CN112280848A - 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及检测试剂盒。本发明提供的试剂盒含有用于特异性检测SMN基因第7外显子的单链DNA组A和/或用于特异性检测SMN基因第8外显子的单链DNA组B；每个单链DNA组均由共用引物和分别检测SMN1和SMN2基因的两个探针组成。本发明试剂盒准确率高、重复性好。本发明对于快速筛查SMN1基因和SMN2拷贝数，降低SMA患儿出生率具有重要意义。

Description

一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及人核酸体外检测技术领域，具体涉及一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及检测试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy，SMA)是常染色体隐性遗传性神经肌肉病。它包括位于人5号染色体上的运动神经元存活基因(Survival of Motor Neuron，SMN)包括端粒端的运动神经元存活基因1(SMN1)和着丝粒端的运动神经元存活基因2(SMN2)，二者均有8个外显子，分别为外显子1、外显子2a、外显子2b以及外显子3～8。SMA是一种常见的神经系统常染色体隐性遗传病，发病率高达1/6000至1/10000，位于神经系统致死性常染色体隐性遗传病第二位。有研究表明，SMN的拷贝数可能与散发性肌萎缩侧索硬化症的预后和表型相关。因此，对于人SMN基因拷贝数进行相对定量分析对于临床疾病的相关监控、检测和预后都十分重要。正常人细胞中2条染色体上各有一个正常的SMN1基因，每个正常细胞中含有2个拷贝数的SMN1基因，携带者1条染色体上的SMN1基因突变导致功能缺失，仅有1个拷贝的SMN1基因，而SMA患者没有正常的SMN1基因，其拷贝数为0。SMN2基因的拷贝数对于SMA疾病患者的表型具有重要影响，SMN2拷贝数越多，SMA的临床表现越轻，患者存活时间也越长。对突变的研究表明，正常人每个细胞中的SMN2的拷贝数可以从0-3个拷贝不等，多数为1拷贝或2拷贝。
在SMN1的基因突变病例当中，SMN1基因第7和第8外显子的缺失最为常见，占SMN1基因突变谱高达95％以上。其它的突变类型多为点突变或小片段的缺失或重复。而SMN2基因第七个外显子与SMN1基因序列仅存在单个碱基差异，不易区分。大样本的研究表明，在携带者群体中，SMN2基因拷贝数可多达4个以上，对于只有1个拷贝SMN1的携带者而言，当SMN1与SMN2采用公用引物进行扩增时，将无法避免多拷贝SMN2基因优势扩增对单拷贝SMN1基因的影响，同样会导致相对定量结果的偏差。
目前临床上用于SMA辅助检测主要有：限制性片段长度多态性聚合酶链式反应技术(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR等。PCR-RFLP法可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者进行定性分析，但不能检测杂合缺失型的携带者，也有可能存在酶切不彻底造成漏诊或误诊。PCR-DHPLC法、MLPA法可用于检测纯合缺失型患者以及杂合缺失型携带者，但操作复杂、通量低、耗时长、需特定的仪器、且价格较贵，不能用于单细胞检测。早期已有使用实时荧光定量PCR技术来检测SMN1基因7号外显子拷贝数，主要分为两种策略方法：一是直接将引物3’端设计在SMN1基因特异位点c.835-44g或c.840C处，检测探针为SMN探针，但这种常规引物设计并不能完全排除假基因SMN2的非特异扩增，而使相对定量的结果出现偏差。另一种方法为将探针设计在SMN1基因特异位点c.840C处，使用非特异引物进行扩增，当引物进行扩增时，SMN1、SMN2基因同时扩增，而在人群中SMN2基因拷贝数可达2-8个，当SMN1/SMN2拷贝数比值过小时，假基因SMN2的优势扩增将会影响目的基因SMN1的扩增导致结果误差，且探针特异性无法保证。近年来，也有学者，在实时定量PCR技术的基础上，对其进行改进，通过引入公用引物、封闭探针、公用对照品等方式增加SMN1扩增的特异性，但是其操作性相对复杂，成本高。上面已经表明现有的检测技术限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR都存在一定的弊端。PCR-RFLP技术运用PCR之后根据不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带原理来区别，属定性分析，因此只能区分目的基因SMN1和假基因SMN2，从而只能达到检测SMN1纯合缺失型，而无法对单拷贝携带者进行诊断，酶切过程也有可能存在酶切不彻底漏诊误诊。PCR-DHPLC技术通量大、精确度高，但受仪器限制较大。MLPA技术基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。实验过程复杂，反应对污染物敏感，可能产生无法解释的结果。且试剂盒产于国外，通量低，价格较贵，属半定量分析，不能用于单细胞检测，即不能用于植入前产前诊断。
