CN110863054A - 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法 - Google Patents

用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110863054A
CN110863054A CN201911316783.3A CN201911316783A CN110863054A CN 110863054 A CN110863054 A CN 110863054A CN 201911316783 A CN201911316783 A CN 201911316783A CN 110863054 A CN110863054 A CN 110863054A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutation
probe
region
gene
wild
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911316783.3A
Other languages
English (en)
Inventor
祝令香
彭志勇
郭永
杨文军
高娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
New Yi Technology (beijing) Co Ltd Manufacturing
Beijing Xinyi Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
New Yi Technology (beijing) Co Ltd Manufacturing
Beijing Xinyi Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by New Yi Technology (beijing) Co Ltd Manufacturing, Beijing Xinyi Biotechnology Co Ltd filed Critical New Yi Technology (beijing) Co Ltd Manufacturing
Priority to CN201911316783.3A priority Critical patent/CN110863054A/zh
Publication of CN110863054A publication Critical patent/CN110863054A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其方法。本发明试剂盒包括一对扩增引物，所述扩增引物用于作为检测基因突变高发区多个突变位点的通用PCR扩增的上游引物和下游引物，其扩增区域包括待检测的基因突变高发区；针对基因突变高发区的野生型特异性检测探针，针对所述基因突变高发区的扩增区域中基因保守序列的内对照探针，所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针标记不同荧光染料。本发明试剂盒和方法可以区分基因突变高发区野生型和突变型，并可根据探针阳性信号位置进一步确定具体突变型别，并且可以实现对各种不同突变型别进行定量，确定各种突变的比例。

Description

用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其 方法
技术领域
本发明涉及数字PCR领域，尤其涉及用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其方法。
背景技术
基因突变是指细胞中的遗传基因(通常指脱氧核糖核酸，DNA)发生的改变。基因突变包括单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入。基因突变是由于细胞分裂时基因的复制发生错误、或受化学物质、基因毒性、辐射或病毒的影响而造成。在一个基因上可以存在多个位点的突变，某些位置存在多个相近或相邻的突变位点，这个区域则称为突变高发区。例如，这种突变高发区包括：表皮生长因子受体EGFR基因 19外显子第746-752位密码子的多种缺失突变。通常，突变高发区具有显著临床意义，与疾病的发生、药物靶点敏感性和耐用性密切相关。随着精准医疗的到来，会有更多的高发区基因突变被研究，并能够指导患者选择更佳的治疗方案。
随着数字PCR发展，数字PCR技术在突变检测中凸显出极大优势，该技术通过微流控芯片可生成数微米到数百微米的液滴，液滴的体积通常为皮升到纳升级别，可以包裹单分子。微液滴是由惰性油相通过生物相容性的表面活性剂包裹水相而产生，常见的生物化学可以在微液滴中实现。其技术优势如下：(1)灵敏度高，一个液滴可包含单个分子或细胞，在物理层面实现单分子级检测；(2)绝对定量，每次微流体芯片可生成数百万个微液滴，对逐个微液滴统计，通过泊松分布计算模板数量，可实现数字化绝对定量，结论可靠。目前，基于微液滴技术的研究工作和各种应用领域已发表在Cell、Nature、Nature Biotechnology、PNAS等高水平杂志上。
基因突变高发区突变检测一直是突变检测的一个难点，现有各种检测技术都无法通过一次检测实现基因突变高发区各种突变类型的检测以及各种突变类型的定量检测。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：a.一对扩增引物，所述扩增引物用于作为检测基因突变高发区多个突变位点的通用PCR扩增的上游引物和下游引物，其扩增区域包括待检测的基因突变高发区；b.针对基因突变高发区的野生型特异性检测探针，所述野生型特异性检测探针与所述基因突变高发区的野生型序列特异性结合，而与突变型序列为非特异性结合；c.针对所述基因突变高发区的扩增区域中基因保守序列的内对照探针，所述内对照探针检测的保守序列同样位于所述一对扩增引物的扩增区域之间，与所述野生型特异性检测探针检测的序列位于同一个扩增区域；所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针标记不同荧光染料，从而实现利用数字PCR的数据分析中的二维散点图区分液滴中不同荧光信号位置，达到对所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针识别，区分基因突变高发区是否具有突变和/或突变类型。
在一种实施方式中，所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针检测的序列在同一条核酸链上，或者在不同的核酸链上。
