CN109371113A - 一种检测人类apoe和slco1b1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种生物医学领域临床检测技术中的核酸检测技术领域，具体是涉及到一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与ApoE和SLCO1B1基因相关的特异性目的基因的引物和探针，以及内标引物和内标探针，本发明的引物相互不干扰，能够在四个单个PCR反应管内同时检测出样品中人类APOE和SLCO1B1基因型，实现多重检测，特异性高，灵敏度好，重复性好。
Description
技术领域
本发明属于一种生物医学领域临床检测技术中的核酸检测技术领域，具体是涉及到一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)技术是当前核酸检测中最常用技术之一，其中采用荧光标记的taqman探针法的实时荧光PCR技术在核酸检测、临床诊断及分子生物学研究等方面的应用已经非常成熟，该技术已经应用到实验室研究、食品安全、医药卫生等众多行业中，但是这些技术大多采用单个反应管检测单一靶核苷酸，当在单个反应管检测多个靶核苷酸时，由于要同时引入检测不同靶核苷酸的引物和探针序列，这些引入的引物和探针会因为互相之间存在杂交而产生干扰，同时因为人类APOE基因的388位点、526位点，SLCO1B1基因的388位点、521位点皆仅有一个点突变，非常困难找到既能区别野生型和突变型，且又能在单管中不会互相干扰的引物探针设计。同时，作为一个试剂盒，需要规避假阴性就需要加入内对照靶核酸序列以及能检测内对照靶核酸序列的引物探针，加剧了单管多重PCR技术的困难。
目前，基因分型的方法主要有测序法、聚合酶链反应-限制性长度多态性技术、芯片法、以及荧光定量PCR法等。这些技术都必须经过繁琐的核酸提取、纯化过程来获得较高纯度的模板DNA。增加操作的步骤，费时费力，且增加人为操作误差导致的假阳性率和假阴性率。
如申请公布号为CN 104846085 A的专利公开了一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStartTaq酶，UNG酶，4组特异性引物，4组特异性探针和内标系统，在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测结果判读方法简单客观，便于分析。但是，需要经过复杂的核酸提取及纯化步骤，容易造成污染及核酸损失，而且MGB分型探针对SNP位点的容忍程度很低，如若靶点位置周围有其他突变，容易造成假阴性。
申请公布号CN106544419A的专利公开了一种用于检测SLCO1B1和ApoE基因多态性的引物、探针及试剂盒，包括针对不同基因位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针，结合荧光定量PCR反应，对从样本提取的基因组DNA进行检测，一次性就可以实现对载体蛋白E(ApoE)基因T388C和C526T、有机阴离子转运多肽1B1编码基因(SLCO1B1)A388G和T521C的基因多态性进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。但是，一个样本做两次PCR反应，其结果判断方法无法客观排除因模板DNA上样量的误差而引起的ΔCt值变化，从而导致结果判断错误。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用，其引物相互不干扰，能够在四个单个PCR反应管内同时检测出样品中人类APOE和SLCO1B1基因型，实现多重检测，特异性高，灵敏度好，重复性好。
本发明的内容包括一种用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与ApoE和SLCO1B1基因相关的特异性目的基因的引物和探针，以及内标引物和内标探针；
所述引物包括：
(1)引物序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，用于检测APOE基因388位点多态性，
(2)引物序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，用于检测APOE基因526位点多态性，
(3)引物序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性，
(4)引物序列为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12用于检测SLCO1B1基因521位点多态性；
所述探针包括：
(1)探针序列为SEQ ID NO.15，用于检测APOE基因388位点多态性共用探针，
(2)探针序列为SEQ ID NO.16，用于检测APOE基因526位点多态性共用探针，
(3)探针序列为SEQ ID NO.17，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性共用探针，
(4)探针序列为SEQ ID NO.18，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性共用探针。
优选的，序号为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11的引物为锁核酸修饰的ARMS引物。
优选的，所述内标引物的序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，所述内标探针的序列为SEQ ID NO.19。