相对以上的方法，实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度，可适用于检测如单细胞等小样本、有适当的内部标准和计算公式，平均变异系数低，允许重复、速度快、封闭反应，避免交叉污染等优势。然而目前大多实时荧光定量PCR技术只针对SMN1基因外显子7设计引物或探针，并且采用传统MGB修饰探针，该修饰探针不能区分一个碱基的差别。大样本的研究表明，在携带者群体中，SMN2基因拷贝数可多达4个以上，对于只有1个拷贝SMN1的携带者而言，MGB探针无法避免多拷贝SMN2基因优势扩增对单拷贝SMN1基因的影响，会导致相对定量结果的偏差。且大多荧光定量PCR技术仅检测SMN1基因，不检测SMN2基因，无法为临床用药提供指导。
随着以降低SMA患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及SMA发病分子机制及分子流行病学的深入研究，开发准确可靠、简单实用、能够实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的快速检测SMN1基因和SMN2拷贝数，从而确诊SMA的新型分子诊断试剂盒为当前迫切之需。
发明内容
本发明的目的是提供一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及检测试剂盒。
第一方面，本发明要求保护一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测试剂盒。
本发明所要求保护的人运动神经元基因拷贝数相对定量检测试剂盒，可含有单链DNA组A和/或单链DNA组B：
所述单链DNA组A由引物对A、探针A1和探针A2组成。
所述引物对A为特异性检测SMN1基因和SMN2基因第7外显子的共用引物，由SEQ IDNo.1所示的上游引物SMN-EX7-F和SEQ ID No.2所示的下游引物SMN-EX7-R组成。
所述探针A1为检测SMN1基因第7外显子的探针SMN1-EX7-P，其核苷酸序列如SEQID No.5所示。
所述探针A2为检测SMN2基因第7外显子的探针SMN2-EX7-P，其核苷酸序列如SEQID No.6所示。
所述单链DNA组B由引物对B、探针B1和探针B2组成；
所述引物对B为特异性检测SMN1基因和SMN2基因第8外显子的共用引物，由SEQ IDNo.3所示的上游引物SMN-EX8-F和SEQ ID No.4所示的下游引物SMN-EX8-R组成。
所述探针B1为检测SMN1基因第8外显子的探针SMN1-EX8-P，其核苷酸序列如SEQID No.7所示。
所述探针B2为检测SMN2基因第8外显子的探针SMN2-EX8-P，其核苷酸序列如SEQID No.8所示。
进一步地，所述试剂盒还可含有单链DNA组C；所述单链DNA组C由引物对C和探针C组成。
所述引物对C为特异性检测内参基因的引物对。
所述探针C为检测所述内参基因的探针。
所述内参基因优选单拷贝基因。由于人为二倍体，因此作为内参基因的单拷贝基因在人细胞中为2个拷贝。
在本发明的具体实施方式中，所述引物对C为检测内参基因PRR30的引物对，由SEQID No.9所示的上游引物PRR30-F和SEQ ID No.10所示的下游引物PRR30-R组成。
所述探针C为检测内参基因PRR30的探针PRR30-P，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
其中，所述探针A1、所述探针A2和所述探针C标记有不同的荧光基团。所述探针B1、所述探针B2和所述探针C标记有不同的荧光基团。
在本发明的具体实施方式中，所述探针A1标记的荧光基团为FAM，所述探针A2标记的荧光基团为VIC，所述探针C标记的荧光基团为NED。所述探针B1标记的荧光基团为FAM，所述探针B2标记的荧光基团为VIC，所述探针C标记的荧光基团为NED。
进一步地，所述试剂盒中还可含有对照品。所述对照品为对照品A、对照品B或对照品C。
所述对照品A由DNA片段A1、DNA片段A2和DNA片段C组成；或者由含有所述DNA片段A1的质粒A1、含有所述DNA片段A2的质粒A2和含有所述DNA片段C的质粒C组成。
