CN110527718A - Sma基因的snp位点的检测方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种SMA基因的SNP(单核苷酸多态性)位点的检测方法。所述方法包括以下步骤：(S10)进行一聚合酶连锁反应(PCR)，扩增包含一SNP位点的一核酸片段；(S20)对所述核酸片段进行一去磷酸化反应；(S30)对所述核酸片段进行一延伸反应，其中使用一延伸引子辨识所述SNP位点的位置，并在所述延伸引子的一3’端延伸与所述SNP位点的碱基互补的一单一核苷酸，而获得一被延伸的延伸引子；(S40)进行一纯化反应，以纯化所述被延伸的延伸引子；以及(S50)检测所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而根据所述SNP位点在SMA基因(包含SMN1与SMN2基因)的碱基种类决定是否发生SMN1基因纯合缺失。

Description

SMA基因的SNP位点的检测方法
技术领域
本发明关于一种基因缺陷的检测方法，尤指SMA基因的SNP(单核苷酸多态性)位点的检测方法。
背景技术
脊髓性肌肉萎缩症(Spinal Muscular Atrophy)的病因是由于基因缺陷导致脊髓前角运动神经的衰亡与退化，造成肌肉逐渐软弱无力与麻痹，并伴随有肌肉萎缩的症状，其肌肉萎缩呈对称性、下肢较上肢严重且身体近端较远端易受影响，到目前为止没有任何治疗方法，其依照严重程度分为三种类型：
严重型脊髓性肌肉萎缩症(Werdnig-Hoffmann Disease,SMA type I)：每两万名婴儿中约有一名，为最常见的一型。婴儿在子宫内或出生后三个月内，便会出现四肢无力、哭声无力及呼吸困难等症状。由于患者易感染呼吸道疾病，多在一岁内便可能死于肺炎，如未积极给予支持性呼吸治疗，很少会活过三岁。
中间型脊髓性肌肉萎缩症(Intermediate type,SMA type II)：其症状常发生在出生后半年到一年期间。病患下肢呈现对称性无力、无法站立行走、肌腱反射减退、舌头或手部偶尔会颤抖。四分之一患者常在两岁前死于呼吸道感染，其他存活者，多因持续肌肉无力造成脊椎侧弯，影响肺部功能而导致呼吸困难，需要支持性呼吸治疗以维持生命。
轻度型脊髓性肌肉萎缩症(Kugelberg-Welander Disease,SMA type III)：其症状发生的时间不一定，从一岁多到青少年、成人期都有可能。症状是轻度对称的肢体近端肌肉无力，上下楼、行走跑步不便，患者长期存活的情况还算不错。
脊髓性肌肉萎缩症发生率约为1/10,00至1/25,000，国内优生保健门诊曾发现过家族成员接连罹病的家族案例，若以中国台湾每年有三十万名新生儿计，一年约有三十多名新病例。脊髓性肌肉萎缩症中90至95％比率的病患属于第五号染色体SMN1基因(Survival Motor Neuron 1gene)纯合缺失 (homozygous deletion)缺陷所导致。
而现行检测SMN1基因缺陷的方法，是以定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)或是直接定序法，但无论是何种方法皆有灵敏度不高、成本高与效率差的问题。因此势必要发展出解决上述问题的方法。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种辨识SMN1基因的纯合缺失的方法。在本发明的方法操作(1)可以在同一反应中同时侦测多个SNP(单核苷酸多态性)位点，可大幅降低分析成本；(2)操作简单快速，且适用各种品质的检体，例如新鲜组织、冷冻组织、石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)tissue)、细胞株萃取的基因体DNA(genomicDNA)或是血浆 cfDNA(circulating cell-free DNA)等；(3)由于所述多个SNP位点位于SMN1 基因容易发生缺失的区域，因此藉由检测所述多个SNP位点能确认SMN1基因的缺失，也能精确侦测到微量检体中不同大小缺失的差异，具有极高效率；(4) 由于SMN1基因的缺失与否与脊髓性肌肉萎缩症(Spinal Muscular Atrophy, SMA)有高度的关系性，因此可以藉由本发明的方法快速地了解患者的SMA基因的基因型对于脊髓性肌肉萎缩症的研究是非常有价值的。
为达上述目的并解决习知技术的缺点，本发明提供一种SMA基因的一个SNP(单核苷酸多态性)位点的检测方法，包括以下步骤：
(S10)对一待测检体进行一聚合酶连锁反应(PCR)，其中使用一对扩增引子，扩增所述待测检体中包含待检测的一SNP位点的一段核酸片段，而获得一被扩增的核酸片段；
(S20)对所述被扩增的核酸片段进行一去磷酸化反应，以去除用于所述聚合酶连锁反应的核酸片段的一5’端的磷酸根；
(S30)对所述核酸片段进行一延伸反应，其中使用一延伸引子辨识所述 SNP位点的位置，并在所述延伸引子的一3’端延伸与所述SNP位点的碱基互补的一单一核苷酸，而获得一被延伸的延伸引子；
(S40)进行一纯化反应，以纯化所述被延伸的延伸引子；以及
(S50)测量所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定所述SNP位点是否发生缺失；
其中所述延伸引子包括选自于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9 和SEQID NO:12所组成的一群组中的一者。
在本发明的一实施例中，所述对扩增引子分别包括选自于SEQ ID NO:1与 SEQ IDNO:2；SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8；及 SEQ ID NO:10与SEQID NO:11所组成的一群组中的一者。
