CN109182493B - 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法 - Google Patents

人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于核酸体外扩增检测领域，具体涉及一种人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括靶标扩增上、下游引物和参比基因扩增上、下游引物；所述靶标扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述参比基因扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。该方法采用荧光PCR技术对人16p11.2微缺失区域某一特异性片段进行扩增，能有效检测该区域是否为杂合缺失，从而间接说明是否患有16p11.2微缺失综合征。本发明具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。

Description

人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于核酸体外扩增检测领域，具体涉及一种人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法。
背景技术
16p11.2微缺失综合征(593kb)(Chromosome 16p11.2 deletion syndrome,593kb)(OMIM：611913)，是因为16号染色体p11.2(Chr16:29.5-30.1Mb)(GRCh37/hg19)区域存在的一个约593kb的复发性杂合缺失而引起的一类综合征。16p11.2微缺失综合征于2008年由Kumar等在孤独症谱系障碍中首次提出，人群的发病率0.03％。患者的主要临床症状包括：发育迟缓、智力障碍和/或孤独症谱系障碍。患者的智商通常在轻度智力障碍到正常之间，但智力正常的也往往有其他发育问题，如语言发育迟缓或者孤独症谱系障碍。大部分患者还有发生超重和肥胖的风险，20％患者有癫痫发作，2岁之前常出现巨头畸形。目前16p11.2微缺失综合征的各种出生缺陷均略微增加，但是脊柱畸形最为常见。因此为降低缺陷婴儿出生概率，减轻国民负担，应对胎儿行16p11.2微缺失综合征筛查。
16p11.2微缺失综合征可以由拷贝数变异的方法如染色体微阵列(chromosomalmicroarray analysis，CMA)或目标缺失分析方法如荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH)技术检出。单核苷酸多态性微阵列(single nucleotidepolymorphism array，SNP array)技术可检出>50kb的CNVs，从而能准确地检测出16p11.2微缺失综合征。但由于染色体微阵列需对胎儿羊水细胞做固定、核型制备及显带分析，荧光原位杂交也需对胎儿羊水细胞固定、脱水、核酸探针杂交、洗涤及荧光镜检，而SNP微阵列虽能有效地诊断16p11.2微缺失综合征，明确其断裂点以及所涉及的基因，但检测过程需要对待检细胞进行DNA提取，酶切、连接、PCR、PCR产物纯化、片段化、标记、杂交、洗染、扫描等一系列复杂操作，临床上不利于16p11.2微缺失综合征的早期胎儿筛查。
发明内容
针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法，采用荧光PCR技术对人16p11.2微缺失区域某一特异性片段进行扩增，能有效检测该区域是否为杂合缺失，从而间接说明是否患有16p11.2微缺失综合征。
本发明的第一个目的在于提出一种检测人16p11.2微缺失综合征的特异性引物，包括靶标扩增上、下游引物和参比基因扩增上、下游引物；所述靶标扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述参比基因扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明的第二个目的在于提出一种检测人16p11.2微缺失综合征的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增靶标的靶标扩增上、下游引物和用于扩增参比基因的参比基因扩增上、下游引物；所述靶标扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述参比基因扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR MIX反应液和去离子水。
更进一步地，所述PCR MIX反应液包括SYBR GreenⅠ、Taq DNA聚合酶、buffer、dNTPs和MgCl2；所述Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为2.5μM；所述MgCl2的浓度为250mM。
进一步地，所述试剂盒还包括质控对照。
更进一步地，所述质控对照包括质控品Ⅰ和质控品Ⅱ，所述质控品Ⅰ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒等量混合形成的野生纯合子质控品，所述质控品Ⅱ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒以1：2混合形成的缺失杂合子质控品。
本发明的第三个目的在于提出一种检测人16p11.2微缺失综合征的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取样本基因组DNA；
(2)纯化步骤(1)中的基因组DNA并测定其浓度和纯度，并将已知浓度的DNA样本用TE稀释成2～20ng/μl；
(3)待测样本中靶标扩增片段和参比基因PCR扩增，分成两管进行：A管扩增靶标扩增片段、B管扩增参比基因；所述A管中包含用于扩增靶标的靶标扩增上、下游引物，所述靶标扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述B管包含用于扩增参比基因的参比基因扩增上、下游引物，所述参比基因扩增上、下游引物分别为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(4)检测结果分析。
进一步地，A管中靶标扩增上、下游引物浓度均为10μM，B管中参比基因扩增上、下游引物浓度均为10μM。
进一步地，所述A管和B管中还包括PCR MIX反应液和去离子水，所述PCR MIX反应液包括SYBR GreenⅠ、Taq DNA聚合酶、buffer、dNTPs和MgCl2；所述Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为2.5μM；所述MgCl2的浓度为250mM。
进一步地，步骤(3)同时包括质控对照中靶标扩增片段和参比基因PCR扩增，所述质控对照包括质控品Ⅰ和质控品Ⅱ；所述质控品Ⅰ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒等量混合形成的野生纯合子质控品，所述质控品Ⅱ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒以1：2混合形成的缺失杂合子质控品。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明采用荧光PCR技术对人16p11.2微缺失区域某一特异性片段进行扩增，能有效检测该区域是否为杂合缺失，从而间接说明是否患有16p11.2微缺失综合征。
(2)本发明的技术方案通过设计特异性高的引物，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有操作简单、检测速度快、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。
(3)本发明的试剂盒及检测方法设置了质控对照，能有效评估本次PCR扩增体系建立是否合理性，同时在突变检测反应液中均添加了参比基因引物，通过参比基因的扩增能有效避免假阴性出现，最终确保试剂盒检测结果准确无误。
附图说明
图1为实施例2中病例1样本扩增曲线。
图2为实施例2中病例2样本扩增曲线。
