CN110257510A - 一种检测apoe基因多态性的引物和探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒。利用2对APOE特异性引物，分别扩增人类APOE基因112位点和158位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本发明在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒，属于基因多态性检测技术领域。
背景技术
人APOE基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q13.2)上，含有4个外显子和3个内含子。
APOE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六种常见表型。APOE3/3型又称野生型。APOE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。APOE4在这两个位置上都是Arg；E2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为APOE3异构体，自然人群中，基因频率ε3分布最高，APOE3/3表型分布约70％。见下表
APOE基因是阿尔兹海默症的一个重要的遗传危险因素。APOE 4等位基因与晚发性家族性AD和散发性AD相关，而APOE2等位基因则对此类疾病具有防护作用。每多遗传一个APOE4的等位基因，相应就增加45％的AD的患病危险,也使得其发病年龄提前。在晚发型家族性AD中,每个APOE4的等位基因能将发病年龄提前7-9年。
APOE基因分型是目前除了影像学外，更及时和有效的针对阿尔兹海默症的风险评估方法；对阿尔兹海默症后期发病预测有较高的准确性，特别是家族性受检者；还可以对APOE4基因型人群进行风险预警。
APOE的基因位点具有遗传多态性，多态性与个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展密切相关。通过对APOE基因类型的检测，可以早期预测心脑血管疾病等的发病概率，反应个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展，指导他汀类用药，并可以此实施健康管理，实现尽早预防。
发明内容
为了克服现有技术检测能力的不足，本发明利用2对载脂蛋白E(APOE)特异性引物，分别扩增人类APOE基因112位点和158位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针(5’末端标记FAM荧光素和5’末端标记VIC荧光素)，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
本发明设置了UNG酶+dUTP防污染措施，即PCR扩增利用UNG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解。以排除由此可能引起的假阳性结果。
本发明以人类GAPDH基因作为内参基因设计特异性引物和探针(5’末端标记ROX荧光素)，实时检测系统的工作情况，以此排除假阴性结果。
本发明的基因多态性包括APOE基因112TT+158CC型(APOEε3/ε3型)、112TT+158TT型(APOEε2/ε2型)、112CC+158CC型(APOEε4/ε4型)、112T/C+158CC型(APOEε3/ε4型)、112TT+158T/C型(APOEε2/ε3型)、112T/C+158T/C型(APOEε2/ε4型)型基因多态性。
本发明的技术方案如下：
一种检测APOE基因多态性的引物和探针，包括检测APOE 112位点ARMS引物和探针以及检测APOE 158位点ARMS引物和探针。
所述检测APOE 112位点ARMS引物对及MGB探针包括：
112T位点引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5；
112C位点引物序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13；
112下游通用引物序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18；
112T探针序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22；
112C探针序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQID NO.27、SEQ ID NO.28；
所述112T探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；
所述112C探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰VIC；3’端修饰BHQ1。
所述检测APOE 158位点ARMS引物对及MGB探针包括：
158T位点引物序列如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ IDNO.38；
158C位点引物序列如SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ IDNO.48；
158上游通用引物序列如SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ IDNO.52；
158T探针序列如SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56；
158C探针序列如SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQID NO.61、SEQ ID NO.62；
所述158T探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；
所述158C探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰VIC,3’端修饰BHQ1。
检测APOE基因多态性的试剂盒，包括上述的检测APOE基因多态性的引物和探针。
优选地，检测APOE基因多态性的试剂盒，还包括检测内部质控的内参引物对及探针：
内参上游引物序列如SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65；
内参下游引物序列如SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67；
内参探针引物序列如SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70；
所述内参探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰ROX,3’端修饰BHQ2。
优选地，检测APOE基因多态性的试剂盒，还包括具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液，所述预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、MUSTANGPURPLE荧光校准染料、dNTP、MgCl2、PCR buffer。
优选地，检测APOE基因多态性的试剂盒，还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为混合APOE112C、112T、158T、158C基因质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。
混合APOE112C、112T、158T、158C基因质粒DNA为E2质粒112T/158T(SEQ IDNO.71)、E4质粒112C/158C(SEQ ID NO.72)。
需要特别说明的是，本发明的重点技术特征在于通过在每个SNP位点的检测上设计两个引物和探针来实现基因多态性的检测，因此，本发明不局限于上述各个引物和探针的序列设计，其余可能的序列能够达到上述目的都应落入本发明的保护范围。
本发明所达到的有益效果：
1.特异性高：试剂盒采用ARMS引物与MGB探针，特异性检测基因多态性。
2.灵敏度高：可以准确检测1ng基因组DNA的基因型。
3.安全无创：样本不但可以采用血液样本，还可以采集人口腔上皮细胞方便快捷。
4.多重反应：每个反应体系进行多重反应，检测同一位点的2种多态性，减少检测操作步骤，降低成本、提高检测效率，有利于临床检测分析应用。
5.UNG酶防污染体系，室温条件即可有效降解PCR产物，不需要额外增加程序时间，缩短检测时间。
6.结果判读无需计算，便捷直观，对操作人员要求不高。
本发明在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。
附图说明
图1是APOE 112T/T野生型样本的检测结果图；
图2是APOE 112C/C纯合突变型样本的检测结果图；
图3是APOE 112T/C杂合突变型样本的检测结果图；
图4是APOE 158C/C野生型样本的检测结果图；
图5是APOE 158T/T纯合突变型样本的检测结果图；
图6是APOE 158T/C杂合突变型样本的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例：
1、试剂盒主要组成成分
2、试剂准备
2.1取出PCR反应液(112位点)和PCR反应液(158位点)，在室温(25℃)下融化，振荡混匀30s，并2000rpm离心10s。
2.2核算当次实验所需的反应数(n)，按照13μL/孔分装量将每种PCR反应液分别分装到n个反应管内。不同体系间需要做好标记，勿混淆。PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回低于-15℃冰箱冷冻避光保存。
n＝样本数+阴性对照(1人份)+阳性对照(1人份)
3、加样
3.1样本准备：提取的人基因组DNA用紫外分光光度计进行浓度和纯度测定，样品OD260/OD280应在1.6-2.0之间，推荐待测样品DNA加入量大于5ng/反应。
将待检测样本的基因组DNA、阴性对照和阳性对照，分别加入已装有2种PCR反应液的反应管中，即每个待检测样本分别用此2种PCR反应液进行检测，加入DNA量为2μL/孔。
3.2盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况。将上述PCR扩增管4000rpm离心5min，避免管壁挂珠；将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。若PCR反应管内加入模板后遇临时状况不能立即上机，建议将加样好模板的PCR反应管放于2～8℃条件下暂时保存，并在2小时内尽快上机检测。
4、PCR扩增(在扩增与分析区进行，请参照各仪器使用说明书进行设置)
4.1开机，并进行仪器性能自检。
4.2取上述已加入待检测DNA的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。
4.3循环参数设定(Protocol)：
4.4运行反应程序。
5、结果分析
反应结束后对APOE的曲线和相应内参的曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline threshold的Begin值，以及End值(用户可根据实际情况自行调整，Begin值可设在2～15、End值可设在5～25，调整阴性对照品的扩增曲线平直或低于阈值线)，使其刚好超过正常阴性对照品的最高点，然后记录定量结果。