所述DNA片段A1为SMN1基因第7外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.12；所述DNA片段A2为SMN2基因第7外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.13；所述DNA片段C为所述内参基因片段。
所述对照品B由DNA片段B1、DNA片段B2和所述DNA片段C组成；或者由含有所述DNA片段B1的质粒B1、含有所述DNA片段B2的质粒B2和所述质粒C组成。
所述DNA片段B1为SMN1基因第8外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.14；所述DNA片段B2为SMN2基因第8外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.15；
所述对照品C由所述DNA片段A1、所述DNA片段A2、所述DNA片段B1、所述DNA片段B2和所述DNA片段C组成；或者由所述质粒A1、所述质粒A2、所述质粒B1、所述质粒B2和所述质粒C组成。
在本发明的具体实施方式中，所述DNA片段C为内参基因RPP30的片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.16。
其中，在所述对照品A中，所述DNA片段A1、所述DNA片段A2和所述DNA片段C的拷贝数之比具体可为1：1：2。
或，在所述对照品A中，所述质粒A1、所述质粒A2和所述质粒C的拷贝数之比具体可为1：1：2。
其中，在所述对照品B中，所述DNA片段B1、所述DNA片段B2和所述DNA片段C的拷贝数之比具体可为1：1：2。
或，在所述对照品B中，所述质粒B1、所述质粒B2和所述质粒C的拷贝数之比具体可为1：1：2。
其中，在所述对照品C中，所述DNA片段A1、所述DNA片段A2、所述DNA片段B1、所述DNA片段B2和所述DNA片段C的拷贝数之比具体可为1：1：1：1：2。
或，在所述对照品C中，所述质粒A1、所述质粒A2、所述质粒B1、所述质粒B2和所述质粒C的拷贝数之比为1：1：1：1：2。
进一步地，所述试剂盒中还可含有PCR反应试剂，Taqman Fast Advanced MasterMix。
第二方面，本发明要求保护用于对人运动神经元基因拷贝数相对定量的系统。
本发明要求保护的用于对人运动神经元基因拷贝数相对定量的系统，可包括：
(b1)前文任一所述的试剂盒。
(b2)装置A，能够采用(b1)中的所述试剂盒对待测DNA样本和前文任一所述对照品分别进行实时荧光定量PCR检测，得到Ct值数据。
进一步地，所述装置A具体可为实时荧光定量PCR仪。
(b3)装置B，包括数据输入模块、数据运算模块和结论输出模块。
所述数据输入模块被配置为输入所述装置A所得的Ct值数据。
所述数据运算模块被配置为接收来自所述数据输入模块的Ct值数据，对所述Ct值数据进行计算，得到所述待测DNA样本的SMN1基因的2-ΔΔCt值和SMN2基因的2-ΔΔCt值。
所述结论输出模块被配置为接收来自所述数据运算模块的运算结果，根据所述待测DNA样本的SMN1基因的2-ΔΔCt值和SMN2基因的2-ΔΔCt值，输出所述待测DNA样本含有多少个SMN1基因拷贝和多少个SMN2基因拷贝的结论。
进一步地，所述结论输出模块被配置为，对于SMN1基因和SMN2基因，均按照如下标准输出结论：
如果所述待测DNA样本无Ct值，则输出“所述待测DNA样本中目的基因的拷贝数为0”的结论；
如果所述待测DNA样本的2-ΔΔCt值大于等于0.5且小于等于1.6，则输出“所述待测DNA样本中目的基因的拷贝数为1”的结论；
如果所述待测DNA样本的2-ΔΔCt值大于1.6，则输出“所述待测DNA样本中目的基因的拷贝数为大于等于2”的结论。
以SMN1基因的第7外显子反应为例，分别计算各个梯度所述对照品的目的基因(SMN1基因第7外显子，FAM通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_FAM-Ct_NED，计算所述对照品三个梯度的ΔCt的平均值，记为ΔCt_a。然后，计算所述待测DNA样本的目的基因(SMN1基因第7外显子，FAM通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_FAM-Ct_NED，记为ΔCt_s。ΔΔCt＝ΔCt_s-ΔCt_a。
进一步地，所述装置B还可包括质控模块；所述质控模块被配置为按照如下标准中的全部或部分对所述装置A所进行的实时荧光定量PCR进行质控：