图3为实施例2中病例3样本扩增曲线。
图4为实施例2中正常人样本扩增曲线。
具体实施方式
下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。
实施例1：用于检测人16p11.2微缺失综合征的特异性引物、试剂盒及应用
一、该用于检测人16p11.2微缺失的试剂盒中装有：
1、引物
靶标扩增上游引物SEQ ID NO.1：
5`-ggttgatctcccaagaccg-3`
靶标扩增下游引物SEQ ID NO.2：
5`-gggagagcacaagcgaaaa-3`
参比基因扩增上游引物SEQ ID NO.3：
5`-cctgatcctcttgtcccacag-3`
参比基因扩增下游引物SEQ ID NO.4：
5`-ggatttagagtctctcagctggtaca-3`
上述引物的浓度均为10μM。
2、PCR MIX反应液：包括SYBR GreenⅠ、Taq DNA聚合酶、buffer、dNTPs和MgCl2；其中Taq DNA聚合酶的浓度为5U/μl；dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为2.5μM；MgCl2的浓度为250mM。
3、去离子水
4、质控对照品
质控对照包括质控品Ⅰ和质控品Ⅱ，所述质控品Ⅰ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒等量混合的野生纯合子质控品，所述质控品Ⅱ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒以1：2混合的缺失杂合子质控品。
(1)包含靶标扩增片段在内的质粒的制备
本发明的包含靶标扩增片段在内的质粒的制备采用常规的实验手段，首先全基因合成靶标扩增片段，将全基因合成的靶标扩增片和PUC57载体进行酶切连接得到重组载体，连接产物转化大肠杆菌DB3.1感受态，提取包含靶标扩增片段在内的质粒。
(2)包含参比基因扩增片段在内的质粒
本发明的包含参比基因扩增片段在内的质粒的制备方法同步骤(1)。
5、将上述的引物、PCR MIX反应液、去离子水配成反应液Ⅰ和反应液Ⅱ，其中反应液Ⅰ为2×Mix，包含用于扩增靶标片段的上下游引物、SYBR GreenⅠ、buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶；反应液Ⅱ为2×Mix，包含用于扩增参比基因的上下游引物、SYBR GreenⅠ、buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶。
二、使用该试剂盒进行待测样本检测
1、提取样本基因组DNA
将待测样本进行DNA提取纯化，所述待测样本为胎儿羊水细胞，采用Qiagen组织细胞提取试剂盒或天根组织细胞提取试剂盒提取胎儿基因组DNA。
2、用nanodrop2000对步骤1提取的DNA进行浓度及纯度测定，260/280在1.7-2.1之间，并将已定浓度的DNA样本用TE稀释成5ng/μl备用。
3、从-20℃冰箱拿出上述两种反应液和两种质控品，将上述2种反应液和两种质控品放室温溶解，等待完全溶解后轻微颠倒混匀离心，反应液按终浓度1×分别分装至PCR管，不足部分加入双蒸水，并留出2μl体积作模板体积。分别以待测样本DNA和两种质控品为模板DNA进行PCR扩增，设置PCR程序进行PCR检测，每种模板DNA分别同时加入两种反应液中，分别进行靶标扩增和参比基因扩增。PCR程序为95℃10min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃收集荧光信号，选择SYBR Green Reagent模式。其中质控品Ⅰ中靶标与内参浓度均为1×105copies/ul，质控品Ⅱ中靶标与内参浓度分别为5×104copies/ul和1×105copies/ul。
PCR反应液的总体积为12.5μL(2×Mix)，反应液的组分、浓度或含量如下：
反应液Ⅰ：
Figure BDA0001797243680000071
反应液Ⅱ：
Figure BDA0001797243680000072
Figure BDA0001797243680000081
其中，反应液Ⅰ中靶标扩增上游引物SEQ ID NO.1(10μM)0.5μl，靶标扩增下游引物SEQ ID NO.2(10μM)0.5μl。反应液Ⅱ中参比基因扩增上游引物SEQ ID NO.3(10μM)0.5μl，参比基因扩增下游引物SEQ ID NO.4(10μM)0.5μl。
4、检测结果的分析。
①质控品Ⅰ：靶标扩增Ct值与参比基因Ct值之差△Ct满足-0.5≤△Ct≤0.5。
②质控品Ⅱ：靶标扩增Ct值与参比基因Ct值之差△Ct满足0.5＜△Ct≤1.5。
③样本靶标扩增Ct值减该样本参比基因扩增Ct值即△Ct＝CtTarget-Ctcontrol，若-0.5≤△Ct≤0.5，表明待测样本16p11.2为野生纯合子，若0.5＜△Ct≤1.5，表明待测样本16p11.2为缺失杂合子，若靶标无扩增曲线，参比基因正常扩增，表明待测样本16p11.2为缺失纯合子。
实施例2：用实施例1的试剂盒检测临床上已知结果样本
1、选取临床上已知结果的3例16p11.2微缺失胎儿样本及1例正常对照样本，其中样本1、样本2、样本3为临床诊断的缺失杂合子，样本4为临床诊断的野生纯合子。
2、采用Qiagen组织细胞试剂盒提取上述4例临床样本DNA。
3、运用nanodrop2000测定上述4个样本DNA浓度及纯度，结果如下：
表1
样本号 突变类型 浓度(ng/μl) 260/280
Case1 Carrier 48.7 1.60
Case2 Carrier 32.5 1.68
Case3 Carrier 27.4 1.91
正常人 Wide type 5 1.82
4、将步骤3中已知浓度的DNA样本用TE稀释成5ng/μL备用。
表2
样本号 样本浓度(ng/μl) 样本体积(μl) TE体积(μl) 终浓度(ng/μl)
Case1 48.7 5 43.7 5
Case2 32.5 5 27.5 5
Case3 27.4 5 22.4 5
正常人 5 5 / 5
5、-20℃冰箱拿出反应液Ⅰ和反应液Ⅱ，放室温完全融化，短暂离心，每个样本基因组DNA、质控Ⅰ和质控Ⅱ均需两种反应液同时检测，分别进行靶标扩增和参比基因扩增。每种反应液均按照下表配制PCR扩增液，分别分装到PCR管中，每孔分装23μL，然后加2μL待测样本或者质控品。
表3
Figure BDA0001797243680000091
6、热循环条件
选择SYBR Green Reagent模式；
PCR程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃收集荧光信号。
7、结果分析
(1)扩增结果显示，质控品Ⅰ满足-0.5≤△Ct≤0.5，说明野生纯合子的△Ct满足-0.5≤△Ct≤0.5。
(2)质控品Ⅱ满足0.5＜△Ct≤1.5，说明杂合缺失型的△Ct满足0.5＜△Ct≤1.5。
(3)4个待测样本的扩增曲线如图1、图2、图3、图4所示，其中图1、图2、图3对应的样本1、样本2、样本3均满足0.5＜△Ct≤1.5，说明3个临床样本16p11.2为杂合缺失型，与临床已知结果一致；图4对应的样本4满足-0.5≤△Ct≤0.5，说明正常人的16p11.2为野生纯合子，与已知结果也一致。
因此，本发明采用荧光PCR技术对人16p11.2微缺失区域某一特异性片段进行扩增，能有效检测该区域是否为杂合缺失，从而间接说明是否患有16p11.2微缺失综合征。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省妇幼保健院 良培基因生物科技（武汉）有限公司
<120> 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttgatctc ccaagaccg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggagagcac aagcgaaaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgatcctc ttgtcccaca g 21
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatttagag tctctcagct ggtaca 26