在一种实施方式中，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因19 外显子缺失突变的试剂盒。
在一种实施方式中，所述试剂盒检测以下等位基因的突变位点的试剂盒： del9(2235_2248>AATTC)，del9(2238-2248>GC)，del9(2239-2247)，del9(2239- 2248>C)，del12(2235_2251>AATTC)，del12(2237-2253>TTGCT)， del12(2238_2252>GCA)，del12(2239-2251>C)，del12(2240-2251del12)， del12(2235-2246del12)，del15(2233-2247del15)，del15(2235_2252>AAT)， del15(2235-2249del15)，del15(2236-2250del15)，del15(2237-2251del15)， del15(2237_2252>T)，del15(2238-2252del15)，del15(2239_2256>CAA)，del15(2239-2253del15)，del15(2240-2254del15)，del18(2235-2255>AAT)， del18(2236-2253del18)，del18(2237_2257>TCT)，del18(2237-2254del18)，del18(2237-2255-T)，del18(2238-2255del18)，del18(2239-2256DEL18)， del18(2239-2258>CA)，del18(2240-2257DEL18)，和del24(2253-2276del24)。
在一种实施方式中，所述扩增引物对是上游引物SEQ ID NO：1:ACCCCCACACAGCAAAGC，下游引物SEQ ID NO：2： TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC；所述内对照探针和所述野生型特异性检测探针分别是SEQ ID NO：3:CCAGAAGGTGAGAAAG；和SEQ ID NO：4:C+C+C+GT+C GCT ATC AA+G+GAATTAA，其中“+”表示的是LNA碱基，即锁核酸碱基，通过使用锁核酸碱基，可以进一步提高探针的融解温度 (Tm)，从而提高对完全匹配模板和错配模板区分的分辨率的目的。
在一种实施方式中，所述内对照探针5'端用FAM进行荧光标记，所述野生型特异性检测探针5'端用VIC进行荧光标记。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照是含有待测突变位点的质粒DNA样本与商品化正常人基因组DNA 混合后制备，所述阴性对照是商品化正常人基因组片段化DNA。
在一种实施方式中，提供一种利用上述试剂盒用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1：将待检测样本中核酸与引物和探针混合，在数字PCR扩增条件下进行扩增；步骤2：获得所述数字PCR扩增的二维散点图，使用所述二维散点图来区分液滴中不同荧光信号位置，从而达到对野生型特异性检测探针和内对照探针识别，并根据探针阳性信号位置，进一步确定是否具有突变和/或突变类型。
在一种实施方式中，所述方法还包括根据所述二维散点图对每种突变进行定量分析。
本发明的另一个方面是提供一种治疗患者的方法，所述患者的肿瘤细胞可能具有EGFR基因19外显子缺失突变，所述方法包括：将患者样本中核酸与本发明的引物和探针混合，在合适条件下使模板分子单个分散在液滴中，从而通过检测微液滴荧光信号差异来确定核酸中是否存在EGFR基因19外显子缺失突变。如果确定存在19外显子缺失突变，则患者治疗时可以使用 EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)有效。
本发明的另一个方面是测定使用EGFR抑制剂TKI对患有恶性肿瘤的患者的治疗是否成功的方法，包括：将患者样本中核酸与本发明的引物和探针混合，在合适条件下使模板分子单个分散在液滴中，从而通过检测微液滴荧光信号差异来确定核酸中是否存在EGFR基因19外显子缺失突变。如果确定存在19外显子缺失突变，则患者治疗时使用EGFR抑制剂TKI的治疗方案可能是成功的。
本发明中可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织，也可以是血浆，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。
本发明的试剂盒和方法不仅利用了数字PCR将模板分子分割在不同单元中分别检测的能力，而且利用了连锁双探针(即野生型特征和内对照探针，内对照探针和野生型特异性检测探针位于同一个扩增区域，称之为连锁双探针；这两个探针标记不同荧光染料)对高发区突变进行特异性检测，使得在本发明在数据分析时，可以使用数字PCR二维散点图区分液滴中不同荧光信号位置，从而达到对连锁双探针准确识别，从而区分野生型和突变型，并可根据探针阳性信号位置进一步确定具体突变型别，并且可以实现对各种不同突变型别进行定量，确定各种突变的比例。该方法所实现的技术效果是不能通过其他技术例如荧光定量PCR实现，具有简便、准确定量、对高发突变区各个突变型准确检测，和/或对其进行准确分型的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明基本原理示意图，其中图1A是模板为野生型时的结果示意图；图1B是模板为突变型时的结果示意图；图1C是模板中既有野生型又有突变型时的结果图。
图2是利用本发明试剂盒检测EGFR基因19外显子缺失突变的结果图，其中2A是模板为野生型的结果图，图2B是模板为突变型M1[del9(2239- 2247)]的结果图，其中FAM和VIC信号存在于同一个液滴中，产生双阳性信号；图2C是模板中既有野生型又有突变型M1[del9(2239-2247)]的结果图；和图2D是模板中既有野生型又有突变型M2[del9(2239-2248>C)]的结果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例一：本发明的基本原理