(c1)空白对照反应在任一检验通道应Ct值35之前无信号，若信号升起，且Ct值＜35，则此次实验结果无效，重新实验。
(c2)所述对照品的最小梯度的目的基因和所述内参基因的反应的Ct值均应≤28，否则，重新实验。
(c3)调整荧光信号阈值至所述对照品的三个梯度的FAM通道信号和VIC通道信号线性相关系数均＞0.95，否则，重新实验。
(c4)所述待测样本中所述内参基因的Ct值应≤28，否则，重新实验。
本发明试剂盒准确率高、重复性好。本发明对于快速筛查SMN1基因和SMN2拷贝数，降低SMA患儿出生率具有重要意义。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、本发明试剂盒的组成
1、特异性扩增SMN1和SMN2基因第7外显子的共用引物：
上游引物SMN-EX7-F：5’-CTTGTGAAACAAAATGCTTTTTA-3’(SEQ ID No.1)；
下游引物SMN-EX7-R：5’-GAATGTGAGCACCTTCCTTCTTT-3’(SEQ ID No.2)。
2、特异性扩增SMN1和SMN2基因第8外显子的共用引物：
上游引物SMN-EX8-F：5’-GTTATGTAATAACCAAATGCAA-3’(SEQ ID No.3)；
下游引物SMN-EX8-R：5’-TTCTCAACTGCCTCACCACCG-3’(SEQ ID No.4)。
3、内参基因RPP30的PCR扩增引物：
上游引物RPP30-F：5’-TTTGGACCTGCGAGCG-3’(SEQ ID No.9)；
下游引物RPP30-R：5’-GAGCGGCTGTCTCCAC-3’(SEQ ID No.10)。
4、检测SMN1基因第7外显子的探针：
SMN1-EX7-P：FAM-AGG+GTTT+CAGAC-BHQ1(SEQ ID No.5)。
5、检测SMN2基因第7外显子的探针：
SMN2-EX7-P：VIC-AGG+GTTT+TAGAC-BHQ1(SEQ ID No.6)。
6、检测SMN1基因第8外显子的探针：
SMN1-EX8-P：FAM-AA+GACTG+GGGT-BHQ1(SEQ ID No.7)。
7、检测SMN2基因第8外显子的探针：
SMN2-EX8-P：VIC-AA+GACTG+AGG-BHQ1(SEQ ID No.8)。
8、检测内参基因RPP30的探针：
RPP30-P：NED-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCG-BHQ2(SEQ ID No.11)。
9、PCR反应试剂为：Taqman Fast Advanced Master Mix(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，4444556)。
10、对照品：SMN1第7外显子(SEQ ID No.12)、SMN2第7外显子(SEQ ID No.13)、SMN1第8外显子(SEQ ID No.14)、SMN2第8外显子(SEQ ID No.15)与RPP40人工合成DNA序列(SEQ ID No.16)溶液，五者拷贝数之比为1：1：1：1：2。
11、去离子水。
实施例2、基因组DNA制备
按医疗常规操作采集人外周静脉血1ml，加入EDTA抗凝。采用QIAGEN公司的人外周血基因组抽提试剂盒抽提基因组DNA，洗脱体积为100μL，采用紫外分光定量仪定量，OD260nm/OD280nm的比值应在1.8-2.0之间，使用去离子水稀释基因组DNA浓度至10-20ng/μL。
实施例3、对照品梯度稀释
对照品准备：将对照品用TE稀释为0.5pg/μL，再梯度稀释，建立1:5:25三个浓度梯度(原液、5倍稀释液和25倍稀释液)备用。
实施例4、PCR反应体系配制
按以下体系配制PCR反应体系：
1、SMN第7外显子反应体系(总反应体系为20μL)：
PCR反应试剂：10μL；
SMN基因第7外显子引物探针组合物：
SMN-EX7-F(0.3μM)、SMN-EX7-R(0.3μM)、SMN1-EX7-P(0.15μM)、SMN2-EX7-P(0.15μM)、RPP30-F(0.2μM)、RPP30-R(0.2μM)及RPP30-P(0.2μM)：3μL(上述浓度为各引物探针在反应体系中的终浓度)。
样本DNA模板：4μL；
去离子水：3μL。
2、SMN第8外显子反应体系(总反应体系为20μL)：
PCR反应试剂：10μL；
SMN基因第8外显子引物探针组合物：