优选的，所述探针序列中，
探针序列为SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.16，其5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1；
探针序列为SEQ ID NO.17和/或SEQ ID NO.18，其5’端修饰有CY5，3’端修饰有BHQ2。
所述内标探针的5’端修饰有VIC,3’端修饰有BHQ1。
本发明还提供一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，包括所述的组合物；组合物中含有：PCR检测试剂A、PCR检测试剂B、PCR检测试剂C和PCR检测试剂D。
所述PCR检测试剂A包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19的多种引物和探针，检测APOE基因388位点、526位点野生型；
所述PCR检测试剂B包括：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19的多种引物和探针，检测APOE基因388位点、526位点突变型；
所述PCR检测试剂C包括：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19的多种引物和探针，检测SLCO1B1基因388位点、521位点野生型；
所述PCR检测试剂D包括：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19的多种引物和探针，检测SLCO1B1基因388位点、521位点突变型。
单个PCR反应管中含有的taq DNA polymerase、氯化镁、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、两种靶核酸探针和内对照核酸探针。其中各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团检测波长互不相同。
本发明采用实时荧光PCR方法，所述实时荧光PCR方法所检测的样品是含有靶核酸的离体样品，如血液、血液制品、脱落细胞等。所述实时荧光PCR方法仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的基因分型。在本发明的第二方面的方法中，样品是经过本发明第一方面样本溶解液与样本混匀短暂静置的混合液，不可用其他方法富集的核酸溶液进行检测，有失败或假阴性的风险。
本文中，“单个PCR反应管”指所述实时荧光PCR方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选择其中所述容器是PCR反应管，其他可以进行PCR反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的实时PCR方法中，在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧光PCR仪来自动完成目标基因位点的检测，非常方便于使用者，也便于机械实现自动化。
在本文中，“多重检测”是指同时检测多种靶核酸，即至少一种。在本发明的第一方面的方法中，由于至少检测了内对照和一种靶核酸，因此检测的核酸至少有两种。当要检测的靶核酸种类不止一种时，同时检测的核酸相应增加。其中，每种核酸只能是DNA。在本发明的具体实施方式中，优先选择进行二重检测、三重检测检测。
本发明检测的靶核酸可以是其中的一种、两种、三种或者四种，分别为APOE基因PCR检测试剂A检测APOE基因388位点、526位点野生型，APOE基因PCR检测试剂B检测APOE基因388位点、526位点突变型；SLCO1B1基因PCR检测试剂A检测SLCO1B1基因388位点、521位点野生型，SLCO1B1基因PCR检测试剂B检测SLCO1B1基因388位点、521位点突变型。本发明人经过大量的样品试验、数据分析及总结，从设计的数对引物探针中优选出四对引物探针并验证了最优工作浓度，可以满足本试剂盒对靶核酸检测的高特异性、高灵敏度和重复性的要求，并且在混合体系中四对引物探针不存在互相干扰的情况。
具体引物探针设计为：
1.针对APOE基因388位点，根据文献报道，优选其高度保守区域作为扩增区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物SEQ ID NO.1和突变型引物SEQ ID NO.2，下游引物为序列为SEQ ID NO.3，探针序列为SEQ ID NO.15。
2.针对APOE基因526位点，根据文献报道，优选其高度保守区域作为扩增区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物SEQ ID NO.4和突变型引物SEQ ID NO.5，下游引物为序列为SEQ ID NO.6，探针序列为SEQ ID NO.16。
3.针对SLCO1B1基因388位点，根据文献报道，优选其高度保守区域作为设计区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物SEQ ID NO.7和突变型引物SEQ ID NO.8，下游引物为序列为SEQ ID NO.9，探针序列为SEQ ID NO.17。