如图1所示，其中图1A中，当模板为野生型时，模板在液滴中分散后，标记不同荧光染料的野生型(WT)探针和内对照(IC)探针均在同一个液滴中被检测到，这时阳性液滴的荧光信号是两个探针的荧光信号的组合；图1B中，当模板为突变型时，模板在液滴中分散后，WT探针由于不能与突变型模板结合或结合效率下降而没有信号或信号降低，阳性液滴中只有IC探针的荧光信号或IC探针信号根据野生型探针与不同突变型模板结合效率不同而具有不同位置，从而可检测并区分突变型1和突变型 2；图1C中，当模板中既有野生型又有突变型时，模板在液滴中分散后，阳性液滴中有些含有野生型模板，则这些液滴有两个探针的荧光信号，有些液滴仅含有突变型模板，则只有IC探针的荧光信号或IC探针信号根据野生型探针与不同突变型模板结合效率不同而具有不同位置，从而可检测和区分突变型1和突变型2，有些液滴既含有野生型模板也含有突变型模板，也是双探针信号。
实施例二：检测EGFR基因19外显子缺失突变
用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的微液滴数字PCR反应条件如下：PCR扩增反应混合物包括：2X MasterMix(with UNG)(新羿制造科技(北京)有限公司)、200-1000nM引物(序列为SEQ ID NO：1-2)、100- 800nM检测探针(序列为SEQ ID NO：3-4)、模板DNA(通过提取试剂进行提取)2ul、补水到30ul，将试剂混匀。
表1.用于检测EGFR基因19外显子缺失突变检测的引物和探针序列
Figure BDA0002326042250000051
Figure BDA0002326042250000061
注释：表1中“+”表示的是LNA碱基，即锁核酸碱基。
用样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)根据使用说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增，扩增条件设定如下表2：
表2.扩增条件
Figure BDA0002326042250000062
PCR完毕后，用芯片阅读仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。检测结果如图2所示，其中2A是野生型模板的检测结果，具有FAM和VIC双阳性信号，在阴性液滴团的右上方；2B是突变型M1[del9(2239-2247)]模板的检测结果，荧光信号仅为 FAM单阳性信号，且在阴性液滴团正上方；2C是野生型模板和突变型M1[del9(2239-2247)]模板同时存在的结果，阳性液滴有两团，一团荧光信号仅为FAM单阳性信号，在阴性液滴团的正上方，一团荧光信号为FAM和 VIC双阳性信号，在阴性液滴团的右上方；2D是野生型模板和突变型 M2[del9(2239-2248>C)]模板同时存在的结果，阳性液滴有两团，一团荧光信号仅为FAM单阳性信号，但由于野生型探针与突变型M2[del9(2239-2248>C)]模板有一定结合能力，因此该阳性信号团也在阴性液滴团的右上方，另外一团荧光信号为FAM和VIC双阳性信号，在阴性液滴团的右上方，FAM单阳性液滴团的左下方。通过这些阳性液滴团的位置可以清楚地判断属于哪种基因型，是一种简便易行的基因分型方法，特别是对异质性突变和杂合突变检测具有较好的分型效果。同时该方法可对突变型所占的突变比例进行准确定量，定量结果如下表3所示。可以看到，样本A是野生型，仅检测到野生型信号(FAM和VIC双阳性信号)，样本B为突变型 M1[del9(2239-2247)]，仅检测到突变型M1信号(FAM信号)，样本C和D 为杂合样本，可检测到野生型信号和突变型的信号，不同突变型的FAM信号位置不同，可区分突变型(图2所示)，而且可以确定突变型的突变率，分别为56.4％和42.14％。因此，该方法具有检测步骤简便，可对突变高发区位置进行突变检测，而且可区分突变型，并提供突变率的优势，具有一定应用价值。
表3.本实施例的定量结果
序号 FAM单阳拷贝数 FAM&VIC双阳拷贝数 突变率FAM/(FAM+FAM&VIC) 备注
2A 0 6982.6 / 野生型
2B 8583.7 0 / 突变型M1
2C 8181.7 6325.7 56.40％ 野生型和突变型M1
2D 3362.3 4617.5 42.14％ 野生型和突变型M2
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京新羿生物科技有限公司
新羿制造科技（北京)有限公司
<120> 用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒及其方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acccccacac agcaaagc 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcacaattgc cagttaacgt cttc 24
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccagaaggtg agaaag 16
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccgtcgcta tcaaggaatt aa 22

Claims (9)

1.用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
a.一对扩增引物，所述扩增引物用于作为检测基因突变高发区多个突变位点的通用PCR扩增的上游引物和下游引物，其扩增区域包括待检测的基因突变高发区；
b.针对基因突变高发区的野生型特异性检测探针，所述野生型特异性检测探针与所述基因突变高发区的野生型序列特异性结合，而与突变型序列为非特异性结合；
c.针对所述基因突变高发区的扩增区域中基因保守序列的内对照探针，所述内对照探针检测的保守序列同样位于所述一对扩增引物的扩增区域之间，与所述野生型特异性检测探针检测的序列位于同一个扩增区域；所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针标记不同荧光染料，从而实现利用数字PCR的数据分析中的二维散点图区分液滴中不同荧光信号位置，达到对所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针识别，区分基因突变高发区是否具有突变和/或突变类型。
2.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述野生型特异性检测探针和所述内对照探针检测的序列在同一条核酸链上，或者在不同的核酸链上。