在本发明的一实施例中，其中所述扩增引子的5’端增加一不与包含所述 SNP位点的核酸片段互补的TAG核酸片段，以增加所述扩增引子与所述延伸引子之间的一分子量差距。
在本发明的一实施例中，所述TAG核酸片段包括SEQ ID NO:19。
在本发明的一实施例中，步骤(S50)中，使用一质谱仪测量所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的所述SNP位点是否发生缺失。
在本发明的一实施例中，在步骤(S50)中，使用一萤光电泳法检测多个所述被延伸的延伸引子的分子量大小和所述些被延伸的延伸引子所被标记的萤光种类，根据各个所述分子量大小和萤光种类决定被延伸的各个所述单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的所述SNP位点是否发生缺失。
在本发明的另一实施例中，在步骤(S50)中，当所述SNP位点所对应的被延伸的所述单一核苷酸的碱基种类为一种时，则所述SNP位点发生缺失；当所述SNP位点所对应的被延伸的所述单一核苷酸的碱基种类为两种时，则SMN1 基因的所述SNP位点未发生缺失。
本发明还提供一种SMA基因的多个SNP(单核苷酸多态性)位点的检测方法，包括以下步骤：
(S100)对一待测检体进行一聚合酶连锁反应(PCR)，其中使用多对扩增引子，扩增所述待测检体中多个核酸片段，各个所述核酸片段包含一个SNP 位点，而获得多个被扩增的核酸片段；
(S200)对多个所述被扩增的核酸片段进行一去磷酸化反应，以去除用于所述聚合酶连锁反应的核酸片段的一5’端的磷酸根；
(S300)对多个所述被扩增的核酸片段进行延伸反应，其中使用多个延伸引子辨识多个所述SNP位点的位置，并在各个所述延伸引子的一3’端延伸与各个所述SNP位点的碱基互补的一单一核苷酸，而获得多个被延伸的延伸引子；
(S400)进行一纯化反应，以纯化多个所述被延伸的延伸引子；以及
(S500)检测多个所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据各个所述分子量大小，决定各个所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定各个所述SNP位点是否发生缺失；
其中多个所述延伸引子包括选自于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:12所组成的一群组中的至少二者。
在本发明的一实施例中，多对所述扩增引子分别包括选自于SEQ ID NO:1与SEQID NO:2；SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8；及SEQ ID NO:10与SEQID NO:11所组成的一群组中的至少二者。
在本发明的一实施例中，多对所述扩增引子的5’端皆增加一不与包含多个所述SNP位点的核酸片段互补的TAG核酸片段，以增加多对所述扩增引子与多个所述延伸引子之间的一分子量差距。
在本发明的一实施例中，所述TAG核酸片段包括SEQ ID NO:19。
在本发明的一实施例中，在步骤(S500)中，使用一质谱仪检测多个所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据各个所述分子量大小决定各个所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的各个所述SNP位点是否发生缺失。
在本发明的另一实施例中，在步骤(S500)中，使用一萤光电泳法，检测多个所述被延伸的延伸引子的分子量大小和所述些被延伸的延伸引子所被标记的萤光种类，根据各个所述分子量大小和萤光种类决定被延伸的各个所述单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的各个所述SNP位点是否发生缺失。
在本发明的一实施例中，在步骤(S500)中，当一个所述SNP位点所对应的所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类为一种时，则决定所述SNP位点发生缺失；当一个所述SNP位点所对应的被延伸的所述单一核苷酸的碱基种类为两种时，则决定SMN1基因的所述SNP位点未发生缺失。
在本发明的一实施例中，多个所述SNP位点为4个。
在本发明的一实施例中，4个所述SNP位点中有一者发生缺失，则代表 SMN1基因或SMN2基因中发生纯合缺失。
在本发明的一实施例中，4个所述SNP位点中4个皆发生缺失，并且发生于SMN1基因，则判断所述待测检体来自于一脊髓性肌肉萎缩症患者。
附图说明
请参考图1，其为SMA基因(Spinal Muscular Atrophy gene)的 SNP(Singlenucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)位点的示意图。
图2为根据本发明的一实施例中的一步骤流程图；
图3A至图3C为根据本发明一实施例中，使用延伸引子SEQ ID NO:3 对阴性对照组与待测检体的SMA基因的外显子7的SNP位点进行检测，其中图3A为阴性对照组而图3B和图3C为待测检体。
图4A至图4B为根据本发明一实施例中，使用延伸引子SEQ ID NO:6 对阴性对照组与待测检体的SMA基因的内插子7的第1个SNP位点进行检测，其中第图4A为阳性对照组而图4B为待测检体。
具体实施方式
请参考图1，其为SMA基因(Spinal Muscular Atrophy gene)的SNP (Singlenucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)位点的示意图。SMA 基因包含两个基因，分别为SMN1基因与SMN2基因(Survival Motor Neuron Gene)，两个基因皆编码SMN蛋白质，然而SMN1基因与SMN2基因之间有5个核甘酸序列的差异，这5个核甘酸序列的差异被称为SNP位点，如在图1中所示，分别位于内插子6、外显子7、内插子7及外显子8。