4.针对SLCO1B1基因521位点，根据文献报道，优选其高度保守区域作为设计区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物SEQ ID NO.10和突变型引物SEQ ID NO.11，下游引物为序列为SEQ ID NO.12，探针序列为SEQ ID NO.18。
在确定了APOE基因388位点、526位点，SLCO1B1基因388位点、521位点引物探针序列及反应浓度之后，设计加入了作为试剂盒控制假阴性的内对照引物探针。本试剂盒采用的内对照靶标为人体基因组的一种管家基因，对应的引物为SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14，荧光探针为SEQ ID NO.19。
优选的，还包括样品溶解液，所述样品溶解液包括如下组分：十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂(LDS)、蛋白酶K、曲拉通、N,N-二羟乙基甘氨酸-KOH缓冲液(Basin)和异硫氰酸胍。
优选的，还包括PCR检测试剂，PCR检测试剂包含：Basin-HCl、甘油、曲拉通、Mg2+、氯化钾、DNTPs、氯化钠和二甲基亚砜。
优选的，还包括2个质控品和1个空白质控品；所述质控品为包含有APOE基因多态性位点388T、388C、526C、526T和SLCO1B1基因多态性位点388A、388G和521T、521C的重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照为不包含APOE和SLCO1B1基因多态性位点及内标基因的Tris-HCl缓冲液。所述重组质粒的载体优选为pUC57。
本发明还提供一种样品处理方法，使用上述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)样本预处理
取口腔拭子液或抗凝全血，加入样本溶解液，吹打混匀，静置，得样品混合液；
(2)将四份样本混合液分别与反应体系PCR检测试剂A、PCR检测试剂B、PCR检测试剂C和PCR检测试剂D混合，再将PCR八联管置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，采集CY5、FAM、VIC荧光信号；
(3)结果判断：当质控品管均有CY5、FAM、VIC荧光信号起线，空白对照均无CY5、FAM、VIC荧光信号起线，样品检测管VIC起线时，判断实验成功；根据四个样品检测管A、B、C、D中荧光信号的ΔCt值情况判读四个位点的基因多态性。
优选的，所述扩增反应的程序为：
优选的，所述试剂盒的结果判定方式为：
ΔCtFAM1＝CtFAM(B)-CtFAM(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtFAM2＝CtFAM(D)-CtFAM(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
ΔCtCY51＝CtCY5(B)-CtCY5(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtCY52＝CtCY5(D)-CtCY5(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
本发明还提供一种试剂盒在检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性方面的应用。
本发明在筛选优化APOE基因388位点、526位点，SLCO1B1基因388位点、521位点和内对照核酸的引物及荧光探针序列后，对单个PCR反应管做了进一步升级，优化dNTPs、酶、氯化镁等组分使用浓度；混合了其他PCR所需反应试剂，如pH缓冲剂和盐。还加入了一定体积的甘油，用以延长酶在PCR条件下的活性。在本发明的具体实施中，pH缓冲剂优先选择的是Bicine-Koh、K-acetate；盐优先选择的是KCl；还可以加入了BSA(牛血清白蛋白)作为蛋白酶保护剂，分别确定各套探针引物序列反应的环境范围，最终在两套体系中获得交集，确定本发明单个多重PCR反应管的体系如表1-4所示。
表1 PCR反应体系A
| 序号 | 组分 | 终浓度 |
| 1 | N,N-二羟乙基甘氨酸-KOH缓冲液ph8.2 | 100mM |
| 2 | 醋酸钾 | 125mM |
| 3 | 甘油glycerol | 8％(V.V) |
| 4 | 牛血清白蛋白(BSA) | 20μg/ml |
| 5 | 曲拉通 | 5％(V.V) |
| 6 | 氯化钠 | 15mM |
| 7 | 二甲基亚砜 | 2mM |
| 8 | KCl | 5mM |
| 9 | Edta | 1μM |
| 10 | Tth DNA polymerase | 1U/test |
| 11 | Taq DNA polymerase | 2U/test |
| 12 | dntps | 2mM |
| 13 | MgCl<sub>2</sub> | 2.5mM |
| 14 | SEQ ID NO.1 | 15pmol/test |
| 15 | SEQ ID NO.3 | 15pmol/test |
| 16 | SEQ ID NO.7 | 15pmol/test |
| 17 | SEQ ID NO.9 | 15pmol/test |
| 18 | SEQ ID NO.13 | 15pmol/test |
| 19 | SEQ ID NO.14 | 15pmol/test |
| 20 | SEQ ID NO.15 | 15pmol/test |
| 21 | SEQ ID NO.17 | 5pmol/test |
| 22 | SEQ ID NO.19 | 5pmol/test |
