CN117305437A - 一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法，涉及生物检测技术领域。本发明提供的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法可在3小时内快速完成检测，同时检测SMA患者及携带者，为SMA的发现和诊疗提供更好的临床辅助判断依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种罕见的常染色体隐性遗传性神经肌肉疾病，5qSMA为最常见类型，因位于染色体5q的运动神经元存活基因(survival motor neuron，SMN)缺失/变异导致SMN蛋白缺乏致病，欧美国家新生儿发病率为1/10000，中国人群变异携带率约1/42。根据起病年龄和最大运动里程碑，临床分为0型(常于出生1月内死亡)、1型、2型、3型和4型，其中前四型在儿童期起病，但无论哪一型，患者均表现为进行性肌萎缩与肌无力，并常伴有呼吸、消化、营养、骨骼等多系统器官损害，生存质量极低，自然病程下1型患者更常因呼吸并发症于2岁内死亡。作为一种严重的致残、致死性疾病，SMA于2018年被纳入国家《第一批罕见病目录》。
SMN有2个高度同源拷贝SMN1(OMIM 600354)和SMN2(OMIM 601627)，两者仅有5个碱基差别。SMN1基因7号外显子纯合缺失是SMA的主要致病原因。5％是由SMN1复合杂合突变所致，即一个等位基因缺失，另一个等位基因发生微小致病性变异，其突变位点位于不同的区域可引起不同的临床表型。
目前临床上与SMA相关的基因诊断技术主要有：多重连接探针扩增(MLPA)、荧光定量PCR、数字PCR技术(Digital PCR)、限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应技术(PCR-RFLP)、高分辨熔解曲线(HRM)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、NGS(下一代测序)等。MLPA技术通过直接检测SMN1及SMN2的拷贝数，但不能检测SMN1基因微小变异与SMN1[2+0]基因型。荧光定量PCR操作简便、成本低廉，适用于人群筛查，但其特异性低于MLPA法，且SMN2拷贝数需要另外设计探针进行检测，且不能检测SMN1基因微小变异和[2+0]基因型。PCR-RFLP只能检测纯合缺失，不能检测杂合缺失及微小变异。数字PCR技术是绝对定量检测，需要设计内参且通量低，仪器普及率低。NGS技术通量高，但需要昂贵的仪器检测成本高、周期长。
因此，开发一种检测全面、成本低廉、稳定以及准确的对SMN基因进行变异分析的方法对SMA携带者筛查与临床确诊具有重要作用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法以准确的实现SMN1基因微小变异与SMN1基因缺失基因的检测。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合，其包括：第一引物探针组、第二引物探针组、第三引物探针组、第四引物探针组、第五引物探针组、第六引物探针组和第七引物探针组；
第一引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2和SEQ ID No.11所示；
第二引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.3-4和SEQ ID No.12所示；
第三引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.5-6和SEQ ID No.13所示；
第四引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.7-8和SEQ ID No.15所示；
第五引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.7-8和SEQ ID No.16所示；
第六引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.9-10和SEQ ID No.17所示；
第七引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2和SEQ ID No.14所示。
第一引物探针组用于检测SMN1的第7外显子缺失突变；第二引物探针组用于检测Exon1 c.22dupA突变；第三引物探针组用于检测Intron6 c.835-5T>G突变；第四引物探针组用于检测Exon3 c.400G>A突变；第五引物探针组用于检测Exon3 c.463_464delAA突变；第六引物探针组用于检测Exon5 c.683T>A和Exon5 c.689C>T突变；第七引物探针组用于检测Exon7 c.863G>T突变。
引物探针序列如下：
具体而言，上述检测引物探针组合包括：用于检测SMN1的第7外显子缺失突变的第一引物探针组；用于检测Exon1 c.22dupA突变的第二引物探针组；用于检测Intron6c.835-5T>G突变的第三引物探针组；用于检测Exon3 c.400G>A的突变的第四引物探针组；用于检测Exon3 c.463_464delAA突变的第五引物探针组；用于检测Exon5 c.683T>A和Exon5c.689C>T突变的第六引物探针组；用于检测Exon7 c.863G>T突变的第七引物探针组。