在内插子6中，SMN1基因的SNP位点的碱基为G，SMN2基因的SNP位点的碱基为A；外显子7中，SMN1基因的SNP位点的碱基为C，SMN2基因的SNP位点的碱基为T；内插子7中，SMN1基因的第一个SNP位点的碱基为A，第二个SNP位点的碱基为A，SMN2基因的第一个SNP位点的碱基为G，第二个SNP位点的碱基为G；外显子8中，SMN1基因的SNP位点的碱基为G，SMN2基因的SNP位点的碱基为A。虽然SMN1基因与SMN2基因之间仅有5个核甘酸序列的差异，却导致SMN1基因与 SMN2基因所表现的SMN蛋白质有很大的差异。SMN1基因表现出完整长度的稳定的SMN蛋白，而SMN2基因表现出的蛋白中仅有约15％是完整长度的稳定的SMN 蛋白，约85％是缩短长度(truncated)的不稳定的SMN蛋白，也因此仅有SMN1 基因所表现的蛋白具有显著的生物学上的意义，SMN2基因则无。当SMN1基因发生缺陷，则很有可能导致脊髓性肌肉萎缩症，当SMN2基因发生缺陷，则基本上不致病。
典型的SMN1基因的缺陷是发生于外显子7、内插子7、外显子8的大范围缺失(deletion)，导致位于其上的4个SNP位点的同时消失，本发明的检测方法则可以通过检测所述4个SNP位点是否缺失，来决定是否SMN1基因的纯合缺失缺陷，对于脊髓性肌肉萎缩症的研究是非常有价值的。
请参考图2，根据本发明的一实施例中的步骤流程图。一种SMA基因的SNP 位点的检测方法，包括以下步骤：(S10)对一待测检体进行一聚合酶连锁反应 (PCR)，其中使用成对扩增引子，扩增所述待测检体中包含一SNP位点的核酸片段，而获得一被扩增的核酸片段；(S20)对所述被扩增的核酸片段进行一去磷酸化反应，以去除用于所述聚合酶连锁反应的核酸片段的一5’端的磷酸根；(S30)对所述被扩增的核酸片段进行一延伸反应，其中使用一延伸引子辨识所述SNP位点的位置，并在所述延伸引子的一3’端延伸与所述SNP位点的碱基互补的一单一核苷酸，而获得一被延伸的延伸引子；(S40)进行一纯化反应，以纯化所述被延伸的延伸引子；以及(S50)检测所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定所述SNP位点是否发生缺失。
现在仅用参考下面非限制性的实施力的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是用做为例证的，不应以任何方式当作上述本发明总体的限制。
聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)和扩增引子与延伸引子的设计：
在本发明方法的步骤(S10)中，对一待测检体进行一聚合酶连锁反应 (PCR)，其中使用一对扩增引子，扩增所述待测检体中包含一SNP位点的一段核酸片段，而获得一被扩增的核酸片段。
一般而言，在对一代测检体进行聚合酶连锁反应之前会先对其进行DNA萃取。举例而言，以市售DNA萃取套件萃取DNA，例如QIAGEN Blood Mini 先以裂解溶液(Lysisbuffer)溶解从患者内皮黏膜取样的细胞，使DNA从细胞内游离出来。在特定条件下DNA通过萃取套件所附的管柱(column)时会与管柱内的一硅胶膜(silica-gel membrane)结合而留在膜上，此时以酒精及冲洗液 (wash buffer)清洗，再离心后去除杂质，最后以纯水将DNA溶出，而萃取DNA， (详细的萃取步骤请参阅DNA萃取套件的使用说明书)。以上DNA萃取方法为一实施范例，各种DNA萃取方法皆可以被利用于本发明的SNP位点检测方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
根据上述的SNP位点的位置设计一对扩增引子，所述一对扩增引子的序列至少部分与包含所述SNP位点的核酸片段的5’与3’端互补(举例而言，包含所述SNP位点的核酸片段约为100个核苷酸大小)。优选地，所述一对扩增引子的序列与包含所述SNP位点的一段核酸片段的5’与3’端完全互补。由于所述成对的扩增引子的序列与包含所述SNP位点的一段核酸片段互补，因此在聚合酶连锁反应中(PCR reaction)，所述成对的扩增引子会分别辨识与黏合所述核酸片段的5’与3’端，而扩增所述成对的扩增引子之间的核酸片段。聚合酶连锁反应中(PCR reaction)的原理应当是本领域一般技术人员所了解，所以不再在本说明书中赘述。
关于扩增引子与延伸引子的设计，举例而言，与包含所述SNP位点的核酸片段的5’与3’端互补的扩增引子的长度约为15个核苷酸，或是更多或是更少个核苷酸，而在步骤(S30)的延伸反应中，所用的延伸引子的长度约为17-20 个核苷酸或是更多或是更少个核苷酸。然而，为了避免扩增引子与延伸引子的片段分量大小太过接近，导致在以质谱仪检测延伸后的延伸引子时，扩增引子的讯号出现在质谱仪的图谱当中而产生干扰，在本发明的一实施例当中，在扩增引子的5’端增加了10个核苷酸的一TAG核酸片段，以增加扩增引子与延伸引子的一分子量差距。举例而言，一般而言质谱仪用于检测分子量介于 4000Da至9000Da之间的延伸后的延伸引子的讯号，5’端增加了TAG核酸片段的扩增引子的分子量将会远大于9000Da，因此不会显示在所观测的质谱仪图谱之中。在本发明的一实施例当中，所述TAG核酸片段例如为SEQ ID NO:19 (ACGTTGGATG)，然而也可以使用其他的TAG核酸片段，其通常不与包含所述SNP 位点的核酸片段互补。然以上所述的扩增引子的长度和分子量，仅为一实施范例，本发明的SNP位点的检测方法，适用于各种长度的扩增引子，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