表2 PCR反应体系B
表3 PCR反应体系C
表4 PCR反应体系D
| 序号 | 组分 | 终浓度 |
| 1 | N,N-二羟乙基甘氨酸-KOH缓冲液ph8.2 | 100mM |
| 2 | 醋酸钾 | 125mM |
| 3 | 甘油glycerol | 8％(V.V) |
| 4 | 牛血清白蛋白(BSA) | 20μg/ml |
| 5 | 曲拉通 | 5％(V.V) |
| 6 | 氯化钠 | 15mM |
| 7 | 二甲基亚砜 | 2mM |
| 8 | KCl | 5mM |
| 9 | Edta | 1μM |
| 10 | Tth DNA polymerase | 1U/test |
| 11 | Taq DNA polymerase | 2U/test |
| 12 | dntps | 2mM |
| 13 | MgCl<sub>2</sub> | 2.5mM |
| 14 | SEQ ID NO.5 | 15pmol/test |
| 15 | SEQ ID NO.6 | 15pmol/test |
| 16 | SEQ ID NO.11 | 15pmol/test |
| 17 | SEQ ID NO.12 | 15pmol/test |
| 18 | SEQ ID NO.13 | 15pmol/test |
| 19 | SEQ ID NO.14 | 15pmol/test |
| 20 | SEQ ID NO.16 | 15pmol/test |
| 21 | SEQ ID NO.18 | 5pmol/test |
| 22 | SEQ ID NO.19 | 5pmol/test |
在本发明中，不同种探针之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样就能够同时且快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。采用的荧光基团及淬灭基团是市售的，如可以采用FAM/SYBR-GREEN，VIC/JOE/VIC，NED/TAMRA/CY3，ROX/Texas Red和CY5等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司直接合成有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式中，各靶核酸采用的荧光标记如表5。
表5各靶核酸对应荧光种类
| 种类 | 探针 | 荧光 | 波长nm |
| APOE基因388位点 | SEQ ID NO.15 | FAM | 520±5 |
| APOE基因526位点 | SEQ ID NO.16 | FAM | 520±5 |
| SLCO1B1基因388位 | SEQ ID NO.17 | CY5 | 650±5 |
| S点LCO1B1基因521位 | SEQ ID NO.18 | CY5 | 650±5 |
| 点内对照 | SEQ ID NO.19 | VIC | 550±5 |
在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判断结果的良好指标。默认设定的阈值优选为3-10循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
本发明提供了检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTPs、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。其中，不同的试剂可以分装在不同的容器中，容器可以是瓶、盒、注射器等容纳上述试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第二方面所述方法进行操作。根据需要，如方便运输、存放，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
本发明提供了检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试剂产品中的应用。检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很同意理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。
以下为各个序列的序列表。
表6序列表
本发明的有益效果是，本发明可以快速检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性(APOE-388T>C，APOE-526C>T，SLCO1B1-388A>G，SLCO1B1-521T>C)，免核酸提取步骤，一管检测多个靶标，可以快速对人APOE基因和SLCO1B1基因进行分型检测，具有操作极简快捷，敏感度高，特异性强，结果判读直接、客观等优势。本发明所述检测方法及试剂盒主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断。
该发明通过优化样品处理方法，优化内对照基因并包装，筛选优化出互不干扰的引物、探针及荧光标记，能够在四个单个PCR反应管内同时检测出样品中人类APOE和SLCO1B1基因型。
本发明无需进行繁琐的核酸提取步骤，在与样品混合静置后，即可开始检测，最大限度节省时间成本、人力物力。本发明的样本混合液只能配合本发明的检测试剂中使用，用于其他种类检测试剂有失效或假阴性风险。
