CN116814777B - 高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒,所述试剂盒是利用封闭型荧光探针熔解曲线检测8个高血压相关的靶标,包括A管多重核酸反应液和B管多重核酸反应液,A管检测的靶标组合为:CYP3A5基因rs776746位点、CACNA1C基因rs2238032位点、CYP2C9基因rs1057910位点、AGTR1基因rs5186位点、和ACE基因rs1799752位点;B管多重核酸反应液检测的靶标组合为CYP2D6基因rs1065852位点、ADRB1基因rs1801253位点和NPPA基因rs5065位点。本发明检测特异性强,位点评估更为全面,检测结果直观、易判读。辅助临床医生更全面、更准确地选择最合适的用药方案,保障用药的有效性和安全性,对现有高血压诊疗起到重要补充和细化作用。

Description

高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,特别涉及高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法。
背景技术
高血压是导致心脑血管病的最危险因素,是患病率和致残率较高并且疾病负担较重的一种不可彻底治愈的慢性疾病。我国高血压患者人数逐年增加已高达数亿,发病率呈上升趋势,高血压导致的并发症脑中风、冠心病、糖尿病、心力衰竭、高血脂、肾病等成为“隐形杀手”。
目前通过药物治疗控制血压以减少高血压并发症成为了高血压的主要治疗手段。高血压药物的个体差异在临床上也十分普遍,据报道约有20%-50%的高血压患者在接受药物治疗后血压未能达到良好控制。临床上常用的五大类降压药物对应的药物代谢酶和受体遗传变异的研究主要集中在:1)β肾上腺素受体阻滞剂:对应的主要基因是CYP2D6*10和ADRB1,CYP2D6*10(100C>T)突变会使代谢酶功能显著降低;ADRB1(1165G>C)突变会使受体敏感性增强,临床药师可以通过患者ADRB1的基因型判断病人是否适合洛尔类药物及确定其给药剂量,从而提高药物疗效和用药准确性。2)血管紧张素II受体拮抗剂(ARB):对应的主要基因是CYP2C9*3和AGTR1,其中CYP2C9*3(1075A>C)突变会显著降低常用降压药洛沙坦的代谢,需适当调整用药剂量,避免药物中毒;AGTR1(1166A>C)突变会使受体敏感性下降,不同基因型的患者对高血压药物产生不同的药理反应,显著影响高血压患者的用药选择。3)血管紧张素转换酶(ACE):是使血管紧张素I转换成血管紧张素II的重要限速酶。ACEI类药物可通过阻断ACE酶抑制RAAS过度激活从而发挥降压疗效,具有良好的靶器官保护作用。4)钙拮抗剂:对应的主要基因是CYP3A5*3(6986A>G),突变会使代谢酶功能显著下降;CACNA1C(1658T>G)使受体敏感性发生改变;5)利尿剂:该类药物对应的主要基因是NPPA(2238T>C,rs5065),该基因突变会使受体敏感性增强。
在用药前对高血压患者进行基因检测,根据检测结果选择最合适的用药方案,保障用药的有效性和安全性,可以对现有高血压诊疗起到重要补充和细化作用。
目前关于高血压用药指导基因检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片法、荧光定量PCR等。一代测序,虽然是检测的金标准,但对试剂和仪器有特殊要求,整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列步骤,费时费力,严重制约其在临床中的应用;基因芯片法,灵敏度有限,且操作过程容易造成交叉污染导致假阳性;CN201610732578中整体使用taqman探针,公用上下游引物,两条探针中间有SNP点突变,且在实际操作中发现分型效果极差。CN108531578A和CN111100929A利用ARMS-PCR引物的3 '端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,比较容易设计优化,但该方法存在一定缺陷,其一,检测通量低,完成一个样本检测需分别设置两管PCR反应液,一管对野生型模板进行扩增和检测,另一管对突变型模板进行扩增和检测;其二,结果判读不直观,需根据△CT对结果进行判断,临床推广受限;其三,不能完全消除非特异性扩增。CN109457024A和CN201910614761是从 HRM(高分辨熔解曲线)技术的基础上进行了改良,将HRM中的饱和染料用探针来替代,而将SNP设计在探针上,但是野生和突变的TM差值小于3℃,区分效果不明显。上述方法使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想,一直无法满足临床检测需求。