在本发明的一实施列中，所述用于扩增所述核酸片段的聚合酶连锁反应的反应浓度条件如下：在5μl的反应体积中含有浓度约为40ng/μl的待测检体 DNA、8单位(units)的Taq聚合酶(polymerase)、各为500nmol的一对扩增引子、浓度为2mM的MgCl2、1倍浓度的PCR缓冲液与浓度为50μM的dNTP(PCR accessory and Enzyme kit，从Agena公司购买)。反应温度条件如下：先以 95℃进行2分钟的变性反应(denature)，接着以95℃进行30秒的变性反应 (denature)，以56℃进行30秒黏合反应(annealing)，及以72℃进行1分钟的延伸反应(extension)，重复此三步骤45循环。以上聚合酶连锁反应为一实施范例，各种聚合酶连锁反应皆可以被利用于本发明的SNP位点检测方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
在本方法的步骤(S10)中，对目的片段进行PCR扩增，扩增反应的条件为本领域技术人员所熟知，在本发明的实施例中也详细描述了示例性的反应条件。并且根据所使用的本发明引子的具体序列，对扩增反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
请见下表一：在本发明的一个优选实施例中，当欲检测的SNP位点为外显子7的SNP位点，在扩增反应中使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2做为所述对的扩增引子，在之后步骤(S30)的延伸反应中使用SEQ ID NO:3做为所述延伸引子。在本发明的另一个优选实施方案中，当欲检测的SNP位点为内插子7的第1 个SNP位点，在扩增反应中使用SEQ ID NO:4和SEQID NO:5做为所述对的扩增引子，在之后步骤(S30)的延伸反应中使用SEQ ID NO:6做为所述延伸引子。
在本发明的一个优选实施例中，当检测多个SNP位点时，在扩增反应中使用所述多个SNP位点所对应的多对扩增引子，在之后步骤(S30)的延伸反应中使用所述多个SNP位点所对应的多个延伸引子(例如，将多个扩增引子混和成为一管试剂，且将多个延伸引子混和成为另一管试剂)。在本发明的表二所揭露的所有引子，皆是经过不断的修正与改良，以确保所有引子之间不会互相作用及相互干扰，故可以同时检测多个SNP位点，以提高效率，更节省成本。除此之外，可只以取2μl检体样本即可进行多个突变检测，更增加检测的方便性、成功率与精密度。举例而言，当欲同时检测SNP位点为外显子7的SNP位点以及内插子7的第1个SNP位点，可在同一扩增反应中同时使用SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5做为所述多对的扩增引子，在之后步骤(S30)的延伸反应中使用SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:6做为所述延伸引子。在本发明的一个最佳实施例中，可以同时检测下表二中所列的所有SNP位点，在扩增反应中使用下表二中所列的所有扩增引子，在之后步骤(S30)的延伸反应中使用下表二中所列的所有延伸引子，(例如，将表二中所有扩增引子混和成为一管试剂，且将表二中所有延伸引子混和成为另一管试剂)。在本发明的表二所揭露的所有引子，皆是经过不断的修正与改良，以确保所有引子之间不会互相作用及相互干扰，故可以同时检测大量的SNP位点，以提高效率，更节省成本。除此之外，可只以取2μl检体样本即可进行多个突变检测，更增加检测的方便性、成功率与精密度。
表一：
去磷酸化反应(SAP酶处理)：
在本发明的步骤(S20)中，对所述被扩增的核酸片段进行一去磷酸化反应，以去除用于所述聚合酶连锁反应的核酸片段的一5’端的磷酸根。举例而言，使用0.3U虾碱磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)及1X SAP 缓冲液和，除去所述聚合酶连锁反应产物中的dNTP的5’端的磷酸根及所述被扩增的核酸片段的5’端的磷酸根，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。以上去磷酸化反应为一实施范例，各种去磷酸化反应皆可以被利用于本发明的SNP位点检测方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
延伸反应：
在本发明的步骤(S30)中，对所述被扩增的核酸片段进行一延伸反应，其中使用一延伸引子辨识所述SNP位点的位置，并在所述延伸引子的一3’端延伸与所述SNP位点的碱基互补的一单一核苷酸，而获得一被延伸的延伸引子。举例而言，在步骤(S30)的延伸反应中，所用的延伸引子的长度约为15-20个核苷酸或是更多或是更少个核苷酸。所述延伸引子的序列与所述SNP位点之前的序列互补(即SNP位点5’端之前的序列)，从而粘合在所述突变的正前方，以辨识所述SNP位点的位置。在适当的聚合酶与反应条件之下，所述延伸引子的3’端延伸与所述SNP位点的碱基互补的单一核苷酸，而获得一被延伸的延伸引子。因此，所获得的被延伸的延伸引子(即产物)与原本的延伸引子的差别仅在于其3’端多了单一核苷酸。举例而言，所述单一核苷酸的碱基可以为 A、T、C、G四种碱基，当SNP位点为胸腺嘧啶(Thymine，T)时，所述被延伸的单一核苷酸为腺嘌呤(Adenine，A)；当SNP位点为腺嘌呤(Adenine，A)时，所述被延伸的单一核苷酸为胸腺嘧啶(Thymine，T)；当SNP位点为胞嘧啶(Cytosine，C)时，所述被延伸的单一核苷酸为鸟粪嘌呤(Guanine，G)；当SNP 位点为鸟粪嘌呤(Guanine，G)时，所述被延伸的单一核苷酸为胞嘧啶 (Cytosine，C)。由于被延伸的单一核苷酸具有不同的碱基，所以所述被延伸的延伸引子具有不同大小的分子量，在之后步骤(S50)中利用质谱仪检测所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小可以得知所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，而决定所述SNP位点是否发生缺失。