本发明根据荧光检测结果计算出的ΔCt值，判断样本APOE和SLCO1B1基因型；采用内标修正方法，内标ΔCt值作为对结果的修正，提高检测准确性。
具体的，本发明具有以下效果：
1、利用本发明试剂盒的样本溶解液可以快速释放人血液样本或者口腔拭子悬液样本中的基因组核酸，整个试验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将样本直接与样本溶解液充分混合即可作为PCR扩增的模板，减少了操作步骤，避免了常规核酸提取过程中的环境污染。
2、利用本发明试剂盒可以快速对人APOE和SLCO1B1基因进行分型，具有操作简单快捷，敏感度高，特异性强，结果判读客观等优势。
3、本试剂盒所用探针为Taqman探针，成本低廉；同时，本发明的所有反应全程闭管进行，PCR反应后不用对产物进行回收、纯化、酶切、电泳等步骤，既节约了检测成本，缩短了检测周期，还降低了PCR产物引起的假阳性污染。
4、本试剂盒包含内标基因的引物和探针，通过对内标基因的检测，减少了因操作过程产生的假阴性。
5、本发明试剂盒采用的是普通荧光定量PCR平台，平台使用范围广，相对于测序法、芯片法更容易实现高通量检测，更能满足临床需要。
6、本发明将管家基因设为内标并作为结果判断标尺，可将各个反应均一化，使结果更加真实可靠。
附图说明
图1-6为实施例2的APOE基因多态性的检测结果图。
其中图1-3为PCR反应体系A分别在通道FAM、CY5和VIC的荧光定量扩增曲线图；图4-6为PCR反应体系B分别在通道FAM、CY5和VIC的荧光定量扩增曲线图。
图7-12为实施例2的SLCO1B1基因多态性的检测结果图。
其中，图7-9为PCR反应体系C分别在通道CY5、FAM和VIC的荧光定量扩增曲线图；图10-12为PCR反应体系D分别在通道CY5、FAM和VIC的荧光定量扩增曲线图。
图13-18为实施例3的APOE基因多态性的检测结果图。
其中图13-15为PCR反应体系A分别在通道FAM、CY5和VIC的荧光定量扩增曲线图；图16-18为PCR反应体系B分别在通道FAM、CY5和VIC的荧光定量扩增曲线图。
图19-24为实施例3的SLCO1B1基因多态性的检测结果图。
其中，图19-21为PCR反应体系C分别在通道CY5、FAM和VIC的荧光定量扩增曲线图；图22-24为PCR反应体系D分别在通道CY5、FAM和VIC的荧光定量扩增曲线图。
具体实施方式
以下本文将通过具体实施例来描述本发明，其中所用检测试剂来自湖南健基生物技术有限公司，所用探针、引物委托上海百利格生物技术公司合成，所用化学试剂采购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，所用DNA polymerase来自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1
本发明试剂盒组成如下：
表7试剂盒的组成
实施中使用试剂盒的操作步骤：
(1)样本预处理
用1.5mL EP管取50μL人口腔拭子悬液，加入50μL样本溶解液，移液器吹打数次混匀，室温静置10min，震荡混匀；
(2)将四份10ul样本混合液分别与40ul反应液A、检测试剂B、检测试剂C和检测试剂D混合，再将PCR八联管置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，采集CY5、FAM、VIC荧光信号；
(3)结果判断：
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(推荐使用机器设定值，用户也可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)
A.空白质控品：四种反应液检测空白质控品，FAM、Cy5通道皆无明显扩增曲线；HEX或VIC如有微弱扩增不影响结果判断。
B.野生型质控品：两种反应液检测CYP2C19-野生型质控品，反应液A的FAM、Cy5通道均有扩增曲线且Ct≤35，且ΔCtFAM1、ΔCtFAM2、ΔCtCY51、ΔCtCY52均大于3。
C.突变型质控品：两种反应液检测CYP2C19-突变型质控品，反应液B的FAM、Cy5、ROX通道均有扩增曲线且Ct≤35。且ΔCtFAM1、ΔCtFAM2、ΔCtCY51、ΔCtCY52＜-3。
D.以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
当质控品管均有CY5、FAM、VIC荧光信号起线，空白管均无CY5、FAM、VIC荧光信号起线，样品检测管VIC起线时，且Ct≤35时判断实验成功；根据两个样品检测管A、B中FAM荧光信号的ΔCt值情况判读APOE基因388的分型，根据两个样品检测管C、D中FAM荧光信号的ΔCt值情况判读APOE基因526的分型；根据两个样品检测管A、B中CY5荧光信号的ΔCt值情况判读SLCO1B1基因388的分型，根据两个样品检测管C、D中CY5荧光信号的ΔCt值情况判读SLCO1B1基因521的分型；
(1)PCR扩增条件设置如下：
基因型判读方法：
计算方式：ΔCtFAM1＝CtFAM(B)-CtFAM(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtFAM2＝CtFAM(D)-CtFAM(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
ΔCtCY51＝CtCY5(B)-CtCY5(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtCY52＝CtCY5(D)-CtCY5(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
