한 크기의 증폭산물을 얻을 수 있을 뿐 아니라, 각각의 유전형 특이적인 프로브에 따른 증폭산물 내 혼합되어 있는 각각의 유전형만을 확인할 수 있다.
보다 상세하게는 서열번호 8의 경우 이름에 표기했던 것처럼, A, B, D, E 유전형을 가지는 HBV만이 결합하여 반응시 잘려지므로 형광을 확인할 수 있으며, 서열번호 9의 경우 B형, 서열번호 10의 경우 C형, 서열번호 11의 경우 D형, 서열번호 12의 경우 E형, 서열번호 13의 경우 F형, 서열번호 14의 경우 G형, 서열번호 15의 경우 H형이 각각 특이적으로 결합할 수 있도록 디자인하였고, 서열번호 16의 경우 모든 유전형이 결합할 수 있는 서열을 선택하였기 때문에 특정 유전형에 한정되지 않아 HBV 감염 여부를 확인할 수 있도록 디자인하였다.
[실시예 3] HBV genotype panel을 이용한 모든 유전자형의 검출
상기 실시예 1 프라이머 및 실시예 2의 프로브를 Worldwide HBV DNA Performance Panel-WWHD301(SeraCare사, 미국)을 이용하여 모든 유전자형의 검출이 가능함을 확인하였다.
증폭의 과정은 ExiCyclerTM Real-Time PCR System(Bioneer사, 한국)을 이용하여 선택된 프라이머와 프로브 조합으로 실시간 PCR을 진행하였다. 구체적으로는 10X Buffer 5 ㎕, Taq DNA polymerase 2.5 U, dNTP 20 mM 5 ㎕, Thermostable Pyrophosphatase, PPi, 안정화제 등을 한 튜브에 넣고, 상기 준비된 B형 간염 바이러스의 주형 DNA를 상기 표 1 및 상기 표 3의 HBV 검출용 프라이머와 프로브 및 증류수를 넣어 총 용량이 50 ㎕이 되도록 혼합한 후 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이 때, 총 용량 50 ㎕ 혼합액에 포함된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 농도는 각각 25 pmole 및 프로브의 농도는 12.5 pmole을 사용하였다. 이를 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 10초씩 45 사이클을 반응시켰다. 증폭된 형광값은 각 PCR 사이클이 진행됨에 따라 60℃ 30초 반응 후에 1회씩 지속적으로 측정되었다.
그 결과 서열번호 4와 서열번호 5의 조합으로 증폭된 산물에 서열번호 16을 적용하여 A 내지 H까지의 유전자형 검출을 확인하여 도 4에 나타내었고, 모든 유전자형이 검출됨을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] HBV 유전자형 분석
상기 실시예 1 프라이머 및 실시예 2의 프로브 조합으로 HBV 유전자형의 정확한 확인여부를 실시간 PCR을 진행하여 형광값의 변화를 통해 확인하였다.
B형 간염 바이러스의 주형 DNA는 서열번호 1과 서열번호 5의 조합으로 선행연구결과(NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203)를 참고하여 주형 DNA를 합성하고, 이를 pGEM-T-Easy Vector(Cat: A1360, Promega사제, 미국)에 클로닝하였다. 클로닝 방법은 Promega사에서 제공된 실험법에 따라 진행하였으며, E. coli 만능세포(competent cell)는 HIT-DH5a(Real Biotech Corporation, Taiwan) 제품을 사용하였으며, 준비된 vector를 Real Biotech Corporation에서 제공하는 실험방법에 따라 형질전환을 진행하였다. 준비된 만능세포는 앰피실린, IPTG, X-Gal이 도포된 LB 평판배지 상에 도말한 후 37℃에서 16시간 배양하였다.
배양이 완료된 평판배지 상의 흰 콜로니를 취하여 다시 LB 액체 배지에서 16시간 정도 증균 배양한 후 원심 분리하여 상층액은 버리고 Accuprep　plasmid DNA prep kit(Bioneer사, 한국)를 사용하여 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 준비된 주형 DNA을 이용하여 각각의 유전자형을 정확하게 확인하였다. 실험의 과정은 상기 실시예 3에서 기술한 것과 같은 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.
그 결과 도 5에서도 확인할 수 있듯이, 서열번호 1과 서열번호 3, 그리고 서열번호 10의 조합으로 HBV C 유전자형을 실시간 PCR법으로 확인할 수 있었다.
또한, 도 6에서도 확인할 수 있듯이, 서열번호 1과 서열번호 3, 그리고 서열번호 13의 조합으로 HBV F 유전자형을 실시간 PCR법으로 확인할 수 있었다.
또한, 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 서열번호 1과 서열번호 3, 그리고 서열번호 15의 조합으로 HBV H 유전자형을 실시간 PCR법으로 확인할 수 있었다.