在本发明的一示例性实施例中，所述延伸反应中所用的核苷酸是经过质量修饰的ddNTP，其确保延伸反应只延伸单一核甘酸(因为核苷酸无法再连接至ddNTP缺氧的3’端)，并使所述被延伸的延伸引子之间的分子量差距加大，而提高(S50)中利用质谱仪检测的分辨率提高。四种ddNTP的分子量分别是： ddATP，271.2Da；ddTTP 327.1D；ddCTP 247.2Da，和ddGTP 287.2Da；其中分子量差异在16Da以上。
在本发明的一示例性实施例中，所述延伸反应的聚合酶为iPLEX酵素(购自美国Agena公司)。而所述适当条件为在terminator mix缓冲溶液下加入聚合酶iPLEX酵素、与延伸引子。先进行95℃变性反应(denature)30秒，再进行 40次循环的[95℃变性反应(denature)5秒，重复5次小循环的(56℃进行黏合反应(annealing)30秒以及80℃延伸反应(extension)5秒)]，最后以72℃进行延伸反应(extension)3分钟。以上延伸反应为一实施范例，各种延伸反应皆可以被利用于本发明的SNP位点检测方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
在本方法的步骤(S30)中，对目的片段进行延伸，延伸反应的条件与一般聚合酶连锁反应(PCR)相似，为本领域技术人员所熟知，在本发明的实施例中也详细描述了示例性的反应条件。并且根据所使用的本发明引子的具体序列，对延伸反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
关于本发明的所述延伸引子的优选实施例，如同上文中所述并请见上表二：当欲检测的SNP位点为21号外显子的861号密码子的SNP位点，在之前步骤 (S10)的扩增反应中使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2做为所述一对的扩增引子，在本步骤(S30)的延伸反应中使用SEQ ID NO:3做为所述延伸引子，依此类推。
在本发明的一个优选实施方案中，当检测多个SNP位点时，在之前步骤 (S10)的扩增反应中使用所述多个SNP位点所对应的多对扩增引子，在本步骤 (S30)的延伸反应中使用所述多个SNP位点所对应的多个延伸引子(例如，将多个扩增引子混和成为一管试剂，且将多个延伸引子混和成为另一管试剂)。在本发明的表二所揭露的所有引子，皆是经过不断的修正与改良，以确保所有引子之间不会互相作用及相互干扰，甚至可以在之前步骤(S10)的扩增反应中使用表二中所列的所有扩增引子，在本步骤(S30)的延伸反应中使用表二中所列的所有延伸引子，故可以同时检测表二中所列的所有SNP位点，以提高效率，更节省成本。除此之外，可只以取2μl检体样本即可进行多个突变检测，更增加检测的方便性、成功率与精密度。
纯化反应：
在步骤(S40)中，进行纯化反应，以纯化所述被延伸的延伸引子。举例而言，在延伸反应产物中加入6毫克树脂(购自美国Agena公司)去除盐离子后，反应20分钟后树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。之后以4000rpm离心五分钟使树脂沉降，取上清液。以上纯化反应为一实施范例，各种纯化反应皆可以被利用于本发明的SNP位点检测方法，因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
测量核酸片段大小：
在步骤(S50)中，可以使用一质谱仪检测所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定所述SNP位点的基因型。举例而言，点取约7奈升(nl)纯化后的产物至含基质的芯片并使用MassARRAY analyzer 4(Agena)分析质谱仪激发核酸片段群于真空电场中飞行，通过感应器撷取各核酸片段的分子量讯号，而衍伸出各核酸片段的分子量大小，根据各个所述分子量大小决定被延伸的各个所述单一核苷酸的碱基种类。并使用TYPER 4.0(Agena)软体分析质谱数据。上述方法利用质谱仪侦测核酸的片段分子量，而无需像传统定序方法利用胶体电泳，由于不同分子的分子量皆不同，因此可以精确地侦测仅有一碱基差异的两个不同的核酸片段，因此在辨识核酸片段时，稳定性及准确度高非常多。
然而在步骤(S50)中，决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类的方法，不应该局限于使用质谱仪，在此所提供另一种可替代的实施方式是使用一萤光电泳法，即在步骤(S30)的延伸反应中，先用四种不同颜色的萤光标记分别标示A、T、C和G四种核苷酸，在步骤(S50)中，以胶体电泳区区分核酸片段的大小，其最高可以区分一个碱基的大小差异的核酸片段，再根据所述被延伸的延伸引子被萤光标记所标示的颜色(即萤光种类)，即可判别所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类。因此使用萤光电泳法可以作为使用质谱仪的一替代方案。然而在以下的实施例中，是使用质谱仪决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，来做为本发明的一示例性实施例，但不应局限于使用质谱仪，任何能够决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类的方法皆应适用。