检测结果有效性判定：
(1)阴性对照品：FAM、VIC通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或者轻微斜线，无明显指数增长期，无Ct(Cq)值或检测Ct(Cq)值＞35；
(2)阳性对照品：FAM、VIC通道Ct(Cq)值≤35，扩增曲线有明显指数增长期。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
样本有效性的判定：
(1)内参基因：所有样本检测中ROX通道Ct值＜35，扩增曲线有明显指数增长期。
(2)如图1-6所示，检测结果的判定：
本发明与现有技术相比：
现有技术特异性不强，野生型和突变型区别不够明显，需采用△Ct并结合扩增曲线判读，结果判读繁琐，对判读人员要求高；本案的试剂盒特异性筛选ARMS引物与MGB探针，特异性非常强，结果判读无需计算，清晰明确。
现有技术中检测APOE基因型多态性时对样本处理要求高，多需要血液样本；本案的试剂盒样本不但可以采用血液样本还可以采集人口腔上皮细胞，无需采血，安全无创，方便快捷。
现有技术每次检测，每个检测体系只能进行单重PCR反应，每个反应体系只能检测一个基因位点多态性的不足；本案的基因检测试剂将多对引物和多条经不同荧光染料基团修饰的特异性荧光探针与PCR预混液配制预混成一个反应体系，使不同靶基因在多对特异性引物结合下高效多重PCR扩增，并利用标记不同荧光染料基团的MGB-NFQ和TaqMan-BHQ荧光探针对目标产物进行实时检测分析。
现有技术PCR反应防污染体系需要额外增加程序时间，本案的基因检测试剂UNG酶防污染体系，室温条件即可有效降解PCR产物，不需要额外增加程序时间，缩短了检测时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏贝格尔生物医药有限公司
<120> 一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒
<141> 2019-08-06
<160> 70
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggacatgga ggacgagt 18
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggacatgga ggacgggt 18
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggacatgga ggacctgt 18
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggacatgga ggacgcgt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcggacatg gaggacgtat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggacatgga ggacgggc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacatggag gacgcgc 17
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggacatgga ggacgagc 18
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<212> DNA
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cggacatgga ggacgtgc 18
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gcggacatgg aggacgttc 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggacatgg aggacatgc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggacatgg aggacttgc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggacatgg aggacctgc 19
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gcaggtcatc ggcatcgcgg a 21
<210> 15
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<212> DNA
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tggcagtgta ccaggccgg 19
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<212> DNA
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cagaagcgcc tggcagtgta c 21
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gcaggtcatc ggcatcgc 18
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aggtcatcgg catcgcggag 20
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<212> DNA
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ccaggcggcc gcacacgt 18
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<212> DNA
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cggccgcaca cgtcc 15
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<212> DNA
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caggcggccg cacacgtcc 19
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<212> DNA
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cggccgcata cgtc 14
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<212> DNA
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caggcggccg cgcacgtcc 19
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<212> DNA
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cggccgcgcc cgtcc 15
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<212> DNA
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cacgcgccgg cggacca 17
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<212> DNA
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cgcgccggcg gaccacgt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacctcctgc acgcgcc 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggcggccg cgcacgt 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcctggtac actgccatgc a 21
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<212> DNA
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gcctggtaca ctgccaggaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggtaca ctgccaggta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggtaca ctgccaggga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcctggtac actgccagac a 21
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<212> DNA
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ggcctggtac actgccagtc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggtaca ctgccagcca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggtaca ctgccaagca 20
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<212> DNA
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cctggtacac tgccacgca 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctggtacac tgccagggg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcctggtaca ctgccaggtg 20
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<212> DNA
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gcctggtaca ctgccaggag 20
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<212> DNA
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gcctggtaca ctgccagtcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctggtaca ctgccagacg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctggtacac tgccagccg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctggtacac tgccaggcg 19