因此,开发一种可以对多个高血压用药指导相关基因位点同时进行检测,判断直观,综合评价更加全面的多重检测试剂盒尤为重要。
发明内容
为了解决上述问题,本申请人基于先前开发的利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法(专利号202111237062.0) 开发了一种高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒,所述试剂盒是利用封闭型荧光探针熔解曲线检测8个高血压相关的靶标,包括A管多重核酸反应液和B管多重核酸反应液,A管检测的靶标组合为: CYP3A5基因rs776746位点、CACNA1C基因rs2238032位点、CYP2C9基因rs1057910位点、AGTR1基因rs5186位点、和ACE基因rs1799752位点;和B管多重核酸反应液检测的靶标组合为CYP2D6基因rs1065852位点、ADRB1基因rs1801253位点和NPPA基因rs5065位点;针对每个待测位点设计特异性上、下游引物和探针,实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制,使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异,且该差异可被检测仪器所区分;所述探针含至少一个RNA碱基,在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团,在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团,在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团,在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少3个连续的硫代磷酸化修饰碱基,所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧,所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值;通过不同位点的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记,实现多个待测位点的多重检测和待测位点中的SNP的检测;
A管多重核酸反应液包括以下引物和探针,其中*为硫代磷酸化修饰,小写字母碱基为RNA碱基,加粗碱基标记荧光基团,斜体碱基连接猝灭基团:
B管多重核酸反应液包括以下引物和探针,其中*为硫代磷酸化修饰,小写字母碱基为RNA碱基,加粗碱基标记荧光基团,斜体碱基连接猝灭基团:
在一种实施方式中,A管五条探针中,共标记三种荧光基团。
在一种实施方式中,B管三条探针中,共标记二种荧光基团。
在一种实施方式中,A管和B管多重核酸反应液还分别包括内参引物和探针:
在一种实施方式中,所述试剂盒还包括CYP3A5基因rs776746位点野生型和突变型质粒、CACNA1C基因rs2238032位点野生型和突变型质粒、CYP2C9基因rs1057910位点野生型和突变型质粒、AGTR1基因rs5186位点野生型和突变型质粒、ACE基因rs1799752 位点野生型和突变型质粒、CYP2D6基因rs1065852 位点野生型和突变型质粒、ADRB1基因rs1801253位点野生型和突变型质粒、NPPA基因rs5065位点野生型和突变型质粒;它们各自作为各自位点的对照。
在一种实施方式中,本发明提供上述试剂盒的使用方法,所述使用方法包括以下步骤:
步骤1:采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血或口腔拭子的基因组DNA作为待检测样本;
步骤2:向A管和/或B管中加入PCR预混反应液和待测样本DNA;同时设置阳性对照和阴性对照,然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应,并采集各个通道荧光信号;
步骤3:PCR扩增反应结束后,根据检测位点的TM值情况进行基因型判定。
在一种实施方式中,步骤2中所述待检测样本最低DNA浓度为10ng/μL,再进行PCR扩增反应。
在一种实施方式中,步骤2中,所述PCR扩增反应的条件为:50℃ 2分钟,95℃预变性10分钟;95℃变性15秒,58℃退火延伸30秒,同时收集荧光,重复55个循环;50℃降温2分钟,45-95℃熔解曲线分析,每隔0.12℃检测一次荧光信号,60℃降温1分钟。