本发明的检测结果如图3A至图4B所示，其横轴为分子量，纵轴为讯号强度。图3A至图3C为根据本发明一实施例中，使用延伸引子SEQ ID NO:3对阴性对照组与待测检体的SMN基因的外显子7的SNP位点进行检测，其中图3A为阴性对照组而图3B和图3C为待测检体。在图2质谱仪的图谱中，检测到延伸引子SEQ ID NO:3的两种延伸产物的信号，分别为分子量6920Da的片段以及分子量 7000Da的片段，其分别对应SMN1基因的外显子7的SNP位点的胞嘧啶(C)以及 SMN2基因的外显子7的SNP位点的胸腺嘧啶(T)，代表阴性对照组中SMN1基因和 SMN2基因的外显子7的SNP位点皆没有发生缺失。
在图3B质谱仪的图谱中，仅检测到延伸引子SEQ ID NO:3的一种延伸产物的信号，为分子量6920Da的片段，其对应SMN1基因的外显子7的SNP位点的胸腺嘧啶(T)，代表待测检体中，SMN1基因的外显子7的SNP位点没有发生缺失，而SMN2基和的外显子7的SNP位点发生缺失。然而如上所述，SMN2基因表现出的蛋白中约85％是缩短长度(truncated)的不稳定的SMN蛋白，SMN2基因所表现的蛋白不具有显著的生物学上的意义。当SMN2基因发生缺陷，则基本上不致病，因此图3B中，待测检体的来源有较低的风险患有脊髓性肌肉萎缩症。在图3C质谱仪的图谱中，仅检测到延伸引子SEQ ID NO:3的一种延伸产物的信号，为分子量7000Da的片段，其对应SMN2基因的外显子7的SNP位点的胸腺嘧啶 (T)，代表待测检体中，SMN2基因的外显子7的SNP位点虽没有发生缺失，但是 SMN1基和的外显子7的SNP位点发生缺失，如上所述，SMN1基因所表现的蛋白是稳定的蛋白，具有显著的生物学上的意义，因此图3C中，待测检体的来源有很高的风险患有脊髓性肌肉萎缩症。
图4A至图4B为根据本发明一实施例中，使用延伸引子SEQ ID NO:6对阴性对照组与待测检体的SMN基因的内插子7的第1个SNP位点进行检测，其中图4A 为阳性对照组而图4B为待测检体。在图4A质谱仪的图谱中，仅检测到延伸引子SEQ ID NO:6的一种延伸产物的信号，为分子量7298Da的片段，其对应SMN2 基因的内插子7的第一组SNP位点的鸟粪嘌呤(G)，代表阳性对照组中虽然SMN2 基因的内插子7的第一组SNP位点未发生缺失，但是SMN1基因的内插子7的第一组SNP位点发生缺失，因此阳性对照组的来源有很高的风险患有脊髓性肌肉萎缩症。在图4B质谱仪的图谱中，检测到延伸引子SEQ ID NO:6的两种延伸产物的信号，为分子量7282Da的片段和7298Da的片段，分别对应SMN1基因的内插子7的SNP位点的腺嘌呤(A)和SMN2基因的内插子7的第一组SNP位点的鸟粪嘌呤(G)，代表待测检体中，SMN1和SMN2基因的内插子7的第一组SNP位点皆未发生缺失，所述待测检体的来源有较低的风险患有脊髓性肌肉萎缩症。
然而以上所述的实验结果，仅为表示本发明的SMA基因的SNP位点的检测方法实际应用的效果，因此不应以此实验结果限制本发明的申请专利范围。在本发明的SMA基因的多个SNP位点的检测方法中，4个所述SNP位点中有一者发生缺失，则代表SMN1基因中发生缺失。然而一般而言，SMN1基因中的缺失，常发生于外显子7、内插子7和外显子8，且通常是大范围的缺失，因此当所述4个SNP位点有一者发生缺失时，通常其他3者也会一同缺失。而仅有SMN1基因所表现的蛋白具有显著的生物学上的意义，SMN2基因则无，所以4个所述SNP 位点中4个皆发生缺失，并且皆发生于SMN1基因时，则所述待测检体可能来自于一脊髓性肌肉萎缩症患者。
然而以上所述的生物分子遗传学上的特征，仅为表示本发明的SMA基因的 SNP位点的检测方法对于遗传学上的重要意义，因此不应以此生物分子遗传学上的特征限制本发明的申请专利范围。
本发明的目的，在于提供一种辨识SMN1基因的缺失的方法。在本发明的方法操作下：(1)可以在同一反应中同时侦测多个SNP(单核苷酸多态性)位点，可大幅降低分析成本；(2)操作简单快速，且适用各种品质的检体，例如新鲜组织、冷冻组织、石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)tissue)、细胞株萃取的基因体DNA(genomicDNA)或是血浆 cfDNA(circulating cell-free DNA)等；(3)由于所述多个SNP位点位于SMN基因容易发生缺失的区域，因此藉由检测所述多个SNP位点能确认SMN基因的缺失，也能精确侦测到微量检体中不同大小缺失的差异，具有极高效率；及 (4)由于SMN1基因的缺失与否与脊髓性肌肉萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)有高度的关系性，因此可以藉由本发明的方法快速地了解患者的SMA基因的基因型对于脊髓性肌肉萎缩症的研究是非常有价值的。
所属领域的技术人员当可了解，在不违背本发明精神下，依据本发明实施样态所能进行的各种变化。因此，显见所列的实施态样并非用以限制本发明，而是企图在所附申请专利范围的定义下，涵盖于本发明的精神与范畴中所做的修改。
序列表
<110> 丰技生物科技股份有限公司
<120> SMA基因的SNP位点的检测方法
<130> TP171290-CN
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> 扩增引子
<400> 1
gaatgtgagc accttccttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> 扩增引子
<400> 2