本发明利用荧光PCR熔解曲线法，首先采用引物扩增人运动神经元存活基因(SMN)上几个与致病性相关的突变位点对应的序列，再通过荧光标记探针与PCR产物形成的双链杂交体进行熔解曲线分析来判断样本的人运动神经元存活基因是否存在突变位点。可一次实验同时检测SMN1基因的纯合/杂合缺失及常见7种微小突变位点，可以节约大量的时间与成本，满足临床快速、方便检测的需求。
发明人在突变位点外围进行引物的设计，在突变点处进行探针序列的设计，利用软件Oligo 7设计引物和探针。上述引物探针组合中的引物和探针序列均为发明人经过大量的筛选获得的扩增特异性高的检测引物探针组合。与现有的检测引物组合相比，具有检测位点多，全面，检测特异性高的技术优势。
在本发明应用较佳的实施方式中，检测引物探针组合中的探针的5’设有荧光报告基团，3’设有荧光淬灭基团；
在一种可选的实施方式中，荧光报告基团包括不限于：5-FAM、6-FAM、HEX、TET、VIC、JOE、Cy3、Cy3.5、NED、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5和Quasar670中的任意一种；
在一种可选的实施方式中，荧光淬灭基团包括不限于：TAMRA、Eclipse、BHQ系列、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ和Lowa BlackTM FQ中的至少一种；
在一种可选的实施方式中，BHQ系列包括不限于BHQ0、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种。
第二方面，本发明还提供了人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒，其包括上述的人运动神经元存活基因的检测引物探针组合。
在本发明应用较佳的实施方式中，检测试剂或试剂盒包括设置于PCR反应液中的检测引物探针组合；且PCR反应液包括：第一PCR反应液、第二PCR反应液和第三PCR反应液；
其中，第一PCR反应液包括第一引物探针组；
第二PCR反应液包括第二引物探针组、第三引物探针组和第七引物探针组；
第三PCR反应液包括第四引物探针组、第五引物探针组、第六引物探针组。
上述PCR反应液中的引物探针组合为本发明优化后的组合，采用其他的组合会一定程度上影响检测结果的准确读出，甚至会在试剂检验中存在交叉干扰现象，检测信号差，无法达到检验目的。
本发明提供的试剂或试剂盒基于实时荧光定量PCR，结合了多重不对称PCR技术、Taqman探针技术及熔解曲线分析技术，使用3管反应体系可同时检测唾液、拭子、血斑、抗凝全血样本中SMN1基因的纯合/杂合缺失及7种常见微小突变位点情况：Exon1c.22dupA、Exon3 c.400G>A、Exon3 c.463_464delAA、Exon5 c.683T>A、Exon5 c.689C>T、Intron6c.835-5T>G、Exon7 c.863G>T。
首先，利用不对称PCR，产生大量与探针互补的单链，探针与单链形成杂合子，再经熔解分析，通过实时检测熔解过程中荧光信号值的变化，根据不同扩增产物与质控品的Tm差判断SMN基因的突变结果。
与目前临床上所用的试剂盒相比，本发明的检测试剂盒位点更多、更全面，且成本更低。使用本发明的检测试剂盒，能快速而准确的帮助确认或排除患有SMA的可能性，减少患儿的出生，帮助采取有效治疗和管理措施，提高患者生活质量。
在本发明应用较佳的实施方式中，各PCR反应液内的任意一个引物探针组中的上游引物与下游引物的摩尔比独立地为(1～10)：(1～10)。例如1:1～5；或1:4～10；或1～5:1；或(4～10)：(1～4)。
在一种可选的实施方式中，各PCR反应液内的任意一个引物探针组中的探针的浓度为0.01μM-1μM。如0.01μM-0.1μM，或者0.05-1μM。上述引物和探针的浓度即为工作浓度。
在本发明应用较佳的实施方式中，试剂或试剂盒还包括如下物质中的至少一种：PCR反应缓冲液、Taq酶、镁离子、dNTP、野生型对照、阴性对照和水。
野生对照为含有SMN1和SMN2靶基因质粒的TE缓冲液，也可以称之为质控品，等同于阳性对照。此处野生对照为未突变的SMN1/2序列。
阴性对照为TE缓冲液。
在一种可选的实施方式中，Taq酶的工作浓度为0.005U/μl～0.05U/μl；
镁离子的工作浓度为0.5mM～1.5mM；
dNTP的工作浓度为0.1mM～0.5mM。
第三方面，本发明还提供了一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合在制备人运动神经元存活基因的检测产品中的应用，检测产品选自试剂、试剂盒或基因芯片。
第四方面，本发明还提供了一种人运动神经元存活基因检测的方法，方法不以疾病的诊断或治疗为目的，其包括如下步骤：采用上述的人运动神经元存活基因的检测引物探针组合或上述的人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒对待测样本进行PCR检测，获取熔解曲线图，根据待测样本与野生型对照在各通道熔解峰的Tm差值的变化判读待测样本是否含有基因突变和确定基因突变的类型。