实施例2
三重检测(APOE-388杂合子，APOE-526纯合子，SLCO1B1-388纯合子，SLCO1B1-521纯合子)
实施中使用试剂盒的操作步骤：
(1)样本预处理
用1.5mL EP管取50μL人抗凝全血，加入100μL红细胞裂解液，移液器吹打数次混匀，10000rpm/min离心1min弃上清，加入50μLddH2O吹打混匀，再加入50uL样本溶解液，震荡混匀，室温静置10min；
(2)将四份10ul样本混合液分别与40ul检测试剂A、检测试剂B、检测试剂C和检测试剂D混合，再将PCR八联管置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，采集CY5、FAM、VIC荧光信号；
(3)结果判断：
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(推荐使用机器设定值，用户也可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)
A.空白质控品：四种反应液检测空白质控品，FAM、Cy5通道皆无明显扩增曲线；HEX或VIC如有微弱扩增不影响结果判断。
B.野生型质控品：两种反应液检测CYP2C19-野生型质控品，反应液A的FAM、Cy5通道均有扩增曲线且Ct≤35，且ΔCtFAM1、ΔCtFAM2、ΔCtCY51、ΔCtCY52均大于3。
C.突变型质控品：两种反应液检测CYP2C19-突变型质控品，反应液B的FAM、Cy5、ROX通道均有扩增曲线且Ct≤35。且ΔCtFAM1、ΔCtFAM2、ΔCtCY51、ΔCtCY52＜-3。
D.以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
当质控品管均有CY5、FAM、VIC荧光信号起线，空白对照管均无CY5、FAM、VIC荧光信号起线，样品检测管VIC起线且Ct≤35时，判断实验成功；根据两个样品检测管A、B中CY5荧光信号的ΔCt值情况判读APOE基因388的分型，根据两个样品检测管A、B中FAM荧光信号的ΔCt值情况判读APOE基因526的分型；根据两个样品检测管C、D中CY5荧光信号的ΔCt值情况判读SLCO1B1基因388的分型，根据两个样品检测管C、D中FAM荧光信号的ΔCt值情况判读SLCO1B1基因521的分型；
(5)PCR扩增条件设置如下：
基因型判读方法：
计算方式：ΔCtFAM1＝CtFAM(B)-CtFAM(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtFAM2＝CtFAM(D)-CtFAM(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
ΔCtCY51＝CtCY5(B)-CtCY5(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtCY52＝CtCY5(D)-CtCY5(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
结果如图1-图12所示。
该样本基因型为APOE-388 TC，APOE-526 CC，SLCO1B1-388 GG，SLCO1B1-521 CC。
实施例3
三重检测(APOE-388纯合子，APOE-526杂合子，SLCO1B1-388纯合子，SLCO1B1-521纯合子)
实施中使用试剂盒的操作步骤
(1)样本预处理
用1.5mL EP管取50μL人抗凝全血，加入100μL红细胞裂解液，震荡混匀，10000rpm离心1min，弃上清，加入50uLddH2O吹打混匀，加入50uL样本溶解液，震荡混匀，室温静置10min，；
(2)将四份10ul样本混合液分别与40ul检测试剂A、检测试剂B、检测试剂C和SLCO1B1基因PCR检测试剂D混合，再将PCR八联管置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，采集CY5、FAM、VIC荧光信号；
(3)结果判断：
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(推荐使用机器设定值，用户也可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)
A.空白质控品：四种反应液检测空白质控品，FAM、Cy5通道皆无明显扩增曲线；HEX或VIC如有微弱扩增不影响结果判断。
B.野生型质控品：两种反应液检测CYP2C19-野生型质控品，反应液A的FAM、Cy5通道均有扩增曲线且Ct≤35，且ΔCtFAM1、ΔCtFAM2、ΔCtCY51、ΔCtCY52均大于3。
C.突变型质控品：两种反应液检测CYP2C19-突变型质控品，反应液B的FAM、Cy5、ROX通道均有扩增曲线且Ct≤35。且ΔCtFAM1、ΔCtFAM2、ΔCtCY51、ΔCtCY52＜-3。
D.以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
当质控品管均有CY5、FAM、VIC荧光信号起线，空白对照管均无CY5、FAM、VIC荧光信号起线，样品检测管VIC起线且Ct≤35时，判断实验成功；根据两个样品检测管A、B中CY5荧光信号的ΔCt值情况判读APOE基因388的分型，根据两个样品检测管A、B中FAM荧光信号的ΔCt值情况判读APOE基因526的分型；根据两个样品检测管C、D中CY5荧光信号的ΔCt值情况判读SLCO1B1基因388的分型，根据两个样品检测管C、D中FAM荧光信号的ΔCt值情况判读SLCO1B1基因521的分型；