3.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测人表皮生长因子EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测以下等位基因的突变位点的试剂盒：del9(2235_2248>AATTC)，del9(2238-2248>GC)，del9(2239-2247)，del9(2239-2248>C)，del12(2235_2251>AATTC)，del12(2237-2253>TTGCT)，del12(2238_2252>GCA)，del12(2239-2251>C)，del12(2240-2251del12)，del12(2235-2246del12)，del15(2233-2247del15)，del15(2235_2252>AAT)，del15(2235-2249del15)，del15(2236-2250del15)，del15(2237-2251del15)，del15(2237_2252>T)，del15(2238-2252del15)，del15(2239_2256>CAA)，del15(2239-2253del15)，del15(2240-2254del15)，del18(2235-2255>AAT)，del18(2236-2253del18)，del18(2237_2257>TCT)，del18(2237-2254del18)，del18(2237-2255-T)，del18(2238-2255del18)，del18(2239-2256DEL18)，del18(2239-2258>CA)，del18(2240-2257DEL18)，和del24(2253-2276del24)。
5.根据权利要求4所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物对是上游引物SEQ ID NO：1:ACCCCCACACAGCAAAGC，下游引物SEQ ID NO：2：TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC；所述内对照探针和所述野生型特异性检测探针分别是SEQ IDNO：3:CCAGAAGGTGAGAAAG；和SEQ ID NO：4:C+C+C+GT+C GCT ATC AA+G+GAATTAA，其中“+”为锁核酸碱基。
6.根据权利要求5所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内对照探针5'端用FAM进行荧光标记，所述野生型特异性检测探针5'端用VIC进行荧光标记。
7.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照是含有待测突变位点的质粒DNA样本与商品化正常人基因组DNA混合后制备，所述阴性对照是商品化正常人基因组片段化DNA。
8.一种利用权利要求1-7任一所述的试剂盒用于基因突变高发区突变检测的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1：将待检测样本中核酸与引物和探针混合，在数字PCR扩增条件下进行扩增；
步骤2：获得所述数字PCR扩增的二维散点图，使用所述二维散点图来区分液滴中不同荧光信号位置，从而达到对野生型特异性检测探针和内对照探针识别，并根据探针阳性信号位置，进一步确定是否具有突变和/或突变类型。
9.根据权利要求8所述的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法还包括根据所述二维散点图对每种突变进行定量分析。
CN201911316783.3A 2019-12-19 2019-12-19 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法 Pending CN110863054A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911316783.3A CN110863054A (zh) 2019-12-19 2019-12-19 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911316783.3A CN110863054A (zh) 2019-12-19 2019-12-19 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110863054A true CN110863054A (zh) 2020-03-06

Family

ID=69659948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911316783.3A Pending CN110863054A (zh) 2019-12-19 2019-12-19 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110863054A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022068079A1 (zh) * 2020-09-30 2022-04-07 浙江大学 一种基于微滴式数字pcr技术的乙型肝炎病毒t216c突变检测方法
CN115678974A (zh) * 2022-11-16 2023-02-03 福州迈新生物技术开发有限公司 一种应用于荧光定量pcr的双探针方法
CN117904286A (zh) * 2024-03-20 2024-04-19 北京致谱医学检验实验室有限公司 确定smn基因突变位于smn1基因的系统及其方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140309128A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays for mutation detection
CN109554444A (zh) * 2018-12-31 2019-04-02 新羿制造科技（北京）有限公司 一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒
CN110438206A (zh) * 2019-08-23 2019-11-12 杭州迪安医学检验中心有限公司 一组检测egfr基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒
CN110564856A (zh) * 2019-10-15 2019-12-13 新羿制造科技（北京）有限公司 一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140309128A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays for mutation detection
CN109554444A (zh) * 2018-12-31 2019-04-02 新羿制造科技（北京）有限公司 一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒
CN110438206A (zh) * 2019-08-23 2019-11-12 杭州迪安医学检验中心有限公司 一组检测egfr基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒
CN110564856A (zh) * 2019-10-15 2019-12-13 新羿制造科技（北京）有限公司 一种用于检测人egfr基因突变的数字pcr试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
R. BIDSHAHRI等: "Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay", 《J MOL DIAGN》 *
T. K.F. YUNG等: "Single-Molecule Detection of Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Plasma byMicrofluidics Digital PCR in Non-Small Cell Lung Cancer Patients", 《CLIN CANCER RES》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022068079A1 (zh) * 2020-09-30 2022-04-07 浙江大学 一种基于微滴式数字pcr技术的乙型肝炎病毒t216c突变检测方法
CN115678974A (zh) * 2022-11-16 2023-02-03 福州迈新生物技术开发有限公司 一种应用于荧光定量pcr的双探针方法
CN117904286A (zh) * 2024-03-20 2024-04-19 北京致谱医学检验实验室有限公司 确定smn基因突变位于smn1基因的系统及其方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106520931A (zh) Egfr基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN110863054A (zh) 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法
CN105713987A (zh) 一种检测人类met基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒
CN110541033A (zh) Egfr基因突变检测用组合物及检测方法
CN109554444A (zh) 一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒
CN112280848A (zh) 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒
CN109694907B (zh) 一种无创产前筛查三体综合征的试剂盒及其应用
CN112481384A (zh) 一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用
CN112852967A (zh) 一种基于ddPCR定量检测ALK、RET和ROS1融合基因的试剂盒
CN113930500A (zh) 人pik3ca基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN111349691B (zh) Egfr基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法
CN107022620A (zh) N‑ras基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN108728538B (zh) Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒
CN114592054B (zh) 用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法
CN116254371A (zh) 一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用
CN115418394A (zh) 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法
CN111172248B (zh) 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒
CN106811537A (zh) 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用
CN109355362B (zh) 一种高灵敏的SNPs检测体系及应用
CN113930501A (zh) 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN109112226B (zh) 一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及其试剂盒
CN116814777B (zh) 高血压用药指导相关基因多态位点的试剂盒及其使用方法
CN113897430B (zh) 人idh1/idh2基因突变的数字pcr检测方法及应用
CN108103158A (zh) 一种高特异性的胚系碱基突变pcr检测方法
CN115725740A (zh) 检测人egfr基因第20外显子插入突变的引物探针组合物、试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200306