CN107460235A - 一种基于ARMS‑PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒 - Google Patents

一种基于ARMS‑PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于ARMS‑PCR熔解曲线检测法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒，包括：检测ApoE基因多态性的引物，其中，所述引物包括分别检测c.388T＞C位点和c.526C＞T位点的两组引物。本发明还提供一种ARMS‑PCR熔解曲线检测方法及一种人类ApoE基因多态性检测试剂盒的PCR方法。本发明提供的基于ARMS‑PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒，能够大大增加等位基因特异性引物区分不同等位基因的能力，大大增加了扩增的两个等位基因片段熔解曲线的差异，提高了熔解曲线法进行SNP分型的能力，用普通荧光PCR仪而无需高精度的高分辨率熔解曲线PCR仪就可进行熔解曲线法SNP分型，检测结果准确，灵敏度高，可对低至1ng的基因组DNA样本准确分型。

Description

一种基于ARMS-PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种人类ApoE基因检测试剂盒，尤其是一种基于ARMS-PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒。
背景技术
载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)是一种糖蛋白，包括299个氨基酸，在人体脂质代谢中起主要作用。ApoE通过多种途径参与机体的脂质代谢调节，是影响机体血脂水平的重要内在因素。ApoE基因与多种心脑血管疾病密切相关，包括高脂蛋白血症及动脉粥样硬化性血管病、冠心病等症。ApoE基因的多态性是这些疾病发展过程和药物治疗疗效个体差异的主要原因。
ApoE基因型由主要两个SNP决定的，即位于112位氨基酸的碱基(c.388T＞C) 和158位氨基酸的碱基(c.526C＞T)。依据112和158位氨基酸的不同组合，形成不同的基因型。ApoE基因有三个等位基因，即E2、E3和E4，共构成6种不同的基因型：3种纯合型(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三种杂合型(E3/E4、E2/E3、E2/E4)。
据报道，ApoE的E4携带者患冠心病的风险要高40％，并且他汀类药物对ApoE 的E4携带者疗效往往不佳或无疗效，而对ApoE的E2携带者的降脂作用最强。
因此对于APOE基因型的检测可为临床医生确定患者基因型，为相关的疾病，如高脂血症的产生原因提供一定的参考，并可辅助医生对他汀类药物使用剂量、毒性反应及疗效进行预测。
目前对基因SNP位点的检测，常见的方法有直接测序法，基因芯片杂交法， PCR-Taqman MGB探针分型法，PCR高分辨率熔解曲线法，ARMS-PCR法等。这些方法在推广上都或多或少存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生污染，产生一定假阴性和假阳性等缺陷。
1)直接测序法，是SNP位点分析的金标准，但该检测方法受到测序仪器的限制，测序仪器昂贵，推广困难。另外直接测序对模板量要求高，通常需要通过PCR扩增富集目的片段后，进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。
2)基因芯片杂交法，目前市面上已有通过CFDA认证的成型的检测试剂盒，珠海赛乐奇生物技术有限公司的“载脂蛋白E(apoE)基因型检测试剂盒(基因芯片法)”，该试剂盒采用PCR-基因芯片杂交法进行检测，经聚合酶链式反应(PCR) 技术扩增相应的APOE基因片段，并与芯片上特异性核酸探针杂交，以区分确定APOE 的基因型。该检测方法，仍然存在操作复杂，开管操作，易造成污染的问题，另外杂交芯片制作复杂，需要载玻片等耗材，大大提高了检测成本。整个检测周期需要3-4 个小时，效率不高。
3)PCR-Taqman MGB探针分型法，因其操作简单，分型准确，全程闭管操作，检测周期短等特点，是目前比较主流的SNP分型方法。目前市面上也已有通过CFDA 认证的成型检测试剂盒，如武汉友芝友生物科技有限公司的“人类SLCO1B1和ApoE 基因多态性检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”，然而其需要两条Taqman-MGB探针，而MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，大大增加了检测成本，且MGB 探针是属于美国LIFE公司专利技术，会在原材料上受到较多限制。
4)PCR高分辨率熔解曲线SNP分型检测技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂，且试剂成本低，只需要普通的荧光染料，而不需要特定探针，但是由于SNP 位点仅仅为一个碱基的变异，因此检测仪器通常比普通的荧光PCR仪更为精密，对于温度敏感性要求特别高，两个不同碱基的变异，熔解温度可能仅仅相差0.2℃，稍有不慎，或者仪器不稳定，则很难进行区分，因此受到仪器的影响很大因此普及受到限制。
5)ARMS-PCR，等位基因特异性扩增法，也称扩增阻碍突变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，只有突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物，由于错配位于引物的 3`端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。该方法通过采用PCR反应结束后进行电泳，从有无放映条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR污染的机会，而且耗时费力。
因此，如何解决检测APOE基因多态性过程中存在的问题，推行一种简单易行，物美价廉，没有特殊昂贵仪器限制的检测方法，成为亟待解决的问题。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种基于ARMS-PCR熔解曲线法的人类APOE基因多态性检测试剂盒，以解决传统检测技术和成品检测试剂盒存在的检测仪器价格高，操作复杂，易污染，检测成本高，临床应用推广难等问题。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种全新的检测方法的技术方案为： ARMS-PCR结合熔解曲线法。
该检测技术将ARMS-PCR技术与熔解曲线法相结合，针对APOE基因的c.388 T＞C位点和c.526C＞T位点，分别各设计两个ARMS-PCR5’端引物和一个通用的3’端反向引物。其中5’端的两个ARMS引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA 互补，为了将扩增产物的熔解曲线差异增大，人为地在其中一条ARMS引物的5’末端，引入人工的单碱基重复序列，使两个ARMS引物扩增出对应特异片段时的熔解温度差异增大。3条引物同时放入一管PCR进行扩增，两条ARMS引物选择性地结合在与各自3’端完全互补的模板上进行扩增，若为纯合模板，只有其中一条ARMS 引物，即3’端可以与模板完全匹配的才能进行扩增，则扩增出对应的特异PCR片段，而若为杂合模板，则两条ARMS引物都可以找到3’端完全互补配对的模板进行扩增，分别得到两个特异性目标片段。通过在加入了荧光染料的PCR反应体系中进行PCR 扩增后，扩增出的PCR片段都带有荧光染料，随后利用荧光PCR仪的熔解曲线步骤进行分型，两个分别对应不同SNP位点的ARMS引物扩增的目的片段的熔解温度最后通过荧光信号反应出来，由于片段差异较大，则可进行准确的SNP分型。具体原理参见图1。
为解决上述技术问题，本发明给提供一种技术方案是基于ARMS-PCR结合熔解曲线法的人类APOE基因多态性检测试剂盒。
所述ApoE基因检测试剂盒包括检测ApoE基因多态性的引物，其中，所述引物包括分别检测c.388T＞C位点和c.526C＞T位点的两组引物。
所述第一组引物为针对c.388T＞C位点野生型(T)的特异性上游引物如SEQ NO.1所示和针对突变型的(C)特异性上游引物如SEQ NO.2所示，以及c.388T＞C 位点野生型(T)的特异性上游引物和突变型的(C)特异性上游引物共用的下游引物如SEQ NO.3所示。
所述第二组引物为针对c.526C＞T位点野生型(C)的特异性上游引物如SEQ NO.4所示和针对突变型的(T)特异性上游引物如SEQ NO.5所示，以及c.526C＞T 位点野生型(C)的特异性上游引物和突变型(T)的特异性上游引物共用的下游引物如SEQ NO.6所示。
上述第一组引物和第二组引物序列如下表1：
上述技术方案的一种优选是：所述试剂盒还包括PCR扩增反应液，c.388T＞C 位点扩增引物混合液，c.526C＞T位点扩增引物混合液，3种参考阳性对照液，阴性对照液。
上述技术方案的一种优选是：在c.388T＞C位点扩增引物混合液中，上述针对c.388T＞C位点野生型(T)的特异性上游引物和针对突变型的(C)特异性上游引物，及c.388T＞C位点共用下游引物，三种引物的浓度比例为1∶2∶3；在c.526C＞T位点扩增引物混合液中，上述针对c.526C＞T位点野生型(C)的特异性上游引物和针对突变型的(T)特异性上游引物，及c.526C＞T位点扩增共用下游引物的浓度比例为2∶1∶3。
更进一步的，上述技术方案的一种优选是：在PCR扩增终体系中，上述针对c.388 T＞C位点野生型(T)的特异性上游引物终浓度为0.25μM，针对突变型的(C)特异性上游引物终浓度为0.5μM，c.388T＞C位点扩增共用下游引物终浓度为0.75μM；上述针对c.526C＞T位点野生型(C)的特异性上游引物终浓度为0.5μM，针对突变型的(T)特异性上游引物终浓度为0.25μM，c.526C＞T位点扩增共用下游引物的浓度为0.75μM。
上述技术方案中的一种进一步优选时：所述PCR扩增预混液包含SYBR染料，具体包括PCR缓冲液、dNTPs、HotStart Taq DNA聚合酶，和SYBR荧光染料。
上述3种参考阳性对照液，是分别为所述c.388位点TT型-c.526位点CC型靶序列的质粒溶液，所述c.388位点TC型-c.526位点CT型靶序列的质粒溶液，以及c.388位点CC型-c.526位点TT型靶序列的质粒溶液。
更进一步的，上述3种参考阳性对照液分别作为所述试剂盒的分型结果确认的参考模板，对所述试剂盒检测人类ApoE基因多态性检测过程中的PCR扩增，分型结果进行质控。
所述阴性对照液为纯水。
本发明还提供一种所述试剂盒的PCR方法，其中：PCR方法包含两个阶段，第一阶段为PCR扩增阶段，第二阶段为熔解曲线分型阶段；其中所述第一阶段PCR扩增循环数必须使PCR扩增进入平台期，需要55个循环，所述第二阶段的熔解曲线阶段需从60℃升温到95℃，温度上升梯度为0.1℃，每上升一个梯度，保持15s，并进行一次荧光信号收集，直至程序结束。
优选的，所述的PCR方法具体如下表2所示：
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的一种基于ARMS-PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒，能够大大增加等位基因特异性引物区分不同等位基因的能力，同时针对同一检测位点的两个特异ARMS引物，选择其中一条引物引入一段人工的单碱基重复序列，可以大大增加了扩增的两个等位基因片段熔解曲线的差异，大大提高了熔解曲线法进行SNP分型的能力，用普通荧光PCR仪而无需高精度的高分辨率熔解曲线 PCR仪就可进行熔解曲线法SNP分型，检测结果准确，灵敏度高，可对低至1ng的基因组DNA样本准确分型。
(2)本发明的一种基于ARMS-PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒，克服了现有的检测技术中，繁琐操作，费时，及成本问题，只需传统的荧光染料，不涉及任何高成本检测试剂，大大节省了成本，提高了效率。
(3)本发明的一种基于ARMS-PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒，全程闭管进行，减少了污染产生的可能性，同时引入了完善的质控系统，保证检测结果的准确性。
(4)本发明的一种基于ARMS-PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒结构简单，操作方便，使用条件低廉，偏于大规模的推广应用。
本发明的这些目的，特点，和优点将会在下面的具体实施方式，附图，和权利要求中详细的揭露。
附图说明
图1是本发明的人类ApoE基因多态性检测试剂盒中ARMS-PCR熔解曲线法设计原理示意图；
图2是实施例1中的检测试剂盒检测样本1的c.388位点分型示意图；
A：表示C.388位点TT型参考阳性对照熔解曲线；
B：表示C.388位点TC型参考阳性对照熔解曲线；
C：表示C.388位点CC型参考阳性对照熔解曲线；
D：表示样本1 C.388位点检测后的熔解曲线，显示为TT型。
图3是实施例1中的检测试剂盒检测样本1的C.526位点分型示意图；
A：表示C.526位点TT型参考阳性对照熔解曲线；
B：表示C.526位点TC型参考阳性对照熔解曲线；
C：表示C.526位点CC型参考阳性对照熔解曲线；
D：表示样本1 C.526位点检测后的熔解曲线，显示为CT型。
具体实施方式
请参见图1-3，下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。文中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社 2002年版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或者制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用于与本技术领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可以应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成。
本实施例的用于检测人类ApoE基因多态性的试剂盒，包括：PCR扩增反应液，c.388T＞C位点扩增引物混合液，c.526C＞T位点扩增引物混合液，3种参考阳性对照液，空白对照液，共5管反应液，具体组成如表3所示。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的用于检测人类ApoE基因多态性的试剂盒的具体检测步骤如下：
1、DNA提取。
采用血样DNA提取试剂盒提取样本1(样本1是EDTA抗凝全血)，具体的操作参见DNA试剂盒抽提产品说明书。
2、样本DNA质量检测。
获得样本DNA后，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.7～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度为5～20ng/μl较为合适。
3、PCR反应。
1)配制20μL PCR反应体系：
计算针对c.388位点检测所需PCR反应管数(PCR反应管数＝样本数+3管参考阳性对照+1管阴性对照)，即检测一个样本的C.388位点，需要5个PCR反应管。
分别取5个荧光PCR管，向其中分别都加入10μL的PCR扩增反应液、1μL 的c.388T＞C位点扩增引物混合液和8μL的PCR级纯水，每个管19μL；分别取1 μL样本1，3种参考阳性对照液各1μL，阴性对照液1μL，加入到对应PCR管中，盖好PCR管盖，根据所加模板进行标记。
同样的方法，配制c.526位点检测所需的5管检测反应液，盖好PCR管盖，根据所加模板进行标记。
2)进行PCR反应
PCR扩增程序如表2所示。
以上PCR反应在宏石SLAN-48P荧光定量PCR仪上进行。
4、结果分析和判读
1)试剂盒有效性的判定
根据3管参考阳性对照、阴性对照PCR熔解曲线结果，判定试剂盒的有效性；其中3管参考阳性对照，熔解曲线分析结果必须分为三簇，分簇形式倾向明显；阴性对照的检测结果应无特异性扩增，不形成熔解曲线，否则可能存在污染，样本检测结果不可靠。
2)样本位点基因型的判定
以3管参考阳性对照品的熔解曲线为基准，分析检测样本的熔解曲线分簇形式倾向，判定SNP基因型。当样本的熔解曲线接近野生型阳性对照熔解曲线时，该样本为该SNP位点的野生纯合型，当样本的熔解曲线接近突变杂合阳性对照熔解曲线时，该样本为该SNP位点的突变杂合阳性型，当样本的熔解曲线接近突变纯合型阳性对照熔解曲线时，该样本为该SNP位点的纯合突变型。
样本1ApoE基因c.388位点检测结果见图2，ApoE基因c.526位点检测结果见图3。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种ARMS-PCR熔解曲线检测方法，其特征在于，包括：
将ARMS-PCR技术与熔解曲线法相结合，针对APOE基因的c.388T＞C位点和c.526C＞T位点，分别各设计两个ARMS-PCR5’端引物和一个通用的3’端反向引物；其中5’端的两个ARMS引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，为了将扩增产物的熔解曲线差异增大，人为地在其中一条ARMS引物的5’末端，引入人工的单碱基重复序列，使两个ARMS引物扩增出对应特异片段时的熔解温度差异增大；
三条引物同时放入一管PCR进行扩增，两条ARMS引物选择性地结合在与各自3’端完全互补的模板上进行扩增，若为纯合模板，只有其中一条ARMS引物，即3’端可以与模板完全匹配的才能进行扩增，则扩增出对应的特异PCR片段，而若为杂合模板，则两条ARMS引物都可以找到3’端完全互补配对的模板进行扩增，分别得到两个特异性目标片段；
在加入了荧光染料的PCR反应体系中进行PCR扩增，扩增出的PCR片段都带有荧光染料，随后利用荧光PCR仪的熔解曲线步骤进行分型，两个分别对应不同SNP位点的ARMS引物扩增的目的片段的熔解温度最后通过荧光信号反应出来，由于片段差异较大，则可进行准确的SNP分型。
2.一种基于权利要求1所述的ARMS-PCR熔解曲线检测方法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括：检测ApoE基因多态性的引物，其中，所述引物包括分别检测c.388T＞C位点和c.526C＞T位点的两组引物；所述第一组引物为针对c.388T＞C位点野生型(T)的特异性上游引物如SEQ NO.1所示和针对突变型的(C)特异性上游引物如SEQ NO.2所示，以及c.388T＞C位点野生型(T)的特异性上游引物和突变型的(C)特异性上游引物共用的下游引物如SEQ NO.3所示；
所述第二组引物为针对c.526C＞T位点野生型(C)的特异性上游引物如SEQ NO.4所示和针对突变型的(T)特异性上游引物如SEQ NO.5所示，以及c.526C＞T位点野生型(C)的特异性上游引物和突变型(T)的特异性上游引物共用的下游引物如SEQ NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增反应液，c.388T＞C位点扩增引物混合液，c.526C＞T位点扩增引物混合液，3种参考阳性对照液，阴性对照液。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：在c.388T＞C位点扩增引物混合液中，上述针对c.388T＞C位点野生型(T)的特异性上游引物和针对突变型的(C)特异性上游引物，及c.388T＞C位点共用下游引物，三种引物的浓度比例为1∶2∶3；在c.526C＞T位点扩增引物混合液中，上述针对c.526C＞T位点野生型(C)的特异性上游引物和针对突变型的(T)特异性上游引物，及c.526C＞T位点扩增共用下游引物的浓度比例为2∶1∶3。
5.根据权利要求2，3或4所述的检测试剂盒，其特征在于：在PCR扩增终体系中，上述针对c.388T＞C位点野生型(T)的特异性上游引物终浓度为0.25μM，针对突变型的(C)特异性上游引物终浓度为0.5μM，c.388T＞C位点扩增共用下游引物终浓度为0.75μM；上述针对c.526C＞T位点野生型(C)的特异性上游引物终浓度为0.5μM，针对突变型的(T)特异性上游引物终浓度为0.25μM，c.526C＞T位点扩增共用下游引物的浓度为0.75μM。
6.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：PCR扩增预混液包括PCR缓冲液、dNTPs、HotStart Taq DNA聚合酶，和SYBR荧光染料。
7.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述参考阳性对照液分别作为所述试剂盒的分型结果确认的参考模板，对所述试剂盒检测人类ApoE基因多态性检测过程中的PCR扩增，分型结果进行质控。
8.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照液为纯水。
9.一种根据权利要求3所述的检测试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR方法包含两个阶段，第一阶段为PCR扩增阶段，第二阶段为熔解曲线分型阶段；其中所述第一阶段PCR扩增循环数必须使PCR扩增进入平台期，需要55个循环，所述第二阶段的熔解曲线阶段需从60℃升温到95℃，温度上升梯度为0.1℃，每上升一个梯度，保持15s，并进行一次荧光信号收集，直至程序结束。
10.一种根据权利要求9所述的PCR方法，其特征在于：所述PCR扩增阶段包括：95℃下保持5min，循环1次；95℃保持10s后60℃保持20s，循环55次，其中，在60℃收集荧光；所述溶解曲线为60℃升温至95℃，升温速率为0.1℃/15s，收集荧光，且循环1次；其中所述PCR反应在荧光定量PCR仪上进行。
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