(4)PCR扩增条件设置如下：
基因型判读方法：
计算方式：ΔCtFAM1＝CtFAM(B)-CtFAM(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtFAM2＝CtFAM(D)-CtFAM(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
ΔCtCY51＝CtCY5(B)-CtCY5(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtCY52＝CtCY5(D)-CtCY5(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
结果如图13-24所示。
该样本基因型为APOE-388 TT，APOE-526 TT，SLCO1B1-388 AG，SLCO1B1-521TT。
<110> 湖南健基生物技术有限公司
<120> 一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用
<160>19
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cggacatggaggacgagt 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cggacatggaggacgagc 18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tgggaggtgaggcgcacc 18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ccgatgacctgcagatgc 18
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gccgatgacctgcagatgt 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
acgcggccctgttccacca 19
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
acaggtattctaaagaaactaaaaaca 27
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
acaggtattctaaagaaactaaaaacg 27
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
aatattaattcttaccttttcccactat 28
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ctgggtcatacatgtggataaaagt 25
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<213>人工序列
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<212>DNA
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<400>14
tgcatctcatatttggaatgactatt 26
<210>15
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ggtgcaggccatgctcgg 18
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
cgcggcctcagcgccat 17
<210>17
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
caacatcgaccttatcc 17
<210>18
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
catgggtaatatgcttcgtggaataggg 28
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
atgtggccgaggactttgattgcac 25
Claims (10)
1.一种用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，其特征是，所述组合物包括针对用于检测待检样品中分别与ApoE和SLCO1B1基因相关的特异性目的基因的引物和探针，以及内标引物和内标探针；
所述引物包括：
(1)引物序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，用于检测APOE基因388位点多态性，
(2)引物序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，用于检测APOE基因526位点多态性，
(3)引物序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性，
(4)引物序列为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性；
所述探针包括：