在本发明中,PCR扩增反应结束后,根据检测位点的Tm值情况进行基因型判定。结果判定的原则为:①阳性对照FAM、CY5、ROX通道均形成特异性的熔解曲线峰,VIC通道有S型扩增曲线;②阴性对照组均无FAM、VIC、CY5、ROX荧光信号;③上述2个条件同时满足,判定实验成功,才可以根据待检样本的各荧光通道靶点的Tm值情况进行分型,判读标准如下:
本发明的有益效果如下:本发明所述人高血压用药指导基因检测试剂盒组合物能够检测CYP3A5(rs776746)、CACNA1C(rs2238032)、CYP2C9(rs1057910)、AGTR1(rs5186)、ACE(rs1799752)、CYP2D6(rs1065852)、ADRB1(rs1801253)和NPPA(rs5065) 8个基因位点,覆盖了临床常用的五大类降压药,且同时选择药物作用受体和代谢酶作为靶点,使得检测更加全面准确,且特异性强、灵敏度高,可以检测低至10ng/ul的核酸样品。同时,本发明基于封闭型荧光探针熔解曲线法设计引物和探针,针对8个SNP位点采用8条特异性探针,通过筛选,实现两管试剂同时检测8个SNP位点,2条探针采用一种荧光报告基团,检测通量相对于使用扩增曲线判定结果的传统实时荧光PCR技术提高了4倍,整个过程的操作都极其简单,结果读取过程通过扩增产物Tm值即可以判定。此外,本发明的组合物检测准确度高,如实施例2所述,使用本发明试剂盒的检测的30例临床样本与一代测序结果一致,表明本发明组合物具有很高的准确性,且能够同时适用口腔拭子样品。本发明检测特异性强,位点评估更为全面,检测结果直观、易判读。辅助临床医生更全面、更准确地选择最合适的用药方案,保障用药的有效性和安全性,对现有高血压诊疗起到重要补充和细化作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测CYP3A5标椎品的熔解曲线图;
图2为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测CACNA1C标椎品的熔解曲线图;
图3为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测CYP2C9标椎品的熔解曲线图;
图4为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测AGTR1标椎品的熔解曲线图;
图5为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测ACE标椎品的熔解曲线图;
图6为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测CYP2D6标椎品的熔解曲线图;
图7为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测ADRB1标椎品的熔解曲线图;
图8为本发明高血压基因多态性检测试剂盒检测NPPA标椎品的熔解曲线图;
图9为本发明高血压基因多态性检测试剂盒反应液A多重检测临床样本的熔解曲线图;
图10为本发明高血压基因多态性检测试剂盒反应液B多重检测临床样本的熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合实施例对本发明作进一步说明,显然,实施例仅是范例,不能对本发明造成限制。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。本发明所采用的实验方法均为常规方法,所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
1. 单重引物与探针的设计
本发明对CYP3A5(rs776746)、CACNA1C(rs2238032)、CYP2C9(rs1057910)、AGTR1(rs5186)、ACE(rs1799752)、CYP2D6(rs1065852)、ADRB1(rs1801253)和NPPA(rs5065) 8个基因位点前后150bp分别作为靶区域进行分析,根据引物探针设计基本原则,利用primer 5软件进行设计,每个靶标设计三组引物探针,针对每个SNP靶标进行了引物与探针的组合筛选,组合如以下表1-2所示。
表1 高血压用药指导相关SNP位点筛选引物探针组合的序列信息
注: *为硫代磷酸化修饰,小写字母碱基为RNA碱基,探针3’做C3 spacer,加粗碱基标记荧光基团,斜体碱基连接猝灭基团。
表2 高血压用药指导相关SNP位点筛选引物探针组合的序列信息