方法还包括使用检测引物探针组合检测SMN1与SMN2的拷贝数。
SMN2的拷贝数与表型严重程度之间存在正相关，大多数重症I型患者有一个或两个SMN2拷贝；大多数II型患者有3个SMN2拷贝；并且大多数III型患者有3或4个SMN2拷贝。正常人群中SMN2的拷贝数从零到三个不等。当检测到SMN1拷贝数为0时，为纯合缺失[0+0]基因型；当检测到SMN1拷贝数为1时，为杂合缺失[0+1]基因型。因此，拷贝数与基因型相对应。
本发明提供的引物探针组合通过检测SMN1与SMN2的拷贝数变异，结合点突变和SMN1大片段(第7外显子)缺失突变检测，减少了漏诊和误诊，操作简便，检测周期短，提高了检测准确性。
在本发明应用较佳的实施方式中，进行PCR检测时，各PCR反应液内的任意一个引物探针组中的上游引物与下游引物的摩尔比独立地为(1～10)：(1～10)；
在一种可选的实施方式中，各PCR反应液内的任意一个引物探针组中的上游引物与下游引物的工作浓度独立地为0.01～5μM，优选为0.1～1μM；
在一种可选的实施方式中，各PCR反应液内的任意一个引物探针组中的探针的浓度为0.01μM-1μM；优选为0.1～0.5μM。
在本发明应用较佳的实施方式中，试剂或试剂盒还包括如下物质中的至少一种：PCR反应缓冲液、Taq酶、镁离子、dNTP、野生型对照、阴性对照和水。
野生型对照为含SMN1和SMN2靶基因质粒的TE缓冲液，也可以称之为质控品，等同于阳性对照。此处野生对照为未突变的SMN1/2序列。
阴性对照为不含靶基因的TE缓冲液。
在一种可选的实施方式中，Taq酶的工作浓度为0.005U/μl～0.05U/μl；
镁离子的工作浓度为0.5mM～1.5mM；
dNTP的工作浓度为0.1mM～0.5mM。
由于第二PCR反应液和第三PCR反应液是多重不对称PCR反应液，且还包含了多条探针，多重PCR及易产生各目的片段的相互抑制，且部分基因位点的GC含量过低、导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，导致非特异扩增和引物之间容易形成引物二聚体等导致扩增失败，影响后续熔解曲线的结果，直接造成没有熔解峰出现。经过大量摸索实验，发明人利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的上述PCR反应体系。
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，本发明采用Touch-down PCR方法，可以避免非特异性PCR扩增的出现，提高反应的特异性。
在一种可选的实施方式中，PCR的反应程序如下：94～96℃15～600s(预变性)；94～98℃10～30s，退火温度55～65℃，20～40s，70～74℃20～30s，5～20个循环，且每个循环退火温度下降0.1～2℃；94～98℃10～30s，50～55℃20～40s收集荧光信号，30～50个循环；94～96℃1～3min，33～37℃1～3min；35～90℃，持续收集荧光信号；
在一种可选的实施方式中，使用第一PCR反应液进行PCR反应以判读SMN1基因缺失的类型，使用第二PCR反应液和第三PCR反应液以判读微小基因突变的类型；
使用第一PCR反应液进行PCR反应的程序如下：
95℃5min；95℃10s，退火温度59℃，20s，72℃20s，10个循环，每个循环降低0.1℃；95℃10s；51℃30s，收集荧光信号，45个循环；95℃2min；35℃1min；35～90℃，按照每0.04℃/s的升温速度，持续收集荧光信号；
使用第二PCR反应液和第三PCR反应液进行PCR反应的程序如下：
95℃5min；95℃10s，退火温度59℃，20s，72℃20s，10个循环，每个循环降低0.1℃；95℃10s；53℃30s，此处收集荧光信号，45个循环；95℃2min；35℃1min；35～90℃，按照每0.04℃/s的升温速度，持续收集荧光信号；
在一种可选的实施方式中，若待测样本的熔解峰图中同时具有SMN1和SMN2两个野生熔解峰W1和W2或只有SMN1熔解峰W1，则判断待测样本为正常基因型([1+1])样本；
若待测样本的熔解峰图中无野生熔解峰W1，具有一个缺失峰M，则判断待测样本为SMN1纯合缺失型([0+0])样本；
若待测样本的熔解峰图中有野生熔解峰W1和一个缺失峰M，则判断待测样本为SMN1杂合缺失([0+1])样本；
在一种可选的实施方式中，使用第二PCR反应液进行PCR反应时，以FAM标记第二引物探针组的探针，以HEX标记第三引物探针组的探针，以ROX标记第七引物探针组的探针；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm＝Tm样本-Tm野生对照)为-4.82±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Exon1 c.22dupA；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-8.0±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Intron6 c.835-T>G；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-12.23±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Exon7 c.863G>T；