aacatccata taaagctatc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> 延伸引子
<400> 3
tttattttcc ttacagggtt t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> 扩增引子
<400> 4
gctctttatt gtgaaagtat g 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<223> 扩增引子
<400> 5
ggtttgtgga aaacaaatg 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<223> 延伸引子
<400> 6
acatttaaaa agttcagatg tta 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> 扩增引子
<400> 7
gctctttatt gtgaaagtat g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<223> 扩增引子
<400> 8
ggtttgtgga aaacaaatg 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<223> 延伸引子
<400> 9
ttctcatact taactggttg gtt 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> protein_bind
<222> (1)..(20)
<223> 扩增引子
<400> 10
ggaatgggta actcttcttg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> 扩增引子
<400> 11
tttctcaact gcctcaccac 20
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(15)
<223> 延伸引子
<400> 12
cctcccaccc ccacc 15
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<223> 扩增引子
<400> 13
gcccaccttg gtctcctaaa 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<223> 扩增引子
<400> 14
acctttgaga cacttgcc 18
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(16)
<223> 延伸引子
<400> 15
tgtcatctct tgtggg 16
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<223> 扩增引子
<400> 16
gcatgcctaa tattttcagg g 21
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<223> 扩增引子
<400> 17
acccctttga agtggtac 18
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(16)
<223> 延伸引子
<400> 18
agtggtacca gagcat 16
<210> 19
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(10)
<223> TAG 序列
<400> 19
acgttggatg 10

Claims (17)

1.一种SMA基因的一个SNP位点的检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(S10)对一待测检体进行一聚合酶连锁反应，其中使用一对扩增引子，扩增所述待测检体中包含待检测的一SNP位点的一段核酸片段，而获得一被扩增的核酸片段，其中所述SNP位点为单核苷酸多态性位点；
(S20)对所述被扩增的核酸片段进行一去磷酸化反应，以去除用于所述聚合酶连锁反应的核酸片段的一5’端的磷酸根；
(S30)对所述被扩增的核酸片段进行一延伸反应，其中使用一延伸引子辨识所述SNP位点的位置，并在所述延伸引子的一3’端延伸与所述SNP位点的碱基互补的一单一核苷酸，而获得一被延伸的延伸引子；
(S40)进行一纯化反应，以纯化所述被延伸的延伸引子；以及
(S50)测量所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定所述SNP位点是否发生缺失；
其中所述延伸引子包括选自于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12所组成的一群组中的一者。
2.如权利要求1所述的SMA基因的一个SNP位点的检测方法，其特征在于：所述对扩增引子分别包括选自于SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8；及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11所组成的一群组中的一者。
3.如权利要求1所述的SMA基因的一个SNP位点的检测方法，其特征在于：所述扩增引子的5’端增加一不与包含所述SNP位点的核酸片段互补的TAG核酸片段，以增加所述扩增引子与所述延伸引子之间的一分子量差距。
4.如权利要求3所述的SMA基因的一个SNP位点的检测方法，其特征在于：所述TAG核酸片段包括SEQ ID NO:19。