이는 상기 표 1 및 표 2의 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프라이머, 및 프로브가 B형 간염바이러스를 정확하게 검출하며, HBV에 대한 높은 민감도를 가지고 있을 뿐 아니라 HBV의 유전자형까지 확정할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.
서열번호 1 내지 서열번호 7은 모든 HBV 유전자형 증폭이 가능한 프라이머 서열을 나타낸 것이며,
서열번호 8 내지 서열번호 16은 HBV 유전자형 판별을 위한 프로브 서열은 나타낸 것이다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 염기서열을 가지는, B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프라이머.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머는
    정방향 프라이머가 서열번호 1, 2, 4 및 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지고,
    역방향 프라이머가 서열번호 3, 5 및 7중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 프라이머.
  3. 서열번호 8 내지 16 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 프로브.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 프로브는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
  5. 하기 i)을 포함하는, B형 간염 바이러스(HBV) 검출용 키트:
    i) PCR을 수행하기 위한 프라이머로서, 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 키트는 하기 ii)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
    ii) 상기 바이러스의 DNA를 정량하기 위한 프로브로서, 서열번호 8 내지 16 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 i)의 프라이머는
    정방향 프라이머가 서열번호 1, 2, 4 및 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지고,
    역방향 프라이머가 서열번호 3, 5 및 7중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제 5항 내지 제 7항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출은 PCR, 또는 실시간 PCR을 이용하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 시료에 B형 간염 바이러스의 DNA에 특이적인 프라이머 및 프로브를 가하여 실시간 PCR을 수행함으로써 상기 바이러스를 검출 및 정량하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스의 검출에 있어서,
    상기 B형 간염 바이러스의 DNA에 특이적인 프라이머로서 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7 중 어느 하나의 염기 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 사용하고,
    상기 B형 간염 바이러스의 DNA에 특이적인 프로브로서 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 사용하는, B형 간염 바이러스(HBV)의 검출방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 프라이머는
    정방향 프라이머가 서열번호 1, 2, 4 및 6 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지고,
    역방향 프라이머가 서열번호 3, 5 및 7중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    상기 검출방법은 유전자형에 따른 B형 간염 바이러스에 대한 검출, 정량, 및 유전자형(genotyping)의 판별을 동시에 하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
PCT/KR2012/003449 2012-04-27 2012-05-04 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 WO2013162109A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0044331 2012-04-27
KR1020120044331A KR20130121283A (ko) 2012-04-27 2012-04-27 Ｂ형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013162109A1 true WO2013162109A1 (ko) 2013-10-31

