CN109517899B - 用于检测egfr基因突变的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR基因突变的试剂盒及检测方法。用于检测EGFR基因突变的试剂盒包括EGFR反应液、EGFR阳性对照和EGFR阴性对照，EGFR反应液由引物和PCR缓冲液组成，EGFR阳性对照为质粒DNA，EGFR阴性对照为野生型人类基因组DNA。本发明灵敏度高，检测仅需150min即可完成，同时还具备特异性好、灵敏度以及准确率高、价格低廉、操作简单的特点，完全可以满足临床快速检测的实际需求。

Description

用于检测EGFR基因突变的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR基因突变的试剂盒及检测方法。
背景技术
EGFR基因是一种表皮生长因子受体基因，位于人类7号染色体上，全长188307个碱基。其表达的蛋白是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，定位于细胞膜上，分子量约为170KDa。EGFR主要是通过信号传导的途径来调节下游基因的转录表达，其酪氨酸激酶区是重要的功能区。突变型的EGFR会导致信号传导途径遭到破坏，下游基因转录表达异常，进而诱使肿瘤的产生。临床实验表明，小分子抑制剂EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)对于EGFR突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者疗效显著。EGFR基因共有28个外显子，其中外显子18-21编码酪氨酸激酶功能区，这个区域也是突变的高发区域。外显子18、19、20、21突变约占EGFR突变的5％，45％，1％和45％。由此可见，对EGFR基因突变的检测，尤其是对其外显子18-21的检测具有十分重要的意义。
目前常用的基因突变检测方法主要有测序法和荧光定量PCR法。这些方法均存在一定的缺陷。测序法灵敏度低(只有20％)，从而导致高的假阴性，而且步骤较多，操作复杂。荧光定量PCR法是目前主流的检测方法，灵敏度较高，操作简单，但是也存在对检测样品需求量大，检测通量较低和精确度不高的不足。因此，如何找到一种对检测样品需求量低，检测通量高，灵敏度和精确度高的基因检测方法至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测EGFR基因突变的试剂盒，灵敏度以及准确率高，价格低廉；本发明同时提供了采用用于检测EGFR基因突变的试剂盒的检测方法，对检测样品需求量低、检测通量高、灵敏度和精确度高、操作简单、检测速度快。
本发明所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒，包括EGFR反应液、EGFR阳性对照和EGFR阴性对照，EGFR反应液由引物和PCR缓冲液组成，EGFR阳性对照为质粒DNA，EGFR阴性对照为野生型人类基因组DNA；
引物由PE-18-M1-F、PE-18-M2-F、PE-18-M3-F、PE-18-M-R、PE-19-M-F、PE-19-M-R、PE-20-M-F、PE-20-M1-R、PE-20-M2-R、PE-21-M1-F、PE-21-M2-F、PE-21-M-R、PE-1-F和PE-1-R组成；
PE-18-M1-F为PE-18-M1-F1、PE-18-M1-F2或PE-18-M1-F3中的一种，
PE-18-M2-F为PE-18-M2-F1、PE-18-M2-F2或PE-18-M2-F3中的一种，
PE-18-M3-F为PE-18-M3-F1、PE-18-M3-F2或PE-18-M3-F3中的一种，
PE-18-M-R为PE-18-M-R1、PE-18-M-R2或PE-18-M-R3中的一种，
PE-19-M-F为PE-19-M-F1、PE-19-M-F2或PE-19-M-F3中的一种，
PE-19-M-R为PE-19-M-R1、PE-19-M-R2或PE-19-M-R3中的一种，
PE-20-M-F为PE-20-M-F1、PE-20-M-F2或PE-20-M-F3中的一种，
PE-20-M1-R为PE-20-M1-R1、PE-20-M1-R2或PE-20-M1-R3中的一种，
PE-20-M2-R为PE-20-M2-R1、PE-20-M2-R2或PE-20-M2-R3中的一种，
PE-21-M1-F为PE-21-M1-F1、PE-21-M1-F2或PE-21-M1-F3中的一种，
PE-21-M2-F为PE-21-M2-F1、PE-21-M2-F2或PE-21-M2-F3中的一种，
PE-21-M-R为PE-21-M-R1、PE-21-M-R2或PE-21-M-R3中的一种；
PE-18-M1-F1、PE-18-M1-F2、PE-18-M1-F3、PE-18-M2-F1、PE-18-M2-F2、PE-18-M2-F3、PE-18-M3-F1、PE-18-M3-F2、PE-18-M3-F3、PE-18-M-R1、PE-18-M-R2、PE-18-M-R3、PE-19-M-F1、PE-19-M-F2、PE-19-M-F3、PE-19-M-R1、PE-19-M-R2、PE-19-M-R3、PE-20-M-F1、PE-20-M-F2、PE-20-M-F3、PE-20-M1-R1、PE-20-M1-R2、PE-20-M1-R3、PE-20-M2-R1、PE-20-M2-R2、PE-20-M2-R3、PE-21-M1-F1、PE-21-M1-F2、PE-21-M1-F3、PE-21-M2-F1、PE-21-M2-F2、PE-21-M2-F3、PE-21-M-R1、PE-21-M-R2、PE-21-M-R3、PE-1-F和PE-1-R依次为SEQ ID NO.01～38所示的序列。
所述的引物优选由PE-18-M1-F1、PE-18-M2-F1、PE-18-M3-F1、PE-18-M-R1、PE-19-M-F1、PE-19-M-R1、PE-20-M-F1、PE-20-M1-R1、PE-20-M2-R1、PE-21-M1-F1、PE-21-M2-F1、PE-21-M-R1、PE-1-F和PE-1-R组成。
所述的引物优选由PE-18-M1-F2、PE-18-M2-F2、PE-18-M3-F2、PE-18-M-R2、PE-19-M-F2、PE-19-M-R2、PE-20-M-F2、PE-20-M1-R2、PE-20-M2-R2、PE-21-M1-F2、PE-21-M2-F2、PE-21-M-R2、PE-1-F和PE-1-R组成。
所述的引物优选由PE-18-M1-F3、PE-18-M2-F3、PE-18-M3-F3、PE-18-M-R3、PE-19-M-F3、PE-19-M-R3、PE-20-M-F3、PE-20-M1-R3、PE-20-M2-R3、PE-21-M1-F3、PE-21-M2-F3、PE-21-M-R3、PE-1-F和PE-1-R组成。
根据人类EGFR基因序列，本发明针对28种基因突变设计荧光引物。
SEQ ID NO.01～38引物序列见表1。
表1SEQ ID NO.01～38引物序列
Figure BDA0001892694550000021
Figure BDA0001892694550000031
所述的PCR缓冲液组成如下：
Figure BDA0001892694550000032
Figure BDA0001892694550000041
本发明所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒是以FFPE DNA为检测样本。
EGFR反应液内包含相应的EGFR基因突变检测和内控检测试剂。内控检测选择的检测区域是人类EGFR基因相对保守的区段，用于监控FFPE DNA样本质量和PCR反应过程。
采用本发明所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒的检测方法，步骤如下：
(1)提取FFPE样本人类基因组DNA；
(2)采用用于检测EGFR基因突变的试剂盒中的EGFR反应液构建PCR扩增反应体系进行PCR反应；
(3)对PCR产物进行毛细管电泳；
(4)根据毛细管电泳峰图显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
步骤(2)中所述的PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0001892694550000042
Figure BDA0001892694550000051
步骤(2)中所述的PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
本发明采用的是高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳相结合的方法来完成同时对多个基因突变位点高精准检测。多重PCR是在一个反应体系中加入多条引物来同时扩增多个突变检测位点，一般2-6个位点。本发明的高多重PCR反应体系中加入更多的引物来检测更多的突变位点(比如40-100个突变)，这样极大降低初始检测样品的需求量，提高检测通量，节省成本。高多重PCR所用的引物用荧光标记，PCR产物可以利用测序级的荧光毛细管电泳仪(如ABI3500测序仪)对荧光标记的PCR产物进行片段分析。这种毛细管电泳分辨率很高，可以区分一个碱基的差别，大大提高了突变检测的准确性和灵敏度。
本发明采用的这种高多重PCR和高精度毛细管电泳相结合的方法同目前主流的PCR方法相比从灵敏度和特异性上有了很大的提高。从一般PCR产物，通过紫外光激发检测，到荧光标记PCR产物，紫外光激发检测，再到荧光标记PCR产物，单频激光激发检测，灵敏度极大提高。这类方法，在一些先进的公司也有应用，但还比较少。突变检测中除了需要同时精准检测多个突变，另一个更重要的方面是检测方法需要有很高的特异性，将突变同野生型以及其它类似的突变区别开来。任何样品都有大量的野生型DNA，很多的突变多发生在相同的区域甚至是同一个位点，这样引物之间以及引物和突变/野生模板之间相互竞争都会导致非特异信号出现。本发明的方法主要是通过以下几个方面来控制非特异扩增的产生，从而来增加特异性：
1、引物设计：本发明将引物设计为“核心区域”和“标记区域”。“核心区域”短，只有14个左右核苷酸，可以保证扩增的特异性，“标记区域”是由多个A或T组成的不同长短的核苷酸序列，依此来将不同的突变标记为长短不同的PCR产物。
2、PCR缓冲液和Taq酶：本发明中所用的PCR缓冲液配方加入有利于灵敏度和扩增特异性的试剂成分，并对各组分进行了优化。所用的Taq酶(NEB公司)缺少3’-5’外切功能，这样很大程度上保证即使引物错配，也不会有扩增，从而进一步提高特异性，同时所用的Taq酶是属于热启动型的酶，可以进一步控制非特异性扩增。
3、PCR循环程序：根据本发明引物的特殊设计，PCR循环采用两个不同的部分。第一个循环部分采用较低的复性温度，针对于短的引物的“中心区域”，既保证引物结合的特异性，同时保证引物和尽量多的突变模板结合，以增加灵敏度。第二个循环部分提高复性温度，以保证在高的特异性下扩增。
本发明基于高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳方法，开发一种高灵敏度检测EGFR 28种基因突变的试剂盒。本试剂盒以FFPE DNA为检测样本，通过检测EGFR基因突变，可以指导EGFR-TKI患者用药。本发明灵敏度高，检测仅需150min即可完成，同时还具备特异性好、灵敏度以及准确率高、价格低廉、操作简单的特点，完全可以满足临床快速检测的实际需求。
本发明的有益效果如下：
本发明采用了特异性荧光引物，可以实现FFPE样本EGFR28种基因突变的快速检测。
(1)应用高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳技术对FFPE临床样本进行检测，体系中添加了18、19、20、21号外显子的多对引物，单管同时测EGFR基因的28种突变，结果明显；
(2)使用本发明的PCR缓冲液，扩增效率、稳定性和特异性大大提高；
(3)灵敏度高，灵敏度可达到0.5％；
(4)检测速度快，整个检测过程仅需要150min即可完成。
附图说明
图1是实施例1阳性对照结果毛细管电泳图。
图2是实施例1阴性对照结果毛细管电泳图。
图3是实施例1空白对照结果毛细管电泳图。
图4是实施例1临床样本19del阳性结果毛细管电泳图。
图5是实施例1临床样本L858R阳性结果毛细管电泳图。
图6是实施例1临床样本L861Q阳性结果毛细管电泳图。
图7是实施例1临床样本G719A阳性结果毛细管电泳图。
图8是实施例1临床样本T790M阳性结果毛细管电泳图。
图9是实施例1临床样本20ins阳性结果毛细管电泳图。
图10是实施例1L858R、T790M灵敏度分析实验结果毛细管电泳图。
图11是实施例2阳性对照结果毛细管电泳图。
图12是实施例2阴性对照结果毛细管电泳图。
图13是实施例2空白对照结果毛细管电泳图。
图14是实施例2临床样本19del阳性结果毛细管电泳图。
图15是实施例2临床样本L858R阳性结果毛细管电泳图。
图16是实施例2临床样本L861Q阳性结果毛细管电泳图。
图17是实施例2临床样本G719A阳性结果毛细管电泳图。
图18是实施例2临床样本T790M阳性结果毛细管电泳图。
图19是实施例2临床样本20ins阳性结果毛细管电泳图。
图20是实施例2L858R、T790M灵敏度分析实验结果毛细管电泳图。
图21是实施例3阳性对照结果毛细管电泳图。
图22是实施例3阴性对照结果毛细管电泳图。
图23是实施例3空白对照结果毛细管电泳图。
图24是实施例3临床样本19del阳性结果毛细管电泳图。
图25是实施例3临床样本L858R阳性结果毛细管电泳图。
图26是实施例3临床样本L861Q阳性结果毛细管电泳图。
图27是实施例3临床样本G719A阳性结果毛细管电泳图。
图28是实施例3临床样本T790M阳性结果毛细管电泳图。
图29是实施例3临床样本20ins阳性结果毛细管电泳图。
图30是实施例3L858R、T790M灵敏度分析实验结果毛细管电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
本发明用于检测EGFR基因突变的试剂盒组成见表2。
表2用于检测EGFR基因突变的试剂盒组成
Figure BDA0001892694550000071
Figure BDA0001892694550000081
实施例1
本实施例以基因工程构建的质粒为阳性质粒，以野生型人类基因组DNA作对照。利用本发明高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳技术检测EGFR 28种基因突变和70例EGFR基因突变临床样本，并与荧光定量PCR检测进行对照。具体步骤及方法如下：
1.检测样本处理与DNA的提取：
(1)质粒处理与提取：各质粒的提取采用质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提质粒溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整质粒浓度到不同拷贝数，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)FFPE DNA提取方法：使用切片机对石蜡组织切片进行处理，切片厚度约5-20μm，每例样本所用切片数量约2-10片，将处理好的石蜡切片置于离心管内，之后DNA的提取采用FFPE DNA提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到不同浓度，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
2.构建PCR扩增反应体系见表3。
表3实施例1PCR扩增反应体系
Figure BDA0001892694550000082
Figure BDA0001892694550000091
3.PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
4.毛细管电泳检测，采用混合PCR产物、变性剂以及片断大小标记物进行检测，检测体系见表4。
表4实施例1毛细管电泳检测体系
名称 体积
HI-DI 7-9μL
Rox350 0.5-2μL
PCR产物 0.5-2μL
Total 10μL
5.使用ABI 3500利用片段分析的方法进行毛细管电泳，根据毛细管电泳峰图1显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
6.在检测的所有70例临床样本中，检测出EGFR 19del 5例，L858R突变4例，L861Q突变3例，20ins突变1例，G719X突变3例，T790M突变4例，阴性样本50例，每一组同时设置空白对照，结果见图2、3、4、5、6、7、8、9。
7.灵敏度分析：使用细胞系H1975对L858R和T790M的质粒DNA进行不同梯度的稀释，每次反应加入5μL模板进行扩增反应。结果表明，本发明的检测体系对这两种突变的灵敏度可达到0.5％，结果如图10。
实施例2
本实施例以基因工程构建的质粒为阳性质粒，以野生型人类基因组DNA作对照。利用本发明高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳技术检测EGFR 28种基因突变和70例EGFR基因突变临床样本。具体步骤及方法如下：
1.检测样本处理与DNA的提取：
(1)质粒处理与提取：各质粒的提取采用质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提质粒溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整质粒浓度到不同拷贝数，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)FFPE DNA提取方法：使用切片机对石蜡组织切片进行处理，切片厚度约5-20μm，每例样本所用切片数量约2-10片，将处理好的石蜡切片置于离心管内，之后DNA的提取采用FFPE DNA提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到不同浓度，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
2.构建PCR扩增反应体系见表5。
表5实施例2PCR扩增反应体系
名称 终浓度
2×PU Buffer 1×PU Buffer
PE-19-M-F2 0.1-0.8μM
PE-19-M-R2 0.1-0.8μM
PE-21-M1-F2 0.1-0.8μM
PE-21-M2-F2 0.1-0.8μM
PE-21-M-R2 0.1-0.8μM
PE-18-M1-F2 0.1-0.8μM
PE-18-M2-F2 0.1-0.8μM
PE-18-M3-F2 0.1-0.8μM
PE-18-M-R2 0.1-0.8μM
PE-20-M-F2 0.1-0.8μM
PE-20-M1-R2 0.1-0.8μM
PE-20-M2-R2 0.1-0.8μM
PE-1-F 0.1-0.8μM
PE-1-R 0.1-0.8μM
模板(ng) 50-300ng
补水至(μL) 25
3.PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
4.采用混合PCR产物、变性剂以及片断大小标记物进行检测，检测体系见表6。
表6实施例2毛细管电泳检测体系
名称 体积
HI-DI 7-9μL
Rox350 0.5-2μL
PCR产物 0.5-2μL
Total 10μL
5.使用ABI 3500利用片段分析的方法进行毛细管电泳，根据毛细管电泳峰图11显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
6.在检测的所有70例临床样本中，检测出EGFR 19del 5例，L858R突变4例，L861Q突变3例，20ins突变1例，G719X突变3例，T790M突变4例，阴性样本50例，每一组同时设置空白对照，结果见图12、13、14、15、16、17、18、19。
7.灵敏度分析：使用细胞系H1975对L858R和T790M的质粒DNA进行不同梯度的稀释，每次反应加入5μL模板进行扩增反应。结果表明，本发明的检测体系对这两种突变的灵敏度可达到0.5％，结果如图20。
实施例3
本实施例以基因工程构建的质粒为阳性质粒，以野生型人类基因组DNA作对照。利用本发明高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳技术检测EGFR 28种基因突变和70例EGFR基因突变临床样本。具体步骤及方法如下：
1.检测样本处理与DNA的提取：
(1)质粒处理与提取：各质粒的提取采用质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提质粒溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整质粒浓度到不同拷贝数，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)FFPE DNA提取方法：使用切片机对石蜡组织切片进行处理，切片厚度约5-20μm，每例样本所用切片数量约2-10片，将处理好的石蜡切片置于离心管内，之后DNA的提取采用FFPE DNA提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到不同浓度，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
2.构建PCR扩增反应体系见表7。
表7实施例3PCR扩增反应体系
名称 终浓度
2×PU Buffer 1×PU Buffer
PE-19-M-F3 0.1-0.8μM
PE-19-M-R3 0.1-0.8μM
PE-21-M1-F3 0.1-0.8μM
PE-21-M2-F3 0.1-0.8μM
PE-21-M-R3 0.1-0.8μM
PE-18-M1-F3 0.1-0.8μM
PE-18-M2-F3 0.1-0.8μM
PE-18-M3-F3 0.1-0.8μM
PE-18-M-R3 0.1-0.8μM
PE-20-M-F3 0.1-0.8μM
PE-20-M1-R3 0.1-0.8μM
PE-20-M2-R3 0.1-0.8μM
PE-1-F 0.1-0.8μM
PE-1-R 0.1-0.8μM
模板(ng) 50-300ng
补水至(μL) 25
3.PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
4.采用混合PCR产物、变性剂以及片断大小标记物进行检测，检测体系见表8。
表8实施例3毛细管电泳检测体系
名称 体积
HI-DI 7-9μL
Rox350 0.5-2μL
PCR产物 0.5-2μL
Total 10μL
5.使用ABI 3500利用片段分析的方法进行毛细管电泳，根据毛细管电泳峰图21显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
6.在检测的所有70例临床样本中，检测出EGFR 19del 5例，L858R突变4例，L861Q突变3例，20ins突变1例，G719X突变3例，T790M突变4例，阴性样本50例，每一组同时设置空白对照，结果见图22、23、24、25、26、27、28、29。
7.灵敏度分析：使用细胞系H1975对L858R和T790M的质粒DNA进行不同梯度的稀释，每次反应加入5μL模板进行扩增反应。结果表明，本发明的检测体系对这两种突变的灵敏度可达到0.5％，结果如图30。
本发明试剂盒检测的所有突变类型信息见表9。采用荧光定量PCR法对这些临床样本进行对比检测，实施例1-3结果表明本发明体系与荧光定量PCR法的符合率达到100％，见表10，进一步证明了本发明体系检测的准确性、快速性、低成本。可见，运用本发明检测FFPE样本EGFR基因突变，与荧光定量PCR法相比，具有相同的准确性，但速度更快、成本更低，可满足EGFR基因突变的快速检测。
表9试剂盒检测的所有突变类型信息
Figure BDA0001892694550000131
Figure BDA0001892694550000141
表10毛细管电泳法与荧光定量PCR法比较结果
Figure BDA0001892694550000142
序列表
<110> 山东普瑞斯分子诊断技术有限责任公司
<120> 用于检测EGFR基因突变的试剂盒及检测方法
<130> 1
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ttaaaataat aaattaatta agatcaaagt gttggc 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
ttaaaataat aaattaatta agatcaaatt gccggc 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ttaaaataat aaattaatta agatcaaagt gctggc 36
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
aaaaaataat ttataatttt aaaaacaaaa agatcaaagt gttgt 45
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
aaaaaataat ttataatttt aaaaacaaaa agatcaaagt gctgt 45
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
aaaaaataat ttataatttt aaaaacaaaa agatctaagt tctgt 45
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
aattttttaa ttaattgatc aaagtgctga 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
aattttttaa ttaattgatc aaagttctga 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
aattttttaa ttaattgatc atagtggtga 30
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
cttgggaaaa acactggagt ttcc 24
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
cttgggaaaa acactggagc ttccca 26
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
cttgggaaaa acactggagt ttcccaa 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 13
cgtcttcctt ctctctctgt aataagg 27
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 14
cgtcttcctt ctctctctgt catag 25
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 15
cgtcttcctt ctctctctgc catagg 26
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 16
ccacacagca aagcagaacc tcac 24
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 17
ccacacagca aagcagaaac tcacac 26
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 18
ccacacagca aagcagaaac tc 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 19
cagcttttcc tctatgagt 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 20
cagcttttcc tccatgag 18
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 21
cagcttttcc tccatgagta c 21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 22
gtggaggtga ggcagatg 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 23
gtggaggtga ggccgatgcc 20
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 24
gtggaggtga ggcagatgcc cag 23
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 25
taataatttt aatataaggg catgagccgc a 31
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 26
taataatttt aatataaggg cacgagttgc a 31
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 27
taataatttt aatataaggg catgagctgc a 31
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 28
atttaataat aaatttaaaa aatatcacag attttgggcg 40
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 29
atttaataat aaatttaaaa aatatcacag attttaggcg 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 30
atttaataat aaatttaaaa aatatcacag attttgagcg 40
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 31
ttataataat ataaaaggct ggccagaca 29
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 32
ttataataat ataaaaggct ggccaaaca 29
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 33
ttataataat ataaaaggcc ggcccaaca 29
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 34
tcctcccctg catgtgttaa acaa 24
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 35
tcctcccctg catgtgttca aca 23
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 36
tcctcccctg catgtgttaa ac 22
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 37
atatgacagg gtgttgatga tgcct 25
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 38
atatacacac tttgtctttg acttct 26

Claims (5)

1.一种用于检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于包括EGFR反应液、EGFR阳性对照和EGFR阴性对照，EGFR反应液由引物和PCR缓冲液组成，EGFR阳性对照为质粒DNA，EGFR阴性对照为野生型人类基因组DNA；
引物由PE-18-M1-F1、PE-18-M2-F1、PE-18-M3-F1、PE-18-M-R1、PE-19-M-F1、PE-19-M-R1、PE-20-M-F1、PE-20-M1-R1、PE-20-M2-R1、PE-21-M1-F1、PE-21-M2-F1、PE-21-M-R1、PE-1-F和PE-1-R组成或者由PE-18-M1-F2、PE-18-M2-F2、PE-18-M3-F2、PE-18-M-R2、PE-19-M-F2、PE-19-M-R2、PE-20-M-F2、PE-20-M1-R2、PE-20-M2-R2、PE-21-M1-F2、PE-21-M2-F2、PE-21-M-R2、PE-1-F和PE-1-R组成或者由PE-18-M1-F3、PE-18-M2-F3、PE-18-M3-F3、PE-18-M-R3、PE-19-M-F3、PE-19-M-R3、PE-20-M-F3、PE-20-M1-R3、PE-20-M2-R3、PE-21-M1-F3、PE-21-M2-F3、PE-21-M-R3、PE-1-F和PE-1-R组成；
PE-18-M1-F1、PE-18-M1-F2、PE-18-M1-F3、PE-18-M2-F1、PE-18-M2-F2、PE-18-M2-F3、PE-18-M3-F1、PE-18-M3-F2、PE-18-M3-F3、PE-18-M-R1、PE-18-M-R2、PE-18-M-R3、PE-19-M-F1、PE-19-M-F2、PE-19-M-F3、PE-19-M-R1、PE-19-M-R2、PE-19-M-R3、PE-20-M-F1、PE-20-M-F2、PE-20-M-F3、PE-20-M1-R1、PE-20-M1-R2、PE-20-M1-R3、PE-20-M2-R1、PE-20-M2-R2、PE-20-M2-R3、PE-21-M1-F1、PE-21-M1-F2、PE-21-M1-F3、PE-21-M2-F1、PE-21-M2-F2、PE-21-M2-F3、PE-21-M-R1、PE-21-M-R2、PE-21-M-R3、PE-1-F和PE-1-R依次为SEQ ID NO.01～38所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于所述的PCR缓冲液组成如下：
2×PU 缓冲液组分 终浓度
海藻糖 1-8%
甘油 6-15%
聚蔗糖 70 0.1-1.5%
Mg2+ 8-15mM
dATP 0.5-2mM
dCTP 0.5-2mM
dGTP 0.5-2mM
dTTP 0.5-2mM
多聚腺苷酸 15-50μg
氨丁三醇 0.05-0.1M
4-羟乙基哌嗪乙磺酸游离酸 2-10mM
KCl 0.01-0.1M
NH4Cl 0.01-0.1M
Taq酶 200-500U/mL。
3.一种权利要求1或2所述的用于检测EGFR基因突变的试剂盒在制备检测试剂中的应用，其特征在于检测步骤如下：
（1）提取FFPE样本人类基因组DNA；
（2）采用用于检测EGFR基因突变的试剂盒中的EGFR反应液构建PCR扩增反应体系进行PCR反应；
（3）对PCR产物进行毛细管电泳；
（4）根据毛细管电泳峰图显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（2）中所述的PCR扩增反应体系如下：
名称 终浓度
2× PU 缓冲液 1× PU 缓冲液
PE-19-M-F 0.1-0.8μM
PE-19-M-R 0.1-0.8μM
PE-21-M1-F 0.1-0.8μM
PE-21-M2-F 0.1-0.8μM
PE-21-M-R 0.1-0.8μM
PE-18-M1-F 0.1-0.8μM
PE-18-M2-F 0.1-0.8μM
PE-18-M3-F 0.1-0.8μM
PE-18-M-R 0.1-0.8μM
PE-20-M-F 0.1-0.8μM
PE-20-M1-R 0.1-0.8μM
PE-20-M2-R 0.1-0.8μM
PE-1-F 0.1-0.8μM
PE-1-R 0.1-0.8μM
模板 50-300ng
补水至 25μL。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（2）中所述的PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
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