SMN-EX8-F(0.4μM)、SMN-EX8-R(0.4μM)、SMN1-EX8-P(0.3μM)、SMN2-EX8-P(0.3μM)、RPP30-F(0.2μM)、RPP30-R(0.2μM)及RPP30-P(0.2μM)：4μL(上述浓度为各引物探针在反应体系中的终浓度)。
样本DNA模板：4μL；
去离子水：2μL。
实施例5、PCR反应
采用ABI 7500实时荧光PCR仪或Roche LightCycler 480进行PCR反应。PCR反应在多通道实时荧光PCR仪上进行，每一循环实时采集FAM、VIC和NED荧光信号(FAM对应SMN1-EX7，或SMN1-EX8；VIC对应SMN2-EX7，或SMN2-EX8；NED对应内参基因RPP30)。本发明采用含U(尿嘧啶)体系，UNG可以消除产物带来的污染。PCR扩增条件如下：50℃2分钟UNG酶激活，95℃2分钟启动后，95℃3秒，60℃45秒共40个循环，每一循环PCR仪实时采集FAM、VIC和NED通道荧光信号。
实施例6、结果分析
1、检验结果分析要求
检验结果应满足以下条件：
(1)空白对照反应在任一检验通道Ct值35之前无信号。若信号升起，且Ct值＜35，则此次实验结果无效，建议重新实验。
(2)正常对照品的最小梯度的目的基因和内参基因的Ct值≤28(若不满足此条件，说明对照品降解，需要重新制备)。
(3)调整荧光信号阈值至正常对照品三个梯度的FAM通道信号和VIC通道信号线性相关系数均＞0.95(若不满足此条件，无法计算样本拷贝数)。
(4)待测样本内参基因的Ct值≤28(若不满足此条件，可能样本降解)。
SMN基因的第7外显子反应：
分别计算各个梯度所述对照品的目的基因(SMN1基因第7外显子，FAM通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_FAM-Ct_NED，计算所述对照品三个梯度的ΔCt的平均值，记为ΔCt_a。然后，计算所述待测DNA样本的目的基因(SMN1基因第7外显子，FAM通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_FAM-Ct_NED，记为ΔCt_s。ΔΔCt＝ΔCt_s-ΔCt_a。
分别计算各个梯度所述对照品的目的基因(SMN2基因第7外显子，VIC通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_VIC-Ct_NED，计算所述对照品三个梯度的ΔCt的平均值，记为ΔCt_a。然后，计算所述待测DNA样本的目的基因(SMN2基因第7外显子，VIC通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_VIC-Ct_NED，记为ΔCt_s。ΔΔCt＝ΔCt_s-ΔCt_a。
SMN基因的第8外显子反应：
分别计算各个梯度所述对照品的目的基因(SMN1基因第8外显子，FAM通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_FAM-Ct_NED，计算所述对照品三个梯度的ΔCt的平均值，记为ΔCt_a。然后，计算所述待测DNA样本的目的基因(SMN1基因第8外显子，FAM通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_FAM-Ct_NED，记为ΔCt_s。ΔΔCt＝ΔCt_s-ΔCt_a。
分别计算各个梯度所述对照品的目的基因(SMN2基因第8外显子，VIC通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_VIC-Ct_NED，计算所述对照品三个梯度的ΔCt的平均值，记为ΔCt_a。然后，计算所述待测DNA样本的目的基因(SMN2基因第8外显子，VIC通道)与所述内参基因(RPP30基因，NED通道)间的ΔCt值，ΔCt＝Ct_VIC-Ct_NED，记为ΔCt_s。ΔΔCt＝ΔCt_s-ΔCt_a。
2、检验结果分析
SMN1和SMN2基因第7外显子、第8外显子拷贝数的分析，采用2-ΔΔCt值法相对定量方式，其依据是每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，比较不同待检样本中DNA的Ct值与SMN1基因1拷贝对照品Ct值的变化，就可对未知标本目的基因的原始拷贝数做出判断。正常人群中，SMN1第7外显子、第8外显子拷贝数均＝2，定量检测时目的基因与内参基因的拷贝数相等而ΔCt值恒定(ΔΔCt＝-1)，2-ΔΔCt值为2.0；如果某个体目的基因缺失了其中1个，定量检测时此基因的Ct值增高幅度为1，与内参基因比较所得的ΔCt值增幅也为1(ΔΔCt＝0)，所计算的2-ΔΔCt值1.0，也就说明目的基因拷贝数只有内参基因的一半；反之如果两个都缺失，则不会有目的序列扩增。SMN2基因同理。所以，根据此数值变化规律，以2-ΔΔCt值法相对定量方式，直接分析SMN基因第7外显子和第8外显子目的序列的相对拷贝数，实现SMA的快速分子诊断及分型。