Family

ID=49483385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2012/003449 WO2013162109A1 (ko) 2012-04-27 2012-05-04 B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20130121283A (ko)
WO (1) WO2013162109A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039599A (zh) * 2015-08-21 2015-11-11 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 分型定性检测乙型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN105400903A (zh) * 2015-12-08 2016-03-16 珠海丽珠试剂股份有限公司 用于检测hbv核酸的引物组、探针、试剂盒及检测样本中hbv核酸的方法
CN105420410A (zh) * 2015-12-08 2016-03-23 珠海丽珠试剂股份有限公司 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102013114173A1 (de) 2013-10-11 2015-04-16 Daeheung R&T Co., Ltd. Hydraulikbuchse eines Fahrzeuges
US11319602B2 (en) * 2017-02-07 2022-05-03 Tcm Biotech Internationl Corp. Probe combination for detection of cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002355098A (ja) * 2000-08-14 2002-12-10 Genome Science Laboratories Co Ltd Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ
US20100255482A1 (en) * 2007-11-06 2010-10-07 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Hepatitis B Virus (HBV) Specific Oligonucleotide Sequences

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002355098A (ja) * 2000-08-14 2002-12-10 Genome Science Laboratories Co Ltd Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ
US20100255482A1 (en) * 2007-11-06 2010-10-07 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Hepatitis B Virus (HBV) Specific Oligonucleotide Sequences

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NCBI, GENBANK 11 April 1995 (1995-04-11), "Hepatitis B virus X, PreC and C genes(Mannoni 3)", accession no. 85311 *
DATABASE NCBI, GENBANK 24 April 2012 (2012-04-24), "Hepatitis B virus isolate 218 reverse transcriptase gene, partial cds", accession no. N650174 *
TADOKORO, K. ET AL.: "Classification of hepatitis B virus genotypes by the PCR Invader method with genotype specific probes", JOURNAL OFVIROLOGICAL METHODS, vol. 138, 24 August 2006 (2006-08-24), pages 30 - 39, XP025030210, DOI: doi:10.1016/j.jviromet.2006.07.014 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039599A (zh) * 2015-08-21 2015-11-11 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 分型定性检测乙型肝炎病毒的引物、探针及试剂盒
CN105400903A (zh) * 2015-12-08 2016-03-16 珠海丽珠试剂股份有限公司 用于检测hbv核酸的引物组、探针、试剂盒及检测样本中hbv核酸的方法
CN105420410A (zh) * 2015-12-08 2016-03-23 珠海丽珠试剂股份有限公司 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法
CN105400903B (zh) * 2015-12-08 2018-09-21 珠海丽珠试剂股份有限公司 用于检测hbv核酸的引物组、探针、试剂盒及检测样本中hbv核酸的方法
CN105420410B (zh) * 2015-12-08 2018-09-21 珠海丽珠试剂股份有限公司 检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130121283A (ko) 2013-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116555497B (zh) 用于检测新型冠状病毒的试剂盒和方法
WO2013162109A1 (ko) B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법
Wedemeyer et al. Flow cytometry: an ‘old’tool for novel applications in medical genetics
WO2010102460A1 (zh) 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒
WO2002052041A2 (en) 5' nuclease nucleic acid amplification assay having an improved internal control
NL2025851B1 (en) Method for identifying species of aedes based on pcr-ms
WO2016190585A1 (ko) 표적핵산 검출방법 및 키트
CN111893215A (zh) 一种检测冠状病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
CN116814777B (zh) 高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法
WO2012099397A2 (ko) 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 방법 및 이를 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 키트
CN102212621B (zh) 一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法
CN106591485A (zh) 一种检测aldh2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒
CN113215325B (zh) 二维pcr单管闭管检测多种hpv亚型的反应体系、方法及试剂盒
KR102076343B1 (ko) 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도
WO2013049822A2 (en) Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv)
KR20220040834A (ko) 분자 비콘 프로브를 포함하는 covid-19 진단 멀티플렉스 lamp 조성물
WO2012070788A9 (en) Method and kit for the quantification of nucleic acids
CN105483279A (zh) 基于AllGlo探针的rs3909184检测分型试剂盒及其分型方法
US20180023127A1 (en) Visually determinable genetic testing
CN103382501A (zh) 阳性对照概念
CN114045363B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测试剂盒
WO2023214617A1 (ko) 엑소좀 내의 인터페론 감마 유전자 측정을 이용한 암 조기 진단 방법 및 진단 키트
JP3396218B2 (ja) 核酸検出方法
WO2023013421A1 (ja) 腫瘍マーカーｃａ１９－９によるがん診断の精度向上を目的とする血液型関連糖鎖遺伝子の迅速スクリーニングのための新規手法
Chakravarty et al. Prevalence of HLA-B* 57: 01 and complete linkage disequilibrium with HCP5 rs2395029: Prevalence and Detection

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12875695

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12875695

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1