(1)探针序列为SEQ ID NO.15，用于检测APOE基因388位点多态性共用探针，
(2)探针序列为SEQ ID NO.16，用于检测APOE基因526位点多态性共用探针，
(3)探针序列为SEQ ID NO.17，用于检测SLCO1B1基因388位点多态性共用探针，
(4)探针序列为SEQ ID NO.18，用于检测SLCO1B1基因521位点多态性共用探针。
2.如权利要求1所述的用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，其特征是，序号为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11的引物为锁核酸修饰的ARMS引物；所述内标引物的序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，所述内标探针的序列为SEQ ID NO.19。
3.如权利要求1-2任一项所述的用于检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的组合物，其特征是，所述探针序列中，
探针序列为SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.16，其5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1；
探针序列为SEQ ID NO.17和/或SEQ ID NO.18，其5’端修饰有CY5，3’端修饰有BHQ2。
所述内标探针的5’端修饰有VIC，3’端修饰有BHQ1。
4.一种检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒，包括如权利要求1-3任一项所述的组合物，所述组合物含有PCR检测试剂A、PCR检测试剂B、PCR检测试剂C和PCR检测试剂D；
所述PCR检测试剂A包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19的多种引物和探针；
所述PCR检测试剂B包括：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19的多种引物和探针；
所述PCR检测试剂C包括：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19的多种引物和探针；
所述PCR检测试剂D包括：SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19的多种引物和探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征是，还包括样品溶解液，所述样品溶解液包括如下组分：十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、蛋白酶K、曲拉通、N,N-二羟乙基甘氨酸-KOH缓冲液、异硫氰酸胍；或者，PCR检测试剂包含：N,N-二羟乙基甘氨酸-KOH缓冲液、甘油、曲拉通、Mg2+、氯化钾、DNTPs、氯化钠和二甲基亚砜。
6.如权利要求4-5任一项所述的试剂盒，其特征是，还包括2个质控品和1个空白质控品；所述质控品为包含有APOE基因多态性位点388T、388C、526C、526T和SLCO1B1基因多态性位点388A、388G和521T、521C的重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述空白质控品为不包含APOE和SLCO1B1基因多态性位点及内标基因的Tris-HCl缓冲液。
7.一种样品处理方法，其特征是，使用如权利要求4-6任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)样本预处理
取口腔拭子液或抗凝全血，加入样本溶解液，吹打混匀，静置，得样品混合液；
(2)将四份样本混合液分别与反应体系PCR检测试剂A、PCR检测试剂B、PCR检测试剂C和PCR检测试剂D混合，再将PCR八联管置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，采集CY5、FAM、VIC荧光信号；
(3)结果判断：当质控品管均有CY5、FAM、VIC荧光信号起线，空白质控品均无CY5、FAM、VIC荧光信号起线，样品检测管VIC起线时，判断实验成功；根据四个样品检测管A、B、C、D中荧光信号的ΔCt值情况判读四个位点的基因多态性。
8.如权利要求7所述的样品处理方法，其特征是，DNA扩增反应的程序为：
9.如权利要求7或8所述的样品处理方法，其特征是，试剂盒的结果判定方式为：
ΔCtFAM1＝CtFAM(B)-CtFAM(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtFAM2＝CtFAM(D)-CtFAM(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
ΔCtCY51＝CtCY5(B)-CtCY5(A)-(CtVIC(B)-CtVIC(A))
ΔCtCY52＝CtCY5(D)-CtCY5(C)-(CtVIC(D)-CtVIC(C))
10.一种如权利要求4-8的试剂盒在检测人类APOE和SLCO1B1基因多态性方面的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190222 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |