CN107164473A

CN107164473A - 一种检测calr基因1型突变的引物组合物及试剂盒

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Publication number: CN107164473A
Application number: CN201710363814.5A
Authority: CN
Inventors: 关明; 曹国君; 方雪恩; 唐宜桂; 许笑; 孔继烈; 张心菊; 李杨
Original assignee: Shanghai Suchuang Diagnostic Products Co ltd; Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Shanghai Suchuang Diagnostic Products Co ltd; Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2017-05-22
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2037-05-22
Also published as: CN107164473B

Abstract

本发明涉及一种检测CALR基因1型突变的引物组合物，其包括含有SEQ ID NO：2‑SEQ ID NO：7所示序列的引物和SEQ ID NO：8所示序列的PNA探针；本发明还涉及一种含有上述引物组合物的试剂盒及其检测方法，以及上述引物组合物扩增的CALR基因1型突变的靶序列，该靶序列为SEQ ID NO：1所示序列。本发明所述的试剂盒及其检测方法具有良好的特异性和稳定性，梯度突变负荷浓度的样本用所建立的LAMP反应体系进行扩增，发现突变负荷检出敏感性可达到1％，与探针法实时PCR的效果相当，且其可对CALR基因1型突变进行可视化检测，与传统的检测方法相比，该方法对设备和环境要求低，检测速度更快，检测灵敏度更高。

Description

一种检测CALR基因1型突变的引物组合物及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测CALR基因1型突变的引物组合物及试剂盒。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是骨髓中一种或多种髓系细胞增殖和外周血中成熟及不成熟细胞增加的克隆性造血干/祖细胞疾病。近年来，多个分子标志物，如JAK2、MPL和TET突变等相继被发现，这些标志物的发现对于理解MPN的分子发病机制具有重要意义，也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。但是，有30％～45％的携有野生型JAK2/MPL的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化(PMF)患者仍然存在诊断困难，新近报道的钙网蛋白基因(CALR)突变将能部分填补这一空白，有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标志物。

CALR是一种主要位于内质网的有多重功能的钙离子结合和储存蛋白分子伴侣，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞增殖、凋亡、黏附、免疫等过程。CALR基因定位于染色体19p13.2，它有9个外显子和9个蛋白结构域，CALR基因突变是由第九外显子插入和缺失引起，导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(KDEL氨基酸序列)的新型的C-羧基末端的蛋白。到目前为止，已经检测到多于40种不同的CALR突变体，其中最常见的两种变异体分别为：由52个碱基缺失引起的1型变异体(p.L367fs*46)和由5个碱基TTGTC插入引起的2型变异体(p.K385fs*47)，它们分别占所有突变体的53％和32％，研究者在体外实验中发现，过度表达的1型突变体增强了白介素-3表达，也促进了STAT5磷酸化作用并且引起信号传导的激活，这种激活作用能被JAK抑制剂阻滞，这说明CALR和JAK2突变可能有类似的机制。

当前CALR基因突变的检测主要依赖于探针实时PCR法或测序法等，以上方法耗时耗力、报告周期长，且在灵敏度方面存在缺陷，所需检测设备昂贵，检测时必须要有专门的设备和训练有素的技术人员，对技术平台要求高，不易于广泛推广。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，建立了一种针对CALR基因1型突变进行快速检测的环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)体系。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种检测CALR基因1型突变的引物组合物，其包括SEQ ID NO：2-SEQID NO：7所示序列的引物。

优选地，上述引物组合物还包括如SEQ ID NO：8所示序列的PNA探针，该PNA探针具有16nt，其末端加了2个赖氨酸，这可增加亲水性。

本发明还提供一种含有上述引物组合物的检测CALR基因1型突变的试剂盒。

优选地，上述试剂盒还包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、钙黄绿素、去离子水、DNA模板。

优选地，上述试剂盒包含25μL扩增反应体系，该扩增反应体系包括2×反应缓冲液12.5μL，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：7所示序列中的每一引物各1μL，SEQ ID NO：8所示序列的PNA探针1μL，Bst DNA聚合酶1μL，钙黄绿素1μL，去离子水1.5μL，DNA模板2μL。

优选地，在上述试剂盒中，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：3所示序列中的每一引物的终浓度均为0.2μmol/L；SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5所示序列中的每一引物的终浓度均为1.6μmol/L；SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7所示序列中的每一引物的终浓度均为1.6μmol/L；SEQ ID NO：8所示序列的PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。

本发明还提供一种用于非诊断和非治疗目的的检测CALR基因1型突变的方法，该方法以被测样本的DNA模板，采用上述引物组合物进行LAMP反应，然后进行可视化判读来鉴定样本是否为CALR基因1型突变阳性。

优选地，所述LAMP反应的条件为：58℃-68℃，60min；更优选为65℃，60min。

优选地，所述LAMP反应所用的设备为能够稳定提供65℃恒温的设备，例如普通PCR仪或恒温金属浴等。

最后本发明还提供一种上述引物组合物扩增的CALR基因1型突变的靶序列，其由SEQ ID NO：1所示序列组成，并且提供一种含有上述CALR基因1型突变的靶序列的重组质粒，该重组质粒为含SEQ ID NO：1所示序列的TA克隆质粒。

上述引物、探针及靶序列的碱基序列如下表1所示。

表1检测CALR基因1型突变的引物、探针及靶序列的碱基序列表

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的CALR基因1型突变进行快速检测的试剂盒和环介导等温扩增方法，其可对CALR基因1型突变进行可视化检测，与传统的检测方法相比，该方法对设备和环境要求低，检测速度更快，检测灵敏度更高。

附图说明

图1是CALR基因1型突变LAMP体系特异性的验证示意图；

图中附图标记为：

B1：临床CALR-2突变阳性基因组DNA；B2：临床CALR-1突变阳性基因组DNA；B3：临床CALR野生型基因组DNA；B4：CALR-2突变阳性质粒；B5：CALR-1突变阳性质粒；B6：CALR野生型质粒；B7：空白对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为本发明选取的CALR基因1型突变的靶序列，以及用于检测CALR基因1型突变的引物及探针序列，。

在CALR基因1型突变的位置周围选定检测的靶片段，利用在线的LAMP引物设计网站PrimerExplorer V5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)针对靶片段，设计适当的特异性引物，

(1)引物序列为：

F3：TGCAGGCAGCAGAGAA(SEQ ID NO：2)；

B3：TTTGGCGCGGCCAGCT(SEQ ID NO：3)；

FIP：TCTTTGTCCTCATCATCCTCCTTGACAAATGAAGGACAAACAGG(SEQ ID NO：4)

BIP：AGATGTCCCCGGCCAGGCAGGCCTCAGTCCAGC(SEQ ID NO：5)；

LF：TCCTCTGCTCCTCGT(SEQ ID NO：6)；

LB：GCTGTAGAGAGGCCTGCCTCCAG(SEQ ID NO：7)。

(2)肽核酸封闭探针PNA序列为：

CTTAAGGAGGAGGAAG-KK(SEQ ID NO：8)(16nt，末端加了2个赖氨酸，增加亲水性)。

(3)靶序列，具体为：

TGCAGGCAGCAGAGAAACAAATGAAGGACAAACAGGACGAGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGATGAGGACAAAGATGAGGATGAGGAGGATGAGGAGGACAAGGAGGAAGATGAGGAGGAAGATGTCCCCGGCCAGGCCAAGGACGAGCTGTAGAGAGGCCTGCCTCCAGGGCTGGACTGAGGCCTGAGCGCTCCTGCCGCAGAGCTGGCCGCGCCAAA(219bp)(SEQID NO：1)。

实施例2

本实施例为本发明检测CALR基因1型突变的试剂盒及其方法。

本发明所采用的试剂盒包括扩增反应体系，该扩增反应体系的总体积为25μL，其包括2×反应缓冲液(RM)12.5μL，引物F3：1μL(终浓度0.2μmol/L)，引物B3：1μL(终浓度0.2μmol/L)，引物FIP：1μL(终浓度1.6μmol/L)，引物BIP：1μL(终浓度1.6μmol/L)，引物LF：1μL(终浓度0.8μmol/L)，引物LB：1μL(终浓度0.8μmol/L)，PNA探针：1μL(终浓度0.8μmol/L)，Bst DNA聚合酶1μL(8U)，钙黄绿素(FD)1μL，去离子水1.5μL，DNA模板2μL。

采用上述试剂盒进行LAMP反应，LAMP反应条件为：58℃-68℃，60min；所用的设备为普通PCR仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备；然后进行可视化判读来鉴定样本是否为CALR基因1型突变阳性，具体为结果判断：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为绿色，即判定为反应阳性。

构建含靶序列的TA克隆质粒，制备梯度浓度的双份样本，具体浓度为10¹copies/ml，10²copies/ml，10³copies/ml，10⁴copies/ml，10⁵copies/ml，10⁶copies/ml，10⁷copies/ml，10⁸copies/ml，用所建立的CALR基因1型突变LAMP反应体系进行检测，均能检出；对临床CALR基因1型突变患者全血样本的基因组DNA和构建的重组质粒能特异性的检出，对CALR基因2型突变患者全血样本的基因组DNA和构建的重组质粒或正常人的野生型基因组DNA和构建的重组质粒均无非特异性的扩增，检测效果良好，详见图1。

转入了CALR-1型突变质粒的293T细胞、转入了野生型质粒的293T细胞，均为10⁶个细胞，用基因组DNA抽提试剂盒抽提DNA，然后按比例稀释，制成梯度突变负荷浓度的样本，用所建立的LAMP反应体系进行扩增，发现突变负荷检出敏感性可达到1％，与探针法实时PCR的效果相当。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属华山医院；复旦大学

；上海速创诊断产品有限公司

<120> 一种检测CALR基因1型突变的引物组合物及其试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 靶序列

<400> 1

tgcaggcagc agagaaacaa atgaaggaca aacaggacga ggagcagagg acaaggagga 60

tgatgaggac aaagatgagg atgaggagga tgaggaggac aaggaggaag atgaggagga 120

agatgtcccc ggccaggcca aggacgagct gtagagaggc ctgcctccag ggctggactg 180

aggcctgagc gctcctgccg cagagctggc cgcgccaaa 219

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物F3

<400> 2

tgcaggcagc agagaa 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物B3

<400> 3

tttggcgcgg ccagct 16

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物FIP

<400> 4

tctttgtcct catcatcctc cttgacaaat gaaggacaaa cagg 44

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物BIP

<400> 5

agatgtcccc ggccaggcag gcctcagtcc agc 33

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物LF

<400> 6

tcctctgctc ctcgt 15

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增引物LF

<400> 7

gctgtagaga ggcctgcctc cag 23

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PNA探针，末端连接2个赖氨酸

<400> 8

cttaaggagg aggaag 16

Claims

1.一种检测CALR基因1型突变的引物组合物，其特征在于，包括SEQ ID NO：2-SEQ IDNO：7所示序列的引物。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，还包括如SEQ ID NO：8所示序列的PNA探针，其末端加了2个赖氨酸。

3.一种含有权利要求1或2所述的引物组合物的检测CALR基因1型突变的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的检测CALR基因1型突变的试剂盒，其特征在于，还包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、钙黄绿素、去离子水、DNA模板。

5.根据权利要求4所述的检测CALR基因1型突变的试剂盒，其特征在于，包括2×反应缓冲液12.5μL，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：7所示序列中的每一引物各1μL，SEQ ID NO：8所示序列的PNA探针1μL，Bst DNA聚合酶1μL，钙黄绿素1μL，去离子水1.5μL，DNA模板2μL。

6.根据权利要求5所述的检测CALR基因1型突变的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：3所示序列中的每一引物的终浓度均为0.2μmol/L；SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5所示序列中的每一引物的终浓度均为1.6μmol/L；SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7所示序列中的每一引物的终浓度均为1.6μmol/L；SEQ ID NO：8所示序列的PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。

7.一种用于非诊断和非治疗目的的检测CALR基因1型突变的方法，其特征在于，以被测样本的DNA模板，采用权利要求1～2中任一项所述的引物组合物进行LAMP反应，然后进行可视化判读来鉴定样本是否为CALR基因1型突变阳性。

8.根据权利要求7所述的检测CALR基因1型突变的方法，其特征在于，所述LAMP反应的条件为：58℃-68℃，60min。

9.一种如权利要求1所述的引物组合物扩增的CALR基因1型突变的靶序列，其特征在于，由SEQ ID NO：1所示序列组成。

10.一种含有权利要求9所述的CALR基因1型突变的靶序列的重组质粒。