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cctggtacac tgccaagcg 19
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gcctggtaca ctgccatgcg 20
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<212> DNA
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ctggtacact gccacgcg 18
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<212> DNA
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gccagagcac cgaggag 17
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tgcgtaagcg gctcctc 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcggacatg gaggacgt 18
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<212> DNA
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cctgcagaag tgcctg 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acctgcagaa gtgcc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgacctgca gaagtgcctg gcag 24
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<212> DNA
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ctgcagaagt gactggc 17
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<212> DNA
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cctgcagaag cgcct 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcagaagca cctggc 16
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<212> DNA
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ctgcagaagc acctgg 16
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ctgcagaagc tcctgg 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgcagaagc ccctgg 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgacctgca gaagcgcctg gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actgtggcgt gatggccg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgggaaactg tggcgtgat 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggctgtgggc aaggtcatc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctccgacgcc tgcttcacca c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccaccttc ttgatgtc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaacgggaa gctcactggc at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tgcctctact ggcgctgcc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttccgtgt ccccactgcc aacgt 25
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<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 69
gaggagacgc gggcacggct gtccaaggag ctgcaggcgg cgcaggcccg gctgggcgcg 60
gacatggagg acgtgtgcgg ccgcctggtg cagtaccgcg gcgaggtgca ggccatgctc 120
ggccagagca ccgaggagct gcgggtgcgc ctcgcctccc acctgcgcaa gctgcgtaag 180
cggctcctcc gcgatgccga tgacctgcag aagtgcctgg cagtgtacca ggccggggcc 240
cgcgagggcg ccgagcgcgg cctcagcgcc atccgcgagc gcctggggcc cctggtggaa 300
<210> 70
<211> 300
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 70
gaggagacgc gggcacggct gtccaaggag ctgcaggcgg cgcaggcccg gctgggcgcg 60
gacatggagg acgtgcgcgg ccgcctggtg cagtaccgcg gcgaggtgca ggccatgctc 120
ggccagagca ccgaggagct gcgggtgcgc ctcgcctccc acctgcgcaa gctgcgtaag 180
cggctcctcc gcgatgccga tgacctgcag aagcgcctgg cagtgtacca ggccggggcc 240
cgcgagggcg ccgagcgcgg cctcagcgcc atccgcgagc gcctggggcc cctggtggaa 300
Claims (7)
1.一种检测APOE基因多态性的引物和探针，其特征在于包括检测APOE 112位点ARMS引物和探针以及检测APOE 158位点ARMS引物和探针。
2.根据权利要求1所述的检测APOE基因多态性的引物和探针，其特征在于,所述检测APOE 112位点ARMS引物对及MGB探针包括：
112T位点引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5；
112C位点引物序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13；
112下游通用引物序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18；
112T探针序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22；
112C探针序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.28；
所述112T探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；
所述112C探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰VIC；3’端修饰BHQ1。
3.根据权利要求1所述的检测APOE基因多态性的引物和探针，其特征在于,所述检测APOE 158位点ARMS引物对及MGB探针包括：
158T位点引物序列如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38；
158C位点引物序列如SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48；
158上游通用引物序列如SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52；
158T探针序列如SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56；
158C探针序列如SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.61、SEQ ID NO.62；
所述158T探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；
所述158C探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰VIC,3’端修饰BHQ1。
4.检测APOE基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测APOE基因多态性的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的检测APOE基因多态性的试剂盒，其特征在于,还包括检测内部质控的内参引物对及探针：
内参上游引物序列如SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65；
内参下游引物序列如SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67；
内参探针引物序列如SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70；
所述内参探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰ROX,3’端修饰BHQ2。
6.根据权利要求4所述的检测APOE基因多态性的试剂盒，其特征在于,还包括具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液，所述预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、MUSTANG PURPLE荧光校准染料、dNTP、MgCl2、PCR buffer。
7.根据权利要求4所述的检测APOE基因多态性的试剂盒，其特征在于,还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为混合APOE112C、112T、158T、158C基因质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。
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