5.如权利要求1所述的SMA基因的一个SNP位点的检测方法，其特征在于：在步骤(S50)中，使用一质谱仪测量所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据所述分子量大小决定所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的所述SNP位点是否发生缺失。
6.如权利要求1所述的SMA基因的一个SNP位点的检测方法，其特征在于：在步骤(S50)中，使用一萤光电泳法，检测被延伸的多个所述延伸引子的分子量大小和所述些被延伸的延伸引子所被标记的萤光种类，根据各个所述分子量大小和萤光种类决定被延伸的各个所述单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的所述SNP位点是否发生缺失。
7.如权利要求1所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：在步骤(S50)中，当所述SNP位点所对应的被延伸的所述单一核苷酸的碱基种类为一种时，则所述SNP位点发生缺失；当所述SNP位点所对应的被延伸的所述单一核苷酸的碱基种类为两种时，则SMN1基因的所述SNP位点未发生缺失。
8.一种SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(S100)对一待测检体进行一聚合酶连锁反应(PCR)，其中使用多对扩增引子，扩增所述待测检体中多个核酸片段，各个所述核酸片段包含一SNP位点，而获得多个被扩增的核酸片段，其中所述SNP位点为单核苷酸多态性位点；
(S200)对多个所述被扩增的核酸片段进行一去磷酸化反应，以去除用于所述聚合酶连锁反应的核酸片段的一5’端的磷酸根；
(S300)对多个所述被扩增的核酸片段进行延伸反应，其中使用多个延伸引子辨识多个所述SNP位点的位置，并在各个所述延伸引子的一3’端延伸与各个所述SNP位点的碱基互补的一单一核苷酸，而获得多个被延伸的延伸引子；
(S400)进行一纯化反应，以纯化多个所述被延伸的延伸引子；以及
(S500)检测多个所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据各个所述分子量大小，决定各个所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定各个所述SNP位点是否发生缺失；
其中多个所述延伸引子包括选自于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:12所组成的一群组中的至少二者。
9.如权利要求8所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：多对所述扩增引子分别包括选自于SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5；SEQ IDNO:7与SEQ ID NO:8；及SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11所组成的一群组中的至少二者。
10.如权利要求9所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：多对所述扩增引子的5’端皆增加一不与包含多个所述SNP位点的核酸片段互补的TAG核酸片段，以增加多对所述扩增引子与多个所述延伸引子之间的一分子量差距。
11.如权利要求10所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：所述TAG核酸片段包括SEQ ID NO:19。
12.如权利要求8所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：在步骤(S500)中，使用一质谱仪检测多个所述被延伸的延伸引子的分子量大小，根据各个所述分子量大小决定各个所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的各个所述SNP位点是否发生缺失。
13.如权利要求8所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：在步骤(S500)中，使用一萤光电泳法，检测多个所述被延伸的延伸引子的分子量大小和所述些被延伸的延伸引子所被标记的萤光种类，根据各个所述分子量大小和萤光种类决定被延伸的各个所述单一核苷酸的碱基种类，从而决定SMN1基因的各个所述SNP位点是否发生缺失。
14.如权利要求8所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：在步骤(S500)中，当一个所述SNP位点所对应的所述被延伸的单一核苷酸的碱基种类为一种时，则决定所述SNP位点发生缺失；当一个所述SNP位点所对应的被延伸的所述单一核苷酸的碱基种类为两种时，则决定SMN1基因的所述SNP位点未发生缺失。
15.如权利要求8所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：多个所述SNP位点为4个。
16.如权利要求15所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：4个所述SNP位点中有一者发生缺失，则代表SMN1基因和SMN2基因中发生纯合缺失。
17.如权利要求15所述的SMA基因的多个SNP位点的检测方法，其特征在于：4个所述SNP位点中4个皆发生缺失，并且发生于SMN1基因，则判断所述待测检体来自于一脊髓性肌肉萎缩症患者。
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