在一种可选的实施方式中，使用第三PCR反应液进行PCR反应时，以FAM标记第五引物探针组的探针，以HEX标记第四引物探针组的探针，以ROX标记第六引物探针组的探针；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为5.29±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Exon3 c.463_464delAA；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-3.90±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Exon3 c.400G>A；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-5.80±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Exon5 c.683T>A和/或Exon5 c.689C>T。
待测样本包括不限于唾液、拭子、血斑和抗凝全血样本中的至少一种。
第五方面，本发明还提供了用于对人运动神经元基因检测的系统，其包括：上述人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒、第一装置和第二装置；第一装置能够采用试剂或试剂盒对待测DNA样本、野生型对照及阴性对照分别进行实时荧光定量PCR检测，获得熔解曲线图；
第二装置包括：数据输入模块、数据分析与结论输出模块；
数据输入模块被配置为输入第一装置所得的熔解曲线图数据；数据分析与结论输出模块被配置为：根据待测样本与野生型对照在各通道熔解峰的Tm差值的变化判读待测样本是否含有基因突变和确定基因突变的类型。
本发明具有以下有益效果：
与现有的检测引物组合相比，本发明提供的检测引物探针组合具有检测位点多，全面，检测特异性高的技术优势。
与目前临床上所用的试剂盒相比，本发明的检测试剂盒位点更多、更全面，且成本更低。使用本发明的检测试剂盒，能快速(3小时内快速完成检测)而准确的帮助确认或排除患有SMA的可能性，减少患儿的出生，帮助采取有效治疗和管理措施，提高患者生活质量。
本发明还提供了一种人运动神经元存活基因检测的方法，利用荧光PCR熔解曲线法，首先采用引物扩增人和运动神经元存活基因(SMN)上几个与致病性相关的突变位点对应的序列，再通过荧光标记探针与PCR产物形成的双链杂交体进行熔解曲线分析来判断样本的人运动神经元存活基因是否存在突变位点。可一次实验同时检测SMN1基因的纯合/杂合缺失及常见7种微小突变位点，可以节约大量的时间与成本，满足临床快速、方便检测的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为反应体系A SMN检测FAM通道典型曲线图；
图2为基因拷贝数比例SMN1：SMN2：Del Exon7＝1:2:1曲线图；
图3为基因拷贝数比例SMN1：SMN2：Del Exon7＝0:2:2曲线图；
图4为基因拷贝数比例SMN1：SMN2：Del Exon7＝0:3:2曲线图；
图5为基因拷贝数比例SMN1：SMN2：Del Exon7＝0:4:2曲线图；
图6为基因拷贝数比例SMN1：SMN2：Del Exon7＝2:2:0曲线图；
图7为反应体系B微小突变检测FAM通道典型曲线图；
图8为反应体系B微小突变检测HEX通道典型曲线图；
图9为反应体系B微小突变检测ROX通道典型曲线图；
图10为反应体系C微小突变检测FAM通道典型曲线图；
图11为反应体系C微小突变检测HEX通道典型曲线图；
图12为反应体系C微小突变检测ROX通道典型曲线图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。
当量、浓度、或其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
此外，本文中要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨在限定单数形式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
进一步地，在以下说明书中将提及大量的表述，这些表述被定义为具有下列含义。
SMN-E7-F：是指用于扩增SMN1的第7外显子的上游引物序列(或正向引物)。
SMN-E7-R：是指用于扩增SMN1的第7外显子的下游引物序列(或反向引物)。
本发明最关键的构思在于：本发明利用荧光PCR熔解曲线法，首先引物扩增人运动神经元存活基因(SMN)上几个与致病性相关的突变位点对应的序列，再通过对荧光标记探针与PCR产物形成的双链杂交体进行熔解曲线分析来判断样本的人运动神经元存活基因是否存在突变位点。可一次实验同时检测SMN1基因的纯合/杂合缺失及常见7种微小突变位点，可节约大量的时间与成本，满足临床快速、方便检测的需求。
实施例1
本实施例提供了一种人运动神经元存活基因的检测试剂盒，可同时检测SMN1缺失(纯合缺失[0+0]基因型和杂合缺失[0+1]基因型)和SMN上七种微小突变：Exon1 c.22dupA、Exon3 c.400G>A、Exon3 c.463_464delAA、Exon5 c.683T>A、Exon5 c.689C>T、Intron6c.835-5T>G、Exon7 c.863G>T。
引物探针的设计与筛选
使用NCBI数据库搜索相关SMN1/SMN2基因序列，两者同源性很高仅相差5个碱基，因此在突变点外围进行引物的设计，在突变点处进行探针序列的设计，利用软件Oligo 7设计引物和探针。探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团修饰。各个突变位点的扩增引物优选组合序列见表1，优选探针序列见表2。
表1本发明试剂盒的引物序列
备注：F为上游引物，R为下游引物。
表2本发明试剂盒的探针序列
2.引物浓度、探针浓度以及反应体系其他组分确定
本发明人运动神经元存活基因(SMN)检测试剂盒包括PCR反应液，PCR反应液包括PCR反应液A(即为第一PCR反应液)、PCR反应液B(即为第二PCR反应液)和PCR反应液C(即为第三PCR反应液)；其中的引物及探针为上述表1和表2中序列，脱氧核糖核苷三磷酸浓度范围在0.1mmol/L～0.5mmol/L，靶标基因的上游引物以及下游引物浓度范围在0.1μmol/L～1μmol/L，正反引物比例为1：10或10：1，靶标基因的探针浓度范围在0.1μmol/L～1μmol/L，Taq DNA聚合酶浓度范围在0.005U/μl～0.05U/μl。利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系见：表3 PCR反应液A配方、表4 PCR反应液B配方和表5 PCR反应液C配方。
表3 PCR反应液A配方
| 组分 | 初始浓度 | 工作浓度 | 工作体积(μl) |
| 纯水 | \ | \ | 5.06 |
| 10×buffer | 10X | 1X | 2 |
| dNTP | 25mM | 0.25mM | 0.2 |
| Mg2+ | 25μM | 1.25μM | 1 |
| SMN-E7-F | 10μM | 0.05μM | 0.1 |
| SMN-E7-R | 50μM | 0.5μM | 0.2 |
| SMN-P | 50μM | 0.2μM | 0.08 |
| Taq酶 | 5U | 0.15U | 0.6 |
表4 PCR反应液B配方
表5PCR反应液C配方
| 组分 | 初始浓度 | 工作浓度 | 工作体积(μl) |
| 纯水 | \ | \ | 5.06 |
| 10×buffer | 10X | 1X | 2 |
| dNTP | 25mM | 0.25mM | 0.2 |
| Mg2+ | 25mM | 1.25mM | 1 |
| E3-F | 10μM | 0.1μM | 0.2 |
| E3-R | 50μM | 1μM | 0.4 |
| E5-F | 50μM | 0.5μM | 0.2 |
| E5-R | 10μM | 0.05μM | 0.1 |
| E3-P1 | 50μM | 0.2μM | 0.08 |
| E3-P2 | 50μM | 0.2μM | 0.08 |
| E5-P | 50μM | 0.2μM | 0.08 |
| Taq酶 | 5U | 0.15U | 0.6 |
注：各PCR反应液为10μl，DNA加样量为10μl，总反应体系为20μl。
由于反应体系B和C是多重不对称PCR且还包含了多条探针，多重PCR及易产生各目的片段的相互抑制，且部分基因位点的GC含量过低、导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，导致非特异扩增和引物之间容易形成引物二聚体等导致扩增失败，影响后续熔解曲线的结果，直接造成没有熔解峰出现。发明人经过大量摸索实验，对引物、探针进行了大量的筛选，并对体系进行了优化，最终优化出上述的3个反应体系。
PCR反应条件的筛选与确定
本发明提供的人运动神经元存活基因(SMN)检测试剂盒采用Touch-down PCR体系。反应条件按下表6进行优化：
表6
经过大量实验对比优化，反应液A最佳反应条件为：
95℃5min；95℃10s，59℃20s(每个循环降低0.1℃)，72℃20s，10个循环；95℃10s；51℃30s(此处收集荧光信号)，45个循环；95℃2min；35℃1min；35～90℃，每0.04℃/s持续收集荧光信号。
反应液B&C最佳反应条件为：
95℃5min；95℃10s，59℃20s(每个循环降低1℃)，72℃20s，10个循环；95℃10s；53℃30s(此处收集荧光信号)，45个循环；95℃2min；35℃1min；35～90℃，每0.04℃/s持续收集荧光信号。
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，本发明采用Touch-down PCR方法，可以避免非特异性PCR扩增的出现，提高反应的特异性。
4、本发明提供的人运动神经元存活基因(SMN)检测试剂盒用于人运动神经元存活基因1(SMN1)的缺失或SMN微小突变的检测过程依次包括如下步骤：
(1)提取待测样本DNA。
(2)PCR扩增：对样本基因组DNA进行PCR检测，获取熔解曲线图。
(3)结果判读：
根据待测样本与野生型质粒对照在各通道熔解峰的Tm差值的变化判读待检样本是否含有相应基因突变，以及基因突变类型。结果判读步骤为：首先，读取各检测通道中标准对照的Tm值；其次，读取待检样本在各检测通道的Tm值；最后，将野生型质粒对照在各检测通道的Tm值减去待检样本在各检测通道对应的Tm值，得到各检测通道的ΔTm值。参照表10和表11判断待检样本是否存在SMN缺失和微小突变，并判断突变的类型。
实施例2
本实施例具体提供了人运动神经元存活基因(SMN)检测试剂盒，用荧光PCR熔解曲线法检测待检样本是否存在SMN缺失和微小突变，并判断突变的类型。
首先采用实施例1表1所示的引物扩增人和运动神经元存活基因(SMN)上几个与致病性相关的突变位点对应的序列，再通过表2所示的荧光标记探针与PCR产物形成的双链杂交体进行熔解曲线分析来判断样本的人运动神经元存活基因是否存在突变位点。
本发明人运动神经元存活基因(SMN)检测试剂盒主要组成如表7，其中的引物与探针为实施例1中对应的序列限定。
表7试剂盒主要组成
2、适用仪器
本发明提供的试剂盒适用于带有FAM、HEX和ROX检测通道且具有熔解曲线分析功能的实时PCR扩增仪，如博日Geen-9600、全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S、SLAN-96P)、Bio-Rad CFX96。
3、储存条件及有效期
本发明提供的PCR反应液为无色透明液体，需-18℃以下避光保存，有效期12个月；
试剂盒需低温保存运输，在途时限不宜超过5天；
试剂盒反复冻融不宜超过3次；
试剂盒开瓶后-18℃以下储存，在效期内性能稳定。
4、样本要求
本试剂盒的检测对象为口腔拭子、唾液、血斑或人外周抗凝全血，抗凝剂使用EDTA抗凝。
5、检验方法
(1)DNA的提取
可使用商业化核酸DNA提取试剂盒(如Qiagen DNA Mini Kit等)，提取过程应按照商业试剂盒的说明书进行操作。PCR扩增前，可采用核酸定量仪或紫外分光光度计对模板DNA浓度和纯度进行测定。本试剂盒要求待检基因组DNA的浓度为5～200ng/μL，纯度(A260/A280)为1.7～2.1。
(2)PCR反应液的准备
从试剂盒中取出所有组所有的试剂从冰箱取出，平衡至室温并震荡混匀，短暂离心。
PCR反应混合液配液标准为：分别取n×9.4μL的PCR反应液A、B和C(n根据反应管数确定)于不同的1.5mL离心管中，每个1.5mL离心管中分别加入n×0.6μL酶混合液，振荡混匀数秒，然后3000rpm瞬时离心5秒。
用微量加样器向八联管或者96孔板中加入10μL的反应液，备用。
(3)加样
用微量加样器分别向每个反应孔加入10μL的待检样本或野生型对照的提取DNA模板，盖紧管盖，3000rpm短暂离心。
(4)PCR扩增
扩增程序如表8
表8
6、参考值(参考范围)
野生型对照在各通道中的熔解峰的Tm值范围如下表9：
表9
注：“-”表示无信号；
检测结果的解释
本发明提供的检测试剂盒在检测一个样本时，包括三个PCR反应体系，共7个检测通道，即每个样本需要查看7个通道的熔解峰情况综合判断样本的基因型。
反应体系A中的FAM通道(A-FAM)检测SMN1基因缺失；正常基因型([1+1])样本通常会出现两种情况，同时具有SMN1和SMN2两个溶解峰W1(Tm1，58.69±1.0℃)和W2(Tm2，53.31±1.0℃)或只有SMN1溶解峰W1(Tm1)；SMN1纯合缺失型([0+0])样本无野生峰W1(Tm1)，并会产生一个缺失峰M(Tm3，43.41±1.0℃)，SMN2野生峰W2(Tm2)或有或无；SMN1杂合缺失([0+1])必然会产生一个缺失峰M(Tm3)，一个SMN1野生峰W(Tm1)，SMN2野生峰W2(Tm2)或有或无。各种基因型在体系各通道的熔解峰情况见表10，典型的检测结果见图1。
表10反应体系A(SMN1缺失)检测结果判读标准
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注：“\”表示该项无参考值；
反应体系B中的FAM通道(B-FAM)检测微小突变Exon1 c.22dupA，野生型峰与缺失型峰的熔点差异(ΔTm)为4.82±1.0℃；反应体系B中的HEX通道(B-HEX)检测微小突变Intron6 c.835-T>G，野生型峰与缺失型峰的熔点差异(ΔTm)为-8.0±1.0℃，反应体系B中的ROX通道(B-ROX)检测微小突变Exon7 c.863G>T，野生型峰与缺失型峰的熔点差异(ΔTm)为-12.23±1.0℃。反应体系C中的FAM通道(FAM)检测微小突变Exon3c.463_464delAA，野生型峰与缺失型峰的熔点差异(ΔTm)为5.29±1.0℃，反应体系C中的HEX通道(C-HEX)检测微小突变Exon3 c.400G>A，野生型峰与缺失型峰的熔点差异(ΔTm)为-3.90±1.0℃，反应体系C中的ROX通道(C-ROX)检测微小突变Exon5 c.683T>A、Exon5c.689C>T，野生型峰与缺失型峰的熔点差异(ΔTm)为-5.80±1.0℃；图2～图7为上述几种基因型在各通道的溶解曲线，各个基因型与野生型熔点峰差值(ΔTm)见11。