SMN1基因和SMN2基因的第7外显子和第8外显子拷贝数定量数据分析结果均可按照如下条件进行判定：
无Ct值，CNS＝0；
0.5≤2-ΔΔCt≤1.6，CNS＝1；
2-ΔΔCt＞1.6，CNS≥2；
其中，CNS为SMN1基因或SMN2基因的第7外显子或第8外显子的拷贝数。
本发明通过上述引物对和Taqman探针组合物可以实现SMN1与SMN2基因第7和第8外显子的相对拷贝数定量。
本发明提出的引物与探针组合物中，目标基因Taqman-LNA探针分别使用FAM和VIC标记，内参基因Taqman探针使用NED标记，显然可以选用其它合适荧光标记。在对SMN1和SMN2第7和第8外显子进行拷贝数相对定量时，单拷贝内参基因仅仅是作为拷贝数相对定量的内参标记，显然选择其它的单拷贝内参基因并不影响目的基因的拷贝数相对定量结果。
本发明提出的引物与探针组合物，其工作浓度已依据相应的PCR缓冲液及PCR循环参数进行优化。显然依据其它合适的PCR缓冲液及PCR循环参数同样可以获得理想的目的基因拷贝数相对定量检测结果。另外，更改引物与探针组合物的储存液浓度并不影响本发明的性质。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的保护范围内。
<110> 北京迈基诺基因科技股份有限公司
<120> 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒
<130> GNCLN200015
<160>
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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cttgtgaaac aaaatgcttt tta 23
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<213> Artificial sequence
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gtcttgtgaa acaaaatgct ttttaacatc catataaagc tatctatata tagctatcta 60
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Claims (10)

1.一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测试剂盒，含有单链DNA组A和/或单链DNA组B：
所述单链DNA组A由引物对A、探针A1和探针A2组成；
所述引物对A为特异性检测SMN1基因和SMN2基因第7外显子的共用引物，由SEQ IDNo.1所示的上游引物SMN-EX7-F和SEQ ID No.2所示的下游引物SMN-EX7-R组成；
所述探针A1为检测SMN1基因第7外显子的探针SMN1-EX7-P，其核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；
所述探针A2为检测SMN2基因第7外显子的探针SMN2-EX7-P，其核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示；
所述单链DNA组B由引物对B、探针B1和探针B2组成；
所述引物对B为特异性检测SMN1基因和SMN2基因第8外显子的共用引物，由SEQ IDNo.3所示的上游引物SMN-EX8-F和SEQ ID No.4所示的下游引物SMN-EX8-R组成；
所述探针B1为检测SMN1基因第8外显子的探针SMN1-EX8-P，其核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示；
所述探针B2为检测SMN2基因第8外显子的探针SMN2-EX8-P，其核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有单链DNA组C；所述单链DNA组C由引物对C和探针C组成；
所述引物对C为特异性检测内参基因的引物对；
所述探针C为检测所述内参基因的探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对C为检测内参基因PRR30的引物对，由SEQ ID No.9所示的上游引物PRR30-F和SEQ ID No.10所示的下游引物PRR30-R组成；
所述探针C为检测内参基因PRR30的探针PRR30-P，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有对照品；
所述对照品为对照品A、对照品B或对照品C：
所述对照品A由DNA片段A1、DNA片段A2和DNA片段C组成；或者由含有所述DNA片段A1的质粒A1、含有所述DNA片段A2的质粒A2和含有所述DNA 片段C的质粒C组成；
所述DNA片段A1为SMN1基因第7外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.12；所述DNA片段A2为SMN2基因第7外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.13；所述DNA片段C为所述内参基因片段；
所述对照品B由DNA片段B1、DNA片段B2和所述DNA片段C组成；或者由含有所述DNA片段B1的质粒B1、含有所述DNA片段B2的质粒B2和所述质粒C组成；
所述DNA片段B1为SMN1基因第8外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.14；所述DNA片段B2为SMN2基因第8外显子，其核苷酸序列为SEQ ID No.15；
所述对照品C由所述DNA片段A1、所述DNA片段A2、所述DNA片段B1、所述DNA片段B2和所述DNA片段C组成；或者由所述质粒A1、所述质粒A2、所述质粒B1、所述质粒B2和所述质粒C组成。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA片段C为内参基因RPP30的片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.16。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：在所述对照品A中，所述DNA片段A1、所述DNA片段A2和所述DNA片段C的拷贝数之比为1：1：2；或
在所述对照品A中，所述质粒A1、所述质粒A2和所述质粒C的拷贝数之比为1：1：2；或
在所述对照品B中，所述DNA片段B1、所述DNA片段B2和所述DNA片段C的拷贝数之比为1：1：2；或
在所述对照品B中，所述质粒B1、所述质粒B2和所述质粒C的拷贝数之比为1：1：2；或
在所述对照品C中，所述DNA片段A1、所述DNA片段A2、所述DNA片段B1、所述DNA片段B2和所述DNA片段C的拷贝数之比为1：1：1：1：2；或
在所述对照品C中，所述质粒A1、所述质粒A2、所述质粒B1、所述质粒B2和所述质粒C的拷贝数之比为1：1：1：1：2。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有PCR反应试剂。
8.用于对人运动神经元基因拷贝数相对定量的系统，包括：
(b1)权利要求1-7中任一所述的试剂盒；
(b2)装置A，能够采用(b1)中的所述试剂盒对待测DNA样本和权利要求4-6中任一所述对照品分别进行实时荧光定量PCR检测，得到Ct值数据；
(b3)装置B，包括数据输入模块、数据运算模块和结论输出模块；
所述数据输入模块被配置为输入所述装置A所得的Ct值数据；
所述数据运算模块被配置为接收来自所述数据输入模块的Ct值数据，对所述Ct值数据进行计算，得到所述待测DNA样本的SMN1基因的2-ΔΔCt值和SMN2基因的2-ΔΔCt值；
所述结论输出模块被配置为接收来自所述数据运算模块的运算结果，根据所述待测DNA样本的SMN1基因的2-ΔΔCt值和SMN2基因的2-ΔΔCt值，输出所述待测DNA样本含有多少个SMN1基因拷贝和多少个SMN2基因拷贝的结论。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于：所述结论输出模块，对于SMN1基因和SMN2基因，均按照如下标准输出结论：
如果所述待测DNA样本无Ct值，则输出“所述待测DNA样本中目的基因的拷贝数为0”的结论；
如果所述待测DNA样本的2-ΔΔCt值大于等于0.5且小于等于1.6，则输出“所述待测DNA样本中目的基因的拷贝数为1”的结论；
如果所述待测DNA样本的2-ΔΔCt值大于1.6，则输出“所述待测DNA样本中目的基因的拷贝数为≥2”的结论。
10.权利要求1-7中任一所述试剂盒或权利要求8或9所述系统在人运动神经元基因拷贝数相对定量检测中的应用。
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