Claims (6)

1.一种检测人16p11.2微缺失综合征的特异性引物，其特征在于，包括靶标扩增上、下游引物和参比基因扩增上、下游引物；所述靶标扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的核苷酸序列；所述参比基因扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
2.一种检测人16p11.2微缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增靶标的靶标扩增上、下游引物和用于扩增参比基因的参比基因扩增上、下游引物；所述靶标扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述参比基因扩增上、下游引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种检测人16p11.2微缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR MIX 反应液和去离子水。
4.根据权利要求3所述的一种检测人16p11.2微缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述PCR MIX 反应液包括SYBR GreenⅠ、Taq DNA 聚合酶、buffer、dNTPs 和MgCl2；所述TaqDNA 聚合酶的浓度为5U/μl；所述dNTPs 包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为2.5μM；所述MgCl2的浓度为250mM。
5.根据权利要求2所述的一种检测人16p11.2微缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控对照。
6.根据权利要求5所述的一种检测人16p11.2微缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述质控对照包括质控品Ⅰ和质控品Ⅱ，所述质控品Ⅰ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒等量混合形成的野生纯合子质控品，所述质控品Ⅱ为包含靶标扩增片段在内的质粒与参比基因扩增片段在内的质粒以1：2混合形成的缺失杂合子质控品。
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