表11反应体系B和反应体系C(微小突变)检测结果判读标准
注：①“-”表示无参考值；②Exon5 c.683T>A与Exon5 c.689C>T的ΔTm相同；
8、检验方法的局限性
本发明提供的检测试剂盒采用的是荧光PCR熔解曲线法，该方法可以检测探针覆盖区域的序列变异，故可能检测到表11所列缺失类型之外的突变，这类样本需要用其它方法进一步验证。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合，其特征在于，其包括：第一引物探针组、第二引物探针组、第三引物探针组、第四引物探针组、第五引物探针组、第六引物探针组和第七引物探针组；
所述第一引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2和SEQ ID No.11所示；
所述第二引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.3-4和SEQ ID No.12所示；
所述第三引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.5-6和SEQ ID No.13所示；
所述第四引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.7-8和SEQ ID No.15所示；
所述第五引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.7-8和SEQ ID No.16所示；
所述第六引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.9-10和SEQ ID No.17所示；
所述第七引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2和SEQ ID No.14所示；
所述第一引物探针组用于检测SMN1的第7外显子缺失突变；所述第二引物探针组用于检测Exon1 c.22dupA突变；所述第三引物探针组用于检测Intron6 c.835-5T>G突变；所述第四引物探针组用于检测Exon3 c.400G>A突变；所述第五引物探针组用于检测Exon3c.463_464delAA突变；所述第六引物探针组用于检测Exon5 c.683T>A和Exon5c.689C>T突变；所述第七引物探针组用于检测Exon7 c.863G>T突变。
2.根据权利要求1所述的人运动神经元存活基因的检测引物探针组合，其特征在于，所述检测引物探针组合中的探针的5’设有荧光报告基团，3’设有荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光报告基团选自：5-FAM、6-FAM、HEX、TET、VIC、JOE、Cy3、Cy3.5、NED、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5和Quasar670中的任意一种；
优选地，所述荧光淬灭基团选自：TAMRA、Eclipse、BHQ系列、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ和Lowa BlackTM FQ中的至少一种；
优选地，所述BHQ系列选自BHQ0、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种。
3.人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的运动神经元存活基因的检测引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒包括设置于PCR反应液中的所述检测引物探针组合；且所述PCR反应液包括：第一PCR反应液、第二PCR反应液和第三PCR反应液；
其中，所述第一PCR反应液包括第一引物探针组；
所述第二PCR反应液包括第二引物探针组、第三引物探针组和第七引物探针组；
所述第三PCR反应液包括第四引物探针组、第五引物探针组、第六引物探针组。
5.根据权利要求4所述的人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于，各所述PCR反应液内的任意一个引物探针组中的上游引物与下游引物的摩尔比独立地为(1～10)：(1～10)；
优选地，所述各所述PCR反应液内的任意一个引物探针组中的探针的浓度为0.01～1μM。
6.根据权利要求5所述的人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括如下物质中的至少一种：PCR反应缓冲液、Taq酶、镁离子、dNTP、野生型对照、阴性对照和水；
优选地，所述Taq酶的工作浓度为0.005U/μl～0.05U/μl；
所述镁离子的工作浓度为0.5mM～1.5mM；
所述dNTP的工作浓度为0.1mM～0.5mM。
7.权利要求1或2所述的人运动神经元存活基因的检测引物探针组合在制备人运动神经元存活基因的检测产品中的应用，其特征在于，所述检测产品选自试剂、试剂盒或基因芯片。
8.一种人运动神经元存活基因检测的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的，其包括如下步骤：采用权利要求1或2所述的人运动神经元存活基因的检测引物探针组合或权利要求3-6任意一项所述的人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒对待测样本进行PCR检测，获取熔解曲线图，根据待测样本与野生型对照在各通道熔解峰的Tm差值的变化判读待测样本是否含有基因突变和确定基因突变的类型；
优选地，所述方法还包括使用检测引物探针组合检测SMN1与SMN2的拷贝数。
9.根据权利要求8所述的人运动神经元存活基因检测的方法，其特征在于，进行PCR检测时，各所述PCR反应液内的任意一个引物探针组中的上游引物与下游引物的摩尔比独立地为(1～10)：(1～10)；
优选地，各所述PCR反应液内的任意一个引物探针组中的上游引物与下游引物的工作浓度独立地为0.01～5μM，优选为0.1～1μM；
优选地，各所述PCR反应液内的任意一个引物探针组中的探针的浓度为0.01μM-1μM；优选为0.1～0.5μM；
优选地，所述PCR的反应程序如下：94～96℃15～600s；94～98℃10～30s，退火温度55～65℃，20～40s，70～74℃20～30s，5～20个循环，且每个循环退火温度下降0.1～2℃；94～98℃10～30s，50～55℃20～40s收集荧光信号，30～50个循环；94～96℃1～3min，33～37℃1～3min；35～90℃，持续收集荧光信号；
优选地，使用所述第一PCR反应液进行PCR反应以判读SMN1基因缺失的类型，使用所述第二PCR反应液和第三PCR反应液以判读微小基因突变的类型；
使用所述第一PCR反应液进行PCR反应的程序如下：
95℃5min；95℃10s，退火温度59℃，20s，72℃20s，10个循环，每个循环降低0.1℃；95℃10s；51℃30s，收集荧光信号，45个循环；95℃2min；35℃1min；35～90℃，按照每0.04℃/s的升温速度，持续收集荧光信号；
使用所述第二PCR反应液和第三PCR反应液进行PCR反应的程序如下：
95℃5min；95℃10s，退火温度59℃，20s，72℃20s，10个循环，每个循环降低0.1℃；95℃10s；53℃30s，此处收集荧光信号，45个循环；95℃2min；35℃1min；35～90℃，按照每0.04℃/s的升温速度，持续收集荧光信号；
优选地，若待测样本的熔解峰图中同时具有SMN1和SMN2两个野生熔解峰W1和W2或只有SMN1熔解峰W1，则判断待测样本为正常基因型([1+1])样本；
若待测样本的熔解峰图中无野生熔解峰W1，具有一个缺失峰M，则判断待测样本为SMN1纯合缺失型([0+0])样本；
若待测样本的熔解峰图中有野生熔解峰W1和一个缺失峰M，则判断待测样本为SMN1杂合缺失([0+1])样本；
优选地，使用所述第二PCR反应液进行PCR反应时，以FAM标记第二引物探针组的探针，以HEX标记第三引物探针组的探针，以ROX标记第七引物探针组的探针；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm＝Tm样本-Tm野生对照)为-4.82±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Exon1 c.22dupA；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-8.0±1.0℃，则判断待测样本为微小突变Intron6 c.835-T>G；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-12.23±1.0℃，则判断待测样本为微小突变c.863G>T；
优选地，使用所述第三PCR反应液进行PCR反应时，以FAM标记第五引物探针组的探针，以HEX标记第四引物探针组的探针，以ROX标记第六引物探针组的探针；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为5.29±1.0℃，则判断待测样本为微小突变c.463_464delAA；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-3.90±1.0℃，则判断待测样本为微小突变c.400G>A；
若待测样本的熔解峰图中，待测样本的缺失峰与野生型峰的熔点差异(ΔTm)为-5.80±1.0℃，则判断待测样本为微小突变c.683T>A和/或c.689C>T；
优选地，所述待测样本选自唾液、拭子、血斑和抗凝全血样本中的至少一种。
10.用于对人运动神经元基因检测的系统，其特征在于，其包括：权利要求3-6任意一项所述的人运动神经元存活基因的检测试剂或试剂盒、第一装置和第二装置；所述第一装置能够采用所述试剂或试剂盒对待测DNA样本、野生型对照及阴性对照分别进行实时荧光定量PCR检测，获得熔解曲线图；
所述第二装置包括：数据输入模块、数据分析与结论输出模块；
所述数据输入模块被配置为输入所述第一装置所得的熔解曲线图数据；所述数据分析与结论输出模块被配置为：根据待测样本与野生型对照在各通道熔解峰的Tm差值的变化判读待测样本是否含有基因突变和确定基因突变的类型。
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