注: *为硫代磷酸化修饰,小写字母碱基为RNA碱基,探针3’做C3 spacer,加粗碱基标记荧光基团,斜体碱基连接猝灭基团。
2. 单重引物与探针的筛选
2.1单重反应液体系如下表3所示:
表3.单重反应液试剂成份组成表
2.2使用的模板为:CYP3A5(rs776746)、CACNA1C(rs2238032)、CYP2C9(rs1057910)、AGTR1(rs5186)、ACE(rs1799752)、CYP2D6(rs1065852)、ADRB1(rs1801253)和NPPA(rs5065) 8个基因位点16个105copies/uL(更接近临床样本的拷贝数)的标准质粒稀释液、15ng/ul、10ng/ul的人源基因组DNA。
2.3反应程序:
2.4 筛选结果:如表4-5所示,8个靶标均筛到了特异性、灵敏度最佳的引物探针组合为:
CYP3A5(rs776746)的第1套引物探针组合、CACNA1C(rs2238032)的第3套引物探针组合、CYP2C9(rs1057910)的第1套引物探针组合、AGTR1(rs5186)的 第1套、第2套引物探针组合、ACE(rs1799752)的第1套引物探针组合、CYP2D6(rs1065852)的第1套、第3套引物探针组合、ADRB1(rs1801253)的第1套、第3套引物探针组合、NPPA(rs5065)的第2套、第3套引物探针组合。各靶标的最佳引物探针组合从灵敏度来看,均可扩至10ng/uL,且在扩增人基因组DNA时无非特异信号,如图1-8所示。
表4. 高血压用药指导相关SNP位点单重引物探针筛选结果
表5. 高血压用药指导相关SNP位点单重引物探针筛选结果
3.多重反应液中靶标组合的确定
核酸多重扩增实验并不是简单地将多对特异性引物探针混合成一个反应体系。多重实验中要求每个靶标自身和之间的引物不能互相结合,同时要求各个靶标的引物探针也不能与模板DNA上非目标片段结合,来保证在多重检测中的特异性;单管扩增中,靶标越多,所使用的引物探针数较多,所以进行多重实验时,多个靶标所使用引物探针浓度也需要进行优化调整才能达到较高的扩增灵敏度和特异性。
3.1多重检测体系如下表6-7所示:
表6. A管多重反应液试剂成份组成表
表7.B管多重反应液试剂成份组成表
3.2反应程序:
3.3两管多重核酸反应液靶标组合的确定
将8个靶标各自筛出的最佳引物探针组合,分别进行多重组合验证,如下表8 所示,不同的反应管组合的靶标数是不一样的,经验证6组多重核酸反应液里的最佳靶标组合分别为:A管“CYP3A5(第1套)+CACNA1C(第3套)+CYP2C9(第1套)+AGTR1(第2套)+ACE(第1套),这三类高血压用药占临床80%以上”、B管“CYP2D6(第1套)+ADRB1(第1套)+NPPA(第2套)”。
表8. 8个高血压用药指导相关SNP位点两管反应液组合筛选结果
从以上表3和表8的实验结果可以看出,本发明设计的引物和探针,A管“CYP3A5(第1套)+CACNA1C(第3套)+CYP2C9(第1套)+AGTR1(第2套)+ACE(第1套)”、B管“CYP2D6(第1套)+ADRB1(第1套)+NPPA(第2套)”。分别进行多重与单重反应的情况下,都可以实现10ng/uL浓度的人基因组DNA检测,说明了本发明两管反应每管反应液中靶标检测没有互相影响。
在现有技术中,由于每个靶标检测都设计两条引物和一个探针,要在单管中实现尽可能多重扩增且能够区分野生、杂合、突变,对引物、探针的设计要求特别高。在本发明A反应管中能检测五个靶标,存在11条引物和5条封闭型检测探针,且同时能够有效区分杂合基因型,在本发明设计引物和酶切探针中,实现了每种靶点之间检测不互相干扰,并且实现了与单重检测相同的检测灵敏度和特异性。
实施例2:本发明检测试剂盒制备以及试剂盒的临床验证
本试剂盒共包含 2 个反应液,其中反应液 A 检测 CYP3A5*3和CACNA1C(标记FAM 荧光)、AGTR1和CYP2C9*3(标记 ROX 荧光)、ACE(标记CY5荧光)、内参基因GAPDH(标记VIC 荧光);反应液 B 检测CYP2D6*10和NPPA(标记 ROX 荧光)、ADRB1(标记 CY5 荧光)、内参基因GAPDH(标记 VIC 荧光)。将2个核酸反应液、空白对照品、阳性对照品共同包装,并配附产品使用说明书,得到本发明中的封闭型探针熔解曲线检测高血压用药指导相关的8个SNP位点的试剂盒。其中核酸反应液、空白对照品以及阳性对照品的组成如下表9所示。
表9.试剂盒成份组成表
2.本发明中的试剂盒检测30例临床样本
2.1试剂准备:
根据待测样品、阴性对照、阳性对照的数量,取出PCR反应液,计算各反应液分装个数n=样本数+阳性对照+空白对照,根据所需样本数目n,分别向荧光定量PCR反应管中加入25μL PCR反应液,充分混匀,瞬时离心后备用。
2.2样品处理
样本类型为人外周血、口腔拭子,使用商品化提取试剂盒进行基因组DNA提取,提取完成后使用TE缓冲液洗脱DNA,并测定DNA浓度,最低基因组DNA浓度为10ng/μl;
2.3荧光定量检测:
(1)向反应管中加入25μl 核酸反应液A和或B及5μl待测样本DNA,将标记好样品名称的PCR反应管按对应顺序放入PCR扩增仪样品孔。
(2)荧光检测通道选择:选择FAM通道检测 CYP3A5和CACNA1C基因位点;选择VIC通道检测内参基因GAPDH;选择ROX通道检测AGTR1、CYP2C9、CYP2D6和NPPA基因位点;选择CY5通道检测ACE和ADRB1基因位点。
(3)荧光定量PCR反应条件
以上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪为例,反应条件设置: Sample Volume设置为30,反应程序为:50℃ 2分钟,95℃预变性10分钟;95℃变性15秒,58℃退火延伸30秒,同时收集荧光,重复55个循环;50℃降温2分钟,45-95℃熔解曲线分析,每隔0.12℃检测一次荧光信号,60℃降温1分钟。
结果分析:①阳性对照FAM、CY5、ROX通道均形成特异性的熔解曲线峰,VIC通道有S型扩增曲线;②阴性对照组均无FAM、VIC、CY5、ROX荧光信号;上述条件同时满足,才可以根据待检样本的各荧光通道靶点的TM值情况进行分型,判读标准如表10:
表10高血压用药指导相关SNP位点基因型判读标准
3.检测结果: 按照所述的方法检测结果未知的30例口腔拭子及外周血临床样品,并将其与一代测序结果进行对比,结果如下表11-12所示:
表11本发明方法检测未知的30例口腔拭子及外周血临床样品结果
表12本发明方法检测未知的30例口腔拭子及外周血临床样品结果
上述30例临床样本荧光检测结果与一代测序结果一致率为100%。其PCR反应液的扩增结果分别如图9和图10所示,从图中可以看出,本发明的组合物能够很好的检测出口腔拭子及外周血样品中人高血压用药指导相关基因多态性。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (5)

1.高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是利用封闭型荧光探针熔解曲线检测8个高血压相关的靶标,包括A管多重核酸反应液和B管多重核酸反应液,A管检测的靶标组合为: CYP3A5基因rs776746位点、CACNA1C基因rs2238032位点、CYP2C9基因rs1057910位点、AGTR1基因rs5186位点和ACE基因rs1799752位点;B管多重核酸反应液检测的靶标组合为CYP2D6基因rs1065852位点、ADRB1基因rs1801253位点和NPPA基因rs5065位点;针对每个待测位点设计特异性上、下游引物和探针,实现对每个待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合片段的熔点Tm值的控制,使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的扩增产物与探针结合形成片段的熔点Tm值有差异,且该差异可被检测仪器所区分;所述探针含至少一个RNA碱基,在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧末端碱基及非末端探针碱基上分别标记猝灭基团,在所述RNA碱基右侧靠近所述探针3’端一侧的非末端碱基上标记荧光基团,在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的末端碱基上连接封闭基团,在所述RNA碱基右侧相隔至少一个碱基后连接至少3个连续的硫代磷酸化修饰碱基,所述硫代磷酸化修饰碱基位于所述荧光基团左侧,所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值低于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值;通过不同位点的PCR产物与所述RNA碱基右侧的含有荧光基团的结合片段的Tm差异和/或不同的荧光标记,实现多个待测位点的多重检测和待测位点中的SNP的检测;
A管多重核酸反应液包括以下引物和探针,其中*为硫代磷酸化修饰,小写字母碱基为RNA碱基,加粗碱基标记荧光基团,斜体碱基连接猝灭基团:
;B管多重核酸反应液包括以下引物和探针,其中*为硫代磷酸化修饰,小写字母碱基为RNA碱基,加粗碱基标记荧光基团,斜体碱基连接猝灭基团:
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,A管五条探针中,共标记三种荧光基团。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,B管三条探针中,共标记二种荧光基团。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,A管和B管多重核酸反应液还分别包括内参引物和探针:
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括CYP3A5基因rs776746位点的野生型质粒和突变型质粒、CACNA1C基因rs2238032位点的野生型质粒和突变型质粒、CYP2C9基因rs1057910位点的野生型质粒和突变型质粒、AGTR1基因rs5186位点的野生型质粒和突变型质粒、ACE基因rs1799752 位点的野生型质粒和突变型质粒、CYP2D6基因rs1065852 位点的野生型质粒和突变型质粒、ADRB1基因rs1801253位点的野生型质粒和突变型质粒、NPPA基因rs5065位点的野生型质粒和突变型质粒;它们各自作为各自位点的对照。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109457024A (zh) * 2018-03-23 2019-03-12 杭州泰领生物技术有限公司 高血压基因多态性荧光pcr溶解曲线检测试剂盒及应用
CN110129430A (zh) * 2019-05-27 2019-08-16 广州海思医疗科技有限公司 一种用于高血压患者用药的检测试剂盒及检测方法
CN110396539A (zh) * 2019-04-29 2019-11-01 广州海思医疗科技有限公司 用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒和方法
CN112080563A (zh) * 2020-09-01 2020-12-15 美思睿(北京)生物科技有限公司 一种检测慢性病精准用药基因的试剂盒
CN113846187A (zh) * 2021-10-24 2021-12-28 北京宏微特斯生物科技有限公司 利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒
CN113981068A (zh) * 2021-11-04 2022-01-28 上海普然生物科技有限公司 一种同时检测心脑血管药物代谢能力基因的引物探针系统及检测试剂盒
CN116463410A (zh) * 2023-03-25 2023-07-21 山西国信凯尔医学检验所有限公司 基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109457024A (zh) * 2018-03-23 2019-03-12 杭州泰领生物技术有限公司 高血压基因多态性荧光pcr溶解曲线检测试剂盒及应用
CN110396539A (zh) * 2019-04-29 2019-11-01 广州海思医疗科技有限公司 用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒和方法
CN110129430A (zh) * 2019-05-27 2019-08-16 广州海思医疗科技有限公司 一种用于高血压患者用药的检测试剂盒及检测方法
CN112080563A (zh) * 2020-09-01 2020-12-15 美思睿(北京)生物科技有限公司 一种检测慢性病精准用药基因的试剂盒
CN113846187A (zh) * 2021-10-24 2021-12-28 北京宏微特斯生物科技有限公司 利用荧光探针熔解曲线检测待测目标核酸序列的方法及其试剂盒
CN113981068A (zh) * 2021-11-04 2022-01-28 上海普然生物科技有限公司 一种同时检测心脑血管药物代谢能力基因的引物探针系统及检测试剂盒
CN116463410A (zh) * 2023-03-25 2023-07-21 山西国信凯尔医学检验所有限公司 基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物及应用

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